JP2002516112A - 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節 - Google Patents

植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節

Info

Publication number
JP2002516112A
JP2002516112A JP2000551014A JP2000551014A JP2002516112A JP 2002516112 A JP2002516112 A JP 2002516112A JP 2000551014 A JP2000551014 A JP 2000551014A JP 2000551014 A JP2000551014 A JP 2000551014A JP 2002516112 A JP2002516112 A JP 2002516112A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
promoter
dna sequence
dna
gene
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000551014A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002516112A5 (ja
Inventor
ピーター・バーナード・ハイフェッツ
デイビッド・アンドリュー・パットン
ジョシュア・ズビ・レビン
チュエ・チュデン
アニック・ジャンヌ・ドゥ・フラモン
マーサ・エム・ダン
ジェン・ション・チェン
Original Assignee
ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22188183&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2002516112(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト filed Critical ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト
Publication of JP2002516112A publication Critical patent/JP2002516112A/ja
Publication of JP2002516112A5 publication Critical patent/JP2002516112A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントを使用した植物内の標的遺伝子の発現を変更する方法に関する。センスおよびアンチセンスRNAフラグメントは対になり、二本鎖RNA分子を形成でき、それにより遺伝子の発現を変える。本発明はまた本発明の方法を使用して得た植物、その子孫および種子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、植物内の遺伝子発現を変える、特に、該遺伝子のセンスおよびアン
チセンスRNAフラグメントを使用した方法、および本発明の方法を使用して得ら
れた遺伝子発現が変えられた植物に関する。
【０００２】 分子生物学および植物形質転換の方法における開発は、例えば、昆虫および真
菌または細菌病原体に対する耐性、除草剤に対する耐性または付加価値性質のよ
うな種々の望ましい性質を有するトランスジェニック植物の製造を可能にしてい
る。これらの望ましい性質は、主に植物内のトランスジーンの過剰発現により得
られる。しかし、ある場合、特定の遺伝子の発現を変え、商業的利益の望ましい
表現型または特性を有する植物を作るように植物を修飾することも望まれる。遺
伝子の発現を変えるための現在の方法は、通常センスまたはアンチセンス抑制に
基づく。例えば、ペチュニアにおけるカルコン合成遺伝子のセンス抑制は、着色
が変えられた花をもたらし、トマトにおけるポリガラクツロニダーゼ遺伝子のア
ンチセンス抑制は果実成熟の遅延を導く。不運なことに、これらの方法はしばし
ば、遺伝子発現を変えるその能力に関して可変性であり、予測できず、多くの場
合、特定の遺伝子活性の完全な破壊は達成されない。遺伝子発現を変えるための
方法は、技術的に試みられている触媒的リボヌクレオチドまたはリボザイムの使
用、または、遺伝的に最も望ましいが、このような目的で慣用的に使用される現
在利用可能な方法では、残念なことに十分ではない相同性遺伝子破壊を含む。し
たがって、改善されたそして商業的に重要な特性を有する植物を得るための、植
物細胞内の遺伝子の発現を効率的におよび予測可能に変えることができる新規方
法のための、長く待望されているが、充たされていない必要性がある。
【０００３】 本発明は、分子技術および遺伝子形質転換を使用した、改善された特性および
性質の植物の製造に関する。特に、本発明は遺伝子のセンスおよびアンチセンス
RNAフラグメントを使用した、植物細胞における遺伝子の発現を変える方法に関
する。重要なことに、このようなセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントは
二本鎖RNA分子の形成ができる。本発明はまたこのような方法を使用して得た植
物細胞、このような細胞由来の植物、このような植物の子孫およびこのような植
物由来の種子に関する。このような植物細胞または植物において、特定の遺伝子
発現の変化が、当分野で現在既知の方法を使用して得られる特定の遺伝子の遺伝
子発現の変化よりも、より効率的であり、選択的であり、より予測可能である。
【０００４】 本発明は、従って以下のものを提供する： 標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子のアンチセンスRNAフラ
グメントを植物細胞内に挿入することを含み、該センスRNAフラグメントおよび
該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成でき、該標的遺伝子の該
細胞内での発現が変えられる方法。好ましい態様において、RNAフラグメントは
二つの異なるRNA分子に含まれる。他の好ましい態様において、RNAフラグメント
は該細胞に挿入する前に混合する。他の好ましい態様において、RNAフラグメン
トを二本鎖RNA分子を形成させる条件下で、該細胞に挿入前に混合する。他の好
ましい態様において、RNAフラグメントを該細胞に連続的に挿入する。さらにま
た別の好ましい態様において、RNAフラグメントは一つのRNA分子に含まれる。こ
のような場合、RNA分子は、好ましくは、その中に包含されるRNAフラグメントが
二本鎖RNA分子を形成するように折りたたまれることが可能である。
【０００５】 本発明は、更に以下のものを提供する： 植物細胞内に、該細胞内で標的遺伝子のセンスRNAフラグメントを発現できる第
１DNA配列、および該細胞内で標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを発現
できる第２DNA配列を挿入することを含み、該センスRNAフラグメントおよび該ア
ンチセンスRNAフラグメントは二本鎖RNA分子を形成でき、該標的遺伝子の該植物
細胞内での発現が変更される。好ましい態様において、DNA配列は植物細胞のゲ
ノムに安定に統合される。好ましい態様において、DNA分子は更に該第１または
該第２DNA配列に操作可能に結合したプロモーターを含む。他の好ましい態様に
おいて、第１DNA配列および第２DNA配列は二つの異なるDNA分子内に包含される
。
【０００６】 あるいは、第１DNA配列および第２DNA配列が一つのDNA分子内に包含される。
この場合、第１DNA配列および第２DNA配列が好ましくは該DNA分子の同じDNA鎖に
含まれ、そして、好ましくは、センスRNAフラグメントおよびアンチセンスRNAフ
ラグメントが一つのRNA分子内に包含される。好ましくは、RNA分子は、その中に
包含されている該RNAフラグメントが二本鎖領域を形成するように折りたたまれ
ることが可能である。他の好ましい態様において、センスRNAフラグメントおよ
びアンチセンスRNAフラグメントは二本鎖RNA分子中に含まれ、または二本鎖RNA
分子として発現される。この場合、第１DNA配列および第２DNA配列は好ましくは
二方向プロモーターに操作可能に結合しているか、または、あるいは、第２DNA
配列が第１プロモーターに操作可能に結合し、第２DNA配列が第２プロモーター
に操作可能に結合し、第１プロモーターおよび第２プロモーターが同じプロモー
ターまたは異なるプロモーターである。他の好ましい態様において、第１DNA配
列および第２DNA配列は該DNA分子の相補的鎖中に包含される。
【０００７】 更に別の好ましい態様において、第２DNA鎖は該DNA分子中の第２DNA配列の相
補的DNA鎖である。 この場合、DNA分子は更に該第１DNA配列に操作可能に結合した第１プロモータ
ーを含む。好ましい態様において、DNA分子は更に第１部位特異的組換え部位を
該第１プロモーターと該第１DNA配列の間に、および第１部位特異的組換え部位
を該DNA配列の３'末端に含み、部位特異的リコンビナーゼの存在下、該第１およ
び第２部位特異的組換え部位は該第１および該第２部位特異的組換え部位の間の
該第１DNA配列を逆にすることができ、好ましくは、互いに逆の配向である。植
物細胞は、好ましくは、更に、該部位特異的組換え部位を認識することができる
部位特異的リコンビナーゼを含む。
【０００８】 更に別の好ましい態様において、DNA分子は更に、該第１DNA配列に操作可能に
結合した第１プロモーターおよび該第２DNA配列に操作可能に結合した第２第２
プロモーターを含み、第１プロモーターおよび第２プロモーターは同じプロモー
ターを含み、または異なるプロモーターを含む。
【０００９】 他の好ましい態様において、標的遺伝子は該植物細胞の天然遺伝子、好ましく
は該植物細胞の必須遺伝子である。更に別の好ましい態様において、DNA分子中
のプロモーターは該天然標的遺伝子の天然プロモーターを含む。更に好ましい態
様において、プロモーターは異種プロモーター、例えば、組織特異的プロモータ
ー、発育調節プロモーター、構造プロモーターまたは誘導性プロモーターである
。所望により、プロモーターはプロモーターの各側でDNA配列の転写開始をでき
る分岐プロモーターである。他の好ましい態様において、遺伝子は、好ましくは
該植物細胞のゲノムに安定に統合された、あるいは、染色体外分子として該植物
細胞に存在する、該植物細胞中の異種遺伝子である。
【００１０】 更に別の好ましい態様において、DNA配列は更に該センスおよびアンチセンスRNA
フラグメントをコードするDNA配列の間にリンカーを含む。リンカーは、例えば
、機能的遺伝子、例えば、選択可能マーカー遺伝子または調節配列、例えば、イ
ントロン処理シグナルを含む発現カセットを含む。
【００１１】 本発明は更にまた以下のものを提供する： 該植物細胞内の該標的遺伝子の発現がRNAフラグメントにより変えられている、
本発明のセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントを含む植物細胞、その植物
細胞に由来する植物およびその子孫、およびその植物に由来する種子。
【００１２】 本発明は更にまた以下のものを提供する： 本発明の方法により得る植物細胞。
【００１３】 “二本鎖RNA(dsRNA)”分子は、標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび標
的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを含み、両方とも互いに相補的なヌク
レオチド配列を含み、それによりセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントが
対となり、二本鎖RNA分子を形成することが可能となる。
【００１４】 “相補的”なる用語は、逆平行ヌクレオチド配列における相補的塩基対の間の
水素結合の形成により、互いに対を形成することが可能となる逆平行ヌクレオチ
ド配列を含む二つのヌクレオチド配列を意味する。
【００１５】 “逆平行”なる用語は、本明細書では、一方のヌクレオチド配列では５'−３'
方向で、他方のヌクレオチド配列では３'−５'の方向で走るホスホジエステル結
合を有する相補的塩基残基の間の水素結合を通して対になる二つのヌクレオチド
配列を意味する。
【００１６】 “標的遺伝子”は、植物細胞内の任意の遺伝子である。例えば、標的遺伝子は
既知の機能の遺伝子または、その機能が未知であるが、その完全なまたは部分的
ヌクレオチド配列が既知である遺伝子である。あるいは、標的遺伝子の機能およ
びそのヌクレオチド配列は両方とも未知である。標的遺伝子は植物細胞の天然遺
伝子または予め植物細胞内または該植物細胞の親細胞に、例えば、遺伝子形質転
換により挿入されている異種遺伝子である。異種標的遺伝子は植物細胞のゲノム
に安定に統合されているか、または植物細胞に染色体外分子として、例えば、自
己複製染色体外分子として存在する。
【００１７】 “天然”遺伝子なる用語は、非形質転換植物細胞のゲノムに存在する遺伝子を
意味する。
【００１８】 “必須”遺伝子は、例えば、植物の生育または製造に必須である生合成酵素、
レセプター、シグナル伝達タンパク質、構造遺伝子生産物、または輸送タンパク
質のようなタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１９】 植物細胞内の標的遺伝子の発現を“変える”のは、本発明の方法を適用した後
の植物細胞における標的遺伝子の発現のレベルが、その方法の適用前の細胞にお
ける発現と異なることを意味する。遺伝子発現を変えるのは、好ましくは、植物
細胞内の標的遺伝子の発現が減少する、好ましくは強く減少する、より好ましく
は遺伝子の発現が検出されないことを意味する。必須遺伝子の発現の変更は、植
物細胞またはそれ由来の植物内のノックアウト変異表現型をもたらし得る。
【００２０】 “単離”は、本発明の内容において、人間の手により、天然環境から離れて存
在し、従って天然の生産物ではない単離核酸分子を意味する。単離核酸分子は、
精製形で存在し得、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞のような非天
然環境で存在し得る。
【００２１】 本明細書で使用する“発現カセット”は、適当な宿主細胞内で特定のヌクレオ
チド配列の発現を指向できるDNA配列を意味し、停止シグナルに操作可能に結合
した目的のヌクレオチド配列に操作可能に結合したプロモーターを含む。典型的
に、ヌクレオチド配列の適当な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は、通常目
的のタンパク質をコードするが、また目的の機能的RNA、例えば、センスまたは
アンチセンス方向でコードするアンチセンスRNAまたは非翻訳RNAをコードし得る
。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得、少なくともそ
の一つのコンポーネントが、少なくとも一つの他のコンポーネントに関して異種
であることを意味する。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現に有用な
組換え形で得られるものであり得る。しかし、典型的に、発現カセットは宿主に
関して異種であり、即ち、発現カセットの特定のDNA配列は宿主細胞に天然で存
在せず、宿主細胞または宿主細胞の先祖に、形質転換により挿入されなければな
らない。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構造的プロモーターまた
は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝された時にのみ転写を開始する誘導性プ
ロモーターの制御下にあり得る。植物のような多細胞性生物において、プロモー
ターはまた特定の組織または器官または発育段階に特定であり得る。
【００２２】 本明細書で使用する“異種”なる用語は、“異なる天然起源”を意味し、また
は非天然状態を示す。例えば、宿主細胞が他の生物、特に他の種由来の核酸配列
で形質転換された場合、核酸配列は宿主細胞に関して、また核酸配列を担持する
宿主細胞の子孫に関しても異種である。同様に、異種は、同じ天然、原細胞タイ
プに由来し、挿入されるが、天然状態では存在しない、例えば、異なるコピー数
、または異なる調節要素の制御下にあるものを意味する。
【００２３】 最も広い意味において、“実質的に同様”なる用語は、ヌクレオチド配列に関
して使用するとき、例えば、一つのアミノ酸の変化が発生するポリペプチド機能
に影響しない場合、対応する配列が、対照ヌクレオチド配列によりコードされる
ポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を有するポリペプチドをコードする
ものである、対照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味する。望
ましくは、実質的に同様のヌクレオチド配列は対照ヌクレオチド配列によりコー
ドされるポリペプチドをコードする。実質的に同様のヌクレオチド配列と対照ヌ
クレオチド配列の間の同一性の割合は(相補的配列の塩基の総数で割った相補的
配列における相補的塩基の数)、望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは
８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より
更に好ましくは少なくとも９９％である。
【００２４】 “調節要素”は、ヌクレオチド配列の発現の寄与に関する配列を意味する。調
節要素は、目的のヌクレオチド配列に制御可能に結合したプロモーターおよび停
止シグナルを含む。それらはまた典型的にヌクレオチド配列の適当な翻訳に必要
な配列を包含する。
【００２５】 “植物”なる用語は、任意の発育段階の植物または植物の部分を意味する。そ
の中には切り枝、細胞または組織培養および種子も含む。本発明と関連して使用
する限り、“植物組織”なる用語は、全植物、植物細胞、植物器官、植物種子、
プロトプラスト、カルス、培養物、および構造および／または機能的単位に組織
化された植物細胞のグループを含むが、これらに限定されない。
【００２６】 本発明は、植物細胞内の遺伝子発現の調節法に関する。植物細胞内の遺伝子の
発現を調節するために一般に利用可能な方法は予測性に欠け、どの遺伝子を調節
するかに依存して可変性を示す。本方法はこれらの問題を解決し、植物細胞にお
ける再現性があり、有効な遺伝子の調節のために提供される。
【００２７】 本発明は、植物細胞内の遺伝子の発現を変えるために、標的遺伝子のセンスRN
AフラグメントおよびアンチセンスRNAフラグメントを利用する。第１の態様にお
いて、本発明は、植物細胞内への標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該
標的細胞のアンチセンスRNAフラグメントの挿入を含み、該センスRNAフラグメン
トおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子の形成をでき、該標的
遺伝子の該細胞内での発現が変えられる、植物細胞内の標的遺伝子の発現を変え
るための方法を提供する。好ましい態様において、RNAフラグメントは植物細胞
に異なる形質転換法により挿入される。例えば、同時継続出願０８／７１７,６
７６号に記載のように、RNAフラグメントは粒子衝撃を使用して宿主細胞に移入
される。他の好ましい態様において、RNAフラグメントがプロトプラストまたは
他のタイプの細胞に、Lebel et al. (1995) Theor. Appl. Genet. 91:899-906に
記載のようなPEG−介在形質転換により、またはエレクトロポレーションにより
挿入する。他の好ましい態様において、RNAフラグメントのマイクロインジェク
ションのような他の技術を使用する。
【００２８】 他の好ましい態様において、RNAフラグメントは二つの異なるRNA分子に包含さ
れる。この場合、RNAフラグメントを該細胞に挿入前に、例えば、二本鎖RNA分子
を形成させる条件下で混合する。他の好ましい態様において、RNAフラグメント
を該細胞に連続して挿入する。好ましくは、RNA分子の各々の挿入の間の間隔は
短く、好ましくは１時間より短い。更に別の態様において、RNAフラグメントは
一つのRNA分子に包含される。一つのRNA分子の使用により、二つの相補的RNAブ
ラグメントが、対形成および二本鎖形成に好都合であるように密接して近い。こ
の場合、RNA分子は、好ましくはその中に含まれる該RNAフラグメントが二本鎖領
域の形であるように折りたたまれることが可能である。この場合、RNAフラグメ
ントの相補的部分は互いに認識し、互いに対を形成し、二本鎖RNA分子を形成す
る。好ましい態様において、RNAフラグメントを、細胞挿入前に二本鎖RNA分子を
形成させる条件下でインキュベートする。更に別の態様において、RNA分子はセ
ンスRNAフラグメントとアンチセンスRNAフラグメントの間にリンカーを含む。リ
ンカーは、好ましくは機能的遺伝子、例えば、選択可能マーカー遺伝子を含む発
現カセットによりコードされるRNA配列を含む。他の態様において、リンカーは
調節配列によりコードされるRNA配列を含み、それは、例えば、イントロン処理
シグナルを含む。
【００２９】 更に好ましい態様において、本発明は、植物細胞内に、該細胞内で標的遺伝子
のセンスRNAフラグメントを発現できる第１DNA配列および該細胞内で該標的遺伝
子のアンチセンスRNAフラグメントを発現できる第２DNA配列を挿入することを含
み、該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントは二本鎖RN
A分子を形成でき、該細胞内の該標的遺伝子の発現が変えられる、方法を提供す
る。好ましい態様において、第１DNA配列および第２DNA配列は、植物細胞のゲノ
ム内に安定に統合される。他の好ましい態様において、第１DNA配列および第２D
NA配列は、植物細胞内に、染色体外分子上、例えば、自己複製分子上に存在する
。あるいは、第１DNA配列は、植物細胞のゲノム内に安定に統合され、第２DNA配
列は植物細胞内に染色体外分子上に存在する。
【００３０】 他の好ましい態様において、DNA配列は二つの異なるDNA分子に含まれる。この
場合、第１DNA配列は第１プロモーターに操作可能に結合し、第２DNA配列は第２
プロモーターに操作可能に結合する。
【００３１】 他の好ましい態様において、DNA配列は一つのDNA分子に包含される。好ましく
は、第１および第２DNA配列はDNA分子の同じDNA鎖内に包含され、好ましくは、
センスRNAフラグメントおよびアンチセンスRNAフラグメントが、DNA分子により
コードされる一つのRNA分子内に含まれ、またはそれとして発現される。この場
合、DNA分子は更に第１または第２DNA配列に操作可能に結合したプロモーターを
含み、プロモーターは第１および第２DNA配列を転写できる。プロモーターは、
好ましくはアンチセンスフラグメントをコードするDNA配列に操作可能に結合し
、これはそれ自体センスフラグメントをコードするDNA配列に結合する。あるい
は、プロモーターはセンスフラグメントをコードするDNA配列に操作可能に結合
し、これはそれ自体アンチセンスフラグメントをコードするDNA配列に結合する
。一つのRNA分子の使用により、二つの相補的RNAフラグメントは、二本鎖形成に
好都合であるように密接して近い。
【００３２】 あるいは、DNA配列が同じDNA鎖に包含される場合、二つの別のRNA分子を作り
、例えば、一つのRNA分子はセンスRNAフラグメントを含み、一つのRNA分子はア
ンチセンスRNAフラグメントを含む。この場合、DNA分子は好ましくは更にRNAフ
ラグメントの発現をできる調節要素を含む。好ましい態様において、このような
調節要素は分岐、２方向プロモーターを含み、これはセンスRNAフラグメントを
コードするDNA配列とアンチセンスRNAフラグメントをコードするDNA配列の間に
位置する。他の好ましい態様において、同じプロモーターまたは、あるいは、別
のプロモーターを含む二つの別のプロモーターを二つのDNA配列の間に置く。更
に他の好ましい態様において、DNA分子は第１DNA配列に操作可能に結合した第１
プロモーターおよび第２DNA分子に操作可能に結合した第２プロモーターを含み
、DNA配列が二つのプロモーターの間に置かれ、二つのプロモーターは逆方向で
の転写の指示ができる。更に別の態様において、DNA配列は更に、該二つの相補
的RNAフラグメントをコードするDNA配列の間にリンカーを含む。リンカーは、好
ましくは、機能的遺伝子、例えば、選択可能マーカー遺伝子を含む発現カセット
を含む。他の態様において、リンカーは、例えば、イントロン処理シグナルを含
む調節配列を含む。
【００３３】 更に別の好ましい態様において、第１および第２DNA配列はDNA分子の相補的DN
A鎖中に含まれる。より好ましくは、第１DNA配列がDNA分子中の第２DNA配列の相
補鎖である。例えば、この場合、第１DNA配列は標的遺伝子のコード鎖に対応し
、センスRNAフラグメントの発現ができ、第２DNA配列は標的遺伝子の相補的非コ
ード鎖に対応し、アンチセンスRNAフラグメントの発現ができる。このように、
この場合、二つの異なるRNA分子が好ましく産生される。したがって、ここでは
、DNA分子は第１DNA配列の５'末端に操作可能に結合し、第１DNA配列の発現がで
きる第１プロモーター、および、第１DNA配列の３'末端に結合し、第１DNA配列
の相補鎖である第２DNA配列の発現ができる第２プロモーターを含む。好ましい
態様において、二つの異なるプロモーターを使用し、あるいは、同じプロモータ
ーを使用し、二つのDNA配列を発現する。他の好ましい態様において、DNA分子は
更にプロモーターの遠位に転写ターミネーターを含む。好ましくは、この場合、
転写は一つのプロモーターの３'末端で開始し、一つの方向でDNA配列を通って処
理され、第２プロモーターを通って３'末端から５'末端に処理され、第２プロモ
ーターの５'末端の転写ターミネーターで停止する。転写ターミネーターの使用
はRNA転写の安定に働き得る。
【００３４】 更に別の好ましい態様において、DNA分子は更に該第１DNA配列に操作可能に結
合したプロモーターを含み、更に、該プロモーターと該第１DNA配列の間に第１
部位特異的組換え部位および該DNA配列の３'末端に第２部位特異的組換え部位を
含み、該第１および第２部位特異的組換え部位は該第１DNA配列を該第１および
該第２組換え部位の間で、部位特異的認識部位の認識ができる部位特異的リコン
ビナーゼの存在下で逆転できる。リコンビナーゼ非存在下で、第１DNA配列によ
りコードされるセンスRNAフラグメントのみが産生できる。対応するリコンビナ
ーゼ存在下で、部位特異的組換え部位の間の対応DNA配列は逆転され、第２DNA配
列はプロモーターに操作可能に結合し、アンチセンスフラグメントが発現される
ようになる。リコンビナーゼの連続した存在下で、更なるDNA配列の逆転が起こ
り、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの両方が蓄積される。本発明は
、従って、また更に、該部位特異的組換え部位の認識ができる部位特異的リコン
ビナーゼを含む。本発明のこの態様は、実施例５に更に記載する。
【００３５】 本発明のDNA分子において、DNA配列は好ましくはプロモーターに操作可能に結
合する。好ましい態様において、DNA分子内のプロモーターは、標的遺伝子が発
現されるように、二本鎖RNAが同じ組織内に、発育の同時期に存在することを確
実とするために、不活性にする該天然標的遺伝子の天然プロモーターを含む。他
の態様において、プロモーターは異種プロモーター、例えば、組織特異的プロモ
ーター、発育調節プロモーター、構造プロモーター、分岐プロモーターまたは誘
導性プロモーターである。他の好ましい態様において、遺伝子は該植物細胞に異
種遺伝子である。停止シグナルはまた、DNA分子に所望により挿入される。
【００３６】 単一RNA分子または二つの別のRNA分子は、好ましくは二本鎖領域を形成でき、
RNAフラグメントの相補的部分が互いに認識し、互いに対を形成し、二本鎖RNA分
子を形成する。本発明のDNA分子は、当分野で既知のまたは下記の方法を使用し
て植物細胞内に形質転換する。例えば、微粒子銃、マイクロインジェクションま
たはAgrobacterium介在形質転換を使用する。また、エレクトロポレーションま
たは化学処理(例えば、PEG処理)を使用した本発明のDNA分子でのプロトプラスト
の形質転換を使用する。
【００３７】 あるいは、本発明のDNA分子またはRNAフラグメントを植物細胞内に、いわゆる
アグロインフェクションを介して挿入するために、ウイルスベクターを使用する
。他の好ましい態様において、本発明のDNAまたはRNAフラグメントは、植物細胞
内に、真空浸潤により、または葉表面の摩擦により挿入する。
【００３８】 本方法は、該植物細胞内の該標的遺伝子の発現が該RNAフラグメントにより変
えられた、本発明のセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントを含む植物細胞
、植物細胞由来の植物および子孫、およびその植物由来の種子をもたらし得る。
【００３９】 本発明において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの間の相補的領
域の長さは、望ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、より望ましくは少なく
とも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５００bp長である。好ましくは
相補的領域は５kbより小さく、より好ましくは２kbより小さい。所望により、セ
ンスおよびアンチセンスRNAフラグメントの間の相補的領域は、標的遺伝子のコ
ード領域を含む。他の好ましい態様において、相補的領域は標的遺伝子の非翻訳
領域(UTR)、例えば、５'UTRまたは３'UTRを含む。他の好ましい態様において、
本発明のセンスまたはアンチセンスRNAフラグメントをコードするDNA配列はc−D
NA分子由来である。他の態様において、プロモーターまたは停止シグナルのよう
な、発現が変えられる標的遺伝子の調節要素を含む。
【００４０】 他の好ましい態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの間
の相補的領域は、発現を変える遺伝子の対応する配列と同一である。他の好まし
い態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの間の相補的領域
は、発現を変え、まだ遺伝子の発現の変更が可能である遺伝子の対応する配列と
実質的に同様である。この場合、相補的領域は発現を変える遺伝子の対応する配
列と望ましくは少なくとも５０％同一であり、より望ましくは少なくとも７０％
同一であり、好ましくは少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくと
も９５％同一である。それにより、一つの二本鎖RNA分子の使用は一つの遺伝子
または複数の遺伝子の発現の変更が可能であり、一つの遺伝子は二本鎖RNAと同
一の配列を含むか、二本鎖RNAと実質的に同様である。
【００４１】 他の好ましい態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントお間
の相補的領域は、センスおよびアンチセンスフラグメントの間にミスマッチを含
まない。他の好ましい態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメン
トの間の相補的領域は、少なくとも一つのミスマッチをセンスおよびアンチセン
スRNAフラグメントの間に含み、二つのRNAフラグメントはまだ対形成し、二本鎖
RNA分子を形成でき、それにより遺伝子の発現が変えられる。相補的領域のセン
スおよびアンチセンスRNAフラグメントの間に、望ましくは５０％より少ないミ
スマッチ、より望ましくは３０％より少ないミスマッチ、好ましくは２０％より
少ないミスマッチ、より好ましくは１０％より少ないミスマッチ、より更に望ま
しくは５％より少ないミスマッチが存在する。
【００４２】 本発明の方法は、例えば、植物細胞の代謝経路、植物の疾病に対する耐性また
は感受性または細胞分化に関する遺伝子の発現の変更に使用する。このような変
化は、特定の代謝経路の修飾、疾病に対する耐性または細胞分化の変化のような
商業的に重要な改善された性質の植物をもたらす。標的遺伝子の他の例は、本明
細書に引用して包含させる、米国特許第５,１０７,０６５号および第５,０３４,
３２３号に記載される。本発明の方法はまたその機能を解明するための遺伝子の
発現の変更に使用できる。この場合、例えば、遺伝子のセンスおよびアンチセン
スRNAを発現することができるDNA配列を、当分野で既知のまたは下記の形質転換
法により植物細胞内に挿入する。DNA配列は、例えば、植物細胞のゲノム内に安
定に統合される。次いで、植物細胞を、例えば、表現型または代謝変化に関して
試験する。あるいは、植物を植物細胞から再生させ、植物またはその子孫を、例
えば、表現型または代謝変化に関して試験する。例えば、必須遺伝子をこのよう
な方法を使用し、形質転換植物を、例えば、胚芽致死、苗木致死または他の関連
した表現型に関してスクリーニングして発見する。次いで、遺伝子の機能の知識
を使用して、遺伝子形質転換により改善された特性の作物を産生し、または新規
化学物質のスクリーニングをする。特に、必須遺伝子は除草剤化合物の標的とし
て良い候補物である。必須遺伝子配列は、例えば、植物で過発現され、遺伝子に
よりコードされる天然に存在する遺伝子の機能を阻害する除草化合物に対する植
物の耐性を付与する。必須遺伝子の変異した変異体はまた除草化合物または関連
化合物に対する耐性のために製造され、スクリーニングされる。このような変異
した変異体は当分野で既知の種々の方法で製造する。必須遺伝子によりコードさ
れる酵素はまたその機能を阻害する化合物のためのスクリーニング、例えば、イ
ンビトロ高処理スクリーニングに使用する。阻害化合物を、次いで、除草活性に
関して試験する。
【００４３】 本発明の方法はまたそのヌクレオチド配列の予めの知識なしに、遺伝子の発現
を無作為に変えるために使用する。この場合、対になり二本鎖RNA分子を形成で
きる無作為RNAフラグメントのライブラリー、または、対になり二本鎖RNA分子を
形成することができるRNAフラグメントをコードする無作為DNA配列のライブラリ
ーを産生し、当分野で既知のまたは下記の方法を使用して植物細胞に挿入する。
形質転換植物細胞または植物を特定の特性または表現型に関してスクリーニング
する。例えば、上記のような必須遺伝子を、このようなスクリーニングを使用し
て発見する。スクリーニングの他の例は、高塩濃度または浸透圧、高温、毒性ま
たは有害物質、例えば、除草化合物の存在のような種々の条件下で、制約されな
い生育、または非形質転換細胞よりも制約されていない生育に関する。このよう
なスクリーニング後、二本鎖RNAまたは二本鎖RNAをコードするDNA分子を回収し
、相補的RNAフラグメントの配列を決定し、このように、発現の変更が特定の特
性または表現型をもたらす遺伝子を単離する。このような遺伝子を、次いで、例
えば、遺伝子形質転換により作物改善にまたは新規化学物質のスクリーニングに
使用する。
【００４４】 植物形質転換法 本発明のDNA分子を、慣用の組換えDNA法を使用して植物または細菌細胞に挿入
する。一般に、本発明のDNA分子を形質転換ベクターに包含させる。プラスミド
、バクテリオファージウイルスおよび他の修飾ウイルスのような、当分野で既知
である多数のこのようなベクター系が使用されている。発現系の成分をまた修飾
し、例えば、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントの発現を増加させる。
例えば、切断配列、ヌクレオチド置換または他の修飾を使用する。当分野で既知
の発現系を使用して適当な条件下の事実上任意の植物細胞を形質転換する。本発
明のDNA分子を含むトランスジーンを好ましくは安定に形質転換し、宿主細胞の
ゲノムに統合させる。他の好ましい態様において、本発明のDNA分子を含むトラ
ンスジーンを自己複製ベクター上に位置させる。自己複製ベクターの例はウイル
ス、特にジェミニウイルスである。形質転換細胞を好ましくは全植物に再生する
。本発明に従って形質転換する植物は、単子葉植物および双子葉植物であり得、
メイズ、小麦、大麦、ライ麦、甘藷、インゲンマメ、エンドウマメ、チコリ、レ
タス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブラ、ラディッシュ、ホウレ
ンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、スカッシュ、
パンプキン、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サ
クランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブ
ラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ダイズ
、トマト、ソルガム、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、ナタネ、クロー
バー、タバコ、ニンジン、ワタ、アルファルファ、コメ、ジャガイモ、ナス、キ
ュウリ、アラビドプシス、および針葉樹および落葉樹のような樹木植物を含むが
、これらに限定されない。望むヌクレオチド配列が特定の植物種に形質転換され
たら、伝統的育種法を使用して、その種中で増殖させ得るか、または、特に商業
品種を含む同じ種の他の変種に移動し得る。
【００４５】 Ａ．植物発現カセットの構築の条件 トランスジェニック植物中での発現を意図する遺伝子配列を、最初に植物内で
発現可能な適当なプロモーターの後ろに、発現カセットに集める。発現カセット
はまた更にトランスジーンの発現に必要なまたは選ばれた更なる配列を含み得る
。このような配列は、例えば、転写ターミネーター、イントロンのような発現を
促進するための外来配列、核心配列(vital sequences)、および遺伝子産物の特
異的細胞小器官および細胞区画への標的を意図した配列を含むが、これらに限定
されない。これらの発現カセットを、次いで、植物形質転換ベクターに下記のよ
うに容易に移入する。以下は典型的発現カセットの種々の成分の記載である。
【００４６】 １．プロモーター 発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物中の
トランスジーンの空間的および時間的発現パターンを決める。選択したプロモー
ターは、トランスジーンを特異的細胞タイプ(葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細
胞など)または特異的組織または器官(例えば、根、葉または花)で発現させ、選
択は遺伝子産物の蓄積の望ましい位置を反映する。あるいは、選択したプロモー
ターは、種々の誘導条件下で遺伝子の発現を駆動する。プロモーターは強度、即
ち、転写を促進する能力を変える。使用する宿主系に依存して、当分野で既知の
多くの適当なプロモーターの任意の一つを使用する。例えば、構造的発現のため
に、CaMV 35Sプロモーター、コメアクチンプロモーター、またはユビキチンプロ
モーターを使用する。例えば、調節可能発現のために、タバコまたはアラビドプ
シス由来の化学誘導性PR−１プロモーターを使用する(例えば、米国特許第５,６
８９,０４４号参照)。
【００４７】 プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷誘導性であるものである。多くのプ
ロモーターが、傷部位で発現されると記載されている。この種の好ましいプロモ
ーターは、Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al.
Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-
158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Fir
ek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993)およびWarner et al. Plant
J. 3:191-201 (1993)に記載のものを含む。
【００４８】 好ましい組織特異的発現パターンは緑色組織特異的、根特異的、幹特異的およ
び花特異的を含む。緑色組織での発現に適したプロモーターは、光合成に関与す
る遺伝子を調節する多くのものを含み、こららの多くは単子葉植物および双子葉
植物の両方からクローン化されている。好ましいプロモーターはホスホエノール
カルボキシラーゼ遺伝子由来のメイズPEPCプロモーターである(Hudspeth & Grul
a, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989))。根特異的発現に好ましいプロモー
ターは、de Framond(FEBS 290:103-106 (1991) ; EP 0452 269)により記載のも
の、および更に好ましい根特異的プロモーターは、本発明により提供されるT−
１遺伝子由来のものである。好ましい幹特異的プロモーターは米国特許第５,６
２５,１３６号に記載のものおよびメイズtrpA遺伝子の発現を駆動するものであ
る。
【００４９】 本発明の好ましい態様は、根特異的形態でヌクレオチド配列を発現するトラン
スジェニック植物である。更に好ましい態様は、傷誘導性または病原体感染誘導
性様式でヌクレオチド配列を発現するトランスジェニック植物である。
【００５０】 ２．転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターが発現カセットでの使用に利用可能である。これら
はトランスジーンを超えた転写の停止およびその正確なポリアデニル化を担う。
適当な転写ターミネーターは、植物中で機能することが既知のものであり、CaMV
35Sターミネーター、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター
およびエンドウマメrbcS E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および
双子葉植物の両方で使用する。
【００５１】 ３．発現の促進または調節のための配列 多くの配列が、転写単位内からの遺伝子発現を促進し、トランスジェニック植
物内のその発現を増加するために、本発明の遺伝子と組合わせて使用できること
が判明している。例えば、メイズAdhI遺伝子のイントロンのような種々のイント
ロン配列が、特に単子葉植物細胞内で発現を促進することが示されている。加え
て、ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列がまた発現を促進することが既知
であり、これらは双子葉植物細胞で特に有用である。
【００５２】 ４．コード配列最適化 選択した遺伝子のコード配列は、目的の作物種での最適発現のためにコード配
列を変えることにより、遺伝子操作し得る。特定の作物種における最適発現を達
成するためのコード配列の修飾法は、既知である(例えば、Perlak et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324 (1991);およびKoziel et al., Bio/technol.
11:194 (1993))。
【００５３】 他の好ましい態様において、本発明のDNA分子を直接プラスチドゲノムに形質
転換する。プラスチド形質転換法は、米国特許第５,４５１,５１３号および第５
,５４５,８１８号、PCT出願番号WO95/16783およびMcBride et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305に詳述されている。葉緑体形質転換の方
法は、選択可能マーカーにフランキングなクローン化プラスチドDNAの領域に、
適当な標的組織への目的の遺伝子と一緒の、例えば、バイオリスティクス(bioli
stics)またはプロトプラスト形質転換(例えば、塩化カルシウムまたはPEG介在形
質転換)を使用した挿入を含む。１から１.５kbフランキング領域、期間標的配列
はプラスチドゲノムとの相同組換えを促進し、従ってプラストーム(plastome)の
特異的領域の置換または修飾を可能にする。最初に、スペクチノマイシンおよび
／またはストレプトマイシンに対する耐性を付与する葉緑体16S rRNAおよびrps
１２遺伝子における点変異を形質転換の選択可能マーカーとして使用する(Svab,
Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87, 8526-8530; Staub, J. M. and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45)。
これらのマーカーの間のクローニング部位の存在は、外来DNA分子の挿入のため
のプラスチド標的ベクターの製造を可能にする(Staub, J.M., and Maliga, P. (
1993) EMBO J. 12, 601-606)。形質転換頻度の実質的な増加は、劣性形質rRNAま
たはr−タンパク質抗生物質耐性遺伝子の優勢選択可能マーカーであるスペクチ
ノマイシン無毒化酵素アミノグリコシド−３'−アデニルトランスフェラーゼを
コードする細菌aadA遺伝子での置換により得られる(Svab, Z., and Maliga, P.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917)。先に、このマーカーは緑藻
Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチドゲノムの高頻度形質転換の十分使用さ
れている(Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089)
。プラスチド形質転換に有用な他の選択可能マーカーは、当分野で既知であり、
本発明の範囲内に包含される。
【００５４】 遺伝子が相同組換えにより環状プラスチドゲノムの数千のコピー内に挿入され
るプラスチド発現が、各植物細胞に存在する。好ましい態様において、本発明の
DNAはプラスチド標的ベクターに挿入し、望ましい植物宿主のプラスチドゲノム
に形質転換する。本発明のDNA分子を含むプラスチドゲノムにホモプラスミック(
homoplasmic)な植物が得られ、DNA分子の高発現が優先的に可能である。好まし
くは、DNA分子によりコードされるセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントは
、植物プラスチド内で対形成でき、二本鎖RNA分子を形成でき、プラスチド遺伝
子の発現を変える。好ましい態様において、センスおよびアンチセンスフラグメ
ントは相補的領域にミスマッチを含まない。他の好ましい態様において、センス
およびアンチセンスフラグメントは少なくとも一つのミスマッチを相補的領域に
含む。この場合、RNAフラグメントをコードするDNA分子中のRNA配列は互いに組
換えできない。
【００５５】 Ｂ．植物形質転換ベクターの構築 植物形質転換に利用可能な多くの形質転換ベクターが植物形質転換分野の技術
者に既知であり、本発明に適当な遺伝子は任意のこのようなベクターと関連して
使用できる。ベクターの選択は好ましい形質転換法および形質転換の標的種に依
存する。ある標的種に関しては、種々の抗生物質または除草剤選択マーカーが好
ましい。形質転換で慣用的に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関
連抗生物質に耐性を付与するnptII遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268
(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983))、除草剤ホスホイノスリシ
ンに耐性を付与するbar遺伝子(White et all., Nucl. Acids Res 18: 1062 (199
0), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロ
マイシンに耐性を付与するhph遺伝子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol
4:2929-2931)、マンノース存在下での陽性選択を可能にするmamA遺伝子(Miles
and Guest (1984) Gene, 32:41-48; 米国特許第５,７６７,３７８号)およびメト
トレキサートに耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 10
99-1104 (1983))、およびグリフォサートに耐性を付与するEPSPS遺伝子(米国特
許第４,９４９,９３５号および第５,１８８,６４２号)を含む。
【００５６】 １．Agrobacterium形質転換に適したベクター 多くのベクターがAgrobacterium tumefaciensを使用した形質転換に利用可能
である。これらは典型的に少なくとも一つのT−DNAボーダー配列を担持し、pBIN
19のようなベクターを含む(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。Agrobacterium
形質転換に適した典型的なベクターはバイナリーベクターpCIB200およびpCIB200
1、ならびにバイナリーベクターpCIB10およびそのヒグロマイシン選択誘導体を
含む(例えば、米国特許第５,６３９,９４９号参照)。
【００５７】 ２．非Agrobacterium形質転換に適したベクター Agrobacterium tumefaciensの使用なしの形質転換は、選択形質転換ベクター
におけるT−DNA配列に関する条件を回避し、結果として、これらの配列を欠くベ
クターがT−DNA配列を含む上記のようなベクターに加えて利用される。Agrobact
eriumに頼らない形質転換法は、微粒子銃、プロトプラスト取り込み(例えば、PE
Gおよびエレクトロポレーション)およびマイクロインジェクションを含む。ベク
ターの選択は、形質転換する種の好ましい選択に大きく依存する。非Agrobacter
ium形質転換に適した典型的ベクターは、pCIB3064、pSOG19およびpSOG35を含む(
例えば、米国特許第５,６３９,９４９号参照)。
【００５８】 Ｃ．形質転換法 目的のDNA配列が発現系にクローン化されたら、それを植物細胞内に形質転換
する。植物の形質転換および再生法は当分野で既知である。例えば、Tiプラスミ
ドベクターを外来DNAの輸送、および直接DNA取りこみ、リポソーム、エレクトロ
ポレーション、マイクロインジェクションおよび微粒子銃に利用する。加えて、
Agrobacterium属由来の細菌を利用して植物細胞を形質転換できる。
【００５９】 双子葉植物の形質転換法は当分野で既知であり、Agrobacterium−ベースの方
法およびAgrobacteriumを必要としない方法を含む。非Agrobacterium法はプロト
プラストまたは細胞による外来遺伝物質の直接の取り込みを含む。これはPEGま
たはエレクトロポレーション介在取り込み、微粒子銃介在送達、またはマイクロ
インジェクションにより達成される。いずれの場合も、形質転換細胞は、当分野
で既知の標準法を使用して全植物に再生される。殆どの単子葉植物種の形質転換
は現在また日常の仕事になっている。好ましい方法は、PEGまたはエレクトロポ
レーション法を使用したプロトプラストへの直接遺伝子移入、カルス組織への微
粒子銃、ならびにAgrobacterium介在形質転換を含む
【００６０】 形質転換事象由来の植物を、当分野で既知の方法を使用して生育させ、繁殖さ
せ、望ましい性質の子孫を作り、望ましい性質の種子を得る。
【００６１】 本発明を更に以下の詳細な実施例を参照して説明する。これらの実施例は説明
の目的でのみ提供し、特記しない限り限定するものと意図しない。
【００６２】 実施例 本明細書で使用する標準組換えDNAおよび分子クローニング法は当分野で既知
であり、Sambrook, et al., Molecular Cloning, 編, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)およびT.J. Silhavy, M.L. Berma
n and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor La
boratory, Cold Spring Harbor, NY(1984)およびAusubel, F.M. et al., Curren
t Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Int
erscience (1987)出版により記載されている。
【００６３】 実施例１：ルシフェラーゼ遺伝子の発現の調節 センスおよびアンチセンスルシフェラーゼRNAフラグメントをコードするキメラD
NA分子の構築(センス／アンチセンス構築) プラスミドpLuc+(Promega)由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子の７３８bp“セ
ンス”配向フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーds LuC1(5'-CGC GGA
TCC TGG AAG ACG CCA AAA ACA-3'、配列番号１；BamHI制限部位下線)およびds
Luc2(5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3'、配列番号
２；HindIII制限部位下線)を使用して、pPH108プラスミドDNAから増幅する。Trb
oPfu熱安定制DNAポリメラーゼ(Stratagene)を、製造者のプロトコールに従って
、５０μl反応物中、９５℃／１分、５５℃／１.５分、７２℃／２分の５サイク
ル、続いて９５℃／１分、７２℃／３.５分の２５サイクルで使用する。同様の
方法で、プラスミドpLuc+由来のホタルルシフェラーゼ遺伝子の７３７bp“アン
チセンス”配向フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc3(5'-CGG
TCT AGA GGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3'、配列番号３；XbaI制限部位下線)およ
びds Luc2(5'-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3'、配列
番号４；HindIII制限部位下線)を使用して、pPH108プラスミドDNAから増幅する
。得られるDNAフラグメントを、低融点アガロース(FMC)から製造した１％トリス
−酢酸ゲルを通した電気泳動、続くPCR産物を含む摘出ゲル切片のフェノール−
クロロホルム抽出により精製する。センス生産物(ds LuC1/2)をBamHIおよびHind
IIIで消化し、アンチセンス生産物由来のDNA(ds Luc3/2)をXbaIおよびHindIIIで
標準法に従って消化する(制限酵素はNew England Biolabsから得た)。得られる
粘着末端DNAフラグメントを上記のようにゲル精製する。mas 1'プロモーター(Va
lten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730)を含むDNAフラグメントを、プラスミ
ドCSA104をEcoRIおよびHincIIで消化し、５６４bp DNAフラグメントを精製する
ことにより得る。このフラグメントをBamHIで再消化し、mas 1'プロモーターを
含む４８４bp EcoRI−BamHIサブフラグメントを単離し、ゲル精製する。プラス
ミドpPH169を構築するために、クローニングベクターpLitmus29(New England Bi
olabs)からのDNAをEcoRIおよびXbaIで消化し、単離フラグメントをT4 DNAリガ
ーゼ(New England Biolabs)を使用して、４方向反応でmas 1'プロモーターEcoRI
−BamHIフラグメントおよびセンス(BamHI−HindIII)およびアンチセンス(HindII
I−XbaI)ds Lucルシフェラーゼ遺伝子フラグメントにライゲートする。
【００６４】 ds LuC1／2／3センス／アンチセンス構築物でのAgrobacterium介在植物形質転
換のために、バイナリーベクターpPH170を構築するために、細菌選択のためのカ
ナマイシン耐性遺伝子およびトランスジェニック植物選択のためのヒグロマイシ
ン耐性遺伝子を担持するバイナリープラスミドpSGCHC1をEcoRIおよびXbaIで消化
する。得られるpSGCHC1からの１１.６kb単離フラグメントをT4 DNAリガーゼ(Ne
w England Biolabs)を使用して、４方向反応でmas 1'プロモーターEcoRI−BamHI
フラグメントおよびセンス(BamHI−HindIII)およびアンチセンス(HindIII−XbaI
)ds Lucルシフェラーゼ遺伝子フラグメントにライゲートする。
【００６５】 Agrobacteriumの形質転換およびアラビドプシス植物の真空浸潤 プラスミドpPH170をAgrobacterium tumefaciens GV3101にエレクトロポレーシ
ョンにより挿入し、形質転換コロニーを選択し、増幅する。構造的に(UBQプロモ
ーター(Norris et al. (1993) PMB 21:895-906)／UBQ + CaMV 35S 5' UTR／luc+
; pPH108)または誘導性に(Arabidopsis PR-1プロモーター／luc;pPH135、ライン
6E)発現するArabidopsis thaliana変異系の４から５週齢植物を、pPH170バイナ
リーT−DNAベクターを他にするAgrobacteriumクローンで真空浸潤する。形質転
換植物をヒグロマイシンおよびカナマイシンで共選択し、ルシフェラーゼ活性測
定のために制御されたファイトトロン条件下で生育させる。加えて、pPH135-6E
バックグラウンドのルシフェラーゼ活性をBTH(BTH処理は本質的にLawton et al.
Plant J. 10: 71-82に記載の通り)導入後４８時間に評価する。ルシフェラーゼ
活性は、ルシフェリン基質添加後の組織抽出物における蛍光ベースアッセイを使
用して定量する。ルシフェラーゼ活性はまた植物内でCCD−冷却ビデオ造影シス
テムを使用してまた追跡する(Hamamatsu)。
【００６６】 実施例２：Arabidopsis GL1遺伝子の発現の調節 GL1遺伝子は、正常突起様構造(葉毛)形成に必要なmyb−様転写因子をコードす
る(Oppenheimer et al. (1991) Cell 67: 483-493)。発育初期でのGL1発現のノ
ックアウトは、突起様構造を欠く植物をもたらす。ノックアウト表現型は、若い
苗木で容易に同定され、致死ではない。培養発現のための３つのベクターおよび
GAL4／C1−調節発現のための３つのベクターを構築する。各プロモーターの試験
のための３つの異なるベクターは、GL1遺伝子フラグメントのセンス(＋)発現、
アンチセンス(−)発現ならびにセンスおよびアンチセンス(＋／−)RNA発現であ
る。(＋)および(−)ベクターは、GL1の発現への効果を比較するためにコントロ
ールする。各場合において、GL1配列の塩基＃７３９から＃１７８１までの５'フ
ラグメント(GenBank Accession M79448)をベクター構築に使用する。
【００６７】 GAL4／C1調節発現 GL1遺伝子フラグメントを交差誘導性ベクター構築物pJG304-1にNcoI−SacIフ
ラグメントとしてクローン化する。プラスミドpJG304はpBSSK+由来である。プラ
スミドpBS SK+(Stratagene, LaJolla, CA)をSacIで直線化し、ヤエナリヌクレ
アーゼで処理してSacI部位を除去し、T4リガーゼで再ライゲートしてpJG201を作
る。10XGAL4コンセンサス結合部位／CaMV 35S最小プロモーター／GUS遺伝子／Ca
MVターミネーターカセットをpAT71からKpnIで除去し、pJG201のKpnI部位にクロ
ーン化し、pJG304を作る。プラスミドpJG304を制限エンドヌクレアーゼAsp718で
部分的に消化し、完全長直鎖状フラグメントを単離する。フラグメントを２２塩
基オリゴヌクレオチドJG-L(5'-GTA CCT CGA G TC TAG ACT CGA G-3'、配列番号
５)のモル過剰とライゲートする。制限分析を使用して、このリンカーがGAL4 D
NA結合部位の５'に挿入されたクローンを同定し、このプラスミドをpJG304DXhoI
と名付ける。
【００６８】 NcoIおよびSacI部位を、５'末端への適当な制限部位を有するPCRプライマーを
合成することにより、(＋)および(−)フラグメントの末端に添加する。(＋／−)
GL1フラグメントを、最初に二つのフラグメントを作ることにより作る：５'末端
にNcoI部位および３'末端にHindIII部位を有する(＋)フラグメント、および５'
末端にHindIII部位および３'末端にSacI部位を有する(−)フラグメント。(＋／
−)ユニットを、得られるフラグメントをEcoRI部位でライゲートすることにより
産生する。発現ユニットはGAL4 DNA結合ドメイン、続いて最小TATA配列、およ
び(＋)、(−)または(＋／−)のいずれかに配向するGL1遺伝子フラグメントを含
む(Guyer et al. (1998) Genetics, 149:633-639)。
【００６９】 構造的発現 双子葉植物で相対的に強く、構造的であるAgrobacterium由来のマンノピンシ
ンダーゼのmas 1'プロモーター(Velten et al. (1984) EMBO Journal 3:2723-27
30)を使用する。上記のように、GL1(＋)、(−)、および(＋／−)フラグメントを
pBluescript中の１'プロモーターの後ろにライゲートする。３つの異なる発現カ
セットをpCIB200にEcoRI／SalIフラグメントとしてライゲートする(Uknes et al
. (1993) Plant Cell 5:159-169)。
【００７０】 実施例３：シスタチオニンベータ−リアーゼ遺伝子の発現の調節 シスタチオニンベータ−リアーゼ(CBL)遺伝子はメチオニン生合成経路中の段
階を行うタンパク質をコードする。CBLはシスタチオニンからホモシステインへ
の変換を触媒する(Ravanel et al. (1998) Proc. Natl. Acad, Sci, USA 95:780
5-7812にレビュー)。Arabidopsis CBL遺伝子のcDNAは同定されている(Ravanel e
t al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:875-772)。植物内のその発現の調節の効果
を、RNA発現(センス構築物)、アンチセンスRNA発現(アンチセンス構築物)ならび
にセンスおよびアンチセンスRNA発現(センス／アンチセンス構築物)の構築物を
使用して試験する。
【００７１】 Ａ．アンチセンス構築物：アンチセンス配向でCGL遺伝子の部分の挿入を有するp
JG304DXhoIベクター由来のバイナリーBASTAベクターpLG261を使用する。 pJG304／aCBL：プラスミドpJG304DXhoIをNcoIおよびSacIで消化し、GUS遺伝子を
切除する。pJG304DXhoI由来のGUSをまたNcoIおよびSacIで消化したCBL PCR生産
物で置き換える。この生産物を、プライマーDG354(5'-GAT CGA GCT CCA CGA GAA
CTG TCT CCG-3'；配列番号６)およびDG357(5'-TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA C
AT TGC-3'；配列番号７)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリー(Minet e
t al. (1992) Plant J. 2:417-422)を鋳型として使用して作る。プラスミドpJG3
04／aCBLを、CBL PCR産物にライゲートしたpJG304DXhoI消化ベクターから構築
する。 pJG261／aCBL：pJG304／aCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位／35S最小プロ
モーター／アンチセンスCBL／CaMVターミネーター融合を含むカセットを切除す
る。このカセットをXhoI消化pJG261にライゲートし(Guyer, et al, Genetics (1
998), 149:633-639)、pJG261／aCBLを作る。
【００７２】 Ｂ．センス構築物：CBLフラグメントが逆の配向である以外、アンチセンス構築
物と同じである。この構築物はATG開始コドンおよび殆どのCBL ORFを含み、CBL
遺伝子の発現の調節のコントロールとして働く。 pJG304／sCBL：プラスミドpJG304DXhoIをNcoIおよびSacIで消化し、GUS遺伝子を
切除する。pJG304DXhoI由来のGUS遺伝子をまたNcoIおよびSacIで消化したCBL P
CR生産物で置き換える。この生産物をプライマーCBL１(5'-CTT GCC ATG GCA CGA
GAA CTG TCT CCG-3'；配列番号８)およびCBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GT
A CAT TGC A-3'；配列番号９)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリーを
鋳型として使用して作る。プラスミドpJG304／sCBLを、CBL PCR生産物にライゲ
ートしたpJG304DXhoI消化ベクターから構築する。 pJG261／sCBL：pJG304／sCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位／35S最小プロ
モーター／センスCBL／CaMVターミネーター融合を含むカセットを切除する。こ
のカセットをXhoI消化pJG261にライゲートし、pJG261／sCBLを作る。
【００７３】 Ｃ．センス／アンチセンス構築物：センス配向のCBL遺伝子(＃１３−１１５９)
を、CBL遺伝子のアンチセンス配向版の下流のベクターpJG304DXhoIのSalI部位に
挿入する。約１０bpのリンカーが二つのコピーのCBLの間に存在する。 pJG304／dsCBL：プラスミドpJG304／aCBLをSacIで消化する。またSacIで消化し
たCBL PCR生産物を、挿入CBL遺伝子がセンス配向で挿入されるように挿入する
。この生産物はCBL2(5'-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3'；配列番号
９)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG
C-3'；配列番号１０)ならびにpFL61 Arabidopsis cDNAライブラリーを鋳型とし
て使用して作る。挿入DNAの所望の配向のプラスミド構築物を、HindIIIでの消化
により同定する。プラスミドpJG304／dsCBLを、CBL PCR生産物にライゲートし
たpJG304／aCBL消化ベクターから構築する。SURE２(Stratagene, LaJolla, CA)
を、構築物を安定化するために細菌宿主として使用する。 pJG261／dsCBL：pJG304／dsCBLをXhoIで切断し、GAL4 DNA結合部位／35S最小プ
ロモーター／アンチセンスCBL／センスCBL／CaMVターミネーター融合を含むカセ
ットを切除する。このカセットをSpeI消化pJG261にライゲートし、pJG261／dsCB
Lを作る。XL１−BLUEMRF'(Stratagene, LaJolla, CA)を細菌宿主として使用し、
構築物を部分的に安定化する。
【００７４】 Ｄ．GAL4結合部位／最小CaMV 35S／CBLトランスジェニック植物の産生 ３つの記載したpJG261/CBL構築物を、Agrobacterium tumefaciens recA-株AGL
1(Lazo et al. (1991) Bio/Technology 9:963-967)に電子形質転換(electro-tra
nsformation)し、Arabidopsis植物(Ecotype Colimbia)を浸潤により形質転換す
る(Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris, 316:1188-1193)。浸潤
植物由来の種子を、１５mg／リットルのBastaを含む発芽培地(４.３g／リットル
のMurashige-Skoog塩、０.５g／リットルのMes、１％スクロース、１０μg／リ
ットルのチアミン、５μg／リットルのピリドキシン、５μg／リットルのニコチ
ン酸、１mg／リットルのミオイノシトール、pH５.８)で選択する。
【００７５】 Ｅ．GAL4／C1トランス活性化因子およびGAL4結合部位／最小35Sプロモーターを
使用したCBLの阻害の比較 GAL4結合部位／最小CaMV 35Sプロモーター／CBL構築物を含むトランスジェニ
ック植物を土壌に移植し、温室で成熟するまで生育させる。各系におけるトラン
スジェニックCBLフラグメントの存在をPCRで確認する。アンチセンス構築物の試
験のためにプライマーASV1(5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'；配列番号１１)
およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-
3'；配列番号１０)を使用して、約１２００pb生産物の存在を確認する。６個の
アンチセンス構築物を有するトランスジェニック系を同定する。センス構築物を
試験するために、プライマーASV2(5'-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3'；配
列番号１２)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT
CCG TCG C-3'；配列番号１０)を使用して、約１２００pb生産物の存在を確認す
る。１３個のセンス構築物を有するトランスジェニック系を同定する。センス／
アンチセンス構築物を試験するために、プライマーASV2(5'-GGA TTT TGG TTT TA
G GAA TTA GAA-3'；配列番号１２)およびCBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA
CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'；配列番号１０)を使用して、約１２００pb
生産物の存在を確認する。加えて、センス／アンチセンス構築物を試験するため
に、プライマーASV1(5'-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3'；配列番号１１)および
CBL3(5'-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3'；配
列番号１０)を使用して、約１２００pb生産物の存在を確認する。センス／アン
チセンス構築物を有する１１個のトランスジェニック系を同定する。
【００７６】 １次形質転換体上に咲いた花を、同型接合体GAL4/C1トランス活性化因子系pAT
53-103の花粉と交配する(Guyer et al., Genetics (1998) 149:633-649)。F1種
子をMS＋２％スクロース培地(４.３g／リットルのMurashige-Skoog塩、０.５g／
リットルのMes、２％スクロース)に蒔く。アンチセンス構築物を含む系は、全て
プレート上のF1子孫に関して異常な表現型を示さない。センス構築物を示す１３
個の系のうち２個は、各プレートで約半分のF1子孫に関して弱い表現型を示す。
センス構築物を含む１３個の系のうち残りの１１個は、プレート上のF1子孫に関
して異常表現型を示さない。センス／アンチセンス構築物を含む１１個の系のう
ち１０個は、各プレートで約半分のF1子孫に関して弱いから強い範囲の表現型を
示す。強い表現型を示す植物は生存せず、プレート上で１４日後に、紫色の着色
が増加し、緑色色素を失い、葉の形成ができない。弱い表現型の植物は、プレー
ト上で１４日後に幾分かの紫色の着色を有し、正常より薄い緑色であり、小さい
葉を形成する。このように、センス／アンチセンス構築物は、アンチセンスまた
はセンス構築物のいずれかよりも内因性必須遺伝子の活性の減少に有効である。
【００７７】 Ｆ．二つのプロモーターを使用したCBLの発現の調節 CBL遺伝子を二つのプロモーター −− 一つはセンス鎖の転写を引き起こし
、他方はアンチセンスの転写を引き起こす −− の間に置く。この試みにおい
て、両方のセンスおよびアンチセンスRNAが植物細胞内で作られ、二つのタイプ
の鎖が互いにハイブリダイズでき、二本鎖RNA分子の形成を導く。ACTIN2をCBL遺
伝子の両方の側にフランキングなプロモーターとして使用する。全てのこれらの
試みに関して、プロモーターの遠位側に転写ターミネーターを使用するか使用し
ない選択がある。転写ターミネーターを使用する場合、転写は一つのプロモータ
ーの３'末端で開始し、一つの配向でCBL遺伝子を通って進み、第２プロモーター
を３'末端から５'末端に通って進み、第２プロモーターの５'末端の転写ターミ
ネーターで停止する。転写ターミネーターは転写されたRNAの安定化に働き得る
。
【００７８】 実施例４：ルシフェラーゼ遺伝子発現の調節 センスおよびアンチセンスルシフェラーゼRNAフラグメントをコードするキメラD
NA分子の構築(センス／アンチセンス構築物) プラスミドpLuc+(PromegaベクターpGL3、Genbank Accession # U47295)からの
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の６７０bp“センス”配向フラグメントをpPH108プ
ラスミドDNAから、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc1(5'-CGC GGA TCC AAG
ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3'、配列番号１３；BamHI制限部位下線)およびds Luc
2(5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3'、配列番号１４；HindIII制
限部位下線)を使用して増幅する。TurboPfu熱安定性DNAポリメラーゼ(Stratagen
e)を、製造者のプロトコールに従って、５０μl反応物中、９５℃／１分、５５
℃／１.５分、７２℃／２分の５サイクル、続いて９５℃／１分、７２℃／３.５
分の２５サイクルで使用する。同様の方法で、プラスミドpLuc+由来のホタルル
シフェラーゼ遺伝子の７３７bp“アンチセンス”配向フラグメントを、pPH108プ
ラスミドDNAから、オリゴヌクレオチドプライマーds Luc3(5'-CGG TCT AGA AAG
ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3'、配列番号１５；XbaI制限部位下線)およびds Luc2
(5'-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3'、配列番号１６；HindIII制
限部位下線)を使用して増幅する。得られるDNAフラグメントを、低融点アガロー
ス(FMC)から製造した１％トリス−酢酸ゲルを通した電気泳動、続くPCR産物を含
む摘出ゲル切片のフェノール−クロロホルム抽出により精製する。センス生産物
(ds LuC1/2)をBamHIおよびHindIIIで消化し、アンチセンス生産物由来のDNA(ds
Luc3/2)をXbaIおよびHindIIIで標準法に従って消化する(制限酵素はNew England
Biolabsから得た)。得られる粘着末端DNAフラグメントを上記のようにゲル精製
する。センスBamHI−HindIIIフラグメントおよびアンチセンスHindIII−XbaIフ
ラグメントを、次いで３方向ライゲーションで、BamHIおよびXbaITheで消化させ
たクローニングベクターpLitmus28(New England Biolabs)にクローン化し、得ら
れる構築物をpAdF3と名付ける。bar遺伝子のオープン・リーディング・フレーム
(D'Halluin et al. (1992) Methods in Enzymology 216:415-426)を含む５６３b
p DNAフラグメントを、プラスミドCSA104 DNAから、オリゴヌクレオチドbar-1(
5'-GCG AAG CTT GAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3'、配列番号１７；HindIII制限
部位太字)およびbar-2(5'-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GAT CTC-3'、配列番号
１８；HindIII制限部位太字)を使用して増幅する。Pfu熱安定性DNAポリメラーゼ
(Stratagene)を、製造者のプロトコールに従って、１００μl反応物中、９４℃
／１分、５５℃／１分、７２℃／１分の２５サイクルで使用する。フェノール抽
出およびエタノール沈殿の精製に続き、bar PCR生産物を、上記のようにHindIII
で消化し、２％アガロースゲルを通してゲル精製する。プラスミドpAdF1をHindI
II bar DNAフラグメントの、HindIIIで消化されているプラスミドpAdF3へのライ
ゲーションにより構築する。この非指向性クローニングの２つの可能性のある構
築物のうち、pAdF1はbar遺伝子への配向により特徴付けられ、これはpAdF3に存
在するルシフェラーゼ遺伝子の“センス”と同じである。Arabidopsis ACT2プロ
モーター(An et al., (1996) Plant J. 10:107-121)を含むBamHI-SalI １.２kb
DNAフラグメントを、pNOV1416(Scott Rabe; NB171 p.122; 8-17-98により作ら
れた構築物)から切断し、BamHIおよびSalIで消化したpUB21にクローン化して、
構築物pAct2を産生する。ACT2プロモーターを次いで、BamHIおよびSpeIでの消化
によりpAct2から切断する。
【００７９】 ds Luc1/2/3RNAセンス／アンチセンスでのアグロバクテリウム介在植物形質転
換のためのバイナリーベクターpAdF4を構築するために、細菌選択のためにカナ
マイシン耐性遺伝子を担持し、植物選択のためにヒグロマイシン耐性遺伝子を担
持するバイナリープラスミドpSGCHC1を、SpeIおよびSacIで消化する。pSGCHC1か
ら得られる１１.６kb単離フラグメントをを３方向反応で、T4 DNAリガーゼ(New
England Biolabs)を使用して、センスおよびアンチセンスルシフェラーゼ遺伝子
フラグメントの両方を含むpAdF3由来のAct2プロモーターBamHI-SpeIフラグメン
トおよびBamHI-SacIフラグメントにライゲートする。同様に、上記のようにSpeI
およびSacIで消化させた１１.６kb pSGCHC1ベクター、Act2プロモーターを担持
するSpeI-BamHIフラグメントおよび、bar遺伝子を囲むセンスおよびアンチセン
スルシフェラーゼフラグメントを含むpAdF1由来のBamHI-SacIフラグメントを含
むバイナリーベクターpAdF2を３方向ライゲーションで構築した。
【００８０】 Agrobacteriumの形質転換およびArabidopsis植物の真空浸潤 プラスミドpAdF2およびpAdF4をAgrobacterium tumefaciens GV3101に、エレク
トロポレーションにより挿入し、形質転換コロニーを選択および増幅する。ルシ
フェラーゼを構造的(UBQ3プロモーター(Norris et al. (1993) PMB 21:895-906)
／UBQ3＋CaMV 35S 5' UTR／luc＋；pPH108)または誘導的(Arabidopsis PR-1プロ
モーター／luc＋；pCIB200、系6E)に発現するArabidopsis thaliana変異系の４
から５週齢植物を、pAdF2またはpAdF4バイナリーT-DNAベクターを担持するAgrob
acteriumクローンで真空浸潤する。形質転換植物をヒグロマイシンおよびカナマ
イシンで共選択し、ルシフェラーゼ活性を測定するために制御されたファイトト
ロン条件下で生育させる。加えて、pCIB200-6Eバックグラウンドにおけるルシフ
ェラーゼ活性を、BTH(本質的に、Lawton et al. (1996) Plant J. 10:71-82に記
載のようなBTH処理)導入４８時間後に評価する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフ
ェリン基質の添加に続く組織抽出物中のルミネッセンスベースアッセイを使用し
て定量する。スリフェラーゼ活性をまた植物内でCCD−冷却ビデオ造影システム
を使用してまた追跡する(Hamamatsu)。pPH108中のルシフェラーゼ遺伝子はpGL3(
Promega, Genbank Accession # U47295)由来である；そしてpCIB200-6E中のルシ
フェラーゼ遺伝子はpGL2(Promega, Genbank Accession # X65323)由来である。
【００８１】 ルシフェラーゼアッセイは、ルシフェラーゼ試薬で行う(Promega、カタログ番
号E1501)。葉パンチを０.１M KPO4 pH７.８緩衝液中で４℃で挽き、短く回転
沈下させる。上清の一定量をルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、ルシフェラ
ーゼ活性をMonolight 2010ルミノメーターで定量する(Becton Dickinson Microb
iology System)。センス／アンチセンス構築物pAdF2およびpAdF4で形質転換した
pPH108植物の分析の結果を表１に、およびセンス／アンチセンス構築物pAdF4で
形質転換したpCIB200-6E植物の結果を表２に示す。
【００８２】 表１：植物内のルシフェラーゼ活性に関する相対的光ユニット 親系pPH108の異なる植物を試験し、種々の植物内のルシフェラーゼの平均レベ
ルを決定する。この系は同型接合ではなく、従ってルシフェラーゼの最大レベル
を示す個々の植物(即ち、植物１、２および３)が同型接合であり得る。pPH108バ
ックグラウンドでpAdF2構築物を含むダブルトランスジェニック植物pPH108(pAdF
2)、またはpPH108バックグラウンドでpAdF4構築物を含むpPH108(pAdF4)の独立し
たT1系を分析する。ルシフェラーゼレベルは、恐らくセンス／アンチセンス構築
物の発現レベルの範囲のために、系毎に異なる。独立したT1事象、pAdF2(Columb
ia(pAdF2))またはpAdF4(Columbia(pAdF4))で形質転換した野生型Arabidopsis Co
lumbia植物をまたコントロールとして分析する。
【表１】
【００８３】 表２：試験した個々の植物におけるルシフェラーゼ活性に関する相対的光ユニッ
ト 親系pCIB200-6E由来の苗木を生育させ、独立したT1ダブルトランスジェニック
系pCIB200-6E(pAdF4)と同様にサンプルにする。独立したT1事象、pAdF4で形質転
換した野生型Arabidopsis Columbia植物をまたコントロールとして分析する。
【表２】
【００８４】 実施例５：部位特異的組換え系を使用した目的の遺伝子の発現の調節 本発明の他の態様において、センスおよびアンチセンスRNAフラグメントを、
部位特異的組換え系を使用して産生する。部位特異的組換えは、DNA開裂および
酵素リコンビナーゼにより介在される再ライゲーションの工程である。レコンビ
ナーゼは非常に特異的DNA配列を認識する。ある部位特異的組換え系はその標的
部位に作用するのに一つだけタンパク質を使用する。Cre/lox、FLP/FRT、R/RSお
よびGin/gixのような数個の部位特異的組換え系が、植物内での部位特異的組換
え系を介在することが既知である(Ow and Medberry, 1995, Critical Reviews i
n Plant Sciences 14:239-261)。組換え基質におけるリコンビナーゼ認識部位の
配置に依存して、組換え工程はDNAは配列の欠失、逆転または統合をもたらす。
この種の一つの特定の反応、即ち逆転が本発明に関連する。二つのリコンビナー
ゼ認識部位を、逆の配向で望ましい遺伝子発現カセットに置く。第１認識部位は
、トランスジーンコード配列の非翻訳リーダー中または５'−遠位領域の中側に
、プロモーターの下流に置く。第２部位は第１部位と逆の配向で、トランスジー
ンコード配列の３'非翻訳領域中または３'−遠位領域の中側に置く。望ましいDN
A配列のコードまたは非コード領域はプロモーターと操作可能に結合する。リコ
ンビナーゼの存在下、逆の配向で二つの認識部位に側面を接する配列が逆転する
。組換え過程の結果として、望ましい遺伝子のコードまたは非コード鎖の両方が
プロモーターに操作可能に結合し、センスおよびアンチセンス転写が同じ染色体
環境において同じ遺伝子座からから産生され、dsRNA分子の形成が可能である。
【００８５】 Creのような部位特異的リコンビナーゼの高レベル構造的発現が、ある植物に
おける異常表現型をもたらすことができる(Que et al., 1998, Plant J. 13:401
-409)。好ましくは、リコンビナーゼの発現は誘導性プロモーターの制御下であ
る。本発明の一つの態様において、リコンビナーゼ発現カセットを、逆の配向で
二つのリコンビナーゼ認識部位に側面を接する望ましいトランスジーン配列の導
入に使用する同じ形質転換ベクターに置く。本発明の他の態様において、リコン
ビナーゼ認識部位に側面を接するトランスジーンを含むトランスジェニック植物
をリコンビナーゼを発現する系と交配するか、リコンビナーゼ発現ベクターで再
形質転換する。本発明の他の態様において、誘導性リコンビナーゼ発現カセット
を含む組換えRNAまたはDNAウイルスを、望ましいトランスジーン構築物を含む植
物の感染に使用する。組換えウイルスは好ましくは異常表現型をもたらさない。
上記態様において、リコンビナーゼは望ましい配列の染色体コピーの逆転をもた
らし、それにより望ましいdsRNAを産生する。
【００８６】 本発明の更に別の態様において、組換え植物DNAウイルスを、dsRNAを形成でき
るセンスおよびアンチセンスRNAフラグメントの産生に使用する。典型的に植物D
NAウイルスは染色体外的(epi-chromosomally)に複製される。好ましい態様にお
いて、二つの逆転リコンビナーゼ認識部位に側面を接する標的遺伝子のRNAフラ
グメントの発現ができるDNA配列を含む構築物を、リコンビナーゼを発現する第
２組換えウイルスと共に植物細胞に挿入する。あるいは、リコンビナーゼ発現カ
セットおよび逆転認識部位に側面を接するDNA配列の両方を同じウイルスDNAベク
ターに結合させる。ウイルスDNAベクターが植物内に挿入された後、リコンビナ
ーゼ遺伝子を発現する。リコンビナーゼ遺伝子の発現は、リコンビナーゼ認識部
位に側面を接するウイルスDNA配列の逆転をもたらし、細胞中のウイルスゲノム
の高コピー数のために、所望のDNA配列からのdsRNAの大量の産生をもたらす。好
ましいリコンビナーゼシステムは、Cre/lox、FLP/FRT、R/RSおよびGin/gixが、
植物内の部位特異的組換え過程の介在が既知である(Ow and Medberry, 1995, Cr
itical Reviews in Plant Sciences 14:239-261、本明細書に引用して包含させ
る)。
【００８７】 実施例６：植物発現カセットの構築の要件 トランスジェニック植物での発現を意図する遺伝子配列は、第１に適当なプロ
モーターの後ろおよび適当な転写ターミネーターの上流の発現カセットに集合す
る。植物発現カセットの構築の全ての要件は、本発明のDNA分子に適用され、当
分野で既知の方法を使用する。
【００８８】 プロモーター選択 発現カセットで使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物内の
DNA分子の空間的および時間的発現パターンを決定する。選択したプロモーター
はDNA分子を特異的細胞タイプ(葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞など)または
特異的組織または器官(例えば、根、葉または花)で発現させ、選択はDNA分子に
よりコードされるRNAフラグメントの生合成の望ましい位置を反映する。あるい
は、選択したプロモーターは、光誘導または他の時間的調節プロモーター下での
DNA分子の発現を駆動し得る。更に別法は、選択プロモーターの化学的調節であ
る。これは、望ましい、化学インデューサーでの処理によりもたらされる時のみ
のDNA分子の発現の誘導を可能する。
【００８９】 転写ターミネーター 種々の転写ターミネーターは発現カセットでの使用に利用可能である。これら
は転写の停止、および好ましくは、正確なポリアデニル化を担う。適当な転写タ
ーミネーターは植物で機能することが既知のものであり、CaMV 35Sターミネータ
ー、tmlターミネーター、ノパリンシンターゼターミネーター、エンドウマメrbc
S E9ターミネーターを含む。これらは単子葉植物および双子葉植物の両方で使用
できる。
【００９０】 発現の促進または調節のための配列 多くの配列が、転写ユニットの中での遺伝子発現を促進させることが判明して
おり、これらの配列は本発明のDNA分子と組合わせて、トランスジェニック植物
内でのその発現の増加のために使用できる。
【００９１】 種々のイントロンが、発現を、特に単子葉植物細胞内で促進することが示され
ている。例えば、メイズAdh1遺伝子のイントロンは、メイズ細胞内に挿入された
とき、その同起源プロモーター下に野性型遺伝子の発現を有意に促進することが
判明している。イントロン１は特に有用であり、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物内の発現を促進することが判明してい
る(Callis et al., Genes Develep 1:1183-1200 (1987))。同じ実験系において
、メイズbronze1遺伝子由来のイントロンは発現促進に同じ作用を有する(Callis
et al., 前掲)。イントロン配列は、慣用的に植物形質転換ベクター内に、典型
的に非翻訳リーダー内に包含されている。
【００９２】 ウイルス由来の多くの非翻訳リーダー配列がまた発現を促進することが既知で
あり、これらは特に双子葉植物細胞で有用である。特に、タバコモザイク病ウイ
ルス(TMV、“Ω−配列”)、メイズクロロティックモットルウイルス(MCMV)およ
びアルファルファモザイクウイルス(AMV)が発現の促進に有効であることが示さ
れている(例えば、Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Sku
zeski et al. Plant Molec. Biol. 15; 65-79 (1990))。
【００９３】 実施例７：発現カセット構築の例 本発明は、プロモーターの起源に拘らず、植物内で発現可能なプロモーターの
制御下の本発明のDNA分子の発現を包含する。したがって、DNA分子を、当分野で
既知の方法を使用して発現カセットに挿入する。これらの発現カセットは、次い
で、下記のように植物形質転換ベクターに容易に移入できる。更に、本発明はま
たDNA分子の発現に必要なまたはDNA分子のために選択した更なる配列と関連した
植物発現可能プロモーターの使用も包含する。このような配列は、転写ターミネ
ーター、発現を促進するための外来配列(イントロンのような[例えば、Adhイン
トロン１]、ウイルス配列[例えば、TMV-Ω]を含むが、これらに限定されない。
【００９４】 構造的発現： プラスミドpCGN1761の構築は、公開特許出願EP0392225に記載されている。pCG
N1761は“ダブル”35Sプロモーターおよびtml転写ターミネーターを、プロモー
ターおよびターミネーターの間の独得なEcoRI部位と共に含み、pUCタイプ骨格を
有する。NotIおよびXhoI部位を存在するEcoRI部位に加えて含む修飾ポリリンカ
ーを含むpCGN1761の誘導体が構築される。この誘導体はpCGN1761ENXと名付ける
。pCHN1761ENXは、トランスジェニック植物の35Sプロモーターの制御下の発現の
目的での、cDNA配列または遺伝子配列(微生物ORF配列を含む)の、そのポリリン
カー内でのクローニングに有用である。このような構築物の全35Sプロモーター
遺伝子−遺伝子配列−tmlターミネーターカセットは、プロモーターの５'のHind
III、SphI、SalIおよびXbaI部位およびターミネーターの３'のXbaI、BamHIおよ
びBglI部位で、形質転換ベクターの移入のために切断できる。更に、ダブル35S
プロモーターフラグメントは、HindIII、SphI、SalI、XbaIまたはPstIでの５'切
断およびポリリンカー制限部位(EcoRI、NotIまたはXhoI)での３'切断により、他
のプロモーターとの置換のために除去できる。
【００９５】 したがって、本発明のDNA分子は、CaMV 35Sプロモーターの制御下の構造的発
現のためのpCGN176ENXに挿入する。
【００９６】 化学的制御可能プロモーター下での発現 この章は、pCGN1761ENX中のダブル35Sプロモーターの選択したプロモーターで
の置換を記載する；例示のために、化学的調節PR-1aプロモーターを記載する。
選択したプロモーターは、好ましくはその源から、制限酵素により切除されるが
、別法として、適当な末端制限部位を担持するプライマーを使用してPCR増幅で
きる。PCR増幅を行ったなら、次いで、プロモーターを再配列させ、標的ベクタ
ー中の増幅プロモーターのクローニング後の増幅エラーをチェックする。化学的
調節可能タバコPR-1aプロモーターをプラスミドpCIB1004から開裂し(EP0332104
参照)、プラスミドoCGN1761ENXに移入する。pCIB1004をNcoIで開裂し、直線状プ
ラスミドの得られる３'突出を、T4 DNAポリメラーゼでの処理により平滑とする
。フラグメントを次いでHindIIIで切断し、フラグメントを含む得られるPR-1aプ
ロモーターをゲル精製し、ダブル35Sプロモーターが除去されているpCGN1761ENX
にクローン化する。これをXhoIで開裂し、T4ポリメラーゼで平滑にし、続いてHi
ndIIIで開裂し、pCIB1004プロモーターフラグメントをクローン化するフラグメ
ントを含む大ベクターターミネーターの単離により行う。これは、PR-1aプロモ
ーターおよびtmlターミネーターおよび独得なEcoRIおよびNotI部位を有する介在
ポリリンカーを有するpCGN1761ENX誘導体を産生する。
【００９７】 本発明のDNA分子をベクターに挿入し、融合生産物(即ち、プロモーター−遺伝
子−ターミネーター)を連続して、本発明に記載のものを含む選択した形質転換
ベクターに移入し、このようにDNA分子の化学的誘導性発現を提供する。
【００９８】 構造的発現：アクチンプロモーター アクチンの数個のイソ形が、殆どの細胞タイプで発現し、素の結果アクチンプ
ロモーターは構造的プロモーターの良い選択であることが知られている。特に、
コメAct1遺伝子由来のプロモーターがクローン化され特徴付けされている(McElr
oy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990))。プロモーターの1.3kbフラグメント
は、コメプロトプラストの発現に必要な全ての調節エレメントを含むことが判明
している。更に、Act1プロモーターに基づく多くの発現ベクターが、特に単子葉
植物での使用のために構築されている(McElroy et al. Mol. Gen. Genet. 231:1
50-160 (1991))。これらはAct1−イントロン１、Adh1 ５'フランキング配列お
よびAdh1−イントロン１(メイズアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から)および
CaMV 35Sプロモーター由来の配列を含む。最大発現を示すベクターは35SとAct1
イントロンまたはAct1 ５'フランキング配列とAct1イントロンの融合である。M
cElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231:160-160 (1991))に記載のプロモーター
発現カセットは、本発明のDNA分子の発現のために容易に修飾され、特に単子葉
植物宿主での使用に適している。例えば、フラグメントを含むプロモーターをMc
Elroy構築物から除去し、pCGN1761ENX中のダブル35Sプロモーターの置換に使用
し、それは次いで挿入または特異的遺伝子配列に利用可能である。このように構
築した融合遺伝子を、適当な形質転換ベクターに移入する。別の報告で、大１イ
ントロンを有するコメAct1プロモーターが培養大麦細胞における高発現を指示す
ることも判明している(Chibbar et al. Plant Cell Rep. 12:506-509 (1993))。
【００９９】 本発明のDNA分子をこのようなプロモーターの下流に置き、融合生産物(即ち、
プロモーター−遺伝子−ターミネーター)を、続いて、本発明に記載のものを含
む選択した形質転換ベクターに移入する。
【０１００】 構造的発現：ユビキチンプロモーター ユビキチンは、多くの細胞タイプに蓄積されることが既知の他の遺伝子生産物
であり、そのプロモーターはトランスジェニックでの使用のために数種からクロ
ーン化されている(例えば、ヒマワリ−Binet et al. Plant Science 79:87-94 (
1991)、メイズ−Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12:619-632 (1989))
。メイズユビキチンプロモーターはトランスジェニック単子葉植物系およびその
配列のために構築されており、単子葉植物形質転換のために構築されたベクター
が特許公開EP0342926に記載されている。更に、Taylor et al. (Plant Cell Rep
. 12:491-495 (1993))が、メイズユビキチンプロモーターおよびダウイ１イント
ロンを含むベクター(pAHC25)、および、微粒子銃を介して挿入したとき、多くの
単子葉植物の細胞懸濁液中でのその高い活性を記載する。ユビキチンプロモータ
ーは、トランスジェニック植物、特に単子葉植物における本発明のDNA分子の発
現に明らかに適している。適当なベクターはpAHC25の誘導体または、適当なユビ
キチンプロモーターおよび／またはイントロン配列の挿入により修飾した本出願
に記載の形質転換ベクターである。
【０１０１】 本発明のDNA分子は、従って、これらのベクターに挿入し、その融合産物(即ち
、プロモーター−遺伝子−ターミネーター)を植物の形質転換に使用し、DNA分子
の構造的発現をもたらす。
【０１０２】 根特異的発現 本発明のDNA分子に関する発現の好ましいパターンは根発現である。ヌクレオ
チド配列の根組織のみへの発現は、その葉および花組織および種子中の発現の付
随した変更なしに、根中のみの標的遺伝子の発現を変える利点を有する。適当な
根プロモーターは、Framond(FEBS 290:103-106 (1991))におよびまた公開特許出
願EP0452269に記載のものである。このプロモーターをpCGN1761ENXのような適当
なベクターに移入し、DNA分子をこのようなベクターに挿入する。全プロモータ
ー−遺伝子−ターミネーターカセットを続いて目的の形質転換ベクターに移入す
る。
【０１０３】 傷誘導性プロモーター 多くのこのようなプロモーターが記載され(例えば、Xu et al. Plant Molec.
Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Ro
hrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plan
t Molec. Biol 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993)
)、全て本発明での使用に適している。Logemann et al.’(前掲)は双子葉植物ジ
ャガイモwun1遺伝子の５'樹流配列を記載する。Xu et al.(前掲)は、双子葉植物
ジャガイモ由来の傷誘導性プロモーター(pin2)が単子葉植物コメで活性であるこ
とを示す。更に、Rohrmeier & Lehle(前掲)は、傷誘導され、標準法を使用して
同起源プロモーターの単離に使用できるメイズWip1 cDNAのクローニングを記載
する。同様に、Firek et al.(前掲)およびWarner et al.(前掲)は、局所傷およ
び病原体浸潤部位で発現される単子葉植物Asparagus officinalis由来の傷誘導
遺伝子を記載する。当分野で既知のクローニング法を使用して、これらのプロモ
ーターを適当なベクターに移入し、本発明のDNA分子に融合し、昆虫病原体河川
の部位でのこれらの遺伝子の発現に使用する。
【０１０４】 髄優先発現 特許出願WO93/07278は、髄細胞で優先的に発現されるメイズtrpA遺伝子の単離
を記載する。標準分子生物学的方法を使用して、このプロモーターまたはその一
部を、pCGN1761のようなベクターに移入でき、そこでそれが35Sプロモーターを
置換し、髄優先法で本発明のDNA分子の発現を駆動するのに使用することができ
る。実際、髄優先プロモーターまたはその一部を含むフラグメントをベクターに
移入し、トランスジェニック植物での利用のために修飾する。DNA分子の髄優先
発現は、このようなベクターへのDNAの挿入により達成される。
【０１０５】 花粉特異的発現 特許出願WO93/は、更に花粉細胞で発現されるメイズカルシウム依存的プロテ
インキナーゼ(CDPK)遺伝子の単離を記載する。遺伝子配列およびプロモーターは
転写の開始からbpまで伸びる。標準分子生物学的方法を使用して、このプロモー
ターまたはその一部をpCGN1761のようなベクターに移入でき、そこでそれが35S
プロモーターを置換し、花粉優先法で本発明のDNA分子の発現を駆動するのに使
用することができる。実際、花粉特異的プロモーターまたはその一部を含むフラ
グメントをベクターに移入し、トランスジェニック植物での利用のために修飾で
きる。
【０１０６】 葉特異的発現 ホスフェノールカルボキシラーゼ(PEPC)をコードするメイズ遺伝子がHudspeth
& Grula (Plant Molec Biol 12:579-589 (1989))に記載されている。標準生物
学的方法を使用して、この遺伝子のプロモーターを、トランスジェニック植物中
で葉特異的方法での本発明のDNA分子の発現の駆動のために使用する。
【０１０７】 実施例８：植物形質転換ベクターの構築 多くの形質転換ベクターが植物形質転換に利用可能であり、本発明のDNA分子
を、適当な条件下で、望ましい細胞でDNA分子の発現をできるように寿樹の発現
カセットに挿入する。ヌクレオチド配列含有発現カセットを、次いで下記の適当
な形質転換ベクターに挿入する。使用のためのベクターの選択は、好ましい形質
転換法および形質転換の標的種に依存する。ある標的種に関して、異なる抗生物
質または除草剤選択マーカーが好ましいことがある。形質転換に慣用的に使用さ
れる選択マーカーは、カナマイシンおよび関連抗生物質に耐性を付与するnptII
遺伝子(Messing & Vierra. Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 30
4:184-187 (1983))、除草剤ホスホイノスリシンに耐性を付与するbar遺伝子(Whi
te et all., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl.
Genet 79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに耐性を付与するhph遺伝
子(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931)およびメトトレキサ
ートに耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104
(1983))を含む。
【０１０８】 (１)Agrobacterium形質転換に適したベクターの選択 多くのベクターがAgrobacterium tumefaciensを使用した形質転換に利用可能
である。これらは典型的に少なくとも一つのT-DNAボーダー配列を担持し、およ
びpBIN19のようなベクターを含む(Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)。以下に二
つの典型的ベクターを記載する。
【０１０９】 pCIB200およびpCIB2001の構築 バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001を、Agrobacteriumでの使用のため
の組換えベクターの構築に使用し、以下の方法で構築する。pTJS75kanを、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の切断を可能にするpTJS75(Schmidhauser & Helinski,
J. Bacterio. 164: 446-455 (1985))のNarI消化、続いくNPTII(Messing & Vierr
a, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983); McBr
ide et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990))を担持するpUC4K由
来のAcclフラグメントの挿入により作る。XhoIリンカーを、左および右T-DNAボ
ーダー配列、植物選択可能nos/nptIIキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含む
pCIB7のEcoRVフラグメントにライゲートし(Rothstein et al. Gene 53:163-161
(1987))、XhoI消化フラグメントをSalI消化pTJS75kanにクローン化し、pCIB200
を作る(EP0332104をまた参照)。pCIB200は以下の独得なポリリンカー制限部位を
含む：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaIおよびSalI。pCIB2001は、ポリリンカー
に更なる制限部位を挿入することにより作ったpCIB200の誘導体である。pCIB200
1のポリリンカー中の独得な制限部位は、EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、Sal
I、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaIおよびStuIである。pCIB2001は、これらの独
得な制限部位の包含に加えて、また植物および細菌カナマイシン選択、Agrobact
erium介在形質転換のための左および右T-DNAボーダー、E. coliと他の宿主の間
の移動のためのRK2由来trfA機能、およびまたRK2由来のOriTおよびOriV機能を有
する。pCIB2001ポリリンカーは、それ自体の調節シグナルを含む植物発現カセッ
トのクローニングに適している。
【０１１０】 上記および本発明のDNA分子を含むの植物発現カセットの任意の一つをpCIB200
1に、好ましくはポリリンカーを使用して挿入する。
【０１１１】 pCIB10およびそのヒグロマイシン選択誘導体の構築 バイナリーベクターpCIB10は、植物の選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を
コードする遺伝子、T-DNAボーダー配列を含み、E. coliおよびAgrobacteriumの
両方での複製を可能にする広い宿主範囲プラスミドpRK252由来の配列を含む。そ
の構築はRothstein et al. (Gene 53:153-161 (1987))に記載されている。Gritz
et al. (Gene 25:179-188 (1983))に記載のヒグロマイシンBホスフォトランス
フェラーゼの遺伝子を含むpCIB10の種々の誘導体が構築されている。これらの誘
導体はヒグロマイシンのみ(pCIB743)またはヒグロマイシンとカナマイシン(pCIB
715、pCIB717)上でのトランスジェニック細胞の選択が可能である。このベクタ
ーを本発明のDNA分子を含む発現カセットの形質転換に使用する。
【０１１２】 (２)非Agrobacterium形質転換に適したベクターの構築 Agrobacterium tumefaciensの使用なしの形質転換は、選択形質転換ベクター
におけるT-DNA配列の必要性を回避し、結果としてこれらの配列を欠くベクター
が、T-DNA配列を含む上記のもののようなベクターに加えて利用できる。Agrobac
teriumに頼らない形質転換法は、微粒子銃、プロトプラスト取り込み(例えば、P
EGおよびエレクトロポレーション)、マイクロインジェクションまたは花粉形質
転換(米国特許第５,６２９,１８３号)を含む。ベクターの選択は、形質転換する
種の好ましい選択に大きく依存する。以下に、ある典型的ベクターの構築を記載
する。
【０１１３】 pCIB3064の構築 pCIB3064は除草剤バスタ(またはホスホイノスリシン)による選択と組合わせた
直接遺伝子移入法に適したpUC由来ベクターである。プラスミドpCIB246は、E. c
oli GUS遺伝子およびCaMV 35S転写ターミネーターへの操作的融合でCaMV 35Sプ
ロモーターを含み、PCT公開出願WO93/07278に記載されている。このベクターの3
5Sプロモーターは二つのATG配列を出発側の５'に含む。これらの側は、ATGを除
去し、制限部位SspIおよびPvuIIを産生するような方法で標準PCR法を使用して変
異させる。新規制限部位は独得なSalI部位から９６および３７bp離れ、実際の出
発部位から１０１および４２bp離れている。pCIB246の得られる誘導体をpCIB302
5と名付ける。GUS遺伝子を次いで、SalIおよびSacIでの消化によりpCIB3025から
切除し、末端を平滑にし、再ライゲートしてプラスミドpCIB3060を産生する。プ
ラスミドpJIT82をJoh Innes Centre, Norwichから得、Streptomyces viridochro
mogenes由来のbar遺伝子を含む４００bp SmaIフラグメントを切除し、pCIB3060
のHpaI部位に挿入する(Thompson et al. EMBO J 6:2519-2523 (1987))。これはC
aMV 35Sプロモーターおよびターミネーターの制御下の除草剤選択のためのbar遺
伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子(E. coliでの選択のため)および独得な
制限部位SphI、PstI、HindIIIおよびBamHIを含むpCIB3064を作る。このベクター
は、本発明のDNA分子の発現を指示するためのそれ自体の調節シグナルを含む植
物発現カセットのクローニングに適する。
【０１１４】 pSOG19およびpSOG35の構築 pSOG35は、メトトレキサートに対する耐性を付与する選択可能マーカーとして
E. coliジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)を使用する形質転換ベクターで
ある。PCRを使用して35Sプロモーター(〜８００bp)、メイズAdh1遺伝子由来のイ
ントロン６(〜５５０bp)およびpSOG10由来のGUS非翻訳リーダー配列の１８bpを
増幅する。E. coliジヒドロフォレートレダクターゼタイプII遺伝子をコードす
る２５０bpフラグメントをまたはPCRで増幅し、これら二つのPCRフラグメントを
、pUC19バックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpBI221(Cl
ontech)由来のSacI-PstIフラグメントと集合させる。これらのフラグメントの集
合は、イントロン６配列と融合した35Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子
およびノパリンシンターゼターミネーターを含む。pSOG19中のGUSリーダーのメ
イズクロロティックモットルウイルス(MCMV)での置換によりベクターpSOG35を産
生する。pSOG19およびpSOG35は、アンピシリン耐性のためのpUC遺伝子を担持し
、外来配列、特に本発明のDNA分子のクローニングに利用可能なHindIII、SphI、
PstIおよびEcoRI部位を有する。
【０１１５】 実施例９：葉緑体形質転換 形質転換ベクター 植物プラスチド中での本発明のDNA分子の発現のために、プラスチド形質転換
ベクターpPH143(WO97/32011、実施例３６)を使用する。次いで、このベクターを
pPH143に挿入し、それによりPROTOXコード配列を置換する。このベクターを、次
いでプラスチド形質転換におよびスペクチノマイシン耐性に関する形質転換体の
選択に使用する。あるいは、DNA分子をpPH143に挿入し、aadH遺伝子を置換させ
る。この場合、形質転換体はPROTOX阻害剤に対する耐性に関して選択する。
【０１１６】 葉緑体形質転換 Nicotiana tabacum c.v. 'Xanthi nc'の種子を、T寒天培地上で１"環状配列で
プレート当たり７つ発芽させ、種蒔き後１２−１４日に、本質的に記載のような
pPH143およびpPH145由来のDNAでコートした１μmタングステン粒子(M10、Biorad
, Hercules, CA)で照射した(Svab, Z. and Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-91
7)。照射した苗をT培地上で２日間インキュベートし、その後葉を取り、５００
μg／mlスペクチノマイシンジヒドロクロライド(Sigma, St. Louis, MO)含有RMO
P培地(Svab, Z., Hajdukiewicz, P. and Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-853
0)のプレート上に明るい光(３５０−５００μmol光子／m2／s)の中、背軸側を上
に置いた。照射後３から８週間に白色葉の下に現れる耐性の芽を、同じ培地上で
サブクローン化し、カルスを形成させ、２次芽を単離しサブクローン化する。独
立したサブクローンの形質転換プラスチドゲノムコピーの完全な隔離(ホモプラ
スミシティー)は、サザンブロット(Sambrook et al., (1989) Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r)の標準法で評価した。BamHI/EcoRI消化全細胞性DNA(Mettler, I. J. (1987) P
lant Mol Biol Reporter 5, 346-349)を１％Tris−ボレート(TBE)アガロースゲル
で分離し、ナイロン膜(Amersham)に移し、rps7/12プラスチド標的配列の部分を
含むpC8由来の０.７kb BamHI/HindIII DNAフラグメントを含む32P標識した無作
為にプライムしたDNA配列とプローブした。同原形質(homoplasmic)芽をスペクチ
ノマイシン含有MS/IBA培地(McBride, K. E. et al. (1994) PNAS 91, 7301-7305
)に無菌的に根付かせ、温室に移す。
【０１１７】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ジョシュア・ズビ・レビン アメリカ合衆国27701ノースカロライナ州 ダーラム、アーバン・アベニュー1008番 (72)発明者 チュエ・チュデン アメリカ合衆国27502ノースカロライナ州 エイペックス、フォーレスト・ブルック・ ドライブ108番 (72)発明者 アニック・ジャンヌ・ドゥ・フラモン アメリカ合衆国27312ノースカロライナ州 ピッツボロ、レイクストーン・エステイツ 426番 (72)発明者 マーサ・エム・ダン アメリカ合衆国27278ノースカロライナ州 ヒルズバーロウ、オークビュー・コート 6201番 (72)発明者 ジェン・ション・チェン アメリカ合衆国27514ノースカロライナ州 チャペル・ヒル、オーチャード・レイン 302番

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的遺伝子のセンスRNAフラグメントおよび該標的遺伝子の
    アンチセンスRNAフラグメントを植物細胞内に挿入することを含み、該センスRNA
    フラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成でき
    るものである、植物細胞内の標的遺伝子の発現を変える方法。
  2. 【請求項２】 該RNAフラグメントが二つの異なるRNA分子に包含されている
    、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 該RNAフラグメントが一つのRNA分子に包含されている、請求
    項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 RNA分子が、その中に包含されるRNAフラグメントが二本鎖領
    域を形成するように折りたたむことができる、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 植物細胞内に、該細胞内で標的遺伝子のセンスRNAフラグメ
    ントを発現できる第１DNA配列、および該細胞内で標的遺伝子のアンチセンスRNA
    フラグメントを発現できる第２DNA配列を挿入することを含み、該センスRNAフラ
    グメントおよび該アンチセンスRNAフラグメントが、二本鎖RNA分子を形成できる
    ものである、植物細胞内の標的遺伝子の発現を変える方法。
  6. 【請求項６】 該標的遺伝子が該植物細胞の必須遺伝子である、請求項５記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 該標的遺伝子が該植物細胞のゲノムに安定に統合された異種
    遺伝子である、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 異種遺伝子が、染色体外分子として該植物細胞内に存在する
    、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 該第１DNA配列および該第２DNA配列が該植物細胞のゲノム内
    に安定に統合されている、請求項５記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該第１DNA配列および該第２DNA配列がが二つの異なるDNA
    分子に包含されている、請求項５記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該DNA分子が更に該第１DNA配列に操作可能に結合した第１
    プロモーターおよび該第２DNA配列に操作可能に結合した第２プロモーターを含
    む、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該第１DNA配列および該第２DNA配列が一つのDNA分子内に
    包含される、請求項５記載の方法。
  13. 【請求項１３】 該第１DNA配列および該第２DNA配列が、該DNA分子の同じD
    NA鎖に包含される、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグ
    メントが一つのRNA分子として発現される、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 該RNA分子が、その中に包含されるRNAフラグメントが二本
    鎖領域を形成するように折りたたむことができる、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 該DNA分子が更に該第１または該第２DNA配列に操作可能に
    結合したプロモーターを含む、請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 該プロモーターが天然標的遺伝子の天然プロモーター、異
    種プロモーター、構造的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモ
    ーターまたは発育調節プロモーターである、請求項１６記載のプロモーター。
  18. 【請求項１８】 該DNA分子が更に該センスRNAフラグメントと該アンチセン
    スRNAフラグメントの間にリンカーを含む、請求項１２記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該リンカーが選択可能マーカー遺伝子のような機能的遺伝
    子を含む、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該リンカーが、イントロン処理シグナルのような調節性配
    列を含む、請求項１８記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該センスRNAフラグメントおよび該アンチセンスRNAフラグ
    メントが二つのRNA分子として発現される、請求項１３記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該第１DNA配列が第１プロモーターに操作可能に結合し、
    該第２DNA配列が第２プロモーターに操作可能に結合している、請求項２１記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 該第１DNA配列および該第２DNA配列が二方向プロモーター
    に操作可能に結合している、請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 該第１DNA配列および該第２DNA配列が該DNA分子の相補的
    鎖に包含されている、請求項１２記載の方法。
  25. 【請求項２５】 該第１DNA配列が、該DNA分子内の該第２DNA配列の相補的D
    NA鎖である、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 該DNA分子が更に該第１DNA配列に操作可能に結合した第１
    プロモーターを含む、請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該DNA分子が更に第１部位特異的組換え部位を該第１プロ
    モーターと該第１DNA配列の間に、および第１部位特異的組換え部位を該DNA配列
    の３'末端に含み、部位特異的リコンビナーゼの存在下、該第１および第２部位
    特異的組換え部位が該第１および該第２部位特異的組換え部位の間の該第１DNA
    配列を逆にすることができる、請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 逆転の結果として、該第１プロモーターが該第２DNA配列
    を発現できる、請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 該植物細胞が、更に該部位特異的組換え部位を認識できる
    部位特異的リコンビナーゼを含む、請求項２７記載の方法。
  30. 【請求項３０】 該DNA分子が更に該第２DNA配列に操作可能に結合したぢア
    ２プロモーターを含む、請求項２６記載の方法。
  31. 【請求項３１】 標的遺伝子のセンスRNAフラグメントを発現できる第１DNA
    配列、および該細胞内で標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメントを発現でき
    る第２DNA配列を含み、該DNA配列が発現されたとき、該センスRNAフラグメント
    および該アンチセンスRNAフラグメントは二本鎖RNA分子を形成でき、該植物細胞
    内での該標的遺伝子の発現が変更されるものである、植物細胞。
  32. 【請求項３２】 請求項３１記載の植物細胞由来の植物およびその子孫。
  33. 【請求項３３】 請求項３２記載の植物由来の種子。
  34. 【請求項３４】 植物細胞内に標的遺伝子のセンスRNAフラグメントを発現
    できる第１DNA配列、および該細胞内で標的遺伝子のアンチセンスRNAフラグメン
    トを発現できる第２DNA配列を挿入することにより得、該センスRNAフラグメント
    および該アンチセンスRNAフラグメントが二本鎖RNA分子を形成できるものである
    、植物細胞。
JP2000551014A 1998-05-26 1999-05-25 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節 Pending JP2002516112A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8494298A 1998-05-26 1998-05-26
US09/084,942 1998-05-26
PCT/EP1999/003608 WO1999061631A1 (en) 1998-05-26 1999-05-25 Dsrna-mediated regulation of gene expression in plants

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009148820A Division JP2009261403A (ja) 1998-05-26 2009-06-23 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002516112A true JP2002516112A (ja) 2002-06-04
JP2002516112A5 JP2002516112A5 (ja) 2005-08-25

Family

ID=22188183

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000551014A Pending JP2002516112A (ja) 1998-05-26 1999-05-25 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節
JP2009148820A Pending JP2009261403A (ja) 1998-05-26 2009-06-23 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009148820A Pending JP2009261403A (ja) 1998-05-26 2009-06-23 植物内の遺伝子発現のｄｓｒｎａ介在調節

Country Status (22)

Country Link
EP (2) EP1516931B1 (ja)
JP (2) JP2002516112A (ja)
KR (1) KR20010071315A (ja)
CN (2) CN101173298B (ja)
AR (1) AR020078A1 (ja)
AT (2) ATE292182T1 (ja)
AU (1) AU751409B2 (ja)
BR (1) BR9910729A (ja)
CA (1) CA2328058C (ja)
CY (1) CY1112420T1 (ja)
DE (1) DE69924484T2 (ja)
DK (2) DK1516931T3 (ja)
ES (2) ES2374521T3 (ja)
HK (1) HK1034999A1 (ja)
HU (1) HUP0102103A3 (ja)
IL (2) IL139374A0 (ja)
MX (1) MXPA00011583A (ja)
PL (1) PL344312A1 (ja)
PT (1) PT1516931E (ja)
TR (1) TR200003481T2 (ja)
WO (1) WO1999061631A1 (ja)
ZA (1) ZA200006594B (ja)

Families Citing this family (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
JP4187413B2 (ja) 1998-03-20 2008-11-26 コモンウェルス サイエンティフィック アンドインダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 遺伝子発現の制御
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
US7005423B1 (en) 1999-07-02 2006-02-28 Devgen Nv Characterization of gene function using double stranded RNA inhibition
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
CA2369422A1 (en) * 1999-05-10 2000-11-16 Syngenta Participations Ag Regulation of viral gene expression
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
EP1206558B1 (en) 1999-08-26 2008-01-09 Calgene LLC Plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
DE10100586C1 (de) 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2001049844A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for gene silencing
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
DK1309726T4 (en) 2000-03-30 2019-01-28 Whitehead Inst Biomedical Res RNA Sequence-Specific Mediators of RNA Interference
WO2002000904A2 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant constructs and their use in reducing gene expression
WO2002059257A2 (en) 2000-10-31 2002-08-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for producing barley yellow dwarf virus resistant cereal plants
CH695778A5 (de) * 2000-11-29 2006-08-31 Hoffmann La Roche Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben.
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
AU2002246742B2 (en) * 2000-12-28 2008-02-07 J & J Research Pty Ltd Double-stranded RNA-mediated gene suppression
JP2004532616A (ja) * 2000-12-28 2004-10-28 ジョンソン・アンド・ジョンソン・リサーチ・ピー・ティー・ワイ・リミテッド 二本鎖ｒｎａ仲介遺伝子抑制
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2002059294A1 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research O Rganisation Methods and means for producing efficient silencing construct using recombinational cloning
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2192945B1 (es) * 2001-07-06 2005-03-01 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Un metodo para interferir con la infeccion de virus en plantas.
CA2921821A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CN1643147B (zh) * 2002-03-14 2010-04-14 联邦科学和工业研究组织 监测和调节基因沉默的方法和工具
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
EP2294915A3 (en) 2002-03-21 2011-04-13 Monsanto Technology LLC Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
US20040180438A1 (en) 2002-04-26 2004-09-16 Pachuk Catherine J. Methods and compositions for silencing genes without inducing toxicity
AR039717A1 (es) * 2002-06-21 2005-03-09 Monsanto Technology Llc Construcciones de arn de intrones cadena doble y usos de las mismas
WO2004001044A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Sinogenomax Company Ltd. Randomised dna libraries and double-stranded rna libraries, use and method of production thereof
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US7956176B2 (en) 2002-09-05 2011-06-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7365186B2 (en) 2002-11-22 2008-04-29 Arborgen, Llc Vascular-preferred promoter sequences and uses thereof
AU2003303589B2 (en) 2002-12-26 2008-04-24 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
JP4909072B2 (ja) 2003-06-06 2012-04-04 アーバージェン インコーポレイテッド 転写因子
US7855323B2 (en) 2004-02-10 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Recombinant DNA for gene suppression
AR047598A1 (es) * 2004-02-10 2006-01-25 Monsanto Technology Llc Semilla de maiz transgenica con mayor contenido de aminoacidos
CA2554212A1 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sina)
US7622301B2 (en) 2004-02-24 2009-11-24 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods using RNA interference for control of nematodes
CA2559161C (en) 2004-03-12 2013-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents targeting vegf
CN102524294B (zh) 2004-04-09 2018-04-06 孟山都技术有限公司 用于在植物中控制昆虫侵袭的组合物和方法
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7453025B2 (en) 2004-09-22 2008-11-18 Arborgen, Llc Reproductive ablation constructs
ES2444001T3 (es) 2004-10-21 2014-02-21 Venganza Inc. Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas
US20060150286A1 (en) * 2004-12-23 2006-07-06 Shihshieh Huang Gene suppression in transgenic plants using multiple constructs
EP1831376A1 (en) 2004-12-28 2007-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Improved grain quality through altered expression of seed proteins
US7554018B2 (en) 2005-01-14 2009-06-30 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
WO2006091194A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome p450 genes
US20060272057A1 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving crop plant architecture and yield
EP1929019A2 (en) 2005-09-08 2008-06-11 Chromatin, Inc. Plants modified with mini-chromosomes
EP2325315B1 (en) 2005-10-28 2014-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
EP1942948A4 (en) 2005-11-04 2010-03-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF THE NAV1.8 GENE
AU2006311730B2 (en) 2005-11-09 2010-12-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Factor V Leiden mutant gene
US8058509B2 (en) 2005-12-21 2011-11-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for in planta production of inverted repeats
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
US7589257B2 (en) 2006-02-09 2009-09-15 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants
CN101421406B (zh) 2006-02-13 2016-08-31 孟山都技术有限公司 用于产生改变的种子油组成的核酸构建体和方法
NZ571568A (en) 2006-03-31 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
MX2008013354A (es) 2006-04-19 2008-11-10 Pioneer Hi Bred Int Moleculas de polinucleotidos aislados que corresponden a alelos mutantes y tipo salvaje del gen de maiz d9, y metodos para usarlas.
WO2007127919A2 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the jc virus
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
WO2007137156A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of aha and therapeutic uses thereof
AU2007253677B2 (en) 2006-05-22 2011-02-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of IKK-B gene
AU2007290367B2 (en) * 2006-08-31 2013-10-31 Monsanto Technology, Llc Phased small RNAs
CA2661181C (en) 2006-08-31 2015-07-21 Monsanto Technology Llc Identifying transgenic corn plants without screening or selection
EP2069380B1 (en) 2006-09-18 2014-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Rnai modulation of scap and therapeutic uses thereof
CA2663581C (en) 2006-09-21 2016-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
WO2008067840A1 (en) 2006-12-08 2008-06-12 Swetree Technologies Ab Plants having improved growth characteristics and method for making the same
WO2008116094A2 (en) 2007-03-21 2008-09-25 Brookhaven Science Associates, Llc Combined hairpin-antisense compositions and methods for modulating expression
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
EP2905336A1 (en) 2007-03-29 2015-08-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
US20100209919A1 (en) 2007-05-23 2010-08-19 Syngenta Participations Ag Polynucleotide markers
EP2164863A4 (en) 2007-06-15 2010-07-28 Univ Arkansas METHOD FOR THE ADMINISTRATION OF MOLECULES IN CELLS USING A RICIN SUB-UNIT AND RELATED COMPOSITIONS THEREOF
CN103215269B (zh) 2007-07-05 2015-01-21 诺瓦提斯公司 用于治疗病毒感染的dsRNA
EP2185706B1 (en) 2007-08-14 2017-09-27 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Improved gene silencing methods
US8097712B2 (en) 2007-11-07 2012-01-17 Beelogics Inc. Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof
EP2573177B1 (en) 2007-11-12 2022-12-28 North Carolina State University Alteration of tobacco alkaloid content through modification of specific cytochrome P450 genes
CN101932712B (zh) 2007-11-20 2014-05-14 先锋国际良种公司 用于改善植物应激耐性的玉米乙烯信号转导基因及其调节
WO2009076400A2 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of factor vii gene
CN101952445A (zh) 2007-12-21 2011-01-19 关键基因公司 毛状体特异性启动子
EP2235185A4 (en) 2007-12-28 2011-10-05 Swetree Technologies Ab WOOD PLANTS WITH IMPROVED GROWTH PROPERTIES AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF BY TRANSCRIPTION FACTORS
NZ588280A (en) 2008-03-05 2012-11-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes
WO2009129281A2 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Compositions and methods for delivering inhibitory oligonucleotides
BRPI0910848A2 (pt) 2008-04-28 2015-08-18 Univ Michigan Tech Elementos de promotores específicos da fibra
US8318693B2 (en) 2008-09-02 2012-11-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of mutant EGFR gene
EP3584320A1 (en) 2008-09-25 2019-12-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
AR075549A1 (es) 2008-09-29 2011-04-20 Monsanto Technology Llc Evento transgenico de soja mon87705 y metodos para detectar el mismo
EA029762B1 (ru) 2008-10-20 2018-05-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
MX2011003616A (es) 2008-10-30 2011-08-15 Pioneer Hi Bred Int Manipulacion de glutamina sintetasas (gs) para mejorar la eficiencia de uso de nitrogeno y rendimiento de grano en plantas superiores.
EP2527454B1 (en) 2008-11-03 2017-05-03 Swetree Technologies AB Vegetabile material, plants and a method of producing a plant having altered lignin properties
CA2743707A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1
CA2746514C (en) 2008-12-10 2018-11-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
WO2010099341A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of mig-12 gene
US8716553B2 (en) 2009-03-02 2014-05-06 Pioneer Hi Bred International Inc NAC transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
CN102421900B (zh) 2009-03-12 2015-07-22 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因表达的脂质配制的组合物以及方法
US8987553B2 (en) 2009-04-14 2015-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Modulation of ACC synthase improves plant yield under low nitrogen conditions
MX336182B (es) 2009-06-08 2016-01-11 Nunhems Bv Plantas tolerantes a la sequia.
CA2764832A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
US9175301B2 (en) 2009-07-24 2015-11-03 Pioneer Hi Bred International Inc Use of dimerization domain component stacks to modulate plant architecture
AP3574A (en) 2009-08-14 2016-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
MX2012003972A (es) 2009-10-02 2012-05-08 Pionner Hi Bred International Inc Regulacion a la baja de acc sintasa para mejorar el rendimiento de las plantas.
US8962584B2 (en) 2009-10-14 2015-02-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. Compositions for controlling Varroa mites in bees
TWI412027B (zh) 2009-11-16 2013-10-11 Sony Corp 碟片匣
WO2011067745A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Rosetta Green Ltd. Compositions and methods for enhancing plants resistance to abiotic stress
AU2010328104B2 (en) 2009-12-09 2014-10-30 Nitto Denko Corporation Modulation of hsp47 expression
CA2786741A1 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Identification of diurnal rhythms in photosynthetic and non-photosynthetic tissues from zea mays and use in improving crop plants
WO2011112570A1 (en) 2010-03-08 2011-09-15 Monsanto Technology Llc Polynucleotide molecules for gene regulation in plants
JP5860029B2 (ja) 2010-03-29 2016-02-16 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスチレチン（ＴＴＲ）関連眼アミロイドーシスのためのｓｉＲＮＡ療法
EP2555778A4 (en) 2010-04-06 2014-05-21 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING CD274 / PD-L1 GENE EXPRESSION
CN107974457A (zh) 2010-05-28 2018-05-01 纽海姆有限公司 果实大小增大的植物
CA2801066C (en) 2010-06-02 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods directed to treating liver fibrosis
EP2593468B1 (en) 2010-07-12 2020-06-10 The State of Israel, Ministry of Agriculture and Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.), Volcani Center Isolated polynucleotides and methods and plants using same for regulating plant acidity
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
CN110123830A (zh) 2010-11-09 2019-08-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制Eg5和VEGF基因的表达的脂质配制的组合物和方法
SG190412A1 (en) 2010-12-06 2013-06-28 Quark Pharmaceuticals Inc Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
EA201391373A1 (ru) 2011-03-23 2014-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы получения сложного локуса трансгенных признаков
US9677084B2 (en) 2011-04-29 2017-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Down-regulation of a homeodomain-leucine zipper I-class homeobox gene for improved plant performance
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US20140216118A1 (en) 2011-06-14 2014-08-07 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and Methods for Making and Biocontaining Auxotrophic Transgenic Plants
CA2844470A1 (en) 2011-06-21 2013-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for producing male sterile plants
US20140275211A1 (en) 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
US9228188B2 (en) 2011-06-21 2016-01-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and method for inhibiting hepcidin antimicrobial peptide (HAMP) or HAMP-related gene expression
KR20230084331A (ko) 2011-06-21 2023-06-12 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 아포리포단백질 c-iii(apoc3) 유전자의 발현 억제를 위한 조성물 및 방법
EP2723351B1 (en) 2011-06-21 2018-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of protein c (proc) genes
EP3597750B1 (en) 2011-06-23 2022-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
US10760086B2 (en) 2011-09-13 2020-09-01 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US10806146B2 (en) 2011-09-13 2020-10-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
EP3434780A1 (en) 2011-09-13 2019-01-30 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US10829828B2 (en) 2011-09-13 2020-11-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
CN104160028A (zh) 2011-09-13 2014-11-19 孟山都技术公司 用于杂草控制的方法和组合物
EP2755467B1 (en) 2011-09-13 2017-07-19 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control
US9840715B1 (en) 2011-09-13 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants
UA116089C2 (uk) 2011-09-13 2018-02-12 Монсанто Текнолоджи Ллс Спосіб та композиція для боротьби з бур'янами (варіанти)
US9920326B1 (en) 2011-09-14 2018-03-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing invertase activity in plants
US20150159166A1 (en) 2011-10-31 2015-06-11 Pioneer Hi Bred International Inc Plant drought tolerance and nitrogen use efficiency by reducing plant sensitivity to ethylene
WO2013067076A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
UA116097C2 (uk) 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
WO2013118120A2 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Rosetta Green Ltd. Isolated polynucleotides expressing or modulating micrornas or targets of same, transgenic plants comprising same and uses thereof in improving nitrogen use efficiency, abiotic stress tolerance, biomass, vigor or yield of a plant
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
EP3919620A1 (en) 2012-05-02 2021-12-08 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
MX360866B (es) * 2012-05-24 2018-11-09 A B Seeds Ltd Composiciones y métodos para silenciar la expresión genética.
EP2885411B1 (en) 2012-08-16 2018-12-05 VIB vzw Means and methods for altering the lignin pathway in plants
CN104870647A (zh) 2012-10-18 2015-08-26 孟山都技术公司 用于植物害虫控制的方法和组合物
CN103060374B (zh) * 2012-10-30 2014-05-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于位点特异性重组的rna干扰载体及其构建方法和应用
US10683505B2 (en) 2013-01-01 2020-06-16 Monsanto Technology Llc Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression
UY35251A (es) 2013-01-01 2014-07-31 Seeds Ltd Ab MOLÉCULAS DE dsRNA AISLADAS Y MÉTODOS PARA USARLAS PARA SILENCIAR MOLÉCULAS DIANA DE INTERÉS
US10000767B2 (en) 2013-01-28 2018-06-19 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
BR112015017830A2 (pt) 2013-01-29 2017-11-21 Bayer Cropscience Lp processos e meios para aumentar a tolerância ao estresse e a biomassa em plantas
US20160002648A1 (en) 2013-03-11 2016-01-07 Mei Guo Genes for improving nutrient uptake and abiotic stress tolerance in plants
WO2014164116A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Functional expression of bacterial major facilitator superfamily (sfm) gene in maize to improve agronomic traits and grain yield
WO2014164797A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
US20160010101A1 (en) 2013-03-13 2016-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Enhanced nitrate uptake and nitrate translocation by over- expressing maize functional low-affinity nitrate transporters in transgenic maize
UY35379A (es) 2013-03-13 2014-09-30 Monsanto Technology Llc ?métodos y composiciones para el control de malezas?.
CN105378060B (zh) 2013-03-13 2019-12-10 经纬生物科技有限公司 非复制型转导颗粒和基于转导颗粒的报告系统
CA2903693A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US20140283211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Monsanto Technology Llc Methods and Compositions for Plant Pest Control
CN105143454A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 先锋国际良种公司 Acc氧化酶多核苷酸和多肽的组合物和使用方法
US10568328B2 (en) 2013-03-15 2020-02-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for weed control
AU2014234265B2 (en) 2013-03-21 2020-01-30 Universiteit Gent Means and methods for the reduction of photorespiration in crops
AU2014278519B2 (en) 2013-06-11 2020-09-10 Syngenta Participations Ag Methods for generating transgenic plants
US9850496B2 (en) 2013-07-19 2017-12-26 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling Leptinotarsa
MX359191B (es) 2013-07-19 2018-09-18 Monsanto Technology Llc Composiciones y métodos para controlar leptinotarsa.
UA120426C2 (uk) 2013-11-04 2019-12-10 Монсанто Текнолоджі Елелсі Композиція та спосіб для боротьби з членистоногими паразитами та зараженням шкідниками
UA119253C2 (uk) 2013-12-10 2019-05-27 Біолоджикс, Інк. Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл
EP3116303B1 (en) 2014-01-15 2020-07-22 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for weed control using epsps polynucleotides
WO2015116680A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Two Blades Foundation Plants with enhanced resistance to phytophthora
AP2016009478A0 (en) * 2014-03-12 2016-09-30 Univ Sydney Rna production in higher plants
WO2015153339A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for controlling insect pests
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
CA2953347A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference
EP3161138A4 (en) 2014-06-25 2017-12-06 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression
US20170159065A1 (en) 2014-07-08 2017-06-08 Vib Vzw Means and methods to increase plant yield
CN114009454A (zh) 2014-07-29 2022-02-08 孟山都技术公司 用于控制昆虫害虫的组合物和方法
BR112017011076A2 (pt) 2014-11-25 2018-08-07 Integrated Plant Genetics Inc métodos e composições para prevenir ou reduzir infecções de plantas cultivadas por agentes patogênicos fúngicos e bacterianos
PL3256589T3 (pl) 2015-01-22 2022-02-21 Monsanto Technology Llc Kompozycje i sposoby kontrolowania leptinotarsa
AU2016270870A1 (en) 2015-06-02 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for delivery of a polynucleotide into a plant
AU2016270913A1 (en) 2015-06-03 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants
AU2016315584B2 (en) 2015-09-02 2022-07-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) iRNA compositions and methods of use thereof
JP6978152B2 (ja) 2015-09-04 2021-12-08 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 複相胞子生殖遺伝子
WO2017062790A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Two Blades Foundation Cold shock protein receptors and methods of use
AU2017234920B2 (en) 2016-03-18 2023-08-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods and compositions for producing clonal, non-reduced, non-recombined gametes
WO2019047914A1 (zh) 2017-09-07 2019-03-14 北京泰德制药股份有限公司 靶向ckip-1的双链rna分子及其用途
EP4004212A1 (en) 2019-07-30 2022-06-01 The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Institute) Methods of controlling cannabinoid synthesis in plants or cells and plants and cells produced thereby
WO2021037972A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Sanofi Compositions and methods for inhibiting pcsk9
WO2021100034A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Protalix Ltd. Removal of constructs from transformed cells
JP2023526328A (ja) 2020-05-14 2023-06-21 エイアールアイズィー・プリシジョン・メディスン・インコーポレイテッド ｓｉＲＮＡを使用してＰＲＤＭ２／ＲＩＺタンパク質の発現を調節するがん治療
CN118019447A (zh) 2021-08-06 2024-05-10 Kws蔬菜有限责任公司 菠菜对霜霉病的持久抗性

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1313830C (en) 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
IL81737A (en) * 1986-03-28 1992-11-15 Calgene Inc Regulation of gene expression in plant cells
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
EP0332104A3 (en) 1988-03-08 1991-03-20 Ciba-Geigy Ag Chemically regulatable dna sequences and genes and uses thereof
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
DE69034081T2 (de) 1989-03-24 2004-02-12 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene Pflanze
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5629183A (en) 1989-05-08 1997-05-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Plant transformation by gene transfer into pollen
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5639949A (en) 1990-08-20 1997-06-17 Ciba-Geigy Corporation Genes for the synthesis of antipathogenic substances
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5527695A (en) * 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
GB9320548D0 (en) * 1993-10-06 1993-11-24 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5576198A (en) 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
US5545817A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
BR9707783A (pt) 1996-02-28 1999-07-27 Novartis Ag Promotores provenientes de genes para protoporfirnogênio oxidase em vegetais
GB9710475D0 (en) * 1997-05-21 1997-07-16 Zeneca Ltd Gene silencing
GB9720148D0 (en) * 1997-09-22 1997-11-26 Innes John Centre Innov Ltd Gene silencing materials and methods
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP4187413B2 (ja) * 1998-03-20 2008-11-26 コモンウェルス サイエンティフィック アンドインダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 遺伝子発現の制御
PT1068311E (pt) * 1998-04-08 2011-07-20 Commw Scient Ind Res Org Processos e meios de obter fenótipos modificados

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200006594B (en) 2002-03-27
DE69924484T2 (de) 2005-09-22
BR9910729A (pt) 2001-02-13
AR020078A1 (es) 2002-04-10
TR200003481T2 (tr) 2001-04-20
ES2237107T3 (es) 2005-07-16
HK1034999A1 (en) 2001-11-09
IL139374A (en) 2011-01-31
DK1516931T3 (da) 2012-02-06
HUP0102103A2 (hu) 2001-09-28
EP1080208B1 (en) 2005-03-30
EP1516931B1 (en) 2011-10-12
DE69924484D1 (de) 2005-05-04
JP2009261403A (ja) 2009-11-12
CA2328058A1 (en) 1999-12-02
AU4368399A (en) 1999-12-13
MXPA00011583A (es) 2001-05-01
EP1516931A3 (en) 2007-10-31
WO1999061631A1 (en) 1999-12-02
ES2374521T3 (es) 2012-02-17
PT1516931E (pt) 2012-01-11
CY1112420T1 (el) 2015-12-09
PL344312A1 (en) 2001-10-22
CA2328058C (en) 2010-10-12
DK1080208T3 (da) 2005-07-04
IL139374A0 (en) 2001-11-25
CN101173298B (zh) 2013-01-02
KR20010071315A (ko) 2001-07-28
AU751409B2 (en) 2002-08-15
EP1516931A2 (en) 2005-03-23
EP1080208A1 (en) 2001-03-07
HUP0102103A3 (en) 2003-03-28
CN1307641A (zh) 2001-08-08
ATE528400T1 (de) 2011-10-15
CN101173298A (zh) 2008-05-07
ATE292182T1 (de) 2005-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1080208B1 (en) Dsrna-mediated regulation of gene expression in plants
EP2811024B1 (en) Plant expression vector
EP1801215B1 (en) Regulation of viral gene expression
US9896693B2 (en) Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof
US20020192813A1 (en) Plant expression vectors
JP2002505875A (ja) 植物中トレハロース生合成遺伝子の発現
EP2301948A1 (en) Promoters for regulation of gene expression in plant roots
JP2002512775A (ja) Ｍｌｏタンパク質をコードし、植物に真菌耐性を付与する遺伝子
CN106011141B (zh) 岷江百合诱导型启动子及其应用
EP1165755B1 (en) Banana and melon promoters for expression of transgenes in plants
US7019195B1 (en) Method for conferring resistance or tolerance aganist furovirus, potyvirus, tospovirus, and cucomovirus to plant cells
WO2000015812A1 (fr) Fragment d'adn a fonction promoteur

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20031209

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20031209

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20061128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070221

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070228

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070528

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090224