ES2317652T3 - Polinucleotido y su utilizacion para modular una respuesta de defensa en las plantas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA CLONACION DEL GEN MLO DE BARLEY, DE MUTANTES MLO Y HOMOLOGOS DE OTRAS ESPECIES, COMPRENDIENDO EL ARROZ Y ARABIDOPSIS THALIANA, LA CUAL PERMITE LA MANIPULACION DE RESPUESTAS DEFENSIVAS FRENTE A PATOGENOS EN PLANTAS. SE EMPLEAN ACIDO NUCLEICO Y POLIPEPTIDOS EN LA PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS EN LAS CUALES LA RESPUESTA DEFENSIVA FRENTE A PATOGENOS ESTA MODULADA, PARTICULARMENTE ESTIMULADA. DIVERSOS ENSAYOS PERMITEN LA DETERMINACION DIAGNOSTICA DE LA PRESENCIA DE ALELOS DE RESISTENCIA O SUSCEPTIBILIDAD EN PLANTAS. LOS COMPUESTOS QUE PERMITEN MODULAR UNA RESPUESTA DEFENSIVA MEDIANTE INTERACCION CON LA PROTEINA MLO O MLO, PUEDEN IDENTIFICARSE MEDIANTE ANALISIS QUE IMPLICAN A DICHA PROTEINA O A FRAGMENTOS DE LA MISMA.

Description

Polinucleótido y su utilización para modular una respuesta de defensa en las plantas.

La presente invención se refiere a la estimulación de una respuesta de defensa en las plantas, con objeto de proporcionar a las plantas una mejorada resistencia al agente patógeno. Más específicamente, ha resultado a partir de la clonación del gen Mlo de la cebada, de los diversos alelos mlo mutantes, y de un número de homólogos de diferentes especies. El gen Mlo se ha aislado utilizando un enfoque de clonación posicional que nunca se ha logrado previamente con la cebada. Los detalles y el debate se proporcionan a continuación. El Mlo en estado natural ejerce una función reguladora negativa en una respuesta de defensa al agente patógeno, de manera que los mutantes exhiben una respuesta de defensa en la ausencia de agente patógeno. Según la presente invención, se puede utilizar la regulación por disminución o la eliminación por competencia de la función Mlo para estimular una respuesta de defensa en las plantas transgénicas, que confiere una resistencia creciente al agente patógeno.

Las mutaciones se han descrito en diversas plantas en las que las respuestas de defensa a los agentes patógenos aparecen para expresarse constitutivamente. Los alelos recesivos de mutación inducida (mlo) del locus Mlo de la cebada exponen un fenotipo de lesión de hoja y confieren una resistencia de amplio espectro, aparentemente durable, al agente patógeno oidio, Erysiphe graminis f sp hordei.

Las respuestas de la resistencia al agente patógeno oidio han estado genéticamente bien caracterizadas (Wiberg, 1974; Søgaard y Jørgensen, 1988; Jørgensen, 1994). En la mayoría de los casos analizados la resistencia se especifica por los genes de resistencia raza-específica siguiendo las reglas de la hipótesis del gen a gen de Flor (Flor, 1971). En este tipo de interacción planta/agente patógeno, la resistencia se especifica por medio de y dependiendo de la presencia de dos genes complementarios, uno del huésped y uno del agente patógeno fúngico. Los genes complementarios se han llamado operacionalmente (agente patógeno) gen resistencia ("R") y gen virulencia, respectivamente. La mayor parte de los genes de resistencia al oidio (Mlx) actúan con rasgos dominantes o semidominantes (Jørgensen, 1994).

La resistencia monogénica lograda mediante los alelos recesivos (Mlo) del locus Mlo es diferente. Aparte de ser recesiva, difiere desde la resistencia raza-específica hasta una sola cepa del agente patógeno en que (i) confiere resistencia de amplio espectro a casi todos los aislados conocidos del agente patógeno, (ii) los alelos de resistencia Mlo se han obtenido mediante tratamiento mutágeno de cualquier variedad en estado natural (Mlo) susceptible probada, y (iii) los alelos de resistencia Mlo exhiben un fenotipo mímico de defensa en ausencia del agente patógeno (Wolter et al., 1993). De este modo, los datos genéticos indican que el alelo Mlo en estado natural ejerce una función reguladora negativa en las respuestas de defensa al ataque del agente patógeno.

La resistencia mediada por los alelos Mlo es actualmente utilizada ampliamente en el cultivo de la cebada y unos 10 millones de hectáreas estimadas se plantan anualmente en Europa con las semillas de este genotipo. Una resistencia al oidio heredada semejante al mlo en otras plantas del cereal no se ha divulgado hasta ahora aunque el hongo sea un patógeno relevante en el trigo (atacado por la Erysiphe graminis f sp tritici), la avena (atacada por la Erysiphe graminis f sp avenae), y el centeno (atacado por la Erysiphe graminis f sp secalis). Dado que los cereales se relacionan altamente morfológicamente, genéticamente y bioquímicamente entre sí (Moore et al., 1995), uno predeciría la existencia de genes homólogos en estas especies. El hecho de no haber encontrado una resistencia semejante al mlo en el trigo ni en la avena es debido probablemente a sus genomas hexaploides, que hace difícil obtener por mutagénesis los alelos defectuosos en las seis copias del gen, y la ocasión de que todas las mutaciones tengan lugar en la naturaleza es remota. El hecho de no haber encontrado un mlo equivalente en otros cereales es debido probablemente a la insignificante cantidad de análisis mutacional en estas especies y las complicaciones como resultado de su naturaleza outbreeding (por ejemplo, el centeno).

Los marcadores RFLP enlazados de cerca al Mlo en el cromosoma 4 de la cebada se identificaron previamente partiendo de la base de una línea de colecciones de retrocruzamiento del mlo que contenía alelos mlo a partir de seis fondos genéticos (Hinze et al., 1991). La posición del mapa de Mlo partiendo de la base de los marcadores RFLP concordaba con su localización cromosómica tal y como se determinó mediante un trazado anterior con los marcadores morfológicos (Jorgensen, 1977).

Teniendo identificado un intervalo genético de \sim3 cM que contiene Mlo limitado con marcadores genéticos, decidimos intentar aislar el gen por medio de la clonación posicional.

Sin embargo, no existe ejemplo documentado de una tentativa positiva de la clonación posicional de un gen de la cebada. Tuvimos que hacer frente a un número de dificultades.

En primer lugar, el genoma de la cebada (5,3 x 10^{9} pb/haploide de equivalente del genoma; Bennett y Smith, 1991) tiene casi el doble de tamaño del genoma humano y dado que el mapa genético total cubre \sim1,800 cM (Becker et al., 1995) nos enfrentamos con un ratio muy desfavorable de distancias genéticas y físicas (1 cM se corresponde con \sim3 Mb).

En segundo lugar, se tuvo que construir un mapa genético de alta resolución alrededor del Mlo permitiendo la colocación de marcadores ligados con una precisión superior a 0,1 cM.

En tercer lugar, nos propusimos delimitar físicamente el gen objetivo y ambos marcadores flanqueantes del ADN en clones genómicos individuales de insertos grandes, un procedimiento calificado más adelante como "aterrizaje cromosómico" (Tanksley et al., 1995). Con este propósito, una completa biblioteca de YAC de la cebada del ADN de la Megabase de la cebada se tuvo que construir con un tamaño medio de insertos de 500 - 600 kb, que no tenía precedente.

En cuarto lugar, tuvimos que preparar herramientas genéticas inusuales que nos permitieron identificar el gen Mlo dentro de una región delimitada físicamente sin la necesidad de una generación arrolladora de tiempo de plantas transgénicas de la cebada y de pruebas con diversos genes del candidato. Utilizamos para nuestros estudios diez mutantes mlo inducidos mediante radiación o químicamente (Jørgensen, 1992). Para una cadena concluyente de la evidencia del aislamiento del gen decidíamos depender de una restauración funcional del alelo Mlo en estado natural que partía de los alelos mlo defectuosos caracterizados. Con este fin, realizamos cruzamientos heteroalélicos de mlo y aislamos recombinantes Mlo intragénicos susceptibles. El análisis de la secuencia de éstos prueba la función del gen descrito.

La clonación del gen Mlo de la cebada y sus homólogos, incluyendo los homólogos de otras especies de plantas, da lugar a un número de prácticas aplicaciones, reflejadas en los diversos aspectos de la presente invención.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado según lo precisado en la Reivindicación 1. Una molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido con la función Mlo. Los expertos en la técnica apreciarán que la "Función Mlo" se refiere a la capacidad de reprimir una respuesta de defensa, siendo dicha respuesta de defensa independiente de la raza y/o el agente patógeno y siendo autónoma de la presencia de un agente patógeno tal como, por ejemplo, el gen Mlo de la cebada, el gen Acd y el gen Lsd de la Arabidopsis.

Las mutaciones mlo que regulan por disminución o interrumpen la expresión funcional de la secuencia Mlo en estado natural son recesivas, de tal manera que son complementados por la expresión de una secuencia en estado natural. De este modo, la "función Mlo" se puede determinar calculando el nivel de respuesta de defensa constitutiva y/o la susceptibilidad de la planta a un agente patógeno tal como, por ejemplo, el oidio o la roya (por ejemplo, la roya amarilla). Por consiguiente, una posible secuencia de nucleótidos con la función Mlo se puede probar sobre la complementación de un mutante mlo adecuado. El término "función mlo" se utiliza para hacer referencia a las secuencias que confieren un fenotipo de mutante mlo en una planta.

La capitalización de "Mlo" y la no capitalización de "mlo" se utilizan de este modo para distinguir entre la función "en estado natural" y la función "mutante".

Un fenotipo del mutante mlo se caracteriza por la exposición de una creciente resistencia contra uno o más agentes patógenos, que es independiente de la raza y/o el agente patógeno y es autónoma de la presencia de un agente patógeno.

La planta de prueba puede ser monocotiledónea o dicotiledónea. Las monocotiledóneas adecuadas incluyen a cualquiera de la cebada, el arroz, el trigo, el maíz o la avena, particularmente de la cebada. Las dicotiledóneas adecuadas incluyen a la Arabidopsis.

El ácido nucleico puede codificar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2, o un alelo, variante, derivado o mutante, o un homólogo, del mismo.

El ácido nucleico puede tener la secuencia de un gen Mlo de la cebada, o ser un mutante, variante (o derivado) o alelo de la secuencia proporcionada, o un homólogo del mismo. Los mutantes, variantes y alelos preferidos son los que codifican una secuencia que conserve una característica funcional del gen en estado natural, especialmente la capacidad de suprimir una respuesta de defensa según lo discutido en la presente invención. Otros mutantes, variantes y alelos preferidos codifican una secuencia que, en un homozigoto, provocan la activación constitutiva de una respuesta de defensa, o al menos promueven la activación de una respuesta de defensa (es decir, es una secuencia del mutante mlo), por ejemplo, reduciendo o suprimiendo por completo o en parte la función Mlo. Las mutaciones preferidas que dan secuencias del mutante mlo se representan en la Tabla 1. Los cambios de una secuencia, para producir un mutante, derivado o variante, pueden ser tanto por la adición, como por la inserción, la cancelación o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ácido nucleico, llevando a la adición, la inserción, la cancelación y/o la substitución de uno o más aminoácidos. Por supuesto, se incluyen los cambios al ácido nucleico que no hace diferenciar a la secuencia de aminoácidos codificada. Las variantes, los mutantes, los alelos y los derivados particulares se discuten además a continuación, así como sus homólogos.

Una secuencia preferida de ácido nucleico según un aspecto de la presente invención se representa en la Figura 2 junto con la secuencia de aminoácidos prevista. El ácido nucleico puede estar sometido a alteración por la substitución de nucleótidos y/o una combinación de adición, inserción y/o substitución de uno o más nucleótidos con o sin la alteración de la secuencia de aminoácidos codificada (en virtud de la degeneración del código genético).

Tal y como se discute posteriormente, los homólogos de la secuencia Mlo representados en la Figura 2, pueden incluir desde el arroz (secuencia genómica en la Figura 5, resultado final, secuencia ADNc en la Figura 10, secuencia de aminoácidos en la Figura 13) y la cebada (secuencia genómica en la Figura 6, resultado final, secuencia ADNc en la Figura 11, secuencia de aminoácidos en la Figura 14); también la Tabla 5B (secuencias de nucleótido) y la Figura 5A (secuencias de aminoácido) representan los homólogos de las EST del arroz y la Arabidopsis.

Un vector puede comprender el ácido nucleico con cualquiera de las secuencias proporcionadas, preferentemente un vector del que un producto se pueda expresar. El vector es preferentemente adecuado para la transformación en una célula de planta y/o una célula microbiana. La presente invención engloba además una célula huésped transformada con dicho vector, especialmente una célula de planta o una célula microbiana (por ejemplo, la Agrobacterium tumefaciens). De este modo, se proporciona una célula huésped, tal como una célula de planta, que comprende ácido nucleico. Dentro de la célula, el ácido nucleico se puede incorporar dentro del genoma nuclear, es decir, un cromosoma. Puede haber más de una secuencia de nucleótidos heteróloga por el genoma haploide.

Un vector que comprende ácido nucleico no necesita incluir a un promotor, particularmente si el vector va a ser utilizado para introducir el ácido nucleico en las células para la recombinación en el genoma.

Las moléculas y los vectores del ácido nucleico se pueden proporcionar en forma aislada y/o purificada de su ambiente natural, en forma substancialmente pura u homogénea, o libre o substancialmente libre de ácido nucleico o genes de la especie de interés u origen diferente de la secuencia relevante. El ácido nucleico puede comprender el ADNc, el ARN, el ADN genómico y puede ser totalmente o parcialmente sintético. El término "aislado" puede englobar todas estas posibilidades.

El producto de la expresión de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas se puede producir por la expresión desde la codificación, por lo tanto, de ácido nucleico en condiciones adecuadas en las células huésped adecuadamente, por ejemplo, la E. coli. Los expertos en la técnica pueden ser bien capaces de construir vectores y diseñar protocolos para la expresión y la recuperación de productos de la expresión del gen recombinante. Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo una o más secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias del promotor, fragmentos del terminador, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes del marcador y otras secuencias también apropiadas. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los procedimientos de transformación dependen del huésped utilizado, pero son bien conocidos. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de las construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en las células y la expresión génica, y el análisis de proteínas, se describen detalladamente en Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

La proteína Mlo purificada, o un fragmento, un mutante o una variante de la misma, por ejemplo producida recombinantemente por la expresión de la codificación por lo tanto de ácido nucleico, se pueden utilizar para elevar los anticuerpos que emplean las técnicas que son estándar en la técnica. Se pueden utilizar anticuerpos y polipéptidos que comprenden los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos en la identificación de homólogos de otras especies tal y como se discute además posteriormente.

Los procedimientos de producción de anticuerpos incluyen la inmunización de un mamífero (por ejemplo, de ser humano, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden obtener a partir de animales inmunizados utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, y pudieron ser cribados, preferentemente utilizando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden utilizar las técnicas de Western-Blot o la inmunoprecipitación (Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82). Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

Como una alternativa o un suplemento para inmunizar a un mamífero, los anticuerpos con especificidad en la unión apropiada se pueden obtener a partir de una biblioteca producida recombinantemente de los dominios variables expresados de la inmunoglobulina, por ejemplo, utilizando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso que exponen dominios de unión de la inmunoglobulina funcional en sus superficies; véase, por ejemplo, la patente WO92/01047.

Se pueden utilizar los anticuerpos elevados hasta un polipéptido o un péptido en la identificación y/o el aislamiento de polipéptidos homólogos, y después en la codificación de genes. Un procedimiento de identificar o aislar un polipéptido con función Mlo o función mlo puede comprender el cribaje de los péptidos o los polipéptidos del candidato con un polipéptido que comprende el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, todo el anticuerpo o un fragmento del mismo) que es capaz de unir un péptido o un polipéptido Mlo o mlo, o fragmento, variante o variante del mismo o preferentemente tiene la especificidad de unión para dicho péptido o polipéptido, tal como tener una secuencia de aminoácidos identificada en la presente invención. Los miembros de unión específicos, tales como los anticuerpos y los polipéptidos, pueden comprender los dominios de unión al antígeno de los anticuerpos que unen y son preferentemente específicos para un péptido o polipéptido Mlo o mlo o un mutante, una variante o un derivado del mismo.

Los péptidos o los polipéptidos del candidato para el cribaje pueden ser, por ejemplo, los productos de una biblioteca de expresión creada utilizando el ácido nucleico derivado de una planta de interés, o pueden ser el producto de un proceso de purificación de una fuente natural.

Un péptido o un polipéptido encontrado para unir el anticuerpo se puede aislar y entonces puede estar sometido a la secuenciación de aminoácidos. Se puede utilizar cualquier técnica adecuada para secuenciar el péptido o el polipéptido tanto de manera total como de manera parcial (por ejemplo, se puede secuenciar un fragmento de un polipéptido). Se puede utilizar la información de la secuencia de aminoácidos en la obtención del ácido nucleico que codifica el péptido o el polipéptido, por ejemplo diseñando uno o más oligonucleótidos (por ejemplo, una fuente degenerada de oligonucleótidos) para utilizar como sondas o cebadores en la hibridación en el ácido nucleico del candidato, o buscando bases de datos de secuencias por ordenador, según se discute además posteriormente.

Un procedimiento para identificar y clonar homólogos Mlo de plantas, incluyendo especies diferentes a la cebada, puede emplear una secuencia de nucleótidos derivada de la demostrada en la Figura 2 o una secuencia de nucleótidos derivada de cualquiera de los otras figuras proporcionadas en la presente invención. Las bibliotecas de ácido nucleico se pueden cribar utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica y las secuencias homólogas identificadas de tal modo probadas después. La disposición de la información de la secuencia para el gen Mlo de la Cebada y de los diversos homólogos permite la obtención de secuencias homólogas de la cebada y de otras especies de plantas, según lo ejemplificado además en la presente invención.

También, uno puede derivar fácilmente los cebadores de la PCR basados en las posibles secuencias del exón, que se pudieron identificar por comparación con la secuencia Mlo proporcionada en la Figura 2 en donde se destacan los exones, y se realizan RT-PCR con ARN total de la planta del interés, por ejemplo, cebada y arroz para los homólogos representados en las Figuras 5 y 6, con las secuencias de ADNc y aminoácido representadas en otras figuras de la presente invención.

El ácido nucleico puede codificar un homólogo Mlo obtenido utilizando una secuencia de nucleótidos derivada de la representada en la Figura 2, o la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos y/o la secuencia de aminoácidos comparte homología con la secuencia codificada por la secuencia de nucleótidos de la Figura 2, preferentemente al menos aproximadamente al 50%, o al menos aproximadamente al 55%, o al menos aproximadamente al 60%, o al menos aproximadamente al 65%, o al menos aproximadamente al 70%, o al menos aproximadamente al 75%, o al menos aproximadamente al 80% de homología, o al menos aproximadamente al 85% de homología, o al menos aproximadamente al 90% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente al 95% de homología. Se puede utilizar la "homología" en relación con una secuencia de aminoácidos para referirse a la identidad o a la similitud, preferentemente la identidad. Los elevados niveles de identidad de aminoácido se pueden limitar a los dominios o las regiones funcionalmente significativos.

Una secuencia de aminoácidos mutante, alelo, variante o derivado puede incluir dentro de la secuencia representada en la Figura 2, un solo cambio de aminoácido con respecto a la secuencia representada en las Figuras 2, ó 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 cambios, aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 cambios, o superior a aproximadamente 50, 60, 70, 80 ó 90 cambios. Además, hasta uno o más cambios dentro de la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2, una secuencia de aminoácidos mutante, alelo, variante o derivado puede incluir los aminoácidos adicionales en el C Terminal y/o el N terminal.

Tal y como bien se sobrentiende, la homología en el nivel de aminoácido se encuentra generalmente en términos de similitud o identidad del aminoácido. La similitud tiene en cuenta la "variación conservadora", es decir, la substitución de un residuo hidrofóbico tal como la isoleucina, la valina, la leucina o la metionina, por otro, o la substitución de un residuo polar por otro, tales como la arginina por la lisina, el ácido glutámico por el ácido aspártico, o la glutamina por la asparragina. La similitud se puede encontrar según lo definido y determinado por el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso común en la técnica o, y si se pueden preferir, el programa estándar BestFit, que forma parte del Wisconsin Package, Versión 8, de septiembre de 1994 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). El programa BestFit realiza una alineación óptima del mejor segmento de la similitud entre dos secuencias. Las alineaciones óptimas se encuentran insertando espacios para maximizar el número de coincidencias utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman.

La homología se puede encontrar sobre la longitud total de la secuencia relevante representada en la presente invención, o preferentemente se puede encontrar sobre una secuencia contigua de aproximadamente o superior a aproximadamente 20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, 333, 400, 450, 500, 550, 600 o más aminoácidos o codones, comparados con la secuencia de aminoácidos relevante o la secuencia de nucleótidos según las circunstancias.

Las secuencias EST proporcionadas en la presente invención, tienen en promedio una similitud del 70% y una identidad del 50% con la secuencia Mlo de aminoácidos de la Figura 2. Con ello demostramos que el homólogo del arroz (Figura 5) y el homólogo de la cebada (Figura 6) tiene una identidad de aminoácido del 81% (secuencias de aminoácido representadas en la Figura 13 y la Figura 14).

Un alelo, variante, derivado, mutante u homólogo de la secuencia específica pueden demostrar poca homología total, se dice que aproximadamente el 20%, o aproximadamente el 25%, o aproximadamente el 30%, o aproximadamente el 35%, o aproximadamente el 40% o aproximadamente el 45%, con la secuencia específica. Sin embargo, en dominios o regiones funcionalmente significativos la homología del aminoácido puede ser mucho más alta. Los posibles dominios o las regiones funcionalmente significativos se pueden identificar utilizando procesos bioinformáticos, que incluyen la comparación de las secuencias de homólogos. Los dominios o las regiones funcionalmente significativos de diferentes polipéptidos se pueden combinar para la expresión de la codificación del ácido nucleico como una proteína de fusión. Por ejemplo, se pueden combinar en una proteína híbrida las propiedades particularmente ventajosas o deseables de diferentes homólogos, de forma que el producto de la expresión resultante, con la función Mlo o la función mlo, puede comprender fragmentos de diversas proteínas parentales.

La información de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la presente invención, o en cualquier parte de la misma, se puede utilizar en un buscador de base de datos para encontrar las secuencias homólogas, cuyos productos de expresión se pueden probar para la función Mlo y la función mlo. Ello puede tener la capacidad de complementar el fenotipo mutante mlo en una planta o puede, en la expresión una planta, conferir un fenotipo mlo.

En las bases de datos públicas de secuencias identificamos recientemente diversos homólogos para la secuencia de la Figura 2. Ya hemos encontrado homologías en el arroz y en la cebada, y en la dicotiledónea Arabidopsis.

Mediante la secuenciación de las homologías, el estudio de sus patrones de expresión y el examen del efecto de la alteración de su expresión, se pueden conseguir que los genes lleven a cabo una función similar al Mlo en la cebada.

La homología entre los homólogos tal y como se describe en la presente invención, se puede explotar en la identificación de homólogos adicionales, por ejemplo, utilizando oligonucleótidos (por ejemplo, una fuente degenerada) diseñada partiendo de la base de la conservación de la secuencia.

Un procedimiento de identificación o un procedimiento de clonación de un homólogo Mlo, por ejemplo, a partir de una especie diferente a la cebada, puede emplear una secuencia de nucleótidos derivada de la representada en la Figura 2 o la representada en cualquiera de las otras Figuras de la presente invención. Por ejemplo, dicho procedimiento puede emplear un oligonucleótido o oligonucleótidos que comprende o comprenden una secuencia o secuencias que se conservan entre las secuencias de las Figuras 2 y/o 5 y/o 6 y/o 10 y/o 11 y/o 12, o codificando una secuencia de aminoácidos conservada entre las de la Figura 2 y/o 7 y/o 13 y/o 14 y/o 15 para buscar a los homólogos. De este modo, se proporciona un procedimiento de obtención de ácido nucleico, que comprende la hibridación de un oligonucleótido o una molécula de ácido nucleico que comprende dicho oligonucleótido al ácido nucleico objetivo/candidato. El ácido nucleico objetivo o candidato puede comprender, por ejemplo, una biblioteca genómica o de ADNc obtenible a partir de un organismo conocido para contener o sospechar que contiene dicho ácido nucleico, monocotiledóneo o dicotiledóneo. La hibridación lograda se puede identificar y se puede aislar el ácido nucleico objetivo/candidato para una investigación y/o un uso posterior.

La hibridación puede suponer la prueba del ácido nucleico y la identificación de la hibridación positiva en condiciones estrictas adecuadas (según técnicas conocidas) y/o la utilización de oligonucleótidos como cebadores en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, tal como la PCR. Para la prueba, las condiciones preferidas son las que son suficientemente estrictas para ello para ser un patrón simple con un pequeño número de hibridaciones identificadas como positivas que se puedan investigar posteriormente. Ello es bien conocido en la técnica para incrementar el rigor de la hibridación gradualmente hasta que sólo queden unos pocos clones positivos.

Como una alternativa a la prueba, aunque aún empleando la hibridación de ácido nucleico, se pueden utilizar los oligonucleótidos diseñados para amplificar las secuencias de ADN en las reacciones PCR o en otros procedimientos que implican la amplificación del ácido nucleico, utilizando procedimientos rutinarios. Véase, por ejemplo, "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al, 1990, Academic Press, Nueva York.

Las secuencias de aminoácidos preferidas adecuadas para utilizar en el diseño de sondas o cebadores de la PCR para algún propósito son secuencias conservadas (completamente, sustancialmente o parcialmente) entre al menos dos péptidos o polipéptidos Mlo codificados por genes capaces de suprimir una respuesta de defensa en una planta, por ejemplo, con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de cualquiera de las diferentes Figuras de la presente invención y/o codificadas por las secuencias de nucleótidos de cualquiera de las diferentes Figuras de la presente invención.

Partiendo de la base de la información de la secuencia de aminoácidos, se pueden diseñar las sondas o los cebadores del oligonucleótido, teniendo en cuenta la degeneración del código genético y, donde convenga, se deriva el uso del codón del organismo del ácido nucléico candidato.

Preferentemente un oligonucleótido, para utilizar por ejemplo en la amplificación del ácido nucleico, dispone aproximadamente de hasta 50 nucleótidos, o aproximadamente 40 nucleótidos, o aproximadamente 30, o pocos nucleótidos de largo (por ejemplo, 18, 21 ó 24).

La valoración de si dicho producto PCR corresponde o no a los genes Mlo homólogos se puede llevar a cabo de varias maneras. Una banda de PCR de dicha reacción pudo contener una mezcla compleja de productos. Los productos individuales se pueden colar y cada uno de ellos se puede cribar individualmente. Se pueden analizar mediante transformación para valorar la función en la introducción en una planta del interés.

Tal y como se apuntó, el ácido nucleico se obtiene utilizando oligonucleótidos, diseñados en base a la información de la secuencia proporcionada en la presente invención, como sondas o cebadores. El ácido nucleico aislado y/o purificado a partir de una o más células de la cebada o de otra planta (véase anteriormente), o una biblioteca de ácido nucleico derivado desde el ácido nucleico aislado y/o purificado de la planta (por ejemplo, una biblioteca de ADNc derivada del mARN aislado de la planta), se puede sondear en condiciones para el hibridación selectiva y/o se puede someter a una reacción específica de amplificación del ácido nucleico tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR). El ácido nucleico sondeado o utilizado como plantilla en la reacción de amplificación puede ser ADN, ADNc o ARN genómicos. Si fuera necesario, uno o más fragmentos de gen se pueden ligar para generar una longitud total de secuencia de codificación.

Hemos probado diversas cebadores de la PCR derivados de la secuencia Mlo descrita en la presente invención para probar su especificidad para la amplificación del ácido nucleico según la presente invención, utilizando plantillas tanto de ADN genómico de cebada como de RT-PCR. Este último se sintetizó a partir de ARN polyA^{+} de cebada. En cada caso éramos capaces de amplificar el Mlo esperado derivado de los fragmentos de gen tal y como se muestra por la clonación y la subsiguiente secuenciación del ADN de los productos de la PCR. Los clones de la longitud total de ADNc se pueden obtener según lo descrito por la tecnología de RACE de las terminaciones 5' y 3' si se utilizan los productos de la RT-PCR como plantillas.

Ejemplos de cebadores probados incluyen:

1

\vskip1.000000\baselineskip

Se han probado diversas combinaciones de cebador:

2

La información de la secuencia proporcionada en la presente invención permite también el diseño de pruebas de diagnóstico para la determinación de la presencia de un alelo específico de resistencia mlo, o un alelo de susceptibilidad (por ejemplo, en estado natural), en cualquier planta, cultivo, variedad, población, raza local, parte de una familia o la otra selección dados en un programa de cultivo u otro genotipo dicho. Una prueba de diagnóstico se puede basar en la determinación de la presencia o la ausencia de un alelo particular por medio de la determinación del ácido nucleico o el polipéptido.

En el nivel del ácido nucleico, esto puede implicar la hibridación de un oligonucleótido o un polinucleótido adecuado, tal como un fragmento del gen Mlo o un homólogo del mismo, incluyendo cualquier homólogo descrito en la presente invención, o cualquier alelo particular, tal como un alelo que dé un fenotipo mlo, tal como cualquier alelo descrito en la presente invención. La hibridación puede implicar la PCR diseñada para amplificar un producto de una versión alélica dada del mlo, con la subsiguiente detección de un producto amplificado por cualquier procedimiento de un número de procedimientos posibles que incluyen, pero no limitan, a la electroforesis en gel, la electroforesis capilar, la hibridación directa de sondas de secuencia de nucleótidos y así sucesivamente. Una prueba de diagnóstico se puede basar en la PCR diseñada para amplificar diversos alelos o cualquier alelo del locus Mlo, con una prueba para distinguir los diversos alelos posibles por cualquier procedimiento de un número de procedimientos posibles, incluyendo el tamaño de fragmento de ADN, la variación de los sitios de restricción (por ejemplo, los CAPS - sitios polimórficos amplificados escindidos) y así sucesivamente. Una prueba de diagnóstico se puede basar también en un gran número de variantes posibles del análisis del ácido nucleico que sean evidentes a los expertos en la técnica, tales como la utilización de una secuencia mlo derivada sintética como sonda de la hibridación.

En líneas generales, los procedimientos se dividen en los que criban la presencia de secuencias de ácido nucleico y los que confían en la detección de la presencia o la ausencia de un polipéptido. Los procedimientos pueden hacer uso de muestras biológicas de una o más plantas o células que se sospechan que contienen las secuencias de ácido nucleico o el polipéptido.

Enfoques ejemplares para detectar el ácido nucleico o los polipéptidos incluyen el análisis de una muestra de la planta o la célula de la planta mediante:

(a)

la comparación de la secuencia de ácidos nucleicos en la muestra con toda o una parte de la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 7 para determinar si la muestra del paciente contiene una mutación;

(b)

la determinación de la presencia en la muestra de un polipéptido incluyendo la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2 o un fragmento del mismo y, si se encuentra presente, la determinación de si el polipéptido se encuentra en longitud total, y/o está mutado, y/o se expresa en el nivel normal;

(c)

la ejecución de la huella dactilar de ADN para comparar el patrón de restricción producido cuando una enzima de restricción corta el ácido nucleico en la muestra con el patrón de la restricción obtenido de la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 7 o de un mutante, un alelo o una variante conocido;

(d)

la entrada en contacto de la muestra con un miembro de unión específico capaz de la unión al ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos según lo expuesto en la Figura 7 o un fragmento del mismo, o un mutante, un alelo o una variante del mismo, el miembro de unión específico que incluye el ácido nucleico que se puede hibridar con la secuencia de la Figura 7 o un polipéptido que incluye un dominio de unión con especificidad para el ácido nucleico que incluye la secuencia de la Figura 7 o el polipéptido codificado por él, o una forma mutada del mismo, y determinando la unión del miembro de unión específico;

(f)

la realización de la PCR que implica una o más cebadores basados en la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 7 para cribar la muestra para el ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de la Figura 7 o un mutante, un alelo o una variante del mismo.

Cuando se criba un ácido nucleico del alelo de resistencia, el ácido nucleico en la muestra se amplificará inicialmente utilizando, por ejemplo, la PCR, para aumentar la cantidad del analito con respecto a otras secuencias presentes en la muestra. Esto permite que las secuencias objetivo sean detectadas con un alto nivel de sensibilidad si se encuentran presentes en la muestra. Esta etapa inicial se puede evitar utilizando las técnicas de selección de alta sensibilidad que están llegando a ser cada vez más importantes en la técnica.

Una forma variante del gen puede contener una o más inserciones, cancelaciones, substituciones y/ o adiciones de uno o más nucleótidos comparados con la secuencia en estado natural (tal y como se representa en al Figura 1) que pueden o no interrumpir la función del gen. Las diferencias en el nivel de ácido nucleico no se reflejan necesariamente por una diferencia en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Sin embargo, la mutación u otra diferencia en un gen puede dar lugar a un codón del marco de lectura o un codón de terminación, que podría afectar seriamente a la naturaleza del polipéptido producido (en su caso), o a una mutación puntual o a un cambio mutacional grave en el polipéptido codificado, incluyendo la inserción, la cancelación, la substitución y/o la adición de uno o más aminoácidos o regiones en el polipéptido. Una mutación en la secuencia del promotor u otra región reguladora puede prevenir o reducir la expresión del gen o afectar al proceso o la estabilidad de la transcripción del
mARN.

Las pruebas se pueden llevar a cabo en las preparaciones que contienen el ADN, el ADNc y/o el mARN genómicos. El ADNc o el mARN de prueba tienen la ventaja de la complejidad del ácido nucleico que es reducido por la ausencia de secuencias de intrones, pero tienen la posible desventaja del tiempo y el esfuerzo adicionales que se requieren en la fabricación de las preparaciones. El ARN es más difícil de manipular que el ADN debido a la frecuencia generalizada de las ribonucleasas.

El ácido nucleico en una muestra de prueba se puede secuenciar y se puede comparar la secuencia con la secuencia representada en la Figura 2, u otra Figura de la presente invención, para determinar si una diferencia se encuentra o no presente. Si es así, la diferencia se puede comparar con los alelos de susceptibilidad conocidos (por ejemplo, según lo resumido en la Tabla 1) para determinar si el ácido nucleico de prueba contiene una o más de las variaciones indicadas, o la diferencia se puede investigar por la asociación con la resistencia a la enfermedad.

El ácido nucleico amplificado se puede secuenciar entonces tal y como se indicó anteriormente, y/o probar de cualquier otra manera para determinar la presencia o la ausencia de una característica particular. El ácido nucleico para la prueba se puede preparar a partir del ácido nucleico eliminado de las células o en una biblioteca utilizando una variedad de otras técnicas tales como la digestión enzimática de restricción y la electroforesis.

El ácido nucleico se puede cribar utilizando una sonda específica de la variante o el alelo. Dicha sonda se corresponde en secuencia a una región del gen, o a su complemento, que contiene una alteración de la secuencia conocida para ser asociada a la resistencia a la enfermedad. En condiciones adecuadamente estrictas, la hibridación específica de dicha sonda para probar el ácido nucleico es indicativa de la presencia de la alteración de secuencia en el ácido nucleico de prueba. Para los propósitos eficientes de cribaje, se puede utilizar más de una sonda en la misma muestra de prueba.

Los oligonucleótidos específicos del alelo o la variante se pueden utilizar de modo parecido en la PCR para amplificar específicamente las secuencias particulares si se encuentran presentes en una muestra de prueba. Se puede llevar a cabo la valoración de si una banda de la PCR contiene una variante del gen mediante diversas maneras familiares para los expertos en la técnica. El producto de la PCR se puede, por ejemplo, tratar de una manera que permita a uno exhibir la mutación o el polimorfismo en un gel desnaturalizante de poliacrilamida de secuenciación del ADN, con las bandas específicas que se encuentran vinculadas a las variantes del gen que son seleccionadas.

Una alternativa o un suplemento, para buscar la presencia de secuencias variables en una muestra de prueba, es buscar la presencia de la secuencia normal, por ejemplo, utilizando una sonda o un cebador del oligonucleótido adecuadamente específico.

Se puede emplear los enfoques que se basan en el hibridación entre una sonda y un ácido nucleico de prueba y la detección subsiguiente de un mal apareamiento. En condiciones apropiadas (de temperatura, pH, etc.), una sonda del oligonucleótido se hibridará con una secuencia que no sea totalmente complementaria. El grado de apareamiento de bases entre las dos moléculas será suficiente para que se aparee a pesar de un mal apareamiento. Son bien conocidos en la técnica diversos enfoques para detectar la presencia de un mal apareamiento entre dos apareamientos de moléculas de ácido nucleico.

Por ejemplo, la ribonucleasas A se divide en el sitio de un mal apareamiento. La escisión se puede detectar mediante electroforesis del ácido nucleico de prueba al que la sonda relevante o la sonda se ha apareado y ha buscado moléculas más pequeñas (es decir, moléculas con una movilidad electroforética más elevada) que la longitud total del híbrido sonda/prueba. Otros enfoques se basan en la utilización de enzimas tales como las resolvasas o las endonucleasas.

De este modo, una sonda del oligonucleótido que tiene la secuencia de una región del gen normal (cadena sentido o antisentido) en el que las mutaciones asociadas con la resistencia a la enfermedad que se sabe que van a ocurrir (por ejemplo, véase la Tabla 1) se pueden aparear al ácido nucleico de prueba y la presencia o la ausencia de un mal apareamiento determinado. La detección de la presencia de un mal apareamiento puede indicar la presencia en el ácido nucleico de prueba de una mutación asociada a la resistencia a la enfermedad. Por otra parte, una sonda del oligonucleótido que tiene la secuencia de una región del gen que incluye una mutación asociada con la resistencia a la enfermedad se puede aparear al ácido nucleico de prueba y la presencia o la ausencia de un mal apareamiento determinado. La presencia de un mal apareamiento puede indicar que el ácido nucleico en la muestra de prueba tiene la secuencia normal, o una secuencia del mutante o el alelo diferente. En cualquier caso, se puede emplear una batería de sondas en diferentes regiones del gen.

Se puede detectar la presencia de diferencias en la secuencia de las moléculas de ácido nucleico mediante la digestión enzimática de restricción, tal como en un procedimiento de huella dactilar de ADN donde el patrón de restricción producido cuando se utilizan una o más enzimas de restricción para cortar una muestra de ácido nucleico se compara con el patrón obtenido cuando una muestra que contiene el gen normal o una variante o un alelo se digiere con la misma enzima o enzimas.

Se puede también evaluar la presencia o la ausencia de una lesión en el promotor u otra secuencia reguladora determinando el nivel de producción de mARN por transcripción o el nivel de producción de polipéptido por la translación del mARN.

El ácido nucleico aislado y/o purificado de una o más células de una planta o una biblioteca de ácido nucleico derivado del ácido nucleico aislado y/o purificado de las células (por ejemplo, una biblioteca de ADNc derivado de mARN aislado de las células), se puede sondear en condiciones para la hibridación selectiva y/o se puede someter a una reacción de amplificación de ácido nucleico específica tal como la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Un procedimiento puede incluir la hibridación de una o más (por ejemplo, dos) sondas o cebadores en el ácido nucleico objetivo. Donde el ácido nucleico es ADN de cadena doble, la hibridación será precedida generalmente por una desnaturalización para producir ADN de cadena simple. La hibridación puede formar parte de un procedimiento de la PCR, o formar parte de un procedimiento de sondeo que no implique la PCR. Un procedimiento de ejemplo sería una combinación de la PCR y la hibridación de bajo rigor. Un procedimiento de cribaje, elegido de entre muchos disponibles para los expertos en la técnica, se utiliza para identificar los acontecimientos de hibridación acertados y para aislar el ácido nucleico hibridado.

La unión de una sonda en el ácido nucleico objetivo (por ejemplo, el ADN) se puede medir utilizando cualquier variedad de técnicas a disposición de los expertos en la técnica. Por ejemplo, las sondas se pueden radiomarcar, fluorescentemente o enzimáticamente. Otros procedimientos que no emplean el marcado de la sonda incluyen el examen de los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, la amplificación utilizando la PCR, la ribonucleasas escindidas y el sondeo del oligonucleótido específico del alelo.

El sondeo puede emplear la técnica de transferencia Southern estándar. Por ejemplo, el ADN se puede extraer de las células y se puede digerir con diversas enzimas de restricción. Los fragmentos de restricción se pueden separar entonces mediante electroforesis en un gel de agarosa, antes de la desnaturalización y la transferencia a un filtro de nitrocelulosa. Se puede hibridar la sonda marcada en los fragmentos de ADN en el filtro y se puede determinar la unión. Se puede preparar el ADN para el sondeo a partir de preparaciones del ARN de las células.

Los experimentos preliminares se pueden realizar por la hibridación en condiciones de bajo rigor de varias sondas para las transferencias Southern de ADN digeridas con enzimas de restricción. Las condiciones adecuadas se conseguirían cuando se obtengan una gran cantidad de fragmentos de hibridación mientras la hibridación de fondo fuera baja. Utilizando estas condiciones, se pueden buscar bibliotecas de ácido nucleico, por ejemplo, bibliotecas de ADNc representativas de secuencias expresadas.

Tal y como se apuntó, los expertos en la técnica son bien capaces de emplear condiciones adecuadas de rigor deseado para la hibridación selectiva, teniendo en cuenta factores como la longitud y la composición base del oligonucleótido, la temperatura, y así sucesivamente.

En algunos ensayos de diagnóstico, los oligonucleótidos que son fragmentos de cualquiera de las secuencias representadas en la Figura 2, o cualquier alelo asociado con la resistencia a la enfermedad, por ejemplo, tal y como se identifican en la Tabla 1, son al menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, más preferentemente al menos aproximadamente 15 nucleótidos en longitud, más preferentemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud, más preferentemente aproximadamente 30 nucleótidos en longitud. Dichos fragmentos representan individualmente por sí mismos aspectos de la presente invención. Los fragmentos y otros oligonucleótidos se pueden utilizar como cebadores o sondas tal y como se ha discutido, pero se pueden también generar (por ejemplo, mediante la PCR) en procedimientos que se ocupan en determinar la presencia en una muestra de prueba de una secuencia indicativa de la resistencia a la enfermedad.

Existen diversos procedimientos para determinar la presencia o la ausencia en una muestra de prueba de un polipéptido particular, tal como el polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 2, u otra figura de la presente invención, o un mutante, variantes o alelo de la secuencia de aminoácidos del mismo (por ejemplo, incluyendo una alteración representada en la Tabla 1).

Una muestra se puede probar para la presencia de una pareja de unión para un miembro de unión tal como un anticuerpo (o una mezcla de anticuerpos), específico para una o más variantes particulares del polipéptido representado en la Figura 2; véase, por ejemplo, la Tabla 1.

En tales casos, la muestra se puede probar poniéndola en contacto con un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo en condiciones adecuadas para la unión específica, antes de que se determine la unión, por ejemplo, utilizando un sistema reportero según lo discutido. Cuando se utiliza un panel de anticuerpos, se pueden emplear diversos marcados reportantes para cada anticuerpo de modo que la unión de cada uno se pueda determinar.

Un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo, se puede utilizar para aislar y/o purificar su polipéptido pareja de unión de una muestra de prueba, para tener en cuenta la secuencia y/o el análisis bioquímico del polipéptido para determinar si tiene la secuencia y/o las propiedades del polipéptido en estado natural o un mutante, una variante o un alelo particular del mismo. La secuencia de aminoácidos es rutinaria en la técnica utilizando máquinas de secuenciación automatizadas.

La utilización de las pruebas de diagnóstico para los alelos mlo permite que el investigador o el cultivado de plantas establezca, con confianza e independencia total de las pruebas de resistencia que consumen tiempo, independientemente de si un alelo deseado se encuentra presente o no en la planta del interés (o de una célula de la misma), si la planta es representante de una colección de otras plantas genéticamente idénticas (por ejemplo, una variedad consanguínea o un cultivo) o de un individuo en una muestra de plantas relacionadas (por ejemplo, la selección de los cultivadores) o sin relación. Los alelos mlo que confieren el fenotipo de resistencia a la enfermedad deseable son recesivos y, por lo tanto, no se detectan en todo el nivel del fenotipo de la planta en condiciones heterozigóticas y en presencia de un alelo Mlo en estado natural. El cribaje fenotípico para la presencia de dichos alelos recesivos es, por lo tanto, posible solamente en material homocigótico para el locus mlo y así retrasar substancialmente la generación en un programa de reproducción de plantas en el que la selección se pueda aplicar de manera fiable y rentable. En un programa de reproducción de retrocruzamiento donde, por ejemplo, un cultivador se propone introgresar un alelo mlo deseable en un genotipo objetivo de elevada realización adaptado selecto, el locus mlo se encontrará permanentemente en las condiciones heterocigóticas hasta que se lleve a cabo la autofecundación. La prueba del ácido nucleico o el polipéptido para la presencia del alelo recesivo evita la necesidad de probar la progenie autofecundada de individuos de generación de retrocruzamiento, ahorrando de este modo considerable tiempo y dinero. En otros tipos de esquema de reproducción basados en la selección y la autofecundación de los individuos deseables, los diagnósticos de ácido nucleico o polipéptido para los alelos mlo deseables en alto rendimiento, los ensayos de bajo coste, tal y como se proporcionan en la presente invención, se puede realizar la selección fiable para los alelos mlo deseables en las primeras generaciones y en más material que sea por lo demás posible. Esta ganancia en la fiabilidad de la selección más el tiempo ahorrado es capaz de probar el primer material y sin que el costoso cribaje del fenotipo de resistencia sea de considerable valor en la reproducción de la planta.

A modo de ejemplo para la prueba del ácido nucleico, el alelo de resistencia mlo-5 de la cebada se caracteriza por una sustitución del nucleótido G por el nucleótido A en el codón de inicio previsto del gen Mlo (Tabla 1). La mutación se puede detectar fácilmente mediante la amplificación de la PCR estándar de un segmento del gen Mlo de la plantilla de ADN genómico con los cebadores:

cebador hacia adelante:

5'-GTTGCCACACTTTGCCACG-3'

cebador reverso:

5'-AAGCCAAGACGACAATCAGA-3'

(por ejemplo), seguido por la digestión con la enzima de restricción PshAl. Esto genera un marcador de secuencias polimórficas amplificadas escindidas (CAPS) que se pueda visualizar utilizando electroforesis en gel de agarosa convencional. La presencia de un fragmento de 769 pb es indicativa de la presencia del alelo mlo-5.

El alelo de resistencia mlo-9 se caracteriza por una sustitución de nucleótido C por el nucleótido T (Tabla 1). Este alelo es de particular relevancia ya que se utiliza con frecuencia en material de cultivo. El acontecimiento mutacional se puede detectar fácilmente utilizando los cebadores:

cebador hacia adelante:

5'-GRRGCCACACTTTGCCACG-3'

cebador reverso:

5'-AAGCCAAGACGACAATCAGA-3'

(por ejemplo), y la digestión subsiguiente de los productos genómicos de amplificación con la enzima de restricción HhaI. Esto genera un marcador de los CAPS que se puede visualizar utilizando electroforesis en gel de agarosa convencional. La presencia de un fragmento de 374 pb es indicativa de la presencia del alelo mlo-9.

Un tercer alelo, particularmente interesante, es el mlo-12, que se caracteriza por una substitución de un residuo 240, específicamente un Phe240 al reemplazo de la leucina. Esto pudo resultar desde una sustitución C720 hasta una sustitución A en la secuencia de nucleótidos de codificación (Tabla 1). Éste es el único alelo mlo actualmente documentado para el que la prueba concluyente se encuentra disponible para que la proteína alterada retenga la actividad en estado natural residual (Hentrich, 1979, Arch. Züchtungsvorsch., Berlin 9, S. 283-291). El mlo-12 expone reacción espontánea de muerte celular no detectable pero confiere un suficiente nivel de resistencia a los agentes patógenos tales como el hongo del oidio. El mlo-12 puede ser, por lo tanto, el alelo de elección en programas de reproducción si los efectos pleiotrópicos mínimos (muerte celular espontánea) se desean después de la introgresión de la resistencia mlo en líneas de cultivo selecto. Además, el sitio molecular de la substitución del aminoácido dentro de la proteína Mlo permite el diseño de alelos con una actividad en estado natural residual, y también la obtención de moléculas que interactúan y/o inhibitorias, que reducen los efectos pleiotrópicos no deseados de una pérdida completa de la función de la proteína Mlo.

La determinación basada en ácidos nucleicos de la presencia o la ausencia de alelos mlo se puede combinar con la determinación del genotipo del ADN genómico vinculado flanqueador u otro ADN genómico no vinculado utilizando sistemas establecidos de marcadores tales como los RFLPs, los microsatélites o los SSRs, los AFLPs, los RAPDs, etc.. Esto permite al investigador o cultivador de la planta el seleccionar no sólo para la presencia del alelo mlo deseable sino también para la planta individual o las familias de plantas que tengan las combinaciones más deseables de fondo genético vinculado y no vinculado. Dichas recombinaciones del material deseable pueden tener solamente lugar pocas veces dentro de una población de reproducción o progenie de retrocruzamiento dado. El ensayo directo del locus mlo según lo ofrecido por la presente invención permite al investigador realizar un enfoque paso a paso para la fijación (que lo hace homocigótico) de la combinación deseada de marcadores flanqueadores y alelos mlo, mediante primero la identificación de los individuos fijados por un marcador flanqueador y después la identificación de la progenie fijada en el otro lado del locus mlo teniendo todo el tiempo la confianza de que se encuentra todavía presente el alelo mlo deseable.

La presente descripción proporciona suficiente información para una persona experta en la técnica para obtener la secuencia del ADN genómico para cualquier alelo mlo nuevo o existente dado y para concebir un ensayo de diagnóstico adecuado basado en ácido nucleico y/o basado en polipéptido. Los alelos mlo existentes a los que se puede aplicar esto incluyen, por ejemplo, el mlo-1, el mlo-3, el mlo-4, el mlo-5, el mlo-6, el Mlo-7, el mlo-8, el mlo-9, el mlo-10, el mlo-12, el mlo-13, el mlo-16, el mlo-17, el mlo-26 y el mlo-28, para los que la información de la secuencia se proporciona en la presente invención (véanse, por ejemplo, la Figura 2 y la Tabla 1). En el diseño un ensayo de ácido nucleico se tiene en cuenta la variación distintiva en la secuencia que caracteriza el alelo variable particular. Un fragmento del oligonucleótido de un alelo mlo, puede tener una secuencia que lo permita hibridar específicamente a ese alelo con respecto a otros alelos mlo. Dicho oligonucleótido abarca un nucleótido en el que tiene lugar una mutación mlo, y que puede incluir el nucleótido mutado en o hacia su extremo 3' ó 5'. Dicho oligonucleótido puede hibridarse con la cadena con sentido o la cadena antisentido. La variación se puede encontrar dentro de la secuencia de codificación del gen mlo, o puede estar dentro de una secuencia de intrones o en una secuencia no codificada localizada corriente arriba o corriente abajo, en el que la interrupción afecta o se relaciona de otra manera con la lesión en el Mlo que resulta en el fenotipo resistente al oidio.

El alelo mlo-9 es comúnmente utilizado, pero no exclusivamente, en el cultivo de plantas (J Helms Jorgensen - Euphytica (1992) 63: 141-152), y el mlo-11 también se utiliza. El uso de los mutantes mlo en el cultivo práctico se ha restringido en gran parte a la cebada de primavera, ya que la respuesta espontánea de la muerte celular asociada a muchos de los alelos mutantes aparece para presentar un castigo al crecimiento y al rendimiento de la planta cuando está incorporada en los genotipos de la cebada de invierno del alto rendimiento. Sin embargo, diversos alelos mlo tienen diversos grados de respuesta espontánea asociada a la muerte celular, y de este modo algunos, o existentes o creados recientemente a partir de programas de mutagénesis o aislados como mutantes espontáneos, sean más adecuados que otros para la incorporación en los fondos de la cebada de invierno. El alelo mlo-12 puede ser particularmente adecuado ya que los efectos pleiotrópicos no detectables tienen lugar a pesar de conferir un suficiente nivel de resistencia al agente patógeno. La utilización de la resistencia al oidio basada en el mlo más extensamente en cebadas de invierno tendrá valor significativo para los cultivadores de cebada así como significativas implicaciones económicas y ambientales tales como la reducida utilización de aportaciones de fungicida con sus costes asociados al tratamiento. La previsión de diagnósticos del ácido nucleico tal y como se proporciona en la presente invención permite el rápido y exacto despliegue de los alelos mlo nuevos y existentes en el plasma germinal de la cebada de invierno.

Se pueden proporcionar plantas que incluyen una célula de la planta según lo descrito en la presente invención, junto con cualquier parte o propágulo de la misma, semilla, progenie híbrida o autofecundada y los descendientes. Una planta puede ser una que no se reproduzca conforme a la raza en una o más propiedades. Se pueden excluir variedades de plantas, particularmente las variedades de plantas inscribibles según los Derechos del Obtentor. Se observa que una planta no necesita ser considerada una "variedad de planta" simplemente porque contiene establemente un transgen dentro de su genoma, introducido en una célula de la planta o en un antepasado de la misma.

Además de una planta, se puede proporcionar cualquier clon de dicha planta, semilla, progenie híbrida o autofecundada y los descendientes, y cualquier parte de cualquiera de ellos, tal como esquejes y semillas. Se puede proporcionar cualquier propágulo de la planta, que es cualquier parte que se pueda utilizar en la reproducción o la propagación, sexual o asexual, que incluye esquejes, semillas, etcétera. Se puede proporcionar también una planta que se propague sexualmente o asexualmente a la progenitura, al clon o al descendiente de dicha planta, o cualquier parte o propágulo de dicha planta, a la progenitura, al clon o al descendiente.

Un procedimiento de hacer una célula de planta que implique la introducción de la secuencia (por ejemplo, como parte de un vector adecuado) en una célula de planta y que ocasiona o permite la recombinación entre el vector y el genoma de la célula de planta para introducir la secuencia de nucleótidos en el genoma.

La siguiente transformación de una célula de planta de una planta se puede regenerar.

Un procedimiento para modular la expresión Mlo en una planta, que puede modular una respuesta de defensa en la planta, puede comprender la expresión de una secuencia heteróloga del gen Mlo (o mutante, alelo, variante u homólogo del mismo, tal y como se ha discutido) dentro de las células de la planta. Tal y como se ha discutido además en la presente invención, la modulación o la alteración del nivel de respuesta de defensa constitutiva en una planta puede ser por medio de la supresión, la represión o la reducción (en la forma Mlo en estado natural) o la promoción, el estímulo, la activación, el incremento, la mejora o el aumento (en la forma mlo mutante). La activación o la mejora de la respuesta de defensa puede conferir o incrementar la resistencia de la planta al agente patógeno, especialmente la resistencia al oidio y/o la roya (tal como la roya amarilla).

El término "heterólogo" se puede utilizar para indicar que el gen/la secuencia de nucleótidos en cuestión se ha introducido en las dichas células de la planta o de un antepasado de la misma, utilizando ingeniería genética, es decir, mediante la intervención humana. Se puede proporcionar una célula de planta transgénica, es decir, transgénico para el ácido nucleico en cuestión. El transgen se puede encontrar en un vector extragenómico o incorporado, preferentemente estable, en el genoma. Un gen heterólogo puede sustituir un gen equivalente endógeno, es decir, uno que normalmente realiza la misma o similar función, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endógeno u otra secuencia. Una ventaja de la introducción de un gen heterólogo es la capacidad de colocar la expresión de una secuencia bajo el control de un promotor de elección, para poder influenciar la expresión según la preferencia, tal como bajo el desarrollo particular, el control espacial o temporal, o bajo el control de un promotor inducible. Además, se pueden utilizar los mutantes, las variantes y los derivados del gen en estado natural, por ejemplo, con una actividad más alta o más baja que el propio gen en estado natural, en lugar del gen endógeno. El ácido nucleico heterólogo, o exógeno o ajeno, se puede encontrar en una célula de planta de forma no natural teniendo lugar en células de ese tipo, variedad o especie. De este modo, el ácido nucleico puede incluir una secuencia de codificación de, o derivada de, un tipo particular de célula o especie de planta o variedad de planta, colocada dentro del contexto de una célula de planta de un tipo o especie o variedad diferentes de planta. Una posibilidad adicional se encuentra para que una secuencia de ácidos nucleicos se coloque dentro de una célula en la que o un homólogo se encuentra de forma natural, pero en el que la secuencia de ácidos nucleicos se encuentra vinculada y/o adyacente al ácido nucleico que no tiene lugar de forma natural dentro de la célula, o las células de ese tipo o especie o variedad de planta, tal como vinculado operativamente a una o más secuencias reguladoras, tal como una secuencia del promotor, para el control de la expresión. Una secuencia dentro de la planta u otra célula huésped puede ser identificablemente heteróloga, exógena o
ajena.

La regulación por disminución de la función del gen Mlo en estado natural lleva a la estimulación de una respuesta de defensa constitutiva. Esto se puede conseguir de varias maneras diferentes, tal y como se ilustra más abajo.

El ácido nucleico se puede colocar bajo el control de un promotor inducible del gen, poniendo de este modo la expresión bajo el control del usuario.

Una construcción de gen puede comprender un promotor inducible vinculado operativamente a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención. Según lo discutido, esto permite el control de la expresión del gen. Las plantas se pueden transformar con dicha construcción de gen y los procedimientos pueden comprender la introducción de dicha construcción en una célula de planta y/o la inducción de la expresión de una construcción dentro de una célula de planta, por ejemplo, mediante la aplicación de un estímulo adecuado, tal como un inductor exógeno o una señal endógena efectivos.

El término "inducible" que se aplica a un promotor es bien entendido por los expertos en la técnica. Esencialmente, la expresión bajo el control de un promotor inducible se "conecta" o incrementa en respuesta a un estímulo aplicado (que se puede generar dentro de una célula o proporcionar exógenamente). La naturaleza del estímulo varía entre los promotores. Algunos promotores inducibles provocan pequeños o imperceptibles niveles de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan la expresión constitutiva perceptible en ausencia del estímulo. Aunque el nivel de expresión se encuentra en ausencia del estímulo, la expresión de cualquier promotor inducible se incrementa en presencia del estímulo correcto. La situación preferible es aquella donde el nivel de expresión aumenta sobre la aplicación del estímulo relevante mediante una cantidad efectiva para alterar una característica fenotípica. De este modo, se puede utilizar un promotor inducible (o "conectable") que provoca un nivel básico de expresión en ausencia del estímulo cuyo nivel es demasiado bajo para ocasionar un fenotipo deseado (y puede de hecho ser cero). En la utilización del estímulo, la expresión se aumenta (o se conecta) hasta un nivel que ocasione el fenotipo deseado.

Los promotores adecuados incluyen el promotor del gen 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S) que se expresa en un alto nivel en virtualmente todos los tejidos vegetales (Benfey et al, (1990a) EMBO J 9: 1677-1684); el promotor meri-5 de la coliflor que se expresa en el meristema apical vegetativo así como diversas posiciones bien localizadas en el cuerpo de la planta, por ejemplo, en el floema interno, la primordia de la flor, los puntos de ramificación en la raíz y los brotes (Medford, J.I. (1992) Plant Cell 4, 1029-1039; Medford et al, (1991) Plant Cell 3, 359-370) y el promotor LEAFY de la Arabidopsis thaliana que se expresa muy pronto en el desarrollo de la flor (Weigel et al, (1992) Cell 69, 843-859).

El ácido nucleico se puede utilizar en la producción de una planta transgénica.

Cuando se introduce una construcción de gen elegida en una célula, se deben tener en cuenta ciertas consideraciones, bien conocidas por los expertos en la técnica. El ácido nucleico a ser insertado se debería insertar dentro de una construcción que contenga los elementos reguladores efectivos que conducirán la transcripción. Debe haber disponible un procedimiento para transportar la construcción en la célula. Una vez la construcción se encuentra dentro de la membrana celular, tendrá o no lugar la integración en el material cromosómico endógeno. Finalmente, en lo que concierne a las plantas, el tipo de la célula objetivo debe ser aquel con el que las células se puedan regenerar en todas las plantas.

Las plantas transformadas con el segmento de ADN que contiene la secuencia se pueden producir mediante técnicas estándar que son ya conocidas para la manipulación genética de plantas. El ADN se puede transformar en las células de planta utilizando cualquier tecnología adecuada, tal como un vector Ti plásmido desarmado llevado por el Agrobacterium que explota su capacidad natural de transferencia del gen (EP-A-270355, EP-A-0116718, NAR 12(22) 8711 - 87215 1984), bombardeo con partículas o microproyectiles (US 5100792, EP-A-444882, EP-A-434616), microinyección (WO 92/09696, WO 94/00583, EP 331083, EP 175966, Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), electroporación (EP 290395, WO 8706614), otras formas absorción directa de ADN (DE 4005152, WO 9012096, US 4684611), absorción de ADN por medio de liposomas (por ejemplo, Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), o el procedimiento vórtex (por ejemplo, Kindle, PNAS USA 87: 1228 (1990d) Physical methods for the transformation of plant cells are reviewed in Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: 1-11).

La transformación del Agrobacterium es ampliamente utilizada por los expertos en la técnica para transformar especies dicotiledóneas. Recientemente, ha habido un progreso substancial hacia la producción rutinaria de plantas transgénicas estables y fértiles, en casi todo plantas monocotiledóneas económicamente relevantes (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, 1072-1074; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, 379-384; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, 835-840; Shimamoto, et al. (1989) Nature 338, 274-276; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, 736-740; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, 957-962; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines 563-574; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, 585-591; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, 250-255; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, 871-884; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839; Gordon-Kamm, et al. (1990) plant Cell 2, 603-618; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, 1495-1505; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, 189-200; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, 925-937; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, 1077-1084; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, 1589-1594; WO92/14828). En particular, la transformación por medio del Agrobacterium se encuentra ahora emergiendo también como procedimiento alternativo muy eficiente de transformación en monocotiledóneas.

La generación de plantas transgénicas fértiles se ha conseguido en los cereales de arroz, maíz, trigo, avena y cebada (resumido en Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, 158-162.; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, 667-674; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): 653-671; Vasil, 1996, Nature Bio-
technology 14 página 702).

Se prefieren el bombardeo con microproyectiles, la electroporación y la absorción directa del ADN cuando el Agrobacterium no es eficiente o efectivo. Alternativamente, se puede emplear una combinación de diferentes técnicas para mejorar la eficiencia del proceso de transformación, por ejemplo, el bombardeo con micropartículas cubiertas de Agrobacterium (EP-A-486234) o el bombardeo con microproyectiles para inducir la herida, seguido por el cocultivo con Agrobacterium (EP-A-486233).

Después de la transformación, se puede regenerar una planta, por ejemplo, a partir de células individuales, tejido calloso o discos de hojas, como es estándar en la técnica. Casi cualquier planta se puede regenerar totalmente a partir de células, tejidos y órganos de la planta. Las técnicas disponibles se encuentran resumidas en Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II y III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, y Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989.

La opción particular de una tecnología de transformación se determinará por su eficiencia para transformar cierta especie de planta así como la experiencia y la preferencia de la persona que ensaye la presente invención con una metodología particular de la opción. Será evidente para la persona experta que la opción particular de un sistema de transformación para introducir el ácido nucleico en las células de planta no es esencial para, o una limitación de, la presente invención, ni es la opción de la técnica para la regeneración de la planta.

La expresión se puede conseguir mediante la introducción de la secuencia de nucleótidos en una orientación con sentido. De este modo, un procedimiento de modulación de una respuesta de defensa en una planta, puede comprender que cause o permita la expresión del ácido nucleico dentro de las células de la planta. Generalmente, será deseable estimular la respuesta de defensa, y esto se puede conseguir mediante la función de interrupción del gen Mlo.

La regulación por disminución de la expresión de un gen objetivo se puede conseguir utilizando la tecnología antisentido o la "regulación con sentido" ("cosupresión").

Al utilizar genes antisentido o secuencias parciales del gen para regular por disminución la expresión del gen, una secuencia de nucleótidos se pone bajo el control de un promotor en una "orientación inversa", de forma que la transcripción produce ARN que es complementario al mARN normal transcrito a partir de la cadena "con sentido" del gen objetivo. Véanse, por ejemplo, Rothstein et al, 1987; Smith et al, (1988) Nature 334, 724-726; Zhang et al, (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188. La tecnología antisentido también se encuentra resumida en Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, y Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-
3496.

Una alternativa es utilizar una copia de todo o parte del gen objetivo insertado en la orientación con sentido, que es la misma, como el gen objetivo, para conseguir la reducción en la expresión del gen objetivo mediante la cosupresión. Véanse, por ejemplo, van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, y US-A-5.231.020.

No se necesita utilizar la secuencia completa que corresponde a la secuencia de codificación (en la orientación inversa para el antisentido). Por ejemplo, se pueden utilizar los fragmentos de longitud suficiente. Es una cuestión rutinaria para la persona experta en la técnica para el cribaje de los fragmentos de diversos tamaños y a partir de diversas partes de la secuencia de codificación para optimizar el nivel de inhibición antisentido. Puede ser ventajoso incluir el codón de iniciación ATG de la metionina, y quizás uno o más nucleótidos localizados corriente arriba del codón de iniciación. Una posibilidad adicional es dirigir una secuencia conservada de un gen, por ejemplo, una secuencia que sea característica de uno o más genes, tales como una secuencia reguladora. Las construcciones antisentido pueden suponer secuencias con terminación 3' o terminación 5' del Mlo u homólogos. En el caso de que varios homólogos del Mlo existan en una especie de la planta, la implicación de las secuencias no translacionadas en la terminación 5' y la terminación 3' en la construcción mejorarán la especificidad del silenciador.

La secuencia empleada puede ser de aproximadamente 500 nucleótidos o menos, posiblemente de aproximadamente 400 nucleótidos, de aproximadamente 300 nucleótidos, de aproximadamente 200 nucleótidos, o de aproximadamente 100 nucleótidos. Puede ser posible utilizar los oligonucleótidos de longitudes mucho más cortas, de 14 - 23 nucleótidos, aunque puede ser posible utilizar fragmentos más largos, y generalmente incluso más largos de aproximadamente 500 nucleótidos son más preferibles donde sea posible, por ejemplo, tales como más largos de aproximadamente 600 nucleótidos, de aproximadamente 700 nucleótidos, de aproximadamente 800 nucleótidos, de aproximadamente 1.000 nucleótidos, de aproximadamente 1.200 nucleótidos, de aproximadamente 1.400 nucleótidos, o más.

Puede ser preferible que exista identidad completa de la secuencia en la secuencia utilizada para la regulación por disminución de la expresión de una secuencia objetivo, y la secuencia objetivo, aunque no sea esencial la complementariedad o la similitud total de la secuencia. Uno o más nucleótidos pueden diferir en la secuencia utilizada a partir del gen objetivo. De este modo, una secuencia empleada en una regulación por disminución de la expresión del gen según la presente invención puede ser una secuencia en estado natural (por ejemplo, el gen) seleccionada a partir de los disponibles, o un mutante, un derivado, una variante o un alelo, por medio de la inserción, la adición, la cancelación o la substitución de uno o más nucleótidos, de dicha secuencia. La secuencia no necesita incluir un marco de lectura abierto o especificar un ARN que sería transladable. Se puede preferir para ello que haya la suficiente homología para hibridar las moléculas de ARN antisentido y con sentido. Puede haber regulación por disminución de la expresión del gen incluso cuando hay aproximadamente el 5%, el 10%, el 15% o el 20% o más mal apareamientos entre la secuencia utilizada y el gen objetivo.

Generalmente, el ácido nucleico transcrito puede representar un fragmento de un gen Mlo, así como incluir una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 2, o el complemento del mismo, o puede ser un mutante, un derivado, una variante o un alelo del mismo, en términos similares según lo discutido anteriormente en relación con las alteraciones que se llevan a cabo a una secuencia de codificación y a la homología de la secuencia alterada. La homología puede ser suficiente para el ARN antisentido para hibridar con el ácido nucleico dentro de las células de planta, aunque con independencia de si la hibridación tiene lugar, se regula por disminución el efecto deseado de la expresión del gen.

La regulación antisentido puede ser regulada por sí mismo empleando a un promotor inducible en una construcción apropiada.

Las construcciones se pueden expresar utilizando el promotor natural, mediante un promotor constitutivamente expresado tal como el promotor 35S del CaMV, mediante un promotor específico del tejido o un promotor específico del tipo de célula, o mediante un promotor que se pueda activar mediante una señal o agente externo. El promotor 35S del CaMV, pero también los promotores actin1 del arroz y el ubiquitino del maíz han demostrado que dan niveles elevados de expresión del gen indicador en el arroz (Fujimoto et al., (1993) Bio/Technology 11, 1151-1155; Zhang, et al., (1991) Plant Cell 3, 1155-1165; Cornejo et al., (1993) Plant Molecular Biology 23, 567-581).

Para la utilización en la regulación antisentido, se proporciona el ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de codificación de un gen Mlo (es decir, que incluye homólogos), o un fragmento de dicha secuencia de codificación adecuada para la utilización en la regulación antisentido de la expresión. Esto puede ser ADN y bajo el control de una secuencia reguladora apropiada para la transcripción antisentido en las células de interés.

Un procedimiento para conferir resistencia al agente patógeno en una planta, puede incluir que cause o permita la transcripción antisentido del ácido nucleico heterólogo dentro de las células de la planta.

La secuencia de nucleótidos de la Figura 2 o un fragmento, un mutante, un derivado, un alelo, una variante o un homólogo del mismo, por ejemplo, cualquier secuencia representada o identificada en la presente invención, se puede utilizar para la regulación por disminución de la expresión del gen, particularmente la regulación por disminución de la expresión de un gen Mlo o el homólogo del mismo, para conferir preferentemente resistencia al agente patógeno en una planta.

Cuando las copias adicionales del gen objetivo se insertan en orientación con sentido, que es igual, que el gen objetivo, se produce una gama de fenotipos que incluye a los individuos donde tiene lugar la sobreexpresión y algunos cuando tiene lugar la pérdida de expresión de la proteína del gen objetivo. Cuando el gen insertado es solamente parte del gen endógeno aumenta el número de individuos que pierden la expresión en las poblaciones transgénicas. El mecanismo por el que tiene lugar la regulación con sentido, particularmente la regulación por disminución, no se encuentra bien entendida. Sin embargo, esta técnica se encuentra bien divulgada en la literatura científica y de patente y se utiliza rutinariamente para el control del gen. Véase, por ejemplo, van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-229; Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289; Zhang et al, 1992 The Plant Cell 4, 1575-1588.

Una vez más, los fragmentos, mutantes, y etcétera, se pueden utilizar en términos similares tal y como se describió anteriormente para la utilización en la regulación antisentido.

Un procedimiento para conferir resistencia al agente patógeno en una planta, puede incluir que cause o permita la expresión del ácido nucleico según la presente invención dentro de las células de la planta. Esto se puede utilizar para suprimir la actividad Mlo. Aquí, la actividad del producto se suprime preferentemente como resultado de la pérdida de expresión dentro de las células de planta.

Según lo observado, la regulación por disminución del Mlo puede promover la activación de una respuesta de defensa, que puede a su vez conferir o aumentar la resistencia al agente patógeno de la planta, especialmente la resistencia al oidio y/o la roya (por ejemplo, la roya amarilla).

Un procedimiento de modulación de la función Mlo en una planta, puede comprender que cause o permita la expresión a partir del ácido nucleico según la presente invención dentro de las células de la planta para suprimir la expresión Mlo endógena.

Las versiones modificadas del Mlo se pueden utilizar para regular por disminución la función Mlo endógena. Por ejemplo, se pueden emplear mutantes, variantes, derivados, etc.. Por ejemplo, la expresión de una secuencia del mutante mlo en un alto nivel puede eliminar por competencia la actividad del Mlo endógeno.

La reducción de la actividad Mlo en estado natural se puede conseguir utilizando ribozimas, tales como la replicación de ribozimas, por ejemplo, de la clase "hammerhead" (Haseloff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591; Feyter et al. Mol., 1996, Gen. Genet. 250: 329-338).

Otra manera de reducir la función Mlo en una planta emplea la mutagénesis por transposones (resumido por Osborne et al., (1995) Current Opinion in Cell Biology 7, 406-413). La inactivación de genes se ha demostrado por medio de un enfoque de "marcado específico" utilizando los elementos móviles endógenos o los transposones clonados heterólogos que conservan su movilidad en los genomas ajenos. Se podían identificar los alelos Mlo que llevan cualquier inserción de secuencia conocida utilizando los cebadores de la PCR con especificidades de unión tanto en la secuencia de inserción como en el homólogo Mlo. Se podían utilizar los "sistemas de dos elementos" para estabilizar el transposón dentro de los alelos inactivados. En el enfoque de los dos elementos, se construye un T-ADN que lleva un transposón no autónomo que contiene el gen marcador seleccionable o cribable insertado en un marcador de escisión. Las plantas que llevan estos T-ADNs se encuentran cruzadas con plantas que llevan un segundo T-ADN que expresa la función de la transposasa. Los híbridos se seleccionan dos veces para la escisión y para el marcador dentro del rendimiento transposón las plantas F_{2} con los elementos transpuestos. El enfoque de los dos elementos tiene una ventaja particular con respecto al Ac/Ds del maíz, pues el Ds transpuesto es más probable que no esté vinculado a la transposasa, facilitando el outcrossing y la estabilización de la inserción Ds (Jones et al., (1994) Science 266, 789-793; Osborne et al., (1995) Current Opinion in Cell Biology 7, 406-413).

La resistencia al oidio basada en el mlo está provocada por la inactivación del alelo Mlo en estado natural, dando lugar a un fenotipo recesivo de resistencia. Se pueden utilizar sustancias que inhiban la actividad de la proteína Mlo en estado natural para inducir el fenotipo de resistencia.

Una importante insinuación, que la inactivación completa de la expresión Mlo no es esencial y puede incluso ser perjudicial, se proporciona mediante la descripción de los alelos mlo de resistencia inducidos por el agente mutágeno que es probable que hayan conservado la actividad residual del alelo en estado natural. Estos alelos no exhiben ninguna necrosis espontánea perceptible de la hoja que afecte negativamente a las velocidades y al rendimiento de la fotosíntesis (Hentrich, W (1979) Arch. Züchtungsvorsch., Berlin 9, S. 283-291).

La proteína Mlo se predice para estar anclada a la membrana mediante siete hélices transmembrana (véase, por ejemplo, la Figura 7). Esta predicción de estructura ha sido reforzada por el análisis reciente de los homólogos del Mlo en el arroz y la Arabidopsis thaliana. La predicción de la estructura del homólogo de la Arabidopsis thaliana también sugiere la presencia de siete hélices transmembrana. Una comparación de los homólogos del Mlo reveló además residuos conservados de la cisteína en los lazos extracelulares posibles 1 y 3 y altas probabilidades de hélices anfipáticas en el segundo lazo extracelular adyacente a las hélices transmembrana previstas 3 y 4. Estos conservados motivos estructurales en la familia de proteínas Mlo recuerdan a los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) descritos extensivamente en los sistemas de mamíferos. Los GPCRs son conocidos para activarse mediante ligandos y para amplificar señales intracelularmente por medio de las proteínas G heterotriméricas. Sin proporcionar de ninguna forma una limitación en la naturaleza o el alcance de cualquier aspecto de la presente invención, se predice que el Mlo activa una subunidad alfa G inhibitoria de las proteínas G heterotriméricas, llevando de este modo a una regulación por disminución de las proteínas efectoras hasta ahora desconocidas.

La previsión de la presente invención de la información de la secuencia Mlo permite la identificación de los antagonistas de la función de la proteína del Mlo (por ejemplo, la función del GPCR). Los antagonistas del Mlo pueden bloquear la activación del receptor por su ligando genuino desconocido, imitando mutaciones recesivas en el gen Mlo. Dichos antagonistas del Mlo se pueden utilizar como compuestos de la protección de cosechas, por ejemplo, aplicado externamente a la planta o a la cosecha o, cuando el compuesto se encuentre como peptidilo en la naturaleza, liberado internamente por medio de un vector biológico (por ejemplo, partícula viral de infección recombinante que expresa la molécula antagónica dentro de las células de planta objetivo) o por medio de una ruta transgénica (las plantas o las células de planta modificadas genéticamente para expresar la molécula del antagonista, quizás bajo el control de un promotor inducible mediante un compuesto aplicado externamente (por ejemplo, el promotor GST-II del maíz - Jepson et al Plant Molecular Biology 26:1855-1866 (1994)) permitiendo el control sobre el ritmo de la expresión del fenotipo de inactivación mlo.

Se pueden probar los segmentos de hoja de plantas Mlo en estado natural con una sustancia de prueba, por ejemplo, a partir de una biblioteca de compuestos aleatoria o combinatoria, para la resistencia sobre el reto con el agente patógeno tal como el oidio. El ensayo del segmento de hoja separado se utiliza como sistema de prueba estándar para anotar la susceptibilidad/resistencia sobre la inoculación con esporas del oidio. Los segmentos de hoja de semilleros de 7 días del genotipo Mlo RorI se pueden poner en el agar, por ejemplo, en pocillos individuales de placas microtiter de 96 pocillos que contienen 50 \mul de agar. Se pueden aplicar diversos compuestos a la superficie del agar en cada pocillo en una concentración de aproximadamente 1 ppm disuelta en DMSO. Alrededor de siete días después de la inoculación de los segmentos separados de hoja con el agente patógeno, tal como las esporas de un aislante virulento del oidio, se pueden reconocer los compuestos que inducen la resistencia por la ausencia de micelio de los hongos en los segmentos de hoja en las placas microtiter.

Se puede utilizar una selección adicional para discriminar entre los compuestos que actúan en la ruta del mlo y los que confieren la resistencia mediante otros mecanismos, o los que exhiben una actividad fungitóxica directa. Con este fin, se pueden utilizar mutantes en genes (genes Ror) que se pueden requerir para la resistencia mlo (Freialdenhoven et al., (1996), The Plant Cell 8, 5-14). Los mutantes de estos genes confieren susceptibilidad al ataque del oidio a pesar de la presencia de alelos mlo de resistencia. Se pueden utilizar las plantas del genotipo Mlo rorl (proteína del Mlo en estado natural y gen Rorl defectuoso), por ejemplo, para probar los compuestos que inducen resistencia en los genotipos Mlo Rorl pero exhiben susceptibilidad en el genotipo Mlo rorl, permitiendo la selección de los antagonistas del Mlo del candidato. Se pueden utilizar los compuestos del candidato de prueba identificados utilizando una prueba de segmento de hoja para reducir drásticamente el número de compuestos del candidato para pruebas in vitro adicionales.

Una etapa de selección adicional de los antagonistas del candidato puede implicar la expresión heteróloga de la proteína Mlo o un fragmento de la misma (por ejemplo, en un sistema de célula del insecto baculovirus) y el posterior ensayo de unión con las moléculas marcadas. La unión específica de los compuestos a las líneas de células que expresan la proteína Mlo en estado natural es un buen indicador de su modo de acción antagónico. El análisis de la secuencia de proteína Mlo deducida ha proporcionado una prueba evidente de que la proteína se encuentra anclada en la membrana por medio de siete hélices transmembrana y se puede representar a un miembro nuevo de la llamada familia del receptor serpentina. La conclusión se respalda por los datos de la secuencia derivados a partir de los genes homólogos identificados en la cebada, el arroz y la Arabidopsis. Las siete proteínas de la transmembrana se han representado para expresarse con alto nivel en el sistema de la célula de Baculovirus/insecto (hasta 107 moléculas por célula - Tate y Grisshamer, 1996, TIBTECH 14: 426-430). Puesto que la familia de proteínas Mlo parece que se encuentran restringidas en el reino de las plantas, éste proporciona un entorno con poca radiación de fondo para las pruebas del compuesto. Los compuestos del candidato que se encuentran o no radiomarcados, se pueden probar para la unión específica en las células Sf9 de insecto que expresan la proteína Mlo después de la infección con una construcción recombinante del baculovirus. La especificidad de la unión se puede probar además mediante la expresión Sf9 de las proteínas mlo del mutante que llevan mutaciones caracterizadas (por ejemplo, como en la Tabla 1) que lleva in vivo a la resistencia.

De este modo, en diversos aspectos adicionales de la presente invención se refiere a los ensayos para las sustancias capaces de interferir con la función Mlo, es decir, que confieren un fenotipo del mutante mlo, dichas sustancias por si mismas y sus aplicaciones.

El Mlo se puede utilizar en la identificación y/o la obtención de una sustancia que inhiba la función Mlo. El Mlo se puede utilizar en la identificación y/o la obtención de una sustancia que induzca resistencia al agente patógeno en una planta.

Los agentes se pueden identificar mediante técnicas de cribaje que implican la determinación o no de un agente bajo una prueba que inhibe o interrumpe la función Mlo para inducir un fenotipo mlo. Los inhibidores del candidato son las sustancias que unen el Mlo.

Se debería, por supuesto, observar que las referencias al "Mlo" en relación a los ensayos y los cribados se debería tomar para referirse a homólogos, tal como en otra especie, incluyendo el arroz y el trigo, no sólo en la cebada, también fragmentos, variantes, alelos y derivados apropiados del mismo. La valoración de sí una sustancia de prueba puede unir la proteína Mlo no requiere necesariamente la utilización de la longitud total de la proteína Mlo. Se puede utilizar un fragmento adecuado (o su análogo o su variante adecuados).

Los fragmentos adecuados del Mlo incluyen a los que incluyan los residuos conocidos para ser cruciales para la función Mlo según lo identificado por los alelos mlo del mutante (Tabla 1). Los fragmentos más pequeños, y los análogos y las variantes de este fragmento, se pueden emplear de modo parecido, por ejemplo, según lo identificado utilizando técnicas tales como el análisis de canceladura o el escaneado por alanina.

Además, una clase de agentes que se pueden utilizar para interrumpir actividad del Mlo son fragmentos de péptidos del mismo. Dichos péptidos tienden a ser cortos, y pueden ser de aproximadamente 40 aminoácidos de largo o menos, preferentemente de aproximadamente 35 aminoácidos de largo o menos, preferentemente de aproximadamente 30 aminoácidos de largo o menos, preferentemente de aproximadamente 25 aminoácidos o menos, preferentemente de aproximadamente 20 aminoácidos o menos, preferentemente de aproximadamente 15 aminoácidos o menos, preferentemente de aproximadamente 10 aminoácidos o menos, o 9, 8, 7, 6, 5 o menos de largo. Los péptidos pueden ser variantes o derivados de la secuencia de una secuencia Mlo en estado natural, que conservan la capacidad de interferir con la función Mlo, por ejemplo, para inducir un fenotipo mlo del mutante. Cuando se encuentran incluidos uno o más aminoácidos adicionales, dichos aminoácidos pueden ser del Mlo o pueden ser heterólogos o ajenos al Mlo. Se puede también incluir un péptido dentro de una proteína de fusión más grande, particularmente donde el péptido se funde a una secuencia no Mlo (es decir, heterólogo o ajena), tal como un dominio del polipéptido o la
proteína.

Los péptidos se pueden generar totalmente o parcialmente por síntesis química. Los compuestos se pueden preparar fácilmente según el líquido estándar bien establecido o, preferentemente, los procedimientos de síntesis de péptido en fase sólida, cuyas descripciones generales se encuentran en líneas generales disponibles (véanse, por ejemplo, en J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^{a} edición, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois 1984), en M. Bodanzsky y A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Nueva York (1984); y Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), o se pueden preparar en solución, mediante el procedimiento de fase líquida o por cualquier combinación de fase sólida, fase líquida y solución química, por ejemplo, completando primero la respectiva parte del péptido y entonces, si se desea y es apropiado, después de la eliminación de cualquier grupo de protección que estén presentes, por la introducción del residuo X mediante la reacción del respectivo ácido carbónico o sulfónico o de su derivado reactivo.

Otra manera conveniente de producir una molécula de peptidilo (péptido o polipéptido) es expresar su codificación del ácido nucleico, mediante la utilización ácido nucleico en un sistema de expresión, tal y como se ha discutido en alguna otra parte de la presente invención. Esto tiene en cuenta los agentes del péptido que se van a liberar en las plantas transgénicamente, mediante el ácido nucleico de la codificación. Si se engancha a un promotor inducible para la expresión bajo el control del usuario, esto tiene en cuenta la flexibilidad en la inducción de un fenotipo mlo y una resistencia al agente patógeno. Esto puede tener en cuenta cualquier efecto secundario que se presenta desde la interferencia con la función Mlo a ser moderada.

Un procedimiento de ensayo para una sustancia capaz de interactuar con la región relevante del Mlo, puede incluir:

(a)

la puesta en contacto de un fragmento del polipéptido o el péptido Mlo del mismo, o una variante, derivado o análogo del mismo, y un compuesto de prueba; y

(b)

la determinación de la interacción o la unión entre dicho polipéptido o péptido y el compuesto de prueba.

Se puede probar un compuesto de prueba que se ha descubierto que interactúa con la parte relevante del Mlo por la capacidad de modular, por ejemplo, interrumpir o interferir con, la función Mlo, tal y como se ha discutido anteriormente.

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Un procedimiento de ensayo para una sustancia capaz de inducir un fenotipo mlo mutante en una planta, puede incluir:

(a)

la puesta en contacto de una planta o una parte de la misma (por ejemplo, una hoja o segmento de hoja) y un compuesto de prueba; y

(b)

la determinando de la resistencia de la función Mlo y/o al agente patógeno y/o la estimulación de una respuesta de defensa en la planta.

La susceptibilidad o la resistencia a un agente patógeno se pueden determinar evaluando el crecimiento del agente patógeno, por ejemplo, para la presencia o la ausencia del oidio, o la extensión, del crecimiento miceliar.

La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido o un péptido se puede evaluar por la capacidad del compuesto de prueba de estimular una respuesta de defensa en una planta. Dichas pruebas pueden funcionar en paralelo o una prueba se puede llevar a cabo en una sustancia que de positivo en otra prueba.

Por supuesto, la persona experta en la técnica diseñará cualquier experimento de control apropiado con el que comparar los resultados obtenidos en el ensayo de prueba.

El comportamiento de un procedimiento de ensayo se puede seguir por el aislamiento y/o la fabricación y/o la utilización de un compuesto, una sustancia o una molécula que de positivo para la capacidad de modular la función Mlo y/o inducir la resistencia al agente patógeno, tal como resistencia al oidio.

El formato exacto de un ensayo se puede variar por los expertos en la técnica utilizando experiencia y conocimiento rutinarios. Por ejemplo, la interacción entre las sustancias se puede estudiar in vitro mediante el marcado con una marca detectable y puesta en contacto con otra que se ha inmovilizado en un soporte sólido. Los marcados detectables adecuados, especialmente para sustancias peptidilos, incluyen la ^{35}S-metionina que se pueda incorporar en los péptidos y los polipéptidos recombinantemente producidos. Los péptidos y los polipéptidos recombinantemente producidos se pueden también expresar como una proteína de fusión que contiene un epitopo que se pueda marcar con un anticuerpo.

Un ensayo puede también tomar la forma de un análisis in vivo. El análisis in vivo se puede realizar en una línea de células, tal como una cepa de levadura o una línea de células de mamífero en las que los polipéptidos o los péptidos relevantes se expresen a partir de uno o más vectores introducidos en la célula.

Por ejemplo, un polipéptido o un péptido que contienen un fragmento del Mlo o un peptidilo análogo o variante del mismo según lo descrito, se puede fusionar a un dominio de unión del ADN tal como el del factor de transcripción de la levadura GAL4. El factor de transcripción GAL4 incluye dos dominios funcionales. Estos dominios son el dominio de unión del ADN (GAL4DBD) y el dominio de activación de transcripción GAL4 (GAL4TAD). Mediante la fusión de dicho polipéptido o péptido a uno de esos dominios y otro polipéptido o péptido a los respectivos homólogos, se restaura un factor funcional de transcripción GAL4 solamente cuando interactúan dos polipéptidos o péptidos de interés. De este modo, la interacción de los polipéptidos o los péptidos se puede medir mediante la utilización de un gen indicador probablemente vinculado a un sitio de unión del ADN de GAL-4 que sea capaz de activar la transcripción de dicho gen indicador. Este formato de ensayo de encuentra descrito por Fields y Song, 1989, Nature 340; 245-246. Este tipo de formato de ensayo se puede utilizar tanto en células de mamífero como en las de levadura. Se encuentran disponibles en la técnica y se pueden preferir otras combinaciones de dominio de unión de ADN y dominio de activación de transcripción, por ejemplo, tal como el dominio de unión de ADN de LexA y el dominio de activación de transcripción VP60.

Cuando se buscan los péptidos u otras sustancias que interactúan con el Mlo, el polipéptido o el péptido Mlo se puede emplear como una fusión con (por ejemplo) el dominio de unión de ADN de LexA, con el polipéptido o el péptido de prueba (por ejemplo, una biblioteca de péptidos aleatoria o combinatoria) como una fusión con (por ejemplo) el VP60. Un incremento en la expresión del gen indicador (por ejemplo, en el caso de la \beta-galactosidasa una consolidación del color azul) resulta de la presencia de un péptido que interactúa con el Mlo, cuya interacción se requiere para la activación de transcripción del gen de la \beta-gactosidasa.

La cantidad de sustancia o compuesto de prueba que se puede agregar a un ensayo se determinará normalmente por ensayo y error dependiendo del tipo de compuesto utilizado. Normalmente, se puede utilizar desde aproximadamente 0,001 nM hasta 1 mM o más concentraciones de posible compuesto inhibidor, por ejemplo, a partir de 0,01 nM hasta 100 \muM, por ejemplo, desde 0,1 hasta 50 \muM, tal como aproximadamente 10 \muM. Se pueden utilizar mayores concentraciones cuando un péptido es la sustancia de prueba. Incluso una molécula que tenga un efecto débil puede ser un compuesto de plomo útil para la posterior investigación y desarrollo.

Los compuestos que se puede utilizar puede ser compuestos químicos naturales o sintéticos utilizados en programas de cribaje del fármaco. También pueden ser utilizados los extractos de plantas que contengan diversos componentes caracterizados o descaracterizados. Los anticuerpos dirigieron al Mlo o a una forma del fragmento del mismo una clase adicional de los posibles compuestos inhibidores. Se pueden caracterizar los anticuerpos del inhibidor candidato y se pueden determinar sus regiones de unión para proporcionar los anticuerpos de cadena simple y los fragmentos del mismo que son responsables de interrumpir la interacción. Otros compuestos del inhibidor candidato se pueden basar en el modelado de la estructura tridimensional de un fragmento de polipéptido o péptido y utilizar el diseño racional del fármaco para proporcionar al compuesto del inhibidor potencial características moleculares particulares de forma, tamaño y carga. Vale el observar, sin embargo, que la tecnología combinatoria de la biblioteca proporciona un modo eficiente de probar un potencialmente gran número de diversas sustancias para la capacidad de interactuar con y/o modular la actividad de un polipéptido. Dichas bibliotecas y su uso son conocidas por la técnica, para todo tipo de productos naturales, pequeñas moléculas y péptidos, entre otros. Se puede preferir en ciertas circunstancias el uso de las bibliotecas del péptido.

Después de la identificación de una sustancia o un agente que modulan o afectan la función Mlo, la sustancia o el agente se pueden además investigar. Además, se puede manufacturar y/o utilizar en preparación, es decir, fabricación o formulación, de una composición para inducir resistencia al agente patógeno en una planta. Éstos se pueden aplicar a las plantas, por ejemplo, para inducir resistencia al agente patógeno, tal como resistencia al oidio. Un procedimiento para inducir resistencia al agente patógeno en una planta puede incluir la aplicación de dicha sustancia a la planta. Se puede aplicar una molécula peptidilo a una planta transgénicamente, por la expresión del ácido nucleico codificado, tal y como se apuntó.

Un polipéptido, péptido u otra sustancia, capaces de modular o interferir con la función Mlo, induciendo resistencia al agente patógeno en una planta según lo descrito en la presente invención, o una molécula de ácido nucleico que codifica un peptidilo tal como una molécula, se pueden proporcionar en un conjunto, por ejemplo, sellado en un envase adecuado que proteja su contenido contra el ambiente exterior. Dicho conjunto puede incluir las instrucciones para su uso.

La presente invención se ejemplificará ahora mediante la ilustración con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1: Clonación Posicional del Mlo. El locus Mlo se ha trazado con precisión cada vez mayor en el brazo largo del cromosoma 4 de la cebada utilizando marcadores morfológicos, RFLP y AFLP. La parte superior de la figura presenta los mapas de combinaciones genéticas de estos marcadores en relación con el Mlo. Todas las distancias genéticas se encuentran indicadas en centiMorgan (cM) en base al análisis de vinculación de los componentes multipunto a excepción de las distancias genéticas entre los marcadores AFLP que se calculan mediante los dos puntos de las estimaciones. El mapa del marcador morfológico (Jørgensen, 1977) coloca el Mlo en una distancia de más de 20 cM de la vaina foliar vellosa (Hs) y la vaina/punta brillante (gsl). El mapa del marcador RFLP se basa en el análisis de 257 individuos F_{2} derivados del cruzamiento Carlsberg II Mlo Grannenlose Zweizeilige mlo-11. El mapa RFLP previamente publicado (Hinze et al., 1991) del mismo cruzamiento se basó en solamente 44 individuos F_{2}. El gen se delimitó a un intervalo de 2,7 cM limitado por los marcadores bAO11 y bAL88. Los marcadores AFLP se identificaron y se trazaron según lo descrito en procedimientos experimentales. Su distancia genética al Mlo se basa en el cruzamiento Ingrid Mlo x BC_{7} Ingrid mlo-3. El resultado crucial del análisis del AFLP ha sido la identificación de dos marcadores, Bpm2 y Bpm9, definiendo intervalos de 0,64 cM que contenían el locus Mlo y un marcador (Bpm16) cosegregando con el Mlo sobre la base de más de 4.000 eventos meióticos. El marcador Bxm2 que se encuentra situado a 0,1 cM en la orientación telomérica del Mlo se derivado de la plantilla de ADN del BAC F15 (véase posteriormente). Un clon del YAC, el YAC YHV303-A6, que contiene el marcador Bpm16 cosegregando y dos locus que lo flanquean (Bpm2 y Bpm9), se representa en la sección central de la figura. La posición del marcador Bpm9 solamente se estimaba por así decirlo dentro del clon YAC según lo indicado por la flecha. La inserción de BAC F15 representa un subfragmento de 60 kb de este YAC según lo indicado en la parte más inferior de la figura. Después de la identificación del marcador Bpm2 del AFLP en el BAC F15, el marcador Bxm2 se descubrió y se colocó a 0,1 cM en la orientación telomérica del Mlo. Se encuentran indicados la posición física aproximada de los marcadores Bpm2, Bpm16 y Bxm2 del AFLP (que abarca un intervalo de aproximadamente 30 kb) así como la localización de algunos sitios de restricción que tienen lugar rara vez. Las líneas discontinuas por debajo de la representación esquemática del ADN del BAC F15 representan la posición de los cóntigos más grandes establecidos de la secuencia del ADN. La estructura del gen Mlo se da esquemáticamente en el fondo de la Figura. Los exones se encuentran destacados mediante barras negras. Las posiciones de los eventos mutacionales se indican para los once alelos mlo probados. Los alelos del mutante que llevan las cancelaciones en su secuencia de nucleótidos se marcan con un \Delta; los alelos del mutante restantes representan substituciones de un solo nucleótido dando lugar en cada caso a intercambios de aminoácidos.

La Figura 2 representa una secuencia de codificación del Mlo y una secuencia codificada de aminoácidos según la presente invención. Se representa la secuencia de aminoácidos predecida a partir de secuencias de ADN de productos de RT-PCR de Mlo Ingrid. Los números de los nucleótidos se dan según el sitio de inicio de translación.

Figura 3: El Análisis de Transferencia Northern de la Acumulación de Transcripción del Mlo. El ARN (20 \mug) y el ARN poly(A)^{+} (5 \mug) totales de las hojas primarias de cebada no infectadas de siete días de vida de uno en estado natural (cultivo Ingrid Mlo) y dos cultivos mutantes (BC Ingrid mlo-1, BC Ingrid mlo-3) se aislaron, separados en un gel de formaldehído al 1,2% y transferidos a una membrana de nitrocelulosa (Hybond). El filtro se probó en condiciones rigurosas (Sambrook et al., 1989) con el producto de RT-PCR del mismo tamaño radiomarcado derivado del Ingrid Mlo (Figura 7). Se detecta sólo una señal clara en los carriles que contienen ARN poly(A)^{+}. La señal corresponde a un tamaño de aproximadamente 2 kb.

Figura 4: El Análisis de Transferencia Southern de Recombinantes Intragénicos derivados de cruzamientos heteroalélicos de mlo. Los alelos de dos marcadores RFLP que flanqueaban el Mlo en lados opuestos de los individuos susceptibles F_{2} o la progenie resistente homocigótica y susceptible homocigótica se determinaron mediante el Análisis de Transferencia Southern. El ADN de la planta (10 \mug) de los individuos se digirieron con Pst I (A) o Hae III (B) y se hibridó con los marcadores WG114 (panel superior; trazos a 3,1 cM en la orientación centromérica al Mlo; véase la Figura 1) y ABG366 (el panel más bajo; trazos a 0,7 cM en la orientación telomérica al Mlo; véase la Figura 1) del RFLP radiomarcados, según procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989). Se probaron un ADN de las líneas parentales mlo-8 y mlo-1 y dos progenies susceptibles homocigóticas (S, Mlo Mlo) y dos progenies resistentes (R, mlo mlo) derivadas a partir de dos plantas susceptibles F_{2} (designadas 1 y 2). Los ADNs en los carriles S y R representan la selección de individuos F_{3} a partir de familias F_{3} obtenidas mediante la autofecundación de los individuos F_{2} susceptibles 1 y 2. Apuntar que se espera que los individuos susceptibles F_{2} sean heterocigóticos en el Mlo en este esquema de la sección. Los fenotipos de la infección se anotaron siete días después de la inoculación con el K1 aislante avirulento del mlo. El ADN de un tercer individuo susceptible de este cruzamiento heteroalélico (véase la Tabla 7) no se encuentra incluido en esta Figura. Se probaron el ADN B de las líneas parentales mlo-5 y mlo-1 y siete progenies susceptibles homocigóticas (S, Mlo Mlo) y siete progenies resistentes (R, mlo mlo) derivados a partir de siete plantas F_{2} susceptibles (designadas del 1 al 7). Los ADNs en los carriles S y R representan los individuos F_{3} seleccionados de las familias F_{3} obtenidas mediante la autofecundación de los individuos F_{2} susceptibles 1 a 7. Se analizó el ADN a partir de dos individuos susceptibles adicionales de este cruzamiento heteroalélico solamente en la generación F_{2} (8* y 9*).

La figura 5 representa una alineación de secuencias genómicas que cubren el gen Mlo de la cebada y un homólogo del arroz aislado por medio de la hibridación cruzada con una sonda específica del gen de la cebada. La línea superior representa la secuencia genómica del ADN del Mlo de la cebada (las secuencias de exón se encuentran subrayadas). La línea del fondo representa la secuencia genómica del arroz la secuencia que contiene el homólogo del Mlo del arroz.

Figura 6 representa una alineación de secuencias genómicas que llevan el gen Mlo de la cebada y un homólogo de la cebada aislado por medio de la hibridación cruzada con una sonda específica del gen de la cebada. La línea superior representa una secuencia del ADN genómico del Mlo de la cebada (las secuencias de exón se encuentran subrayadas). La línea del fondo representa la secuencia genómica que contiene el homólogo del Mlo de la cebada.

Figura 7: Nucleótido y Secuencia de Aminoácidos Deducida a partir del ADNc del Mlo de la cebada. El nucleótido y la secuencia de aminoácidos deducida se basan en los datos combinados de RT-PCR y RACE obtenidos a partir de experimentos utilizando el ARN del cultivo Ingrid Mlo. Se marca mediante un asterisco el codón de terminación, se subraya la posible señal de poliadenilación y los términos detectados de los productos RACE se indican mediante flechas sobre la secuencia. Las posiciones de los intrones tal y como se identifican por comparación con los clones genómicos correspondientes se marcan mediante triángulos debajo de la secuencia del ácidos nucleicos. Seis hélices precedidas que abarcan la transmembrana según el algoritmo de MEMSAT (Jones et al., 1994) se encuentran en barras en color gris. Una posible señal de localización nuclear (K-K-K-V-R) y el sitio de la quinasa de la caseína II (S-IF-D) en la mitad del terminal carboxilo de la proteína se representan en negrita.

La Figura 8 representa la secuencia genómica del homólogo del arroz (Oryza sativa) que incluye las secuencias de codificación y flanqueadoras.

La Figura 9 representa la secuencia genómica del homólogo de la cebada (Hordeum vulgare) que incluye las secuencias de codificación y flanqueadoras.

La Figura 10 representa la secuencia de ADNc del homólogo del arroz.

La Figura 11 representa la secuencia de ADNc del homólogo de la cebada.

La Figura 12 representa la secuencia de ADNc del homólogo de la Arabidopsis thaliana.

La Figura 13 representa la secuencia de aminoácidos del homólogo del arroz.

La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos del homólogo de la cebada.

La Figura 15 representa la secuencia de aminoácidos del homólogo de la Arabidopsis.

La Figura 16 representa un buen conjunto de secuencias de aminoácidos de los homólogos del Mlo, la cebada, el arroz y la Arabidopsis.

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Ejemplo 1

Clonación del Mlo de la cebada Búsqueda objetiva de los marcadores AFLP fuertemente vinculados al Mlo

Los esfuerzos para aumentar la densidad del marcador del ADN alrededor de Mlo se coordinaron intentando construir un mapa genético de alta resolución local. Una posibilidad diferente habría sido ampliar el tamaño de la población del cruzamiento Carlsberg II Mlo x Grannenlose Zweizeilige mlo-11 caracterizado (Hinze et al., 1991) pero tenía sentido para que fuera ventajoso establecer un mapa de alta resolución que comenzaba a partir del unas líneas BC de mlo adecuadas y de su línea parental recurrente. Lo que importa es que parental donante de la línea BC representa un fondo genético diferente en comparación con la línea parental recurrente. De esta manera, la búsqueda de los marcadores AFLP vinculados se podía comenzar paralelamente con la generación de una población de trazado grande a partir de un cruzamiento entre las mismas líneas genéticas. Además, la línea BC basada en el cruzamiento permitió la prueba de colinealidad de los marcadores del ADN en las inmediaciones del Mlo según lo determinado a partir del cruzamiento Carlsberg II Mlo x Grannenlose Zweizeilige mlo-11 (Hinze et al., 1991). Para el nuevo cruzamiento a una línea de retrocruzamiento (BC) de mlo-3 se utilizó que se había retrocruzamiento siete veces en el fondo Ingrid genético (BC_{7} Ingrid mlo-3; Hinze et al., 1991). La línea se caracterizó previamente para llevar un segmento de ADN introgresado relativamente pequeño en el cromosoma 4 de la cebada. Además, la línea parental donante de la Malteria Heda mlo-3 muestra con respecto al ADN de los polimorfismos Ingrid parentales recurrentes con la mayor parte de los locus RFLP identificados vinculados al Mlo. De este modo, buscando polimorfismos solamente entre dos plantillas de ADN, a partir de líneas Ingrid Mlo y BC7 Ingrid mlo-3, esperábamos aumentar la densidad de los marcadores de ADN con los AFLPs alrededor del Mlo de una manera objetiva.

Las mismas dos líneas se cruzan para establecer una población de segregación para el trazado de alta resolución de los marcadores del ADN, representando formalmente unos ocho retrocruzamientos. Los individuos F_{2} se anotaron para la resistencia del mlo después de la inoculación del oidio con el K1 aislante (virulento en el Ingrid Mlo y no virulento en el BC_{7} Ingrid mlo-3). Inicialmente, solamente una pequeña fracción de F_{2} (77 individuos) se analizaron para la recombinación de eventos con marcadores de RFLP flanqueadores. El análisis de cuatro recombinantes identificados (designados como 8-32-2, 7-38-4, 1-34-1 y 1-49-4) indicó la colinealidad del orden del marcador en este cruzamiento comparado con el cruzamiento Carlsberg II Mlo x Grannenlose Zweizeilige mlo-11 (Hinze et al., 1991) analizado previamente. Varias de las 77 plantas de semillero F_{2} que exhibieron un fenotipo susceptible y una heterocigocidad para los locus de marcadores del ADN flanqueadores probados (bAO11, bAL88/2, y bAP91; Hinze et al., 1991) se maduraban para proporcionar además el material de la semilla autofecundada que segregaba para el Mlo/mlo-3 en la generación F_{3}. En total, el material de la hoja se cosechó para el marcador de alta resolución que trazaba a partir de 2.026 individuos derivados de la generación F_{2} o F_{3} autofecundada.

Los candidatos a marcadores de AFLP se identificaron probando todas las combinaciones posibles de cebador Pst I/Mse I (1.024) que se extendían en secuencias genómicas hasta las posiciones del nucleótido +2 y +3, respectivamente. De modo parecido, se ha analizado casi 1.900 combinaciones de cebador Eco RI/Mse I (+3/+3). Cuatro plantillas de ADN se incluyeron en este análisis: Ingrid Mlo, BC_{7} Ingrid mlo-3, una fuente de ADN de dos individuos F_{2} fenotípicamente resistentes del mlo, y una fuente de ADN de nueve individuos F_{2} fenotípicamente susceptibles. Los individuos F_{2} resistentes y susceptibles que se incluyeron como fuentes de ADN en la búsqueda de AFLPse habían seleccionado del análisis RFLP mencionado anteriormente de 77 segregantes F_{2}. El ADN de F_{2} combinada nos permitió controlar si los polimorfismos del candidato detectados entre la plantilla de ADN de los parentales eran rasgos hereditarios en el F_{2}. Todos los marcadores identificados del candidato de AFLP se han reexaminado con ocho plantillas de ADN: Ingrid Mlo, BC_{7} Ingrid mlo-3, fuentes de ADN de individuos de tres familias F_{3} que sean susceptibles homocigóticos fenotípicamente (Mlo Mlo) según los experimentos de inoculación de K1; ADN de tres individuos F_{2} resistentes. Un total de 18 cebadores Pst I/Mse I y 20 Eco RI/Mse I se confirmaron en base al procedimiento de selección.

El número de marcadores AFLP identificados fue útil para asignarlos primero por así decirlo para los intervalos del marcador basados en el mapa RFLP alrededor del Mlo. Se esperaba que este enfoque permitiera tanto la evaluación de la distribución de los AFLPs entre los intervalos RFLP previamente identificados cerca del Mlo como la selección de un par de marcadores AFLP flanqueadores con los que los recombinantes se podrían identificar entre los 2.026 segregantes. Para la asignación del AFLP utilizamos esos cuatro recombinantes que se habían identificado con los marcadores RFLP fuera de la pequeña muestra mencionada anteriormente de 77 segregantes F_{2} a partir del Ingrid Mlo x BC_{7} Ingrid mlo-3 (dos recombinantes en el intervalo bAP91-bAL88, uno en el Mlo-bAO11, y uno en el bAO11-ABG366). Se encontraron un total de 18 AFLPs para ser situados dentro de una distancia genética de aproximadamente 3,5 cM incluyendo el Mlo.

Construcción de un mapa de AFLP de alta resolución alrededor del Mlo

Se utilizó un procedimiento de dos etapas para construir el mapa del AFLP de alta resolución. Primero, se cribaron los 2.026 segregantes para los eventos de recombinación entre los dos marcadores del AFLP en los lados opuestos del Mlo y posteriormente se utilizaron solamente los pocos recombinantes identificados para trazar todo los AFLPs identificados en el intervalo objetivo de 3,5 cM. Se eligieron los marcadores Bpm1 y Bpm9 del AFLP, detectando cada uno fragmentos alélicos de ADN en el Ingrid Mlo y el BC_{7} Ingrid mlo-3 y situados en sitios opuestos del Mlo para el cribaje de las plantillas de ADN de los segregantes para los eventos de recombinación. Alternativamente, la búsqueda para los recombinantes se habría podido llevar a cabo con los marcadores bAO11 y bAL88 del RFLP flanqueadores. Sin embargo, aunque la conversión en los sitios polimórficos amplificados escindidos (CAPS) fuera acertada para ambos marcadores, se toparon con dificultades para exhibir los alelos de ambos locus simultáneamente a partir del ADN genómico purificada de forma rudimentaria. Se cribaron un total de 2.026 individuos (los segregantes F_{2} o F_{3}) simultáneamente con los marcadores Bpm1 y Bpm9 del AFLP y se identificaron 98 recombinantes. El análisis del AFLP se llevó a cabo posteriormente con cada uno de las 98 plantillas de ADN de los recombinantes para identificar los alelos de cada uno de los identificados de los locus de AFLP. Los recombinantes se han autofecundado y los experimentos de inoculación con el K1 aislante del oidio se realizaron utilizando al menos 25 individuos de cada familia recombinante para deducir los alelos de la generación anterior en el locus Mlo. Los datos obtenidos permitieron la construcción de un mapa de alta resolución alrededor del Mlo basado en más de 4.000 eventos meióticos y una resolución de al menos 0,025 cM derivados por medio de los dos puntos de las estimaciones. El resultado esencial ha sido la identificación de un marcador del ADN cosegregando con el Mlo (Bpm16) y dos marcadores flanqueadores (Bpm2 y Bpm9) a una distancia de 0,25 y 0,4 cM, respectivamente (Figura 1).

Construcción de una biblioteca de YAC de la cebada de gran tamaño de insertos, aislado del Bpm16 que contiene los YACs, y la delimitación física del Mlo

La evidencia genética indica que la resistencia del mlo es debida a la pérdida de la función en el alelo en estado natural del Mlo. Por lo tanto, se decidió para establecer una biblioteca de YAC de gran tamaño de insertos a partir del cultivo Ingrid Mlo en el vector pYAC4 (Burke et al., 1987; Hieter, 1990). El ADN de la Megabase adecuado para los experimentos de clonación del YAC se preparó en cantidades de miligramos a partir de los protoplastos mesófilos de semilleros de cinco días de vida según un protocolo modificado descrito por Siedler y Graner (1991). El ADN se digirió parcialmente con Eco RI en presencia de metiltransferasa de Eco RI para obtener fragmentos de ADN después de la electroforesis en gel en campo pulsante (PFGE) preparatoria en el rango de tamaño de 500 - 600 kb. Después de que la ligadura con Eco RI digiriera el pYAC4, el ADN se transformó en la cepa de la levadura AB1380 y se seleccionaron las colonias que llevaban el ADN del pYAC4 recombinante en el medio completo sintético solidificado que carecía de triptofano y uracilo (Sherman et al., 1986). Se probaron cuarenta colonias de levadura aleatoriamente seleccionadas para la presencia de ADN de la cebada utilizando ADN genómico del ADN marcado de la cebada en experimentos Southern. Se encontró el tamaño de los insertos del YAC después de las separaciones del PFGE para variar entre los 500 y los 800 kb. En promedio se esperaba que una distancia genética de 0,2 cM para representarse en el clon individual del YAC recombinante. Se han generado un total de \sim40.000 clones que representaban cuatro equivalentes del genoma de la cebada.

Se han aislado cuatro clones del YAC (designados como 303A6, 322G2, 400H11 y 417D1) con el marcador Bpm16 cosegregando con el Mlo. Su tamaño de insertos se determinó por el PFGE para ser de 650, 710, 650 y 820 kb, respectivamente. El análisis del AFLP había demostrado que tres de estos clones (303A6, 322G2 y 417D1) contienen también ambos locus del marcador flanqueador mientras que el clon 400H11 contiene solamente los locus Bpm16 y Bpm2. Estas conclusiones sugirieron con fuerza que el gen Mlo se había delimitado físicamente en los clones recombinantes 303A6, 322G2 y 417D1 del YAC.

El YAC 303A6 se eligió para los experimentos de subclonación en el vector pECSBAC4 del BAC que contenía un sitio Eco RI único (Shizuya et al., 1992; el vector pECSBAC4 se encuentra descrito por Frijters y Michelmore, 1996; presentado). El ADN total de la levadura de este clon se digirió parcialmente con Eco RI para obtener fragmentos de ADN con un tamaño medio del 50 kb y ligado en el vector del BAC digerido y desfosforilado del Eco RI. Las colonias de bacterias que contenían el ADN derivado del YAC 303A6 en el pECSBAC4 se identificaron mediante replica de los experimentos de hibridación de colonias. Un conjunto de la colonia que contenía las membranas se hibridó con el ADN del AB1380 de la levadura marcado y el conjunto de replica se hibridó con el ADN del YAC303A6 marcado purificado con PFGE. Los clones recombinantes del BAC que contienen el locus Bpm16 del AFLP se identificaron posteriormente utilizando el fragmento Pst I/Mse I de Bpm16 genómico clonado de 108 pb como sonda en los experimentos de hibridación de la colonia.

Un clon BAC, el BAC F15, que contiene un inserto de \sim60 kb se escogió para estudios detallados adicionales. Se encontró que el clon BAC recombinante contenía además el Bpm2 del locus del marcador del AFLP, pero no el Bpm9. En este punto, el ADN del inserto F15 del BAC indicó la acertada delimitación física en la orientación telomérica pero no se sabía si el inserto contendría secuencias que limitan en la dirección centromérica. En vez de construir un cóntigo de BAC entre el Bpm 16 y el Bpm9, se eligió la opción para desarrollar nuevos marcadores polimórficos a partir del BAC F15. Un polimorfismo alélico Xba I/Mse I (designado como Bxm2) se identificó entre las líneas parentales del Ingrid Mlo y el BC_{7} Ingrid mlo-3.

Un análisis de los 25 individuos recombinantes que llevaban los eventos de recombinación dentro del Mlo que contenía el intervalo Bpm2 - Bpm9 permitió el trazado del Bxm2 en la orientación centromérica a una distancia de 0,1 cM del Mlo. Solamente se encontraron cuatro de los 16 recombinantes disponibles en el intervalo Bpm9 - Mlo y ninguno de los 9 recombinantes en el intervalo Mlo - Bpm2 para exhibir un evento de recombinación entre el Bxm2 y el Mlo. Se concluyó que el Mlo se había delimitado físicamente en el BAC F15 entre los locus Bpm2 y Bxm2 del marcador (Figura 1).

Identificación del gen Mlo y de los mutantes del mlo

Se inició un proyecto de secuencia al azar para determinar los cóntigos de la secuencia del inserto de \sim60 kb de BAC F15 antes de que el marcador Bxm2 se identificara y se mostrara para delimitar el gen en la orientación telomérica. En paralelo, se generó un mapa físico (Figura 1). El mapa físico indicó que los marcadores Bpm2 y Bxm2 flanqueadores son separados físicamente por \sim30 kb. Los cóntigos de la secuencia se buscaron en las regiones de alta probabilidad de codificación utilizando las versiones UNIX del paquete de programas STADEN. Solamente un cóntigo de la secuencia de casi 6 kb, incluyendo el marcador Bpm16 cosegregando, reveló una extensa región con alta probabilidad de codificación.

Las reacciones de la RT-PCR se realizaron con el ARN total de la hoja derivado del cultivo Ingrid Mlo utilizando una serie de cebadores deducidos a partir de las regiones que indicaron altas probabilidades de la codificación y obtenidas en cada caso un distinto producto de amplificación. La secuencia de los productos de la RT-PCR más grandes reveló un solo marco de lectura abierto extenso de 1.602 pb (Figura 2). La posible proteína deducida de 533 aminoácidos tiene un peso molecular de 60,4 kDal. El producto de la RT-PCR de \sim1,7 kb se utilizó como una sonda de hibridación y se detectó una sola transcripción de ARN de \sim1,9 kb de longitud (Figura 3). Una comparación de la secuencia genómica y del fragmento más grande de la RT-PCR revela 12 exones y 11 intrones, cada uno flanqueado por las secuencias del sitio del empalme características (Figura 1).

Ya que el marcador Bpm16 se encuentra situado en el extremo 3' del gen descrito anteriormente (exón 11) y se cosegrega con el locus Mlo, comenzamos una secuencia directa de la PCR de varios alelos inducidos por el mutágeno disponibles de resistencia del mlo. Identificamos en 14 de 15 alteraciones probadas de nucleótido de alelos del mutante que dan lugar a alteraciones individuales del aminoácido, cancelaciones o cambios del marco de la secuencia en estado natural (Tabla 1). Sospechamos que el mlo-2 del alelo del mutante se encuentra situado dentro del promotor o de las secuencias no translacionadas 5'. La región es de notoria dificultad para secuenciarse por medio de la secuencia directa de la PCR de la plantillas de ADN genómicos pero es probable que los experimentos que utilizan una serie de cebadores anidados solucionen este problema. En resumen, la secuencia comparativa del ADN genómico a partir de diversas líneas de mlo mutante y sus respectivos cultivos en estado natural de Mlo proporcionaron una prueba evidente que el Mlo se ha identificado.

Recombinantes Intragénicos

Había sido la intención proporcionar una cadena de evidencia para el aislamiento molecular del Mlo que no se basara en experimentos de complementación por medio de las plantas transgénicas de la cebada. Habíamos elegido desarrollar una herramienta genética inusual para confirmar que el gen identificado representaba el Mlo. Se razonó que si las mutaciones observadas en el gen descrito anteriormente provocaron la resistencia al hongo del oidio, los eventos de recombinación entre los sitios del alelo mutante deberían restablecer las secuencias en estado natural. Se predijo que aquellos recombinantes intragénicos pondrían de manifiesto la susceptibilidad en el ataque del oidio.

Se concibió un esquema de cruzamiento implicando los alelos de resistencia del mlo, el mlo-1, el mlo-5 y el mlo-8. Los alelos mutantes se originan a partir de los fondos genéticos Haisa (mlo-1) y Carlsberg II (mlo-5 y mlo-8). Los cruzamientos intermutantes se realizaron según se representa en la Tabla 2 que genera en cada caso por lo menos 10 plantas F_{1}. Las poblaciones F_{2} se obtuvieron por autofertilización. Las plantas de semillero F_{2} se criban para los individuos susceptibles poco comunes después de la inoculación con el K1 aislante del oidio que es virulento en cada cultivo en estado natural del Mlo parental. Los individuos F_{2} susceptibles se identificaron con una frecuencia de \sim6 x 10^{-4}. En cambio, si los números comparables de progenies a partir de las autofecundaciones de cada uno de los mutantes del mlo se probaron para la resistencia al K1, no se identificó ninguna planta de semillero susceptible. Esta conclusión indicó con fuerza que la mayoría de los individuos susceptibles derivados de los cruzamientos intermutantes no era debido a los eventos de reversión espontáneos de los alelos mlo mutantes.

La herencia de los individuos F_{2} susceptibles se probó después de la autofecundación en las familias F_{3}. Cada uno de los individuos F_{2} segregó a los individuos F_{3} susceptibles y resistentes que indicaban la heterocigocidad para la resistencia/susceptibilidad que conferían los alelos en los F_{2}. Las progenies F_{3} susceptible homocigóticas se aislaron para la mayoría de individuos F_{2} susceptibles mediante la autofecundación de individuos F_{3} y la identificación posterior de familias F_{4} en quienes solamente detectaron a los individuos susceptibles.

Se ha realizado un análisis molecular de los individuos susceptibles utilizando los marcadores del RFLP conocidos por estar firmemente vinculados (< 3 cM) a cada lado del locus Mlo (Figura 4). El marcador WG114 del RFLP traza en orientación centromérica al Mlo, el marcador ABG366 traza en dirección del telómero. Los alelos del RFLP detectados se representan para los cruzamientos intermutantes mlo-8 x mlo-1 (A) y mlo-1 x mlo-5 (B). Se analizó el ADN a partir de los individuos F_{2} susceptibles (indicados mediante un *) o a partir de la progenie F_{3} susceptible homocigótica (S) y resistente homocigótica (R) obtenidos a partir de los individuos F_{2} susceptibles autofecun-
dados.

La progenie F_{3} susceptible homocigótica de la planta F_{2} número #1 susceptible del cruzamiento mlo-1 x mlo-8 (Figura 4) revela el alelo WG114 derivado del mlo-1 parental en orientación centromérica al lado del Mlo y el alelo ABG366 del mlo-8 parental en la orientación telomérica al Mlo. La progenie F_{3} resistente homocigótica de la planta F_{2} número #1 de este cruzamiento revela en cambio solamente los alelos del marcador flanqueador derivados del mlo-1 parental. La conclusión indicó con fuerza que la susceptibilidad en la planta F_{2} número #1 es provocada por un tipo de sobrecruzamiento de recombinación en la meiosis precedente de un cromosoma que da lugar a una restitución del alelo en estado natural del Mlo mientras que el segundo cromosoma F2 del individuo 1 contiene un alelo funcionalmente inalterado del mlo-1. Los alelotipos de los locus del RFLP de la progenie F_{3} susceptible homocigótica de la planta F_{2} número #2 susceptible son idénticos a los descritos anteriormente. Sin embargo, los alelos del marcador flanqueador de la progenie F_{3} resistente homocigótica de este individuo se encuentran en ambos casos derivados a partir del mlo-8 parental. Se concluye que un tipo de cruzamiento de recombinación restituyó otra vez un alelo en estado natural del Mlo en el individuo F_{2} número #2 susceptible.

Nueve individuos F_{2} susceptibles se recuperaron del cruzamiento mlo-1 x mlo-5 (Figura 4). Para los individuos F_{2} números #1 a #7 susceptibles se analizaron en el nivel del ADN tanto la progenie F_{3} susceptible homocigótica como la resistente homocigótica. Observar que solamente el ADN de los individuos F_{2} susceptibles heterocigótica se analizó en el caso de los individuos números #8 y #9 (marcados mediante un *). Se observaron los siguientes patrones del alelo con respecto a los locus del RFLP flanqueador: (i) La progenie F_{3} resistente homocigótica demostró en ambos lados del Mlo o solamente los alelotipos de los locus WG114 y ABG366 derivados del mlo-1 parental (los individuos números #1, #3, #6, #7) o solamente los alelotipos derivados del mlo-5 parental (los individuos números #2, #4, #5). (ii) La progenie F_{3} susceptibles homocigóticos demostró en cambio o solamente los alelotipos de ambos locus derivados del mlo-5 parental (los individuos números #3, #5, #6) o demostraron diversos alelotipos en ambos lados del Mlo (los individuos números #1, #2, #4, #7). (iii) La progenie F_{3} susceptible homocigótica con diversos alelotipos en ambos lados contiene siempre en orientación centromérica el alelo WG114 derivado del mlo-1 y en orientación telomérica el alelo ABG366 derivado del mlo-5. (iv) El individuo F_{2} número #8 susceptible heterocigótico revela en cualquier lado cerca del Mlo solamente a los alelos derivados del mlo-5 parental. El individuo número #9 susceptible heterocigótico revela en los alelos en orientación centromérica derivados tanto del mlo-1 parental como del mlo-5 parental mientras que solamente el alelo derivado del mlo-5 se detecta en orientación telomérica. Una interpretación global de los datos sugiere que la susceptibilidad en los individuos F2 números #1, #2, #4, #7 y #9 sea provocada por un tipo de sobrecruzamiento de recombinación que restituye el alelo en estado natural del Mlo. Los tipos de no sobrecruzamiento de recombinación pudieron haber restituido el alelo en estado natural del Mlo en los individuos números #3, #5, #6 y #8.

Una compilación de los alelos detectados del RFLP flanqueador de todos los individuos F_{2} susceptibles aislados o la progenie F_{3} homocigótica se representa en la Tabla 3. Observar que el individuo número #3 del cruzamiento mlo-1 x mlo-8 no se representa en la Figura 4. La compilación revela que (i) los tipos de sobrecruzamiento de recombinación (CO) y los tipos de no sobrecruzamiento de recombinación (NCO) se encuentran en una proporción de 7:5, (ii) los tipos de cruzamiento de recombinación se encuentran resueltos unidireccionales, y (iii) los recombinantes del NCO no se observaron con los alelos del RFLP vinculados al mlo-1 parental.

Los recombinantes intragénicos del tipo CO aislados de los cruzamientos mlo heteroalélicos se utilizaron para probar si habían sido restituidas las secuencias en estado natural del gen candidato del Mlo. Para los tres alelos relevantes mlo-1 mlo-5 y mlo-8 se ha identificado los sitios de mutación del candidato de los alelos (Tablas 1 y 4). La secuencia directa de la PCR del ADN genómico de los recombinantes intragénicos susceptibles derivados tanto de los cruzamientos heteroalélicos mlo-1 x mlo-8 como de los mlo-1 x mlo-5 reveló la restitución de las secuencias en estado natural (Tabla 4). Esta observación sugiere con fuerza que el evento de sobrecruzamiento intragénico tuvo lugar entre el nucleótido -1 y el +483 en el primer cruzamiento y entre el +3 y el +483 en el segundo cruzamiento (según el sitio de inicio translacional). De este modo, el análisis molecular de siete recombinantes intragénicos a partir de dos cruzamientos heteroalélicos proporciona la prueba final de que el gen candidato descrito anteriormente representa el Mlo.

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Ejemplo 2

Homólogos del gen Mlo identificado

Las bases de datos disponibles de la secuencia tag expresada (EST) de la Oryzae sativa (arroz) y la Arabidopsis thaliana se buscaron para las secuencias homólogas de la proteína. Cinco clones de ADNc de la Arabidopsis se identificaron con los que se dedujeron las secuencias de aminoácidos mostraba una sustancial similitud a la proteína del Mlo. Notable es el clon 205N12T7 del ADNc que revela una probabilidad aleatoria de 1,2 x 10^{-45}. Además, se encontró al menos un homólogo significativo en el arroz (OSR16381A).

Una biblioteca de BAC de arroz (Wang et al., 1995) también se ha cribado con un fragmento genómico de la cebada marcado que contenía el Mlo. Se aisló un clon de BAC que contenía un inserto de \sim23 kb. El posterior aislamiento permite la subclonación de un fragmento de arroz genómico Pst I de 2,5 kb que demuestra la fuerte hibridación cruzada con la sonda del gen Mlo de la cebada. La secuencia del ADN de este fragmento reveló notables semejanzas de la secuencia del ADN dentro de las secuencias del exón del gen Mlo de la cebada (Figura 5).

Finalmente, el clon de la cebada genómica \lambda de 13 kb derivada del cultivo Igri (Stratagene) se aisló con un fragmento genómico de cebada marcado que contenía el Mlo. La secuencia de nucleótidos derivada de un fragmento Sac I de 2,6 kb subclonado revela otra vez amplias semejanzas de la secuencia en gen Mlo (Figura 6). La localización del homólogo del Mlo de la cebada dentro del genoma no se encuentra dentro del ADN de BAC F15.

En resumen, existe una prueba concluyente para los homólogos del Mlo tanto en una especie de planta monocotiledónea como dicotiledónea.

Discusión

Cualquier especulación en cuanto al modo de acción del Mlo y el ácido nucleico y los polipéptidos del mlo no debería proporcionar ninguna limitación en la naturaleza o el alcance de cualquier aspecto o realización de la presente invención.

En plantas, la resistencia a los agentes patógenos se determina con frecuencia mediante los genes de resistencia dominantes, cuyos productos se supone que reconocen los productos del gen de avirulencia derivados del agente patógeno. Este modo de defensa al agente patógeno sigue la hipótesis gen a gen de Flor (Flor, 1971). Recientemente, varios genes de resistencia del tipo "gen a gen" se han aislado molecularmente (Martin et al., 1993; Bent et al., 1994; Jones et al., 1994; Mindrinos et al., 1994; Whitham et al., 1994; Grant et al., 1995; Lawrence et al., 1995; Song et al., 1995). La sorprendente conclusión es que las proteínas deducidas comparten notables dominios estructurales similares aunque provocan las reacciones de resistencia a los agentes patógenos tales como virus, hongos y bacterias (Dangl, 1995; Staskawicz et al., 1995). Los genes aislados codifican para las proteínas que contengan una región rica en leucina (LRR), con o sin un sitio de unión del nucleótido sujeto (NBS), indicativo de la unión del ligando y la interacción proteína - proteína o codifican una simple serina/treonina quinasa. Una combinación estructural de la LRR y el dominio de la quinasa se ha divulgado en la proteína deducida del gen de resistencia Xa21 del arroz (Song et al., 1995). La similitud estructural de los genes de resistencia en una defensa del tipo "gen a gen" hace posible la existencia de unos mecanismos de resistencia subyacentes comunes.

La resistencia mediada por los alelos de resistencia recesivos del gen Mlo difieren en varios aspectos de la resistencia "gen a gen" (véase los comentarios introductorios anteriores). El aislamiento molecular del gen Mlo y la secuencia de varios alelos mlo inducidos por mutación descritos en la presente invención, confirma las interpretaciones anteriores de los estudios genéticos mutacionales y mendelianos combinados (Hentrich, 1979; Jørgensen, 1983). Se concluye que los alelos defectuosos del locus Mlo median la resistencia de amplio espectro a los agentes patógenos tal como el patógeno oidio. Esto es contradictorio con la implicación de un evento de reconocimiento específico de un producto derivado de un patógeno tal y como se ha propuesto para los genes de resistencia específicos de la raza.

Los efectos pleiotrópicos de los alelos mlo han proporcionado algunas pistas hacia el desarrollo de un concepto molecular de la respuesta de la resistencia de amplio espectro observada.

En primer lugar, las plantas del mlo que crecen asépticamente exhiben en una alta frecuencia una formación espontánea de las aposiciones de la pared celular (CWAs) en las células epidérmicas de la hoja (Wolter et al., 1993). Esas CWAs se forman habitualmente en respuesta al intento de penetración del agente patógeno directamente por debajo del apresorio fúngico. Se cree que las CWAs forman una barrera física contra el ingreso del gente patógeno y que han estado implicadas en varias ocasiones en la resistencia mediada del mlo (Bayles, 1990).

En segundo lugar, en una fase posterior, las plantas desarrollan pequeñas manchas necróticas en la hoja detectables macroscópicamente. La respuesta espontánea de la necrosis de la hoja se ha estudiado extensivamente con una colección única de 95 alelos mlo inducidos químicamente (Hentrich, 1979). Los alelos se clasificaron como cualquiera que mostraba un fenotipo de la infección gradualmente diferente sobre la infección de una mezcla de nueve aislantes del oidio. Esos alelos mlo que dan lugar a un fenotipo de la infección intermedio (es decir, desarrollo de un considerable número de colonias fúngicas de esporulación sobre la inoculación) no mostraron ninguna necrosis espontánea perceptible en la hoja mientras que la categoría de los alelos de resistencia más efectivos exhibe una necrosis pronunciada en ausencia del agente patógeno. De este modo, existe evidencia sólida de que la categoría anterior de alelos mlo retiene la actividad residual del alelo en estado natural y esos alelos parecen que no exhiben ninguna necrosis espontánea detectable en la hoja.

En tercer lugar, una expresión constitutiva de genes relativos a la defensa se ha observado en las plantas de semillero del mlo que han crecido en condiciones libres de oidio, en hojas primarias con 10 - 11 días de vida; esto incluye los genes de la familia PR-1, las chitinasas y las peroxidasas.

Hemos demostrado que el mlo en la cebada confiere resistencia creciente a diferentes tipos de roya amarilla (Puccinia struciformis) cuando una a una mezcla de polvo de talco y esporas se sopla con aire sobre las hojas de las plantas de cebadas del mlo después de la aparición de la expresión constitutiva de los genes relacionados con la defensa (plantas de semillero de mlo con 10 - 11 días de vida).

De este modo, parece ser que las múltiples respuestas asociadas a la defensa se expresan constitutivamente en plantas del mlo.

La relación temporal de estos eventos es interesante: la aparición de la acumulación constitutiva de transcripción relativa a la defensa se detecta en plantas de semillero de 11 días de vida y precede a la formación de CWA que es seguida por el aspecto de la necrosis en la hoja visible macroscópicamente. Lo que es importante, sin embargo, es que la resistencia del mlo se puede probar experimentalmente cuanto antes en plantas de semillero de 5 días de vida y se encuentran completamente funcionales en este tiempo. Concluimos que la proteína del Mlo tiene una función reguladora negativa en la defensa de la planta y que las plantas con una proteína defectuosa se "preparan" para la aparición de las respuestas de defensa.

La secuencia de aminoácidos deducida del Mlo no revela ninguna homología significativa en cualquiera de los genes de resistencia de la planta descritos hasta ahora, apoyando la idea de un mecanismo de resistencia molecular distinto. El gen del Mlo no muestra tampoco similitudes llamativas en ninguna secuencia caracterizada de genes de planta o mamífero en diversas bases de datos. Sin embargo, las secuencias homólogas altamente significativas se han identificado en las bases de datos EST y genómicas tanto del arroz como de la Arabidopsis thaliana (Tabla 5 y Figura 5). Esto sugiere con fuerza que la proteína del Mlo represente a un miembro de una nueva familia de proteína. Un motivo de localización nuclear posible (NLS) se encuentra dentro del exón 12 proporcionando la indicación de la localización nuclear de la proteína (KEKKKVR; Nigg et al., 1991). La importancia de este motivo se sostiene mediante un motivo de la quinasa de la caseína II localizada 14 aminoácidos en dirección del NH_{2} terminal (SIFD; Rihs et al., 1991). Las pruebas funcionales pueden examinar la posible localización subcelular de la proteína del Mlo.

Las mutaciones se han descrito también en la otras especies de plantas en la que las respuestas de defensa a los agentes patógeno parecen ser expresadas constitutivamente (Walbot et al., 1983; Pryor, 1987; Jones, 1994). Se ha sugerido que esta clase de mutantes, llamados lesion mimics (Les) o los mutantes necróticos (nec), afectan al control de las respuestas de defensa de la planta. Los mutantes lesion mimics heredados recesivamente se han analizado sistemáticamente en la Arabidopsis thaliana (Greenberg and Ausubel, 1993; Dietrich et al., 1994; Greenberg et al., 1994; Weymann et al. 1995). Los genes afectados se han designado como acd (muerte celular acelerada; acd1 y acd2) o lsd (lesiones que simulan la respuesta de la resistencia a la enfermedad; lsd1 a lsd7).

Cada uno de los mutantes exhibe, en ausencia de agente patógeno, características HR tales como modificaciones en la pared celular de la planta y la acumulación de transcripciones del gen relativas a la defensa. Las hojas del mutante acd2 se han mostrado para acumular elevados niveles de ácido salicílico y de la Arabidopsis phytoalexin, camelexín (Tsuji et al., 1992). Lo que es importante es que los mutantes acd y lsd exhiben una elevada resistencia a un agente patógeno bacteriano (P. syringae) y fúngico (P. parasitica). El mutante lsd1 es excepcional al conferir una acentuada resistencia al agente patógeno en un estado de prelesión, en contraste con los otros locus defectuosos que exhiben una elevada resistencia al agente patógeno solamente en el estado positivo de lesión. En este sentido, el lsd1 se asemeja a los mutantes del mlo en la cebada. Otra característica llamativa del lsd1 es la extensión indeterminada de lesiones en contraste con los otros mutantes donde se encuentra determinado el crecimiento de la lesión.

Procedimientos experimentales Material de la Planta

Una compilación de los mutantes del mlo y sus variedades madre analizadas en este estudio ha sido descrita por Jørgensen (1992) [mlo-1, mlo-3, mlo-4, mlo-5, mlo-7, mlo-8, mlo-9, mlo-10, mlo-11] y por Habekuss y Hentrich (1988) [mutantes en el cultivo Plena 2018 (mlo-13), 2034 (mlo-17), 2118]. Ya que el mutante 2118 no se ha asignado a un número de alelo hasta ahora, señalamos aquí el alelo como el mlo-26, según la enumeración vigente en la base de datos Grain Gene (gopher://greengenes.cit.cornell.edu:70/77/.graingenes.n dx/index?mlo).

El mapa de alta resolución se basa en un cruzamiento entre Ingrid Mlo x BC_{7} Ingrid mlo-3. Las plantas F_{1} se autofecundaron generando una población F_{2} de segregación de aproximadamente 600 plantas. Las plantas F_{2} fenotípicamente susceptibles que mostraron heterocigocidad para los marcadores del RFLP en los sitios opuestos del Mlo se autofecundaron y se generaron además segregantes en la generación F_{3} para el trazado de alta resolución.

Pruebas de Infección con Oidio

El aislante fúngico K1 (Hinze et al., 1991) es virulento en todos los cultivos utilizados en el presente estudio que lleva el alelo Mlo y los avirulentos en todos los genotipos probados del mlo. El crecimiento de las plantas y la inoculación con la Erysiphe graminis f sp hordei se llevaron a cabo según lo descrito anteriormente (Freialdenhoven et al., 1996). El genotipo en el Mlo de los recombinantes utilizados para el mapa de alta resolución se determinó después de la autofecundación y posteriores experimentos de inoculación en las familias F_{3} o F_{4} que comprenden al menos a 24 individuos.

Análisis AFLP

El ADN genómico para el análisis AFLP fue aislada según Stewart y Via (1993). El análisis AFLP se llevó a cabo con modificaciones de poca importancia según lo descrito por Vos et al. (1995). Para el cribaje de los marcadores de AFLP vinculados al Mlo utilizamos las combinaciones de enzimas Pst I/Mse I con los cebadores de amplificación que llevaban las bases selectivas +2 y +3, respectivamente, en las secuencias genómicas de los fragmentos amplificados. Para los cebadores de amplificación Eco RI/Mse I utilizamos las bases selectivas +3 y +3, respectivamente. Se ha utilizado un conjunto de cuatro plantillas de ADN: a partir del cultivo Ingrid Mlo parental susceptible, el BC_{7} Ingrid mlo-3 parental resistente, una fuente de dos individuos F_{2} resistentes (mlo-3 mlo-3) y una fuente de nueve individuos F_{2} susceptibles (Mlo Mlo) derivados del cruzamiento Ingrid Mlo x BC_{7} Ingrid mlo-3. Los fragmentos genómicos amplificados que representan los marcadores Bpm2, Bpm9, y Bpm16 de AFLP (Figura 1) se clonaron y se secuenciaron como sigue: las piezas de gel (fijadas mediante secado al vacío en papel 3MM de Whatman) que contenían los fragmentos genómicos amplificados se identificaron por medio de autoradiografía y se extirparon posteriormente. Se agregaron 10 \mul de agua, se hirvieron durante 10 minutos y después de la centrifugación se utilizaron 5 \mul del sobrenadante como una plantilla para la reamplificación no radiactiva (30 ciclos) con los cebadores de AFLP selectivos. Se aislaron los productos de amplificación después del gel de agarosa utilizando un equipo de aislamiento de ADN (Jetsorb, Genomed Inc., Estados Unidos). El ADN se hizo reaccionar con polimerasa Klenow y T4 polinucleótido quinasa y posteriormente se clonó en el sitio EcoRV del pBluescript SK (Stratagene). Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo utilizando un equipo de reacción de secuenciación DYE Terminator Cycle (Perkin Elmer) y se resolvieron en un secuenciador automatizado ABI 373 o uno 377 (Applied Biosystems).

Biblioteca de YAC de la Cebada y Construcción de Subbiblioteca de BAC de la YAC YHV303-A6

La biblioteca de YAC del cultivo Ingrid de la cebada se estableció utilizando el vector pYAC4 (Burke et al., 1987; Kuhn and Ludwig 1994) y la cepa AB 1380 de la levadura. Los detalles de la construcción de la biblioteca y su caracterización se describirán en otro lugar. El cribaje de los clones YAC que contienen el marcador Bpm16 se hizo mediante el análisis AFLP. Para la construcción de una subbiblioteca de BAC de YAC YHV303-A6, se utilizó el ADN total de este clon de la levadura. Después de la digestión parcial Eco RI y la electroforesis en gel en campo pulsante preparatoria, se recuperaron los fragmentos de ADN en el rango de tamaño de 50 kb y se subclonaron en el vector pECSBAC4. Se identificaron los clones que llevaban los insertos derivados YHV303-A6 mediante un procedimiento de hibridación de la colonia en dos etapas. Se utilizó el primer ADN marcado total de la cepa no recombinante de la levadura AB 1380 como una sonda para eliminar la mayor parte de los clones que llevaban el inserto de ADN derivado de la cepa del huésped. En una etapa de hibridación posterior los clones restantes se sondearon con el cromosoma recombinante marcado YHV303-A6 después del enriquecimiento mediante la electroforesis en gel preparatoria en campo pulsante.

Secuencia de ADN del BAC F15

El ADN del BAC F15 se aisló mediante una preparación alcalina de un plásmido a gran escala de lisis según Sambrook et al. (1989). Se nebulizaron 50 \mug de ADN purificado mediante un tratamiento a alta presión con gas argón en una cámara de reacción durante 150 segundos. Los extremos del ADN cortado y reprecipitado se hicieron romos mediante un relleno mediado por T4 polimerasa de ADN en la reacción. Los fragmentos de ADN en el rango de tamaños entre 800 pb y 3 kb se aíslan de los geles de la agarosa utilizando un equipo de aislamiento de ADN (Jetsorb, Genomed Inc., Estados Unidos), subclonado en el vector pBluescript SK (Stratagene) y propagado en la E. coli DN5\alpha. Se seleccionaron los clones que llevaban un inserto derivado del BAC F15 mediante hibridación utilizando el ADN cortado del BAC F15 como una sonda. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo tal y como se describió anteriormente. La evaluación de los datos de la secuencia, la construcción de los cóntigos de la secuencia, y la valoración de las probabilidades de codificación se llevaron a cabo mediante el paquete de software de STADEN para los usuarios de Unix (4ª edición, 1994). La valoración de las probabilidades de codificación se basó en una evaluación combinada de frecuencias de bases posicionales irregulares, preferencia de bases posicionales y el uso del codón de la cebada en los cóntigos investigados. Las búsquedas de homología se llevaron a cabo utilizando el software BLAST.

Secuenciación Basada en la PCR de Alelos en el Mlo

El ADN cromosómico de la planta para este propósito se aisló según Chunwongse et al. (1993). Las secuencias de ADN de los alelos Mlo de las diferentes variedades de la cebada, los mutantes mlo, las líneas BC, y los recombinantes intragénicos utilizados en el presente estudio se obtuvieron mediante la secuenciación basada en la PCR. Siete subfragmentos traslapados del gen (cada uno de 400 pb - 600 pb de longitud) se amplificaron mediante PCR (35 ciclos, a 60ºC de temperatura de apareamiento) utilizando los conjuntos de cebadores específicos. Después de la electroforesis en gel de agarosa preparatoria y el aislamiento de los productos de amplificación utilizando el equipo de Jetsorb (Genomed Inc., Estados Unidos) los fragmentos se reamplificaron para aumentar la especificidad. Los productos resultantes se purificaron posteriormente de los nucleótidos y los oligonucleótidos (Jetpure, Genomed Inc., Estados Unidos) y se utilizaron como plantilla de ADN que secuenciaba las reacciones (véase anteriormente). Todas las secuencias del ADN de los alelos mutantes y las regiones correspondientes de las líneas parentales y los recombinantes intragénicos se derivaron de ambos cepas y se confirmaron dos veces en sistemas independientes de experimentos. Además, los alelos mutantes mlo-1, mlo-3, mlo-4, mlo-5, mlo-7, mlo-8, mlo-9 y mlo-10 también se verificaron en las correspondientes líneas BC en el cultivo Ingrid.

La RT-PCR y la Rápida Ampliación de las Terminaciones de ADNc (RACE).

La RT-PCR se llevó a cabo utilizando el sistema de preamplificación SUPERSCRIPT para una primera síntesis de cadenas de ADN (Gibco BRL). El ARN total (1 \mug) de hojas primarias de la cebada (cultivo Ingrid) de siete días de vida sirvió como plantilla. La primera síntesis de cadenas de ADN se cebó mediante un cebador oligo(dT). La región de codificación del gen Mlo se amplificó posteriormente utilizando oligonucleótidos 25L (GTGCATCTGCGTGTGCG
TA) y 38 (CAGAAACTTGTCTCATCCCTG) en una sola etapa de amplificación (35 ciclos, a 60ºC de temperatura de apareamiento). El producto resultante se analizó mediante secuenciación directa. Las terminaciones 5' y 3' del ADNc del Mlo se determinaron mediante RACE (Frohman et al., 1988) utilizando el equipo de amplificación de ADNc MARATHON (Clontech). Los procedimientos experimentales correspondientes se llevaron a cabo principalmente según las instrucciones del fabricante. Para obtener los productos RACE específicos, fueron necesarias dos series de amplificación consecutivas (35 ciclos, a 55ºC de temperatura de apareamiento). Para este propósito, se utilizaron dos juegos de cebadores nidados en combinación con los cebadores adaptadores del equipo: oligonucleótidos 46 (AGGGTCAGGATCGCCAC) y 55 (TTGTGGAGGCCGTGTTCC) para la terminación 5' y cebadores 33 (TGCAGC
TATATGACCTTCCCCCTC) y 37 (GGACATGCTGATGGCTCAGA) para la terminación 3'. Los productos RACE se subclonaron en el pBluescript SK (Stratagene). Diez clones de terminaciones 5' y ocho clones de terminaciones 3' se escogieron para el análisis de la secuencia del ADN.

El término "AFLPs" se utiliza en la presente invención para referirse a los "marcadores AFLP".

La Tabla 1 resume los sitios de mutación identificados de diversos mutantes dentro del gen Mlo. Se encuentran indicados el origen, el mutágeno y el efecto previsto de la mutación en el nivel de aminoácido.

La Tabla 2 representa el resultado de los cruzamientos heteroalélicos mlo y las autofecundaciones de las respectivas líneas mlo para aislar los eventos de recombinación intrangénicos.

La Tabla 3 resume los genotipos en los marcadores RFLP flanqueador en la progenie F_{2} susceptible o F_{3} homocigótico a partir de cruzamientos intermutantes. CO y NCO indican los recombinantes de tipo sobrecruzamiento y de tipo no sobrecruzamiento deducido a partir del intercambio de marcador molecular flanqueador. La Tabla 3 resume el análisis de la secuencia del ADN de los recombinantes intrangénicos susceptibles de tipo sobrecruzamiento (a partir de progenie F_{3} susceptible homocigótica) y las correspondientes líneas mutantes mlo parentales. Se representan las secuencias que flanquean los sitios de mutación identificados.

La Tabla 4 representa los resultados de la secuenciación directa de la PCR del ADN genómico de los recombinantes intrangénicos susceptibles derivados tanto del cruzamiento heteroalélico mlo-1 x mlo-8 como del mlo-1 x mlo-5, dejando ver la restitución de las secuencias en estado natural.

La Tabla 5 representa diversa Arabidopsis thaliana y dos tags de secuencias expresada (ETSs) del arroz con homología a la proteína Mlo.

La Tabla 5A representa las secuencias de aminoácidos, con "secuencia problema" indicando la parte de la secuencia de proteína Mlo con la que se ha encontrado homología, con la secuencia de aminoácidos prevista de cada EST identificado marcado con "secuencia introducida".

La Tabla 5B representa las secuencias de nucleótidos de la EST que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la Tabla 5A. Se representan el número de acceso GenBank T22145 (definición 4153 clon 97N8T7 de ADNc de la Arabidopsis thaliana, NCBI identificación de secuencia 932185), número T22146 (definición 4153 clon 97N9T7 de ADNc de la Arabidopsis thaliana, NCBI identificación de secuencia 932186), número N37544 (definición 18771 clon 205N12T7 de ADNc de la Arabidopsis thaliana, NCBI identificación de secuencia 1158686), número T88073 (definición 11769 clon 155I23T7 de ADNc de la Arabidopsis thaliana, NCBI identificación de secuencia 935932) número H76041 (definición 17746 clon 193P6T7 de ADNc de la Arabidopsis thaliana, NCBI identificación de secuencia 1053292), número D24287 (secuencia parcial de ADNc de arroz R16381A, nID g428139) y D24131 (secuencia parcial de ADNc de arroz R14081A, nID g427985). Las secuencias de Arabidopsis son de Newman et al. (1994) Plant Physiol. 106 1241-55. Las secuencias de arroz son de Minobe, Y. y Sasaki, T. presentado el 2 de noviembre de 1993 al DDBJ.

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TABLA 5A

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Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bulletWYLLIE, A.H. Current Biology, 1995, vol. 5, 97-104 [0216]

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: John Innes Centre Innovations Limited

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Norwich Research Park, Colney Lane

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Norwich

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Norfolk

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): NR4 7UH

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 01603-456500

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Schulze-Lefert, Paul Maria Josef

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, Colney Lane

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Norwich

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): NR4 7UH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Panstruga, Ralph

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, Colney Lane

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Norwich

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): NR4 7UH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Büschges, Rainer

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, Colney Lane

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Norwich

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (CP): NR4 7UH

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos y Materiales para la Modulación de una Respuesta de Defensa {}\hskip4.65cm en las Plantas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO OF SECUENCIAS: 56

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD VIGENTE: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/GB97/02046

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB9615879.5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 29 de julio de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB9622626.1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 30 de octubre de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB9704789.8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 7 de marzo de 1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 533 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 1:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1602 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 2:

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2098 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 3:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2177 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 4:

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2431 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2281 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1917 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 7:

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 533 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 8:

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7175 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4105 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo homologue

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1611 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 11:

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1635 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 12:

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1880 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 13:

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 536 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 14:

40

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 544 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 15:

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 526 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 544 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 536 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 526 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: homólogo Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 19:

50

51

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22145

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.500000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 22:

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22146

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 23:

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22146

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 26:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22146

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 27:

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 28:

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: N37544

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 29:

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 30:

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: N37544

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 31:

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

67

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 32:

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: H76041

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 33:

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 34:

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: H76041

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 35:

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 36:

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: H76041

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 37:

73

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 38:

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T88073

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 39:

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 40:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T88073

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 41:

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 42:

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T88073

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 43:

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 44:

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: D24287

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 45:

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: D24287

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Hordeum vulgare

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: Mlo

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 48:

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: D39989

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 382 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22145

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 50:

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 390 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T22146

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 51:

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 585 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: N37544

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 460 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: T88073

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 476 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: H76041

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 400 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: D24287

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 325 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: D24131

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: NÚMERO DE IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

94

Claims (33)

1. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido representada en la Figura 2.

2. Polinucleótido según la Reivindicación 1 en el que la secuencia de codificación es la secuencia de codificación representada en la Figura 2.

3. Polinucleótido aislado que en la expresión en una planta transgénica ejerce un efecto regulador negativo en una respuesta de defensa a un agente patógeno de la planta al oidio o la roya, cuya respuesta de defensa es independiente del agente patógeno y autónoma de la presencia del agente patógeno, que codifica el polinucleótido a un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que es un mutante, alelo, variante o derivado de la secuencia Mlo de la Cebada representada en la Figura 2, o es un homólogo de otra especie o un mutante, alelo, variante o derivado del mismo, la secuencia de aminoácidos diferente de la representada en la Figura 2 por medio de la adición, la sustitución, la supresión y/o la inserción de uno o más aminoácidos.

4. Polinucleótido según la Reivindicación 3 que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 13.

5. Polinucleótido según la Reivindicación 4 en el que la secuencia de codificación es la que se representa en la Figura 10.

6. Polinucleótido según la Reivindicación 3 que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 14.

7. Polinucleótido según la Reivindicación 6 en el que la secuencia de codificación es la que se representa en la Figura 11.

8. Polinucleótido según la Reivindicación 3 que codifica un polipéptido que incluye la secuencia de aminoácidos representada en la Figura 15.

9. Polinucleótido según la Reivindicación 8 en el que la secuencia de codificación es la que se representa en la Figura 12.

10. Polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones anteriores vinculado operativamente una secuencia regulatoria para la expresión.

11. Polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que en la expresión en una planta transgénica produce un polipéptido que puede estimular o mantener una respuesta de defensa de la planta al oidio o la roya, incluyendo el polipéptido codificado una secuencia de aminoácidos que es un mutante, alelo, variante o derivado de la secuencia Mlo de la Cebada representada en la Figura 2, o de un homólogo de otra especie, la secuencia de aminoácidos diferente de la representada en la Figura 2 por medio de la adición, la sustitución, la supresión y/o la inserción de uno o más aminoácidos.

12. Polinucleótido según la Reivindicación 11 que estimula o mantiene dicha respuesta de defensa de la planta en la expresión homocigótica en la planta.

13. Polinucleótido según la Reivindicación 11 en el que la secuencia de aminoácidos incluye una modificación seleccionada a partir del grupo consistente en:

\quad

Trp^{162} a Arg, marco de lectura después de Phe^{395}, marco de lectura después de Trp^{159}, Met^{1} a Ile^{a}, Gly^{226} a Asp, Met^{1} a Val^{a}, Arg^{10} a Trp, supresión de Phe^{182} y Thr^{183}, Val^{30} a Glu, Ser^{31} a Phe, y Leu^{270} a His,

\quad

en el que ^{a} indica que el codón de inicio siguiente se encuentra en las posiciones del nucleótido 79 - 81 y se encuentra en el marco con la secuencia de codificación y,

\quad

en el que dichos nucleótidos y aminoácidos se encuentran numerados en el sitio de inicio translacional de la secuencia de ADNc de Mlo representado en la Figura 2.

14. Polinucleótido según la Reivindicación 13 en el que la secuencia de aminoácidos es la de la Figura 2 que incluye una sustitución en el residuo 240.

15. Polinucleótido según la Reivindicación 13 en el que la secuencia de aminoácidos incluye la leucina en el residuo 240.

16. Polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 15 vinculado operativamente a una secuencia regulatoria para la expresión.

17. Polinucleótido aislado que tiene al menos aproximadamente 600 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 o son complemento.

18. Polinucleótido según la Reivindicación 17 vinculado operativamente a una secuencia regulatoria para la transcripción.

19. Polinucleótido aislado que tiene al menos aproximadamente 300 nucleótidos contiguos de la secuencia de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 o son complemento, vinculados operativamente a una secuencia regulatoria para la transcripción.

20. Polinucleótido según la Reivindicación 18 o la Reivindicación 19 en el que la secuencia regulatoria comprende un promotor inducible.

21. Vector de ácido nucleico adecuado para la transformación de una célula de planta y que incluye un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes.

22. Célula de planta que contiene un polinucleótido heterólogo o un vector de ácido nucleico según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes.

23. Célula según la Reivindicación 22 que se encuentra comprendida en una planta.

24. Planta que comprende una célula de planta según la Reivindicación 22.

25. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10 para la estimulación de una respuesta de defensa en una planta.

26. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 16 para la estimulación de una respuesta de defensa en una planta.

27. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 20 para la estimulación de una respuesta de defensa en una planta.

28. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 20 para la regulación por disminución de la expresión de un gen codificado por un polipéptido codificado por un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10.

29. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10 en la producción de una planta transgénica.

30. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 16 en la producción de una planta transgénica.

31. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 20 en la producción de una planta transgénica.

32. Utilización de un polinucleótido codificado por un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10, en el cribaje de compuestos capaces de estimular una respuesta de defensa en una planta.

33. Utilización de un polinucleótido codificado por un polinucleótido según cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 16, en el cribaje de compuestos capaces de estimular una respuesta de defensa en una planta.