JP2002512775A - Ｍｌｏタンパク質をコードし、植物に真菌耐性を付与する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、真菌病原体に対して植物の耐性を制御するタンパク質をコードする遺伝子について記載している。この発明はまた、真菌病原体に耐性があるトランスジェニック植物および植物を真菌病原体に対して耐性にする方法について記載している。さらにこの発明は、真菌病原体に対する植物の耐性を制御する追加タンパク質をコードする追加遺伝子の分離方法について開示している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） この発明は、真菌性疾患に対する植物の耐性を制御するタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列に関するものである。この発明はまた、真菌性疾患に対する
耐性植物および植物に真菌性疾患耐性を付与する方法に関するものである。

【０００２】 （背景技術） 真菌性疾患は、合衆国における農作物に対して毎年約９１億ドルの損失をまね
くもので、非常に広範な種類の生物学的に多様な病原体により誘発される。伝統
的には、それらを制御するために種々の戦略が使用されてきた。抵抗特性が農業
的に重要な品種に関して改良されたため、狭い範囲の病原体分離株または種類、
またはさらに広い範囲に対して様々なレベルの耐性が付与されている。しかしな
がら、これは、遺伝的交雑により望ましい特性を商業ラインに導入するという長
期にわたる労働集約的な過程を伴い、さらに病害虫が進化して天然植物耐性を克
服するという危険性があるため、新たな抵抗特性を加えて商業ラインを改良する
絶え間無い努力が要求される。別法として、真菌性疾患は、化学殺菌剤の適用に
より制御されている。この戦略は通常有効な制御をもたらすが、また可能な耐性
病原体発生をも随伴し、環境に対する有害な衝撃を伴い得る。さらに、ある種の
作物、例えば大麦および小麦では、化学殺菌剤による病原体の制御は困難または
非実践的である。最近の技術により、分子レベルでの植物およびそれらの病原体
間における相互作用に対する理解が深められ、耐性機構は部分的に解明されてき
た。この分子特性確認の大部分は、モデル植物アラビドプシス（Arabidopsis）
で実施され、耐性機構はまた経済的に重要な作物について解明され始めている。
ウドンコ病は殆どの植物種に影響を及ぼす主な病気であり、広範に研究されてき
た。それらは、植物組織における白色ないし灰色がかった生長を示す点または斑
点を特徴とし、それらは真菌の菌糸体および閉子器に相当する。ウドンコ病は、
エリシファレス（Erysiphales）目に属する幾つかの種類の真菌により誘発され
る。例えば、エリシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）は、穀物およびイ
ネ科植物のウドンコ病を誘発する。ウドンコ病は殆どの作物において制御困難で
あるが、最もよく知られている病原体分離株に耐性を示す大麦系は有効である。
単一座、Ｍｌｏ座における突然変異は、耐性表現型に関与していることが示され
た。ｍｌｏ耐性機構については部分的に解明されている。それは、主としてカロ
ース、加えて炭水化物、フェノールおよびタンパク質を含む、病原体との接触部
位における、パピラと呼ばれる大きな細胞壁付加生長の形成を含む。ｍｌｏ植物
では、細胞壁付加生長が病原体の侵入を阻止するため、耐性が付与される。残念
なことに、ウドンコ病を制御するこの強力な手段は大麦に限定されている。農業
における真菌性疾患、特にウドンコ病により誘発される問題を考察すると、農家
にとって経済的に魅力があり、環境的にも許容し得る他の作物においてこれらの
タイプの病原体を制御する新規で有効な戦略に対する要望は未だ果たされていな
いままである。

【０００３】 （発明の開示） この発明は、遺伝子工学技術の適用による植物での新規疾病制御戦略に対する
要望に関するものである。特に、この発明は、好ましくは経済的に重要な作物に
おけるウドンコ病に対する制御戦略に関するものである。この発明は、Ｍｌｏタ
ンパク質をコードする分離されたＤＮＡ分子に関するものであり、その場合上記
Ｍｌｏタンパク質は植物に真菌病原体に対する耐性を付与する。特に、この発明
は、本発明の発明者らが最初に発見している保存されたアミノ酸配列を含むＭｌ
ｏタンパク質、および上記Ｍｌｏタンパク質をコードする分離されたＤＮＡ分子
に関するものである。この発明はまた、植物において本発明のＤＮＡ分子を発現
させるベクターに関するものである。さらにこの発明は、本発明のＤＮＡ分子の
いずれか１つを含むトランスジェニック植物に関するものである。この発明では
また、本発明ＤＮＡ分子のいずれかの発現により真菌病原体に対して耐性を示す
トランスジェニック植物を含む植物衛生特性が改善された農産物について報告し
ている。さらにこの発明はまた、本発明ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する遺
伝子の内在性コピーによりコードされるタンパク質のトランスジェニック植物に
おける発現を改変するかまたは本発明ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する遺伝
子の内在性コピーによりコードされるタンパク質の活性または安定性を改変する
ことにより、真菌性疾患に対する耐性を植物に付与する方法に関するものである
。上記トランスジェニック植物は、望ましくは生きている表皮植物細胞に感染す
る病原体、さらに望ましくはウドンコ病菌としても知られているエリシファレス
（Erysiphales）目に属する真菌、好ましくはウドンコ病の誘発因子である、エ
リシフェ（Erysiphe）属に属する真菌に耐性を示し、さらに好ましくはこれらの
植物はエリシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）に耐性を示す。この発明
はさらに、本発明ＤＮＡ分子と同じかまたは類似した機能を有するタンパク質を
コードし、本発明で示された保存アミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子の分離方
法について報告している。

【０００４】 すなわち、この発明は、潜在的には作物に適用される化学物質の量を低減化し
、制御因子に耐性がある病原体の出現の危険性を低減化する、経済的に重要な作
物における真菌性疾患を制御するための新規で有効な戦略を提供する。

【０００５】 すなわち、この発明は、真菌病原体に対する耐性を植物に付与するＭｌｏタン
パク質をコードするＤＮＡ分子であって、タンパク質が配列番号１または配列番
号２に示されたアミノ酸配列と同一または実質的に類似した少なくとも１個のア
ミノ酸配列を含み、好ましくはｃＤＮＡ分子であるＤＮＡ分子を提供する。好ま
しい態様において、ＤＮＡ分子は、好ましくは大麦から誘導されるのではなく、
双子葉植物または小麦、トウモロコシ、イネ、オート麦、ライ麦、モロコシ類、
サトウキビ、キビ、マイロおよびヤシ科から成る植物群から誘導される。好まし
い態様において、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号３、配列番号５または配列番
号７に示されたヌクレオチド配列のいずれか１つと同一または実質的に類似して
いるか、または配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されたＭｌｏタン
パク質と同一または実質的に類似したＭｌｏタンパク質をコードする。さらに好
ましい態様において、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示されたヌク
レオチド配列を含むＤＮＡ分子は小麦から誘導される。別の好ましい態様におい
て、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番
号１５または配列番号１７に示されたヌクレオチド配列のいずれか１つと同一ま
たは実質的に類似しているか、または配列番号１０、配列番号１２、配列番号１
４、配列番号１６または配列番号１８に示されたヌクレオチド配列のいずれか１
つによりコードされるＭｌｏタンパク質と同一または実質的に類似したＭｌｏタ
ンパク質をコードする。さらに好ましい態様において、配列番号９、配列番号１
１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７に示されたヌクレオチド配
列を含むＤＮＡ分子は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）か
ら誘導される。別の好ましい態様において、上述されたＤＮＡ分子は、内在性タ
ンパク質の活性が失われるように修飾される。本発明の一実施態様では、上記Ｄ
ＮＡ修飾の結果、対応するタンパク質のアミノ酸配列における次の変化、すなわ
ち −Ｔｒｐ（１６３）からＡｒｇへ、 −Ｐｒｏ（３９６）の後のフレームシフト、 −Ｔｒｐ（１６０）の後のフレームシフト、 −Ｍｅｔ（１）からＩｌｅへ、 −Ｇｌｙ（２２７）からＡｓｐへ、 −Ｍｅｔ（１）からＶａｌへ、 −Ａｒｇ（１１）からＴｒｐへ、 −Ｐｈｅ（１８３）、Ｔｈｒ（１８４）欠落、 −Ｖａｌ（３１）からＧｌｕへ −Ｓｅｒ（３２）からＰｈｅへ −Ｌｅｕ（２７１）からＨｉｓへ といった変化の１つ、全部または組み合わせがもたらされる。

【０００６】 さらに好ましい態様において、真菌病原体は、望ましくは生きている表皮細胞
に感染し、さらに望ましくは、真菌病原体は、ウドンコ病菌としても知られてい
るエリシファレス（Erysiphales）目から、好ましくはエリシフェ（Erysiphe）
属に属し、さらに好ましくは、真菌病原体はエリシフェ・グラミニス（Erysiphe
graminis）である。

【０００７】 別の態様において、分離されたＤＮＡ分子は、上記の分離された分子に対して
アンチセンス、例えば配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列と同
一または実質的に類似した少なくとも１つのアミノ酸配列を含むＭｌｏタンパク
質をコードするＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ分子に対してアンチセンス、特に配
列番号３、５、７、９、１１、１３、１５または１７に示されたＤＮＡ分子と同
一または実質的に類似しており、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６
または１８に示されたＭｌｏタンパク質と同一または実質的に類似したＭｌｏタ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子に対してアンチセンスである。

【０００８】 さらに本発明は、配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列と同一
または実質的に類似した少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質であっ
て、Ｍｌｏタンパク質であり、真菌病原体に対する耐性を植物に付与するタンパ
ク質を提供する。このタンパク質は、好ましくは大麦から誘導されるのではなく
、双子葉植物または小麦、トウモロコシ、イネ、オート麦、ライ麦、モロコシ類
、サトウキビ、キビ、マイロおよびヤシ科から成る植物群から誘導される。好ま
しい態様では、本発明タンパク質は、配列番号３、配列番号５または配列番号７
に示されたヌクレオチド配列のいずれか１つと同一または実質的に類似したヌク
レオチド配列によりコードされるか、または配列番号４、配列番号６または配列
番号８に示されたＭｌｏタンパク質のいずれか１つと同一または実質的に類似し
ている。さらに好ましい態様において、タンパク質は小麦から誘導される。別の
好ましい態様において、本発明タンパク質は、配列番号９、配列番号１１、配列
番号１３、配列番号１５または配列番号１７に示されたヌクレオチド配列のいず
れか１つと同一または実質的に類似したヌクレオチド配列によりコードされるか
、または配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列
番号１８に示されたＭｌｏタンパク質のいずれか１つと同一または実質的に類似
している。さらに好ましい態様において、タンパク質はアラビドプシス・タリア
ナ（A.thaliana）から誘導される。別の好ましい態様において、真菌病原体は、
望ましくは生きている表皮細胞に感染し、さらに望ましくは、真菌病原体は、ウ
ドンコ病菌としても知られているエリシファレス（Erysiphales）目から、好ま
しくはエリシフェ（Erysiphe）属から誘導され、さらに好ましくは真菌病原体は
エリシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）である。別の態様において、本
発明はまた、上記ＤＮＡ分子のいずれかによりコードされるタンパク質の突然変
異形態または先端切除形態を包含する。

【０００９】 さらに本発明は、上記ＤＮＡ分子のいずれか１つ、例えば上記ｃＤＮＡを含む
発現カセットを提供し、ここでＤＮＡ分子は、植物においてＤＮＡ分子を発現し
得るプロモーターおよび終止シグナルに機能し得るように結合されている。好ま
しい態様において、発現カセットは異種である。別の好ましい態様において、プ
ロモーターおよび終止シグナルは真核生物性である。さらに別の好ましい態様に
おいて、プロモーターおよび終止シグナルはコーディング領域に関して異種であ
る。

【００１０】 さらに本発明は、上記発現カセットのいずれか１つを含むベクターを提供する
。好ましい態様において、ベクターは、植物における発現カセットの形質転換に
使用される。別の好ましい態様において、この発明のベクターは上記ＤＮＡ分子
のいずれか１つの増幅に使用される。

【００１１】 さらに本発明は、分離された本発明ＤＮＡ分子を含む発現カセットまたはそれ
の一部を含む細胞を提供し、この場合発現カセット中のＤＮＡ分子は上記細胞に
おいて発現可能である。好ましい態様において、ＤＮＡ分子は大麦からは誘導さ
れない。別の好ましい態様において、細胞は植物細胞である。さらに別の好まし
い態様において、発現カセットは細胞のゲノムに安定して組込まれているかまた
は自己複製ベクターに封入されており、染色体外分子として細胞中に残存してい
る。

【００１２】 さらに本発明は、分離された本発明ＤＮＡ分子を含む発現カセットまたはそれ
の一部を含む植物を提供する。好ましい態様において、ＤＮＡ分子は大麦からは
誘導されない。別の好ましい態様において、発現カセット中に含まれるＤＮＡ分
子は植物において発現可能である。別の好ましい態様において、ＤＮＡ分子は、
植物ゲノムに安定して組込まれるかまたは自己複製ベクター中に封入されており
、染色体外分子として細胞中に残存する。別の好ましい態様において、植物は真
菌病原体、望ましくは生きている表皮細胞に感染する真菌病原体に耐性を示し、
さらに望ましくは真菌病原体は、ウドンコ病菌としても知られている、エリシフ
ァレス（Erysiphales）目から、好ましくはエリシフェ（Erysiphe）属から誘導
され、さらに好ましくは真菌病原体はエリシフェ・グラミニス（Erysiphe grami
nis）である。本発明はまた、かかる植物の種子であって、所望により処理（例
、プライミングまたはコーティング）され、および／またはパッケージ化、例え
ば使用説明書を伴った袋に入れられていてもよい種子に関するものである。

【００１３】 さらに本発明は、分離された本発明ＤＮＡ分子を含む植物を含む農産物を提供
する。好ましい態様において、農産物は例えば飼料、食料またはサイレージとし
て使用され、真菌病原体により生産されるマイコトキシン、例えばアフラトキシ
ンを含むことはない。従って、農産物は改善された植物衛生特性を有する。

【００１４】 さらに本発明は、真菌病原体に対して植物を耐性にする方法であって、 ａ）「センス」配向で上記ＤＮＡ分子のいずれか１つによりコードされるＲＮ
Ａ転写物を植物において発現させるか、または ｂ）「アンチセンス」配向で上記ＤＮＡ分子のいずれか１つによりコードされ
るＲＮＡ転写物を植物において発現させるか、または ｃ）上記ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する内在性遺伝子によりコードされ
るメッセンジャーＲＮＡ転写物を特異的に開裂し得るリボザイムを植物において
発現させるか、または ｄ）上記ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する遺伝子によりコードされる内在
性タンパク質へ特異的に指向されたアプタマーを植物において発現させるか、ま
たは ｅ）上記ＤＮＡ分子のいずれか１つの突然変異または先端切除形態を、それが
優性で負の突然変異体として作用し得るように、植物において発現させるか、ま
たは ｆ）上記ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する遺伝子の少なくとも１つの染色
体コピーを植物における相同的組換えにより修飾するか、または ｇ）上記ＤＮＡ分子のいずれか１つに対応する遺伝子の調節エレメントの少な
くとも１つの染色体コピーを植物における相同的組換えにより修飾する 段階を含む方法を提供する。

【００１５】 さらにこの発明は、かかる植物の種子であって、所望により処理（例、プライ
ミングまたはコーティング）および／またはパッケージされている、例えば使用
説明書を伴った袋に入れられていてもよい種子を含む上記方法のいずれか１つに
より得られる植物を提供する。別の好ましい態様において、得られる植物は真菌
病原体、望ましくは生きている表皮細胞に感染する真菌病原体に耐性を示し、さ
らに望ましくは真菌病原体は、ウドンコ病菌としても知られている、エリシファ
レス（Erysiphales）目から、好ましくはエリシフェ（Erysiphe）属から誘導さ
れ、さらに好ましくは真菌病原体はエリシフェ・グラミニス（Erysiphe gramini
s）である。

【００１６】 さらのこの発明は、上記方法のいずれか１つにより得られる植物衛生特性が改
善された農産物を提供する。

【００１７】 さらに本発明は、Ｍｌｏタンパク質をコードするＤＮＡ分子の分離方法であっ
て、 ａ）配列番号１の少なくとも６個のアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオ
チドおよび配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸をコードする配列に相補的な
縮重オリゴヌクレオチドを、上記ＤＮＡと上記縮重オリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションを可能にする条件下で植物から抽出されたＤＮＡと混合し、
そして ｂ）植物ＤＮＡのＤＮＡフラグメントであって、段階ａ）における縮重オリゴ
ヌクレオチドにアニーリングし得るヌクレオチド配列をその左および右端に含む
ＤＮＡフラグメントを増幅し、そして ｃ）段階ｂ）のＤＮＡフラグメントを含む完全長ｃＤＮＡクローンを得る 段階を含む方法を提供する。

【００１８】 さらに本発明は、「インビトロ組換え」または「ＤＮＡシャフリング」による
本発明ヌクレオチド配列の突然変異コピーの製造方法を提供する。本発明ヌクレ
オチド配列の突然変異コピーを用いることにより、真菌病原体に対して改善され
た耐性が付与される。好ましい態様において、本発明ヌクレオチド配列の突然変
異コピーを用いると、さらに広範囲の病原体に対する耐性が付与される。上記の
一方法は、次の通り、すなわち

【００１９】 本発明によるＤＮＡ分子の突然変異誘発方法であって、ＤＮＡ分子が所望のサ
イズの２本鎖ランダムフラグメントに開裂されており、 ａ）生成された２本鎖ランダムフラグメントの集団に、２本鎖鋳型ポリヌクレ
オチドとの同一性を有する領域およびそれとの非相同性を有する領域を含むオリ
ゴヌクレオチドである、１つまたはそれ以上の１本または２本鎖オリゴヌクレオ
チドを付加し、 ｂ）生成した２本鎖ランダムフラグメントおよびオリゴヌクレオチドから成る
混合物を１本鎖フラグメントに変性させ、 ｃ）生成した１本鎖フラグメントの集団とポリメラーゼを、１本鎖フラグメン
トの同一性領域であって、対の一員が他方の複製をプライミングするのに十分で
ある同一性領域におけるアニーリングを誘導することにより、アニーリングされ
たフラグメントの対が形成される条件下でインキュベーションすることにより、
突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドが形成され、そして ｄ）さらに少なくとも２周期について第２および第３段階を反復し、この場合
、さらなる周期の第２段階において生成した混合物がその前周期の第３段階から
の突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドを含み、さらなる周期がさらに突然変異
誘発２本鎖ポリヌクレオチドを形成する、 段階を含む方法を提供する。

【００２０】 （定義） 「分離されたＤＮＡ分子」は、人間の手によってその自然環境から離れて存在
しているため、自然の産物ではないヌクレオチド配列である。分離されたヌクレ
オチド配列は、精製形態で存在し得るかまたは非自然環境で、例えばトランスジ
ェニック宿主細胞において存在し得る。

【００２１】 ここで定義されている「タンパク質」は、対応するヌクレオチド配列によりコ
ードされる全タンパク質であるか、またはヌクレオチド配列の対応する部分によ
りコードされるタンパク質の一部である。

【００２２】 「分離されたタンパク質」とは、分離されたヌクレオチド配列によりコードさ
れるタンパク質であるため、自然の産物ではない。分離されたタンパク質は、精
製形態で存在し得るかまたは非自然環境、例えばトランスジェニック宿主細胞で
存在し得、この場合タンパク質は、正常には発現されないかまたは同質遺伝子の
非トランスジェニック宿主細胞において異なる形態または異なる量で発現される
。

【００２３】 「真菌病原体に対する耐性」植物は、真菌病原体の植物における生長能力を阻
害または制限することによって、真菌により誘発される真菌感染症の徴候を全く
または殆ど示さない。その結果、植物の生長が改善されると、収率は高くなり、
種子も多く生産される。

【００２４】 「真菌病原体に対して植物に耐性を付与するタンパク質」とは、タンパク質が
真菌病原体に対する植物の耐性に関与する植物遺伝子経路の調節に係わっている
ことを意味する。このタンパク質は、それが真菌病原体に対する植物の耐性を高
めるという点で正の調節因子であり得るか、またはこのタンパク質は、それが真
菌病原体に対する植物の耐性を抑制するという点で負の調節因子であり得る。真
菌病原体に対して植物に耐性を付与するタンパク質の一特定例は、Ｍｌｏタンパ
ク質である。

【００２５】 ここで「Ｍｌｏタンパク質」は、疾病耐性経路において実質的に類似した機能
を有し、幾つかの構造相同性を共有する一群のタンパク質（Ｍｌｏファミリー）
の一員を意味する。構造相同性は、例えばこの群の構成員が少なくとも１つの保
存領域を共有することであり得る。

【００２６】 最も広い意味において、「実質的に類似した」という語が、ここでヌクレオチ
ド配列に関して使用されているとき、それはレファレンスヌクレオチド配列に対
応するヌクレオチド配列を意味し、その場合対応する配列は、レファレンスヌク
レオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同じ構造および機能を
有するポリペプチドをコードし、例えばその場合ポリペプチド機能に影響を及ぼ
すことのないアミノ酸の変化が見られるに過ぎない。望ましくは、実質的に類似
したヌクレオチド配列は、レファレンスヌクレオチド配列によりコードされるポ
リペプチドをコードする。実質的に類似したヌクレオチド配列およびレファレン
スヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージは、望ましくは少なくとも８０％
、さらに望ましくは８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少
なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。

【００２７】 「実質的に類似した」という語が、ここでタンパク質に関して使用されている
場合、それはレファレンスタンパク質に対応するタンパク質を意味し、その場合
タンパク質はレファレンスタンパク質と実質的に同じ構造および機能を有してお
り、例えばその場合ポリペプチド機能に影響を及ぼすことの無いアミノ酸の変化
が見られるに過ぎない。タンパク質またはアミノ酸配列に使用されているとき、
実質的に類似したタンパク質またはアミノ酸配列およびレファレンスタンパク質
またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、望ましくは少なくとも８０％
、さらに望ましくは８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少
なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％である。配列同一性のパー
センテージは、ダイナミックプログラミングアルゴリズムに基いたコンピュータ
ープログラムを用いて測定される。本発明の範囲内で好ましいコンピュータープ
ログラムには、質問がタンパク質であるのかＤＮＡであるのかとは関係無く利用
可能な配列データベース全てを調べるために設計されたＢＬＡＳＴ（ベーシック
・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール）探索プログラムがある。この探
索ツールのバージョンＢＬＡＳＴ２.０（ギャップＢＬＡＳＴ）は、既にインタ
ーネットで公開され利用できる（現在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。
それは、大域的アラインメント（平行整列）とは反対に局所的なものを求める発
見的アルゴリズムを使用しているため、単離領域のみを共有する配列間の関係を
検出できる。ＢＬＡＳＴ探索で入れられたスコアは明確な統計的解釈を有する。
上記プログラムは、好ましくはデフォルト値にセットされた所望のパラメーター
により実行される。

【００２８】 「遺伝子」の語は、コーディング配列および随伴された調節配列を指し、コー
ディング配列は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、
センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに転写される。調節配列の例は、プロモ
ーター配列、５'および３'非翻訳配列および終止配列である。存在し得るさらに
別のエレメントは、例えばイントロンである。

【００２９】 「発現」は、植物における内在性遺伝子または導入遺伝子の転写および／また
は翻訳を指す。例えば、アンチセンス構築物の場合、発現はアンチセンスＤＮＡ
の転写のみを指し得る。

【００３０】 ここで使用されている「発現カセット」は、適当な宿主細胞における特定ヌク
レオチド配列の発現を指令し得るＤＮＡ配列を意味し、終止シグナルに機能し得
るように結合されている興味の対象であるヌクレオチド配列に機能し得るように
結合されたプロモーターを含む。それはまた、典型的にはヌクレオチド配列の適
切な翻訳に要求される配列を含む。コーディング領域は、通常興味の対象である
タンパク質をコードするが、また興味の対象である機能的ＲＮＡ、例えばアンチ
センスＲＮＡまたはセンスもしくはアンチセンス方向で特定遺伝子、例えばアン
チセンスＲＮＡの発現を阻害する非翻訳ＲＮＡについてもコードし得る。興味の
対象であるヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得ることから、
その成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに関して異種である
ことを意味する。発現カセットはまた、天然に存在しているが、異種発現に有用
な組換え形態で得られたものであり得る。しかしながら、典型的には、発現カセ
ットは宿主に関して異種であり、すなわち、発現カセットの特定ＤＮＡ配列は、
宿主細胞に天然には存在せず、形質転換事象により宿主細胞または宿主細胞の祖
先へ導入されたものでなければならない。発現カセットにおけるヌクレオチド配
列の発現は、宿主細胞が何らかの特定外部刺激因子に暴露されたときのみ転写を
開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。多
細胞生物、例えば植物の場合、プロモーターはまた特定組織または器官または発
達段階に特異的であり得る。

【００３１】 ここで使用されている「異種（の）」は、「異なる自然または合成起源のもの
である」ことを意味するかまたは非自然状態を表わす。例えば、宿主細胞が別の
生物から、特に別の種から誘導された核酸配列により形質転換されている場合、
その遺伝子はその宿主細胞およびまたその遺伝子を担う宿主細胞の子孫に関して
異種である。形質転換核酸は、異種プロモーター、異種コーディング配列または
異種終止配列を含み得る。別法として、形質転換核酸は完全に異種であり得るか
または異種および内在性核酸配列の何らかの可能な組み合わせを含み得る。同様
に、異種とは、同じ自然の原細胞型から誘導され、挿入されたヌクレオチド配列
であるが、非自然状態、例えば異なるコピー数または異なる調節エレメントの制
御下で存在する場合を指す。

【００３２】 「プロモーター」の語は、随伴されたＤＮＡ配列の転写を開始するＤＮＡ配列
を指す。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の調節因子として作用する成分、
例えば活性化因子、エンハンサーおよび／またはリプレッサーを含み得る。

【００３３】 ここで使用されている「合成ヌクレオチド配列」は、天然配列には存在しない
構造特性を含むヌクレオチド配列を意味する。例えば、双子葉植物および／また
は単子葉植物の遺伝子のＧ＋Ｃ含量および正常コドン分布により緊密に類似して
いる人工配列が合成であると言われる。

【００３４】 調節ＤＮＡ配列がコーディングＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼすように２つの
配列が位置する場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードする
ＤＮＡ配列に「機能し得るように結合され」または「随伴され」ていると言われ
る。

【００３５】 「調節エレメント」は、ヌクレオチド配列の発現をもたらすのに関与する配列
を指す。調節エレメントは、興味の対象であるヌクレオチド配列に機能し得るよ
うに結合されたプロモーターおよび終止シグナルを含む。それらはまた、一般的
にはヌクレオチド配列の適切な翻訳に要求される配列を包含する。

【００３６】 「植物」は、あらゆる発達段階における植物または植物の一部および特に種子
植物を全て包含する。またそこには、切削物、細胞または組織培養物および種子
も含まれる。本発明と連係的に使用されている「植物組織」の語は、総体植物、
植物器官、植物種子、プロトプラスト、カルス、細胞培養物、および構造的およ
び／または機能的単位に組織化された植物細胞から成る群を包含するが、これら
に限定はされない。

【００３７】 「植物細胞」は、原形質体および細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的
単位を指す。植物細胞は、単離された単細胞または培養細胞形態、または高度に
組織化された単位の一部、例えば植物組織または植物器官であり得る。

【００３８】 ここで使用されている「形質転換」は、細胞への核酸の導入を意味する。特に
、興味の対象である生物体のゲノムへのＤＮＡ分子の安定した組込みが含まれる
。

【００３９】 「選択可能マーカー」は、植物細胞で発現されると細胞に選択的利点を与える
遺伝子により付与される。選択可能マーカー遺伝子により形質転換された細胞が
有する選択的利点は、非形質転換細胞の生長と比べて、負の選択剤、例えば抗生
物質または除草剤の存在下でそれらが生長できるためであり得る。非形質転換細
胞と比べて、形質転換細胞が有する選択的利点はまた、それらの増強されたかま
たは新規な受容能により栄養素、成長因子またはエネルギー供給源として加えら
れた化合物を利用できるためであり得る。選択可能マーカー遺伝子はまた、植物
細胞で発現されると負および正の選択的両利点を細胞に与える遺伝子または遺伝
子の組み合わせを包含する。

【００４０】 「スクリーン可能マーカー」は、発現されても形質転換細胞に対して選択的利
点を与えないが、発現されると形質転換細胞を非形質転換細胞とは表現型の異な
るものにする遺伝子により付与される。

【００４１】 配列リストにおける配列の簡単な説明 配列番号１ 保存アミノ酸配列１ 配列番号２ 保存アミノ酸配列２ 配列番号３ 小麦Ｍｌｏタンパク質ＴｒＭｌｏ１のヌクレオチド配列 配列番号４ ＴｒＭｌｏ１のタンパク質配列 配列番号５ 小麦Ｍｌｏタンパク質ＴｒＭｌｏ２のヌクレオチド配列 配列番号６ ＴｒＭｌｏ２のタンパク質配列 配列番号７ 小麦Ｍｌｏタンパク質ＴｒＭｌｏ３のヌクレオチド配列 配列番号８ ＴｒＭｌｏ３のタンパク質配列 配列番号９ アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質ＣＩＢ１０２
５９のヌクレオチド配列 配列番号１０ ＣＩＢ１０２５９のタンパク質配列 配列番号１１ アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質ＣＩＢ１０
２９５のヌクレオチド配列 配列番号１２ ＣＩＢ１０２９５のタンパク質配列 配列番号１３ アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質ＣＩＢ１０
２９６のヌクレオチド配列 配列番号１４ ＣＩＢ１０２９６のタンパク質配列 配列番号１５ アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質Ｆ１９８５
０のヌクレオチド配列 配列番号１６ Ｆ１９８５０のタンパク質配列 配列番号１７ アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質Ｕ９５９７
３のヌクレオチド配列 配列番号１８ Ｕ９５９７３のタンパク質配列 配列番号１９ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−１ 配列番号２０ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−３ 配列番号２１ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−５

【００４２】 配列番号２２ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−７ 配列番号２３ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−１０ 配列番号２４ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−１５ 配列番号２５ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−２６ 配列番号２６ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−ＧＳＰ１ 配列番号２７ オリゴヌクレオチドＭＬＯ−ＧＳＰ２ 配列番号２８ オリゴヌクレオチドＳＴ２７ 配列番号２９ オリゴヌクレオチドＮ３７５４４−１ 配列番号３０ オリゴヌクレオチドＮ３７５４４−２ 配列番号３１ オリゴヌクレオチドＴ２２１４６−１ 配列番号３２ オリゴヌクレオチドＴ２２１４６−２ 配列番号３３ オリゴヌクレオチドＨ７６０４１−１ 配列番号３４ オリゴヌクレオチドＨ７６０４１−２ 配列番号３５ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−１ 配列番号３６ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−２ 配列番号３７ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−３ 配列番号３８ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−４ 配列番号３９ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−５ 配列番号４０ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−６ 配列番号４１ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−７ 配列番号４２ オリゴヌクレオチドＳＡＳ−８

【００４３】 寄託物

【表１】 寄託物はすべて、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター（１８１５ノ
ーザン・ユニバーシティー・ストリート、ペオリア、イリノイ６１６０４、アメ
リカ合衆国）により行われた。

【００４４】 この発明は、真菌病原体に対する耐性を植物に付与する、Ｍｌｏタンパク質を
コードするＤＮＡ分子に関するものである。この発明の発明者らは、最初にＭｌ
ｏタンパク質間から保存アミノ酸配列を同定している。この発明の保存アミノ酸
配列は、小麦から誘導された３種のＭｌｏタンパク質およびアラビドプシス・タ
リアナ（A.thaliana）から誘導された３種のＭｌｏタンパク質間で保存されてい
る。これらのアミノ酸配列はまた、２種の予測されたアラビドプシス（Arabidop
sis）Ｍｌｏタンパク質においても保存されている。配列番号１に示された第１
の保存アミノ酸は、１３個のアミノ酸を含む。配列番号１における第４アミノ酸
は、Ｌ、ＶまたはＩであり、その第５アミノ酸はＶまたはＬであり、その第７ア
ミノ酸はＦまたはＬである。配列番号１における第１３アミノ酸はＩではなく、
好ましくはＴ、ＳまたはＡである。配列番号２に示された第２の保存アミノ酸配
列は、１４個のアミノ酸を含む。配列番号２における第１アミノ酸はＭではなく
、好ましくはＩ、Ｖ、ＳまたはＧである。その第３アミノ酸はＦ、ＬまたはＶで
あり、その第６アミノ酸はＹまたはＮであり、その第７アミノ酸はＡまたはＶで
あり、その第８アミノ酸はＬまたはＩであり、その第１０アミノ酸はＴまたはＳ
である。本発明は、上記保存アミノ酸配列の少なくとも１つを含む分離されたＭ
ｌｏタンパク質および上記Ｍｌｏタンパク質をコードする分離されたＤＮＡ分子
を包含する。本発明はまた、配列番号１および配列番号２に示された両保存配列
を含む分離されたＭｌｏタンパク質を包含する。好ましい態様において、この発
明のＭｌｏタンパク質をコードする分離されたＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡ分子であ
る。

【００４５】 さらに別の態様において、保存アミノ酸配列の少なくとも１つを含むＭｌｏタ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子は大麦からは誘導されない。別の態様において
、上記ＤＮＡ分子は、双子葉植物または小麦、トウモロコシ、イネ、オート麦、
ライ麦、モロコシ、トウキビ、キビ、マイロまたはヤシ科から誘導される。好ま
しい態様において、この発明のＤＮＡ分子は、配列番号３、５または７および配
列番号９、１１、１３、１５または１７に示されたＤＮＡ分子と同一または実質
的に類似しているかまたはＭｌｏタンパク質をコードし、これは配列番号４、６
または８または配列番号１０、１２、１４、１６、１８に示されたＭｌｏタンパ
ク質のいずれか１つと同一または実質的に類似している。配列番号３、５または
７に示されたＤＮＡ分子は小麦から誘導され、それぞれ配列番号４、６または８
に示されたＭｌｏタンパク質をコードする。上記ＤＮＡ分子の分離については実
施例１でさらに説明されている。配列番号９、１１、１３、１５または１７に示
されたＤＮＡ分子は、アラビドプシス（Arabidopsis）から誘導され、それぞれ
配列番号１０、１２、１４、１６または１８に示されたＭｌｏタンパク質をコー
ドする。上記ＤＮＡ分子の分離については、実施例２でさらに説明されている。
ＴｒＭｌｏ１と呼ばれる小麦Ｍｌｏタンパク質をコードする配列番号３のＤＮＡ
分子は、それぞれＮＲＲＬ Ｂ−２１９４８およびＮＲＲＬ Ｂ−２１９４９の受
入れ番号でＴｒＭｌｏ１およびＴｒＭｌｏ１−５株として寄託されている。Ｔｒ
Ｍｌｏ２と呼ばれる小麦Ｍｌｏタンパク質をコードする配列番号５のＤＮＡ分子
は、それぞれＮＲＲＬ Ｂ−２１９５０およびＮＲＲＬ Ｂ−２１９５１の受入れ
番号でＴｒＭｌｏ２およびＴｒＭｌｏ２−５株として寄託されている。ＴｒＭｌ
ｏ３と呼ばれる小麦Ｍｌｏタンパク質をコードする配列番号７のＤＮＡ分子は、
それぞれＮＲＲＬ Ｂ−２１９５２およびＮＲＲＬ Ｂ−２１９５３の受入れ番号
でＴｒＭｌｏ３およびＴｒＭｌｏ３−５株として寄託されている。ＴｒＭｌｏ１
およびＴｒＭｌｏ３は、対応するＭｌｏ遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含み、また対
応する５'および３'非翻訳領域の幾つかを含む。ＴｒＭｌｏ２は、回収された対
応する遺伝子の最長ｃＤＮＡクローンである。ＴｒＭｌｏ１およびＴｒＭｌｏ３
との比較から推論すると、それは全コーディング領域を含むが、ただし第１メチ
オニン（開始コドン）は除く。ＴｒＭｌｏ２はまた、対応する遺伝子の３'非翻
訳領域の幾つかを含む。

【００４６】 ＣＩＢ１０２５９と呼ばれるアラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク
質をコードする配列番号９のＤＮＡ分子は、ＮＲＲＬ Ｂ−２１９４５の受入れ
番号でｐＣＩＢ１０２５９株として寄託されている。ＣＩＢ１０２９５と呼ばれ
るアラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質をコードする配列番号１１
のＤＮＡ分子は、ＮＲＲＬ Ｂ−２１９４６の受入れ番号でｐＣＩＢ１０２９５
株として寄託されている。ＣＩＢ１０２９６と呼ばれるアラビドプシス（Arabid
opsis）Ｍｌｏタンパク質をコードする配列番号１３のＤＮＡ分子は、ＮＲＲＬ
Ｂ−２１９４７の受入れ番号でｐＣＩＢ１０２９株として寄託されている。ＣＩ
Ｂ１０２５９、ＣＩＢ１０２９５およびＣＩＢ１０２９６は、対応するＭｌｏ遺
伝子の完全長ｃＤＮＡを含み、また対応する５'および３'非翻訳領域の幾つかを
含む。アラビドプシス（Arabidopsis）Ｍｌｏタンパク質ファミリーの一員であ
るＦ１９８５０およびＵ９５９７３をコードするヌクレオチド配列は、ジーンバ
ンクから入手される。しかしながら、両クローンとも、推定されるアミノ酸配列
を決定しても、ジーンバンクのエントリーにおいて推定されるアミノ酸配列とは
適合しないことがわかる。従って、本発明の発明者らにより決定されたＭｌｏタ
ンパク質は新規であって、明らかにはされていない。新たに予測された両タンパ
ク質は、配列番号１および２に示された保存アミノ酸配列を含むため、それらを
コードする分離ｃＤＮＡと同様本発明に包含される。

【００４７】 本発明のＤＮＡ分子によりコードされるＭｌｏタンパク質は、真菌病原体、望
ましくは生きている表皮植物細胞に感染する真菌病原体、さらに望ましくはウド
ンコ病菌としても知られているエリシファレス（Erysiphales）目からの真菌病
原体に対する耐性を植物に付与する（Agrios G.（１９８８）Plant Pathology、
第３版、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、特に２７１頁）。好ま
しくは、本発明のＤＮＡ分子によりコードされるＭｌｏタンパク質は、エリシフ
ェ（Erysiphe）属に対する耐性を植物に付与し、さらに好ましくは真菌病原体エ
リシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）である。

【００４８】 本発明はまた、この発明のＤＮＡ分子のいずれか１つを含む組換えベクターを
包含する。これらのベクターにおいて、上記ＤＮＡ分子は、好ましくは上記ＤＮ
Ａ分子を発現し得る宿主細胞においてＤＮＡ分子を発現させるための調節エレメ
ントを含む発現カセットに含まれる。上記調節エレメントは、通常プロモーター
および終止シグナルであり、好ましくはまた本発明ＤＮＡ分子によりコードされ
るタンパク質の有効な翻訳を可能にするエレメントを含む。好ましい態様では、
発現カセットは異種である。上記ベクターは、この発明のＤＮＡ分子のいずれか
１つを含む発現カセットの宿主細胞への形質転換に使用される。好ましい態様に
おいて、発現カセットは上記宿主細胞のＤＮＡへ安定して組込まれる。別の好ま
しい態様では、発現カセットはベクターに含まれ、これは宿主細胞において複製
し得、染色体外分子として宿主細胞に残存する。さらに好ましい態様では、上記
染色体外複製分子は、宿主細胞におけるこの発明のＤＮＡ分子の増幅に使用され
る。好ましい態様において、上記宿主細胞は微生物、例えば細菌、特にエシェリ
キア・コリ（E.coli）である。別の好ましい態様において、宿主細胞は真核生物
細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である。

【００４９】 別の態様において、本発明ＤＮＡ分子は、インビトロ組換えまたはＤＮＡシャ
ッフリングとして知られている技術においてランダム突然変異の組込みにより修
飾される。この技術については、Stemmerら、Nature ３７０：３８９−３９１（
１９９４）および米国特許５６０５７９３に記載されており、これらを引用して
説明の一部とする。何百万のヌクレオチド配列の突然変異コピーが、ここに記載
された元のヌクレオチド配列に基いて製造され、改善された特性、例えば真菌病
原体に対して増強された耐性またはさらに広範囲の病原体に対する耐性を有する
変異型が回収される。この方法では、この発明のヌクレオチド配列を含む２本鎖
ポリヌクレオチドの鋳型から突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドが形成され、
その場合、鋳型の２本鎖ポリヌクレオチドは、所望のサイズの２本鎖ランダムフ
ラグメントに開裂されており、そして生成した２本鎖ランダムフラグメントの集
団に１つまたはそれ以上の１本または２本鎖オリゴヌクレオチドを加え（ただし
、これらのオリゴヌクレオチドは、２本鎖鋳型ポリヌクレオチドとの同一性領域
および非相同性領域を含む）、生成した２本鎖ランダムフラグメントおよびオリ
ゴヌクレオチドから成る混合物を１本鎖フラグメントに変性させ、上記１本鎖フ
ラグメントをその同一性領域でアニーリングすることによりアニーリングされた
フラグメントの対を形成させる条件下（ただし、上記同一性領域は対の一員が他
方の複製をプライミングするのに十分なものである）、生成した１本鎖フラグメ
ントの集団をポリメラーゼとインキュベーションすることにより、突然変異誘発
２本鎖ポリヌクレオチドを形成し、少なくともさらに２周期について第２および
第３段階を反復し、その場合さらなる周期の第２段階で生成した混合物は前周期
の第３段階からの突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドを含んでいるものとし、
そしてさらなる周期によりさらに別の突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドが形
成される段階が含まれる。好ましい態様において、２本鎖ランダムフラグメント
の集団における単一種の２本鎖ランダムフラグメントの濃度は、総ＤＮＡの１重
量％未満である。さらに好ましい態様において、鋳型の２本鎖ポリヌクレオチド
は少なくとも約１００種のポリヌクレオチドを含む。別の態様において、２本鎖
ランダムフラグメントのサイズは約５ｂｐ〜５ｋｂである。さらに別の態様にお
いて、この方法の第４段階では、少なくとも１０周期について第２および第３段
階を反復する。

【００５０】 この発明はまた本発明ＤＮＡ分子を含む細胞を包含しており、その場合ＤＮＡ
分子はその自然細胞環境中にはない。好ましい態様において、上記細胞は植物細
胞である。別の好ましい態様において、本発明ＤＮＡ分子は上記細胞において発
現可能であり、上記細胞でそれらを発現させ得る発現カセットに含まれる。好ま
しい態様において、発現カセットは上記宿主細胞のＤＮＡへ安定して組込まれる
。別の好ましい態様において、発現カセットはベクターに含まれ、細胞で複製し
得、染色体外分子として細胞中に残存している。

【００５１】 本発明はまた、上記植物細胞を含む植物を包含する。別の態様において、本発
明ＤＮＡ分子は植物において発現し得、トランスジェニック植物における本発明
のＤＮＡ分子のいずれか１つまたはその一部分の発現により、真菌病原体に対し
てトランスジェニック植物に耐性が付与される。好ましい態様において、真菌病
原体は、望ましくは生きている表皮細胞に感染し、さらに望ましくは、真菌病原
体は、ウドンコ病菌として知られているエリシファレス（Erysiphales）目から
、好ましくはエリシフェ（Erysiphe）属に由来し、さらに好ましくは真菌病原体
はエリシフェ・グラミニス(Erysiphe graminis)である。従って、本発明はまた
、本発明ＤＮＡ分子のいずれか１つまたはその一部の発現により真菌病原体に対
して耐性にされたトランスジェニック植物を包含する。

【００５２】 本発明に従い形質転換された植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得、
トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、エンドウ、チコリー、レ
タス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレン
ソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、コショウ、セロリ、カボチャ、ペポ
カボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サ
クランボ、モモ、ズバイモモ、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブ
ラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、ト
マト、モロコシ、スイートコーン、テンサイ、ヒマワリ、菜種、クローバー、タ
バコ、ニンジン、綿、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリ、ア
ラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、および木本植物、例えば針
葉樹および広葉樹を包含し、特にトウモロコシ、小麦またはテンサイを含むが、
これらに限定されるわけではない。

【００５３】 一旦所望のヌクレオチド配列が特定植物種に形質転換されると、それは、伝統
的な品種改良技術を用いて、その種で増殖されるかまたは同種の他の品種、特に
商業的品種に移され得る。トランスジェニック植物でそれらを発現させる場合、
ＤＮＡ分子は修飾および最適化を必要とし得る。生物体には全てコドン使用につ
いて特異的な優先性があることは当業界では公知であり、本発明のＤＮＡ分子に
含まれるヌクレオチド配列におけるコドンを変えることにより、それによってコ
ードされるアミノ酸を維持しながら、特異的な植物優先性に適合させることがで
きる。さらに、植物における高度発現は、ＧＣ含量が少なくとも３５％、好まし
くは４５％より大であるコーディング配列から最もよく達成される。ＧＣ含量が
低いヌクレオチド配列は、メッセージを不安定にし得るＡＴＴＴＡモチーフ、お
よび不適当なポリアデニル化を誘発し得るＡＡＴＡＡＡモチーフが存在するため
あまり発現し得ない。好ましい遺伝子配列は単子葉および双子葉植物の両種で十
分に発現され得るが、単子葉植物または双子葉植物の優先性は異なることが示さ
れたため、配列に修飾を加えることにより、これらの特異的コドン優先性および
ＧＣ含量優先性が説明され得る（Murrayら、Nucl. Acid Res.１７：４７７−４
９８（１９８９））。さらに、ヌクレオチド配列は、メッセージ先端切除を誘発
する非正統的スプライス部位の存在についてスクリーニングされる。ヌクレオチ
ド配列、例えば上記配列内で為される必要がある変化は全て、公開された特許出
願ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０３５９４７２およびＷＯ９３／０７２７８に記載
された方法を用いて位置指定突然変異導入法、ＰＣＲおよび合成遺伝子構築の公
知技術を用いて行われる。

【００５４】 有効な翻訳開始のために、開始メチオニンに隣接する配列は修飾を必要とし得
る。例えば、それらは植物において有効であることが知られている配列を包含さ
せることにより修飾され得る。ジョシは植物に適した共通部分を提案し（NAR１
５：６６４３−６６５３（１９８７））、クロンテックはさらなる共通翻訳イニ
シエーターを提案している（１９９３／１９９４カタログ、２１０頁）。これら
の共通部分は、この発明のヌクレオチド配列による使用に適している。これらの
配列は、ＡＴＧを含めてそれまで（修飾されていない第２アミノ酸を残す）、ま
たは別法としてＡＴＧに続きＧＴＣを含めてそれまで（導入遺伝子の第２アミノ
酸を修飾する可能性を伴う）のヌクレオチド配列を含む構築物へ組込まれる。

【００５５】 トランスジェニック植物におけるＤＮＡ分子は、植物において機能的であるこ
とが示されたプロモーターにより駆動される。プロモーターの選択は、発現に関
する時間的および空間的必要条件、およびまた標的種により異なる。葉の病原体
から植物を防御するためには、葉における発現が好ましい。穂の病原体から植物
を防御するためには、花序（例、下穂、円錐花序、トウモロコシの穂軸など）に
おける発現が好ましい。根の病原体から植物を防御するためには、根における発
現が好ましい。土壌伝播性病原体から実生を防御するためには、根および／また
は実生における発現が好ましい。しかしながら、多くの場合、複数のタイプの植
物病原体に対する防御が求められているため、多重組織における発現が望ましい
。双子葉植物からの多くのプロモーターは単子葉植物で機能し、逆も同様である
ことが示されたが、理想的には双子葉植物における発現には双子葉植物プロモー
ターが、単子葉植物における発現には単子葉植物プロモーターが選択される。し
かしながら、選択されるプロモーターの由来に制限はない。所望の細胞における
ＤＮＡ分子の発現を駆動する上でそれらが機能できれば十分である。

【００５６】 構成的に発現される好ましいプロモーターには、アグロバクテリウム（Agroba
cterium）オパイン合成遺伝子に由来するプロモーター、例えばｎｏｓプロモー
ター、またはアグロバクテリウムＴｉプラスミド（Veltenら（１９８４）EMBO J
. ３：２７２３−２７３０）由来の二重プロモーター、または植物で機能し得る
ウイルス性プロモーター、例えばＣａＭＶ ３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター、
およびアクチンまたはユビキチンをコードする遺伝子由来のプロモーターがある
。別の好ましいプロモーターは、合成プロモーター、例えばゲルビン・スーパー
ＭＡＳプロモーター（Niら（１９９５）Plant J. ７：６６１−６７６）である
。この発明のＤＮＡ分子はまた、化学的に調節されているプロモーターの調節下
で発現され得る。これにより、作付け植物を誘導性化学物質で処理するときのみ
、真菌性疾患を付与するタンパク質が合成され得る。遺伝子発現の化学的誘導に
好ましい技術は、公開された出願ＥＰ０３３２１０４および米国特許５６１４３
９５に詳述されている。化学的誘導に好ましいプロモーターは、タバコＰＲ−１
ａプロモーターである。

【００５７】 プロモーターの好ましいカテゴリーは、傷害誘導性のものである。傷害部位お
よび植物病原体感染部位で発現される多様なプロモーターが報告されている。理
想的には、かかるプロモーターは、感染部位における局所活性のみを示すべきで
、こうして真菌性疾患を制御するタンパク質のみ、それを合成して侵襲性昆虫有
害虫を殺す必要がある細胞で蓄積される。この種の好ましいプロモーターには、
Stanfordら、Mol. Gen. Genet. ２１５：２００−２０８（１９８９）、Xuら、P
lant Molec. Biol. ２２：５７３−５８８（１９９３）、Logemannら、Plant Ce
ll １：１５１−１５８（１９８９）、Rohrmeier & Lehle、Plant Molec. Biol.
２２：７８３−７９２（１９９３）、Firekら、Plant Molec. Biol. ２２：１
２９−１４２（１９９３）、および Warnerら、Plant J. ３：１９１−２０１（
１９９３）により報告されたものがある。

【００５８】 好ましい組織特異的発現パターンには、緑色組織特異的、根特異的、幹特異的
および花特異的なものがある。緑色組織での発現に適したプロモーターには、光
合成に関与する遺伝子を調節する多くのものがあり、これらの多くは単子葉植物
および双子葉植物の両方からクローン化されたものである。好ましいプロモータ
ーは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子からのトウモロコシＰＥＰＣプロ
モーターである（Hudspeth ＆ Grula、Plant Molec. Biol. １２：５７９−５８
９（１９８９））。根特異的発現に好ましいプロモーターは、de Framondにより
報告されたもの（FEBS ２９０：１０３−１０６（１９９１）、ＥＰ０４５２２
６９）であり、さらに好ましい根特異的プロモーターはこの発明により提供され
るＴ−１遺伝子由来のものである。好ましい幹特異的プロモーターは米国特許５
６２５１３６に記載された、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動するもの
である。

【００５９】 本発明の好ましい態様は、根特異的な方法でＤＮＡ分子を発現するトランスジ
ェニック植物である。さらに好ましい態様は、傷害誘導性または病原体感染誘導
的方法でＤＮＡ分子を発現するトランスジェニック植物である。

【００６０】 好適なプロモーターの選択に加えて、植物でタンパク質を発現させる構築物は
、異種ヌクレオチド配列の下流に結合される適当な転写ターミネーターを必要と
する。幾つかの上記ターミネーターが利用可能であり、当業界では公知である（
例、ＣａＭＶからのｔｍ１、ｒｂｃＳからのＥ９）。植物で機能することが知ら
れている利用可能なターミネーターであれば、この発明に従い使用され得る。

【００６１】 多様な他の配列は、この発明のＤＮＡ分子に関する発現カセットに組込まれ得
る。これらは、発現を増強することが示された配列、例えばイントロン配列（例
、Ａｄｈ１およびｂｒｏｎｚｅ１から）およびウイルス性先導配列（例、ＴＭＶ
、ＭＣＭＶおよびＡＭＶから）を含む。

【００６２】 植物における異なる細胞局在性に対するＤＮＡ分子の発現を標的とすることが
好ましいことであり得る。細胞質ゾルでの局在化が望ましいものであり得る場合
もあれば、細胞レベル下の細胞小器官における局在化が好ましいものであり得る
場合もある。導入遺伝子コード化酵素の細胞レベル下局在化は、当業界でよく知
られた技術を用いて行われ得る。一般的には、公知細胞小器官標的化遺伝子産物
からの標的ペプチドをコードするＤＮＡを操作し、ヌクレオチド配列の上流で融
合させる。多くの上記標的配列が葉緑体について知られており、異種構築物にお
けるそれらの機能は立証されている。

【００６３】 植物形質転換に適したベクターはこの明細書の他の箇所に記載されている。ア
グロバクテリウム（Agrobacterium）−仲介形質転換の場合、バイナリー・ベク
ターまたは少なくとも１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を担うベクターが好適であ
り、直接遺伝子転移の場合、いかなるベクターでも適しており、興味の対象であ
る構築物のみを含む線形ＤＮＡが好まれ得る。直接遺伝子転移の場合、単一ＤＮ
Ａ種による形質転換または共形質転換が使用され得る（Schocherら、Biotechnol
ogy ４：１０９３−１０９６（１９８６））。直接遺伝子転移およびアグロバク
テリウム（Agrobacterium）仲介転移の両場合とも、形質転換は、通常（ただし
、必ずではない）抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシンまたはメタトレキ
セート）または除草剤（グルフォシネート、グリフォセートまたはプロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼ阻害剤）に対する耐性を提供し得る選択可能マーカー
、または形質転換細胞へ選択的利点を付与し得る選択可能マーカー、例えばホス
ホ−マンノース遺伝子により行われる。しかしながら、選択可能マーカーの選択
は本発明にとって重要ではない。

【００６４】 別の好ましい態様において、この発明のＤＮＡ分子は、直接色素体ゲノムへ形
質転換される。色素体形質転換技術は、米国特許第５４５１５１３、５５４５８
１７および５５４５８１８号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１６７８３号、および M
cBrideら（１９９４）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１、７３０１−７３０５
に詳しく記載されている。葉緑体形質転換に関する基本技術は、例えばバイオリ
スティクスまたはプロトプラスト形質転換法（例、塩化カルシウムまたはＰＥＧ
形質転換法）を用いて、適当な標的組織へ興味の対象であるＤＮＡ分子と共存す
る選択可能マーカーに隣接するクローン化色素体ＤＮＡの領域を導入する段階を
含む。ターゲッティング配列と呼ばれる１〜１.５ｋｂフランキング領域により
、色素体ゲノムによる相同的組換えは容易になるため、プラストムの特異領域の
置換または修飾が行われ得る。最初に、スペクチノマイシンおよび／またはスト
レプトマイシンに対する耐性を付与する色素体１６Ｓ ｒＲＮＡおよびｒｐｓ１
２遺伝子における点突然変異は、形質転換のための選択可能マーカーとして使用
される（Svab,Z., Hajdukiewicz,P. および Maliga, P.（１９９０）Proc. Natl
. Acad. Sci. USA ８７、８５２６−８５３０、Staub,J.M. および Maliga,P.（
１９９２）Plant Cell ４、３９−４５）。この結果、安定したホモプラズミッ
ク（homoplasmic）形質転換体が標的葉の衝撃１００回につき約１回の頻度で得
られた。これらのマーカー間にクローニング部位が存在するため、外来遺伝子導
入のための色素体ターゲッティングベクターが作製され得る（Staub, J.M.およ
び Maliga, P.（１９９３）EMBO J. １２、６０１−６０６、これを引用して説
明の一部とする）。

【００６５】 形質転換頻度の実質的増加は、優性選択可能マーカー、スペクチノマイシン解
毒性酵素アミノグリコシド−３'−アデニルトランスフェラーゼをコードする細
菌性ａａｄＡ遺伝子（Svab, Z.および Maliga, P.（１９９３）Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA ９０、９１３−９１７）により劣性ｒＲＮＡまたはｒ−プロテイン
抗生物質耐性遺伝子を置換することにより達成される。以前、このマーカーは、
緑藻クラミドモナス・レインハルティイ（Chlamydomonas reinhardtii、コナミ
ドリムシ）の色素体ゲノムの高頻度形質転換に使用され、成果を挙げた（Goldsc
hmidt-Clermont，M.（１９９１）Nucl. Acids Res. １９、４０８３−４０８９
）。色素体形質転換に有用な他の選択可能マーカーは当業界において公知であり
、本発明の範囲内に包含される。一般的に、ホモプラスチド（homoplastidic）
状態へ到達するのには形質転換後約１５−２０細胞分裂周期が要求される。遺伝
子が相同的組換えによって各植物細胞に存在する環状色素体ゲノムの数千コピー
の全てに挿入される色素体発現は、核発現された遺伝子全体にわたる膨大なコピ
ー数という利点を利用することにより、可溶性植物タンパク質全体の１０％を容
易に上回り得る発現レベルを可能にする。

【００６６】 本発明はまた、本発明ＤＮＡ分子のいずれか１つの発現により真菌病原体に対
して耐性にされたかまたは下記方法のいずれか１つにより真菌病原体に対して耐
性にされたトランスジェニック植物を含む農産物を包含する。上記植物は真菌病
原体に耐性を示すため、それらにおける病原体増殖は抑制される。従って、上記
植物およびそこから誘導された農産物が、多くの真菌病原体により自然生産され
、ヒトおよび動物に対し強い毒性を呈し得るマイコトキシンを含むとはあまり考
えられない。従って、上記農産物は、優れた植物衛生的特性を有する。好ましい
態様において、上記農産物は、飼料として、サイレージとして、または食料とし
て使用される。

【００６７】 本発明のさらに別の目的は、真菌病原体に対して植物を耐性にする方法を提供
することである。本発明ＤＮＡ分子によりコードされるＭｌｏタンパク質は、真
菌病原体に対する耐性を植物に付与するもので、上記タンパク質の自然宿主環境
においてそれらの発現を改変することは本発明の好ましい対象である。本発明の
さらに好ましい対象は、上記タンパク質の自然環境においてそれらの安定性また
は活性を改変することである。植物における本発明ＤＮＡ分子によりコードされ
るタンパク質の発現、安定性または活性の上記改変により、真菌病原体に対する
植物の耐性は増強される。好ましい態様において、本発明ＤＮＡ分子によりコー
ドされるタンパク質は、それが真菌病原体に対する植物の耐性に関与する植物に
おける遺伝経路を抑制するという点で、真菌病原体に対する植物耐性の負の調節
剤である。従って、本発明の好ましい対象は、本発明ＤＮＡ分子によりコードさ
れるＭｌｏタンパク質の発現をそれらの自然宿主環境において低減化するか、ま
たはそれらの自然宿主環境において上記タンパク質の安定性または活性を低減化
することである。

【００６８】 「センス」抑制 好ましい態様において、本発明ＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質の発
現の低減化は、「センス」抑制により達成される（例えば、Jorgensenら（１９
９６）Plant Mol. Biol. ３１、９５７−９７３に引用されている）。この場合
、本発明ＤＮＡ分子の全体または一部が発現カセットに含まれており、ＤＮＡ分
子が発現され得る宿主細胞、好ましくは植物細胞で導入される。ＤＮＡ分子は、
「センス配向」で発現カセットに挿入されており、ＤＮＡ分子の５'末端が発現
カセットにおいてプロモーターに隣接していること、およびＤＮＡ分子のコーデ
ィング鎖が転写され得ることを意味する。好ましい態様において、ＤＮＡ分子は
完全に翻訳可能であり、その一部のＤＮＡ分子に含まれる遺伝情報は全てタンパ
ク質に翻訳される。別の好ましい態様において、ＤＮＡ分子は部分的に翻訳可能
であり、短いペプチドが翻訳される。好ましい態様において、これは、ＤＮＡ分
子において少なくとも１個の未成熟停止コドンを挿入することにより達成され、
翻訳は停止に至る。別のさらに好ましい態様において、ＤＮＡ分子は転写される
が翻訳産物は作製されていない。これは、普通ＤＮＡ分子によりコードされるタ
ンパク質の開始コドン、例えば「ＡＴＧ」を除去することにより達成される。さ
らに別の好ましい態様において、ＤＮＡ分子またはその一部を含む発現カセット
は、宿主細胞のゲノムへ安定して組込まれる。別の好ましい態様において、ＤＮ
Ａ分子またはその一部を含む発現カセットは、染色体外複製性分子に含まれる。
この上記発現カセットの１つを含むトランスジェニック植物において、発現カセ
ットに含まれるＤＮＡ分子に対応する遺伝子の発現が、低減化または排除される
ことにより、トランスジェニック植物においてタンパク質レベルが低減化される
かまたはそれが存在しなくなる。その結果として、トランスジェニック植物は真
菌病原体に対して耐性を示す。

【００６９】 「アンチセンス」抑制 別の好ましい態様において、本発明のＤＮＡ分子によりコードされるタンパク
質の発現の低減化は、「アンチセンス」抑制により達成される。本発明のＤＮＡ
分子の本体またはその一部は発現カセットに含まれており、この場合ＤＮＡ分子
は宿主細胞、好ましくは植物細胞に導入され、そこでＤＮＡ分子が発現し得る。
ＤＮＡ分子は、「アンチセンス配向」で発現カセットに挿入されることから、Ｄ
ＮＡ分子の３’末端が発現カセットにおけるプロモーターに隣接していること、
およびＤＮＡ分子の非コーディング鎖が転写され得ることを意味している。好ま
しい態様において、ＤＮＡ分子またはその一部を含む発現カセットは宿主細胞の
ゲノムに安定して組込まれている。別の好ましい態様において、ＤＮＡ分子また
はその一部を含む発現カセットは、染色体外複製性分子に含まれている。この方
法について記載している幾つかの出版物を引用して、さらに説明を行う（Green,
P.J.ら、Ann.Rev.Biochem.５５：５６９−５９７（１９８６）、van der Krol,A
. R.ら、Antisense Nuc. Acids & Proteins、１２５−１４１頁（１９９１）、A
bel,P.P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６９４９−６９５２（１９８
９）、Ecker, J.R.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８３：５３７２−５３７６
（１９８６年８月））。

【００７０】 相同的組換え 別の好ましい態様において、本発明ＤＮＡ分子に対応する少なくとも１個のゲ
ノムコピーを、Paszkowskiら、EMBO Journal ７：４０２１−２６（１９８８）
に詳述されている相同的組換えにより植物のゲノムにおいて修飾する。この技術
では、相同配列の特性を用いて、相同的組換えとして当業界で知られている方法
により相互認識させ、互いの間でヌクレオチド配列を交換する。相同的組換えは
、細胞におけるヌクレオチド配列の染色体コピーおよび形質転換により細胞に導
入されたヌクレオチド配列の移入コピー間で行われ得る。すなわち特異的修飾は
、ヌクレオチド配列の染色体コピーにおいて正確に導入される。一態様では、本
発明タンパク質をコードする遺伝子の調節エレメントに修飾を加える。既存の調
節エレメントを、異なる調節エレメントにより置き換えるため、タンパク質の発
現が低減化されるか、またはそれらが突然変異誘発または欠失されるため、タン
パク質の発現は排除される。別の態様において、タンパク質のコーディング領域
は、コーディング配列全体のコーディング配列の一部欠失または突然変異により
修飾される。突然変異タンパク質の発現はまた、真菌病原体に対する強化された
耐性を植物に付与し得る。

【００７１】 別の好ましい態様において、ＤＮＡ分子の染色体コピーにおける突然変異は、
末端に二重ヘアピンキャップを伴う二重らせん立体配座においてＲＮＡおよびＤ
ＮＡ残基の隣接伸長部から成るキメラオリゴヌクレオチドで細胞を形質転換する
ことにより導入される。オリゴヌクレオチドの追加的特徴は、ＲＮＡ残基におけ
る２'−Ｏ−メチル化の存在である。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、本発明ＤＮＡ分子
の染色体コピーの配列と整列し、所望のヌクレオチド変化を含むように設計され
ている。この技術については、米国特許５５０１９６７でさらに詳述されている
。

【００７２】 リボザイム さらに別の態様では、本発明タンパク質をコードするＲＮＡを、上記ＲＮＡに
特異的な触媒性ＲＮＡまたはリボザイムにより開裂する。リボザイムがトランス
ジェニック植物において発現されることにより、植物細胞において本発明タンパ
ク質をコードするＲＮＡの量は低減化されるため、細胞に蓄積されるタンパク質
の量が低減化し、真菌病原体に対する植物の耐性は強化される。この方法につい
ては、米国特許４９８７０７１でさらに詳述されている。

【００７３】 優性ネガティブ突然変異体 別の好ましい態様では、この発明のヌクレオチド配列によりコードされるタン
パク質の活性が改変される。これはトランスジェニック植物における優性ネガテ
ィブ突然変異体の発現により達成され、内在性タンパク質の活性の喪失が導かれ
る。

【００７４】 アプタマー 別の態様において、本発明ＤＮＡ分子によりコードされるタンパク質の活性は
、トランスジェニック植物において、タンパク質に特異的に結合する核酸リガン
ド、いわゆるアプタマーを発現させることにより阻害される。アプタマーは、Ｓ
ＥＬＥＸ（システマティック・エヴォルーション・オブ・リガンズ・バイ・エク
スポネンシャル・エンリッチメント）方法により優先的に得られる。ＳＥＬＥＸ
法では、ランダム化配列の領域を有する１本鎖核酸の候補混合物を、タンパク質
と接触させ、標的に対するアフィニティーが増加した核酸を候補混合物の残りか
ら分割する。分割された核酸を増幅することにより、リガンド濃厚化混合物が生
産される。数回反復後、タンパク質に対して最適アフィニティーをもつ核酸が得
られ、これをトランスジェニック植物における発現に使用する。この方法は、米
国特許５２７０１６３でさらに詳述されている。

【００７５】 保存配列を含むヌクレオチド配列を分離する方法 本発明のＤＮＡ分子によりコードされたＭｌｏタンパク質に含まれる保存配列
は、上記配列をコードする他のＤＮＡ分子の分離に使用される。好ましい態様で
は、配列番号１または配列番号２に示された配列をコードする少なくとも１つの
可能なオリゴヌクレオチドを含む縮重オリゴヌクレオチドの混合物が製造される
。配列番号１に示された配列をコードするオリゴヌクレオチドの混合物および配
列番号２に示された配列をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチドの混合
物を、選ばれた鋳型ＤＮＡとのＰＣＲ増幅反応に使用する。縮重オリゴヌクレオ
チドの混合物は当業界ではよく知られており、縮重の程度は必要に応じて変えら
れる。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、植物からの総ＤＮＡのサンプルで
あり、上記ＤＮＡサンプルは当業界で熟知された方法により得られる。上記ＰＣ
Ｒ反応から生成する増幅フラグメントは、当業界でよく知られた方法により分離
され、当業界では共によく知られている、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするかまたはＲＡＣＥプロトコールを用いることにより対応する完全長ｃＤＮ
Ａを分離するのに使用される。この方法は、真菌病原体に対する耐性を植物に付
与する新規遺伝子を分離するための新規で有用な戦略を代表する。

【００７６】 以下、詳細な実施例により本発明についてさらに説明する。これらの実施例は
、説明のみを目的としており、特記しない場合、限定を意図したものではない。

【００７７】 （実施例） 実施例１：小麦からのＭｌｏ遺伝子のクローニングおよび配列決定 逆転写−ＰＣＲ方法を用いて小麦からのＭｌｏ遺伝子をクローン化する。ＲＮ
Ａは、小麦品種ＵＣ７０３の葉から製造され、ストラタジーンＲＴ−ＰＣＲキッ
トを用いて逆転写をプログラムするのに使用される。生成したｃＤＮＡは、下記
プライマーを用いるＰＣＲ反応で使用される。 ＭＬＯ−２６ 5'TTC CAG CAC CGG CAC AAG AA3'（配列番号２５） ＭＬＯ−１０ 5'AAG AAC TGC CTG AAG AAG GC3'（配列番号２３） ＭＬＯ−７ 5'CAG AAA CTT GTC TCA TCC CTG G3'（配列番号２２） ＭＬＯ−５ 5'ACA GAG ACC ACC TCC TTG GAA3'（配列番号２１） ＭＬＯ−１５ CAC CAC CTT CAT GAT GCT CA3'（配列番号２４）

【００７８】 ＰＣＲは下記に列挙したプライマー対を用いて行われ、その反応により、示さ
れたサイズのフラグメントが増幅された。 ＭＬＯ−２６およびＭＬＯ−１０ ５０３ｂｐ ＭＬＯ−２６およびＭＬＯ−７ １４８１ｂｐ ＭＬＯ−５およびＭＬＯ−１５ ６５０ｂｐ

【００７９】 フラグメントをｐＣＲ２.１またはｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（インビトロゲン）
へクローン化する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から製造し、ＤＮＡ配列決定
に付す。配列決定により、互いに非常に高い類似性を有する３種の異なるｃＤＮ
Ａ配列の存在が明らかにされた。これらの小麦Ｍｌｏ遺伝子は、ＴｒＭｌｏ１、
ＴｒＭｌｏ２およびＴｒＭｌｏ３と呼ばれる。

【００８０】 ラムダ−ＺＡＰIIベクターで構築された小麦ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングすることにより、追加の小麦Ｍｌｏクローンを分離する。このライブラリ
ーをスクリーニングするため、大規模切除を遂行することにより、ライブラリー
をｃＤＮＡクローンのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースの集合体へ変換する。これら
を８００００独立クローンのプールにおいて別々に増大させ、プラスミドＤＮＡ
を製造する。オリゴヌクレオチドプライマーＭＬＯ−５およびＭＬＯ−１５を用
いて、プールされたＤＮＡにおいてＰＣＲ反応を遂行する（上記参照）。３つの
プールから、予想通りのサイズの６５０塩基対から成るバンドが得られた。それ
に続いて、さらにそれ以上低い密度での細菌クローンの連続培養により、これら
のプールを分画した後、各段階ともプライマーＭＬＯ−５およびＭＬＯ−１５を
用いて各サブプールにおいてプラスミドＤＮＡ製造およびＰＣＲを行う。数ラウ
ンドの分画後、Ｍｌｏ配列を伴う挿入体を含む単一クローンを分離する。これら
のクローンのうちの２つの挿入体を配列決定すると、それらが同一挿入体を含む
ことが判る。第３クローンの配列は、他の２つのクローンのそれと同一である挿
入体であることが判るが、５'末端に４０個の追加塩基を伴う。

【００８１】 小麦Ｍｌｏの残りの部分のクローニングは、ｃＤＮＡ末端のランダム増殖（Ｒ
ＡＣＥ）により行われる。ＲＡＣＥ反応は、マラトンｃＤＮＡ増幅キット（クロ
ンテク）を用いることにより小麦ＵＣ７０３ポリ−Ａ⁺ ＲＮＡにおいて行われる
。ポリ−Ａ⁺ ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースカラム（ギブコＢＲＬ）を用い
て総小麦ＲＮＡから製造される。ＲＡＣＥ反応に使用されるオリゴヌクレオチド
は次のものである。 MLO-GSP1 5'TGG ACC TCT TCA TGT TCG ATC CCA TCT G3'（配列番号２６） MLO-GSP2 5'CCT GAC GCT GTT CCA GAA TGC GTT TCA3'（配列番号２７）

【００８２】 キットに用意されたプライマーＭＬＯ−ＧＳＰ１および５'アダプタープライ
マーを用いて増幅すると、〜１３００ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが得ら
れる。プライマーＭＬＯ−ＧＳＰ２および３'アダプターを用いて増幅すると、
〜６００ヌクレオチドのＤＮＡフラグメントが得られる。これらのフラグメント
をｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯへクローン化し、ＴｒＭｌｏ１−５、ＴｒＭｌｏ２−
５およびＴｒＭｌｏ３−５と命名すると、それぞれ小麦Ｍｌｏ遺伝子ＴｒＭｌｏ
１、ＴｒＭｌｏ２およびＴｒＭｌｏ３の５'末端を含んでいる。プラスミドＤＮ
Ａをこれらのクローンから製造し、プラスミド挿入体を配列決定する。

【００８３】 実施例２ アラビドプシス（Arabidopsis）からのＭｌｏ ｃＤＮＡのクローニング プログラムＴＢＬＡＳＴＮを用いて、Ｍｌｏタンパク質配列をデータベースエ
ントリーの翻訳結果と比較すると、Ｍｌｏとの類似性をもつ若干のエントリーが
判明する。これらのうち、アラビドプシス（Arabidopsis）ＥＳＴエントリーに
対応する完全長ｃＤＮＡをクローン化し、受入れ番号Ｈ７６０４１、Ｎ３７５４
４およびＴ２２１４６とする。各ＥＳＴについて、プラスミドｐＦＬ６１（Mine
tら（１９９２）Gene Nov １６，１２１（２）：３９３−３９６）で構築された
アラビドプシス（Arabidopsis）ｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴに対応する
配列を増幅するようにオリゴヌクレオチドを設計する。使用されるオリゴヌクレ
オチドは下記のものである：

【００８４】 N37544-1 5'AAG ATC AAG ATG AGG ACG TGG AAG TCG TGG 3'（配列番号２９） N37544-2 5'AGG CTG AAC CAC TGG GGC GCC TCT CAC CAC 3'（配列番号３０） T22146-1 5'CAA GTA TAT GAT GCG CGC TCT AGA GGA TGA3'（配列番号３１） T22146-2 5'AGG TTT CAC CAC TAA GTC TCC TTC AAT GGC3'（配列番号３２） H76041-1 5'GAT CAT TCA AGA CTT AGG CTC ACT CAT GAG3'（配列番号３３） H76041-2 5'AAC AGC AAG GAA GAT TAC AAA TGA TGC CCA3'（配列番号３４）

【００８５】 プライマーＮ３７５４４−１およびＮ３７５４４−２は、ｃＤＮＡライブラリ
ーから製造されたＤＮＡからの〜５００塩基対フラグメントを増幅し、プライマ
ーＴ２２１４６−１およびＴ２２１４６−２は、〜２５０塩基対フラグメントを
増幅する。プライマーＨ７６０４１−１およびＨ７６０４１−２は、〜３５０お
よび〜３００塩基対の２種のフラグメントを増幅する。〜３００塩基フラグメン
トはＥＳＴ配列から推定されるサイズを有し、続いてｃＤＮＡライブラリーにお
けるＨ７６０４１ ＥＳＴに対応するｃＤＮＡの存在を診断するのに使用される
。ライブラリーからのＤＮＡをエシェリキア・コリ（E.coli）へ形質転換し、ク
ローンを各々〜２００００クローンから成るプールに組織化する。異なるプライ
マー対を用いるＰＣＲにより個々のプールからのＤＮＡをスクリーニングし、続
いて陽性プールをよりいっそう小さいクローン数へ小分画（subfractionate）す
る。個々の陽性クローンの分離は、このプロセスを完了するまで成し遂げるか、
または場合によっては、一旦プールサイズが２００クローンまたはそれ未満に達
した後プローブとしてＥＳＴ配列を用いるコロニーハイブリダイゼーションによ
り達成される。ＥＳＴ Ｎ３７５４４およびＴ２２１４６の場合、ＥＳＴに対応
するクローンの分離を成し遂げ、挿入体を配列決定する。ＥＳＴ Ｎ３７５４４
に対応するｃＤＮＡをプラスミドｐＣＩＢ１０２９５においてＣＩＢ１０２９５
と称し、ＥＳＴ Ｔ２２１４６に対応するｃＤＮＡ（ＣＩＢ１０２９６）を含む
プラスミドをｐＣＩＢ１０２９６と称する。これら２種のＥＳＴの場合、対応す
るゲノム配列は、ジェンバンクに最近寄託されたアラビドプシス（Arabidopsis
）ＢＡＣクローン配列の部分形態で利用可能である。特に、ジェンバンクにより
測定されたところによると、これらのゲノム配列から翻訳されると推定されたタ
ンパク質配列は、ｃＤＮＡの直接配列決定により測定された配列とは対応しない
。従って、ＥＳＴ Ｎ３７５４４およびＴ２２１４６に対応する遺伝子のアミノ
酸配列は、ジェンバンクのエントリーからは明らかではなく、ｃＤＮＡクローン
のクローニングおよび配列決定を通して解明されるだけである。Ｈ７６０４１Ｅ
ＳＴのためのプライマーを用いて分離されたクローンは、挿入体としてＨ７６０
４１に関する遺伝子ではなく、新規Ｍｌｏ遺伝子ファミリー構成員を含んでいる
ことが見出された。この挿入体を完全に配列決定し、このＭｌｏ遺伝子ファミリ
ー構成員を、プラスミドｐＣＩＢ１０２５９におけるＣＩＢ１０２５９と命名す
る。

【００８６】 実施例３ 小麦におけるＭｌｏ遺伝子発現のためのベクター構築 小麦における大麦Ｍｌｏ遺伝子の「アンチセンス」発現のために２種のベクタ
ーを構築する。大麦ｃＤＮＡおよびプライマー対ＭＬＯ−５およびＭＬＯ−７を
用いてＰＣＲを遂行すると（上記（１）参照）、この反応の結果、１１２４ｂｐ
フラグメントが増幅され、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ）へクローン化される。酵素
ＳａｃIIおよびＮｏｔＩを用いてこのフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔから切除する
。１１２４塩基対フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）へクロー
ン化する。そこで挿入体をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位により切除し、Ｍ
ｌｏコーディング配列がトウモロコシのユビキチンプロモーターとは反対に向か
う配向でＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ−消化ｐＣＩＢ９８０６（特許出願０８／８３８
２１９に記載されている）へクローン化する。このプラスミドをｐＣＫ０１と称
す。

【００８７】 小麦において全Ｍｌｏ遺伝子を「アンチセンス」発現させるベクターを構築す
るため、プライマー対ＭＬＯ−１（5'ATG TCG GAC AAA AAA GGG GT3'（配列番号
１９））およびＭＬＯ−１０（上記（１）参照）を用いてＰＣＲを行うと、この
反応の結果、６３５ｂｐフラグメントが増幅され、これをｐＣＲ２.１（インビ
トロゲン）へクローン化する。このフラグメントをＥｃｏＲＩフラグメントとし
てｐＣＲ２.１から切除し、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）（プロメガ）へ挿入する。
Ｍｌｏにおいて自然に存するＳａｃＩ部位からプライマー部位ＭＬＯ−１０に及
ぶ３２０ヌクレオチドのフラグメントを、ＳａｃＩおよびＢｓｔＸＩにより切除
する。ｐＣＫ０１をＳａｃＩおよびＢｓｔＸＩにより消化し、３２０塩基フラグ
メントを挿入する。単子葉植物発現ベクターにおいてＭｌｏ遺伝子の構築を完成
させるため、２１０ヌクレオチドのＳａｃＩフラグメントを、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ
（−）誘導体から切除する。このフラグメントは、プライマー部位ＭＬＯ−１か
らＭｌｏ遺伝子において自然に存するＳａｃＩ部位まで、Ｍｌｏコーディング配
列の５'末端を含む。ｐＣＫ０１誘導体をＳａｃＩで消化し、２１０塩基フラグ
メントを挿入する。プライマーＭＬＯ−１およびＭＬＯ−１０を用いて、ＰＣＲ
により新たに構築されたベクターにおける２１０塩基フラグメントの配向につい
てクローンを分析する。２１０塩基フラグメントがユビキチンプロモーターに対
してアンチセンス配向で挿入されているクローンからのみ、Ｍｌｏコーディング
配列の５'末端に対応する５３０塩基対産物が得られた。生成したプラスミドは
、ユビキチンプロモーターに対して「アンチセンス」配向で全Ｍｌｏコーディン
グ配列を含んでおり、ｐＣＫ０２と称する。

【００８８】 「センス」配向でＭｌｏ遺伝子を発現させるベクターを構築するため、プラス
ミドｐＣＫ０２をＢａｍＨＩで消化することにより、挿入体としてのＭｌｏコー
ディング配列が放出される。ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＣＫ０２塩基ベクタ
ーへ再連結する。ｐＣＫ０２に対して逆配向でＭｌｏコーディング配列を伴うコ
ロニーをＳａｃＩ消化により同定すると、ｐＣＫ０２と同一の立体配置を有する
クローンにおける２１０塩基フラグメントとは反対に、上記クローンでは１.８
ｋｂフラグメントが得られた。トウモロコシユビキチンプロモーターに対して「
センス」配向でＭｌｏコーディング配列を伴うクローンを、ｐＣＫ０３と称する
ものとして選択する。

【００８９】 実施例４ アラビドプシス（Arabidopsis）においてＭｌｏ遺伝子を発現させるためのベ
クターの構築 ｐＣＫ０２を随伴した（大麦Ｍｌｏ遺伝子について）、ｐＣＩＢ１０２５９、
ｐＣＩＢ１０２９５およびｐＣＩＢ１０２９６におけるＭｌｏクローンを、ＰＣ
Ｒ反応で使用すると、ＢａｍＨＩ制限部位が隣接する完全長遺伝子配列を担うバ
ンドが得られた。使用されたプライマーの配列は次の通りである。 SAS-1:5'GGA TTA AGA TCT AAT GGC3'（配列番号３５、pCIB10295の場合） SAS-2:5'CAA AGA TCT TCA TTT CTT AAA AG3'（配列番号３６、pCIB10295の場合
） SAS-3:5'GCG GAT CCA TGT CGG ACA AAA AAG G3'（配列番号３７、大麦Ｍｌｏの
場合） SAS-4:5'GCG GAT CCT CAT CCC TGG CTG AAG G3'（配列番号３８、大麦Ｍｌｏの
場合） SAS-5:5'GGA TCC ACC ATG GCC ACA AGA TG3'（配列番号３９、pCIB10259の場合
） SAS-6:5'GGA TCC TTA GTC AAT ATC ATT AGC3'（配列番号４０、pCIB10259の場合
） SAS-7:5'GCG GAT CCA TGG GTC ACG GAG GAG AAG3'（配列番号４１、pCIB10269の
場合） SAS-8:5'GCG GAT CCT CAG TTG TTA TGA TCA GGA3'（配列番号４２、pCIB10269の
場合）

【００９０】 バンドをｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯへクローン化し、挿入体を生成したプラスミ
ドから配列決定することにより、ＰＣＲにより導入された突然変異が存在しない
ことを確認する。プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、挿入体を精製し、ＢａｍＨ
Ｉ−消化ｐＰＥＨ２８、すなわちＢａｍＩ部位のすぐ下流にアラビドプシス（Ar
abidopsis）ユビキチン遺伝子プロモーターＵＢＱ３（Norrisら、（１９９３）P
lant Molecular Biology ２１：８９５−９０６）のコピーを含むシャトルベク
ターへクローン化する。ＵＢＱ３に融合したＭｌｏ配列を含むクローンを同定し
、制限分析を行うことにより、ＵＢＱ３に対して「センス」および「アンチセン
ス」配向で挿入体を伴うクローンを同定する。各Ｍｌｏ遺伝子について、「セン
ス」配向で挿入体を伴うクローンおよび「アンチセンス」配向で挿入体を伴うク
ローンをＸｂａＩで消化し、挿入体を精製し、ＸｂａＩ−消化ｐＣＩＢ２００へ
クローン化する。これによって、Ｔ−ＤＮＡボーダー間にＵＢＱ３−Ｍｌｏ遺伝
子融合体が配列する。

【００９１】 実施例５ 小麦の形質転換および発現因子の同定 特許出願ＷＯ９４／１３８２２に詳述されている要領で、未成熟胚の粒子衝撃
により小麦を形質転換する。バスタ含有培地で苗木を再生させ、ＰＣＲ分析にか
ける。ＰＣＲによりＭｌｏ導入遺伝子の存在ついて診断するため、下記プライマ
ーを使用する。 ＭＬＯ−３： ５'ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＡＴ ＣＧ３’ ＳＴ２７： ５’ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＡ３’

【００９２】 プライマーＭＬＯ−３は、Ｍｌｏ導入遺伝子の領域に対応し、プライマーＳＴ
２７はトウモロコシユビキチンプロモーター配列内に存する。ＰＣＲでＭｌｏ遺
伝子およびユビキチンプロモータープライマーの両方を使用すると、２種のＭｌ
ｏプライマーの使用から生じる偽陽性が排除され、小麦に存在するＭｌｏ遺伝子
の染色体コピーからプライミングし得る。Ｍｌｏ導入遺伝子を含むことが確認さ
れた植物を、ＲＮＡゲルブロット分析に付すことにより、それらが改変されたレ
ベルの染色体コード化小麦Ｍｌｏ ｍＲＮＡを含むか否かを測定する。ポリ−Ａ⁺
ＲＮＡを個々のトランスジェニック系から製造し、ハイボンド−Ｎ＋フィルタ
ーへブロッティングする。Ｍｌｏ遺伝子の５'末端に対応する５３０塩基フラグ
メントによりブロットをプローブする。この領域は、ｐＣＫ０１クローンには存
在しない。従って、ｐＣＫ０１を含むトランスジェニック系において導入遺伝子
から発現されるアンチセンスＲＮＡとのハイブリダイゼーションは行われない。
ｐＣＫ０２トランスジェニック系の場合、導入遺伝子はこの５'末端フラグメン
トを含んでおり、プローブは異なるサイズの２つのバンドとハイブリダイズする
。アンチセンス導入遺伝子に対応する〜２.５ｋｂ ｍＲＮＡは、小麦染色体コー
ド化Ｍｌｏ遺伝子から誘導された２.０ｋｂ ｍＲＮＡとは区別される。個々の系
における導入遺伝子により達成された遺伝子抑制効率の測定値として２.０ｋｂ
ｍＲＮＡの存在量をモニターする。

【００９３】 実施例６ トランスジェニック小麦系の疾病試験 トランスジェニックおよび非形質転換ＵＣ７０３（対照）小麦系の植物を、そ
れらが２週令になるまで温室で生長させる。パーシヴァル生長チャンバー（８時
間暗所、１６℃、および１６時間明所、２０℃のサイクル）へ植物を移し、胞子
の自由適用によりエリシフェ・グラミニス・エフ・エスピー・トリティシ（Erys
iphe graminis f. sp. tritici）を接種する。真菌胞子形成の程度を接種後２週
間評価する。植物を１（菌糸生長はほとんどまたは全く無し、目に見える胞子形
成は全くなし）、２（ある程度の菌糸生長および胞子形成、ただし対照植物では
劣る）または３（対照に匹敵する菌糸生長および胞子形成）で評価する。Ｍｌｏ
構築物を発現するトランスジェニック小麦系は、病原体に対して強化された耐性
を示す。アンチセンス大麦Ｍｌｏ構築物により得られた結果の一例を下記に示す
。

【００９４】 疾病耐性に関するトランスジェニック系Ｒ１およびＲ２からの姉妹細胞のスク
リーニング Ｍｌｏアンチセンス形質転換体（Ｔ２種子）の姉妹細胞を植え付け、エリシフ
ェ・グラミニス（E.graminis）を接種し、疾病耐性について評価する。

【表２】 耐性を呈するＲ１およびＲ２植物のパーセンテージが小さいという事実は、導入
遺伝子についてまだ分離しているＴ２集団が試験されたという事実によるもので
あり得る。

【００９５】 実施例７ Ｍｌｏ遺伝子を発現するアラビドプシス（Arabidopsis）系の分析 Ｍｌｏ遺伝子を含むｐＣＩＢ２００の誘導体を用いて、真空浸透法によりアラ
ビドプシス（Arabidopsis）生態型Ｗｓ−Ｏを形質転換する（Bechtold,N.、Elli
s,J.および Pelletier,G.（１９９３）C. R. Acad. Sci. Paris ３１６、１１９
４−１１９９）。カナマイシン選択により後代をスクリーニングして、形質転換
体を同定する。Ｍｌｏトランスジェニック系については、ＲＮＡゲルブロット分
析によりＭｌｏを発現した植物を同定する。Ｍｌｏ遺伝子については、ＲＮＡゲ
ルブロット分析により定常状態レベルのｍＲＮＡ蓄積における改変について形質
転換体を分析する。標的遺伝子のセンスまたはアンチセンス抑制を呈する形質転
換体を、植物病原体真菌エリシフェ・チコラセアルム（Erysiphe cichoracearum
）およびペロノスポラ・パラシティカ（Peronospora parasitica）、および細菌
病原体シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・トマト（Pseudomonas syringae
pv. tomato）に対する反応での改変について検定する。トリパンブルー染色を
用いて肉眼および顕微鏡の両方でトランスジェニック植物の葉を調べることによ
り、壊死の存在について試験する。

【００９６】 エリシフェ（Erysiphe）接種のため、胞子をアラビドプシス・ロセッテス（Ar
aidopsis rosettes）へ自由適用し、植物を２５℃でのパーシヴァル生長チャン
バーで維持する。接種後１０日間真菌胞子形成の程度を評価する。

【００９７】 実施例８ Ｍｌｏ配列間における類似性領域の使用による追加的Ｍｌｏ遺伝子ファミリー
構成員の分離 Ｍｌｏ遺伝子によりコードされると予測されるアミノ酸配列の平行整列は、全
遺伝子産物間に若干の短い高アミノ類似性領域があることを示した。これらの領
域に対して縮重プライマーを設計し、これらのプライマーとのＰＣＲ反応をＰＣ
Ｒ試薬供給者の勧告に従い行う。増幅されたフラグメントをプローブとして用い
ることにより、新規Ｍｌｏ遺伝子の完全長ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを分離
する。追加的Ｍｌｏ遺伝子の分離に使用される本発明Ｍｌｏタンパク質間に保存
されたアミノ酸配列（太字）および縮重オリゴヌクレオチドを下記に示す。

【表３】 Ｘ１＝Ｌ、ＶまたはＩ，Ｘ２＝ＶまたはＬ、Ｘ３＝ＦまたはＬ、Ｘ４＝Ｔ、Ｓま
たはＡ。Ｘ５＝Ｉ、Ｖ、ＳまたはＧ、Ｘ６＝Ｆ、ＬまたはＶ、Ｘ７＝ＹまたはＮ
、Ｘ８＝ＡまたはＶ、Ｘ９＝ＬまたはＩ、Ｘ１０＝ＴまたはＳ。Ｒ＝Ａ、Ｇ Ｙ
＝Ｃ、Ｔ Ｍ＝Ａ、Ｃ Ｋ＝Ｇ、Ｔ Ｓ＝Ｃ、Ｇ Ｗ＝Ａ、Ｔ Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ Ｂ＝
Ｃ、Ｇ、Ｔ Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇ Ｄ＝Ａ、Ｇ、Ｔ Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ。

【００９８】 実施例９ コーディング配列および隣接配列の修飾 トランスジェニック植物宿主で発現するようにこの出願に記載されているＤＮ
Ａ分子を修飾することにより、それらの発現は達成および最適化またはダウンレ
ギュレーションされ得る。次の問題と直面することになり得、これらのＤＮＡ分
子の修飾は当業界でよく知られている技術を用いて行われ得る。

【００９９】 （１）コドン使用。植物種によって好ましいコドン使用は異なる。一般的には
、植物進化は、単子葉植物の第３塩基位置におけるヌクレオチドＣおよびＧの強
い優先性に向かう傾向を示しており、双子葉植物はこの位置でヌクレオチドＡま
たはＴを用いることが多い。特定標的トランスジェニック種に好ましいコドン使
用を組込むよう遺伝子を修飾することにより、ＧＣ／ＡＴ含量および非正統的ス
プライシングに関する下記問題の多くは克服される。

【０１００】 （２）ＧＣ／ＡＴ含量。植物遺伝子は一般に３５％を越えるＧＣ含量を有する
。ＡおよびＴヌクレオチドに富むＤＮＡ分子は、植物において幾つかの問題を誘
発し得る。まず、ＡＴＴＴＡのモチーフは、メッセージの不安定化を誘発すると
考えられ、多くの短命ｍＲＮＡの３'末端で見出される。次に、メッセージ内の
不適当な位置におけるポリアデニル化シグナル、例えばＡＡＴＡＡＡの発生は、
転写物の未熟な先端切除を誘発すると考えられる。さらに、単子葉植物は、スプ
ライス部位としてＡＴ濃厚配列を認識し得る（下記参照）。

【０１０１】 （３）開始メチオニンに隣接する配列。リボソームはメッセージの５'末端に
結合し、どこで翻訳を開始するかで第１の利用可能なＡＴＧについて走査すると
考えられている。それにも拘わらず、ＡＴＧに隣接するある種のヌクレオチドに
関する優先性が存在すること、および本発明ＤＮＡ分子の発現がＡＴＧにおける
新規共通翻訳イニシエーターを組込むことにより高められ得ることが信じられて
いる。クロンテク（１９９３／１９９４カタログ、２１０頁）は、植物において
エシェリキア・コリ（E.coli）ｕｉｄＡ遺伝子を発現させる共通翻訳イニシエー
ターとしての配列を示唆している。さらに、ジョシ（NAR １５：６６４３−６６
５３（１９８７））は、ＡＴＧに隣接する多くの植物配列を比較した結果、共通
配列を示唆している。植物におけるＤＮＡ分子発現で困難に直面する状況では、
開始ＡＴＧにこれらの配列の１つを組込むと、翻訳が改善され得る。それらの場
合、共通配列の最後の３ヌクレオチドは、それらが第２ＡＡ残基で修飾されてい
るため、修飾配列への組込みには適していないことがあり得る。開始メチオニン
に隣接する好ましい配列は、異なる植物の種類では異なり得る。ジェンバンクの
データベースに置かれた１４トウモロコシ遺伝子の調査により下記結果が提供さ
れた。 １４トウモロコシ遺伝子における開始ＡＴＧの前の位置： -10 -9 -8 -７ -6 -5 -4 -3 -2 -1 C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 7 T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0 A 2 3 1 4 3 2 3 7 2 3 G 6 3 6 0 6 5 4 6 1 5

【０１０２】 この分析は、ヌクレオチド配列が組込まれている所望の植物種について行われ
ており、ＡＴＧに隣接する配列は好ましいヌクレオチドを組込むように修飾され
得る。

【０１０３】 （４）非正統的スプライス部位の除去。本発明ＤＮＡ分子はまた、５'または
３'スプライス部位として植物で認識され、開裂されることにより、先端切除ま
たは欠失されたメッセージを生じ得るモチーフを含み得る。これらの部位は、当
業界でよく知られている技術を用いて除去され得る。

【０１０４】 （５）優性ネガティブ突然変異体の作製 さらに、本発明ＤＮＡ分子はまた、この発明のヌクレオチド配列によりコード
されるタンパク質の活性が改変されるように修飾されている分子を含み得る。こ
れは、トランスジェニック植物におけるタンパク質の優性ネガティブ突然変異体
の発現により達成され、それによって内在性タンパク質の活性が失われる。上記
優性ネガティブ突然変異体の製造へと導くＭｌｏヌクレオチド配列における突然
変異の位置は、下記に列挙されている。下記に列挙されている単一突然変異また
は異なる突然変異の組み合わせが導入され得る。

【表４】

【表５】

【０１０５】 コーディング配列および隣接配列を修飾する技術は、当業界ではよく知られて
いる。本発明ＤＮＡ分子の初回発現が低く、上記配列に改変を加えるのが適当と
思われる場合、合成遺伝子の構築は当業界公知の方法に従い達成され得る。これ
らは、例えば、公開された特許明細書ＥＰ０３８５９６２、ＥＰ０３５９４７２
およびＷＯ９３／０７２７８に記載されている。ほとんどの場合、トランスジェ
ニック植物へ転移させる前に一時的検定プロトコール（当業界ではよく知られて
いる）を用いて遺伝子構築物を検定するのが好ましい。

【０１０６】 実施例１０ 植物形質転換ベクターの構築 多様な形質転換ベクターが植物の形質転換に利用可能であり、この発明のＤＮ
Ａ分子はいずれかの上記ベクターと連係的に使用され得る。使用されるベクター
の選択は、好ましい形質転換技術および形質転換用標的の種類により異なる。あ
る種類の標的の場合、異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好まれ得る。
形質転換で常用される選択マーカーには、カナマイシン、パロモマイシン、ジェ
ネティシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔII遺伝子（Vieira
および Messing、１９８２、Gene １９：２５９−２６８、Bevanら、１９８３、
Nature ３０４：１８４−１８７）、アミノグリコシド３'−アデニルトランスフ
ェラーゼをコードし、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐
性を付与する、細菌性ａａｄＡ遺伝子（Goldschmidt-Clermont、１９９１、Nucl
. Acids Res. １９：４０８３−４０８９）、抗生物質ハイグロマイシンに対す
る耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（Blochlinger および Diggelmann、１９８４、M
ol. Cell. Biol. ４：２９２９−２９３１）、およびメトトレキセートに対する
耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Bourouis および Jarry、１９８３、EMBO J.２
：１０９９−１１０４）がある。使用される他のマーカーには、除草剤ホスフィ
ノトリシンに対する耐性を付与するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子（Whiteら、１９９０、Nucl. Acids Res. １８：１０６２、Spencer
ら、１９９０、Theor. Appl. Genet.７９：６２５−６３１）、グリフォセート
耐性をコードする突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Hincheeら、１９８８
、Bio/Technology ６：９１５−９２２）、イミダゾリオンまたはスルホニル尿
素耐性を付与する突然変異体アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（Le
eら、１９８８、EMBO J. ７：１２４１−１２４８）、アトラジンに対する耐性
を付与する突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子（Smedaら、１９９３、Plant Physiol. １
０３：９１１−９１７）、または米国特許第５７６７３７３号に記載された突然
変異体プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ遺伝子がある。米国特許第５７６７
３７８号に記載されている通り、陽性選択をもたらす選択マーカー、例えばホス
ホマンノースイソメラーゼ遺伝子もまた、使用される。

【０１０７】 形質転換細胞の同定はまた、スクリーン可能なマーカー遺伝子、例えばクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ
（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または形質
転換細胞に表現型の異なる特性を付与する他のいずれかのタンパク質をコードす
る遺伝子の発現を通して達成され得る。

【０１０８】 （１）アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換に適したベクターの構
築 多くのベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium
tumefaciens）を用いる形質転換に利用可能である。これらは一般的に少なくと
も１つのＴ−ＤＮＡボーダー配列を担い、例えばｐＢＩＮ１９（Bevan、Nucl. A
cids Res.（１９８４））およびｐＸＹＺといったベクターが含まれる。以下、
２種の典型的ベクターの構築について記載する。

【０１０９】 ｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１の構築 バイナリーベクターｐＣＩＢ２００およびｐＣＩＢ２００１は、アグロバクテ
リウム（Agrobacterium）により用いられる組換えベクターの構築に使用され、
下記の方法で構築される。ｐＴＪＳ７５ｋａｎは、ｐＴＪＳ７５（Schmidhauser
& Helinski、J Bacteriol. １６４：４４６−４５５（１９８５））のＮａｒＩ
消化により作製され、テトラサイクリン耐性遺伝子が切除された後、ＮＰＴIIを
担うｐＵＣ４ＫからのＡｃｃＩフラグメントが挿入され得る（Vieira & Messing
、Gene １９:２５９−２６８（１９８２）、Bevanら、Nature ３０４：１８４−
１８７（１９８３）、McBrideら、Plant Molecular Biology １４：２６６−２
７６（１９９０））。左右のＴ−ＤＮＡボーダー、植物選択可能ｎｏｓ／ｎｐｔ
IIキメラ遺伝子およびｐＵＣポリリンカーを含むｐＣＩＢ７のＥｃｏＲＶフラグ
メントにＸｈｏＩリンカーを連結させ（Rothsteinら、Gene ５３：１５３−１６
１（１９８７））、ＸｈｏＩ−消化フラグメントをＳａII−消化ｐＴＪＳ７５ｋ
ａｎへクローン化することにより、ｐＣＩＢ２００が作製される（ＥＰ０３３２
１０４、実施例１４も参照）。ｐＣＩＢ２００は、次の特有なポリリンカー制限
部位：ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇIII、ＸｂａＩおよびＳａIIを含
む。ｐＣＩＢ２００１は、追加制限部位のポリリンカーへの挿入により作製され
たｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーにおける特
有の制限部位は、ＥｃｏＲＩ、ＳｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇIII、ＸｂａＩ、ＳａI
I、ＭｌｕＩ、ＢｃII、ＡｖｒII、ＡｐａＩ、ＨｐａＩおよびＳｔｕＩである。
ｐＣＩＢ２００１はまた、これらの特有な制限部位を含むことに加えて、植物お
よび細菌カナマイシン選択、アグロバクテリウム仲介形質転換に関する左および
右Ｔ−ＤＮＡボーダー、エシェリキア・コリ（E.coli）および他の宿主間での起
動に関するＲＫ２−誘導ｔｒｆＡ機能、およびＲＫ２からのＯｒｉＴおよびＯｒ
ｉＶ機能も有する。ｐＣＩＢ２００１ポリリンカーは、それら自体の調節シグナ
ルを含む植物発現カセットのクローニングに好適である。

【０１１０】 ｐＣＩＢ１０およびそのハイグロマイシン選択誘導体の構築 バイナリーベクターｐＣＩＢ１０は、植物における選択のためのカナマイシン
耐性をコードする遺伝子およびＴ−ＤＮＡ右および左ボーダー配列を含み、広い
宿主範囲のプラスミドｐＲＫ２５２からの配列を組込むことにより、エシェリキ
ア・コリ（E.coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）の両方でのそ
の複製が可能となる。それの構築は、Rothsteinらにより報告されている（Gene
５３：１５３−１６１（１９８７））。Gritzら（Gene ２５：１７９−１８８（
１９８３））により報告されたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼに
関する遺伝子が組込まれたｐＣＩＢ１０の様々な誘導体が構築された。これらの
誘導体は、ハイグロマイシンのみ（ｐＣＩＢ７４３）、またはハイグロマイシン
およびカナマイシン（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）についてトランスジェ
ニック植物細胞の選択を可能にする。

【０１１１】 （２）非アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換に適したベクターの
構築。 アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用
いない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおいてＴ−ＤＮＡ配列に関す
る必要条件を回避するため、これらの配列を欠くベクターが、Ｔ−ＤＮＡ配列を
含むベクター、例えば上記のものに加えて利用され得る。アグロバクテリウム（
Agrobacterium）に頼らない形質転換技術には、粒子衝撃、プロトプラスト摂取
（例、ＰＥＧおよび電気穿孔）および顕微注入による形質転換法がある。ベクタ
ーの選択は、形質転換されている種に好ましい選択に大きく左右される。以下、
幾つかの典型的ベクターの構築について記載する。

【０１１２】 ｐＣＩＢ３０６４の構築 ｐＣＩＢ３０６４は、除草剤バスタ（またはホスフィノトリシン）による選択
と組み合わせた直接遺伝子転移技術に好適なｐＵＣ由来のベクターである。プラ
スミドｐＣＩＢ２４６は、エシェリキア・コリ（E.coli）ＧＵＳ遺伝子への機能
的融合におけるＣａＭＶ ３５ＳプロモーターおよびＣａＭＶ ３５Ｓ転写ターミ
ネーターを含んでおり、ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０７２７８に記載されている
。このベクターの３５Ｓプロモーターは、出発部位の２つのＡＴＧ配列５'を含
む。これらの部位には、ＡＴＧを除去し、制限部位ＳｓｐＩおよびＰｖｕIIを生
成する要領で標準ＰＣＲ技術を用いて突然変異が導入されている。新規制限部位
は、唯一のＳａIIから９６および３７ｂｐ離れ、実際の出発部位から１０１およ
び４２ｂｐ離れている。ｐＣＩＢ２４６の生成された誘導体をｐＣＩＢ３０２５
と称する。次いで、ＧＵＳ遺伝子をＳａIIおよびＳａｃＩ消化によりｐＣＩＢ３
０２５から切除し、末端を平滑にし、再連結することにより、プラスミドｐＣＩ
Ｂ３０６０が生成される。プラスミドｐＪＩＴ８２は、ノーウィッチのジョーン
・イネス・センターから入手され、ストレプトマイシス・ヴィリドクロモゲネス
（Streptomyces viridochromogenes）からのｂａｒ遺伝子を含む４００ｂｐ Ｓ
ｍａＩフラグメントを切除し、ｐＣＩＢ３０６０のＨｐａＩ部位へ挿入する（Th
ompsonら、EMBO J ６：２５１９−２５２３（１９８７））。この結果、除草剤
選択のためにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびターミネーターの制御下にあ
るｂａｒ遺伝子、アンピシリン耐性の遺伝子（エシェリキア・コリ（E.coli）に
おける選択のため）および特有な部位ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIIIおよび
ＢａｍＨＩをもつポリリンカーを含むｐＣＩＢ３０６４が生成された。このベク
ターは、それら自体の調節シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに適
している。

【０１１３】 ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５の構築 ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択可能マーカー
としてエシェリキア・コリ（E.coli）遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ
Ｒ）を利用する形質転換ベクターである。ＰＣＲを用いて、３５Ｓプロモーター
（〜８００ｂｐ）、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子からのイントロン６（〜５５０
ｂｐ）およびｐＳＯＧ１０からの１８ｂｐのＧＵＳ非翻訳先導配列を増幅する。
エシェリキア・コリ（E.coli）ジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードす
る２５０ｂｐフラグメントもまたＰＣＲにより増幅され、これら２つのＰＣＲフ
ラグメントを、ｐＵＣ１９ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼター
ミネーターを含むｐＢＩ２２１（クロンテク）からのＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグ
メントにより組立てる。これらのフラグメントの組立てにより生成されたｐＳＯ
Ｇ１９は、イントロン６配列、ＧＵＳ先導配列、ＤＨＦＲ遺伝子およびノパリン
シンターゼターミネーターと融合した状態で３５Ｓプロモーターを含む。ｐＳＯ
Ｇ１９におけるＧＵＳ先導配列をトウモロコシ・クロロティック・モトル・ウイ
ルス（Maize Chlorotic Mottle Virus、ＭＣＭＶ）からの先導配列により置き換
えると、ベクターｐＳＯＧ３５が生成された。ｐＳＯＧ１９およびｐＳＯＧ３５
は、アンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を担い、外来配列のクローニングに
利用可能なＨｉｎｄIII、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位を有する。

【０１１４】 実施例１１ 植物発現カセットの構築に関する必要条件 まず、トランスジェニック植物における発現を意図した遺伝子配列を、発現カ
セットにおいて適当なプロモーターの後および適当な転写ターミネーターの上流
に組立てる。

【０１１５】 プロモーター選択 発現カセットで使用されるプロモーターの選択により、トランスジェニック植
物における導入遺伝子の空間的および時間的発現パターンが決定される。選択さ
れたプロモーターは、特異的細胞型（例えば葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の表層
細胞）または特異的組織もしくは器官（例えば、根、葉または花）において導入
遺伝子を発現し、この選択は本発明ＤＮＡ分子の生合成の目的位置を反映する。
別法として、選択されたプロモーターは、光誘導または他の一時的調節プロモー
ター下において遺伝子の発現を駆動し得る。さらに別の方法では、選択されたプ
ロモーターを化学的に調節する。これは、所望され、また化学的誘導物質での処
理により誘発されたときのみ、ヌクレオチド配列の発現を誘導する可能性を提供
する。

【０１１６】 転写ターミネーター 様々な転写ターミネーターが発現カセットにおける使用に利用可能である。こ
れらは、導入遺伝子を越えた転写の終結およびその正確なポリアデニル化を担っ
ている。適当な転写ターミネーターは、植物で機能することが知られているもの
であり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ｔｍｌターミネーター、ノパリンシン
ターゼターミネーター、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターが含まれる。こ
れらは単子葉植物および双子葉植物の両方で使用され得る。

【０１１７】 発現の増強または調節を目的とする配列 多様な配列について、転写単位内からの遺伝子発現を増強することが見出され
ており、これらの配列をこの発明の遺伝子と連係的に使用することにより、トラ
ンスジェニック植物におけるそれらの発現を増加させることができる。

【０１１８】 様々なイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を高めることが
示された。例えば、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子のイントロンは、トウモロコシ
細胞に導入されたときその同族プロモーター下で野生型遺伝子の発現を著しく高
めることが見出された。イントロン１は、特に有効であることが見出されており
、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子との融合構築物にお
いて発現を高めた（Callisら、Genes Develop １：１１８３−１２００（１９８
７））。同じ実験システムにおいて、トウモロコシｂｒｏｎｚｅ１遺伝子からの
イントロンは、発現増強に関して類似した効果を有していた（Callisら、前出）
。イントロン配列は、植物形質転換ベクターへ、典型的には非翻訳先導配列内に
常用手順で組込まれた。

【０１１９】 ウイルスから誘導された若干の非翻訳先導配列もまた発現を高めることが知ら
れており、これらは双子葉植物細胞において特に有効である。具体的には、タバ
コ・モザイクウイルス（ＴＭＶ、「Ω−配列」）、トウモロコシ・クロロティッ
ク・モトル・ウイルス（ＭＣＭＶ）、およびアルファルファ・モザイクウイルス
（ＡＭＶ）からの先導配列は、発現を高めるのに有効であることが示された（例
、Gallieら、Nucl. Acids Res.１５：８６９３−８７１１（１９８７）、Skuzes
kiら、Plant Molec. Biol. １５：６５−７９（１９９０））。

【０１２０】 細胞内での遺伝子産物のターゲッティング 遺伝子産物をターゲッティングする様々な機構は植物に存在することが知られ
ており、これらの機構の機能を制御する配列についてはある程度詳細に特性確認
されている。例えば、葉緑体に対する遺伝子産物のターゲッティングは、様々な
タンパク質のアミノ末端先端部に見出されるシグナル配列により制御され、これ
は葉緑体移入中に開裂されることにより、成熟タンパク質を生じる（例、Comai
ら、J. Biol. Chem. ２６３：１５１０４−１５１０９（１９８８））。これら
のシグナル配列を異種遺伝子産物に融合すると、葉緑体への異種産物の移入が行
われ得る（van den Broeckら、Nature ３１３：３５８−３６３（１９８５））
。適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは、ＲＵＢＩＳＣＯタンパク質、ＣＡ
Ｂタンパク質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２タンパク質および葉緑体局在化
が知られている多くの他のタンパク質をコードするｃＤＮＡの５'末端から分離
され得る。

【０１２１】 他の遺伝子産物は、他の細胞小器官、例えばミトコンドリアおよびペルオキシ
ソームに局在化されている（例、Ungerら、Plant Molec. Biol. １３：４１１−
４１８（１９８９））。また、これらの産物をコードするｃＤＮＡを操作するこ
とにより、これらの細胞小器官に対する異種遺伝子産物のターゲッティングが行
われ得る。上記配列の例は、ミトコンドリアの場合核コード化アデノシントリホ
スファターゼおよび特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼイソ型であ
る。細胞タンパク粒へのターゲッティングは、Rogersらにより報告されている（
Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：６５１２−６５１６（１９８５））。

【０１２２】 さらに、他の細胞区画に対する遺伝子産物のターゲッティングを誘発する配列
が特性確認されている。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラストに対するターゲ
ッティング、およびアリューロン細胞からの細胞外分泌に関与する（Koehler &
Ho、Plant Cell ２：７６９−７８３（１９９０））。さらに、カルボキシ末端
配列と連係したアミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞ターゲッティングに関与す
る（Shinshiら、Plant Molec. Biol. １４：３５７−３６８（１９９０））。

【０１２３】 興味の対象である導入遺伝子配列への上記の適当なターゲッティング配列の融
合により、導入遺伝子産物を細胞小器官または細胞区画へ指向させることが可能
である。葉緑体ターゲッティングの場合、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡ
Ｂ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子またはＧＳ２遺伝子からの葉緑体シグナル
配列を、導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧへの枠で融合する。選択されたシグナル
配列は公知開裂部位を含むべきであり、構築される融合体は、開裂に要求される
開裂部位後のいずれかのアミノ酸を考慮に入れるべきである。場合によって、開
裂部位および導入遺伝子ＡＴＧ間に少数のアミノ酸を付加するかまたは別法とし
て導入遺伝子配列内で幾つかのアミノ酸を置換することにより、この必要条件は
達成され得る。葉緑体移入のために構築された融合体は、インビトロ転写構築物
のインビトロ翻訳による葉緑体摂取、次いでBartlettら（Edelmannら（編集）Me
thods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. １０８１−１０９１頁（
１９８２）、Wasmannら、Mol. Gen. Genet. ２０５：４４６−４５３（１９８６
））により報告された技術を用いるインビトロ葉緑体摂取の効率について試験さ
れ得る。これらの構築技術は当業界ではよく知られており、ミトコンドリアおよ
びペルオキシソームに等しく適用可能である。ターゲッティングの選択は殺虫剤
毒素についても必要とされ得る。これは通常細胞質ゾルまたは葉緑体であり得る
が、ミトコンドリアまたはペルオキシソームの場合もあり得る。ヌクレオチド配
列の発現はまた、ＥＲ、アポプラストまたは液胞へのターゲッティングを必要と
し得る。

【０１２４】 細胞ターゲッティングに関する上記機構は、それらの同族プロモーターと連係
的に利用されるだけでなく、異種プロモーターとも連係的に利用されることによ
り、ターゲッティングシグナルが誘導するプロモーターのとは異なる発現パター
ンを有するプロモーターの転写調節下において特異的細胞ターゲッティング目標
をもたらし得る。

【０１２５】 実施例１２ 発現カセット構築の実例 この発明は、プロモーターの起源とは関係無く、植物で発現可能なプロモータ
ーの調節下におけるＤＮＡ分子の発現を包含する。さらに、本発明は、ＤＮＡ分
子の発現について要求または選択されるさらに別の配列と連係させたあらゆる植
物発現性プロモーターの使用を包含する。上記配列には、転写ターミネーター、
発現を高める外来配列（例えばイントロン［例、Ａｄｈイントロン１］、ウイル
ス性配列［例、ＴＭＶ−Ω］）、および特異的細胞小器官および細胞区画に対す
る遺伝子産物のターゲッティングを意図した配列があるが、これらに限定はされ
ない。

【０１２６】 構成的発現：ＣａＭＶ ３５Ｓ プロモーター プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構築は、公開特許出願ＥＰ０３９２２２５に記
載されている。ｐＣＧＮ１７６１は、「二重」３５Ｓプロモーターおよびプロモ
ーターとターミネーター間に唯一のＥｃｏＲＩ部位をもつｔｍｌ転写ターミネー
ターを含み、ｐＵＣ型バックボーンを有する。既存のＥｃｏＲＩ部位に加えてＮ
ｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位を含む修飾ポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の
誘導体が構築される。この誘導体をｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと命名する。ｐＣＧ
Ｎ１７６１ＥＮＸは、トランスジェニック植物における３５Ｓプロモーターの制
御下での発現を目的とするポリリンカー内におけるｃＤＮＡ配列または遺伝子配
列（微生物ＯＲＦ配列を含む）のクローニングに有用である。かかる構築物の完
全３５Ｓプロモーター‐遺伝子配列‐ｔｍｌターミネーターカセットは、プロモ
ーターまでのＨｉｎｄIII、ＳｐｈＩ、ＳａIIおよびＸｂａＩ部位５'およびター
ミネーターまでのＸｂａＩ、ＢａｍＨＩおよびＢｇII部位３'により切除され、
形質転換ベクター、例えば上記実施例３５記載のベクターへ転移され得る。さら
に、二重３５Ｓプロモーターフラグメントは、ＨｉｎｄIII、ＳｐｈＩ、ＳａII
、ＸｂａＩまたはＰｓｔＩによる５'切除、およびポリリンカー制限部位（Ｅｃ
ｏＲＩ、ＮｏｔＩまたはＸｈｏＩ）のいずれかによる３'切除により除去され、
別のプロモーターにより置換され得る。

【０１２７】 翻訳開始部位の最適化によるｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸの修飾 この項に記載された構築物のいずれの場合でも、クローニング部位をめぐる修
飾が翻訳を高め得る配列の導入により為され得る。微生物から誘導された遺伝子
が植物発現カセットへ導入されるとき、これらの遺伝子は植物における翻訳開始
に好適であり得るそれらの開始メチオニンに隣接する配列を含み得ないため、こ
れは特に有用である。微生物から誘導された遺伝子が植物発現カセットへそれら
のＡＴＧにおいてクローン化される場合、それらの挿入部位を修飾することによ
り、それらの発現を最適化することは有用であり得る。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ
の修飾が例として記載されており、植物発現に関して最適化された幾つかの配列
の１つが組込まれている（例、Joshi、前出）。

【０１２８】 化学的に調節可能なプロモーター下における発現 この項では、選択されたいずれかのプロモーターによる、ｐＣＧＮ１７６１Ｅ
ＮＸにおける二重３５Ｓプロモーターの置換について記載する。例として、化学
的に調節されたＰＲ−１ａプロモーターについて記載する。選択されたプロモー
ターは、好ましくは制限酵素によりその供給源から切除されるが、別法として適
当な末端制限部位を担うプライマーを用いてＰＣＲ−増幅され得る。ＰＣＲ増幅
が行われる場合、プロモーターを再配列決定することにより、標的ベクターにお
いて増幅されたプロモーターのクローニング後の増幅誤差をチェックするべきで
ある。化学的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモーターは、プラスミドｐＣＩ
Ｂ００４（ＥＰ０３３２１０４、構築について実施例２１参照）から開裂され、
プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸへ転移される。ｐＣＩＢ１００４をＮｃｏＩ
で開裂し、生成した線形化フラグメントの３'オーバーハングをＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼ処理により平滑にする。次いで、フラグメントをＨｉｎｄIIIにより開
裂し、生成したＰＲ−１ａプロモーター含有フラグメントをゲル精製し、二重３
５Ｓプロモーターが除去されたｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸへクローン化する。これ
はＸｈｏＩによる開裂およびＴ４ポリメラーゼによる平滑化により行われ、次い
でＨｉｎｄIIIにより開裂し、ｐＣＩＢ１００４プロモーターフラグメントがク
ローン化される大型ベクター‐ターミネーター含有フラグメントを分離する。こ
れにより、ＰＲ−１ａプロモーターおよびｔｍｌターミネーターおよび特有なＥ
ｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位を伴う介在ポリリンカーをもつｐＣＧＮ１７６１Ｅ
ＮＸ誘導体が生成される。この発明のＤＮＡ分子はこのベクターに挿入され得、
それに続いて融合産物（すなわちプロモーター‐遺伝子‐ターミネーター）は、
この明細書に記載されたものを含む、いずれかの選択された形質転換ベクターへ
転移され得る。

【０１２９】 構成的発現：アクチンプロモーター アクチンの幾つかのイソ型は、ほとんどの細胞型で発現されることが知られて
いるため、アクチンプロモーターは構成的プロモーターにとって良い選択である
。特に、イネＡｃｔ１遺伝子からのプロモーターは、既にクローン化され、特性
確認されている（McElroyら、Plant Cell ２：１６３−１７１（１９９０））。
プロモーターの１.３ｋｂは、イネのプロトプラストにおける発現に必要とされ
る調節エレメントを全て含むことが見出された。さらに、Ａｃｔ１プロモーター
に基く多様な発現ベクターが、具体的には単子葉植物で使用するために構築され
た（McElroyら、Mol. Gen. Genet. ２３１：１５０−１６０（１９９１））。こ
れらは、Ａｃｔ１−イントロン１、Ａｄｈ１ ５'フランキング配列およびＡｄｈ
１−イントロン１（トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から）およ
びＣａＭＶ３５Ｓプロモーターからの配列を組込んでいる。最高の発現を呈する
ベクターは、３５ＳおよびＡｃｔ１イントロンまたはＡｃｔ１ ５'フランキング
配列およびＡｃｔ１イントロンの融合体である。開始ＡＴＧ（ＧＵＳリポーター
遺伝子の）をめぐる配列を最適化しても、発現は高められた。McElroyらにより
報告された（Mol. Gen. Genet. ２３１：１５０−１６０（１９９１））プロモ
ーター発現カセットは、この発明のＤＮＡ分子を発現させるために容易に修飾さ
れ得、単子葉植物宿主における使用に特に適している。例えば、プロモーター含
有フラグメントを McElroy 構築物から除去して用いることにより、ｐＣＧＮ１
７６１ＥＮＸにおける二重３５Ｓプロモーターと置換され得、次に、これは特異
的遺伝子配列の挿入に利用され得る。次いで、こうして構築された融合遺伝子は
、適当な形質転換ベクターへ転移され得る。別の報告では、イネＡｃｔ１プロモ
ーターはまた、その最初のイントロンを伴い、培養された大麦細胞で高度発現を
指令することが見出された（Chibbarら、Plant Cell Rep. １２：５０６−５０
９（１９９３））。

【０１３０】 構成的発現：ユビキチンプロモーター ユビキチンは、多くの細胞型で蓄積することが知られている別の遺伝子産物で
あり、そのプロモーターは、トランスジェニック植物で用いられる幾つかの種か
らクローン化されている（例、ヒマワリ‐ Binetら、Plant Science ７９：８７
−９４（１９９１）、トウモロコシ- Christensenら、Plant Molec. Biol.６１
９−６３２（１９８９））。トウモロコシのユビキチンプロモーターは、トラン
スジェニック単子葉植物系で発現され、単子葉植物形質転換用に構築されたその
配列およびベクターは、特許公開ＥＰ０３４２９２６に開示されている。さらに
、Taylorら（Plant Cell Rep.１２：４９１−４９５（１９９３））は、トウモ
ロコシユビキチンプロモーターおよび最初のイントロンを含むベクター（ｐＡＨ
Ｃ２５）およびマイクロプロジェクティル衝撃により導入されたときの多様な単
子葉植物の細胞懸濁液におけるその高い活性について報告している。ユビキチン
プロモーターは、トランスジェニック植物、特に単子葉植物における本発明ＤＮ
Ａ分子の発現に明らかに適している。適当なベクターは、ｐＡＨＣ２５の誘導体
またはこの明細書に記載されている形質転換ベクターのいずれかであり、適当な
ユビキチンプロモーターおよび／またはイントロン配列の導入により修飾されて
いる。

【０１３１】 根の特異的発現 この発明のヌクレオチド配列にとって好ましい発現パターンは、根の発現であ
る。根の発現は、土壌伝播性真菌病原体の制御に特に有用である。適当な根のプ
ロモーターは、de Framond（FEBS ２９０：１０３−１０６（１９９１））によ
り報告されたものであり、公開特許出願ＥＰ０４５２２６９にも記載されている
。このプロモーターは、ヌクレオチド配列の挿入およびそれに続く興味の対象で
ある形質転換ベクターへのプロモーター‐遺伝子‐ターミネーターカセット全体
の転移に適したベクター、例えばｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸに導入される。

【０１３２】 傷害誘導性プロモーター 傷害誘導性プロモーターは一般に傷害誘導に対してだけでなく、植物病原体感
染部位に対しても活性を呈するため、それらはこの発明のＤＮＡ分子の発現に特
に適している。多様な上記プロモーターが報告されており（例、Xuら、Plant Mo
lec. Biol. ２２：５７３−５８８（１９９３）、Logemannら、Plant Cell １：
１５１−１５８（１９８９）、Rohrmeier & Lehle、Plant Molec. Biol. ２２：
７８３−７９２（１９９３）、Firekら、Plant Molec. Biol. ２２：１２９−１
４２（１９９３）、Warnerら、Plant J. ３：１９１−２０１（１９９３））、
全てこの発明での使用に適している。Logemannら（前出）は、双子葉植物ジャガ
イモｗｕｎ１遺伝子の５'上流配列について報告している。Xuら（前出）は、双
子葉植物ジャガイモ（ｐｉｎ２）からの傷害誘導性プロモーターが単子葉植物イ
ネに活性を呈することを示した。さらに、Rohrmeier & Lehle（前出）は、傷害
誘導性であり、標準技術を用いることにより同族プロモーターの分離に使用され
得るトウモロコシＷｉｐ１ ｃＤＮＡのクローニングについて報告している。同
様に、Firekら（前出）およびWarnerら（前出）は、局所損傷および病原体侵入
部位で発現される単子葉植物アスパラグス・オフィシナリス（Asparagus offici
nalis）からの傷害誘導性遺伝子について報告している。当業界で公知のクロー
ニング技術を用いることにより、これらのプロモーターは適当なベクターへ導入
され、この発明のＤＮＡ分子に融合され、植物病原体感染部位でこれらの遺伝子
を発現させるのに使用され得る。

【０１３３】 髄優先的発現 特許出願ＷＯ９３／０７２７８（チバ‐ガイギによる）は、髄細胞で優先的に
発現されるトウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の分離について報告している。転写起点
から‐１７２６まで伸びる遺伝子配列およびプロモーターが提示されている。標
準分子生物学的技術を用いることにより、このプロモーターまたはその一部はベ
クター、例えばｐＣＧＮ１７６１へ導入され得、そこで３５Ｓプロモーターと置
換され、髄優先的方法で本発明ＤＮＡ分子の発現を駆動するのに使用され得る。
事実、髄優先的プロモーターまたはその一部を含むフラグメントは、いずれのベ
クターにでも導入され、トランスジェニック植物において有用となるように修飾
され得る。

【０１３４】 花粉特異的発現 さらに特許出願ＷＯ９３／０７２７８（チバ‐ガイギによる）は、花粉細胞で
発現されるトウモロコシのカルシウム依存性プロテインキナーゼ（ＣＤＰＫ）遺
伝子の分離について報告している。遺伝子配列およびプロモーターは、転写起点
から１４００ｂｐまで伸長している。標準的分子生物学技術を用いることにより
、このプロモーターまたはその一部は、ベクター、例えばｐＣＧＮ１７６１へ導
入され得、そこでそれは３５Ｓプロモーターと置き換わり、この発明のＤＮＡ分
子の発現を駆動するのに使用され得る。事実、花粉特異的プロモーターまたはそ
の一部を含むフラグメントは、いずれのベクターにでも導入され、トランスジェ
ニック植物において有用となるように修飾され得る。

【０１３５】 葉特異的発現 ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコードするトウモロコシ遺伝
子については、Hudspeth & Grula（Plant Molec Biol.１２：５７９−５８９（
１９８９））により報告されている。標準的分子生物学技術を用いて、この遺伝
子におけるプロモーターを使用することにより、トランスジェニック植物におい
て葉特異的方法での遺伝子発現が駆動され得る。

【０１３６】 葉緑体ターゲッティングを伴う発現 Chen & Jagendorf（J. Biol. Chem. ２６８：２３６３−２３６７（１９９３
））は、異種導入遺伝子の移入を目的とする葉緑体トランジット（一時）ペプチ
ドの有効利用について報告している。使用されるこのペプチドは、ニコチアナ・
プルムバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）由来のｒｂｃＳ遺伝子か
らのトランジットペプチドである（Poulsenら、Mol. Gen. Genet. ２０５：１９
３−２００（１９８６））。制限酵素ＤｒａＩおよびＳｐｈＩ、またはＴｓｐ５
０９ＩおよびＳｐｈＩを用いることにより、このトランジットペプチドをコード
するＤＮＡ配列は、プラスミドｐｒｂｃＳ−８Ｂから切除され（Poulsenら、前
出）、上記構築物のいずれかで使用されるように操作され得る。ＤｒａＩ−Ｓｐ
ｈＩフラグメントは、開始ｒｂｃＳ ＡＴＧに対して‐５８から、移入開裂部位
直後の成熟ペプチドの第１アミノ酸（同じくメチオニン）を含めてそこまで伸長
し、Ｔｓｐ５０９Ｉ−ＳｐｈＩフラグメントは、開始ｒｂｃＳ ＡＴＧに対して
−８から、成熟ペプチドの第１アミノ酸を含めてそこまで伸長している。すなわ
ち、これらのフラグメントは、いずれかの選択された発現カセットのポリリンカ
ーへ好適に挿入されることにより、選択されたプロモーター（例、３５Ｓ、ＰＲ
−１ａ、アクチン、ユビキチンなど）の非翻訳先導配列への転写融合体を生成し
得、トランジットペプチドの正確な融合下流においてこの発明のＤＮＡ分子を挿
入させ得る。この種の構築物は、当業界では常用されている。例えば、ＤｒａＩ
末端が既に平滑である場合、５' Ｔｓｐ５０９Ｉ部位はＴ４ポリメラーゼ処理に
より平滑にされ得るか、または別法としてリンカーまたはアダプター配列に連結
されることにより、選択されたプロモーターへのその融合を容易にし得る。３'
ＳｐｈＩ部位は、それ自体維持され得るか、または別法としてリンカー配列のア
ダプターへ連結されることにより、後続の本発明ＤＮＡ分子の挿入に適した制限
部位を利用可能にするような形で選択されたベクターへのその挿入を容易にし得
る。理想的には、ＳｐｈＩ部位のＡＴＧは維持されており、この発明のＤＮＡ分
子の第１ＡＴＧを含む。Chen & Jagendorf（前出）は、葉緑体移入にとって理想
的な開裂のための共通配列を提供しており、どの場合でも、メチオニンは成熟タ
ンパク質の第１位にあるのが好ましい。それに続く位置ではそれ以上の変異があ
り、アミノ酸はそれほど重大ではない場合もあり得る。いずれの場合でも、融合
構築物は、Bartlettら（Edelmannら（編）Methods in Chloroplast Molecular B
iology, Elsebier. １０８１−１０９１頁（１９８２））および Wasmann ら（M
ol. Gen. Genet. ２０５：４４６−４５３（１９８６））により報告された方法
を用いることにより、インビトロ移入効率について評価され得る。一般的には、
最善の方法は、アミノ末端に全く修飾を加えないでこの発明のＤＮＡ分子を用い
て融合体を生成すること、および上記融合体が高い効率で葉緑体移入されていな
いことが明らかであるときのみ修飾を加えるだけにすることであり得、この場合
修飾は確立された文献に従い為され得る（Chen & Jagendorf、前出、Wasmanら、
前出、Ko & Ko、J. Biol. Chem. ２６７：１３９１０−１３９１６（１９９２）
）。

【０１３７】 似た操作を行うことにより、他の供給源（単子葉植物および双子葉植物）から
および他の遺伝子からの配列をコードする他のＧＳ２葉緑体トランジットペプチ
ドを利用することができる。さらに、似た方法に従うことにより、他の細胞レベ
ル下区画、例えばミトコンドリアに対するターゲッティングも達成され得る。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 レスリー・ジーン・ストローン アメリカ合衆国27713ノースカロライナ州 ダーラム、ダンジー・サークル32番、アパ ートメント・エヌ (72)発明者 キャサリン・メイ・クレイマー アメリカ合衆国27278ノースカロライナ州 ヒルズバーロウ、キャロル・レイン6835番 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 4B024 AA08 BA80 CA04 CA06 DA01 DA06 EA01 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA58X AA89X AA89Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA53 4H045 AA11 BA10 CA32 DA86 EA05 FA74

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｍｌｏタンパク質をコードするＤＮＡ分子であって、Ｍｌｏ
   タンパク質が、配列番号１または配列番号２に示された配列の少なくとも１つを
   含み、Ｍｌｏタンパク質が真菌病原体に対する耐性を植物に付与するものである
   、分子。
2. 【請求項２】 ＤＮＡ分子が配列番号３、配列番号５または配列番号７に示
   されたヌクレオチド配列のいずれか１つと同一または実質的に類似しているか、
   または配列番号４、配列番号６または配列番号８に示されたＭｌｏタンパク質と
   同一または実質的に類似したＭｌｏタンパク質をコードする、請求項１記載のＤ
   ＮＡ分子。
3. 【請求項３】 ＤＮＡ分子が配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配
   列番号１５または配列番号１７に示されたヌクレオチド配列のいずれか１つと同
   一または実質的に類似しているか、または配列番号１０、配列番号１２、配列番
   号１４、配列番号１６または配列番号１８に示されたＭｌｏタンパク質と同一ま
   たは実質的に類似したＭｌｏタンパク質をコードする、請求項１記載のＤＮＡ分
   子。
4. 【請求項４】 ＤＮＡ分子が大麦から誘導されたものではない、請求項１〜
   ３のいずれか１項記載のＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 内在性タンパク質の活性が失われるようにＤＮＡが修飾され
   ている、請求項１〜４のいずれか１項記載のＤＮＡ分子。
6. 【請求項６】 ＤＮＡ修飾の結果、対応するタンパク質のアミノ酸配列にお
   ける次の変化、すなわち −Ｔｒｐ（１６３）からＡｒｇへ、 −Ｐｒｏ（３９６）の後のフレームシフト、 −Ｔｒｐ（１６０）の後のフレームシフト、 −Ｍｅｔ（１）からＩｌｅへ、 −Ｇｌｙ（２２７）からＡｓｐへ、 −Ｍｅｔ（１）からＶａｌへ、 −Ａｒｇ（１１）からＴｒｐへ、 −Ｐｈｅ（１８３）、Ｔｈｒ（１８４）欠落、 −Ｖａｌ（３１）からＧｌｕへ −Ｓｅｒ（３２）からＰｈｅへ −Ｌｅｕ（２７１）からＨｉｓへ といった変化の１つ、全部または組み合わせがもたらされる、請求項５記載のＤ
   ＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項のＤＮＡ分子に対してアンチセ
   ンスであるＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 配列番号１または配列番号２に示された配列の少なくとも１
   つを含むタンパク質であって、タンパク質がＭｌｏタンパク質であり、植物に真
   菌病原体に対する耐性を付与する、タンパク質。
9. 【請求項９】 タンパク質が、配列番号３、配列番号５または配列番号７に
   示された配列のいずれか１つと同一または実質的に類似しているヌクレオチド配
   列によりコードされるか、または配列番号４、配列番号６または配列番号８に示
   されたタンパク質のいずれか１つと同一または実質的に類似している、請求項８
   記載のタンパク質。
10. 【請求項１０】 タンパク質が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３
    、配列番号１５または配列番号１７に示された配列のいずれか１つと同一または
    実質的に類似したヌクレオチド配列によりコードされるか、または配列番号１０
    、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に示されたタ
    ンパク質のいずれか１つと同一または実質的に類似している、請求項８記載のタ
    ンパク質。
11. 【請求項１１】 タンパク質が大麦から誘導されたものではない、請求項８
    〜１０のいずれか１項記載のタンパク質。
12. 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を含む発現
    カセット。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載のＤＮＡ分子を含む発現カセットを含むベ
    クター。
14. 【請求項１４】 請求項１〜７のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を含む発現
    カセットまたはそれの一部を含む細胞であって、発現カセット中のＤＮＡ分子が
    その細胞において発現可能である、細胞。
15. 【請求項１５】 ＤＮＡ分子が細胞のゲノムに安定して組込まれている、請
    求項１４記載の細胞。
16. 【請求項１６】 細胞が植物細胞である、請求項１４または１５のいずれか
    １項記載の細胞。
17. 【請求項１７】 請求項１〜７のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を含む発現
    カセットまたはそれの一部を含む植物であって、発現カセット中のＤＮＡ分子が
    その植物において発現可能である、植物。
18. 【請求項１８】 ＤＮＡ分子が植物の植物ゲノムに安定して組込まれている
    、請求項１７記載の植物。
19. 【請求項１９】 請求項１〜７のいずれか１項記載の分離されたＤＮＡ分子
    を含む植物を含む農産物であって、改善された植物衛生特性を有する農産物。
20. 【請求項２０】 ａ）「センス」配向で請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を植物に
    おいて発現させるか、または ｂ）「アンチセンス」配向で請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子を
    植物において発現させるか、または ｃ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子に対応する内在性遺伝子に
    よりコードされるメッセンジャーＲＮＡ転写物を特異的に開裂し得るリボザイム
    を植物において発現させるか、または ｄ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子によりコードされるタンパ
    ク質またはタンパク質の一部に特異的に指向されたアプタマーを植物において発
    現させるか、または ｅ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子の突然変異または先端切除
    形態を植物において発現させるか、または ｆ）請求項１〜６のいずれか１項記載のＤＮＡ分子に対応する遺伝子の少なく
    とも１つの染色体コピーを植物において相同的組換えにより修飾する という段階を含む、真菌病原体に対して植物を耐性にする方法。
21. 【請求項２１】 請求項２０記載の方法により真菌病原体に対して耐性にさ
    れた植物。
22. 【請求項２２】 真菌病原体が生きている表皮細胞に感染する、請求項２１
    記載の植物。
23. 【請求項２３】 真菌病原体がエリシファレス（Erysiphales）目に由来す
    るものである、請求項２１記載の植物。
24. 【請求項２４】 真菌病原体がエリシフェ（Erysiphe）属に由来するもので
    ある、請求項２１記載の植物。
25. 【請求項２５】 真菌病原体がエリシフェ・グラミニス（Erysiphe gramini
    s）である、請求項２１記載の植物。
26. 【請求項２６】 請求項２０記載の方法を用いて得られる改善された植物衛
    生特性を有する農産物。
27. 【請求項２７】 Ｍｌｏタンパク質をコードするＤＮＡ分子の分離方法であ
    って、 ａ）配列番号１の少なくとも６個のアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオ
    チドおよび配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸をコードする配列に相補的な
    縮重オリゴヌクレオチドを、上記ＤＮＡと上記縮重オリゴヌクレオチドとのハイ
    ブリダイゼーションを可能にする条件下で植物から抽出されたＤＮＡと混合し、
    そして ｂ）植物ＤＮＡのＤＮＡフラグメントであって、段階ａ）における縮重オリゴ
    ヌクレオチドにアニーリングし得るヌクレオチド配列をその左および右端に含む
    ＤＮＡフラグメントを増幅し、そして ｃ）段階ｂ）のＤＮＡフラグメントを含む完全長ｃＤＮＡクローンを得る 段階を含む方法。
28. 【請求項２８】 ＤＮＡ分子が所望のサイズを有する２本鎖ランダムフラグ
    メントに開裂されており、 ａ）生成された２本鎖ランダムフラグメントの集団に、２本鎖鋳型ポリヌクレ
    オチドとの同一性を有する領域およびそれとの非相同性を有する領域を含むオリ
    ゴヌクレオチドである、１つまたはそれ以上の１本または２本鎖オリゴヌクレオ
    チドを付加し、 ｂ）生成した２本鎖ランダムフラグメントおよびオリゴヌクレオチドから成る
    混合物を１本鎖フラグメントに変性させ、 ｃ）生成した１本鎖フラグメントの集団とポリメラーゼを、１本鎖フラグメン
    トの同一性領域であって、対の一員が他方の複製をプライミングするのに十分で
    ある同一性領域におけるアニーリングを誘導することにより、アニーリングされ
    たフラグメントの対が形成される条件下、インキュベーションすることにより、
    突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドが形成され、そして ｄ）さらに少なくとも２周期について第２および第３段階を反復し、この場合
    、さらなる周期の第２段階において生成した混合物がその前周期の第３段階から
    の突然変異誘発２本鎖ポリヌクレオチドを含み、さらなる周期がさらに突然変異
    誘発２本鎖ポリヌクレオチドを形成する、 段階を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子の突然変異誘発方法。