KR20160131072A - 고등 식물에서의 rna 생산 - Google Patents

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KR20160131072A
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피터 마이클 워터하우스
케네스 나르바
이그나시오 마리오 라리누아
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더 유니버시티 오브 시드니
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Abstract

본 발명은 고등 식물의 색소체에서의 RNA 생산 및 프로세싱에 관한 것이다.

Description

고등 식물에서의 RNA 생산{RNA PRODUCTION IN HIGHER PLANTS}
발명의 분야
본 발명은 고등 식물에서의 RNA 간섭을 포함하는, 고등 식물에서의 RNA 생산 및 프로세싱, 및 고등 식물의 엽록체 및 관련 색소체에서의 유전자의 발현에 관한 것이다.
발명의 배경
명세서에서의 임의의 종래 기술에 대한 언급은 이러한 종래 기술이 임의의 사법권에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성하거나, 또는 이러한 종래 기술이 관련 기술 분야의 기술자에 의해 이해되고/되거나, 관련된 것으로 간주되고/되거나, 종래 기술의 다른 일부분들과 조합될 것으로 합리적으로 예상될 수 있다는 것을 인정 또는 시사하지 않는다.
동족 해충의 필수 유전자를 침묵시키기 위해 숙주 RNA를 사용하는 것은 해충 방제를 위한 신흥 접근법이다. 이러한 접근법은 '트랜스킹덤(transkingdom) RNA 간섭' 또는 '트랜스킹덤 RNAi'로 지칭될 수 있다. 일반적으로, 숙주에 의해 생산된 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 해충이 섭취했을 때, 해충 RNA 간섭 (RNAi) 기구가 섭취된 dsRNA를 siRNA, 또는 해충 생존에 영향을 미치는 해충에서의 본질적인 유전자 침묵화 또는 관련 이벤트를 유도할 수 있는 기타 RNA 형태로 전환시키는 것으로 이해된다. 나비목(lepidoptera)에 적용가능한 이러한 접근법의 예에 대해 문헌 [Terenius O. et al. 2011 J. Insect Physiol. 57:231-245]를 참조한다. RNA 간섭 (RNAi)은 내인성 세포 경로를 이용함으로써, 표적 유전자 서열 모두 또는 이의 적합한 크기의 임의의 일부분에 대해 특이적인 간섭 RNA (iRNA) 분자 (예를 들어, dsRNA 분자)가 이에 의해 코딩되는 mRNA의 분해를 초래하는 프로세스이다. 최근, RNAi가 다수의 종 및 실험 시스템에서 유전자 "녹다운(knockdown)"을 수행하는데 사용되었다; 예를 들어, 카에노랍디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans), 식물, 곤충 배아, 및 조직 배양 중인 세포. 예를 들어, 문헌 [Fire et al. (1998) Nature 391:806-811]; [Waterhouse et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139]; [Wesley V et al. (2001) Plant J. 27: 581-590]; [Martinez et al. (2002) Cell 110:563-574; [McManus and Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747]을 참조한다.
나비목 곤충의 유전자를 포함하는 해충 유전자의 침묵화를 수득하기 위해 높은 수준의 dsRNA가 요구된다는 것이 잘 확립되어 있다 (Terenius O, 상기 문헌; Mao Y. et al. 2007 Nat. Biotechnol. 25: 1307-1313; Kumar P. et al. 2012 PLoS ONE 7:e31347).
WO2012/054919는 하등 식물 (클라미도모나스(Chlamydomonas))의 엽록체 및 핵을 모기 생존을 위한 필수 유전자를 함유하는 구축물로 형질전환시키는 연구이다. 그 후, 먹이가 모기 집단을 방제하는데 사용될 수 있다는 것을 실연하기 위해, 형질전환된 클라미도모나스가 모기에 먹이로 공급된다.
WO2012/054919는 하등 식물의 엽록체 형질전환 및 핵 형질전환 양쪽 모두가 모기 집단의 방제를 위한 유용한 먹이를 제공한다는 것을 발견하였다. 구체적으로, WO2012/054919에 따르면, 결과는 엽록체 또는 핵 게놈으로부터 발현된 3HKT 역위 반복물을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 클라미도모나스를 먹이로 공급하는 것이 모기 유충의 성장을 억제하는데, 그리고 궁극적으로 이의 사망을 야기하는데 효과적이었음을 나타낸다 (WO2012/054919의 [00219] 단락).
그밖에, 트랜스킹덤 RNAi의 유도를 위해 곤충이 숙주를 먹이로 할 때 dsRNA가 곤충에 전달되어야 한다는 것이 핵 형질전환체의 연구로부터 가설되었다. [Mao and Kumar, 상기 문헌]을 참조한다. 이는 특정 시간에 해충이 숙주를 먹이로 할 때, dsRNA가 해충에 공급되게 이용가능할 수 있도록 항정 상태 수준(steady state level)의 dsRNA를 생산 및 유지하는 숙주가 효과적인 해충 방제에 요구된다는 것을 의미한다. 고등 또는 하등 식물에서 항정 상태 수준의 dsRNA를 생산 및 유지하는 최상의 방법은 여전히 불명확하다.
하등 식물에서, WO2012/054919은 [00220] 단락에서 엽록체에서의 침묵화 RNA의 발현이 트랜스킹덤 RNAi의 유도에 중요할 수 있다는 가설을 세웠다. 그러나, WO2012/054919는 이것이 엽록체 발현이 침묵화 RNA의 항정 상태 수준을 가능하게 하기 때문인지, 또는 침묵화 RNA가 섭취되었을 때 이를 보호하는 것이 엽록체의 색소체 포장(plastid packaging)인지를 결론짓지 않았다. 색소체 포장의 중요성이 다른 이들에 의해 제안되었다. 문헌 [Bogarad L. 2000 TIBTECH 18: 257-263]; [McBride K et al., 1995 Nature Biotechnology 13: 362-365]; [Verma D and Daniell H 2007 Am Soc Plant Biol. 145:1129-1143]을 참조한다.
하등 식물 엽록체 형질전환체에 의해 발현된 RNA가 dsRNA를 이루는지 여부가 WO2012/054919로부터 여전히 불명확하다. 구체적으로, WO2012/054919는 클라미도모나스 엽록체 형질전환체, 또는 형질전환체를 섭취한 곤충에서 dsRNA 또는 siRNA를 측정하지 않았다. 따라서, WO2012/054919는 트랜스킹덤 RNAi를 용이하게 하는데 충분한 양으로 클라미도모나스 또는 기타 하등 식물의 엽록체에서 dsRNA가 생산될 수 있다는 것을 나타내지 않는다.
추가로, WO2012/054919로부터, 클라미도모나스 핵 형질전환체에서 dsRNA가 생산되는 것으로 보이는데, 이는 WO2012/054919에 따르면 이러한 형질전환체가 표면적으로 엽록체 형질전환체만큼 트랜스킹덤 RNAi 유도에 유용하였기 때문이다. dsRNA가 트랜스킹덤 RNAi에 필수적이기 때문에, 한가지 의미는 dsRNA가 고등 식물의 핵에서보다 하등 식물의 핵에서 더 양호하게 축적될 수 있다는 것일 수 있다. 이는 고등 및 하등 식물의 RNA 프로세싱 경로에서의 분기점을 가리킬 것이다. 고등 및 하등 식물에서의 RNA 프로세싱 사이의 차이의 많은 예가 있다. 특히, 문헌 [Casas-Mollano J. et al. 2008 Genetics 179: 69-81]을 참조한다. 엽록체 및 핵 형질전환체가 동등하게 dsRNA를 축적한다는 것을 조건으로, 트랜스킹덤 RNAi 유도를 위한 엽록체 및 핵 형질전환체의 효능에서의 약간의 차이가, 색소체 내의 침묵화 RNA의 우수한 축적보다는, 엽록체에 독특한 색소체 포장으로부터 발생할 수 있는 듯하다. 이는 실제로 [00220] 단락에서의 WO2012/054919의 가설이다.
중요하게, 독자적으로 색소체 포장은 항정 상태 수준의 dsRNA의 생산 및 유지를 가능하게 하는 메커니즘이 아니다. 포장은 섭취 후에 생산된 것을 보호할 뿐이다. 따라서, 색소체 포장 자체는 트랜스킹덤 RNAi 유도에 요구되는 것으로 공지된 높은 수준의 dsRNA의 생산에 충분하지 않다.
하등 및 고등 식물의 엽록체 RNA 프로세싱 경로 사이의 추가적인 중요한 차이는 클라미도모나스가 예시되는 바와 같은 하등 식물은 RNA 편집 시스템이 없는 반면, 고등 식물의 엽록체 RNA 프로세싱 경로에는 이러한 시스템이 존재한다는 것이다. 문헌 [Stern et al. 2010 Annu. Rev. Plant Biol. 61:125-55]을 참조한다. 따라서, 하등 식물 엽록체에서 생산된 동족 해충의 표적 유전자에 상응하는 RNA는 관련된 해충 표적 유전자와 서열이 동일한 것으로 이해되고, 이는 적합하게 서열 특이적인 siRNA가 해충에서 형성되고 트랜스킹덤 RNAi가 유도되는 가능성을 증가시킨다. 고등 식물 엽록체 내의 RNA 편집 시스템의 존재는 이같은 결과가 고등 식물의 엽록체 형질전환체를 사용하여 가능할지 여부의 의문을 일으킨다.
논의된 바와 같이, dsRNA가 신속하게 분해되기 때문에 고등 생물에서 항정 상태 수준의 dsRNA를 유지하는 것이 어렵다. 고등 식물에서, 이러한 분해는 siRNA를 수반하는 것으로 생각되지만, 아직 규정되지 않은 기타 RNAi 관련 메커니즘 또는 기타 메커니즘이 수반될 수 있다.
고등 식물의 엽록체에서의 RNA 프로세싱 경로의 이해가 약간 진전되었다. 그러나, 여전히 미지수인 것이 많다. 연구원들은 왜 전형적인 엽록체 게놈 내의 100개 미만의 소수의 유전자의 발현이 이렇게 복합적인지를 종종 질문한다. [Stern, 상기 문헌]을 참조한다.
고등 식물 엽록체의 RNA 프로세싱 경로는 고등 식물 세포핵 및 시토졸에서의 경로와 상이한 것으로 이해된다. 이는 색소체는 원핵생물 기원인 반면, 식물 세포핵 및 시토졸은 진핵생물 기원이기 때문이다. 어떤 이들은 시아노박테리아 선조로부터 유래된 엽록체가 유전자 발현의 원핵생물 및 진핵생물 특색을 조합하고, 다수의 핵-코딩 단백질에 의해 조절된다고 생각한다. [Stern, 상기 문헌]을 참조한다. 그러나, 경로가 상이한 정도 및 이러한 차이의 RNA 프로세싱에 대한 관련성은 공지되어 있지 않다.
어떤 이들은 원핵생물과 진핵생물 사이의 차이를 감안하여, 진핵생물 세포에서는 작동하는 것으로 보이지만 원핵생물 세포에서는 그렇지 않은 메커니즘이 엽록체에서 작동하지 않아야 한다고 제안하였다. RNAi가 한 특정 메커니즘이다. 동시에, 또 다른 이들은 엽록체 내에 축적된 RNA로부터 유래된 siRNA의 존재를 관찰하여, 엽록체에서 작동되는 RNAi 메커니즘을 가리켰다. 문헌 [Martinez de Alba A.E. et al. 2002 Am. Soc Microbiol. 76: 13094-13096]을 참조한다. 추가로, RNase III의 엽록체 상동체(homolog)가 mRNA 프로세싱에서 또한 수반될 수 있다. RNase III는 RNA 침묵화에 관련된 효소 예컨대 다이서(Dicer)를 포함하는 dsRNA-의존적 엔도리보뉴클레아제의 대형 패밀리의 구성원이다. [Stern, 상기 문헌]을 참조한다. 엽록체에서 핵-유래 인자가 관찰되는 것은 RNA 편집 및 스플라이싱 인자를 포함하여, 다수의 핵-코딩 트랜스(trans) 작용 인자가 엽록체에서 확인되는 것을 감안하여 아마도 뜻밖이지 않을 것이다.
일반적으로, 고등 식물의 엽록체 내의 내인성 유전자의 RNA의 항정 상태 수준이 어떻게 제어되는지가 공지되어 있지 않다. 관련 메커니즘이 고등 식물의 엽록체에서의 외인성 유전자의 발현에 동등하게 적용될 것인지가 또한 공지되어 있지 않다. 추가로, RNA의 항정 상태 수준에 대한 엽록체에서의 트랜스진(transgene)의 과발현의 영향이 공지되어 있지 않다. 아마도 이러한 이유로 많은 이들이 핵 형질전환을 기초로 고등 식물에서의 트랜스킹덤 RNAi 접근법에 착수하였고, 이는 핵의 RNA 프로세싱 기구가 고등 식물에서 더욱 명확하게 이해되고, 결과가 예측가능하기 때문이다.
이러한 연구들은 초기에 dsRNA 프로세싱 기구가 결여된 세포의 사용에 집중함으로써, dsRNA의 분해를 피했다. 한가지 문제는 dsRNA 프로세싱 기구가 결여된 식물의 성장 성능에 대한 영향이었다. 이러한 문제는 고등 식물의 핵에서의 dsRNA의 형성 및 보호를 가능하게 하는 변형된 구축물을 제공하는 것으로 개선되었다. 예를 들어 US20090263364, US20070011775, US20090263364, US20080194504; US20060095987, 문헌 [Fenner B. et al. 2006 J. Virol. 80: 6822-6833]; 및 [Salomon W. et al 2010 Nucl. Acids. Res. 38: 3771-3779]을 참조한다. RNAi 유도 구축물에서의 이러한 개선 및 발전으로 표면적으로 핵 형질전환이 트랜스킹덤 RNAi를 위한 dsRNA 생산에 대한 바람직한 접근법으로서 확립되었다.
고등 식물에서의 dsRNA의 생산 및 축적을 위한 대안적인 접근법 또는 개선된 접근법이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 상기 언급된 요구를 다루려 노력하고, 한 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 색소체를 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- 코딩 영역이 식물의 게놈에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- 색소체가 dsRNA의 서열을 포함하는 siRNA 분자를 포함하지 않는,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물;
- dsRNA
를 포함하고,
- dsRNA가 코딩 영역에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 모두 함유하는 것인,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
추가적인 실시양태에서,
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
를 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물이 제공된다.
추가적인 실시양태에서,
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
를 포함하고,
- 코딩 영역이 식물의 게놈에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물이 제공된다.
추가적인 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 색소체 또는 구축물을 함유하는 식물 또는 이로부터 유래된 번식 물질이 제공된다.
추가적인 실시양태에서,
- 관다발 식물의 색소체를 상기 기술된 실시양태 중 어느 하나의 핵산 구축물로 형질전환시키는 단계;
- 핵산 구축물로부터의 색소체에서의 dsRNA 생산을 위한 조건을 세포에 제공함으로써,
관다발 식물의 세포 내에 dsRNA에 축적시키는 단계
를 포함하는, 관다발 식물의 세포 내에 dsRNA를 축적시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적인 측면 및 상기 단락들에서 기술된 측면들의 추가적인 실시양태가 예로써, 그리고 첨부된 도면을 참조로 제공된 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1a. 핵 또는 엽록체 게놈 내로의 통합으로부터 dsRNA 또는 헤어핀 (hpRNA)를 생산하는 방식의 개략도.
도 1a- 1. 1개는 센스 전사체를 생산하고 다른 1개는 안티센스 전사체를 생산하는 2개의 독립적인 전사 단위 (문헌 [Waterhouse PM et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139]에 최초로 기술된 바와 같음). 전사 단위들은 게놈 내에 공동으로 위치할 수 있거나 (예컨대 동일한 T-DNA 상에 도입된 단위에 의해 생산됨), 또는 관련되지 않은 위치에 (예컨대 상이한 염색체 상에) 있을 수 있다. dsRNA를 형성하기 위해 센스 및 안티센스 RNA가 만나서 혼성화되는 것이 요구된다.
도 1a- 2. 1개의 "코딩 영역" 서열이 2개의 "내부로 가리키는/수렴성" 프로모터 사이에 놓여 (문헌 [Timmons L and Fire A. 1998 Nature 395: 854]에 최초로 기술된 바와 같음), 1개의 프로모터는 센스 RNA가 생산되도록 1개의 DNA 가닥의 전사를 야기할 것이고, 다른 프로모터는 안티센스 RNA가 제조되도록 다른 DNA 가닥의 전사를 지시할 것이다. dsRNA를 형성하기 위해 2개의 RNA가 만나서 혼성화되는 것이 요구된다.
도 1a- 3. 듀플렉스 구조의 줄기와 유사한 dsRNA가 있는 헤어핀 (hp) RNA가 제조되도록 뒤로 접혀서 자가-혼성화되는 능력이 있는 단일 RNA를 생성시키는 1개의 프로모터에 의해 구동된 1개의 전사 단위 (문헌 [Waterhouse et al. 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-139]에 최초로 기술된 바와 같음). 전사체의 제1 영역은 전사체의 마지막 영역에 대해 센스 배향으로 있을 수 있다 (또는 반대). DNA 구축물을 안정화시키기 위해 센스 및 안티센스 영역을 분리하는 "스페이서" 영역이 있는 것이 중요하다. 이러한 예에서, 스페이서 영역은 hpRNA 전사체의 일부로서 전사될 것이고, 루프를 형성할 것이다.
도 1a- 4. 듀플렉스 구조의 줄기와 유사한 dsRNA가 있는 헤어핀 (hp) RNA가 제조되도록 뒤로 접혀서 자가-혼성화되는 능력이 있는 단일 RNA를 생성시키는 1개의 프로모터에 의해 구동된 1개의 전사 단위. 전사체의 제1 영역은 전사체의 마지막 영역에 대해 센스 배향으로 있을 수 있다 (또는 반대). DNA 구축물을 안정화시키기 위해 센스 및 안티센스 영역을 분리하는 "스페이서" 영역이 있는 것이 중요하다. 이러한 예에서, 스페이서 영역은 인트론을 코딩하고, 이는 전사되지만, 그 후 매우 작은 루프가 있는 hpRNA 전사체가 생산되도록 스플라이싱으로 제거될 것이다 (문헌 [Smith NA et al 2000 Nature 407: 319-320]에 최초로 기술된 바와 같음).
도 1b. 핵 게놈 내로 통합되었을 때의 핵 통합 구축물의 개략도. v153 핵 형질전환 구축물이 이의 통합 형태로 도시된다. 이러한 구축물은 CaMV 35s 프로모터로부터 Ha-HpAce1236-189 헤어핀을 발현하도록 디자인된다. 백본(backbone)은 표준 이원성 아그로박테리아 형질전환 벡터인 pORE-03의 유도체이다. 숙주 핵 게놈 내의 통합 부위는 아그로박테리아 매개 형질전환의 표준 통합 역학에 따라 변할 것이다. 후속 cDNA 합성 단계 (301r, 216f/r, 및 올리고 dT), 및 RT-PCR 검출 단계 (217f/r + 216 f/r, 및 25f + 216 f/r)에 사용된 프라이머가 도시되고, 후자 세트에 대해서는 예상 생성물 크기 (e=..)가 함께 지시된다. 이후의 인트론 스플라이싱에 의해 생산되어 잔존할 종의 것 및 표준 핵/세포질 RNA 상에서 작동하는 것으로 공지된 표준 RNAi-유형 경로에 의한 프로세싱 이후의 것을 포함하여, 예상 RNA 생성물 및 구조가 제시된다.
도 1c. 엽록체 게놈 내로 통합되었을 때의 엽록체 발현 구축물 (핵 인트론이 있음)의 개략도. v206 엽록체 형질전환 구축물이 이의 통합 형태로 도시된다. 이러한 구축물은 Prrn 프로모터로부터 Ha-HpAce1236-189 헤어핀을 발현하도록 디자인된다. 백본은 표준 엽록체 형질전환 벡터인 pPRV323Clox의 유도체이다. 숙주 엽록체 게놈 내의 통합 부위는 정확하여, 포함된 재조합 영역에 의해 trnI / trnA에서 정의된다. 후속 cDNA 합성 단계 (301r, 216f/r, 276r, 280r, 및 올리고 dT) 및 RT-PCR 검출 단계 (217f/r + 216 f/r, 및 25f + 216 f/r)에 사용된 프라이머가 도시되고, 후자 세트에 대해서는 예상 생성물 크기 (e=..)가 함께 지시된다. 생산된 예상 RNA 생성물이 제시된다. 이러한 경우에, 표준 스플라이싱 기구가 엽록체에서 작동하지 않기 때문에, 포함된 핵/세포질 인트론이 스플라이싱되지 않을 것이다. RNAi 프로세싱 기구의 추가적인 부재 하에, 잔존하는 생성물은 디자인된 헤어핀에 의해 의도된 표적을 커버하도록 원래 포함된 바와 같은 서열의 실질적인 일부분 또는 이러한 서열 모두를 포함할 것이다. 이러한 경우에, 다수의 엽록체 전사체에 대해 통상적으로 발생하는 것으로 공지된 바와 같이, 천연의 상류 전사 단위로부터 전사가 계속될 수 있는 경우 ("리드-쓰루(read-through)")에 형성된 추가적인 더 긴 RNA 종이 있을 수 있다.
도 1d. 엽록체 게놈 내로 통합되었을 때의 엽록체 발현 구축물 (엽록체 인트론이 있음)의 개략도. v301 엽록체 형질전환 구축물이 이의 통합 형태로 도시된다. 이러한 구축물은 Prrn 프로모터로부터 Ha-HpAce1236-189 헤어핀을 발현하도록 디자인된다. 백본은 표준 엽록체 형질전환 벡터인 pPRV323Clox의 유도체이다. 숙주 엽록체 게놈 내의 통합 부위는 정확하여, 포함된 재조합 영역에 의해 trnI / trnA에서 정의된다. 후속 cDNA 합성 단계 (301r, 216f/r, 276r, 280r, 및 올리고 dT) 및 RT-PCR 검출 단계 (217f/r + 216 f/r, 및 25f + 216 f/r)에 사용된 프라이머가 도시되고, 후자 세트에 대해서는 예상 생성물 크기 (e=..)가 함께 지시된다. 생산된 예상 RNA 생성물 및 구조가 제시된다. 이러한 경우에, 포함된 엽록체 인트론이 엽록체에서 스플라이싱되어 제거될 것이다. RNAi 프로세싱 기구의 부재 하에, 잔존하는 생성물은 디자인된 헤어핀에 의해 의도된 표적을 커버하도록 원래 포함된 바와 같은 서열의 실질적인 일부분 또는 이러한 서열 모두를 포함하지만, 인트론 서열은 포함하지 않을 것이다. 스플라이싱의 결과로서, RNA 구축물은 한쪽 끝에 작은 루프가 있는 막대 모양의 RNA 듀플렉스를 형성할 것이다. 이러한 경우에, 다수의 엽록체 전사체에 대해 통상적으로 발생하는 것으로 공지된 바와 같이, 천연의 상류 전사 단위로부터 전사가 계속될 수 있는 경우 ("리드-쓰루")에 형성된 추가적인 더 긴 RNA 종이 있을 수 있다.
도 2. 트랜스진의 발현을 나타내는 형질전환체로부터의 RNA 추출물의 RT-PCR. 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 엽록체 형질전환 식물 조직 (v206 샘플 #1-9), 엔. 벤타미아나(N. benthamiana) 핵 형질전환 조직 (v153 핵 대조군 샘플 #17), 및 비-형질전환 엔. 벤타미아나 조직 (비-형질전환 대조군 샘플 #24)으로부터 추출된 RNA 샘플을 사용한 6개의 상이한 역전사 (RT) 검정법으로부터의 결과가 제시된다. 2가지 상이한 주형 조건을 사용하여 (주형으로서의 cDNA 합성 전의 추출된 RNA (샘플 내의 DNA 오염 가능성 테스트용), 및 상응하는 cDNA 샘플 세트), 각각의 샘플을 3가지 상이한 프라이머 세트로 증폭시켰다. 예상 생성물 크기가 e=..으로 지시된다. 포함된 마커는 100 bp에서 1 kb까지 100 bp 간격으로 밴드가 있는 MBI 퍼맨타스(MBI Fermentas) 100 bp 마커이다. (A-B) 제1 PCR 프라이머 세트는 안티-센스 (AS) 줄기에 인트론 루프를 함유하는 대형 RNA 종의 존재에 대해 테스트하기 위해 인트론 및 후방 줄기 접합부에 걸쳐 증폭시키도록 디자인되었다 (프라이머 g25f 및 g216f/r). 상자에 담긴 영역은 특이적 증폭이 있다면 생성물이 나타날 구역을 가리킨다. (C-D) 제2 세트는 루프 서열과 독립적으로 전장 센스 (SE) 또는 안티-센스 (AS) 줄기의 존재에 대해 테스트하기 위해 dsRNA 줄기 영역에 대해 내부였지만, 줄기의 말단에서 결합한다 (프라이머 g216f/r 및 g217f/r). (E-F) 제3 세트는 eIF4E에 대한 편재성 하우스-키핑(house-keeping) 서열의 존재에 대해 테스트하기 위한 대조군 반응이었다 (프라이머 g165f 및 g166r).
엽록체 샘플 #9는 이러한 세트에서 분석되지 않았다. 그러나, 이는 이미 이전의 PCR 검정법에서 양성인 것으로 확인되었다.
도 3. 엽록체 형질전환체 및 대조군에서의 dsRNA의 노던-기반 정량.
엽록체 형질전환 샘플을 고분자량 (MW) 또는 '대형 RNA' 노던 분석에 적용하였다. (A) 샘플 #1-9, 17 및 24 각각에 대해 RNA 추출물을 다시 제조하였다 (각각의 샘플을 포름아미드에 재현탁시켰다). 1.4％ TBE 아가로스 겔 상에 레인 당 약 10 ㎕의 각각의 샘플 + 6 ㎕의 포름아미드 RNA 로딩 염료를 로딩하고 (4 ㎕의 샘플만 입수가능한 샘플 7은 제외), 2개의 하부 전방 염료(dye front)가 적절하게 분리될 때까지 100 V에서 러닝시켰다. 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr)로 염색하고 가시화하여, 상대적인 로딩량을 평가하였다. (B) 겔을 철야로 하이본드(Hybond) N+ (아머샴(Amersham)) 상으로 모세관으로 이송시키고, 샘플을 막에 UV 가교시켰다. 막을 예비-혼성화시키고, 65℃에서 퍼펙트하이브(PerfectHyb)와 혼성화시켰다. 프로브 (총 길이가 538 nt이고, ~ 357 nt가 HaAce에 연속적으로 매칭됨)는 역으로 삽입된 HaAce1236 pGEM 벡터 (v158)로부터 런-오프(run off) (SP6)된 부분적인 길이의 SE 가닥 UTPp32 리보프로브였다. 막을 1시간 동안 노출시켰다. (C) RNA 양을 ImageJ를 사용하여 정량하고, 로딩된 양에 대해 표준화하였다 (EtBr 영상을 사용함). 엔. 벤타미아나 비-형질전환 대조군 (1로 설정됨)에 대해 상대적인 밴드 강도에서의 표준화된 배수 변화로서 상대적인 발현 수준을 계산하였다.
추가적인 RNA 추출물을 위한 잔여 물질이 불충분하였기 때문에 샘플 #6은 이러한 실시예 세트에서 생략되었다.
도 4. 엽록체 형질전환체 및 대조군에서의 siRNA의 노던-기반 정량. 엽록체 형질전환 샘플을 저분자량 (MW) 또는 '소형 RNA' 노던 분석에 적용하여, siRNA 크기의 프로세싱 생성물을 검출하고 이의 상대적인 양을 정량하였다. 실시예 4에서 사용된 것과 동일한 RNA 추출물이 여기에 사용되었다. (A) 17％ PAGE 겔 상에 레인 당 약 25 ㎕의 각각의 샘플 + 25 ㎕의 포름아미드 RNA 로딩 염료를 로딩하였다. 이는 ~ 18-42 ug의 로딩된 양의 추정 범위를 초래하였다. 로딩 전에, PAGE 겔을 150 V / 40분으로 예비-러닝시켰다. 로딩 후, 겔을 150V / ~ 30분 + 200 V /~ 4-5시간으로 러닝시켰다 (전방 염료가 적절하게 이동했을 때까지). 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr)로 염색하고 가시화하여, 상대적인 로딩량을 평가하였다. (B) 겔을 45 V / 60분으로 하이본드 N+ (아머샴) 상으로 전기적으로 이송시키고, 샘플을 막에 UV 가교시켰다. 막을 예비-혼성화시키고, 42℃에서 퍼펙트하이브와 혼성화시켰다. 프로브를 표준 방법에 의해 또한 '탄산염화'시켜 ~ 50 nt의 단편으로 분할한 것을 제외하고는, 이전에 기술된 바와 동일하게 프로브를 제조하였다. 막을 1시간 및 60시간 동안 노출시켰고, 이때 2개의 시점 사이에 검출 한계의 차이가 없었다 (1시간 시점이 본원에서 제시됨). (C) RNA 양을 ImageJ를 사용하여 정량하고, 로딩된 양에 대해 표준화하였다 (EtBr 영상을 사용함). 엔. 벤타미아나 비-형질전환 대조군 (1로 설정됨)에 대해 상대적인 밴드 강도에서의 표준화된 배수 변화로서 상대적인 발현 수준을 계산하였다.
잔여 물질이 불충분하였기 때문에 샘플 #6 및 7은 이러한 실시예 세트에서 생략되었다.
도 5a 트랜스제닉 및 비- 트랜스제닉 모종 상에서의 헬리코베르파 아르미게라 (Helicoverpa armigera ) 유충의 성장 속도
플라스틱 페트리 접시에서 세정된 6-10일령 모종을 4일 동안 먹인 후의 헬리코베르파 유충의 평균 중량 (n=4-13; 실험을 시작할 때의 원래의 n=20/처리). 유충이 침입한 모종을 함유하는 페트리접시를 제어된 환경 조건 (28℃, ~ 60％ 상대 습도, 16:8 [명:암])에서 유지시켰다. 이러한 데이터는 v206 (엽록체에서 hpRNA를 발현함)으로 형질감염된 4개의 독립적인 라인 모두에서, 야생형 엔. 벤타미아나 모종을 먹인 것들과 비교하여 유충이 이의 성장 속도 면에서 유의하게 감소되었음 (p<0.005 n= 7-13)을 나타낸다. v153 (핵/세포질에서 hpRNA를 발현함)으로 형질감염된 2개의 라인을 먹인 유충의 성장 속도는 wt을 먹인 것에 대해 유의하게 상이하지 않았다 (p>0.9; n =4-7).
도 5b. 본원에서 언급된 벡터들의 관계 경로의 개략도. 실시예 1에서 어셈블리된 엽록체 형질전환 구축물들은 여러 기존의 벡터 (pPRV323Clox, pORE-03, 및 pRNAi-GG)의 유도체였다. pPRV323Clox가 먼저 오류성 Kpn I RE 부위를 제거하도록 변형되었다. 이러한 벡터 내로 엽록체 프로모터, 5' UTR, MCS 및 3' UTR이 삽입되어, pR1이 생성되었다. pORe-03이 먼저 CaMV 35s 프로모터의 삽입 + 백본 내에 존재하는 Bsa I 부위의 제거에 의해 변형되어, p32c가 생성되었다. pRNAi-GG는 골든 게이트(Golden Gate) (GG) 클로닝 카세트의 공급원으로서 사용되었다. GG 카세트가 p32c 내로 복사되어, p32c-GG가 생성되었다. 그 후, p32c-GG가 GG 반응에서 사용되어, 헬리코베르파 아르미게라 아세틸콜린에스테라제 표적 유전자 (Ha-Ace1236-189)에 대한 헤어핀 구축물인 v153이 생성되었다. v153은 핵 형질전환 실시예에서 사용된 구축물이었다. 이러한 구축물을 GG Ha-HpAce1236-189 요소를 pR1 내로 전달하도록 추가로 사용하여, v206이 생성되었다. v206은 엽록체 형질전환 실시예에서 사용된 구축물이었다.
도 6. 예시적 서열. (A) 진뱅크(Genbank) 등록 번호: AF369793에 상응하는, 헬리코베르파 아르미게라 (Ha)로부터의 아세틸콜린에스테라제 (Ac) 유전자 (표적 유전자)에 대한 mRNA 서열. (B) Ha로부터의 Ac 유전자의 서열로부터 유래된 Ha-Ace1236-189 (표적 서열). (C) pRNAi-GG 내에 존재하는 바와 같은 인트론 스페이서 영역을 사용한 Ha-HpAce1236-189 (서열 Ha-Ace1236-189의 헤어핀). 제시된 서열은 표적 서열의 말단 끝부분으로부터의, DNA 구축물 (스플라이싱-전)에서 나타날 때의 서열이다.
도 7. v153에 대한 플라스미드 지도.
도 8. v153에 대한 뉴클레오티드 서열.
도 9. 변형된 v206에 대한 플라스미드 지도.
도 10. 변형된 v206에 대한 뉴클레오티드 서열.
도 11. v301에 대한 플라스미드 지도.
도 12. v301에 대한 뉴클레오티드 서열.
실시양태의 상세한 설명
농업에서 식물의 해충 및 병원체의 성장을 억제하기 위한 효율적인 수단으로서 트랜스킹덤 RNAi가 최근 떠올랐다. 이러한 접근법은 외인성 dsRNA가 세포성 RNase III 효소 (예를 들어, 다이서 또는 다이서-유사 단백질, 예컨대 DCL1, DCL2, DCL3, 및 DCL4)에 의해 소형 간섭 (siRNA) 분자로 프로세싱되는, 다수의 진핵생물 내에 존재하는 RNA 프로세싱 경로를 이용한다. 다이서는 긴 dsRNA 분자를 일반적으로 뉴클레오티드 약 19-24개의 길이인 siRNA로 절단하고, 그 후 이는 2개의 단일-가닥 RNA로 풀린다: 패신저(passenger) 가닥 및 가이드(guide) 가닥. 패신저 가닥은 분해되고, 가이드 가닥은 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 가이드 가닥이 mRNA 분자의 상보적인 서열에 특이적으로 결합하고, RISC 복합체의 촉매 성분인 아르고노트(Argonaute)에 의해 절단을 유도할 때, 전사-후 유전자 침묵화가 발생한다.
트랜스킹덤 RNAi는 dsRNA 분자를 표적 생물에 제공함으로써 내인성 RNA 프로세싱 경로를 이용하고, 이때 dsRNA 분자는 표적 생물에 의해 생산되는 것이 아니라, 또 다른 생물, 예를 들어, 표적 생물이 소비할 생물에 의해 생산된다. dsRNA 또는 hpRNA 분자를 생산하는 일부 방식이 도 1a에서 도시된다. 이러한 접근법의 한 예는 표적 생물 내의 특이적인 표적 유전자에 대해 상동성인 dsRNA 분자를 식물 내에 제공하는 것이다. 식물에 의해 생산된 dsRNA를 해충이 섭취했을 때, 해충 RNA 간섭 (RNAi) 기구가 섭취된 dsRNA를 siRNA, 또는 해충 생존에 영향을 미치는 해충에서의 본질적인 유전자 침묵화 또는 관련 이벤트를 유도할 수 있는 기타 RNA 형태로 전환시키는 것으로 이해된다. 이러한 접근법은 "비-세포 자발적 RNAi"로 또한 지칭되었고, dsRNA 분자가 생산되고, 프로세싱되며, 이의 침묵화 효과를 발휘하는 것이 모두 단일 세포에서 이루어지는 경우와 구별된다.
dsRNA 분자를 숙주 세포 내에 제공하는 한가지 접근법은 숙주 게놈으로부터 핵에서 발현될 때 dsRNA 분자를 코딩하는 구축물을 숙주의 세포핵 내로 도입하는 것이다. 숙주 생물 내에 dsRNA 분자를 제공하는 것에서, 숙주 생물 자체의 RNA 프로세싱 기구가 dsRNA 분자를 siRNA로 분해할 수 있는 것으로 또한 알려졌다. 그러므로, 해충에서 유전자 침묵화를 유도할 수 있는 siRNA가 식물에서 생산될 수 있다. 그러나, 트랜스킹덤 RNAi가 성공적이기 위하여, 높은 수준의 dsRNA가 표적 생물에 제공되어야 하는 것으로 현재 잘 알려져 있다. 따라서, 트랜스킹덤 RNAi 방법론에서의 최근의 노력은 이같이 siRNA로 프로세싱되는 것을 방지하기 위해 숙주 세포 핵에서 생산된 dsRNA 분자를 안정화시키는 수단에 집중되었다. 예를 들어, 어떤 이들은 분해를 방지하기 위한 RNA-결합 분자의 제공을 제안하였다. 다른 이들은 siRNA로의 프로세싱으로 인한 임의의 손실을 보상하기 위해 숙주 세포의 핵에서의 dsRNA 발현 수준을 증가시키는 것이 필요하다고 제안하였다. 또 다른 이들은 dsRNA 분자의 화학적 변형을 제안하였다. 명백한 것은 이러한 상황을 바로잡으려는 것에서의 모든 노력이 기존의 핵-형질전환 방법론을 변형하는 것에 대해 이루어졌다는 것이다.
본 발명가들은 dsRNA 분해 문제의 해결에 대한 상이한 접근법을 채택하였고, 관다발 식물의 색소체, 예를 들어, 엽록체에서 생산된 dsRNA가 동일한 세포의 핵에서 생산된 dsRNA와 동일한 분해 또는 프로세싱에 대해 감수성이지 않다는 것을 뜻밖에 발견하였다. 중요하게, 본 발명가들은 관다발 식물의 엽록체를 선택적으로 형질전환시키는 것에 의해 관다발 식물 내에 dsRNA를 축적시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 추가로, 본 발명가들은 본 발명에 따라 생성된 엽록체에 실질적으로 siRNA 내용물이 없다는 것을 발견하였고, 이는 본 발명을 트랜스킹덤 RNAi 용도에 적용하는데 유리하다. 추가로, 본 발명가들은 엽록체에 축적된 dsRNA가 다른 엽록체 RNA 프로세싱 경로에 의해 달리 실질적으로 프로세싱되지 않는다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명가들은 필수적인 유충 유전자에 대해 표적화된 hpRNA를 엽록체에서 발현하는 트랜스제닉 식물을 유충에 먹이는 것이 이같은 유충의 성장에 대한 강한 억제 효과가 있다는 것을 발견하였다.
색소체가 다이서-유사 효소를 사용하여 dsRNA 분자를 siRNA로 분해하는지 여부가 지금까지 미지였기 때문에 본 발명가들의 발견은 뜻밖이었다. 예를 들어, 어떤 이들은 엽록체-복제 바이로이드에 상응하는 siRNA가 식물 세포 내에 존재하는 것이 고등 식물의 엽록체 내의 다이서-유사 프로세싱 기구를 지시한다고 추측하였다. 그러나, 본 발명가들은 고등 식물의 색소체에서 생산된 dsRNA 분자가 색소체 내에서 siRNA로 프로세싱되지 않는다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명가들은 관다발 식물의 색소체가 높은 수준의 dsRNA의 생산을 위한 적절한 환경을 제공한다는 것을 발견하였다.
따라서, 제1 실시양태에서, 본 발명은
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 색소체를 제공한다.
일반적으로, 긴 dsRNA 분자를 일반적으로 뉴클레오티드 약 19-24개의 길이인 siRNA로 절단하는 세포성 RNase III 효소 (예를 들어, 다이서)에 의해 dsRNA 분자로부터 siRNA가 생산된다. 일반적으로, 뉴클레오티드 19-24개 미만의 길이의 이중 가닥 구조를 갖는 dsRNA 서열은 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따라 생산된 dsRNA 분자는 siRNA가 dsRNA로부터 생산되는데 일반적으로 요구되는 자신의 초기의 성질의 실질적인 부분을 유지한다. 달리 말하면, dsRNA 분자는 표적 생물의 RNase III 기구가 dsRNA 분자에 결합하여 이로부터 siRNA 분자를 생산하는 것을 가능하게 하는 성질을 유지한다. 본 발명에 따라 생산된 dsRNA가 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는다는 것은 이러한 맥락에서이다. 이것은 하기에서 추가로 설명되지만, 이것으로 전환하기 전에, dsRNA의 성질을 추가로 논의하는 것이 유용하다.
구체적으로, 일반적으로 dsRNA는 제1 가닥과 제2 가닥이 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 의해 서로 결합하여 '줄기'를 형성할 수 있도록 가닥들 간에 충분한 서열 상보성이 있는 제1 RNA 가닥 및 제2 RNA 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, dsRNA의 줄기는 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 100％ 상보성으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 줄기를 형성하는 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 1개 이상의 미스매치가 있을 수 있어, 줄기의 가닥들 사이의 상보성이 100％ 미만일 수 있다. 일반적으로, 줄기의 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 상보성 수준은 80％, 바람직하게는 85％, 바람직하게는 90％, 바람직하게는 95, 96, 97, 98 또는 99％를 초과한다. 일반적으로, 미스매치는 뉴클레오티드 약 3개, 바람직하게는 뉴클레오티드 약 2개 이하의 연속 서열에 걸쳐진다. 바람직하게는, 미스매치는 간격을 두고 떨어진 위치에 있는 줄기의 제1 가닥 및 제2 가닥의 단일 뉴클레오티드들 사이로 제한된다.
상기를 감안하여, 정해진 길이의 dsRNA의 줄기는 실제로 하나 이상의 미스매치 영역 또는 위치를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 제1 가닥 및 제2 가닥이 뉴클레오티드 30개의 영역 내의 1개 또는 2개의 미스매치를 제외하고는 뉴클레오티드 30개의 영역에 걸쳐 완벽한 상보성을 갖는 경우, 제1 가닥 및 제2 가닥이 뉴클레오티드 30개의 dsRNA의 줄기를 구성한다고 할 것이다.
dsRNA는 1개 이상의 줄기를 포함할 수 있다. 1개를 초과하는 줄기가 있는 경우, 이들은 연속적으로 또는 무리지어 배열되어 직렬이거나 중첩된 역위 반복물을 형성할 수 있고, 이는, 예를 들어, "망치머리", "역기" 또는 "개뼈"를 닮은 2-줄기 구조, 또는 "클로버잎"을 닮은 3개 이상의 줄기를 함유하는 구조, 또는 슈도노트(pseudoknot)-유사 형상의 구조를 닯은 dsRNA 구조를 형성한다. 임의의 이러한 구축물은 이중-가닥 줄기의 내부에서 (예를 들어, 다수의 안티-센스 또는 센스 뉴클레오티드 서열 분절 사이의 스페이서로서 또는 염기 쌍을 형성하는 안티-센스 뉴클레오티드 서열 분절과 센스 뉴클레오티드 서열 분절 사이의 스페이서로서) 또는 이중-가닥 줄기의 외부에서 (예를 들어, 한 쌍의 역위 반복물을 분리하는, 센스 또는 안티-센스 또는 관련되지 않은 RNA 서열의 루프 영역으로서) 발견되는 스페이서 분절을 추가로 포함할 수 있다. 염기 쌍을 형성하는 안티-센스 및 센스 뉴클레오티드 서열 분절이 길이가 다른 경우, 더 긴 분절이 스페이서로서 작용할 수 있다.
dsRNA는 단일 가닥의 RNA가 줄기 구조를 형성할 수 있게 하는 역위 반복 서열이 있는 단일 가닥의 RNA로부터 발생할 수 있다. 대안적으로, dsRNA는 dsRNA 분자의 줄기를 형성하도록 정렬되어 서로 염기 쌍을 형성하는 2개 이상의 RNA 분자로부터 발생할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 한 실시양태에서, dsRNA로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 것은 dsRNA의 길이, 특히 dsRNA의 줄기의 길이이다. 전형적으로, dsRNA의 줄기는 길이가 뉴클레오티드 30개 이상이다. 뉴클레오티드 30개보다 짧은 길이에서는, 해충 생물의 RNA 중합효소 III 시스템이 dsRNA로부터 siRNA를 생성시킬 수 있는 정도가 제한될 수 있다. 다양한 실시양태에서, dsRNA의 줄기는 적어도 약 50개, 적어도 약 75개, 적어도 약 100개, 적어도 약 150개, 적어도 약 200개, 적어도 약 250개, 적어도 약 300개, 또는 이를 초과하는 개수의 염기 쌍으로 이루어질 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, dsRNA는 적어도 약 100개의 염기 쌍을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, dsRNA의 줄기는 적어도 약 250개의 염기 쌍, 또는 이를 초과하는 개수, 예를 들어, 500 또는 1000개의 염기 쌍을 포함한다.
dsRNA는 코딩 영역에 의해 코딩된다. 코딩 영역은 외인성 핵산 서열이다. 일부 실시양태에서, 코딩 영역은 트랜스진을 코딩할 수 있다. 일부 예에서, 트랜스진은 표적 유전자 서열을 포함하는 생물에서 발견되는 핵산 분자에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 dsRNA 분자의 한쪽 또는 양쪽 가닥을 코딩하는 서열일 수 있다. 추가적인 예에서, 트랜스진은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-내성 유전자), 질환의 작용 메커니즘에 관련된 바이오마커를 코딩하는 유전자, 제약상 유용한 화합물, 또는 원하는 농업 형질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
이러한 예 및 기타 예에서, 트랜스진은 트랜스진의 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)를 함유할 수 있다. 하기에서 예가 추가로 기술된다.
일부 실시양태에서, 코딩 영역은 본질적으로 단일한 이중-가닥 RNA를 코딩할 수 있고, 표적 유전자의 적어도 하나의 분절에 대해 안티-센스인 다수의 연속적인 안티-센스 뉴클레오티드 서열 분절, 및 표적 유전자의 적어도 하나의 분절에 대해 센스인 다수의 연속적인 센스 뉴클레오티드 서열 분절을 포함한다; 다수의 연속적인 안티-센스 분절 및 다수의 연속적인 센스 분절은 단일한 이중-가닥 RNA 줄기, 또는 (다수의 이중-가닥 줄기를 분리하는, 염기 쌍을 형성하지 않은 스페이서 DNA의 존재 또는 부재 하에) 연속적으로 배열된 다수의 이중-가닥 줄기를 형성할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 코딩 영역은 RNA의 다수의 dsRNA 줄기를 코딩하고, 표적 유전자의 적어도 하나의 분절에 대해 안티-센스인 다수의 안티-센스 뉴클레오티드 서열 분절, 및 표적 유전자의 적어도 하나의 분절에 대해 센스인 다수의 센스 뉴클레오티드 서열 분절을 포함하며, 이때 상기 다수의 안티-센스 뉴클레오티드 서열 분절 및 다수의 센스 뉴클레오티드 서열 분절이 일련의 이중-가닥 줄기 내에 배열된다.
특정 실시양태에서, dsRNA는 dsRNA 및 hpRNA 중 하나 또는 양쪽 모두를 지칭할 수 있다.
코딩 영역에 의해 코딩되는 dsRNA 분자는 관다발 식물의 특정 해충 또는 병원체를 표적화하는 siRNA 분자의 생산을 가능하게 하는 서열을 가질 수 있다. 그러므로, 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 표적 생물의 표적 유전자에 대해 상보적일 것이고, 숙주 식물의 뉴클레오티드 서열에 상응하지 않을 것이다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - dsRNA 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- 코딩 영역이 식물의 게놈에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
전형적으로, 코딩 영역은 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 바람직한 표적 유전자는 관련 해충의 생존에 필수적인 유전자이다. 해충은 식물, 동물, 세균, 바이러스 또는 진균 계의 것일 수 있다. 이러한 실시양태에서, dsRNA는 표적 유전자의 mRNA를 절단하거나 또는 이의 번역을 억제하는 siRNA 분자의 생산을 가능하게 한다. 해충 및 표적 유전자의 예는 하기와 같다:
Figure pct00001
딱정벌레목 해충, 예를 들어 디아브로티카 비르기페라 비르기페라 르콩트(Diabrotica virgifera virgifera LeConte) (서부 옥수수 뿌리벌레, "WCR"), 디아브로티카 바르베리 스미스 앤드 로렌스(Diabrotica barberi Smith and Lawrence) (북부 옥수수 뿌리벌레, "NCR"), 디아브로티카 운데심푼크타타 호와르디 바버(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber) (남부 옥수수 뿌리벌레, "SCR"), 디아브로티카 비르기페라 제아에 크리산 앤드 스미스(Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith) (멕시코 옥수수 뿌리벌레, "MCR"), 디아브로티카 발테아타 르콩트(Diabrotica balteata LeConte); 디아브로티카 운데심푼크타타 테넬라(Diabrotica undecimpunctata tenella), 디. 스페시오사 게르마르(D. speciosa Germar), 및 디아브로티카 운데심푼크타타 운데심푼크타타 만네르헤임(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata Mannerheim);
Figure pct00002
노린재목 해충, 예를 들어, 유쉬스투스 헤로스(Euschistus heros) (파브르(Fabr.)) (신열대 갈색 노린재, "BSB"), 네자라 비리둘라(Nezara viridula) (L.) (남부 녹색 노린재), 피에조도루스 구일디니이(Piezodorus guildinii) (웨스트우드(Westwood)) (적색띠 노린재), 할리모르파 할리스(Halyomorpha halys) (스탈(Stal)) (갈색 대리석무늬 노린재), 치나비아 힐라레(Chinavia hilare) (세이(Say)) (녹색 노린재), 유쉬스투스 세르부스(Euschistus servus) (세이) (갈색 노린재), 디켈롭스 멜라칸투스(Dichelops melacanthus) (달라스(Dallas)), 디켈롭스 푸르카투스(Dichelops furcatus) (F.), 에데사 메디타분다(Edessa meditabunda) (F.), 티안타 페르디토르(Thyanta perditor) (F.) (신열대 적색 어깨 노린재), 치나비아 마르기나툼(Chinavia marginatum) (팔리소 드 보부아(Palisot de Beauvois)), 호르시아스 노빌레루스(Horcias nobilellus) (베르그(Berg)) (목화 벌레), 타에디아 스티그모사(Taedia stigmosa) (베르그), 디스데르쿠스 페루비아누스(Dysdercus peruvianus) (구에린-메네빌(Guerin-Meneville)), 네오메갈로토무스 파르부스(Neomegalotomus parvus) (웨스트우드), 렙토글로수스 조나투스(Leptoglossus zonatus) (달라스), 니에스트레아 시다에(Niesthrea sidae) (F.), 리구스 헤스페루스(Lygus hesperus) (나이트(Knight)) (서부 장님노린재(Western Tarnished Plant Bug)), 및 리구스 리네올라리스(Lygus lineolaris) (팔리소 드 보부아);
Figure pct00003
나비목 해충, 예를 들어, 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis) (유럽 옥수수 천공충), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (가을 거염벌레), 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) (사탕무 거염벌레), 스포도프테라 오르니토갈리(Spodoptera ornithogalli) (황색줄무늬 거염벌레), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) (옥수수 이삭벌레), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon) (검거세미), 헬리코베르파 아르미게라 (목화 다래벌레), 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis) (사탕수수 천공충), 디아트라에아 그란디오셀라(Diatraea grandiosella) (북서부 옥수수 천공충), 엘라스모팔푸스 리그노셀루스(Elasmopalpus lignosellus) (작은 옥수수줄기 천공충), 파파이페마 네브리스(Papaipema nebris) (줄기 천공충), 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella) (분홍색 다래벌레), 플라티페나 스카브라(Plathypena scabra) (녹색 클로버벌레), 콜리아스 에우리테메(Colias eurytheme) (알팔파 모충), 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) (벨벳콩 모충), 슈도플루시아 인클루덴스(Pseudoplusia includens) (대두 자벌레), 플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella) (배추좀나방), 아그로미자 파르비코르니스(Agromyza parvicornis) (옥수수 얼룩 잠엽충), 아코로이아 그리셀라(Achoroia grisella), 아클레리스 글로베라나(Acleris gloverana), 아클레리스 바리아나(Acleris variana), 아독소파이에스 오라나(Adoxophyes orana), 알라바마 아르길라세아(Alabama argillacea), 알소필라 포메타리아(Alsophila pometaria), 아미엘로이스 트란시텔라(Amyelois transitella), 아나가스타 쿠에니엘라(Anagasta kuehniella), 아나르시아 리네아텔라(Anarsia lineatella), 아니소타 세나토리아(Anisota senatoria), 안테라에아 페르니이(Antheraea pernyi), 아르칩스(Archips) 종, 아르기로타에니아(Argyrotaenia) 종, 아테티스 민다라(Athetis mindara), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 부쿨라트릭스 투르베리엘라(Bucculatrix thurberiella), 카드라 카우텔라(Cadra cautella), 코리스토네우라(Choristoneura) 종, 코킬스 호스페스(Cochylls hospes), 코르시라 세팔로니카(Corcyra cephalonica), 시디아 라티페레아누스(Cydia latiferreanus), 시디아 포모넬라(Cydia pomonella), 다타나 인테게리마(Datana integerrima), 덴드롤리무스 시베리쿠스(Dendrolimus sibericus), 데스미아 페네랄리스(Desmia feneralis), 디아파니아 히알리나타(Diaphania hyalinata), 디아파니아 니티달리스(Diaphania nitidalis), 엔노모스 서브시그나리아(Ennomos subsignaria), 에오레우마 로프티니(Eoreuma loftini), 에스페스티아 엘루텔라(Esphestia elutella), 에란니스 틸라리아(Erannis tilaria), 에스티그메네 아크레아(Estigmene acrea), 율리아 살루브리콜라(Eulia salubricola), 유포코엘리아 암비구엘라(Eupocoellia ambiguella), 유포에실리아 암비구엘라(Eupoecilia ambiguella), 유프록티스 크리소로에아(Euproctis chrysorrhoea), 육소아 메소리아(Euxoa messoria), 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella), 그라폴리타 몰레스타(Grapholita molesta), 하리시나 아메리카나(Harrisina americana), 헬리코베르파 서브플렉사(Helicoverpa subflexa), 헤밀레우카 올리비아에(Hemileuca oliviae), 호모에오소마 엘렉텔룸(Homoeosoma electellum), 히판티아 쿠네아(Hyphantia cunea), 케이페리아 리코페르시셀라(Keiferia lycopersicella), 람브디나 피셀라리아 피셀라리아(Lambdina fiscellaria fiscellaria), 람브디나 피셀라리아 루구브로사(Lambdina fiscellaria lugubrosa), 류코마 살리시스(Leucoma salicis), 로베시아 보트라나(Lobesia botrana), 록소스테게 스틱티칼리스(Loxostege sticticalis), 리만트리아 디스파르(Lymantria dispar), 마칼라 티리살리스(Macalla thyrisalis), 말라코소마(Malacosoma) 종, 마메스트라 브라시카에(Mamestra brassicae), 마메스트라 콘피구라타(Mamestra configurata), 만두카 퀸퀘마쿨라타(Manduca quinquemaculata), 만두카 섹스타(Manduca sexta), 마루카 테스툴라리스(Maruca testulalis), 멜란크라 픽타(Melanchra picta), 오페로프테라 브루마타(Operophtera brumata), 오르기이아(Orgyia) 종, 팔레아크리타 베르나타(Paleacrita vernata), 파필리오 크레스폰테스(Papilio cresphontes), 프리가니디아 칼리포르니카(Phryganidia californica), 필로노릭테르 블란카르델라(Phyllonorycter blancardella), 피에리스 나피(Pieris napi), 피에리스 라파에(Pieris rapae), 플라티노타 플로우엔다나(Platynota flouendana), 플라티노타 스툴타나(Platynota stultana), 플라티프틸리아 카르두이닥틸라(Platyptilia carduidactyla), 플로디아 인테르푼크텔라(Plodia interpunctella), 폰티아 프로토디세(Pontia protodice), 슈달레티아 우니푼크타(Pseudaletia unipuncta), 사불로데스 아에그로타타(Sabulodes aegrotata), 스키주라 콘신나(Schizura concinna), 시토트로가 세레알렐라(Sitotroga cerealella), 스필론타 오셀라나(Spilonta ocellana), 타우른스토포에아 피티오캄파(Thaurnstopoea pityocampa), 엔솔라 비셀리엘라(Ensola bisselliella), 트리코플루시아 히(Trichoplusia hi), 우데아 루비갈리스(Udea rubigalis), 크실로미게스 쿠리알리스(Xylomyges curiails), 이포노메우타 파델라(Yponomeuta padella), 및 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens) (담배 싹벌레); 및
Figure pct00004
선충류 해충, 예를 들어, 아펠렌코이데스(Aphelenchoides) 종, 벨로놀라이무스(Belonolaimus) 종, 크리코네멜라(Criconemella) 종, 디틸렌쿠스(Ditylenchus) 종, 글로보데라(Globodera) 종, 헤테로데라(Heterodera) 종, 히르쉬만니엘라(Hirschmanniella) 종, 호플로라이무스(Hoplolaimus) 종, 멜로이도기네(Meloidogyne) 종, 프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종 및 라도폴루스(Radopholus) 종, 특정 종의 비-포괄적 목록은 디로필라리아 이미티스(Dirofilaria immitis), 글로보데라 팔리다(Globodera pallida), 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines), 헤테로데라 제아에(Heterodera zeae), 멜로이도기네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도기네 자바니카(Meloidogyne javanica), 온코세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus), 프라틸렌쿠스 페네트란스(Pratylenchus penetrans), 라도폴루스 시밀리스(Radopholus similis), 및 로틸렌쿨루스 레니포르미스(Rotylenchulus reniformis)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 예에서, Caf1-180 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174258), VatpaseC (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174259), Rho1 (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0174260), VatpaseH (미국 특허 출원 공개 번호 2012/0198586), PPI-87B (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091600), RPA70 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0091601), RPS6 (미국 특허 출원 공개 번호 2013/0097730), ROP (미국 특허 출원 공개 번호 14/577811), RNAPII (미국 특허 출원 공개 번호 14/577854), 및/또는 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0164205, 2011/0054007, 및 2009/0265818, 미국 특허 번호 6,326,193, 유럽 특허 출원 번호 EP1210875 및 EP2633048, 및 PCT 국제 특허 출원 번호 WO2011153418, WO2007080126, WO2012143542, WO2005110068, 및 WO2006047495에 개시된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 딱정벌레목, 노린재목, 및/또는 나비목 해충, 또는 곤충 해충 이외의 생물 (예를 들어, 식물-기생 선충류) 내의 하나 이상의 천연 핵산 서열의 적어도 일부분에 대해 상동성일 수 있거나, 또는 딱정벌레목, 노린재목, 및/또는 나비목 해충, 또는 곤충 해충 이외의 생물 (예를 들어, 식물-기생 선충류, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0188438, 2006/0080749, 2009/0300796, 및 PCT 국제 특허 출원 번호 WO2003052110, WO2004066183, WO2004005485, WO2005019408, WO2006046148, WO2007087153, WO2007095496, 및 WO2009133126에 개시된 것) 내의 유전자를 표적화하는 dsRNA 분자가 이로부터 전사되는 트랜스제닉 이벤트일 수 있는 예시적인 핵산 분자가 개시된다.
특정 실시양태에서, 핵산 구축물은 dsRNA를 코딩하기 위한 1개를 초과하는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 구축물은 제1 곤충 표적 유전자에 대한 제1 dsRNA를 코딩하기 위한 제1 코딩 영역, 및 곤충 표적 유전자에 대한 추가적인 dsRNA를 코딩하기 위한 추가적인 코딩 영역을 포함할 수 있다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 색소체 또는 엽록체는 1개를 초과하는 유형의 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 색소체 또는 엽록체는 하기를 포함할 수 있다:
- 제1 곤충 표적 유전자에 대한 제1 dsRNA를 코딩하기 위한 제1 코딩 영역을 포함하는 제1 핵산 구축물;
- 곤충 표적 유전자에 대한 추가적인 dsRNA를 코딩하기 위한 추가적인 코딩 영역을 포함하는 추가적인 핵산 구축물.
제1 코딩 영역 및 추가적인 코딩 영역, 및 각각으로부터 생산된 dsRNA는 동일하거나 상이할 수 있다.
추가로, 제1 코딩 영역 및 추가적인 코딩 영역은 동일한 프로모터 또는 조절 서열 또는 상이한 프로모터 또는 조절 서열의 제어 하에 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 코딩 영역은 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고, 추가적인 코딩 영역은 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
다른 실시양태에서, 제1 코딩 영역 및 추가적인 코딩 영역 양쪽 모두가 구성적 프로모터의 제어 하에 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 엽록체 및 색소체에서의 dsRNA 발현에 유용한 특정 프로모터의 예가 하기에서 기술된다.
침묵화 효과가 있을 것으로 예상되는 최소 인식도는 뉴클레오티드 19개의 연속 서열 블록 내에 완벽하게 동일한 16개 이상을 초과하는 뉴클레오티드의 블록을 1개 이상 공유하는 표적 mRNA 내의 서열과 헤어핀의 줄기 내의 서열 사이에 있을 것일 것이다.
다른 실시양태에서, 표적 유전자는 유전자 침묵화 또는 RNAi가 요구되는 유전자이다. 이같은 유전자는 질환 병리에서 발현되는 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 유전자는 산업 공정에서 발현되는 것일 수 있다.
dsRNA 분자가 관다발 식물의 세포질 내에 제공되었을 때 (핵 내에서의 DNA 구축물의 발현을 통해 또는 다른 방식으로), dsRNA 분자가 세포질 내의 다이서 효소에 의해 인식되고, siRNA로 프로세싱되는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명가들은 동일한 식물의 색소체 내에 제공된 dsRNA는 동일한 프로세싱의 대상이 아니라는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따라 생산된 dsRNA 분자는 siRNA로 프로세싱되지 않고, 색소체는 dsRNA 분자 서열로부터 유래된 siRNA 분자를 포함하지 않는다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- 색소체가 dsRNA의 서열을 포함하는 siRNA 분자를 실질적으로 포함하지 않는,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
일반적으로 색소체는 dsRNA의 서열을 포함하는 siRNA 분자를 함유하지 않지만, 일부 실시양태에서, 색소체가 RNA 파괴 또는 이화로부터 발생한 분해 생성물을 함유할 수 있고, 다르게는 특정 siRNA를 색소체에서의 dsRNA 생산 또는 축적과 관련이 없는 양으로 함유할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
관다발 식물의 색소체가 공지된 세포질 RNase III ("다이서") 효소의 상동체를 포함할 수 있는 것으로 추측되었다. 또한, 엽록체 RNA가 종종 유의한 RNA 편집의 대상이 되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 관다발 식물의 색소체 내에 제공된 dsRNA가 DNA 구축물에 의해 코딩되는 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 모두 유지할 것인지 여부가 지금까지 알려지지 않았다. 본 발명가들은 고등 식물 엽록체가 표적 유전자에 대한 코딩 영역으로부터 전사된 dsRNA를 실질적으로 편집하지 않거나 또는 코딩 영역으로부터 전사된 dsRNA의 실질적인 말단절단 또는 스플라이싱이 없다는 것을 뜻밖에 발견하였다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 색소체가
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물;
- dsRNA
를 포함하고,
- dsRNA가 코딩 영역에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 모두 함유하는,
관다발 식물의 색소체가 제공된다.
일반적으로 dsRNA는 줄기 구조 형성에 필요한 dsRNA의 영역을 제거할 전사-후 변형을 겪지 않았다는 점에서 프로세싱되지 않는다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 5' 또는 3' 비번역 영역 또는 폴리 A 꼬리를 제거하도록 변형되었다. 일부 실시양태에서, dsRNA는 비-상보성 영역 예컨대 RNA 헤어핀에서와 같이 루프 구조를 형성하는 것으로 관찰되는 것을 제거하도록 변형되었다.
본 발명은 트랜스킹덤 RNAi 용도에서 사용하기 위한 높은 수준의 dsRNA 분자를 제공하는 것에서 특히 유용하다. 앞서 논의된 바와 같이, 트랜스킹덤 RNAi가 성공적이기 위해, 다량의 dsRNA가 표적 생물에 제공되어야 하는 것으로 현재 인정된다. 본 발명의 한가지 특히 중요한 발견은 색소체에서 생산된 dsRNA가 색소체로부터 시토졸 내로 통과할 수 없다는 것이다. 이는 2가지 측면에서 중요하다. 첫째, 색소체 내에 잔존함으로써, dsRNA가 색소체 내에 다량으로 축적될 수 있다. 둘째, 색소체에 의해 시토졸과의 상호작용으로부터 보호됨으로써, dsRNA가 궁극적으로 색소체에서 생산된 dsRNA에 영향을 미칠 수 있거나 또는 다르게는 식물 성장 및 생산에 영향을 미칠 수 있는 시토졸 RNAi를 유도할 수 없다. 실제로, 색소체는 다른 경우에는 RNAi를 유도할 상황에서 dsRNA 생산을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명에 따르면, dsRNA가 색소체로부터 시토졸 내로 나가는 것이 방지되고, 따라서 시토졸에서 RNAi를 유도하는 것이 방지되도록, dsRNA가 관다발 식물의 색소체에 축적되고 색소체에 의해 유지되는 것으로 이해될 것이다.
상기 기술된 실시양태들에서, 색소체는 엽록체, 유색체, 백색체, 또는 전색소체(proplastid)일 수 있다. 전형적으로, 색소체는 엽록체이다. 미토콘드리아는 본 발명에 따른 핵산 구축물을 또한 포함할 수 있는 비-색소체 소기관이다.
추가적인 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 색소체 또는 엽록체에 의해 생산된 경우의 dsRNA가 제공된다.
B. 핵산 구축물
한 실시양태에서, 본 발명은
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- 색소체에서의 dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
를 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물을 제공한다.
구체적으로, 구축물은 식물의 색소체 내로 형질전환될 수 있다. 구축물은, RNA로 발현되면, 또 다른 생물에서 표적 유전자 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 dsRNA 분자를 형성하거나 생산하는 코딩 영역을 포함한다. 발현을 개시시키거나 강화하기 위해, 이같은 핵산 구축물은 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있고, 이러한 조절 서열은 dsRNA로 발현될 수 있는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다수의 실시양태에서, 전사된 dsRNA 분자는 안정화된 형태로, 예를 들어, 헤어핀 및 줄기 및 루프 구조로서 제공될 수 있다.
dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 구축물은 적어도 1개의 프로모터에 대해 1개의 뉴클레오티드 서열은 센스 배향이고 다른 뉴클레오티드 서열은 안티센스 배향이도록 배열된, 적어도 2개의, 코딩 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 센스 뉴클레오티드 서열 및 안티센스 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 약 다섯개 (~ 5개) 내지 약 천개 (1000개)의 스페이서 서열에 의해 연결 또는 결합된다. 스페이서 서열은 센스 서열과 안티센스 서열 사이에서 루프를 형성할 수 있다. 센스 뉴클레오티드 서열 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 또는 이의 단편의 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상동성일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 핵산 구축물 분자는 스페이서 서열 없이 dsRNA 분자를 코딩할 수 있다. 실시양태에서, 센스 코딩 서열 및 안티센스 코딩 서열은 길이가 상이할 수 있다.
트랜스킹덤 RNAi를 용이하게 하는데 유용한 것으로 확인된 서열은 발현된 dsRNA 분자 내로 본 발명의 핵산 구축물 내의 적합한 발현 카세트의 생성을 통해 쉽게 혼입될 수 있다. 예를 들어, 이같은 서열은 표적 유전자 서열에 상응하는 제1 분절을 취하고, 이러한 서열을 제1 분절에 대해 상동성이거나 상보적이지 않은 스페이서 영역인 제2 분절에 연결시키고, 이를 적어도 일부분이 제1 분절에 대해 실질적으로 상보적인 제3 분절에 연결시킴으로써 줄기 및 루프 구조의 헤어핀으로서 발현될 수 있다. 이같은 구축물은 제1 분절과 제3 분절의 혼성화에 의해 줄기 및 루프 구조를 형성하고, 이때 제2 분절을 포함하는 루프 구조가 형성된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2002/0048814 및 US 2003/0018993; 및 국제 PCT 공개 번호 WO94/01550 및 WO98/05770을 참조한다.
한 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 스페이서 서열은 인트론의 서열, 특히 엽록체 또는 색소체 게놈의 유전자의 인트론의 서열을 포함할 수 있다. 예가 표 1에서 제시된다.
<표 1>
육상 식물 엽록체의 단백질-코딩 유전자 내에 존재하는 인트론
Figure pct00005
문헌 [Introns in chloroplast protein-coding genes of land plants. AINE L. PLANT & JOHN C. GRAY Photosynthesis Research 16:23-39 (1988)]
엽록체 또는 색소체가 곤충 RNAi와 연관된 곤충 다이서 및 관련 효소에 대한 더 양호한 기질일 수 있는 더 작은 루프가 있는 헤어핀 RNA을 생산하는 것을 가능하게 할 수 있기 때문에 엽록체 또는 색소체에 의해 프로세싱되는 엽록체 또는 색소체 인트론은 본 발명의 특정 실시양태에서 특별한 장점이 있을 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 스페이서 서열은 색소체의 1차 RNA 전사체로부터의 인트론의 스플라이싱을 위한 컨센서스(consensus) 스플라이스 신호의 서열을 가질 수 있다. 이러한 실시양태에서, 컨센서스 스플라이스 신호는 자신은 엽록체 인트론의 서열을 갖지 않는 스페이서 서열의 측면에 있을 수 있다.
본 발명의 실시양태는 하나 이상의 dsRNA 분자의 항정 상태 수준의 발현을 달성하기 위한 색소체 내로의 본 발명의 구축물의 도입 (즉, 형질전환)을 포함한다. 핵산 구축물은, 예를 들어, 벡터, 예컨대 선형 또는 폐환형 플라스미드일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주의 색소체 게놈 내로 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 추가적으로, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 발명의 코딩 영역은, 예를 들어, 하나 이상의 숙주에서 연결된 코딩 서열 또는 기타 DNA 서열의 발현을 구동시키는 기능을 하는 적절한 프로모터의 제어 하에 벡터 내로 적절하게 삽입될 수 있다. 다수의 벡터가 이러한 목적을 위해 이용가능하고, 적합한 벡터의 선택은 주로 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기 및 벡터로 형질전환될 특정 색소체에 좌우될 것이다. 각각의 벡터는 이의 기능 (예를 들어, DNA 증폭 또는 DNA 발현) 및 이와 상용성인 특정 숙주 세포 또는 아세포성 소기관에 따라 다양한 성분을 함유한다.
벡터는, 예를 들어, 형질전환된 세포가 생산되도록, 세포 내로 도입된 핵산 분자이다. 벡터는 숙주 세포 내에서 벡터가 복제되게 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터의 예는 외인성 DNA를 세포 내로 전달하는 플라스미드; 코스미드; 박테리오파지; 또는 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 하나 이상의 유전자, 안티센스 서열, 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 관련 기술 분야에 공지된 기타 유전 요소를 또한 포함할 수 있다. 벡터는 세포에 형질도입되거나, 세포를 형질전환시키거나 또는 세포를 감염시킴으로써, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하게 한다. 벡터는 세포 내로의 핵산 분자의 진입을 달성하는 것을 보조하는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코팅 등)을 임의적으로 포함할 수 있다.
벡터는 벡터가 숙주 세포의 색소체 내에서 복제되게 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 서열은 벡터가 숙주 세포의 색소체에서 복제될 수 있게 하지만, 숙주 세포의 시토졸 또는 핵에서는 그렇지 않도록 한다.
한 실시양태에서, 핵산 구축물은 자신이 포함하는 트랜스진의 숙주 세포의 색소체 게놈 내로의 통합을 허용하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 트랜스진이 핵 게놈보다는 선택적으로 또는 적어도 우선적으로 색소체 게놈 내로 통합되도록 핵산 구축물이 개조된다. 따라서, 한 실시양태에서, 핵산 구축물은 숙주 세포의 색소체의 게놈 내로의 통합을 가능하게 하지만 숙주 세포의 핵의 게놈 내로는 그렇지 않은 서열을 함유한다. 통합 영역의 예는 trnV-3' - rps12, trnI - trnA, 및 trnfM - trnG이다. 구체적인 통합 부위의 예는 trnH/pbA, trnG/trnfM, ycf3/trnS, rbcL/accD, petA/psbJ, 5'rps12/clpP, petD/rpoA, ndhB/rps7, 3'rps12/trnV, trnV/rrn16, rrn16/trnI, trnI/trnA, trnN/trnR, 및 rpl32/trnL이다.
색소체에서의 dsRNA 분자의 발현 (즉, 전사)를 가능하게 하기 위해, 핵산 구축물은 하나 이상의 조절 서열, 예컨대 핵산 구축물이 발현될 색소체에서 기능하는 이종성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된, dsRNA 분자를 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계에 있을 때 제1 뉴클레오티드 서열이 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합에 의해 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열들은 일반적으로 연속적이고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는, 동일한 리딩 프레임 (예를 들어, 폴리시스트론 ORF) 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결되기 위해 핵산들이 연속적일 필요는 없다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는, 조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용되었을 때, 연결된 코딩 서열의 발현에 조절 서열이 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열" 또는 "제어 요소"는 회합된 코딩 서열의 전사의 시기 및 수준/양, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 인핸서; 줄기-루프 구조물; 억제인자 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 여기에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적인 가닥 상에 위치할 수 있다.
본원에서 사용된 경우에, "프로모터"라는 용어는 전사 시작점의 상류일 수 있고 전사를 개시시키기 위한 RNA 중합효소 및 기타 단백질의 인식 및 결합에서 수반될 수 있는 DNA 영역을 지칭한다. 프로모터는 세포 내에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 프로모터는 세포 내에서의 발현을 위한 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시시킬 수 있는 프로모터일 수 있다. 발생적 제어 하의 프로모터의 예는 특정 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 씨, 수염뿌리, 물관부 도관, 가도관, 또는 후막 조직에서 우선적으로 전사를 개시시키는 프로모터를 포함한다. 이같은 프로모터들은 "조직-선호형"으로 지칭된다. 특정 조직에서만 전사를 개시시키는 프로모터는 "조직-특이적"으로 지칭된다.
"세포 유형-특이적" 프로모터는 하나 이상의 기관 내의 특정 세포 유형, 예를 들어, 뿌리 또는 잎 내의 도관 세포에서의 발현을 주로 구동시킨다. 특정 아세포성 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 또는 기타 색소체)에서만 전사를 개시시키는 프로모터는 경우에 따라 "색소체-특이적", "엽록체-특이적" 또는 "미토콘드리아-특이적"으로 지칭된다. 일부 프로모터는 1개를 초과하는 아세포성 위치에서 전사를 개시시킬 수 있다는 것이 이해될 것이다.
한 특히 바람직한 실시양태에서, 핵산 구축물은 색소체에서 작동가능한 프로모터 또는 조절 요소를 함유하고, 숙주 세포의 핵 또는 시토졸 또는 기타 소기관에서 작동가능한 프로모터 또는 조절 요소를 함유하지 않는다.
"유도성" 프로모터는 환경적인 제어 하에 있을 수 있는 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터에 의해 전사를 개시시킬 수 있는 환경적 조건의 예는 혐기성 조건 및 빛의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호형, 세포 유형 특이적, 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터 클래스를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에 또는 대부분의 세포 또는 조직 유형에서 활성일 수 있는 프로모터이다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명의 일부 실시양태에서 사용될 수 있다. 문헌 [Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366]을 참조한다. 유도성 프로모터로, 유도제에 반응하여 전사 속도가 증가된다. 예시적인 유도성 프로모터는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터; 벤젠술폰아미드 제초제 독성 완화제에 반응하는 옥수수로부터의 In2 유전자; Tn10으로부터의 Tet 억제인자; 및 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도될 수 있는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터 (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 구성적 프로모터는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 35S 프로모터; 벼 액틴 유전자로부터의 프로모터; 유비퀴틴 프로모터; pEMU; MAS; 옥수수 H3 히스톤 프로모터; 및 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자에 대해 5'인 XbaI/NcoI 단편인 ALS 프로모터 (또는 상기 XbaI NcoI 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열) (국제 PCT 공개 번호 WO 96/30530)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가적으로, 임의의 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터가 본 발명의 일부 실시양태에서 사용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자로 형질전환된 식물은 특정 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 코딩 서열의 생성물을 생산할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터는 뿌리-선호형 프로모터, 예컨대 파세올린 유전자로부터의 것; 잎-특이적 및 광-유도형 프로모터 예컨대 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것; 꽃밥-특이적 프로모터 예컨대 LAT52로부터의 것; 꽃가루-특이적 프로모터 예컨대 ZmJ3으로부터의 것; 및 소포자-선호형 프로모터 예컨대 apg로부터의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구축물에서 사용하기에 적절한 프로모터는 유도성, 바이러스성, 합성 또는 구성적 프로모터인 것들을 포함하고, 이들 모두 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 이같은 프로모터를 기술하는 비제한적인 예는 미국 특허 번호 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196 (35S 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 출원 일련 번호 09/757,089 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)를 포함한다. 추가적인 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9) 및 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (양쪽 모두 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도 플라스미드 상에서 운반됨); 콜리모바이러스 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 피그워트(figwort) 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); 엽록소 a/b 결합 단백질 유전자 프로모터; CaMV35S (미국 특허 번호 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 번호 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (진뱅크 등록 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73]; [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구축물은 조직-특이적 프로모터, 예컨대 뿌리-특이적 프로모터를 포함한다. 뿌리-특이적 프로모터는 작동가능하게 연결된 서열의 발현을 뿌리 조직에서 배타적으로 또는 우선적으로 구동시킨다. 뿌리-특이적 프로모터의 예가 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,110,732; 5,459,252 및 5,837,848; 및 문헌 [Opperman et al. (1994) Science 263:221-3]; 및 [Hirel et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18]을 참조한다. 일부 실시양태에서, dsRNA 분자를 코딩하는 영역이 2개의 뿌리-특이적 프로모터 사이에 클로닝될 수 있고, 이들은 트랜스제닉 식물 세포 및/또는 색소체에서 dsRNA 분자가 생산되도록 트랜스제닉 식물 세포에서 작동가능하고 이러한 세포에서 발현된다.
임의적으로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가적인 조절 서열은 번역 리더 서열로서 기능하는, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 5' UTR을 포함한다. 번역 리더 서열은 완전히 프로세싱된 mRNA 내에 존재하고, 1차 전사체의 프로세싱 및/또는 RNA 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 충격 단백질 리더 (미국 특허 번호 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5' UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 번호 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 번호 5,362,865); AtAntl; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크 등록 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터 영역은 엽록체 유전자, 예컨대 시금치 또는 완두콩으로부터의 psbA 유전자, 옥수수로부터의 rbcL 및 atpB 프로모터 영역, 및 rRNA 프로모터 (색소체 rrn 오페론으로부터의 것)로부터 유래된다. 프로모터의 예가 문헌 [Verma & Daniell (2007) Plant Physiol. 145: 1129-43]; [Rasala et al. (2011) Plant Biotech. J. 9: 674-83], [Hanley-Bowdoin and Chua, TIBS (1987) 12:67-70]; [Mullet et al., Plant Molec. Biol. (1985) 4:39-54]; [Hanley-Bowdoin (1986) 박사 논문, The Rockefeller University]; [Krebbers et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10:4985-5002]; [Zurawski et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:3251-3270]; 및 [Zurawski et al., Proc. Nat'l Acad Sci. U.S.A. (1982) 79:7699-7703]에 기술되어 있다. 기타 프로모터가 확인될 수 있고, 이렇게 확인된 프로모터의 상대적인 강도를 관심 프로모터를 프로모터가 없는 마커 유전자에 대해 5'에 놓고, 예를 들어 현재까지 확인된 가장 강한 엽록체 프로모터인 psbA 유전자로부터의 프로모터로부터 수득된 전사에 대해 상대적인 이의 유효성을 관찰하는 것에 의해 평가할 수 있다. 다양한 기술에 의해 코딩 영역 발현의 효율이 추가적으로 강화될 수 있다. 이는 관심 DNA 서열에 대해 5'으로 일렬로 삽입된 다중 프로모터, 예를 들어 이중 psbA 프로모터의 사용, 인핸서 서열 부가 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터 영역은 하기 표 2에 제시된 바와 같은 엽록체 유전자로부터 유래된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
대부분의 경우에, 엽록체에서 기능성인 프로모터는 유도성이기보다는 구성적이다. 그러나, 관심 dsRNA 분자의 유도성 발현을 제공하는 것을 원하는 경우, 조절가능한 프로모터 및/또는 전사 및/또는 번역 수준에서 조절을 제공하는 서열을 (3' 말단에) 함유하는 5' 비번역 영역 (5' UTR)이 제공될 수 있다. 전사 및 RNA 안정성이 엽록체 유전자 발현의 중요한 결정인자인 것으로 보인다. 예를 들어, 빛에 의해 발현이 조절가능한 유전자로부터의 5' 비번역 영역이 사용될 수 있다. 유사하게, 3' 역위 반복물 영역이 외래 유전자의 RNA를 안정화시키는데 사용될 수 있다. 조절가능한 유전자는 특정한 관심 자극에 반응하여 강화된 발현 또는 자극의 부재 하에서의 낮은 발현 또는 발현 부재에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 빛을 조사하는 동안은 발현 강화가 발생하는 반면, 무시할 수 있는 빛에서는 실질적으로 감소된 발현이 발생하거나 발현이 발생하지 않는 경우에 빛으로 조절가능한 유전자가 확인될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 5' UTR은 GGAGG, psbA, rbcL, atpB, Cry2A, 및 T7유전자10을 포함한다.
임의적으로 관심 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있는 추가적인 조절 서열은 3' 비번역 영역 (3'UTR), 3' 전사 종결 영역, 또는 폴리아데닐화 영역을 또한 포함한다. 이들은 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 유전 요소이고, 폴리아데닐화 신호 및/또는 전사 또는 mRNA 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 기타 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 식물에서 폴리아데닐화 신호는 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 부가하는 것을 야기하는 기능을 한다. 폴리아데닐화 서열은 다양한 식물 유전자로부터 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이다. 상이한 3' 비번역 영역들을 사용하는 예가 문헌 [Ingelbrecht et al, (1989) Plant Cell 1:671-80]에서 제공된다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 예는 피숨 사티붐 RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 AGRtu.nos (진뱅크 등록 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 3' UTR은 rps16, rbcL, psbA, 및 petD를 포함한다.
일부 실시양태에서, 형질전환 벡터는 1개를 초과하는 표적 서열에 대해 특이적으로 상보적인 서열을 함유할 수 있어서, 표적 생물의 하나 이상의 집단 또는 종의 세포에서 2개 이상의 유전자의 발현을 억제하기 위한 1개를 초과하는 dsRNA의 생산을 허용한다. 상이한 유전자들 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 분절들이 트랜스제닉 식물에서의 발현을 위해 단일한 복합 핵산 분자 내로 조합될 수 있다. 이같은 분절들은 연속적일 수 있거나 또는 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물 또는 벡터는 형질전환된 세포에 선별가능한 표현형을 부여하는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 마커는 살생물제 저항성, 항생제 저항성 (예를 들어, 카나마이신, 제네티신(Geneticin) (G418), 블레오마이신, 히드로마이신 등), 또는 제초제 내성 (예를 들어, 글리포세이트 등)을 코딩할 수 있다.
선별가능한 마커의 예는 카나마이신 저항성을 코딩하고 카나마이신, G418 등을 사용하여 선별될 수 있는 neo 유전자; 비알라포스 저항성을 코딩하는 bar 유전자; 글리포스페이트 내성을 코딩하는 돌연변이체 EPSP 신타제 유전자; 브로목시닐에 대한 저항성을 부여하는 니트릴라제 유전자; 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 유전자 (ALS); 및 메토트렉세이트 저항성 DHFR 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 앰피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 겐타마이신, 히그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리신, 퓨로마이신, 스펙티노마이신, 리팜피신, 스트렙토마이신 및 테트라시클린 등에 대한 저항성을 부여하는 다수의 선별가능한 마커가 이용가능하다. 이같은 선별가능한 마커의 예가, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708; 및 6,118,047에 예시되어 있다.
본 발명의 재조합 핵산 구축물 또는 벡터는 스크리닝이 가능한 마커를 또한 포함할 수 있다. 스크리닝이 가능한 마커는 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예시적인 스크리닝이 가능한 마커는 다양한 발색성 기질이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 β-글루쿠로니다제 또는 uidA 유전자 (GUS) (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium. P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); β-락타마제 유전자 (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); 다양한 발색성 기질 (예를 들어, 발색성 세팔로스포린인 PADAC)이 공지되어 있는 효소를 코딩하는 유전자; 루시페라제 유전자 (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); 발색성 카테콜을 전환시킬 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); 아밀라제 유전자 (Ikatu et al. (1990) Bio Technol. 8:241-2); 티로신을 DOPA 및 도파퀴논 (이는 차례로 멜라닌으로 축합됨)으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); 및 a-갈락토시다제를 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 구축물은 살곤충성 폴리펩티드의 생산을 위한 코딩 영역을 또한 포함할 수 있다.
살곤충성 폴리펩티드는 딱정벌레목, 나비목 또는 노린재목 해충에 대해 살곤충성일 수 있다.
살곤충성 폴리펩티드는 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)에서 발견되는 폴리펩티드의 서열을 갖는 것일 수 있다.
살곤충성 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis) 폴리펩티드는 Cry1 (예를 들어, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ca, Cry1Da), Cry2 (예를 들어, Cry2Ab), Cry3 (예를 들어, Cry3Bb; Cry3A), Cry6, Vip3 (예를 들어, Vip3Ab1), Cry34, Cry35, 및 이들의 변형물 (부가물 및 결실물을 포함하지만 이에 제한되지 않음)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. Bt의 확장성 목록이 http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html에서 유지되고 정기적으로 업데이트된다. 현재, 추가적인 Cyt 독소 및 식물성장 살곤충성 단백질(Vegetative Insecticidal Protein) (VIP) 독소 등과 함께, "Cry" 독소의 73개를 초과하는 주요 군 (Cry1-Cry73)이 있다. 각각의 숫자 군 중 다수에 대문자 하위군이 있고, 대문자 하위군에 소문자 하위군이 있다 (예를 들어, Cry1에 A-L이 있고, Cry1A에 a-i가 있다).
살곤충성 폴리펩티드는 PIP-1 폴리펩티드일 수 있다.
한 실시양태에서, 비. 투린기엔시스 살곤충성 폴리펩티드가 CPB (콜로라도 감자 딱정벌레), 옥수수 뿌리벌레, 또는 기타 곤충 해충에서의 필수 유전자에 대해 살곤충성인 dsRNA를 함유하는 구축물과 함께 사용될 수 있다. 이같은 표적 유전자는, 예를 들어, CPB에서의 ATPase 코딩 유전자를 포함한다. 기타 이같은 표적 유전자는, 예를 들어, 옥수수 뿌리벌레에서의 공포 ATPase, ARF-1, Act42A, CHD3, EF-1α, ROP, RNAPII, 및 TFIIB를 포함한다. 적절한 표적 유전자의 예는 WO2007035650에 개시된 바와 같은 공포 ATPase이다.
일부 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 재조합 핵산 구축물이 트랜스제닉 식물을 생성시키고 이종성 핵산을 식물 색소체에서 특이적으로 발현시켜 항정 상태 수준의 dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 구축물을 식물 형질전환 벡터, 구체적으로는 색소체 형질전환 벡터 내로 삽입하고, 이를 색소체 (예를 들어, 엽록체) 내로 도입하는 것에 의해, 식물 형질전환 벡터가 제조될 수 있다.
엽록체에서 발현 카세트를 함유하는 플라스미드의 복제를 수득하기를 원하는 경우, 임의의 엽록체 복제 기원이 발현 구축물에서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산 구축물이 이로부터 생산된 dsRNA가 숙주 세포 핵 또는 dsRNA로부터 siRNA가 생산될 수 있는 기타 숙주 세포 구획에서 발현되는 것을 방지하도록 개조된다. 이는 식물에서 유래된 siRNA 또는 회합된 아르고노트 단백질로 오염되지 않고, 따라서 강화된 살곤충 효능을 지니는 살곤충성 dsRNA를 함유하는 식물 물질의 생산을 가능하게 한다. 이러한 실시양태에 따라,
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- 색소체에서의 dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터로서, 바람직하게는 표 2에서 제시된 프로모터 또는 조절 요소로부터 선택된 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위로서, 바람직하게는 trnH/pbA, trnG/trnfM, ycf3/trnS, rbcL/accD, petA/psbJ, 5'rps12/clpP, petD/rpoA, ndhB/rps7, 3'rps12/trnV, trnV/rrn16, rrn16/trnI, trnI/trnA, trnN/trnR, 및 rpl32/trnL의 통합 부위 군으로부터 선택된 통합 부위
를 포함하는, 관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물이 제공된다.
이러한 실시양태에 따르면, 엽록체에서만 활성화되는 프로모터의 사용 및 엽록체 게놈 내로의 통합만 가능하게 하는 통합 부위의 사용은 관련된 트랜스진에 대한 dsRNA를 엽록체 외부에서 발현하는 식물의 형성을 방지하고, 관련된 트랜스진에 대한 siRNA를 발현하는 식물의 형성을 방지한다. 한가지 장점은 이러한 구축물을 사용함으로써 색소체 및 핵 형질전환체 양쪽 모두인 세포의 집단이 생성되지 않기 때문에 색소체 및 핵 형질전환체 양쪽 모두인 세포를 추가로 선별해야 하지 않으면서 엽록체 형질전환의 존재를 기초로 형질전환체를 선별할 수 있다는 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서,
- 스페이서 영역에 의해 분리된 제1 영역 및 제2 영역이 있는 RNA 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역으로, 제1 영역이 제2 영역에 대한 부분적인 또는 완전한 서열 상보성을 갖고, 스페이서가 표 1에 제시된 인트론의 서열과 동일하거나 상동성인 RNA 분자를 코딩하는 코딩 영역;
- 색소체에서의 RNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터로서, 바람직하게는 표 2에서 제시된 프로모터 또는 조절 요소로부터 선택된 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위로서, 바람직하게는 trnH/pbA, trnG/trnfM, ycf3/trnS, rbcL/accD, petA/psbJ, 5'rps12/clpP, petD/rpoA, ndhB/rps7, 3'rps12/trnV, trnV/rrn16, rrn16/trnI, trnI/trnA, trnN/trnR, 및 rpl32/trnL의 통합 부위 군으로부터 선택된 통합 부위
를 포함하는, 관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물이 제공된다.
C. 색소체 형질전환
임의의 다수의 방법에 의해 본 발명의 핵산 구축물이 관심 식물 세포 내로 형질전환될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 생물탄도(biolistic) 장치 (예를 들어, 문헌 [Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299-302]; 미국 특허 번호 4,945,050 참조); 전기천공 (Fromm et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824-5828); 레이저 빔, 전기천공, 미세주입, 또는 DNA를 엽록체 내로 도입할 수 있는 임의의 기타 방법의 사용을 포함한다. 이러한 기술의 사용은 광범위한 단자엽 및 쌍자엽 식물 세포 양쪽 모두에서 본원에 기술된 본 발명을 적용하는 것을 허용한다.
본원에서 사용된 경우에, "형질전환" 또는 "형질도입"이라는 용어는 1개 이상의 핵산 분자(들)의 세포 내로의 전달을 지칭한다. 세포 내로 형질도입된 핵산 분자가 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해 세포에 의해 안정적으로 복제될 때 세포가 이러한 핵산 분자로 "형질전환"된다. 본원에서 사용된 경우에, "형질전환"이라는 용어는 핵산 분자가 이같은 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 바이러스 벡터로의 형질감염; 플라스미드 벡터로의 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션(lipofection) (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주입 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리아-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접적인 DNA 섭취; 및 미세발사체 포격 (Klein et al. (1987) Nature 327:70)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
포격 형질전환 기술에서 사용하기 위해, 핵산 구축물이 포격 입자에 흡착되고, 전형적으로 이러한 입자는 평균 크기가 약 0.7 ㎛인 텅스텐 입자로 이루어진다. 텅스텐과 밀도가 유사한 기타 금속, 예컨대 금, 백금 등으로 이루어진 입자를 또한 사용할 수 있다. 전형적으로, 텅스텐 1 ㎍ 당 약 2-5 ㎍의 DNA, 일반적으로는 텅스텐 1 ㎍ 당 약 2 ㎍의 DNA가 흡착된다. DNA가 입자에 흡착된 후, 임의의 입자 덩어리가, 예를 들어 초음파처리에 의해, 분산된다. DNA를 금속 포격 입자의 외부 표면 상에 고착시키는 임의의 방법이 허용될 수 있고, 관련 기술 분야의 기술자에게 공지되어 있다. (예를 들어, [Sanford et al. (1988) 상기 문헌] 및 [Klein et al. 상기 문헌] 참조). DNA는 전달을 위해 입자에 고정되어야 하지만, 세포 내로의 DNA 방출을 방해하는 방식으로 고착되지 않아야 한다.
형질전환을 위해, 발현 카세트가 흡착된 포격 입자 약 100-500 ㎍, 일반적으로는 약 200 ㎍을 제조사의 설명서에 따라 입자 총 (예컨대 바이올리스틱스 인크(Biolistics, Inc.) 및 듀퐁(DuPont)으로부터 입수가능한 것) 내로 장전한다. 페트리 플레이트 (5 cm 직경) 당 일반적으로 100-300 ㎍의 신선한 중량의 단리된 세포를 성장 표면, 예컨대 와트만(Whatman) #1 여과지 + 성장 배지를 예를 들어 함유하는 페트리 접시 또는 조직 배양 접시 상에 놓아, 세포를 고체 표면에 고착시킨다. 세포는 단일 세포층 내에 있어야 하는 것이 아니라, 몇 개의 층의 두께일 수 있다. 고정된 세포를 입차 총의 포격 챔버 내에 놓고, 가능한 한 높게는 진공, 일반적으로는 약 0.07 내지 0.3 기압, 바람직하게는 0.07 하에 놓는다. 그 후, 포격 전에 샘플 챔버 내의 압력을 약 0.07 기압으로 감소시킨다. 바람직하게는 세포를 입자 총의 총신의 끝부분으로부터 약 10 cm에서 (듀퐁 유전자 총 내의 네번째 레벨에서) 포격한다. 입자 총의 발포 메커니즘을 활성화시키고, 세포를 1-3회, 일반적으로는 2회 포격하여, 형질전환된 세포의 수를 증가시킨다. 그 후, 진공을 해제하고, 포격된 세포를 약 26℃의 신선한 성장 배지 내에 놓고, 바람직하게는 성장 챔버 내에 빛을 비춘다. 기타 탄도 장치는 "플라잉 디스크(flying disc)" 예컨대 플라스틱 막으로 제조된 것 또는 예를 들어 나일론 그물 (94 ㎛)로 제조된 디스크 ("헬륨 인트레인먼트(entrainment)" 방법)의 사용을 포함한다.
형질전환 프로세스에서 사용된 숙주 세포가 전능성(totipotency)을 보유할 때 트랜스제닉 색소체 (예를 들어, 엽록체)를 함유하는 식물이 생성될 수 있다. 형질전환된 세포 또는 조직으로부터 트랜스제닉 식물을 재생시키는 절차들은, 관련 기술 분야의 기술자의 능력 내에서 적절하게 변형되면서, 일반적으로 유사하다. 꽃밥 또는 배아 (하기 참조)로부터의 쌍자엽식물 예컨대 사탕무 (Freytag et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:30-34); 담배 (Svab et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. (1990) 8526-8530), 또는 단자엽식물 예컨대 밀의 재생이 일상적으로 성공적이었다.
다른 식물 물질, 예를 들어, 꽃밥 배양물에서 유래된 식물 또는 배아에서 유래된 캘러스 내의 색소체를 형질전환시키는 것을 원한다면, 식물 물질을 편리한 용기, 예를 들어, 단리된 세포에 대해 상기 기술된 바와 같은 페트리 접시 내에 놓는다. (US 6,680,426; 문헌 [Hanson et al (2012) Journal of Experimental Botany, 64: 753-768]; 및 [Golds et al., (1993) Nature Biotechnology 11, 95-97]을 또한 참조한다).
색소체가 형질전환된 것으로 나타났으면, 이러한 식물의 세포를 반복적으로 조직 배양에 사용할 수 있고, 원하는 경우의 캘러스 조직의 성장 또는 식물 재생이 이어진다. 따라서, 변형된 식물 세포가 세포 및 조직 배양물의 사용에 의해 반복적으로 재생될 수 있다. 일부 경우에, 종자로부터 적합한 번식이 유지될 수 있다. 형질전환된 세포를 확인하는 능력을 개선하기 위해, 앞서 기재된 바와 같은 선택가능하거나 또는 스크리닝이 가능한 마커 유전자를 형질전환체를 생성시키는데 사용된 형질전환 벡터와 함께 사용하는 것을 원할 수 있다. 선별가능한 마커가 사용되는 경우, 세포를 선별제 또는 선별제들에 노출시킴으로써 잠재적으로 형질전환된 세포 집단 내에서 형질전환된 세포가 확인된다. 스크리닝이 가능한 마커가 사용되는 경우, 원하는 마커 유전자 형질에 대해 세포를 스크리닝할 수 있다.
선별제에 대한 노출에서 생존한 세포 또는 스크리닝 검정법에서 양성으로 채점된 세포를 식물 재생을 지지하는 배지에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적절힌 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)를 추가적인 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형시킬 수 있다. 충분한 조직이 식물 재생 작업을 시작하는데 이용가능할 때까지, 또는 반복된 수동 선별 라운드 후에, 조직의 형태가 재생에 적절할 때까지 (예를 들어, 2주 이상), 조직을 성장 조절제가 있는 기본 배지에서 유지시킨 후, 슈트(shoot) 형성에 도움이 되는 배지로 옮길 수 있다. 충분한 슈트 형성이 일어날 때까지 배양물을 주기적으로 옮긴다. 슈트가 형성되면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물을 추가적인 성장 및 성숙을 위해 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물 내의 dsRNA 분자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정법을 수행할 수 있다. 이같은 검정법은, 예를 들어, 분자생물학 검정법, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, PCR, 및 핵산 서열분석; 식물의 일부분의 검정법, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정법을 포함한다.
형질전환 접근법에 따라, 형질전환체가 색소체 및 핵 형질전환체 양쪽 모두인 세포를 포함할 수 있어, 색소체 형질전환에 연관된 마커에 대한 선별은 색소체 및 핵 형질전환체 양쪽 모두인 세포의 선별을 또한 초래할 수 있고, 잠재적으로는 엽록체 외부에서 dsRNA를 발현하고/하거나 siRNA를 형성할 수 있는 세포를 초래하며, 이는 이러한 세포에 의해 생성된 식물의 살곤충 효능에 영향을 미칠 수 있다. 색소체 게놈에서의 통합을 가능하게 하지만 핵 게놈은 그렇지 않은 상동 재조합 영역 (본원에서 통합 부위로도 기술됨)을 함유하는 상기 기술된 본 발명의 바람직한 구축물을 이용하고, 엽록체에서만 활성인 프로모터를 사용함으로써 이러한 문제를 처리할 수 있다. 이는 선별 방법이 색소체에서 dsRNA를 생산하고 색소체의 외부에서는 dsRNA 또는 siRNA를 생산하지 않는 세포 또는 식물을 선별할 수 있게 한다.
예를 들어, 관심 핵산 분자 또는 dsRNA에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 예를 들어 사용하는 PCR 증폭에 의해, 통합 이벤트를 분석할 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예상되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어지는 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 잘 기술되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios, Q. et al. (2002) Plant J. 32:243-53]), 임의의 식물 종 (예를 들어, 지. 메이스(Z. mays) 또는 지. 맥스(G. max)) 또는 조직 유형 (세포 배양물 포함)으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 이를 초과하는 개수의 상이한 dsRNA 분자가 식물 세포에서 생산된다. 상이한 형질전환 이벤트들에서 도입된 다중 핵산 구축물로부터 또는 단일 형질전환 이벤트에서 도입된 단일 핵산 구축물로부터 dsRNA 분자가 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 dsRNA 분자가 단일 프로모터의 제어 하에 발현된다. 다른 실시양태에서, 다수의 dsRNA 분자가 다중 프로모터의 제어 하에 발현된다. 표적 유전자 서열이 있는 하나 이상의 생물 내의 상이한 유전자좌들에 대해 각각 상동성인 다중 핵산 서열을 포함하는 단일 dsRNA 분자가 발현될 수 있다.
핵산 구출물로 식물을 직접적으로 형질전환시키는 것에 더하여, 적어도 하나의 트랜스제닉 이벤트가 있는 제1 식물을 이같은 이벤트가 결여된 제2 식물과 교배시킴으로써 트랜스제닉 식물이 제조될 수 있다. 예를 들어, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물을 형질전환에 우호적인 제1 식물 라인 내로 도입하여 트랜스제닉 식물을 생산할 수 있고, 이러한 트랜스제닉 식물을 제2 식물과 교배하여, dsRNA 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제2 식물 라인의 유전 배경 내로 유전자이입시킬 수 있다.
다수의 관다발 식물 중 임의의 것을 상기 방법에 따라 형질전환시킬 수 있다.
색소체 및 본 발명의 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA와 동일하거나 상이한 생물학적 작용 경로를 해충에서 표적화하는 살곤충성 구축물로 색소체를 또한 형질전환시킬 수 있다. 이러한 구축물의 예는 상기 언급된 바와 같은 살곤충성 단백질, 특히 비. 투린기엔시스 살곤충성 단백질, 바람직하게는 Cry 단백질을 코딩하는 것들을 포함한다. 이러한 구축물의 관련 코딩 영역은 본 발명의 핵산 구축물 (즉, dsRNA를 생산하는 것) 내에서 제공될 수 있거나, 또는 별도의 구축물 내에 있을 수 있다. 후자와 관련하여, 예를 들어, 한 실시양태에서, 색소체는
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- 색소체에서의 dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
를 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인
제1 핵산 구축물, 및
살곤충제, 바람직하게는 살곤충성 단백질을 코딩하기 위한 코딩 영역
을 포함하는 추가적인 핵산 구축물
을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 색소체는 2개를 초과하는 상이한 핵산 구축물을 갖고, 이중 하나는 본원에 개시된 바와 같은 살곤충성 dsRNA를 코딩 또는 생산하기 위한 핵산 구축물이다. 다른 실시양태에서, 색소체는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 초과하는 상이한 구축물을 갖고, 이중 적어도 하나는 본원에 개시된 바와 같은 살곤충성 dsRNA를 코딩 또는 생산하기 위한 핵산이다.
D. 식물
관다발 식물은 유관속식물(tracheophyte)로도 알려져 있고, 고등 식물로도 알려져 있다. 관다발 식물은 식물의 도처에 물 및 미네랄을 수송하기 위한 목질화 조직 (물관부)가 있는 육상 식물이다. 관다발 식물에는 광합성 산물을 수송하기 위한 특수한 비-목질화 조직 (체관부)도 있다. 따라서, 본 발명의 식물은 석송류, 속새류, 양치류, 겉씨식물 (구과식물 포함) 및 속씨식물 (개화 식물)로 이루어진 군으로부터 선택된 식물, 및 트라케오피타(Tracheophyta) 및 트라케오비온타(Tracheobionta) 군으로부터의 식물일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 식물은 캐놀라, 목화, 감자, 퀴노아, 아마란스, 메밀, 홍화, 대두, 사탕무, 해바라기, 평지, 담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 브라시카(Brassica) 종 (예를 들어, 비. 나푸스(B. napus), 비. 라파(B. rapa), 비. 준세아(B. juncea), 비. 카리나타(B. carinata), 비. 니그라(B. nigra), 비. 올레라세아(B. oleracea), 비. 알바(B. alba) 등), 목화, 알팔파 및 클로버로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍자엽식물이다.
바람직한 실시양태에서, 식물은 옥수수, 벼, 호밀, 수수, 기장, 밀, 사탕수수, 귀리, 보리, 파인애플, 바나나, 야자, 관엽식물, 및 벼과식물 (예를 들어, 브라키아리아(Brachiaria), 롤리움(Lolium), 및 페스큐)로 이루어진 군으로부터 선택된 단자엽식물이다.
따라서, 추가적인 실시양태에서, 본 발명은
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인
색소체를 함유하는 식물을 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은
- 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- 색소체에서의 dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터;
- 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
를 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물을 함유하는 식물을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 식물은 핵산 구축물에 의해 코딩되는 dsRNA에 혼성화하기 위한 siRNA를 함유하지 않을 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 식물은 색소체 이외의 구획 내에 핵산 구축물에 의해 코딩되는 dsRNA를 함유하지 않을 수 있다. 이러한 실시양태들에서, 식물은 식물의 색소체 내에 dsRNA를 함유할 수 있지만, 또 다른 소기관, 시토졸, 핵 또는 식물 내의 기타 장소 내에 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA로부터 유래되거나 또는 다르게는 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA에 대한 서열 상동성 또는 상보성이 있는 siRNA를 함유하지 않는다.
일반적으로 본 발명의 식물은 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA로부터 유래되거나 또는 다르게는 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA에 대한 서열 상동성 또는 상보성이 있는 siRNA를 함유하지 않거나, 또는 엽록체 내부에서 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA에 대한 서열 상동성 또는 상보성이 있는 dsRNA를 엽록체 외부에 함유하지 않는 반면에, 한 실시양태에서, 본 발명의 식물에 엽록체 내부에서 핵산 구축물에 의해 생산된 dsRNA에 대한 서열 상동성 또는 상보성이 없는 dsRNA 또는 siRNA가 있을 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 실시양태에서, 본 발명에 따른 식물은 식물의 핵에서 dsRNA 또는 siRNA의 생산 또는 발현을 가능하게 하는 핵 형질전환 이벤트를 추가로 포함할 수 있고, 단 이러한 dsRNA 또는 siRNA는 엽록체 내부에서 생산된 dsRNA의 것과의 서열 상동성 또는 상보성이 없다. 한 예에서, 유전자 침묵화를 제공함으로써 바람직한 작물학 형질 또는 살곤충 성질을 형성하도록 식물이 추가로 조작될 수 있다. 후자는 식물에 의한 살곤충성 화합물의 생산을 초래하는 siRNA의 형성으로부터 발생할 수 있다.
한 실시양태에서, 식물은 살곤충제, 예컨대 RNA 또는 단백질을 코딩하기 위한 핵산 구축물, 또는 살곤충제 자체를 함유하는, 엽록체 또는 색소체 이외의 세포 소기관을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵 또는 세포질이 살곤충제, 예컨대 RNA 또는 단백질을 코딩하기 위한 핵산 구축물, 또는 살곤충제 자체를 1개 이상 함유하고, 바람직하게는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 초과하는 상이한 구축물 또는 구축물에 의해 코딩되는 유전자 생성물을 함유한다.
본 발명의 식물은 본 발명의 실시양태의 핵산 구축물에 대해 이형질성(heteroplasmic) (각각의 세포의 총 엽록체 개수 중 일부만 형질전환됨), 또는 동형질성(homoplasmic) (각각의 세포 내의 엽록체 모두 또는 대부분이 형질전환됨)일 수 있다. 바람직하게는, 식물은 동형질성이다. 더욱 바람직하게는, 식물은 포스트(post)-T1 세대이고, 동형질성이다.
본 발명의 식물은 RNAi 경로의 기능에 요구되는 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 내에 돌연변이를 포함할 수 있다. 이같은 유전자 생성물의 한 예는 다이서-유사 4이다. 기타 예는 DRB4 및 이의 오르토로그(ortholog)를 포함한다. 이러한 식물들은 돌연변이 (예를 들어, 녹아웃(knock out) 또는 상동 재조합으로부터 초래된 돌연변이)를 함유하는 식물 세포 또는 영양 조직을 제공하고, 이러한 세포를 본원에 기술된 본 발명의 실시양태의 핵산 구축물로 형질전환시킴으로써 생성될 수 있다. 별법적으로, 본원에 기술된 본 발명의 실시양태의 핵산 구축물로 형질전환된 식물을 RNAi 경로의 기능에 요구되는 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 내에 돌연변이가 있는 식물과 교배시킬 수 있다.
본 발명의 식물은 제초제, 예컨대 페녹시 옥신을 포함하는 카르복실산-함유 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 또한 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 식물, 특히
- - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
- dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
- dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인
색소체를 함유하는 식물로부터 유래되거나 또는 다른 방식으로 수득된 종자, 절단물 또는 기타 영양 물질을 제공한다.
상기 기술된 바와 같은 종자는 살곤충성 dsRNA를 함유할 수 있고, 상기 기술된 코딩 영역 및 프로모터를 함유하는 핵산 구축물을 함유할 수 있다. 대안적으로, 종자는 살곤충성 dsRNA를 함유하지 않을 수 있고 (예를 들어, 프로모터가 종자에서 활성화되지 않기 때문에), 단순히 상기 기술된 코딩 영역 및 프로모터를 함유하는 핵산 구축물을 함유할 수 있으며, 그 후, 예를 들어 종자가 발아되고/되거나 잎을 생산할 때, 색소체 또는 엽록체에서 살곤충성 dsRNA를 형성하도록 핵산 구축물이 활성화될 수 있다.
종자는 코팅될 수 있고, 한 형태에서, 종자는 임의 형태의 침묵화 RNA, 바람직하게는 dsRNA를 포함하는 살곤충성 RNA로 코팅될 수 있다. 기타 코팅물은 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 살곤충성 단백질 또는 화학물질을 포함하는 기타 살곤충제를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 기술된 실시양태에 따른 식물에 의해 생산된 상품이 제공된다.
E. 살곤충 조성물
본 발명은 본 발명에 따른 식물, 바람직하게는 엽록체 또는 관련 색소체에서의 살곤충성 dsRNA의 생산에 대해 동형질성인 식물로부터 유래된 물질을 이용하는 것에 추가로 관련된다. 이러한 물질은 본 발명의 식물의 색소체 또는 엽록체에서 생산된 살곤충성 dsRNA와 관련하여 특정한 순도 등급 형태로 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 물질은 화학적 처리보다는 간단한 물리적 처리 (예를 들어, 잘게 썰기, 절단, 분쇄)가 진행된 가공된 식물 물질일 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 물질의 하나 이상의 성분을 추출하고/하거나 분리하고/하거나 보존하기 위해, 물질에 화학적 처리가 진행되었을 수 있다.
추가로, 물질이 살아 있는 세포 배양물의 형태로 제공될 수 있다.
특정 실시양태에서, 이러한 물질들은 종자 (살곤충성 dsRNA로 형질전환되지 않은 종자를 포함함)를 코팅하기 위한 종자 코팅물로서를 포함하여, 하나 이상의 용도에서 살곤충 조성물로서 이용될 수 있다
또 다른 실시양태에서, 물질은 살곤충성 미끼로서 사용될 수 있다. 미끼는 해충을 유인할 수 있거나, 또는 해충이 특정 장소로 진입하는 것을 방지할 수 있다.
살곤충 조성물은 종자, 식물 또는 작물에 분무하기 위한 분무가능한 액체, 또는 고체 예컨대 분말, 과립, 펠릿 등의 형태를 취할 수 있다.
F. 방법
한 실시양태에서, 해충 또는 해충의 환경에 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물을 제시 또는 제공하는 것을 포함하는, 곤충 해충을 방제하는 방법이 제공된다. 전형적으로, 식물의 엽록체 또는 색소체 내에 함유된 dsRNA가, 해충 또는 곤충과 접촉했을 때, 바람직하게는 해충 또는 곤충의 위장관과 접촉 했을 때, 해충 또는 곤충에서 생물학적 기능을 억제하거나 해충 또는 곤충에서 RNAi 경로를 일으켜서 필수적인 곤충 또는 해충 유전자의 기능의 간섭을 초래하는 기능을 한다. 바람직하게는, 곤충 해충의 방제가 요구되는 환경은 작물, 또는 식물 경작지이다.
전형적으로, 곤충 해충의 방제는 본 발명의 핵산 또는 색소체가 있는 식물을 함유하지 않는 환경 내의 해충 집단과 비교하여 해충 집단이 감소되는 것을 초래한다.
한 실시양태에서, 해충 방제는 본 발명의 핵산 또는 색소체가 있는 식물을 소비하지 않은 해충 집단과 비교하여 곤충 해충의 성장을 억제하거나 최소화하는 것을 초래한다. 이러한 실시양태에서, 해충은 본 발명의 핵산 또는 색소체가 있는 식물을 소비하는 것에 의해 사망할 수 있거나 또는 사망하지 않을 수 있다. 이러한 실시양태에서, 곤충 해충의 성장을 억제하거나 최소화하는 것은 작물 손상 최소화를 초래할 수 있고, 수율 개선을 초래할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 dsRNA 및 이를 함유하는 식물 또는 색소체는 사망을 유도하고/하거나, 성장 속도를 감소시키고/시키거나, 생식력을 감소시킨다는 점에서 살곤충성이다.
작물 또는 식물 경작지는 상기 기술된 바와 같은 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물로 이루어질 수 있거나, 또는 이러한 식물을 포함하고 상기 기술된 바와 같은 색소체 또는 핵산 구축물을 함유하지 않는 식물 형태의 비-엽록체 형질전환체 피난처 식물을 함유할 수 있다. 작물 또는 경작지가 비-엽록체 형질전환체 피난처 식물을 함유하는 경우, 바람직하게는 작물 또는 경작지는 30％ 미만, 바람직하게는 20％ 미만, 바람직하게는 10％ 미만, 더욱 바람직하게는 5％ 미만의 비-엽록체 형질전환체 피난처 식물인 식물을 함유한다.
바람직하게는, 해충 방제는 식물의 잎, 뿌리, 생식 조직, 또는 군엽에 대한 손상의 최소화 또는 감소를 초래한다. 바람직하게는, 손상 감소는 비-형질전환 대조군에서 관찰되는 것의 적어도 50％, 바람직하게는, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 또는 95％ 초과이다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 해충 또는 병원체에 의한 식물 또는 이의 일부분의 손상을 감소시키기 위해, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물을 작물 또는 경작지 내의 해충 또는 병원체에 제시하는 것을 포함하는, 작물 또는 식물 경작지의 수율을 개선하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서,
본 발명에 따른 핵산 구축물 또는 색소체를 포함하는 식물 또는 그로부터의 번식 물질을 제공하는 단계;
재배된 식물에서 핵산 구축물이 발현되도록 식물을 재배하고, 이때 핵산 생성물이 발현되어 dsRNA가 형성되는 것이 식물 내에서 또는 식물 상에서의 해충 생육력 또는 성장을 억제하는 단계
를 포함하는, 작물의 수율을 개선하는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 옥수수 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 옥수수에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
옥수수:
Figure pct00009
또 다른 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 수수 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 수수에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
수수:
Figure pct00010
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 해바라기 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 해바라기에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
해바라기:
Figure pct00011
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 벼 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 벼에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
벼:
Figure pct00012
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 밀 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 밀에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
밀:
Figure pct00013
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 목화 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 목화에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
목화:
Figure pct00014
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 보리 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 보리에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
보리:
Figure pct00015
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 오일 종자 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 오일 종자 평지에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
오일 종자 평지:
Figure pct00016
한 실시양태에서, 상기 기술된 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 대두 식물을 해충에게 제시하는 것을 포함하는, 대두에서 곤충 해충을 방제하거나, 또는 곤충 해충에 의해 야기되는 침입 또는 손상을 방지하거나, 또는 곤충 해충을 사망시키는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 곤충 해충은 하기 표로부터 선택된다.
대두:
Figure pct00017
본원에 기술된 바와 같은 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물은 곤충 저항성 관리(Insect Resistance Management) (IRM) 전략에서 사용될 수 있다.
일반적으로 IRM 전략은 특정 구조물 내에 형질전환 식물 및 비-형질전환 식물 (소위 "피난처" 식물)을 식재하는 것을 수반한다. 이러한 구조물에서, 피난처 식물은 살곤충 압력 하에 있지 않고 따라서 살곤충 저항성 대립유전자에 대해 선택될 가능성이 더 적은 곤충에 대한 저장소를 제공한다. 경작지에서 이러한 곤충을 살곤충 저항성 대립유전자를 형성하는 돌연변이에 대해 선택된 곤충과 교배시키는 것은 이종접합성 유전자형을 생성시킬 가능성이 더 높고, 따라서 살곤충 저항성이 발달될 가능성 또는 다르게는 저항성이 발달되기까지의 시간을 감소시킨다. www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm에서 IRM을 위한 예시적인 접근법이 제시된다.
곤충의 다중 경로를 표적화하도록 식물 내로 구축물들을 "적층"함으로써 살곤충 저항성 일배체형의 유전 가능성을 추가로 감소시키는 것에 의해 IRM 전략이 강화될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Roush et al.]을 참조하고, 이들은 살곤충성 트랜스제닉 작물의 관리를 위한, "피라미드화" 또는 "적층"으로 또한 칭해지는 2-독소 전략법을 예를 들어 약술하였다. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). 구체적으로, 각각 표적 해충에 대해 효과적이고 교차-저항성이 없거나 거의 없는 2개 이상의 유사한 (예를 들어, 2개 이상의 상이한 dsRNA 표적) 또는 상이한 살곤충 활성 (예를 들어 Bt 또는 색소체 RNAi)의 적층 또는 피라미드화는 더 작은 피난처의 사용을 허용할 수 있다. 루쉬(Roush)는 성공적인 적층물의 경우, 피난처가 10％ 미만인 피난처 크기가 단일 (비-피라미드화) 형질에 대한 약 50％ 피난처에 필적하는 저항성 관리를 제공할 수 있다고 제안하였다. 현재 이용가능한 피라미드화 Bt 옥수수 제품의 경우, 미국 환경 보호청은 단일 형질 제품 (일반적으로 20％)보다 유의하게 더 적은 (일반적으로 5％) 비-Bt 옥수수의 구조화된 피난처가 식재되는 것을 요구한다.
[Roush et al. 상기 문헌], 및 미국 특허 번호 6,551,962에 추가로 논의된 바와 같이, 경작지 내의 다양한 기하학적 식재 패턴 (상기 언급된 바와 같음) 및 인-백(in-bag) 종자 혼합물을 포함하여, 피난처의 IRM 효과를 제공하는 다양한 방식이 있다.
상기 백분율 또는 유사한 피난처 비가 2개, 3개, 또는 이를 초과하는 개수의 살곤충 활성을 함유하는 대상 적층물 또는 피라미드에 사용될 수 있다. 단일 표적 해충에 대한 3개의 작용 부위가 있는 삼중 적층물의 경우, 1가지 목표는 감수성 개체의 피난처, 예를 들어 5％ 피난처를 유지하는 것일 수 있다. 이는 예를 들어 10 에이커를 초과하는 상업용 면적에 대해 특히 그러하다.
경시적으로 치사 용량이 해충에 이용가능하다는 것을 확실하게 하는 저항성 관리에 대한 효능 및 신뢰도에 용량이 영향을 미친다. 본 발명의 한 실시양태에서, 색소체 내에 위치할 때 이용가능한 dsRNA의 발현이 더 커서 더 높은 용량이 표적 해충에 이용가능하게 된다. 색소체 내의 dsRNA는 트랜스제닉 식물의 성장 및 발생에 걸쳐 안정적으로 남아 있어, 표적 해충에 대한 용량의 이용가능성을 경시적으로 유지한다
본원에 개시된 조성물 및 방법은 해충에 의한 손상을 방제하기 위한 다른 방법 및 조성물과 조합되어 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 식물, 색소체, 및 핵산 구축물이 딱정벌레목, 나비목, 및/또는 노린재목 해충에 대해 효과적인 하나 이상의 화학 작용제, 딱정벌레목, 나비목, 및/또는 노린재목 해충에 대해 효과적인 생물농약(biopesticide), 윤작, 또는 본 발명의 RNAi-매개 방법 및 RNAi 조성물의 특색과 상이한 특색을 나타내는 재조합 유전 기술 (예를 들어, 딱정벌레목, 나비목, 및/또는 노린재목 해충에 해로운 식물에서의 단백질의 재조합 생산 (예를 들어, Bt 독소))을 추가적으로 사용하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 경우에, 문맥적으로 달리 요구되는 경우를 제외하고, "포함하다"라는 용어 및 이러한 용어의 변형, 예컨대 "포함하는" 및 "포함하였다"는 추가적인 첨가물, 성분, 정수 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다.
구체적으로 지시되거나 암시되지 않는 한, 단수형 관사 ("a", "an", 및 "the")는 본원에서 사용된 경우에 "적어도 1개"를 의미한다.
본 명세서에서 개시되고 정의된 발명이 언급되었거나 본문 또는 도면으로부터 명백한 개별적인 특색들 중 2개 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 모든 이러한 상이한 조합은 본 발명의 다양한 대안적인 측면을 구성한다.
실시예
실시예 1. 핵산 구축물
엽록체 형질전환 벡터 pR1의 구축
엽록체 형질전환 구축물은 엽록체 형질전환 벡터 pPRV323Clox (이전의 pPRV312L; NCBI 등록 번호 DQ489715.1) (문헌 [Chakrabarti et al., 2006] 및 [Lutz et al., 2007])의 유도체였다. 이러한 벡터는 엔. 타바쿰(N. tabacum)의 형질전환용으로 디자인되어, 엔. 타바쿰 엽록체 게놈의 trnI 및 trnA 서열과 재조합되었다. 이는 관련된 엔. 벤타미아나를 성공적으로 형질전환시키는데 또한 사용되었는데, 엔. 타바쿰 및 엔. 벤타미아나 재조합 영역이 99.52％ 유사하기 때문이다 (2076 bp 중 오직 10개의 차이) (Davarpanah et al., 2009). 본래 이러한 벡터는 상류의 리보솜 RNA 프로모터 (rrn16)로부터의 (관심 서열의) 리드-쓰루 발현을 위해, 또는 선별가능한 마커 aadA의 상류에서의 완전한 발현 카세트의 삽입을 위해 디자인되었다. 후자의 상황이 본 실시예에서 사용되었다.
먼저 pPRV323Clox를 '돌연변이 PCR'을 사용함으로서 변형시켜, 오류성으로 5'에 존재하고 3' 상동 재조합 아암(arm)에 인접한 맵핑되지 않은(unmapped) Kpn I 제한 효소 인식 부위 (하기에 기술된 고안된 어셈블리 계획을 방해했을 것이다)를 수정하였다. ...ATG(G>C)(TACCdel)GCT…로 지시된 바와 같이 서열이 변화되어, 벡터의 원래 서열인 ATGGTACCGCT가 ATGCGCT로 변형된 벡터 pPRV323Clox(k-fix)가 생성되었다. Asc I, rrn 프로모터 (Prrn), 엔. 벤타미아나 엽록체 루비스코 대형 서브유닛 유전자에 대한 전사체의 5' 비번역 영역 (rbcL 5' UTR), 다중 클로닝 부위 (MCS), 및 rbcL 3' UTR 및 Not I을 코딩하는 서열들을 포함하도록 합성 dsDNA 삽입물이 합성되었다 (진스크립트(Genscript)). pUC57 벡터에서 삽입물이 전달되었고, 이를 Asc I 및 Not I로 절제하고, 사전에 Asc I 및 Not I로 소화된 pPRV323Clox(k-fix) 내로 서브클로닝하여, 새로운 벡터 pR1이 생성되었다.
'골든 게이트' dsRNA 어셈블리 벡터 p32c - GG의 구축
먼저 대형 dsRNA 발현 단위가 2차 '어셈블리' 벡터에서 어셈블리된 후, 완전한 단위로서 pR1 내로 옮겨졌다. 역위 반복물 (별칭 헤어핀) 어셈블리에 대해 기존에 개조된 '골든 게이트' (GG) 방법 (Yan et al., 2012)의 추가로 변형된 버전에 의해 dsRNA 발현 단위가 제조되었다. 이러한 어셈블리 방법에 대해 성분들을 설정하기 위해, GG 클로닝 카세트를 이의 원형 벡터인 pRNAi-GG (NCBI 등록 번호 JQ085427.1; 아라비돕시스 생물 자원 센터(Arabidopsis Biological Resource Center) (ARBC)로부터 입수가능함, #CD3-1786)로부터 프라이머 g187f 및 g188r (표 3 참조)을 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 Xho I 및 Kpn I 제한 효소로 소화시키고, 사전에 유사하게 소화된 이원성 벡터 p32c 내로 삽입하였다. p32c는 CaMV 35s 프로모터 (-343 내지 +1 버전) 및 변경된 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함하도록 미리 변형된, pORE-03 이원성 벡터의 사내 유래 버전이다. 서열을 …GAGAG(G>A)AG(A>G)CC…로 지시된 바와 같이 전환시킴으로써 BsaI RE 인식 부위인 GGTCTCN|NNNN (본래 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 II (PPT, 선별가능한 마커 유전자) 내에 존재함)을 제거하도록 p32c를 돌연변이 PCR에 의해 또한 미리 변형시켰는데, 이러한 BsaI 부위가 이후의 GG 헤어핀 어셈블리를 방해했을 것이기 때문이다. 달리 말하면, 벡터 내의 서열 GAGAGGAGACC가 GAGAGAAGGCC로 변형되었다. 이러한 변화는 침묵 돌연변이를 초래하여, 뉴클레오티드 서열은 변경되었지만 번역된 PPT 서열은 변화가 없을 것이다. 생성된 GG 벡터 p32c-GG는 이. 콜라이(E. coli) DB3.1 세포에서 유지되었는데, GG 발현 벡터가 다른 이. 콜라이 실험실 균주 (예를 들어 DH5알파)에서는 박테리아 세포 사망을 야기하는 cddB 유전자를 코딩하기 때문이다.
골든 게이트 방법을 사용한 p32c - GG 벡터에서의 대형 dsRNA 발현 단위 어셈블리
하기의 예외사항과 함께, 얀(Yan) 등이 이들의 유사한 벡터 pRNAi-GG에 대해 최초로 기술한 바와 같은 방법을 따라 (Yan et al., 2012), p32c-GG 어셈블리 벡터 내에 줄기 길이가 염기 쌍 수 백개 이하인 헤어핀을 전형적으로 코딩하는 대형 dsRNA 발현 단위를 만들었다. PEG-보충 결찰 완충제 (예를 들어, 2× 신속 결찰 완충제)에서 2시간 동안 결찰을 수행하였고, 따라서 총 결찰 부피가 증가되었으며, 최종 80℃ 인큐베이션을 생략하였고 (이는 PEG가 있는 결찰 완충제와 비-상용성이다), GT116 세포 (인비트로젠(Invivogen))를 DH5알파 대신 사용하였다 (DH5알파 세포도 작동하였지만, GT116 세포와 비교하여 더 적은 콜로니가 회수되었다). 본 발명가들은 PEG-기반 완충제가 불가결한 변형임을 발견하였는데, 이것 없이는 매우 적은 콜로니가 회수되거나 콜로니가 회수되지 않았기 때문이다. 간략하게, 어셈블리 프로세스는 하기의 단계들을 포함하였다. 하기의 레이아웃을 갖도록 디자인된 프라이머로, 제조사의 프로토콜에 따라 KOD 중합효소 (토요보(Toyobo))를 사용하여 PCR에 의해 표적 줄기를 증폭시켰다:
정방향 프라이머 레이아웃 = ACCA_GGTCTCA(GGAG)_bind [여기에서, 서열 'ACCA'는 5' 말단 제한 효소 결합 자리이다. (이는 인접한 하류 위치에서 절단하려 할 때 제한 효소가 서열을 '붙잡기' 위해 약간의 추가적인 '잡을 것'을 제공하도록 말단의 5' 끝부분에 부가된 여분의 4개의 염기이다); '_'는 정서할 때 속기 서열 내의 상이한 기능 단위들을 분리하기 위한 분할 기호일 뿐이고, 실제 서열에서는 물리적으로 표시되지 않는다; 'GGTCTCA(GGAG)'는 Bsa I 제한 효소 (RE) 부위이다. 대부분의 RE 부위와 달리, 이는 GGTCTCA를 인식하지만, 이의 외부인 3'의 인접한 4개의 뉴클레오티드 (NNNN)에서 절단할 것이다. 이러한 4개의 뉴클레오티드는 임의의 서열일 수 있고, 이러한 예에서는 서열 "(GGAG)"가 사용되었고, 선행하는 Bsa I인식 서열과 함께 '블루' 유형의 Bsa I 서열 (예를 들어 GGTCTCAGGAG)로 명명된다; 'bind'는 후속 PCR에서 증폭되는 특이적인 표적 서열에 '결합'하기 위해 무엇이든 특이적인 서열이 각각의 프라이머의 3' 끝부분에 부가될 필요가 있다는 것을 나타내는 포괄적인 플레이스홀더이고, 즉 이러한 서열은 각각의 표적에 대해 변한다] (예를 들어, 표 3의 서열식별번호(SEQ ID No): 3 참조).
역방향 프라이머 레이아웃 = ACCA_GGTCTCA(TCGT)_bind (예를 들어, 표 3의 서열식별번호: 4 참조).
PCR 후에, 반응물을 칼럼으로 정제하고 (퀴아젠(Qiagen)), 30 ㎕ 용출 완충제 내에 용출시킨다. 그 후, GG 반응물이 50 ng의 정제된 PCR 반응물, 200 ng의 벡터, 5 U Bsa I, 10 U T4 리가제, 2× 신속 결찰 완충제(RAPID LIG. BUFFER) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 및 H2O (20 ㎕가 되도록 하는 양)로 구성되었다. GG 반응물을 37℃에서 2시간 + 50℃에서 5분으로 인큐베이션하였다. 3 ㎕의 반응물을 표준 절차에 따라 제조된 ~ 50 ㎕의 GT116 전기-수용성(electro-competent) 세포 믹스 내로 전기천공시켰다. 카나마이신 (벡터 선별용) 및 클로람페니콜 (인트론 포함 선별용)을 포함하는 적합한 선별 배지 상에 전체 형질전환 믹스를 스프레딩(spreading)하였다. 전형적으로, ~ 50-100개의 콜로니가 회수되었다.
핵 dsRNA 발현 대조군 벡터 v153의 구축
p32c 이원성 벡터로부터 유래된, 도 1에 제시된 핵 dsRNA 발현 대조군 벡터 v153이 상응하는 엽록체 형질전환 벡터 v206을 어셈블리하는 과정 중에 중간체 벡터로서 만들어졌다. 양쪽 벡터 모두 dsRNA 발현 단위인 Ha-AceHp1236-189를 코딩하였고, 이는 자가-상보적인 189 nt의 센스 (SE) / 안티센스 (AS) 줄기 형상을 갖도록 디자인되었고, 이때 ~ 1599 nt의 핵 / 세포질 인트론-기반 스페이서 또는 '루프'에 의해 줄기들이 분리된다. 189 nt의 줄기 서열은 나비목 나방인 헬리코베르파 아르미게라 (Ha; 목화 다래벌레)로부터의 아세틸콜린에스테라제 유전자 (Ace; NCBI 등록 번호 AF369793)에 대해 상동성이도록 선택되었고, nt 위치 1236 (CDS의 첫 번째 nt에 대해 상대적임)에서 시작하여 5' 방향으로 189 nt의 총 길이에 대해 계속된다. 어셈블리의 제1 단계는 사전에 기술된 방법을 사용하여 벡터 p32c-GG에서 hp1236-189에 대한 dsRNA 발현 단위를 구축하는 것이었다. 실시예 1에서의 특이적인 어셈블리의 경우, Ace1236-189에 상응하는 서열이 에이치. 아르미게라(H. armigera) cDNA, 및 프라이머 g216f/r 및 g217f/r을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 생성된 벡터인 p32c-Ha-AceHp1236-189를 v153으로 개명하였고, 이는 핵 dsRNA 발현 대조군 벡터로서의 역할을 하였다. 이를 관련 기술 분야의 기술자에게 통상적으로 공지된 표준 아그로박테리아 형질전환 방법 및 선별 공정을 사용하여 엔. 벤타미아나 내로 형질전환시켰다. v153이, 엔. 벤타미아나의 핵 게놈 내로의 통합 후에 형성될 것으로 예상되는 바와 같이, 일반적인 선형화된 환경에서 제시되어 도 1.a에서 도시된다. 식물체 내(in planta)에서의 이러한 벡터 구축물의 통합 또는 발현을 결정하기 위한 후속 PCR 검정법에서 사용된 프라이머를 개략적으로 나타내는 것과 함께, 이러한 벡터로부터의 예상되는 dsRNA 생산 및 RNAi-유형 프로세싱의 단순화된 개략도가 제시된다.
dsRNA 엽록체 형질전환 및 발현 벡터 v206의 구축
도 1에 제시된 엽록체 형질전환 벡터 v206이 추가적인 벡터 및 상기에서 약술된 방법을 사용하여 v153으로부터 만들어졌다. pR1-Ha-AceHp1236-189로 또한 지칭되는 v206은 v153을 공여체로 사용하여 dsRNA 발현 단위를 pR1 내로 이동시킴으로써 v153으로부터 어셈블리되었다. 이러한 전달은 dsRNA 발현 단위를 Xho I 및 Kpn I로 절제하고, 이를 사전에 Sal I (Xho I과 상용성인 점착성 말단) 및 Kpn I로 소화된 pR1 내로 서브클로닝함으로써 달성되었다. 생성된 벡터인 v206이 엔. 벤타미아나의 엽록체 게놈 내로 정확하게 통합된 후의 주변의 엽록체 게놈 서열의 환경에서 도 1.CB에서 도시된다. 이러한 벡터의 후속 PCR 검정법에서 사용된 프라이머를 개략적으로 나타내는 것과 함께, 이러한 벡터로부터의 예상되는 dsRNA 생산 및 RNAi-유형 프로세싱의 단순화된 개략도가 제시된다.
dsRNA 엽록체 형질전환 및 발현 벡터 v301의 구축
도 1에 제시된 엽록체 형질전환 벡터 v301이 추가적인 벡터 및 상기에서 약술된 방법을 사용하여 v206으로부터 만들어졌다. v301은 PDK 인트론+CMr 영역을 795 bp 엽록체 인트론 서열 (atpF 인트론) 및 소형 측면 영역으로 교체함으로써 v206으로부터 어셈블리되었다. 교체 서열은 프라이머 BEN0002F 및 BEN0003R을 사용하여 니코티아나 벤타미아나로부터 증폭되었다. 생성된 벡터인 v301이 엔. 벤타미아나의 엽록체 게놈 내로 정확하게 통합된 후의 주변의 엽록체 게놈 서열의 환경에서 도 1.d에서 도시된다. 이러한 벡터의 후속 PCR 검정법에서 사용된 프라이머를 개략적으로 나타내는 것과 함께, 이러한 벡터로부터의 예상되는 dsRNA 생산 및 RNAi-유형 프로세싱의 단순화된 개략도가 제시된다.
실시예 2. 숙주 세포 및 엽록체의 형질전환
엔. 벤타미아나 조직 배양 방법
먼저 소형 부피의 종자 (~ 50 ㎕ 부피 등가물)를 Cl- 기체로 멸균함으로써 엔. 벤타미아나 식물을 조직 배양에 도입하였다. 100 ml의 히포클로라이트 (4％ 이용가능)에 첨가된 3 ml 1 N HCL의 개방 접시가 있는 밀봉된 유리 챔버에서 ~ 1-4시간 동안 종자의 개방된 튜브에 신선하게 기체를 공급하였다. 종자를 무라시게-스쿡(Murashige-Skoog) 배지 + 3％ (w/v) 수크로스 및 5％ (w/v) 노블 아가(noble agar) (MSN) (Murashige et al., 1962) 상에 스프레딩하였다. 식물을 15×6 cm 화분에서 유지시켰고, 2-3주마다 또는 필요에 따라 새로운 배지로 옮겼다.
금 마이크로-캐리어 제조 (포격용)
0.6 마이크로미터의 금 마이크로-캐리어 (바이오래드(Biorad))를 바이올리스틱(Biolistic) PDS-1000/He 입자 전달 시스템에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였고, 이는 샌포드(Sanford) 등의 방법을 따른다 (Sanford et al., 1993). 간략하게, 30 mg의 마이크로-캐리어를 1.5 ml 미세원심분리 튜브 내로 칭량하고, 1 ml의 70％ 에탄올을 첨가하고, 혼합물을 3-5분 동안 와동시켰다. 15분 동안 금이 침강되도록 한 후, 5초 동안 원심분리하였다 (~ 20,000 rcf 이하). 상청액을 폐기하고, 1 ml의 증류수를 금에 첨가하고, 1분 동안 와동시키고, 1분 동안 침강되게 하였다. 5초 동안 스피닝하여 금을 펠릿화시키고, 상청액을 제거하였다. 물로 세정하는 단계를 2번 반복하여, 총 3회로 수행하였다. 500 ㎕의 무균성 50％ 글리세롤을 최종 펠릿에 첨가하였다 (제제를 4℃에서 보관하였고, ~ 2주까지 사용할 수 있었다). 이러한 부피로 10개의 표준 제제를 제조하였다.
금 마이크로-캐리어 의 DNA-코팅
금 마이크로-캐리어를 포격일에 DNA로 코팅하였다. 상기에서 제조된 마이크로-캐리어를 >= 5분 동안 와동시켜, 금을 다시 현탁시켰다. 각각의 구축물에 대해, 50 ㎕ (~ 3 mg)의 금 현탁액을 침강을 방지하도록 와동시키면서 새로운 튜브로 이동시켰다. 5 ㎕ DNA (이상적으로는 1 ug/㎕), 50 ㎕ 2.5 M CaCl2 및 20 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘을 각각의 분취량의 금에 첨가하였다. DNA 농도가 충분히 높지 않으면, 충분한 부피의 DNA (> 5 ul)를 5 ug까지 첨가하였고, 나머지 성분의 부피를 이에 따라 비율에 맞게 증가시켰다. 각각의 샘플을 3분 동안 와동시키고, 10분 동안 침강되게 하고 (제조사가 언급한 1분 보다 길게), 5초 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 140 ㎕의 70％ 에탄올을 펠릿에 첨가하고, 재현탁될 때까지 (~ 1분) 혼합물을 와동시켰다. 마이크로-캐리어를 1분 동안 침강되도록 두고, 추가로 5초 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 140 ㎕의 100％ 에탄올로 이러한 단계를 반복하였다. 마이크로-캐리어의 최종 펠릿을 48 ㎕의 100％ 에탄올에 재현탁시키고, 포격할 때 (같은 날)까지 얼음 상에서 보관하였다. 이러한 부피로 엽록체의 형질전환에서 사용하기 위한 >6개의 '샷(shot)'을 제조하였다.
입자 포격 방법을 사용한 엽록체의 형질전환
바이올리스틱 PDS-1000/He 기계 (바이오래드)를 층류 캐비넷 내로 이동시키고, 70％ 에탄올로 엄격하게 표면을 멸균시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 준비시켰다. 권고에 따라, 헬륨은 '고등급' (4.5; > 99.995％ 순도)이었는데, 더 낮은 등급은 기계를 막거나 샘플을 오염시킬 수 있기 때문이다. 정지 스크린, 마크로-캐리어 홀더, 및 마크로-캐리어 디스크를 100％ 에탄올에 가볍게 잠깐 담궈서 멸균시킨 후, 무균성 여과지가 라이닝된 접시 상에서 공기-건조시켰다. 1100 psi 파열 디스크를 70％ 이소프로판올에 잠깐 담그고, 습한 (그러나 과도하게 젖지는 않은) 상태로 발포 노즐 내로 로딩하였다 (적절한 밀봉을 위해 약간의 이소프로판올이 필요하다). 라인에서 공기를 제거하고 이를 He으로 채우도록 각각의 세션의 최초의 '샷'은 파열 디스크 단독이었다 (즉, 샘플이 없었다). 각각의 금 마이크로-캐리어 제제를 >1분 동안 초음파처리하고, 먼저 마크로-캐리어 홀더 내에 놓고, 공기-건조시켜 (~ 1-5분), 6 ul/샷을 마크로-캐리어의 중앙에 걸쳐 균일하게 스프레딩하였다. ~ 25-28 인치 Hg의 진공에서 6 cm (노즐로부터)에서 포격하였다. MSN 플레이트 상에서 배축 면 (뒷면)을 위로 하여 잎에 포격하였다. 표준 100 × 20 mm 배양 접시의 중앙에 놓인 조직 배양 식물로부터의 ~ 2-3 ㎠의 1개의 잎 (또는 여러 개의 더 작은 잎)으로, 최대 24시간 전에 잎을 준비하였다.
외식체 , 캘러스 및 식물체 선별 ( 이형질성 )
포격 후에, 플레이트를 즉각적으로 세공 테이프 (3M)로 2번 싸서 밀봉하고, 암실에서 ~ 48-72시간 동안 유지시켰다. 그 후, 각각의 잎을 ~ 0.5-1 ㎠의 작은 분절로 절단하고, 무균 상태로 향축면 (윗면)을 위로 하여 500 mg/L 스펙티노마이신, 2 mg/L BAP 및 0.5 mg/L NAA를 함유하는 MSN 선별 배지로 옮겼다 (캘러스 및 슈트 형성을 유도하기 위해). 2-3주마다 조직을 신선한 배지로 이동시켰다. 형질전환되지 않은 조직은 ~ 2-4주 후에 담황색이 되고, ~ 4-8주부터 캘러스가 나타나기 시작한다. ~ 0.5-1 ㎤일 때 캘러스를 외식체 물질로부터 떼어내서, 별도의 배지로 이동시켰다. 신생 슈트를 캘러스로부터 가능한 한 빨리 떼어내고, 동일한 배지에서 유지시켰다. 슈트가 1-2개의 ~ 0.5-1 ㎠의 잎으로 발달되었을 때, 이를 500 mg/L 스펙티노마이신을 함유하는 (그러나 호르몬은 없는) MSN 배지로 이동시켜 뿌리 형성을 유도하였다. 적절한 뿌리 발달 후, 식물체를 토양으로 이동시켰다.
형질전환된 세포는 이형질성 (각각의 세포의 총 엽록체 개수 중 일부만 형질전환됨), 또는 동형질성 (각각의 세포 내의 엽록체 모두 또는 대부분이 형질전환됨)일 수 있다. 단일 선별 라운드, 예를 들어 캘러스 형성, 슈트 형성 및 단리, 및 뿌리 유도 후의 포격된 잎으로부터 재생된 니코티아나 슈트는 항상 키메라 (이형질성)인 것으로 생각된다 (문헌 [Maliga et al., 2012] 및 [Maliga et al., 2004]). 일반적으로 동형질성(homoplasmy) 또는 적어도 유전적으로 안정적인 식물은 반복적으로 새롭게 형성된 슈트를 작은 조각으로 분할하고 캘러스 형성을 다시 유도하는 것에 의한 2회 이상의 연속적인 선별 라운드에 의해 달성되는 것으로 여겨진다. '형질성(plasmy)' 수준은 삽입 접합점에 걸친 적절한 PCR 반응에 의해 결정될 수 있다.
캘러스 또는 식물체로부터의 DNA 추출
~ 2-3 ㎣의 작은 절편을 제거함으로써 DNA 추출을 위해 개별적인 캘러스의 샘플을 취했다. DNA 추출이 예정된 신생 식물체를 각각 ~ 0.5-1 ㎠인 2개 이상의 잎이 있는 단계까지 성장시킨 후, 1개의 잎을 추출용으로 수확하였다. DNA 추출을 기본적인 '염석' 방법으로 수행하였다. 각각의 조직 샘플을 멸균된 소형 스테인레스 스틸 볼 및 ~ 180-200 ㎕의 DNA 추출 완충제 (0.5 M NaCl 및 1％ SDS)가 있는 200 ㎕ PCR 스트립 튜브 내에 놓았다. 튜브를 ~ 2분 동안 ~ 30회의 회전/초로 믹서-밀에서 격렬하게 진탕시켰다. 되돌리기 및 뒤집기에 의해 샘플 플레이트를 다시 배향시키고, 플레이트를 다시 진탕시켰다. 튜브를 플레이트 원심분리기를 사용하여 3800 rpm에서 1시간 동안 원심분리하였다. 100 ㎕의 상청액을 200 ㎕의 100％ 에탄올이 있는 신선한 플레이트로 옮겼다. 샘플 플레이트를 다시 전과 같이 원심분리하였다. 샘플 플레이트를 강하게 뒤집어서 상청액을 폐기하였다. 샘플 플레이트를 거꾸로 하여 ~ 20초 동안 ~ 300 rpm에서 원심분리하였다. 200 ㎕의 70％ 에탄올을 각각의 웰에 첨가하고 (빠른 세정), 샘플 플레이트를 강하게 뒤집어서 상청액을 다시 폐기하였다. 샘플 플레이트를 거꾸로 하여 ~ 20초 동안 ~ 300 rpm에서 다시 원심분리하였다. 샘플 플레이트를 실온에서 ~ 20분 동안 공기-건조시키고, 펠릿을 100 ㎕의 T.E. 완충제에 재현탁시키고, 4℃에서 보관하였다.
엽록체 라인 생성
v206 엽록체 형질전환을 사용하여 9개의 엔. 벤타미아나 식물 라인을 생성시켰다 (샘플 #1-9). 각각의 선택된 라인은 독립적인 형질전환 이벤트로부터의 것이었다. 각각의 라인은 스펙티노마이신에 대해 저항성이었고, 엽록체 게놈 내로의 v206 혼입을 PCR로 확인하였다. 비-형질전환 엔. 벤타미아나를 음성 또는 또는 비-형질전환 대조군으로 유지시켰고 (샘플 #24), 이전에 지시된 바와 같이 v153의 핵 형질전환 라인을 생성시켰으며, 양성 핵 형질전환 대조군으로서 유지시켰다 (샘플 #17).
실시예 3. RT- PCR을 사용한 트랜스진 발현의 확인
RNA 추출 및 DNase 처리
전체 RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 트리졸(Trizol) (라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))을 사용하여 추출하였다. DNA 추출에 대해 앞서 기술된 것과 유사하게 RNA 추출용 조직을 수확하였다. 조직을 급속 냉동시키고, 액체 N2에서 막자 및 막자사발로 분쇄하였다. 약 1.5 ml의 트리졸을 ~ 0.5-1 ml 등가 부피의 미세하게 분말화된 조직에 첨가하였다. 표준 방법에서의 모든 기타 부피를 이에 따라 (사용된 1.5 ml의 트리졸에 대해) 조정하였다. 최초의 균질화물 (균질화 직후)을 12,000×g에서 10분 동안 ~ 4℃에서 원심분리하는 임의적인 단리 단계가 포함되었다. 펠릿을 폐기하고, 정화된 균질화물을 프로토콜에 따라 추가로 가공하였다. 각각의 샘플을 ~ 30-50 ㎕의 RNase가 없는 물 (예를 들어 DEPC 처리)에 재현탁시켰다. 추출 후, RNA 샘플을 제조사의 프로토콜 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 따라 DNase로 처리하여, 후속 역전사 테스트에서의 거짓-양성 증폭의 가능성을 감소시켰다. 간략하게, 8 ㎕의 RNA 샘플을 1 ㎕의 DNase 완충제 및 1 ㎕의 RQ1 DNase 효소 (NEB)와 조합하였다. 반응물을 37℃에서 ~ 30분 동안 인큐베이션한 후, 1 ㎕의 정지 용액을 첨가하고, 혼합물을 65℃에서 ~ 10분 동안 추가로 인큐베이션하여, DNase를 완전히 불활성화시켰다.
RT- PCR
각각의 샘플을 역전사 PCR (RT-PCR)에 적용하여, 긴 dsRNA 종의 존재에 대해 테스트하였다. 사용된 RT-PCR은 단일 cDNA 합성 단계가 먼저 수행된 후, 상이한 RNA 종에 대한 별개의 PCR 반응이 이어진 2-단계 RT-PCR이었다. 각각의 cDNA 합성 반응은 제조사의 프로토콜에 따라 수퍼스크립트 III 제1 가닥 합성(Superscript III First Strand Synthesis) 키트 (인비트로젠)으로 수행되었다. 사용자에 의해 포함된 구체적인 성분은 총 13 ㎕의 사용자 입력 부피에 대한 5 ㎕의 혼합된 프라이머 (각각 1 ㎕의 g280r, g276r, g216f/r, g301r 및 올리고 dT), 1 ㎕의 dNTP, 및 7 ㎕의 DNase-처리 RNA 샘플이었다. cDNA 합성 후, 1 ㎕의 각각의 샘플을 표준 20 ul PCR 반응에서 주형으로 사용하였다. v206 엽록체 샘플 #1-9, v153 핵 대조군 #17, 및 비-형질전환 엔. 벤타미아나 대조군 #24의 샘플 상에서 PCR을 수행하였다. 2가지 상이한 주형 조건을 사용하여, 각각의 샘플을 3개의 상이한 프라이머 세트로 증폭시켰다: 1) 주형으로서의 cDNA 합성 전의 추출된 RNA (샘플 내의 DNA 오염 가능성 테스트용), 및 2) 상응하는 cDNA 샘플 세트. 제1 PCR 프라이머 세트는 AS 줄기에 인트론 루프를 함유하는 대형 RNA 종의 존재에 대해 테스트하기 위해 인트론 및 후방 줄기 접합부에 걸쳐 증폭시키도록 디자인되었다 (프라이머 g25f 및 g216f/r). 제2 세트는 루프 서열과 독립적으로 전장 SE 또는 AS 줄기의 존재에 대해 테스트하기 위해 dsRNA 줄기 영역에 대해 내부였지만, 줄기의 말단에서 결합한다 (프라이머 g216f/r 및 g217f/r). 제3 세트는 eIF4E에 대한 편재성 하우스-키핑 서열의 존재에 대해 테스트하기 위한 대조군 반응이었다 (프라이머 g165f 및 g166r).
도 2에 나타난 바와 같이, 9개의 엽록체 cDNA 샘플 모두가 인트론-후방 줄기 PCR에 대해 양성이었고, 이는 적어도 양쪽 절편을 함유하는 RNA 종의 발현을 입증한다 (도 2A 및 B). 인트론 및 AS 줄기 절편은 SE 줄기의 하류에 있기 때문에, 이러한 결과는 전장 dsRNA 형성 영역의 존재를 가리킨다. v153 핵 발현 대조군 벡터로 형질전환된 엔. 벤타미아나로부터의 cDNA를 함유하는 PCR 반응으로부터 앰플리콘이 없었다. 이는 식물에서의 전사 동안 또는 전사 직후에 인트론이 효율적으로 RNA로부터 스플라이싱되어 제거되는 경우에 예상될 것이다. 비-형질전환 엔. 벤타미아나 대조군으로부터의 cDNA를 함유하는 PCR 반응으로부터 앰플리콘이 없었다. 이것 또한 예상대로였는데, 엔. 벤타미아나가 Ha-AceHp1236-189 dsRNA 서열을 발현하지 않기 때문이다. '비-RT' PCR 반응 (즉, cDNA 합성 전에 RNA만 주형으로 사용된 반응)이 앰플리콘을 나타내지 않았고, 이는 cDNA 샘플 세트에서 나타난 특이적 생성물의 형성에 영향을 미치는 검출가능한 수준의 DNA 오염이 없었다는 것을 입증한다.
9개의 엽록체 cDNA 샘플 모두가 줄기 영역에 대해 특이적인 dsRNA/hp PCR에 대해 또한 양성이었고 (도 2C 및 D), 이는 각각의 샘플에 대해 적어도 SE 및 또는 AS 줄기가 전체적으로 존재한다는 것을 추가로 입증한다. 엽록체 형질전환 샘플 v206 #8이 비-RT 대조군 반응에서 소량의 생성물을 나타냈지만, 이는 상응하는 cDNA 반응에서 나타난 것보다 훨씨 더 낮았다. 핵 발현 dsRNA 영역/헤어핀이 식물에서 전사 직후에 ~19-24 bp의 더 작은 siRNA 크기의 종으로 효율적으로 프로세싱되고, 그렇게 하여, 발현된 긴 dsRNA의 양을 검출가능한 수준 미만으로 감소시킨 경우에 예상될 바와 같이, v153 핵 발현 대조군으로부터의 cDNA를 함유하는 PCR 반응으로부터 앰플리콘이 없었다. 예상대로, 엔. 벤타미아나 비-형질전환 대조군으로부터의 cDNA를 함유하는 PCR 반응으로부터 앰플리콘이 없었다.
엽록체 cDNA 샘플 및 2개의 대조군 cDNA 샘플 모두가 eIF4E 하우스-키핑 서열에 대해 양성이었다 (도 2E 및 F). 이러한 결과는 모든 cDNA 샘플이 PCR을 위한 적절한 주형이었음을 입증하였고, 따라서, 예상되는 바와 같이, RNAi 경로에 의해 효율적으로 프로세싱될 가능성이 높기 때문에, v153 샘플에 검출가능한 dsRNA가 없다는 해석을 지지한다. '비-RT' 대조군 반응은 어떠한 샘플에서도 검출가능한 생성물이 없었고, 이는 샘플에 유의한 DNA 오염이 없었다는 것을 추가로 나타낸다.
실시예 4. 노던 블롯팅을 사용한 엽록체 형질전환체 및 대조군 내의 dsRNA의 정량
엽록체 형질전환 샘플을 추가로 고분자량 (MW) 또는 '대형 RNA' 노던 분석에 적용하여, 상응하는 핵-발현 대조군 샘플 (및 비-형질전환 대조군)과 비교하여 엽록체-형질전환 샘플 내에 존재하는 대형 dsRNA를 검출하고 이의 상대적인 양을 정량하였다. 각각의 샘플을 RNase가 없는 물보다는 포름아미드에 재현탁시킨 것을 제외하고는 앞서 기술된 방법에 따라 샘플 #1-9, 17 및 24 각각에 대해 RNA 추출물을 다시 제조하였다. (추가적인 RNA 추출물을 위한 잔여 물질이 불충분하였기 때문에 샘플 #6은 이러한 실시예 세트에서 생략되었다.) 1.4％ TBE 아가로스 겔 상에 레인 당 약 10 ㎕의 각각의 샘플 + 6 ㎕의 포름아미드 RNA 로딩 염료를 로딩하고 (4 ㎕의 샘플만 입수가능한 샘플 7은 제외), 2개의 하부 전방 염료가 적절하게 분리될 때까지 100 V에서 러닝시켰다. 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr)로 염색하고 가시화하여, 상대적인 로딩량을 평가하였다 (도 3.A). 겔을 철야로 하이본드 N+ (아머샴) 상으로 모세관으로 이송시키고, 샘플을 막에 UV 가교시켰다. 막을 예비-혼성화시키고, 65℃에서 퍼펙트하이브와 혼성화시켰다. 프로브는 역으로 삽입된 HaAce1236 pGEM 벡터 (v158)로부터 런-오프 (SP6)된 부분적인 길이의 SE 가닥 UTPp32 리보프로브였다; 달리 말하면, 프로브는 표적 서열의 안티-센스 또는 dsRNA의 AS 줄기를 검출하기 위한 것이었다. 프로브 길이는 538 nt이었고, 엽록체 및 핵 형질전환 식물 내로 혼입된 표적의 전체적인 189 nt에 스패닝(spanning)된 HaAce에 대해 상동성인 ~ 357 nt가 있었다. 막을 1시간 동안 노출시켰다.
도 3.B에서 볼 수 있듯이, 다수의 엽록체 형질전환 샘플이 크기 면에서 RNAi-유형 기구에 의해 프로세싱되지 않은 경우에 HaAce1236-189 dsRNA 서열에 대해 예상되는 것에 상응하는 특이적인 고분자량 RNA를 다량으로 보유하였다. 상응하는 핵 발현 대조군인 샘플 #17은 프로세싱되지 않은 긴 dsRNA의 증거를 나타내지 않았고, 비-형질전환 대조군과 유사한 배경 신호 수준이었다. RNA 양을 ImageJ를 사용하여 정량하고, 로딩된 양에 대해 표준화하였다 (EtBr 영상을 사용함). 엔. 벤타미아나 비-형질전환 대조군 (1로 설정됨)에 대해 상대적인 밴드 강도에서의 표준화된 배수 변화로서 상대적인 발현 수준을 계산하였다. 도 3.C에서 볼 수 있듯이, 모든 v206 엽록체 샘플에 검출가능한 양의 특이적인 dsRNA가 있었다. 라인들 간에 약간의 변동이 있었고, 이는 각각의 라인의 독립적인 성질을 감안하면 뜻밖이지 않았다. 이러한 실시예에서의 다수의 독립적인 라인, 특히 1, 2, 4, 5, 8 및 9가 꽤 높은 수준의 dsRNA 생산 및 축적을 나타냈다. 표준화하였을 때, v153 핵 발현 대조군 샘플이 검출가능한 양의 dsRNA를 유지하지 않았다는 것이 명백하였고, 이는 이전의 RT-PCR 데이터와 비슷한 결과였다.
실시예 5. 노던 블롯팅을 사용한 엽록체 형질전환체 및 대조군 내의 siRNA의 정량
추가로 엽록체 형질전환 샘플을 저분자량 (MW) 또는 '소형 RNA' 노던 분석에 적용하여, 샘플 내의 dsRNA가 RNAi-유형 프로세싱 기구에 노출된 경우에 존재할 것으로 예상되는 siRNA 크기의 프로세싱 생성물을 검출하고 이의 상대적인 양을 정량하였다. 실시예 4에서 사용된 것과 동일한 RNA 추출물이 사용되었다 (잔여 물질이 불충분하였기 때문에 샘플 #6 및 7은 이러한 실시예 세트에서 생략되었다). 17％ PAGE 겔 상에 레인 당 약 25 ㎕의 각각의 샘플 + 25 ㎕의 포름아미드 RNA 로딩 염료를 로딩하였다. 이는 ~ 18-42 ㎍의 로딩된 양의 추정 범위를 초래하였다. 로딩 전에, PAGE 겔을 150 V / 40분으로 예비-러닝시켰다. 로딩 후, 겔을 150V / ~ 30분 + 200 V /~ 4-5시간으로 러닝시켰다 (전방 염료가 적절하게 이동했을 때까지). 겔을 에티듐 브로마이드 (EtBr)로 염색하고 가시화하여, 상대적인 로딩량을 평가하였다 (도 4.A). 겔을 45 V / 60분으로 하이본드 N+ (아머샴) 상으로 전기적으로 이송시키고, 샘플을 막에 UV 가교시켰다. 막을 예비-혼성화시키고, 42℃에서 퍼펙트하이브와 혼성화시켰다. 프로브를 표준 방법에 의해 또한 '탄산염화'시켜 ~ 50 nt의 단편으로 분할한 것을 제외하고는, 이전에 기술된 바와 동일하게 프로브를 제조하였다. 막을 1시간 및 60시간 동안 노출시켰고, 이때 2개의 시점 사이에 검출 한계의 차이가 없었다 (1시간 시점이 본원에서 제시됨).
도 4.B는 엽록체 형질전환 샘플 중 어느 것도 프로브에 대해 특이적인 소형 RNA 종의 어떠한 징후도 나타내지 않았음을 나타낸다. 그러나, v153 핵 발현 대조군 샘플 (#17)은 ~ 19-24 nt의 예상 크기 범위에 상응하는 강하고 명확한 생성물을 나타냈다. 비-형질전환 엔. 벤타미아나 대조군은 예상 대로 소형 RNA 크기 범위에서 특이적-결합을 나타내지 않았다. RNA 양을 ImageJ를 사용하여 정량하고 (도 4.C), 로딩된 양에 대해 표준화하였다 (EtBr 영상을 사용함). 엔. 벤타미아나 비-형질전환 대조군 (1로 설정됨)에 대해 상대적인 밴드 강도에서의 표준화된 배수 변화로서 상대적인 발현 수준을 계산하였다. 엽록체 샘플은 소형 RNA 종이 생산된다는 증거를 나타내지 않는 반면 v153 핵 발현 대조군 샘플은 높은 수준의 소형 RNA를 보유한다는 것을 나타내어, 노던 영상의 해석이 정량에서 추가로 입증된다.
실시예 6. 작물 종의 엽록체 형질전환
옥수수는 실질적으로 본원 및 미국 특허 출원 번호 20080289063A1에 일반적으로 기술된 바와 같이 형질전환된다. 담배, 당근, 목화, 대두 및 식용 잎 작물 (예를 들어, 양상추) 형질전환은 본원 및 문헌 [Verma and Danielle (2007) Plant Physiol. 145(4): 1129-1143]에 일반적으로 기술된 바와 같이 수행된다. 벼, 밀, 수수, 해바라기, 캐놀라, 사탕무 및 보리는 문헌 [Maliga (2014) Chloroplast Biotechnology, Humana Press]에서 확인되는 바와 같은 프로토콜을 따라 형질전환될 수 있다. 식물 형질전환 분야의 기술자는 작물 종을 기초로 프로토콜을 변형시킬 수 있다.
실시예 7a. 살곤충 활성
dsRNA를 발현하는 엽록체가 있는 트랜스플라스토믹(transplastomic) 식물을 트랜스제닉 및 야생형 니코티아나 벤타미아나의 모종 상에서 신생 헬리코베르파 아르미게라 유충으로 수행된 생물검정법에서 살곤충 활성에 대해 테스트하였다. 헬리코베르파 유충을 인공 사료 상에서 알 (영리 곤충사육장에 의해 유지된 콜로니로부터 수득됨; AgBiTech, 퀸즐랜드주 터움바)에서 부화시키고, 부화로부터 수 시간 이내에, 개별적인 유충을 젖은 낙타털 브러시로 채집하여, 플라스틱 페트리 접시 내의 세정된 6일령 모종 상에 침착시켰다 (20마리의 개체/페트리접시). 그 후, 유충이 침입한 모종을 함유하는 페트리접시를 기체 교환을 허용하는 뚜껑으로 밀봉하였다. 페트리접시를 제어된 환경 조건 (28℃, ~ 60％ 상대 습도, 16:8 [명:암])에서 4일 동안 유지시킨 후, 생존 유충의 중량을 기록하였다 (도 5a). 4일의 급식 기간 동안 적합한 유전자형의 신선한 모종을 매일 페트리접시에 첨가하였다. 이러한 데이터는 v206 (엽록체에서 hpRNA를 발현함)으로 형질감염된 4개의 독립적인 라인 모두에서, 야생형 엔. 벤타미아나 모종을 먹인 것들과 비교하여 유충이 이의 성장 속도 면에서 유의하게 감소되었음 (p<0.005 n= 7-13)을 나타낸다. v153 (핵/세포질에서 hpRNA를 발현함)으로 형질감염된 2개의 라인을 먹인 유충의 성장 속도는 wt을 먹인 것에 대해 유의하게 상이하지 않았다 (p>0.9; n =4-7).
실시예 7b. 살곤충 활성
하기에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 기술 분야의 기술자에게 공지된 바와 같은 다양한 생물검정법에 의해 살곤충 활성을 측정할 수 있다. 나비목 곤충 해충은 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 헬리코베르파(Helicoverpa) 종, 아그로미자 파르비코르니스, 아그로티스 입실론, 디아트라에아(Diatraea) 종, 엘라스모팔푸스 리그노셀루스, 오스트리니아 누빌라리스, 스포도프테라(Spodoptera) 종, 파파이페마 네브리스, 헬리오티스(Heliothis) 종, 펙티노포라 고시피엘라, 플루텔라 크실로스텔라, 마메스트라 콘피구라타, 슈도플루시아 인클루덴스, 플라티페나 스카브라, 안티카르시아 겜마탈리스, 콜리아스 에우리테메, 아코로이아 그리셀라, 아클레리스 글로베라나, 아클레리스 바리아나, 아독소파이에스 오라나, 알라바마 아르길라세아, 알소필라 포메타리아, 아미엘로이스 트란시텔라, 아나가스타 쿠에니엘라, 아나르시아 리네아텔라, 아니소타 세나토리아, 안테라에아 페르니이, 아르칩스 종, 아르기로타에니아 종, 아테티스 민다라, 봄빅스 모리, 부쿨라트릭스 투르베리엘라, 카드라 카우텔라, 코리스토네우라 종, 코킬스 호스페스, 코르시라 세팔로니카, 시디아 라티페레아누스, 시디아 포모넬라, 다타나 인테게리마, 덴드롤리무스 시베리쿠스, 데스미아 페네랄리스, 디아파니아 히알리나타, 디아파니아 니티달리스, 엔노모스 서브시그나리아, 에오레우마 로프티니, 에스페스티아 엘루텔라, 에란니스 틸라리아, 에스티그메네 아크레아, 율리아 살루브리콜라, 유포코엘리아 암비구엘라, 유포에실리아 암비구엘라, 유프록티스 크리소로에아, 육소아 메소리아, 갈레리아 멜로넬라, 그라폴리타 몰레스타, 하리시나 아메리카나, 헤밀레우카 올리비아에, 호모에오소마 엘렉텔룸, 히판티아 쿠네아, 케이페리아 리코페르시셀라, 람브디나 피셀라리아 피셀라리아, 람브디나 피셀라리아 루구브로사, 류코마 살리시스, 로베시아 보트라나, 록소스테게 스틱티칼리스, 리만트리아 디스파르, 마칼라 티리살리스, 말라코소마 종, 마메스트라 브라시카에, 만두카 퀸퀘마쿨라타, 만두카 섹스타, 마루카 테스툴라리스, 멜란크라 픽타, 오페로프테라 브루마타, 오르기이아 종, 팔레아크리타 베르나타, 파필리오 크레스폰테스, 프리가니디아 칼리포르니카, 필로노릭테르 블란카르델라, 피에리스 나피, 피에리스 라파에, 플라티노타 플로우엔다나, 플라티노타 스툴타나, 플라티프틸리아 카르두이닥틸라, 플로디아 인테르푼크텔라, 폰티아 프로토디세, 슈달레티아 우니푼크타, 사불로데스 아에그로타타, 스키주라 콘신나, 시토트로가 세레알렐라, 스필론타 오셀라나, 타우른스토포에아 피티오캄파, 엔솔라 비셀리엘라, 트리코플루시아 히, 우데아 루비갈리스, 크실로미게스 쿠리알리스, 및 이포노메우타 파델라.
dsRNA를 발현하는 엽록체가 있는 트랜스플라스토믹 식물을 인공 곤충 사료 상에서 신생 나비목 유충으로 수행된 생물검정법에서 살곤충 활성에 대해 테스트한다. 나비목 유충을 영리 곤충사육장 (벤존 리서치 인크(Benzon Research Inc.), 펜실베니아주 칼라일)에 의해 유지된 콜로니로부터 수득된 알에서 부화시킨다.
이러한 생물검정법은 곤충 생물검정법용으로 특수하게 디자인된 128-웰 플라스틱 트레이 (C-D 인터내셔날(C-D International), 뉴저지주 피트먼)에서 수행된다. 각각의 웰은 다종 나비목 사료 (사우스랜드 프로덕츠(Southland Products), 애리조나주 레이크 빌리지)를 함유한다. 트랜스플라스토믹 이벤트로부터의 침연된 식물 물질이 사료 내로 혼입된다.
부화로부터 수 시간 이내에, 개별적인 유충을 젖은 낙타털 브러시로 채집하여, 처리된 사료 상에 침착시킨다 (웰 당 1마리의 유충). 그 후, 침입된 웰을 기체 교환을 허용하도록 통기 구멍이 있는, 투명한 플라스틱의 접착성 시트 (C-D 인터내셔날, 뉴저지주 피트먼)로 밀봉한다. 생물검정법 트레이를 제어된 환경 조건 (28℃, ~ 60％ 상대 습도, 16:8 [명:암])에서 5일 동안 유지시킨 후, 각각의 샘플에 노출된 곤충의 총 마릿수, 죽은 곤충의 마릿수, 및 생존 곤충의 중량을 기록한다. 백분율 사망률 및 백분율 성장 억제를 각각의 처리에 대해 계산한다. 성장 억제 (GI)는 하기와 같이 계산된다:
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]
[식 중, TWIT는 처리물에서의 곤충의 총 중량이고,
TNIT는 처리물에서의 곤충의 총 마릿수이고,
TWIBC는 배경 점검물 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총 중량이며,
TNIBC는 배경 점검물 (완충제 대조군)에서의 곤충의 총 마릿수이다].
GI50 (성장 억제)은 테스트 곤충의 평균 성장 (예를 들어, 산 곤충의 중량)이 배경 점검물 샘플에서 나타난 평균값의 50％인 투여량으로 정의된다. 통계 분석은 JMP™ 소프트웨어 (SAS, 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 수행된다. LC50 (치사 농도)는 테스트 곤충의 50％가 사망한 투여량으로 정의된다.
일부 종의 경우, 생물검정법이 32-웰 테스트 트레이에서 수행된다. 약 5 mL의 2％ 물-한천 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 한천이 완전히 고체화되게 한다.
식물은 약 3주령이고, T1 세대에서 테스트된다. T1 잎 물질의 3개의 사본이 완결된다. 1개의 잎을 절단하고 (2.54 cm × 1.27 cm 직사각형), 트레이의 1개의 웰 내에 놓는다. 각각의 웰에 10마리의 개별적인 곤충 유충을 침입시킨다.
침입된 웰을 기체 교환을 허용하도록 통기 구멍이 있는, 투명한 플라스틱의 접착성 시트 (C-D 인터내셔날, 뉴저지주 피트먼)로 밀봉한다. 트레이를 콘비론(conviron) 인큐베이터 내에 놓고, 3일 동안 28℃ (16:8h 명:암, 60％ RH)에서 유지시킨 후, 각각의 잎 조각에 대한 손상의 총량 (0, 5, 10, 15, 25, 50, 75％ 손상 등 내지 100％)을 기록한다.
실시예 8: 트랜스제닉 식물의 생물검정법.
트랜스플라스토믹 식물 세포에서 생산된 dsRNA의 생물활성을 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 방법에 의해 실연한다 (예를 들어, 문헌 [Huang et al., 2006 Econ. Entomol. 99: 194-202] 참조). dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직 또는 조직 조각을 제어 급식 환경에서 표적 곤충에게 먹이는 것에 의해 효능이 실연될 수 있다. 또는, dsRNA를 생산하는 식물로부터 유래된 다양한 식물 조직으로부터 dsRNA 추출물을 제조하고, 본원에서 앞서 기술된 바와 같은 인공 사료 생물검정법에 혼입시킬 수 있다. 이러한 급식 검정법의 결과가 dsRNA를 생산하지 않는 숙주 식물로부터의 적합한 대조군 조직을 사용하는 유사하게 수행된 생물검정법 또는 기타 대조군 샘플에 비교되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
구축물로부터 식물에서 생산된 다양한 이벤트의 생물학적 활성을 나비목 곤충의 식이 활성에 의해 야기되는 잎 손상을 방지하는 것에 대해 테스트한다.
1.0 × 0.5 인치 사각형의 잎 절단물을 V5 (옥수수의 경우) T0 트랜스제닉 식물의 V3 또는 V4 잎으로부터 이중으로 취한다. 각각의 테스트에 대해, 먼저 야생형 식물 잎 조직의 샘플을 취해서 잎 가장자리에서의 교차 오염을 방지한 후, 형질전환된 식물이 이어진다. 각각의 생물검정법 트레이 웰 (32-웰 트레이 및 뚜껑, CD 인터내셔날, 뉴저지주 피트먼)에서, 1개의 잎 절단물을 2％ 물-한천 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 뉴저지주 페어 론) 상에 놓고, 이를 곤충 종 당, 이벤트 당, 및 구축물 당 2회 반복한다. 각각의 웰에 10마리의 신생 나비목 곤충을 침입시키고, 공기 교환을 허용하도록 천공된 플라스틱 뚜껑으로 밀봉한다. 트레이를 28℃ (16:8 시간 명:암, 40％ RH)에 놓고, 3일 후 잎 손상 백분율에 대해 등급을 매긴다. 잎 손상 백분율 데이터를 JMP® 프로(Pro) 9.0.1 (2010년, SAS 인스티튜트 인크(SAS Institute Inc.), 노스캐놀라이나주 캐리)을 사용하여 ANOVA, 및 터키-크래머(Tukey-Kramer) 테스트로의 평균 분리 (분산이 상동성인 경우)로 분석한다.
<표 3> 본 연구에서 사용된 벡터 구축물
Figure pct00018
<표 4> 본 연구에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> The University of Sydney <120> RNA production in higher plants <130> 50089244TPG <150> US 61/951,569 <151> 2014-03-12 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g187f <400> 1 cgctcgagcg gagtgagacc aattctcg 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g188r <400> 2 cgggtacccg gagtgagacc ctgtgtat 28 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g216f/r <400> 3 accaggtctc aggagcatgg agttggatga cagga 35 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g217f/r <400> 4 accaggtctc ctcgagctga cgggaatccc aatatg 36 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g25f <400> 5 tgatagatca tgtcattgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g165f <400> 6 tgaagtagag aaaccggcgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g166r <400> 7 ccaagcagcc tgtttcgatt 20 <210> 8 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g280r <400> 8 aacgacccaa ttgcaagagc ggagctctac caactgagct atatcccccc gagccaagtg 60 gagcgcattt aaatagtgta ccataac 87 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g276r <400> 9 cgaaggataa ttacttgagt tc 22 <210> 10 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide g301r <400> 10 tactcctact cataatgttt tgttactact cataactgtt tcttactctt tgatattatt 60 tgttacttta gc 72 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide BEN0002F <400> 11 gcatgcaaat ctaagtgtag tgct 24 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide BEN0003R <400> 12 catatgtcga atagtattca agatcct 27 <210> 13 <211> 2580 <212> DNA <213> Helicoverpa armigera <400> 13 acgcggggag tctactctgt cacgtcgatg gagacgcatc gcggtcggcc tctctctcaa 60 tattattact ttattaccat acaaaacgtg agtgagtgtc tgtgaactta tttcaacttg 120 agtgacggtt gctccggacc atacagcgag ctgacagttc agccaaggtc atcgatcagc 180 aatttgacac cagttgtgtt tatatactat atgtacgacc acaacagaat accgtgtgcc 240 cctagaaatg tgttttaaca agtatctcat taagctggcg gattacttca gatcagtttc 300 tgatacgtct cgttaatgcc cgtgcgaaca acaacattcg aaatgatcag caacacgaag 360 atcgtgttca ccaagctcct gctgtgctgc ttcgtgtcag gcgccgtcgc gaggtcgtgg 420 gccaaccatc acgacaccac cacgtcaacc acgcagacca cccccaccac tagtcctgtg 480 cctaagaact tccataatga tccactcatc gtcgaaacta aaagtggcct cgtcaaaggc 540 tacgctaaga cagttatggg cagggaagta cacatcttca ccggtattcc gtttgcgaag 600 ccccctctag gaccgttaag attccgcaaa ccggtaccca tcgacccgtg gcatggagta 660 cttgaagcca ctgcgatgcc aaatagctgt tatcaagaac ggtatgagta cttccccggt 720 tttgagggag aggaaatgtg gaatccaaac acaaatatat cagaggactg tctctatcta 780 aacatttggg ttccccagca cttacgagtc cgtcatcatc aagataagcc tcttgcggag 840 aggcccaaag tgccgatact agtgtggatt tacggtggcg gctatatgag tggcacggca 900 acactcaacc tatataaagc agacataatg gcttcttcca gtgatgtaat agtagcatct 960 atgcaatata gggttggggc gttcggattt ttatacttga ataaatattt ctcgccgggc 1020 agtgaagagg cgccgggaaa tatgggctta tgggatcaac aactcgctat tcgttggatt 1080 aaagataatg ctcgtgcttt tggtggtgac ccagaattga taactttgtt tggagagtcg 1140 gcaggcgggg gaagcgtgag tttgcatatg ctttcaccag agatgaaggg attattcaaa 1200 cgaggcatct tgcaatctgg aacgttaaac gctccatgga gttggatgac aggagagaga 1260 gcacaagaca taggaaaagt gttagtagat gactgtaatt gcaatagcag cctactagct 1320 gccgatccga gcttagtgat ggactgtatg cgcggagtcg atgcaaaaac tatatcagta 1380 cagcagtgga attcctatac tggcatattg ggattcccgt cagctcccac ggttgacggc 1440 gtgtttttgc ccaaagaccc ggacacaatg atgaaagaag gcaatttcca taataccgag 1500 gtgcttcttg gaagtaatca agacgaagga acctatttct tactatacga tttccttgac 1560 tacttcgaga aagacgggcc cagcttcttg cagcgggaga aatttctaga aattgtcgac 1620 accatattca aggatttctc caaaataaag agggaagcta tcgtattcca 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agcgtgtgga 2520 aagaaaacgg gacagtgaca aggaacgtta caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 <210> 14 <211> 189 <212> DNA <213> Helicoverpa armigera <400> 14 catggagttg gatgacagga gagagagcac aagacatagg aaaagtgtta gtagatgact 60 gtaattgcaa tagcagccta ctagctgccg atccgagctt agtgatggac tgtatgcgcg 120 gagtcgatgc aaaaactata tcagtacagc agtggaattc ctatactggc atattgggat 180 tcccgtcag 189 <210> 15 <211> 2011 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Inverted repeat nucleotide sequence derived from Helicoverpa armigera <400> 15 catggagttg gatgacagga gagagagcac aagacatagg aaaagtgtta gtagatgact 60 gtaattgcaa tagcagccta ctagctgccg atccgagctt agtgatggac tgtatgcgcg 120 gagtcgatgc aaaaactata tcagtacagc agtggaattc ctatactggc atattgggat 180 tcccgtcaga cgagcccttg gtaaggaaat aattattttc ttttttcctt ttagtataaa 240 atagttaagt gatgttaatt agtatgatta taataatata gttgttataa ttgtgaaaaa 300 ataatttata aatatattgt ttacataaac aacatagtaa tgtaaaaaaa tatgacaagt 360 gatgtgtaag acgaagaaga taaaagttga gagtaagtat attattttta atgaatttga 420 tcgaacatgt aagatgatat acggccggta agaggttcca actttcacca taatgaaata 480 agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa 540 atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 600 cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 660 attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 720 cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 780 gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 840 acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 900 tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 960 aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 1020 gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 1080 gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtctgtga tggcttccat 1140 gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 1200 tcgcgtggat ccggcttact aaaagccaga taacagtatg cgtatttgcg cgctgatttt 1260 tgcggtataa gaatatatac tgatatgtcg gtcccataat agtaattcta gctggtttga 1320 tgaattaaat atcaatgata aaatactata gtaaaaataa gaataaataa attaaaataa 1380 tattttttta tgattaatag tttattatat aattaaatat ctataccatt actaaatatt 1440 ttagtttaaa agttaataaa tattttgtta gaaattccaa tctgcttgta atttatcaat 1500 aaacaaaata ttaaataaca agctaaagta acaaataata tcaaactaat agaaacagta 1560 atctaatgta acaaaacata atctaatgct aatataacaa agcgcaagat ctatcatttt 1620 atatagtatt attttcaatc aacattctta ttaatttcta aataatactt gtagttttat 1680 taacttctaa atggattgac tattaattaa atgaattagt cgaacatgaa taaacaaggt 1740 aacatgatag atcatgtcat tgtgttatca ttgatcttac atttggattg attacagttg 1800 gtctagagat ttcgtctaga tcgtctgacg ggaatcccaa tatgccagta taggaattcc 1860 actgctgtac tgatatagtt tttgcatcga ctccgcgcat acagtccatc actaagctcg 1920 gatcggcagc tagtaggctg ctattgcaat tacagtcatc tactaacact tttcctatgt 1980 cttgtgctct ctctcctgtc atccaactcc a 2011 <210> 16 <211> 8610 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V153 vector sequence <400> 16 gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60 atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240 atgttactag atccctaggg aagttcctat tccgaagttc ctattctctg aaaagtatag 300 gaacttcttt gcgtattggg cgctcttggc ctttttggcc accggtcgta cggttaaaac 360 caccccagta cattaaaaac gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 420 ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 480 caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagtccacta gacgctcacc gggctggttg 540 ccctcgccgc tgggctggcg gccgtctatg gccctgcaaa cgcgccagaa acgccgtcga 600 agccgtgtgc gagacaccgc agccgccggc gttgtggata cctcgcggaa aacttggccc 660 tcactgacag atgaggggcg gacgttgaca cttgaggggc cgactcaccc ggcgcggcgt 720 tgacagatga ggggcaggct cgatttcggc cggcgacgtg gagctggcca gcctcgcaaa 780 tcggcgaaaa cgcctgattt tacgcgagtt tcccacagat gatgtggaca agcctgggga 840 taagtgccct gcggtattga cacttgaggg gcgcgactac tgacagatga ggggcgcgat 900 ccttgacact tgaggggcag agtgctgaca gatgaggggc gcacctattg acatttgagg 960 ggctgtccac aggcagaaaa tccagcattt gcaagggttt ccgcccgttt ttcggccacc 1020 gctaacctgt cttttaacct gcttttaaac caatatttat aaaccttgtt tttaaccagg 1080 gctgcgccct gtgcgcgtga ccgcgcacgc cgaagggggg tgccccccct tctcgaaccc 1140 tcccggcccg ctctcgcgtt ggcagcatca cccataattg tggtttcaaa atcggctccg 1200 tcgatactat gttatacgcc aactttgaaa acaactttga aaaagctgtt ttctggtatt 1260 taaggtttta gaatgcaagg aacagtgaat tggagttcgt cttgttataa ttagcttctt 1320 ggggtatctt taaatactgt agaaaagagg aaggaaataa taaatggcta aaatgagaat 1380 atcaccggaa ttgaaaaaac tgatcgaaaa ataccgctgc gtaaaagata cggaaggaat 1440 gtctcctgct aaggtatata agctggtggg agaaaatgaa aacctatatt taaaaatgac 1500 ggacagccgg tataaaggga ccacctatga tgtggaacgg gaaaaggaca tgatgctatg 1560 gctggaagga aagctgcctg ttccaaaggt cctgcacttt gaacggcatg atggctggag 1620 caatctgctc atgagtgagg ccgatggcgt cctttgctcg gaagagtatg aagatgaaca 1680 aagccctgaa aagattatcg agctgtatgc ggagtgcatc aggctctttc actccatcga 1740 catatcggat tgtccctata cgaatagctt agacagccgc ttagccgaat tggattactt 1800 actgaataac gatctggccg atgtggattg cgaaaactgg gaagaagaca ctccatttaa 1860 agatccgcgc gagctgtatg attttttaaa gacggaaaag cccgaagagg aacttgtctt 1920 ttcccacggc gacctgggag acagcaacat ctttgtgaaa gatggcaaag taagtggctt 1980 tattgatctt gggagaagcg gcagggcgga caagtggtat gacattgcct tctgcgtccg 2040 gtcgatcagg gaggatattg gggaagaaca gtatgtcgag ctattttttg acttactggg 2100 gatcaagcct gattgggaga aaataaaata ttatatttta ctggatgaat tgttttagta 2160 cctagatgtg gcgcaacgat gccggcgaca agcaggagcg caccgacttc ttccgcatca 2220 agtgttttgg ctctcaggcc gaggcccacg gcaagtattt gggcaagggg tcgctggtat 2280 tcgtgcaggg caagattcgg aataccaagt acgagaagga cggccagacg gtctacggga 2340 ccgacttcat tgccgataag gtggattatc tggacaccaa ggcaccaggc gggtcaaatc 2400 aggaataagg gcacattgcc ccggcgtgag tcggggcaat cccgcaagga gggtgaatga 2460 atcggacgtt tgaccggaag gcatacaggc aagaactgat cgacgcgggg ttttccgccg 2520 aggatgccga aaccatcgca agccgcaccg tcatgcgtgc gccccgcgaa accttccagt 2580 ccgtcggctc gatggtccag caagctacgg ccaagatcga gcgcgacagc gtgcaactgg 2640 ctccccctgc cctgcccgcg ccatcggccg ccgtggagcg ttcgcgtcgt ctcgaacagg 2700 aggcggcagg tttggcgaag tcgatgacca tcgacacgcg aggaactatg acgaccaaga 2760 agcgaaaaac cgccggcgag gacctggcaa aacaggtcag cgaggccaag caagccgcgt 2820 tgctgaaaca cacgaagcag cagatcaagg aaatgcagct ttccttgttc gatattgcgc 2880 cgtggccgga cacgatgcga gcgatgccaa acgacacggc ccgctctgcc ctgttcacca 2940 cgcgcaacaa gaaaatcccg cgcgaggcgc tgcaaaacaa ggtcattttc cacgtcaaca 3000 aggacgtgaa gatcacctac accggcgtcg agctgcgggc cgacgatgac gaactggtgt 3060 ggcagcaggt gttggagtac gcgaagcgca cccctatcgg cgagccgatc accttcacgt 3120 tctacgagct ttgccaggac ctgggctggt cgatcaatgg ccggtattac acgaaggccg 3180 aggaatgcct gtcgcgccta caggcgacgg cgatgggctt cacgtccgac cgcgttgggc 3240 acctggaatc ggtgtcgctg ctgcaccgct tccgcgtcct ggaccgtggc aagaaaacgt 3300 cccgttgcca ggtcctgatc gacgaggaaa tcgtcgtgct gtttgctggc gaccactaca 3360 cgaaattcat atgggagaag taccgcaagc tgtcgccgac ggcccgacgg atgttcgact 3420 atttcagctc gcaccgggag ccgtacccgc tcaagctgga aaccttccgc ctcatgtgcg 3480 gatcggattc cacccgcgtg aagaagtggc gcgagcaggt cggcgaagcc tgcgaagagt 3540 tgcgaggcag cggcctggtg gaacacgcct gggtcaatga tgacctggtg cattgcaaac 3600 gctagggcct tgtggggtca gttccggctg ggggttcagc agccagcgct ttactgagat 3660 cctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020 gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080 gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260 ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320 ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380 gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 4440 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 4500 tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttggatctc ctgtggttgg 4560 catgcacata caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta 4620 ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat 4680 agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgctagtgga tctcccagtc acgacgttgt 4740 aaaacgggcg ccccgcggaa agcttgctag ctgagacttt tcaacaaagg ataatttcgg 4800 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa 4860 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc attcaagatc 4920 tctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 4980 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgacatctcc actgacgtaa 5040 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc 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tatatagtat tattttcaat caacattctt 6780 attaatttct aaataatact tgtagtttta ttaacttcta aatggattga ctattaatta 6840 aatgaattag tcgaacatga ataaacaagg taacatgata gatcatgtca ttgtgttatc 6900 attgatctta catttggatt gattacagtt ggtctagaga tttcgtctag atcgtctgac 6960 gggaatccca atatgccagt ataggaattc cactgctgta ctgatatagt ttttgcatcg 7020 actccgcgca tacagtccat cactaagctc ggatcggcag ctagtaggct gctattgcaa 7080 ttacagtcat ctactaacac ttttcctatg tcttgtgctc tctctcctgt catccaactc 7140 catgctccga gctcggtacc gctagccgta ccttttacta gtgatatccc tgtgtgaaat 7200 tgttatccgc tacgcgtgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc 7260 ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa 7320 taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc 7380 aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat 7440 cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ccatgggaag ttcctattcc gaagttccta 7500 ttctctgaaa agtataggaa cttcagcgat cgcagacgtc gggatcttct gcaagcatct 7560 ctatttcctg aaggtctaac ctcgaagatt 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gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 6000 agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt 6060 tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 6120 ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 6180 taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 6240 tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 6300 gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 6360 atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 6420 ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 6480 cactattctc agaatgactt ggttgagtat tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 6540 ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc 6600 aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg 6660 ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 6720 gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 6780 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gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 7680 ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 7740 tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 7800 ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 7860 tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 7920 attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 7980 tcagtgagcg aggaagc 7997

Claims (26)

  1. 색소체가
    - - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역
    - dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
    를 포함하는 핵산 구축물을 포함하고,
    - dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
    관다발 식물의 색소체.
  2. 제1항에 있어서, 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 dsRNA를 추가로 포함하고, 상기 dsRNA는 코딩 영역에 의해 코딩되는 것인 색소체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 코딩 영역이, 식물의 게놈에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 색소체.
  4. 제3항에 있어서, 코딩 영역이 식물의 해충 또는 병원체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 색소체.
  5. 제1항에 있어서, siRNA 분자가 색소체의 내부에서 형성되지 않는 것인 색소체.
  6. 제1항에 있어서, dsRNA가, 코딩 영역에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 모두 함유하는 것인 색소체.
  7. 제6항에 있어서, dsRNA에 색소체에 의한 편집, 스플라이싱(splicing) 또는 캡핑(capping)이 적용되는 것인 색소체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 살곤충제를 코딩하기 위한 적어도 하나의 추가적인 코딩 영역을 추가로 포함하는 색소체.
  9. 제8항에 있어서, 살곤충제가 살곤충성 폴리펩티드인 색소체.
  10. - 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 코딩하기 위한 코딩 영역;
    - dsRNA 분자의 생산을 가능하게 하기 위한, 색소체에서 작동가능한 프로모터
    - 관다발 식물의 색소체 게놈 내로의 구축물의 통합에 대해 선택적인 하나 이상의 통합 부위
    를 포함하고,
    - dsRNA는 그로부터의 siRNA 생산을 가능하게 하는 서열을 갖는 것인,
    관다발 식물의 형질전환을 위한 핵산 구축물.
  11. 제10항에 있어서, 코딩 영역이, 식물의 게놈에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 구축물.
  12. 제10항에 있어서, 코딩 영역이 식물의 해충 또는 병원체의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 구축물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 구축물이 적어도 하나의 살곤충제를 코딩하기 위한 적어도 하나의 추가적인 코딩 영역을 포함하는 구축물.
  14. 제13항에 있어서, 살곤충제가 살곤충성 폴리펩티드인 구축물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 색소체 또는 구축물을 함유하는 식물.
  16. 제15항에 있어서, 식물이 제1항의 색소체에 대해 실질적으로 동형질성(homoplasmic)인 식물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 식물이
    - 살곤충성 폴리펩티드를 코딩하기 위한 적어도 하나의 추가적인 핵산 구축물; 및/또는
    - 살곤충성 RNA를 코딩하기 위한 적어도 하나의 추가적인 핵산 구축물
    을 추가로 포함하는 식물.
  18. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 핵산 구축물이 식물 세포의 핵 내에 위치하는 것인 식물.
  19. 제18항의 식물로부터 유래된 번식 물질.
  20. - 관다발 식물의 색소체를 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 핵산 구축물로 형질전환시키는 단계;
    - 핵산 구축물로부터의 색소체에서의 dsRNA 생산을 위한 조건을 세포에 제공하는 단계
    를 포함하는, 관다발 식물의 세포 내에 dsRNA를 축적시키는 방법.
  21. 제20항에 있어서, dsRNA 분자가 식물 세포의 엽록체의 게놈 내로 안정적으로 통합된 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 핵산 구축물이 선별가능한 마커를 포함하는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 핵산 구축물의 선별가능한 마커를 사용하여 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 구축물에 대해 실질적으로 동형질성인 식물 세포 또는 식물을 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물을 해충 또는 해충의 환경에 제시하는 것을 포함하는, 곤충 해충을 방제하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 해충 곤충의 방제가 요구되는 환경이 작물 또는 식물의 경작지인 방법.
  26. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물; 또는
    - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하는 식물, 및 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 색소체 또는 핵산 구축물을 포함하지 않는 식물 형태의 비-엽록체 형질전환체 피난처 식물
    을 포함하는 작물 또는 경작지.
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