KR101460741B1

KR101460741B1 - 병저항성 관련 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질 유전자 CaGRP1 및 이를 이용한 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR101460741B1
Application number: KR20130126251A
Authority: KR
Inventors: 황병국; 김대성
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2014-11-13

Abstract

본 발명은 병저항성 관련 유전자 CaGRP1( C apsicum a nnuum G lycine - rich R NA -binding P rotein 1 ), 이를 이용한 형질전환 식물체 및 식물병 저항성 탐색방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 상기 유전자는 식물병 저항성과 관련된 고추 카이네이즈 CaPIK1와 상호작용하는 신규 저항성 관련 유전자로서 병원균의 공격에 대한 식물체의 방어 반응 연구 및 병저항성 식물체 제작을 위한 효율적이고 효과적인 분자적 육종을 위한 유전재료로서 유용하게 사용될 수 있는 이점이 있다.

Description

병저항성 관련 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질 유전자 CaGRP1 및 이를 이용한 형질전환 식물체{Disease resistance-related gene CaGRP1, and transgenic plants using the same}

본 발명은 병저항성 관련 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질 유전자 CaGRP1( C apsicum a nnuum G lycine - rich R NA - binding P rotein 1 ) 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 고추식물의 세균병인 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 비병원성균에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되는 식물병 저항성 관련 고추 카이네이즈 유전자인 CaPIK1(pepper receptor-like cytoplasmic protein kinase)이 인코딩하는 단백질과 상호작용하는 단백질을 인코딩하는 신규 저항성 관련 유전자인 CaGRP1 유전자의 염기서열 및 그에 따른 아미노산 서열을 제공하며, 이를 이용한 병저항성 형질전환 식물체 및 식물체의 병저항성 세포사멸 및 방어반응 탐색에 관한 것이다.

갑작스런 기후 변화 및 지구온난화에 따른 환경은 지진, 홍수, 폭설등의 자연재해가 더욱 빈번하게 발생하고 있고 이에 따른 병해충의 발생이 증가됨에 따라 인간 및 자연환경에 유해한 화학농약의 사용이 불가피하게 되고 있다. 그러나 선진국에 진입하는 우리나라에서는 경제발전과 생활수준의 향상으로 소비자의 소득수준이 증가됨에 따라 고품질 청정 농작물에 대한 선호도가 높아짐에 따라 화학농약을 사용하지 않는 친환경 유기농법에 의한 고품질 작물의 수요가 증가하고 있는 실정이다. 이런 여론의 흐름을 따라서 녹색성장을 위한 국제적으로도 협력방안이 모색되어 가고 있고 모든 산업과 사회의 전반적인 생활양식이 친환경 지향적으로 전환되어가는 추세이다.

농업에 있어서 친환경 녹색성장을 이룩하기 위해서는 전통적 육종이나 분자 육종방법으로 환경 스트레스에 대해 잘 견디어내고 주요 식물병에 대한 병저항성 작물을 개발하여 화학농약의 사용을 최소한으로 줄여 재배하는 것이 가장 환경 친화적이고 경제적인 작물재배 방법이다. 식물의 병 저항성 반응 또는 환경적 스트레스에 대한 저항성을 가지는 식물의 방어관련 기작에 대해서는 지금까지 잘 밝혀져 있지 않아 생체 내 식물방어기작을 규명하는 과학기술적 가치를 지닌다. 또한 식물저항성 관련 유전자의 정보는 작물의 분자적 유전육종의 직접적 재료로서 제공될 수 있을 뿐 아니라 전통적 유전육종에도 사용될 수 있는 장점을 지니고 있다.

우리나라에서 집약적으로 재배되고 주요 경제 작물로써 고추(Capsicum annuum L.)의 식물병 방제는 그 중요성이 지대하고, 또한 식물병에 대한 방어의 신호전달경로를 연구하기 위한 훌륭한 실험시스템을 제공해 주고 있다. 고추 세균성점무늬병원균과 고추와의 상호작용에서 방어반응에 관여하는 유전자의 분리와 기능 분석은 고추의 병방어 반응 경로뿐 아니라 모델 식물인 애기장대에서의 과발현을 통해 식물 병방어 반응에 대한 과학적 이해를 증진시키고, 저항성관련 유전자를 고추식물에서 발현시킨 병저항성 형질전환식물의 개발을 위한 유전자원의 토대가 된다.

식물이 병원균에 감염되면, 기주식물은 이에 대항하기 위한 다양한 세포내 대사 시스템을 작동시켜 방어기작을 활성화한다. 이러한 방어기작은 병원체에 대한 기주세포의 인식을 시작으로, 세포내 Ca² ⁺, 활성산소 및 산화질소의 증가, 칼로스 집적 (callose deposition), 페놀 관련 항균성 물질인 2차 대사산물의 생성, 국부적 세포 사멸과 같은 과민성 반응, 그리고 다양한 병방어 관련 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. 그러나 현재 과민성 반응을 조절하는 인자와 그것의 메커니즘에 대한 연구가 매우 미흡한 실정이다.

본 발명의 배경이 되는 기술로, 대한민국 등록특허 제10-1149109호(2012.05.25)에는 병 저항성 관련 고추 RNA-바인딩 프로테인 유전자 CaRBP1 및 이를 이용한 형질전환 식물체에 관해 기재되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1298130호(2013.08.20)에는 나문재(Suaeda asparagoides) 유래의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein)인 SaRBP1, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자를 포함하는 스트레스 저항성 증진용 조성물, 상기 유전자를 발현하여 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관해 기재되어 있다. 그러나, 식물병 저항성 관련 고추 카이네이즈와 직접 상호작용하여 과민성 반응성 반응을 조절하는 병저항성 관련 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질 유전자에 대해 개시된 바는 없다.

대한민국 등록특허 제10-1149109호(2012.05.25) 대한민국 등록특허 제10-1298130호(2013.08.20)

본 발명은 이와 같은 종래기술상의 과제를 해결하기 위한 것으로서, 본 발명자들은 신규 저항성 관련 유전자인 CaGRP1이 인코딩하는 단백질이 CaPIK1 단백질과 직접 상호작용하여 과민성 반응을 조절하는 인자임을 확인하고, 본 유전자를 클로닝 하여 동정, 분석하였고, 이는 병저항성 작물 품종을 육종하는데 실질적으로 기여할 것으로 기대된다.

따라서 본 발명의 목적은, 식물병 저항성 관련 유전자의 하나인 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질의 유전자 CaGRP1( C apsicum a nnuum G lycine - rich R NA - binding P rotein 1 )를 분리하여 해독함으로써 그 염기서열 정보 및 그에 따른 아미노산 서열 정보를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 CaGRP1 유전자를 이용하여 식물병에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

더 나아가, 본 발명은 상기 CaGRP1 유전자를 이용하여 식물병에 대한 저항성 탐색방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 식물병 저항성 관련 유전자로서 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질을 코딩하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 고추 유래의 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질1 유전자(Capsicum annuum Glycine - rich RNA -binding Protein 1, CaGRP1)를 제공한다: (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자 (CaGRP1); 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자 (CaGRP1).

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 고추 유래의 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질1 (Capsicum annuum Glycine-rich RNA - binding Protein 1, CaGRP1)을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 유전자(CaGRP1)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 상기 CaGRP1 유전자 발현을 억제하는 재조합 벡터 TRV2(Tobacco Rattle Virus 2):CaGRP1로 형질전환된 식물체를 제공한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 상기 목적은 고추 녹광 품종 (Capsicum annuum cv. Nockwang)에 과민성 세포사멸을 일으키는 비병원성 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strain Bv5-4a)에 감염될 때 특이적으로 발현이 유도되는 CaPIK1이 코딩하는 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 신규 저항성 관련 유전자 CaGRP1을 확인하여 그 염기서열을 결정하고, CaPIK1 단백질과 CaGRP1 단백질의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 (Yeast Two Hybrid) 기법, BiFc (Bimolecular fluorescence complementation) 기법, Co-IP (co-immunoprecipitation) 기법을 이용하여 확인하고, 병원균 처리를 통한 CaGRP1의 발현 여부를 조사하고, CaGRP1 단백질의 세포내 위치를 담배(Nicotiana benthamiana) 식물을 이용하여 확인하고, 고추식물에서 CaPIK1, CaGRP1 유전자의 일시적 발현을 통한 세포사멸 효과를 확인하고, VIGS를 통한 CaGRP1의 유전자가 억제된 고추식물에서 CaGRP1 유전자의 식물병 저항성 유도 여부를 확인하여 달성하였다.

먼저, 본 발명은 고추 세균성 점무늬병균의 비병원성균주 접종에 대해 과민성 저항성 반응을 나타내는 녹광 고추 품종으로부터 mRNA를 분리하여 이로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, cDNA 라이브러리를 이용하여 이스트 투 하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 수행하여 CaPIK1와 상호작용하는 cDNA 클론을 동정하였다. 이 클론을 이스트 세포에서 분리 정제하여 수득하였다. 그 후 본 발명자들은 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질 코딩 유전자 염기서열 (서열번호 1) 및 그에 따른 아미노산 서열 (서열번호 2)을 확인하였다 (도 1 참조).

따라서 본 발명은 본 발명은 식물병 저항성 관련 유전자로서 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질을 코딩하는 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자 (CaGRP1) 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자 (CaGRP1)를 제공한다. 본 발명의 CaGRP1 유전자에서, 상기 염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1인 것을 특징으로 한다.

나아가 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질(CaGRP1)을 제공한다.

CaGRP1 cDNA의 코딩 리전 (Coding region, ORF)은 172개의 아미노산을 암호화하는 519개의 염기서열로 이루어져 있고, CaGRP1 단백질 서열의 N-termini 쪽부터 차례대로 RNA 인식 모티프 (RNA recognition motif; 7-80), 글라이신-리치 리젼 (Glycine-rich region; 85-169)을 갖는 것이 확인되었다 (도 2 참조). 확인된 CaGRP1의 유전자 염기서열과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 도 1에 나타내고, 다른 작물 (담배 야생종, 애기장대, 콩과, 벼)의 GRP와의 아미노산 서열 상동성을 도 2에 나타냈다.

다음에, 본 발명은 CaPIK1 단백질과 CaGRP1 단백질의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 (Yeast Two Hybrid) 기법을 이용한 효모 체내에서의 상호작용, BiFc (Bimolecular fluorescence complementation) 기법, Co-IP (co-immunoprecipitation) 기법을 이용하여 담배(Nicotiana benthamiana)에서의 상호작용을 확인하여 도 3에 나타냈다.

다음에, 본 발명은 식물의 잎면에 병원균 처리 이후 mRNA를 분리하여, CaGRP1 유전자의 차별적 발현을 확인하는 단계를 포함하는 식물체의 병 저항성을 탐색하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 상기 생물적 처리는 고추 세균성 점무늬병원균의 병원성 또는 비병원성 세균 등 병원균을 예로 들 수 있다. 상기 CaGRP1 유전자의 발현 여부 확인은 RT-PCR, 노던 블럿, 외에도 mRNA의 발현을 측정할 수 있는 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 CaGRP1 유전자의 발현을 확인하였다 (도 4). 이때 고추 식물에서 CaGRP1 유전자의 3개의 전사체가 있음을 확인하고 CaGRP1 유전자의 게놈 시퀀스(Genomic sequence) 부분을 클로닝하여 조사한 결과, CaGRP1 -1, CaGRP1 -2, CaGRP1 -3의 세 개의 전사체가 만들어졌음을 확인하였다 (도 4 참조). CaGRP1 -2의 발현이 가장 강하고, 다른 작물의 GRP 유전자들과 상동성이 가장 강해 CaGRP1 -2를 CaGRP1으로 명명하고 이 클론을 가지고 실험을 수행하였다. 도 4의 Genomic sequcence scheme의 구체적 염기서열은 도 5에 나타내었다 (도 5 참조). 본 발명에 의한 CaGRP1 유전자가 식물병원균에 의해 차별적으로 유도 발현되는 것을 실험을 통해 확인하였다 (도 4 참조). 따라서 본 발명에 의한 CaGRP1 유전자는 식물체의 저항성 탐색방법에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자(CaGRP1)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 상기 재조합 벡터는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 pGADT7:CaGRP1 , pGBKT7:CaGRP1 , pSPYNE:CaGRP1, pSPYCE:CaGRP1 , pBIN35S:CaGRP1 : HA, 또는 TRV2:CaGRP1이다.

나아가, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 이용하여 제조한 형질전환된 식물체를 제공한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 식물세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기의 CaGRP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 고추식물에서 일시적으로 CaGRP1를 발현시킨 식물체를 제작하였고, 특이적으로 재조합 벡터 TRV2:CaGRP1으로 CaGRP1 유전자가 억제된 식물체의 제작, 확인함으로써 새로운 병저항성 형질전환 식물체의 제작방법 및 저항성 분자 육종의 재료를 제공할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 일시적으로 고추식물에서 CaPIK1 유전자와 CaGRP1 유전자를 함께 발현시켜 나타나는 세포사멸 현상과, ROS (reactive oxygen species) 와 NO (Nitric Oxide)를 관찰하였고 (도 6 ~ 도 8 참조), CaGRP1 유전자의 발현을 억제하는 VIGS 식물체 제작 (도 9 ~ 도 11 참조)을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 신규 병저항성 관련 유전자인 CaGRP1는 식물병 저항성 관련 고추 카이네이즈 유전자인 CaPIK1이 코딩하는 단백질과 직접 상호작용하여 과민성 세포사멸반응을 조절하는 인자이다. 따라서 본 발명은 과민성 세포사멸반응 기작을 연구하고 주요 식물병에 저항성인 작물 품종을 육종하는데 실질적으로 기여할 수 있다. 특히 발명에 의한 CaGRP1 유전자의 발현을 억제하거나,과발현시켜 식물병 저항성에 기여함을 확인하여 본 발명에 의한 CaGRP1는 병 저항성 식물체의 육종을 위한 재료로서 식물병 저항성 탐색 및 저항성 품종 개발을 촉진할 수 있는 효과가 있으므로 본 발명은 식물육종 산업상 매우 유용한 발명이라 할 것이다.

도 1은 본 발명에 의하여 고추 녹광 품종 (Capsicum annnuum L. cv. Nockwang)으로부터 클로닝한 고추 CaGRP1 유전자의 염기서열 및 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,
도 2는 본 발명에 의한 CaGRP1 아미노산 서열과 다른 작물의 글리신 리치 RNA-바인딩 단백질의 아미노산 서열의 상동성을 나타낸 도면이고,
도 3은 CaPIK1 단백질과 CaGRP1 단백질의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 (Yeast Two Hybrid) 기법, BiFc (Bimolecular fluorescence complementation) 기법, 및 Co-IP (co-immunoprecipitation) 기법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명에 의한 CaGRP1 유전자의 발현을 병원균 처리로 유도한 결과 및 본 발명에 의한 CaGRP1 유전자의 Genomic sequcence scheme를 나타내는 도면이고,
도 5는 도 4의 Genomic sequcence scheme의 구체적 염기서열을 나타낸 도면이고,
도 6 ~ 도 8은 CaGRP1과 CaPIK1 동시발현시 세포사멸 변화를 나타내는 도면이고,
도 9 ~ 도 11은 바이러스 유도 유전자 억제(virus-induced gene silencing; VIGS)의 방법을 사용하여 본 발명에 의한 CaGRP1 유전자의 발현이 억제된 고추 녹광 품종의 식물에 병원성 균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 고추 세균성 점무늬병균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하였을 때, 병 저항성의 변화를 나타낸 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 1] CaGRP1 유전자의 염기/아미노산 서열 결정

고추 세균성 점무늬병에 대한 병저항성 관련 단백질 중 하나인 고추 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질(CaGRP1) 코딩 유전자 염기서열 및 그로부터 추론되는 아미노산 서열을 제공하기 위하여 하기와 같은 시험을 수행하였다.

고추 녹광 품종(Capsicum annuum cv. Nockwang)에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)을 접종하고 15시간 동안 습실 처리한 후 저항성 병반인 과민성 세포사멸반응이 나타난 식물체를 습실에서 꺼내어 잎을 수거하였다.

다음에, 이 잎 표본으로부터 mRNA를 추출하여 역전사한 후 이를 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이렇게 제작된 cDNA 라이브러리를 이용하여 이스트 투-하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)을 수행하여 고추 식물의 병저항성 관련 단백질인 CaPIK1과 상호작용하는 cDNA 클론을 동정하였다. 이 클론을 이스트(yeast) 세포에서 분리 정제하여 수득하였다.

수득된 클론들을 해독(Sequencing)한 후, 블라스트 프로그램을 이용하여 GenBank에 등록된 유전자 데이터베이스와 비교함으로써 GRP 단백질 코딩 유전자를 확인하고 CaGRP1 유전자로 명명하였다. 확인된 CaGRP1의 유전자 염기서열(서열번호 1)과 상기 염기서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 2)을 도 1에 나타내었다.

[ 실시예 2] CaGRP1 과 CaPIK1 의 상호작용 확인

상기 실시예 1에서 수득한 CaGRP1 단백질과 CaPIK1 단백질의 상호작용을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[단계 1]

CaGRP1의 cDNA를 이스트 투-하이브리드 벡터(Yeast two-hybrid vector)에 삽입하여 CaPIK1와 상호작용하는지 알아보았다. pGADT7:CaGRP1 과 pGBKT7:CaPIK1 , 그리고 pGBKT7:CaGRP1 과 pGADT7:CaPIK1를 동시에 도입시킨 이스트 균주를 알라닌, 히스티딘, 로이신, 트립토판이 없는 선발 배지(SD-AHLT)에서 생육시키고 엑스-알파-갈락토시다아제가 들어간 배지에서 파랑색 색깔을 띠면 이스트 생장을 확인하는 것으로 상호작용은 확인하였다 (도 3). 음성(negative) 대조군인 Lam과 SV40-T는 선발배지에서 생장을 못 하고 갈락토오스를 분해하지 못하여 발색반응이 나타나지 않았다. 양성 대조군인 Lam과 SV40-T는 선발배지에서 왕성히 생장하고 갈락토오스를 분해하여 푸른 발색반응을 보였다. CaGRP1와 CaPIK1은 선발배지에서 왕성히 생장하고 푸른 발색을 보였다.

[단계 2]

CaGRP1과 CaPIK1이 식물체 내에서 상호작용하는지 알아보기 위하여 CaPIK1과 CaGRP1로 BiFc (Bimolecular fluorescence complementation)와 Co-IP (co-immunoprecipitation) 를 각각 수행하였다. BiFc는 pSPYNE과 pSPYCE 벡터에 형광단백질인 YFP의 N-termini 와 C-termini 가 각각 달려 있어서 벡터안에 삽입된 유전자가 코딩하는 단백질이 상호작용하게 되면 온전한 YFP가 생성되어 confocal microcope를 통해 형광단백질을 관찰할 수 있다. pSPYNE 와 pSPYCE 에 CaGRP1 와 CaPIK1 의 cDNA을 삽입시킨 재조합 벡터를 제작하였다. Co-IP 기법은 유전자에 각각 다른 에피토프 태그를 퓨젼시켜 발현시킨 후 한쪽의 태그 단백질들로 침강(precipitation)을 시킨 후 그 침강산물에서 다른쪽의 단백질이 검출되는 지를 확인하여 단백질간의 상호작용을 검정하는 기법이다. p35S:CaGRP1:HA과 p35S:CaPIK1:cMyc를 각각 제작하였다. 제작된 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electroporation)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 담배(Nicotiana benthamiana )의 잎에 주사기를 이용, 엽육주사(infiltration) 방법으로 접종하여 일시적으로 유전자의 발현을 유도시킨 후 BiFc 및 Co-IP 방법이 수행되었다. Co-IP의 경우 식물 잎 조직에서 단백질 추출 후 cMyc 아가로즈를 통해 단백질을 침강하고, HA 항체를 이용해 이뮤노블로팅을 실시하여 단백질간 상호 작용을 확인하였다 (도 3 참조).

[ 실시예 3] 고추식물에서의 CaGRP1 유전자의 발현 탐색

상기 실시예 1에서 수득한 CaGRP1 유전자의 병저항성 탐색에의 이용방법을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.

[단계 1]

먼저 저항성 탐색 방법을 구체적으로 제시하기 위하여 식물체와 친화적 반응을 나타내는 고추 세균성 점무늬병원균 (Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 불친화적 반응을 나타내는 비병원성 균주 Bv5-4a를 배양한 후, 10⁸ cfu/㎖의 농도로 6엽기의 고추 녹광 품종 5, 6엽의 뒷면에 주사기를 이용하여 접종하고, 접종 후에는 28℃, 100% 상대습도 조건에서 15시간 동안 습실 처리 하였다. 건전한 고추 식물의 각 조직과 접종 후 시간대별로 잎을 샘플링 하여 RNA를 분리하고, 알티-피시알 (RT-PCR)을 통해 CaGRP1 유전자의 발현 차이를 관찰하였다 (도 4 참조).

이상의 실험결과를 도 4에 나타내었으며 실험의 결과 CaGRP1 유전자는 건전식물에서는 그 발현이 미미하나, 상처 또는 병 처리시 구조적인 발현 패턴을 보이는 것으로 나타났다.

[ 실시예 4] CaGRP1 과 CaPIK1 동시발현시 세포사멸 변화

고추 식물체에서 CaPIK1과 상호작용하는 CaGRP1이 CaPIK1이 일으키는 세포사멸에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 동시에 발현시켜서 세포사멸의 변동사항을 확인하였다. 실시예 1에서 수득한 CaGRP1 유전자를 식물 과발현용 pBIN35S:HA 벡터에 도입시켜 pBIN35S:CaGRP1 : HA을 제조한 후 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기 천공법을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 기존의 pBIN35S:CaPIK1 : cMyc 함유 균주와 섞어 6주차 고추 식물의 잎에 접종하여 일시적으로 CaGRP1와 CaPIK1 유전자의 과다발현을 유도시켜 시험을 수행하였다.

[단계 1]

CaGRP1을 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaGRP1 : HA), CaPIK1를 과발현하는 재조합벡터 (35S:CaPIK1 : cMyc)와 어떠한 유전자도 과발현하지 않는 대조구 벡터 (35S:00)를 이용하여 형질전환시킨 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)을 Yeast-Peptone (YEP: yeat extract 10g, peptone 10g, sodium chloride 5g/L) 배지에서 진탕배양 한 뒤 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 균주현탁액 농도를 흡광도 600(optical density 600, OD₆₀₀)에서 CaPIK1 1.0, CaGRP1 1.0으로 각각 맞추어 1:1로 섞어서 고추식물의 잎에 접종하고, 0, 12, 24, 48 시간 뒤에 세포사멸에 의한 전해질 유출로 인한 전도율 증가를 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 접종 2일째, CaPIK1을 발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종한 잎에서 세포사멸이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. CaGRP1을 발현하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종한 잎에서는 세포사멸이 일어나지 않았다. CaPIK1과 CaGRP1를 함께 접종한 잎에서는 CaPIK1을 단독으로 접종한 잎에 비해서 약한 세포사멸이 나타났고, 세포사멸을 정량화하여 도식화하였다 (도 6).

[단계 2]

CaGRP1의 세포사멸 억제 효과를 확인하기 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium)의 점진적 농도 배분을 통한 실험을 수행하였다. 또한 대조구로 CaPIK1의 비활성 카이네이즈 돌연변이인 CaPIK1 ^K130R 을 추가하여 함께 실험하였다.

CaPIK1은 0.5로 고정하고, CaGRP1는 0.05, 0.1, 0.5로 맞추고 이를 각각 섞어 담배(Nicotiana benthamiana)잎에 각각 접종하고 0, 24, 48, 72 시간 뒤에 세포사멸에 의한 전해질 유출로 인한 전도율 증가를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. CaGRP1의 농도가 높을수록 세포사멸의 억제 효과가 강해졌다. CaPIK1의 단백질 발현은 일정하고, CaGRP1 단백질 발현은 아그로박테리움(Agrobacterium)의 농도에 의존적으로 증가함을 이뮤노 블롯팅을 통해 확인하였다 (도 7). 또한 트립판 블루 (trypan blue staining)을 통해 세포 사멸 부분을 염색하여 광학 현미경으로 관찰하였다. CaGRP1의 농도가 진할수록 파랑색으로 염색되는 세포사멸 부분이 줄어듦을 확인할 수 있었다 (도 7).

[단계 3]

CaPIK1은 0.5로 고정하고, CaGRP1는 0.05, 0.1, 0.5로 맞추고 이를 각각 섞어 담배(Nicotiana benthamiana ) 잎에 각각 접종한 이후 24시간 이후 DAB 염색을 통해 활성산소를 관찰하였고, 24, 48, 72시간 이후의 세포간 과산화수소를 정량화한 결과 CaGRP1의 농도가 높아질수록 생성되는 활성산소의 양이 감소하였다. 또한 접종 이후 24, 48시간 이후 산화질소 (Nitric Oxide, NO)를 NO에 민감한 염색제, DAF-2DA (4,5-diaminofluorescein diacetate)를 이용해 잎 조직에서 염색하고 confocal microscope를 통해 관찰한 결과 역시 CaGRP1의 농도가 높아질수록 NO 생성에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 8 참조).

[ 실시예 5] CaGRP1 유전자 발현의 억제에 의한 병 저항성의 변화

고추식물에서 CaGRP1 유전자의 발현이 특이적으로 억제되었을 때 병 발생과 관련 다른 유전자들의 발현감소 여부 및 병에 대한 감수성의 증가 여부를 알아보기 위하여, 실시예 1에서 수득한 CaGRP1 유전자를 바이러스 유도 유전자 억제(VIGS, virus-induced gene silencing)에서 이용되어지는 TRV (Tobacco Rattle Virus)를 이용하여 CaGRP1 유전자를 TRV2 벡터에 도입시켜 재조합 벡터인 TRV2:CaGRP1를 제조하였다 (참고문헌 : Baulcombe D. C. (1999) Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113). TRV2:CaGRP1의 재조합 벡터는 CaGRP1의 ORF의 5' 말단에 Xba1 효소의 제한사이트인 TCTAGA, 3' 말단에 BamH1 효소의 제한사이트인 GGATCC를 각각 링크하여 Xba1, BamH1 효소 처리하였다. TRV2 벡터의 MCS 내 사이트를 Xab1과 BamH1으로 절단하고, 상기 효소 처리된 CaGRP1과 TRV2 벡터를 T4 ligase 효소를 이용하여 연결하여 제작하였다.

이렇게 제조한 재조합벡터 TRV2:CaGRP1를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciense strain GV 3101)에 전기천공법 (electrophoration)을 통하여 도입하고 다시 재조합벡터가 들어가 있는 GV3101 균주를 고추 유묘 (seedling)의 떡잎에 주사기를 이용, 엽육주사 (infiltration) 방법으로 접종하여 고추식물에 도입함으로써 CaGRP1 유전자의 발현의 억제를 유도시켰다. 또한 기존의 TRV2:CaPIK1을 이용하여 CaPIK1의 발현을 억제시킨 식물체와 CaGRP1와 CaPIK1을 모두 억제시킨 식물체를 제작하였다.

[단계 1]

CaGRP1의 발현이 억제된 식물체에서 세균성 병에 대한 저항성의 변화를 알아보기 위하여 상기의 CaGRP1의 유전자의 발현이 억제된 고추 식물과 대조구로서 TRV2:00 벡터를 접종한 고추 녹광품종에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 5 x 10⁴ cfu ml^-1로 접종하여 접종 후 0, 3일에 감염 식물조직에서의 세균 생장을 측정하였다. 도 9에서와 같이 실험결과 VIGS로 CaGRP1의 발현이 억제된 식물에서 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a의 접종 후 감염조직에서 병원성 균과 비병원성 균의 세균 생장을 측정한 결과 대조구에 비교하여 CaGRP1의 발현이 억제된 식물에서 비병원성 세균의 생장이 감소하였다. 또한 CaGRP1와 CaPIK1이 모두 억제된 식물체에서는 CaPIK1 유전자가 억제된 식물과 유의적으로 차이를 보이지 않았다 (도 9 참조).

[단계 2]

CaGRP1, CaPIK1의 발현이 각각 억제된 식물과 두 유전자 모두 억제된 식물에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 10⁷ cfu ml^- ¹ 로 접종하여 접종 후 12, 24, 48시간에 이온전도도를 측정하였다. 도 10과 같이 대조구 식물 (TRV:00)에 비해 CaGRP1을 억제시킨 식물에서는 이온전도도가 증가하였고, CaPIK1을 억제시킨 식물에서 이온전도도가 감소하였고, 두 유전자를 함께 억제시킨 식물은 CaPIK1을 억제시킨 식물과 유사하였다 (도 10 참조).

[단계 3]

CaGRP1, CaPIK1의 발현이 각각 억제된 식물과 두 유전자 모두 억제된 식물에 고추 세균성 점무늬병균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria)의 병원성균주 Ds1과 비병원성 균주 Bv5-4a를 10⁷ cfu ml^-1 로 접종하여 접종 후 6, 12, 24시간에 활성산소의 일종인 과산화화수소를 측정하였다. 도 11과 같이 대조구 식물 (TRV:00)에 비해 CaGRP1 을 억제시킨 식물에서 비병원성 균주를 접종했을 때 활성산소가 증가하였고, CaPIK1을 억제시킨 식물에서 활성산소의 생성이 감소하였고, 두 유전자를 함께 억제시킨 식물은 CaPIK1을 억제시킨 식물과 유사하였다 (도 11 참조).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현의 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Disease resistance-related gene CaGRP1, and transgenic plants using the same <130> P11-130910-02 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 519 <212> DNA <213> Capsicum annuum cv. Nockwang <400> 1 atggcagaag ttgagtatag gtgctttgtc ggtggtctag cttgggctac taatgaccaa 60 acacttgcgg atgctttttc tcagttcggc gaagttacgg aatccaagat tattaatgat 120 agggaaactg gtagatctag aggatttgga tttgttacct tcaaggatga gcaatccatg 180 aaggatgcta ttgaagggat gaacggccag gatcttgatg gtcgtaacat cactgtgaat 240 gaagctcagt cccgcggtgg cggcggcggt ggtggaagag gcggtggcgg cggctatgga 300 ggtggccgac gtgaaggagg tggtggctac ggaggtggca gacgtgaagg cggtggtggt 360 ggatatggtg gtggcggcgg ttacggtggt ggccgtcgcg aaggtggtta tggtggtgga 420 ggtggtggat atggcggcgg tgaccgctac aatgatggtg gatctcgcta ctcaagaggt 480 ggcggcggtg gtgcttccga tgggaactgg aggaattag 519 <210> 2 <211> 172 <212> PRT <213> Capsicum annuum cv. Nockwang <400> 2 Met Ala Glu Val Glu Tyr Arg Cys Phe Val Gly Gly Leu Ala Trp Ala 1 5 10 15 Thr Asn Asp Gln Thr Leu Ala Asp Ala Phe Ser Gln Phe Gly Glu Val 20 25 30 Thr Glu Ser Lys Ile Ile Asn Asp Arg Glu Thr Gly Arg Ser Arg Gly 35 40 45 Phe Gly Phe Val Thr Phe Lys Asp Glu Gln Ser Met Lys Asp Ala Ile 50 55 60 Glu Gly Met Asn Gly Gln Asp Leu Asp Gly Arg Asn Ile Thr Val Asn 65 70 75 80 Glu Ala Gln Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly 85 90 95 Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Arg Arg Glu Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly 100 105 110 Gly Arg Arg Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Gly Arg Arg Glu Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr 130 135 140 Gly Gly Gly Asp Arg Tyr Asn Asp Gly Gly Ser Arg Tyr Ser Arg Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ala Ser Asp Gly Asn Trp Arg Asn 165 170

Claims

식물병 저항성 관련 유전자로서 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질을 코딩하는 하기 (a) 또는 (b)의 분리된 고추 유래의 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질1 유전자(Capsicum annuum Glycine - rich RNA - binding Protein 1, CaGRP1):
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 유전자;
(b) 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 유전자.
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 고추 유래의 글리신-리치 RNA-바인딩 단백질1 (Capsicum annuum Glycine - rich RNA - binding Protein 1, CaGRP1).
제1항 기재의 유전자(CaGRP1)를 포함하는 재조합 벡터.
제3항 기재의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체.
제1항 기재의 CaGRP1 유전자 발현을 억제하는 재조합 벡터 TRV2(Tobacco Rattle Virus 2):CaGRP1으로 형질전환된 식물체.