WO2006114470A2 - GEN OCP3 DE ARABIDOPSIS THALIANA Y SU MUTACIÓN RECESIVA ocp3, Y SU USO COMO REGULADOR DE LA RESISTENCIA EN PLANTAS A ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS NECROTRÓFICOS - Google Patents

GEN OCP3 DE ARABIDOPSIS THALIANA Y SU MUTACIÓN RECESIVA ocp3, Y SU USO COMO REGULADOR DE LA RESISTENCIA EN PLANTAS A ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS NECROTRÓFICOS Download PDF

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Definitions

  • the present invention falls within the technical field of plant biotechnology, and specifically refers to the Arabidopsis OCP3 gene and its ocp3 mutation, as well as its function in the regulation of resistance to diseases caused by necrotrophic pathogens, and their applications in the generation of transgenic plants resistant to this type of pathogens.
  • Plants react to attack by phytopathogenic microorganisms with a series of inducible responses that lead to local and systemic expression of a broad spectrum of antimicrobial defenses. These include the strengthening of mechanical barriers, oxidative burst, de novo production of antimicrobial compounds and the induction of the hypersensitive response mechanism (HR), where the tissue surrounding the site of infection dies and in turn limits the growth of the pathogen preventing its spread (Hammond-Kosack and Parker, (2003) Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Op. Biotechnol. 14, 177-193.)
  • HR hypersensitive response mechanism
  • Induction of the hypersensitive response is often associated with the development of acquired systemic resistance (SAR), another well-studied defense response that provides lasting plant-wide protection against a broad spectrum of pathogens (Durrant and Dong, (2004) Systemic acquired resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 42, 185-209.) Isolation and analysis of mimics with altered defense responses (Durrant and Dong, 2004; Kunkel and Brooks, (2002) Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr. Op. Plant Biol. 5, 325-331) are helping the characterization of cellular components involved in signal transduction and the understanding of the role of plant defense signal molecules. These studies are of paramount importance to understand the coupling of recognition of pathogens to the activation of defense responses in the plant.
  • SAR systemic resistance
  • Salicylic acid a benzoic acid derivative
  • SA is a central signal molecule that mediates different aspects of HR and SAR responses. It has long been shown that the synthesis and accumulation of salicylic acid is essential to create an effective defense response against oomycetes and bacterial pathogens (Gqffhey, T, Friedrich, L., Vernooij, B., Negretto, D., Nye , G, Uknes, S., Ward, E., Kessmann, H., and Ry ais, J. (1993). Requirement of salicylic acid for induction of systemic acquired resistance. Science 261, 754-756).
  • NPR1 / NIM1 an ankyrine repeat protein
  • Arabidopsis NPRl gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. CeIl 88, 57-63) although, independent NPRl routes have been proposed and genetically identified to channel salicylic acid signaling (Clarke, JD, Liu , Y., Klessig, DF, and Dong, X. (1998).
  • Uncoupling PR gene expression from NPRl and bacterial resistance Characterization of the dominant Arabidopsis cpr6-l mutant.
  • the Arabidopsis ssl mutation restores pathogenesis-related gene expression in nprl plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent.
  • Plant CeIl 11, 191-206. In addition to salicylic acid, it has been shown that other signaling molecules such as jasmonic acid (JA) and ethylene (ET), alone or in concerted combination, regulate aspects other than responses of plant defense (Kunkel and Brooks, 2002; Turner, JG, ElHs, C, and Devoto, A. (2002).
  • the jasmonate signal pathway Plant CeIl (suppl), S153-S164.) And genetic indications of this involvement in the response to fungal pathogens have also been provided.
  • Arabidopsis mimics with deficiencies in the accumulation of salicylic acid (SA) (for example, pad4 and edsl) or with an alteration in the response to salicylic acid (for example, nprl) have a better induction of genes that respond to jasmonic acid (JA) (Penninckx, IA, Eggermont, K., Térras, FR, Thomma, BP, De Samblanx, GW, Buchala, A., Metraux, JP, Manners, JM, Broekaert, WF (1996).
  • Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway.
  • NPRl modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol. Plant CeIl 15; 760-770.)
  • ROS reactive oxygen species
  • CV superoxide
  • H2O2 hydrogen peroxide
  • Salicylic acid potentiates an agonist-dependent gain control that amplifies pathogen sign in the activation of defense mechanisms.
  • Esal an Arabidopsis mutant with enhanced susceptibility to a range of necrotrophic fungal pathogens, shows a distorte d induction of defense responses by reactive oxygen generating compounds. Plant J. 29, 131-40.) But the exact mechanism and components that associate a redox signaling with the induced defense response remain poorly understood.
  • Ep5C gene from tomato plants which encodes a cationic peroxidase
  • H 2 O after the perception of a pathogen, and with a mode of gene activation conserved in both tomato and Arabidopsis plants
  • the H2 ⁇ 2-regulated Ep5C generates encodes to peroxidase required for bacterial speck susceptibility in tomato. Plant J. "in press”).
  • the present invention describes the isolation and characterization of the deregulated Arabidopsis thaliana ocp3 mutant in the expression of the H 2 O 2 inducible Ep5C gene previously identified. It is shown that OCP3 encodes a homeobox type transcription factor that regulates different aspects of the defense response. Through the analysis of ocp3 mimicking plants and the analysis of epistasis with other defense-related mimics, it is proposed that OCP3 controls critical aspects of the JA-mediated pathway in necrotrophic pathogens. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the Ep5C gene encodes an extracellular cationic peroxidase and is activated transcriptionally by the H 2 O 2 generated during the course of plant-pathogen interactions (Coego et al., 2005).
  • a search for imitators was carried out using transgenic Arabidopsis plants that carry an Ep5C-GUS gene construct (the GUS gene encodes for the enzyme ⁇ -Glucoronidase).
  • the logical basis of the present investigation was that looking for imitators that showed a constitutive expression of the indicator gene in plants grown under non-inductive conditions, mutations that affect the regulation of this signaling pathway would be identified.
  • ocp3 (from Overexpression of Cationic Peroxidase gene promoter) were named and the mutant selected for further analysis was ocp3 (Figure 1). Macroscopically, ocp3 plants were not very different from wild-type plants both in terms of plant architecture and in terms of growth habit ( Figure IA). However, in early stages of plant development, ocp3 plants show a delay in the speed of growth compared to wild-type plants. This delay in the speed of growth is also accompanied by the presence of a less intense green color in the young leaves. Histochemical staining was performed to investigate the expression model of the constitutive indicator gene in ocp3 mutants compared to non-mutagenized wild-type parental plants.
  • H 2 O 2 was the signal molecule that triggered the activation of Ep5C transcription after pathogen perception (Coego et ai, 2005), it was hypothesized that the accumulation of H 2 O 2 increases in ocp3 plants or, alternatively, the ocp3 mutant must be hypersensitive to ROS.
  • sensitivity to H 2 O 2 or reagents that directly or indirectly generate H 2 O 2 was studied. Seeds of ocp3 and the parental line were allowed to germinate in MS medium (Murashige and Skoog) containing different amounts of H 2 O 2 and growth was recorded at different time intervals.
  • H 2 O 2 when generated during a plant-pathogen interaction or when generated in situ by infiltration with different H 2 O 2 generation systems, is the signal that triggers the transcription activation of Ep5C-GUS, characteristic in transgenic Arabidopsis plants (Coego et al., 2005). Therefore, both the generation of H 2 O 2 and the activation of the signaling mechanism leading to the activation of the transcription of Ep5C concur in the ocp3 mutant.
  • the ocp3 mutant has a greater resistance to necrotrophic pathogens, but not to biotrophic pathogens.
  • Figure 2 shows the response of ocp3 plants to the obligate virulent biotropic oomycete by parasites and their comparison with the response of wild-type parental plants.
  • the growth of the pathogen was tested by direct observation of hyphae stained in infected leaves ( Figure 2A) and by the count of spores produced in the infected leaves ( Figures 2B). Using these two measures, there was no significant difference in the growth of pathogens between wild-type plants and ocp3 plants.
  • PDFl.2 a marker gene whose expression is inducible for the ET / JA response defense path against Necrotrophic fungal pathogens (Turner et al, 2002), is constitutively expressed in ocp3 plants ( Figure IF).
  • ocp3 plants The greater resistance of ocp3 plants to necrotrophic fungi requires jasmonic acid (JA) but not salicylic acid (SA) or ethylene (ET)
  • nahG encodes a salicylate hydroxylase that blocks the SA route through the degradation of SA (Delaney, TP, Uknes, S., Vernooij, S., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gutrella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994).
  • COIl encodes an F-box protein involved in ubiquitin-mediated degradation of JA signaling through the formation of functional E3 ubiquitin ligase complexes (Xie, DX, Feys, BF, James, S., Nieto-Face , M., and Turner, JG (1998).
  • COIl An Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility. Science 280, 1091-1094.; Devoto, A., Nieto-Face, M., Xie, D. , ElUs, C, Harmston, R., Patrick, E., Davis, J., Sharratt, L., Coleman, M., and Turner, JG (2002). COIl links jasmonate signalling and fertility to the SCF ubiquitin-ligase complex in Arabidopsis. Plant J. 32, 457-466). In addition, coil plants cannot express PDFl.2 and show greater sensitivity to necrotrophic fungi (Thomma et al., 1998; Turner et al. 2002).
  • JINl is a transcription factor of the MYC type of the bHLHzip type that functions in a COIl-dependent manner (Lorenzo et ai, 2004).
  • a backcross was performed between ocp3 / ocp3 plants and wild-type OCP3 / OCP3 plants containing the Ep5C-GUS transgene and the offspring were analyzed.
  • the constitutive expression of the GUS activity was absent in the 21 seedlings tested, and in the F2 plants, the expression was present in 31 of 118 seedlings.
  • the ocp3 mutant was subjected to backcrossing with wild-type Lansberg erecta (Ler) to generate a population of F2 mapping and recombinant seedlings were identified through the use of single sequence length polymorphism markers (SSLP) (Bell, CJ., And Ecker, JR (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.).
  • SSLP single sequence length polymorphism markers
  • OCP3 was located at 4 cM of Nga249 and 1.9 cM of ca72.
  • Other polymorphic markers were designed for the region between Nga249 and ca72 and the OCP3 position was narrowed to a genomic region that included the end of the artificial bacterial clone (BAC) T5KB and the beginning of the BAC clone F2I11.
  • BAC artificial bacterial clone
  • F2I11 BAC clone
  • At5gl l270 The sequence corresponding to the At5gl l270 gene was identified as the only one that showed a single nucleotide substitution (from G to A in the coding chain (exon 3)) that produced a single amino acid substitution (from Ala to Thr) (Figure 5C) . No mutation was found in the remaining eighteen genes. At5gl l270 contains two introns and encodes a 553 amino acid protein.
  • At5gl l270 As OCP3, a 3.2 Kb fragment containing At5gl l270 in ocp3 was introduced by Agrobacterium-mediated transformation. Three transgenic lines were tested for the constitutive expression of GUS and for resistance to B. cinérea and P. cucumerina. In all of them, the constitutive expression of GUS was canceled and normal susceptibility to fungal pathogens had been recovered, demonstrating that At5gl 1270 is OCPS (Figure 5D-E summarizes the result of this complementation for one of the generated transgenic lines; line 2AT).
  • OCP3 expression is partially suppressed by fungal infection
  • OCP3 The expression of OCP3 was analyzed in response to infection with a fungal necrotrophic pathogen in wild-type plants at different time intervals after infection. In no tissue analyzed, levels of OCP 3 mRNA could be detected by Northern blot analysis, indicating that the OCPS gene is transcribed at a very low rate. To solve this difficulty, the presence of OCPS mRNA by RT-PCR was studied. These analyzes revealed that OCPS is constitutively expressed in leaf tissue of healthy plants.
  • Figure 6 demonstrates that after infection with P. cucumerina there is a reduction in the level of accumulation of OCPS mRNAs, being more evident at 72 hours after infection.
  • the marker gene inducible by JA and by fungi PDF 1.2 is positively regulated after infection with P. cucumerina.
  • an induced expression of the PRl gene related to defense also occurs and is indicative of tissue deterioration that occurs as a result of the fungus growth habit.
  • the negative regulation of OCP3 after fungal infection, its inverse correlation with the induced expression of PDF 1.2 and the recessive nature of the ocp3 mutation favors interpretation that OCP3 functions as a repressor of the resistance response to fungal pathogens in wild-type plants.
  • the transition from G to A identified at the genomic level in the ocp3 allele coding chain causes an alteration in normal processing for mRNA derived from ocp3.
  • This short deletion causes a phase shift in the ocp3 open reading frame that results in the generation of a phase termination codon that produces a truncated protein of 210 amino acid residues instead of the 354 wild type protein residues. (see below, figure 8).
  • This deletion was further confirmed in different ocp3 plants by RT-PCR, using a series of internal primers ⁇ and designed from the genomic sequence ( Figure 7A).
  • OCP3 encodes a homeobox transcription factor
  • OCP3 contains Different outstanding features. Near the C-terminal end, a 60 amino acid domain is identified (position 284 to 344) that resembles that of a homeodomain (HD) encoded by homeobox genes of various organisms (Gehring, WJ, Affolter, M. and Bürglin, T. (1994). Homeodomain proteins. Annu Rev Biochem, 63, 487-526.). The OCP3 homeodomain shares most of the highly conserved amino acids that constitute the signature characteristic of the 60 amino acid HD module.
  • HD homeodomain
  • OCP3 Another notable feature of OCP3 is the presence of an extended region rich in acidic moieties (positions 84-181), a characteristic common to several transcription activators (Cress, WD, and SJ Triezenberg. 1991. Critical structural elements of the VP 16 transcriptional activation domain. Science 251: 87-90.). The last identifiable feature within OCP3 is the presence of the canonical LxxLL motif at positions 101-105 ( Figure 8A).
  • This motif is a characteristic sequence that facilitates the interaction of different co-activators of transcription to nuclear receptors and, in this way, is a defining characteristic identified in several nuclear proteins (Heery, DM, E, Kalkhoven, S. Hoare, and MG Parker, 1997. A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors. Nature 387: 733-736.) All these structural reasons strongly indicate that OCP3 is a nuclear protein involved in the regulation of transcription in Arabidopsis .
  • OCP3 According to a general classification scheme for homeobox genes (http://www.homeobox.cjb.net/) OCP3 is unique in that it distinguishes itself from the main classes of homeodomain-containing proteins found in plants, including KNOX or HD- ZIP In addition, OCP3 is present as a single gene copy in the genome of Arabidopsis.
  • the data presented in the present invention provide evidence of a role of OCP3 in the regulation of resistance to necrotrophic pathogenic microorganisms.
  • a recessive mutation in the OCPS gene resulted in increased resistance of ocp3 plants to the fungal pathogens Botrytis cinérea and Plectosphaerella cucumerina, while resistance to infection by the parasitic Peromypora oomycete or the Pseudomonas syringae DC3000 bacteria remained unchanged in the same plants.
  • the OCP3 gene is expressed at very low levels in healthy plants and this constitutive expression is partially repressed during the course of infection with a fungal necrotroph.
  • the resistance phenotype conferred by the ocp3 mutation is blocked when tested in the coil mutant as a base organism, with ocp3 coil mutant double plants retaining the highest sensitivity to the necrotrophs attributable to coil.
  • OCP3 participates in the defense response regulated by JA.
  • the recessive ocp3 mutation confers constitutive expression of the PDF 1.2 gene, which encodes a defense protein with a defined role in the JA-mediated plant defense response (Thomma et ai, 1998).
  • H 2 O 2 and other ROI molecules normally occur at high levels during infection by both biotrophic and necrotrophic pathogens and have been implicated as regulatory signals for the basal resistance response to these pathogens ⁇ fengiste, T, Chen, X. , Salmerón, JM, and Dietrich, RA (2003).
  • the BOSl gene encodes an R2R3MYB transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis. Plant CeIl 15, 2551-2565; Tiedemann, AV (1997). Evidence for a primary role of active oxygen species in induction of host cell death during infection of bean leaves with Botrytis cinerea. Physiol Mol.
  • Salicylate superoxide synthesis and cell suicide in plant defense, Trenas Plant ScL 2, 162-165.
  • SA may be necessary for a local response to a necrotroph such as Botrytis at the point of infection (Govrin, EM, and Levine, A. (2000).
  • the hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea Curr. Biol. 10, 751-757; Ferrari, S., Plotnikova, JM, De Lorenzo, G., and Ausubel, FM. (2003).
  • Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. Plant J. 35, 193-205.
  • OCP3 is a member of the homeobox gene family.
  • Homeobox proteins are ubiquitous in higher organisms and represent master control changes involved in developmental processes and cell adaptation to changes in the environment. They function as transcription regulators that are characterized by the presence of a homeodomain (HD) conserved evolutionarily responsible for specific binding to DNA (Gehring et al., 1994).
  • HD homeodomain
  • two main classes of genes encoding HD have been identified: the class of HD represented by KNOTTEDl (Vollbrecht, E., Veit, S., Sinha, N. and Hake, S. (1991).
  • KNOTTEDl Vollbrecht, E., Veit, S., Sinha, N. and Hake, S. (1991).
  • the developmental gene Knotted-1 is a member ofa maize homeobox gene family.
  • HD-Zip proteins members of an Arabidopsis homeodomain superfamily Proc Nati Acad Sd USA, 89, 3894-3898.
  • the latter is characterized by an additional leucine zipper motif, adjacent to the HD that facilitates the homo and heterodimerization of transcription regulators.
  • the functional characterization of some members of the homeobox family confirms a role for some of them as key regulators of hormone signaling (Himmelbach, A., Hoffmann, T., Laube, M., Hohener. B., and GrM, E.
  • ATHB6 Homeodomain protein ATHB6 is a target of the protein phosphatase ABIl and regulates hormone responses in Arabidopsis. EMBO J 21: 3029-3038.), In adaptive responses to environmental parameters (Steindler, C, Matteucci, A. , Sessa, G, Weimar, T., Ohgishi, M., Aoyama, T., Morelli, G. and RubertiJ. (1999).
  • Shade avoidance responses are mediated by the ATHB-2 HD-Zip protein, a negative regulator of gene expression.Development, 126, 4235-4245.; Zhu, J., Shi, H, Lee, Bh., Damsz, B., Cheng, S., Stirm, V., Zhu JK., Hasegawa, P., Bressan, RA (2004) An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway. Proc. Nati Acad.
  • a tomato homeobox gene (HD- Zip) is involved in limiting the spread of programmed cell death. PlantJ. 20, 591-600.).
  • the point mutation identified in ocp3 results in abnormal processing of the corresponding transcript that causes an internal deletion where the first 36 nucleotides of exon III are no longer present in the mature ocp3 mRNA. This short deletion causes a phase shift in the ocp3 ORF that results in the generation of a premature termination codon.
  • this mutation produces a truncated ocp3 protein consisting of 210 amino acid residues instead of the 354 amino acid residues characteristic of OCP 3.
  • the predicted 60 amino acid domain corresponding to homeodomain (HD) is located within the C-terminal domain of 144 amino acids missing in ocp3.
  • This domain is decisive for homeobox proteins to function as regulators of transcription, since it is the site where contact with DNA is established, mainly through helix 3 of the HD domain, which is directed to the main groove of the DNA helix present in the promoter region of downstream genes (Gehring et al. 1994), it is conceivable that the mutated ocp3 protein no longer functions as a transcription regulator.
  • OCP3 functions as a specific transcription factor of the COI1-dependent and JA-mediated plant cell transduction pathway and modulates the transcription of genes important for the response or defense responses to necrotrophic pathogens.
  • the identification of OCP3 target genes and the interaction with associated protein molecules is our challenge for the future.
  • the possible interaction of OCP3 with other transcription regulators involved in the defense response to necrotrophic pathogens such as the JIN1 protein related to MYC ⁇ Lorenzo et al, 2004), the ERF1 protein of type AP2 (Lorenzo, O., Piqueras, R., Sánchez-Serrano, JJ, and Solano, R. (2003).
  • ETHYLENE RESPONSE FACTORl integrates mean from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15, 165-178.), The BOSl protein related to MYB (Mengiste et al., 2003) or the transcription factor WRKY70 (Li et al., 2004), and how they work in a coordinated way to regulate transcription is another interesting challenge for the future. All these strategies should help to understand the regulatory mechanism of the OCP3 function and how this function can be exploited to generate plants more resistant to fungal pathogens without affecting defense responses against other types of pathogens.
  • OCP3 genetically manipulating the OCP3 gene through reverse genetics mechanisms in transgenic plants that repress or alter the gene expression of OCP3, or alter its functionality as a transcription factor, will allow agronomically exploiting the role of OCP3 in regulating the defensive response of plants against these pathogenic aggressions.
  • Figure 4 Effect of mutations related to JA and ET on the resistance response to diseases of ocp3 plants.
  • (C) OCP3 exon / intron structure OCP3 exon / intron structure.
  • the coding regions are indicated with thick lines.
  • the insert presents the nucleotide change and its influence on the protein sequence.
  • the mutant allele is indicated below the wild type sequence.
  • the lowercase letters mark nucleotide sequences at the beginning of exon 3.
  • the transition from G to A due to the mutagen is indicated in uppercase and bold.
  • the deduced amino acid sequences are indicated in the single letter code with capital letters under each nucleotide triplet and the bold letters mark the amino acid changes (from Ala to Thr) in the protein sequences.
  • the plants were inoculated as described in Figure 2 with B. cinérea (on the right) and P. cucumerina (on the left) and the symptoms of the disease were evaluated by determining the mean diameters of the lesion on 3 leaves of 8 plants .
  • the data points represent the average size of the lesion ⁇ SE of the measurements.
  • FIG. 6 Expression of OCP3 and defense response marker genes after infection with P. cucumerina RT-PCR analysis of the expression of OCP3, PDF1-2 and PR-I in leaf tissues infected with P. cucumerina. Wild-type plants were inoculated by spraying with a suspension of 10 5 spores / ml, and the tissue was frozen for RNA extraction. The numbers indicate hours after inoculation. The part gels lower show RT-PCR for the internal elF4 ⁇ gene used as load control. The experiment was repeated twice obtaining similar results.
  • Figure 7 OCP3 cDNA analysis of ocp3
  • PfullDl is located at the beginning of exon 1; pfullRl is located the end of exon 4; pDl at the end of exon 2; pD2 at the beginning of exon 3 and pRl in the middle of exon 3.
  • D indicates the direct orientation (from 5 'to 3') while R denotes the inverse orientation (from 3 'to 5').
  • B Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products obtained when using mRNA from wild type (wt) and ocp3 plants and different combination of primers. Note the reduction in molecular weight and, thus, the faster migration of the amplified band from ocp3 plants with pDl + pRl primers compared to that obtained from wild type plants.
  • C Nucleotide sequence and amino acid sequence derived from cDNA clones derived from mRNA isolated from wild type plants (OCP3) and mimics (ocp3). The reverse transcribed products were amplified with pfullDl and pfullRl primers and the two chains were sequenced completely. Note the internal deletion of 36 nucleotides in all sequenced ocp3 cDNAs. The nucleotide sequence common to cDNAs derived from ocp3 and OCP3 is underlined. The internal deletion in ocp3 cDNAs influences the derived amino acid sequence and causes a phase shift that generates a termination codon premature in ocp3 protein.
  • (B) Expected protein structure of OCP3. The relative position of nuclear localization signals (NLS), of the nuclear protein interaction domain (LxxLL), of the acid domain and of the homeodomain (HD) is indicated.
  • (C) Alignment of sequences showing the C-terminal amino acid sequence of OCP3 with the homeodomain of different Arabidopsis homeobox genes including members of the KN and HD-Zip family. The asterisk above the alignments corresponds to positions of amino acids in the HD that are highly conserved in all organisms and defines the homeodomain identification signal. Black shading indicates amino acids conserved in all entries, and gray shading indicates amino acids with very similar physicochemical characteristics.
  • Pseudomonas syringae pw. tomato DC3000 (Ps tomato DC3000) and was prepared for inoculation as previously described (Mayda et al. 2000). The density of the bacterial populations was determined by culturing serial dilutions in King's B medium supplemented with rifampin (50 ⁇ g / ml) at 28 ° C and counting the colony forming units. Data were presented as means and standard deviations of the logarithm (cfu / crn 2 ) of at least six replicas. For the parasitic Peronospora resistance experiments, three-week-old plants were sprayed with a suspension of P.
  • P. cucumerina was isolated from naturally infected Arabidopsis (access Landsberg erecta) and grown in potato dextrose agar of 19.5 g / 1 (Difco, Detroit) at room temperature for 2 weeks before collecting spores and to suspend them in 10 mM MgSO 4 .
  • B. cinerea strain BMMl, isolated from Pelargonium zonale was grown in potato dextrose agar 19.5 g / 1 (Difco) at 20 0 C for 10 days.
  • the conidia were collected and suspended in sterile PDS (12 g I "1 , Difco).
  • the plants were maintained. with a relative humidity of 100% and the symptoms of the disease were evaluated 4 to 10 days after inoculation by determining the average diameter of the lesion in 3 leaves of 5 plants.
  • Crosses were made by emasculating unopened buds and using the pistils as pollen receptors. Backcrossing with the parental transgenic line was performed using Ep5C-GUS plants as pollen donors. Reciprocal crosses were also made. Fl and F2 plants were grown in MS plates and tested for GUS activity. Segregation of the phenotype in the F2 generation was analyzed with a chi-square test to check the quality of the fit.
  • SSLP single sequence length polymorphism markers
  • mutant alleles used throughout this invention were nprl-7 (Cao et al., 1997), pad4-l (Zhou et ai, 1998), coil-1 (Xie et ai, 1998), ein2-5 (Alonso et ai, 1999) and jinl-1 (Lorenzo et ai, 2004).
  • Transgenic plants in the Columbia ecotype) that expressed the bacterial nahG gene have been described (Reuber et al. 1998).
  • the double mutants ocp3 nprl, ocp3 pad4, ocp3 coil, ocp3 ein2, ocp3 jinl and ocp3 nahG were generated using ocp3 as a pollen receptor.
  • the homozygosity of the loci was confirmed using molecular markers for each of the alleles in segregation populations. All double mutants were confirmed in the F3 generation, except ocp3 coil plants that were sterile and could not propagate in heterozygosity for coil.
  • the F2 seeds were plated with MS containing 20 ⁇ M 1-amino-cyclopropane-l-carboxylic acid (ACC) and placed in A growth chamber After three days in the dark, the seedlings were evaluated for the presence or absence of the triple response induced by ethylene (ET) (Guzman and Ecker 1990).
  • ET ethylene
  • the ein2 mutant which was insensitive to ET, does not present the triple response.
  • F2 plants lacking the triple response were collected and transferred to the substrate to assess homozygosity for ocp3.
  • the genomic region of OCP3 was amplified by PCR using primers with gene specificity designed to include the 1.5 Kb region upstream of the initiation codon and a portion of the 3 'region that follows the termination codon.
  • the sequences of the OCP3 advance and reverse genomic primers used were: (5'-GAGATTGGAACGTGGGTCGACTTTAG-S) and
  • RNA samples were prepared from leaf tissues using the Ambion Totally RNA kit (Austin TX). Reverse transcription was performed using the RT kit for PCR from Clontech ⁇ Palo Alto, CA).
  • OCP3 were: OCP3PCRl (5'-GCTTAAAAGACTGGCTTATGCATTG-3 ') / OCP3PCR2
  • the primers used to amplify PDF 1.2 were PDF1.2PCR1 (5'- ATGGCTAAGTTTGCTTCCAT-3 ') / PDF 1.2PCR2 (5'- ACATGGGACGTAACAGATAC-3').
  • the primers used to amplify PRl were PRlPCRl (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-3 ') / PRlPCR2 (5'-AACCCACATGTTCACGGCGGA-3').

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al gen OCP3 de Arabidopsis y su mutación ocp3, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos necrotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas transgénicas resistentes a este tipo de patógenos.

Description

TÍTULO
GEN OCP3 DE ARABIDOPSIS THALIANA Y SU MUTACIÓN RECESIVA ocp3, Y SU USO COMO REGULADOR DE LA RESISTENCIA EN PLANTAS A ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS NECROTRÓFICOS.
La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al gen OCP3 de Arabidopsis y su mutación ocp3, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos necrotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas transgénicas resistentes a este tipo de patógenos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las plantas reaccionan al ataque por microorganismos fitopatógenos con una serie de respuestas inducibles que conducen a la expresión local y sistémica de un amplio espectro de defensas antimicrobianas. Éstas incluyen el fortalecimiento de barreras mecánicas, estallido oxidativo, producción de novo de compuestos antimicrobianos y la inducción del mecanismo de respuesta hipersensible (HR), donde el tejido que rodea al sitio de infección muere y a su vez limita el crecimiento del patógeno impidiendo su extensión (Hammond-Kosack y Parker, (2003) Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Op. Biotechnol. 14, 177-193.)
Nuestra comprensión de cómo las plantas activan las respuestas de defensa se ha desarrollado substancialmente, y esto en parte se ha facilitado por la clonación y caracterización de factores de resistencia a enfermedades de las plantas que reconocen los factores avirulentos correspondientes del patógeno para inducir la respuesta hipersensible o HR (Dangl y Jones, (2001) Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411, 826-33.)
La inducción de la respuesta hipersensible a menudo está asociada con el desarrollo de resistencia sistémica adquirida (SAR), otra respuesta de defensa bien estudiada que proporciona una protección duradera en toda la planta contra un amplio espectro de patógenos (Durrant y Dong, (2004) Systemic acquired resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 42, 185-209.) El aislamiento y análisis de imitantes con respuestas de defensa alteradas (Durrant y Dong, 2004; Kunkel y Brooks, (2002) Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr. Op. Plant Biol. 5, 325-331) están ayudando a la caracterización de componentes celulares implicados en la transducción de señales y a la comprensión del papel de las moléculas señal de defensa de las plantas. Estos estudios tienen una importancia primordial para comprender el acoplamiento de reconocimiento de patógenos a la activación de respuestas de defensa en la planta. El ácido salicílico (SA), un derivado de ácido benzoico, es una molécula señal central que media diferentes aspectos de las respuestas HR y SAR. Desde hace mucho tiempo se ha demostrado que la síntesis y acumulación del ácido salicílico es indispensable para crear una respuesta de defensa eficaz contra oomicetes y patógenos bacterianos (Gqffhey, T, Friedrich, L., Vernooij, B., Negretto, D., Nye, G, Uknes, S., Ward, E., Kessmann, H., and Ry ais, J. (1993). Requirement of salicylic acid for induction of systemic acquired resistance. Science 261, 754-756). y su señalización está mediada en su mayor parte por una proteína de repetición de anquirina, NPR1/NIM1 (Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J.D., Volko, S., and Dong, X. (1997). The Arabidopsis NPRl gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. CeIl 88, 57-63) aunque, se han propuesto y se han identificado genéticamente rutas independientes de NPRl para canalizar la señalización por ácido salicílico (Clarke, J.D., Liu, Y., Klessig, D.F., and Dong, X. (1998). Uncoupling PR gene expression from NPRl and bacterial resistance: Characterization ofthe dominant Arabidopsis cpr6-l mutant. Plant CeIl 10, 557-569; Clarke, J.D., Volko, S.M., Ledford, H., Ausubel, F.M., and Dong, X (2000). Roles of Salicylic Acid, Jasmonic Acid, and Ethylene in cpr-Induced Resistance in Arabidopsis. Plant CeIl 12, 2175-2190; Mayda, E., Mauch-Mani, B., and Vera, P. (2000). The Arabidopsis dth9 mutant is compromised in systemic acquired resistance without qffecting SA-dependent responses. Plant CeIl 12, 2119-2128; Shah, J., Kachroo, P., and Klessig, D.F. (1999). The Arabidopsis ssl mutation restores pathogenesis-related gene expression in nprl plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent. Plant CeIl 11, 191-206.) Además del ácido salicílico, se ha demostrado que otras moléculas de señalización tales como el ácido jasmónico (JA) y el etileno (ET), solos o en combinación concertada, regulan otros aspectos distintos de las respuestas de defensa de las plantas (Kunkel y Brooks, 2002; Turner, J.G., ElHs, C, and Devoto, A. (2002). The jasmonate signal pathway. Plant CeIl (suppl), S153-S164.), y también se han proporcionado indicios genéticos de esta implicación en la respuesta a patógenos fúngicos. Por ejemplo, ciertos imitantes de Arabidopsis que no pueden producir ácido jasmónico (por ejemplo, un mutante triple fad3 fad7 fad8), o que no pueden percibir esta hormona (por ejemplo, coil, jinl o jarl/jin4) tuvieron una susceptibilidad alterada a diferentes patógenos necrotróficos {Kunkel y Brooks, 2002; Lorenzo O., Chico, J.M., Sánchez-Serrano, JJ. , Solano, R. (2004). JASMONATE-INSENSIΗVE1 Encocles a MYC Transcription Factor Essential to Discrimínate between Dijferent Jasmonate-Regulated Defence Responses in Arabidopsis. Plant CeIl 16, 1938-1950; Staswick, P.E., Yuen, G.Y., and Lehman, CC. (1998). Jasmonate signaling mutants of Arabidopsis are susceptible to the soilfungus Pythium irregulare. Plant J. 15, 747-54; Thomma, B.P.H.J., Eggermont, K. Penninchc, I.A.M.A., Mauch-Mani, B., Vogelsang, R., Cammue, B.P.A. andBroekaeri, W.F. (1998). Sepárate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95, 15107-11; Thomma, B,P., Penninchc, I.A., Broekaert, W.F., and Cammue, B.P. (2001). The complexity of disease signaling in Arabidopsis. Curr Opin Immunol.13, 63-68; Vijayan P, Shockey J, Levesque CA, CookRJ. Browse J. (1998). A role for jasmonate in pathogen defense of Arabidopsis. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95, 7209-7214.) Además, durante la respuesta de resistencia a enfermedades, se ha descrito una relación antagonista mutua entre las rutas de señalización por ácido salicílico y ácido jasmónico (Kunkel y Brooks, 2002). A este respecto, los imitantes de Arabidopsis con deficiencias en la acumulación de ácido salicílico (SA) (por ejemplo, pad4 y edsl) o con una alteración en la respuesta al ácido salicílico (por ejemplo, nprl) presentan una mejor inducción de genes que responden al ácido jasmónico (JA) (Penninckx, I.A., Eggermont, K., Térras, F.R., Thomma, B.P., De Samblanx, G. W., Buchala, A., Metraux, J.P., Manners, J.M., Broekaert, W.F. (1996). Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway. Plant CeIl 8, 2309-23; Clarke et al., 1998; Gupta, V., Willits, M.G., and Glazebrook, J. (2000). Arabidopsis thaliana EDS4 contributes to salicylic acid (SA)-dependent expression of defense responses: evidencefor inhibition ofjasmonic acid signaling by SA. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 503-511.) Se ha postulado que la supresión normal de los genes de respuesta a JA por SA se regula por la diferente localización celular de la proteína NPRl (Spoel, S.H., Koornneef, A., Claessens. S.M.C., Korzelius, J.P., van PeIt, J.A., Mueller, MJ. , Buchala, A.J., Metraux, J., Brown, R., Kazan, K., Van Loon, L.C., Dong, X., and Pieterse, CM. J. (2003). NPRl modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol. Plant CeIl 15; 760-770.)
De forma similar, ciertos estudios genéticos proporcionan indicios que indican que la señalización con JA también puede controlar negativamente la expresión de genes que responden a SA en Arabidopsis (Petersen, M., Brodersen, P., Naested, H., Andreasson, E., Lindhart, U., Johansen, B., Nielsen, H.B., Lacy, M., Austin, MJ. , Parker, J.E., Sharma, S.B., Klessig, D.F., Martienssen, R., Mattsson, O., Jensen, A.B., and Mundy J. (2000). Arabidopsis MAP Kinase 4 Negatively Regulates Systemic Acquired Resistance. CeIl 103, 1111-1120; Kloek et al, 2001; Li, J, Brader, G., andPalva, ET. (2004). The WRKY70 Transcription Factor: A Node of Convergence for Jasmonate-Mediated and Salicylate-Mediated Signáis in Plant Defense. Plant CeIl 16, 319-333.) El mecanismo molecular que explica tal réplica de ruta sigue sin entenderse bien. Por lo tanto, la caracterización de componentes moleculares que finalmente coordinan las rutas de señalización por SA y JA es primordial para la compresión, y finalmente la creación por ingeniería genética, de mecanismos de resistencia muy regulados que proporcionan una protección eficaz a subseries específicas de patógenos. Además de las moléculas señal mencionadas anteriormente, desde hace mucho tiempo se ha reconocido la producción y acumulación de especies oxígeno reactivas (ROS), principalmente superóxido (CV) y peróxido de hidrógeno (H2O2), durante el curso de una interacción planta-patógeno (Apóstol, L, Heinstein, F.H., Low. P.S. (1989). Rapid stimulation ofan oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116.; Baker, CJ, and Orlandi, E. W. (1995). Active oxygen species in plant pathogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 33, 299-321.) Los indicios sugieren que el estallido oxidativo y la señalización redox afín asociada posteriormente, pueden jugar un papel central en la integración de una diversa serie de respuestas de defensa de las plantas (Alvarez ME, Pennell RI, Meijer PJ, Ishikawa A, Dixon RA, Lamb C (1998). Reactive oxygen intermediates medíate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. CeIl 92, 773-784; Grant, JJ, and Loake, G. J. (2000). Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol, 124, 21-29). Además, también se ha documentado en plantas, una réplica entre respuestas de defensa dependientes de ROS y SA (Kauss, H., Jeblick, W. (1995). Pretreatment ofParsley Suspensión Cultures with Salicylic Acid Enhances Spontaneous and Elidted Production of H2O2. Plant Physiol. 108. 1171- 1178.; Mur, L.A., Brown, IJL, Darby, R.M., Bestwick, C.S., Bi, Y.M., Mansfield, J. W., Draper, J. (2000). A loss of resistance to avirulent bacterial pathogens in tobáceo is associated with the attenuation of a salicylic acid-potentiated oxidative burst. Plant J. 23, 609-621; Shirasu, K., Nakajima, K, Rajasekhar, V.K., Dixon, R.A., and Lamb, C. (1997). Salicylic acid potentiates an agonist-dependent gain control that amplifies pathogen signáis in the activation of defense mechanisms. Plant CeIl. 9, 261-70; Tierens, K.F., Thomma, B.P., Barí, R.P., Garmier, M., Eggermont, K., Brouwer, M., Penninckx, I.A., Broekaert, W.F., and Cammue, B.P. (2002). Esal, an Arabidopsis mutant with enhanced susceptibility to a range of necrotrophic fungal pathogens, shows a distorted induction of defense responses by reactive oxygen generating compounds. Plant J. 29, 131-40.) pero sigue sin entenderse bien el mecanismo exacto y los componentes que asocian una señalización redox con la respuesta de defensa inducida.
Recientemente, se ha identificado el gen Ep5C de plantas de tomate, que codifica una peroxidasa catiónica, y se ha usado como marcador para respuestas tempranas dependientes de la transcripción, controladas por H2O después de la percepción de un patógeno, y con un modo de activación génica conservado tanto en tomate como en plantas Arabidopsis (Coego, A., Ramírez, V., Ellul, P., Mayda, E., and Vera, P. (2005). The H2θ2-regulated Ep5C gene encodes a peroxidase required for bacterial speck susceptibility in tomato. Plant J. "in press "). Como la expresión inducida por patógenos de Ep5C se basa en la producción y acumulación de H2O2 por la célula vegetal afectada, esto apunta a Ep5C como marcador para buscar nuevos componentes de defensa que finalmente participan en las rutas relacionadas con la defensa en las plantas. Para este fin, en la presente invención se describe el aislamiento y caracterización del mutante ocp3 de Arabidopsis thaliana desregulado en la expresión del gen Ep5C inducible por H2O2 identificado previamente. Se demuestra que OCP3 codifica un factor de transcripción de tipo homeobox que regula diferentes aspectos de la respuesta de defensa. Por medio del análisis de plantas imitantes ocp3 y el análisis de epistasis con otros imitantes relacionados con la defensa, se propone que OCP3 controla aspectos críticos de la ruta mediada por JA en patógenos necrotróficos. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Aislamiento y caracterización del mutante ocp3 de Arabidopsis.
Tal y como se ha comentado anteriormente, el gen Ep5C codifica una peroxidasa catiónica extracelular y se activa transcripcionalmente por el H2O2 generado durante el curso de interacciones planta-patógeno (Coego et al., 2005). Para identificar señales y mecanismos implicados en la inducción del gen Ep5C y probar el impacto que puede tener esta ruta en la resistencia a enfermedades, se realizó una búsqueda de imitantes usando plantas transgénicas de Arabidopsis que llevan una construcción génica Ep5C- GUS (el gen GUS codifica para la enzima β-Glucoronidasa). La base lógica de la presente investigación fue que buscando imitantes que mostraran una expresión constitutiva del gen indicador en plantas cultivadas en condiciones no inductivas, se identificarían mutaciones que afectan a la regulación de esta ruta de- señalización. Por lo tanto, se mutagenizó una de nuestras líneas transgénicas de Arabidopsis Ep5C-GUS, previamente caracterizada con metanosulfonato de etilo (EMS) y se usaron plantas M2 (segunda generación de un imitantes inducido, en el presente caso por agentes químicos o físicos) para determinar la existencia de cualquier expresador constitutivo de GUS en ausencia de cualquier amenaza por patógenos. De aproximadamente 10.000 plantas M2 investigadas, se identificaron 18 expresadores constitutivos de GUS que se dejó que produjeran semillas. La actividad GUS se ensayó de nuevo en la descendencia de todos estos supuestos mutantes para confirmar si el fenotipo era heredable. Ocho líneas, correspondientes a seis grupos de complementación mantuvieron la actividad constitutiva GUS en generaciones posteriores. Se denominó a estos mutantes ocp (del inglés Overexpression of Cationic Peroxidase gene promoter) y el mutante seleccionado para el análisis adicional fue ocp3 (figura 1). Macroscópicamente, las plantas ocp3 no fueron muy distintas de las plantas de tipo silvestre tanto en términos de la arquitectura de la planta como en términos del hábito de crecimiento (figura IA). Sin embargo, en fases tempranas del desarrollo de las plantas, las plantas ocp3 muestran un retraso en la velocidad de crecimiento en comparación con las plantas de tipo silvestre. Este retraso en la velocidad de crecimiento también va acompañado de la presencia de un color verde menos intenso en las hojas jóvenes. Se realizó una tinción histoquímica para investigar el modelo de expresión del gen indicador constitutivo en los mutantes ocp3 en comparación con las plantas parentales de tipo silvestre no mutagenizadas. Como se muestra en la figura IB, en las plántulas parentales no se detectó actividad GUS excepto en una zona discreta en la unión entre la raíz y el tallo (véase la flecha del panel izquierdo de la figura IB). Al contrario, en las plántulas ocp3 se detectó actividad GUS en las hojas en expansión así como en los cotiledones y en el tallo, pero se detectó muy poca actividad en las raíces. De la misma manera, en las hojas en roseta de las plantas ocp3, la actividad GUS se distribuyó a lo largo de todo el haz de la hoja, mientras que las hojas de las plantas parentales no mostraron una expresión de GUS detectable (figura IC).
Como se propuso que el H2O2 era la molécula señal que desencadenaba la activación de la transcripción de Ep5C después de la percepción del patógeno (Coego et ai, 2005), se hipotetizó que la acumulación de H2O2 aumenta en plantas ocp3 o, como alternativa, el mutante ocp3 debe ser hipersensible a ROS. Para examinar si las plantas ocp3 mostraban algún fenotipo en relación con esto, se estudió la sensibilidad al H2O2 o a reactivos que generan directa o indirectamente H2O2. Se dejaron germinar semillas de ocp3 y de la línea parental en medio MS (Murashige y Skoog) que contenía diferentes cantidades de H2O2 y el crecimiento se registró a diferentes intervalos de tiempo. No se encontraron diferencias significativas en la inhibición del crecimiento para ocp3 con respecto a las plántulas parentales. De manera similar, la inhibición del crecimiento fue parecido en las plántulas de tipo silvestre y ocp3 cuando se ensayó con luz en presencia de las moléculas generadoras de ROS, con rosa de bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'- tetrayodofluoresceína) o paraquat (metil viologen). De esta manera, según estos ensayos, la mutación ocp3 no confiere un aumento de sensibilidad o una mayor resistencia al estrés oxidativo. Sin embargo, el análisis de transferencia de Northern con ARNm de plantas de tipo silvestre y plantas ocp3 reveló (figura IF; calles de la derecha) que las plántulas imitantes expresaban constitutivamente GST6, un gen que como se había demostrado previamente se controlaba por H2O2 (Alvarez et al., 1998; Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R., and Lamb, C. (1994). H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. CeIl 79, 583- 93.). Esto refleja que las plantas ocp3 pueden estar produciendo y/o acumulando mayores niveles de H2O2 que los encontrados normalmente en las plantas de tipo silvestre. Para ensayar esto, se tiñeron hojas in situ con 3,3'-diaminobencidina (DAB), un reactivo histoquímico que en presencia de H2O2, se polimeriza para producir un precipitado pardo-rojizo visible (Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y., and Collinge, D.B. (1997). Subcellular localization ofH2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J. 11, 1187-1194.). En las hojas de las plantas de tipo silvestre pudo observarse muy poca tinción con DAB (figura ID, izquierda). Al contrario, las hojas de plantas ocp3 mostraron distintos focos de tinción con DAB esparcidos a lo largo de todo el haz de la hoja (figura ID, a la derecha). Además, las plantas ocp3 no mostraron ningún signo de muerte celular o colapso celular, como se reveló después de la tinción con azul trípano (figura IE) y no mostró diferencias con el tipo silvestre cuando se ensayó la producción de aniones superóxido (O2 ) por tinción con nitroazul de tetrazolio. De esta manera, la mayor acumulación observada de H2O2 y la inducción de GST6 en plantas ocp3, sugiere que la mutación produce una señal relacionada con el estrés oxidativo, pero no induce una respuesta de muerte celular. Esto concuerda con la observación previa en la que el H2O2, cuando se genera durante una interacción de planta-patógeno o cuando se genera in situ por infiltración con diferentes sistemas de generación de H2O2, es la señal que desencadena la activación de la transcripción de Ep5C-GUS, característica en plantas transgénicas de Arabidopsis (Coego et al., 2005). Por lo tanto, en el mutante ocp3 concurren tanto la generación de H2O2 como la activación del mecanismo de señalización que conduce a la activación de la transcripción de Ep5C.
El mutante ocp3 tiene una mayor resistencia a patógenos necrotróficos, pero no a patógenos biotróficos.
Para estudiar una relación causal entre la ruta de señalización que media la activación de Ep5C-GUS en ocp3, y la que media la susceptibilidad a enfermedades, se ensayó la respuesta de este mutante a diferentes patógenos que generan enfermedades en Arabidopsis. En la figura 2 se muestra la respuesta de plantas ocp3 al oomicete biótrofo virulento obligado P eronospor a parasítica y su comparación con la respuesta de plantas parentales de tipo silvestre. El crecimiento del patógeno se ensayó por observación directa de hifas teñidas en hojas infectadas (figura 2A) y por el recuento de las esporas producidas en las hojas infectadas (figuras 2B). Usando estas dos medidas, no hubo ninguna diferencia significativa en el crecimiento de patógenos entre las plantas de tipo silvestre y las plantas ocp3. Se produjo esporulación en el 50% de las hojas tanto de plantas de tipo silvestre como de plantas ocp3. Por lo tanto, la mutación ocp3 no afecta a la susceptibilidad de la planta a la colonización por P. parasítica. Se investigaron adicionalmente los cambios en la susceptibilidad de plantas ocp3 a patógenos, usando el patógeno bacteriano virulento Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) y controlando la velocidad de crecimiento de esta bacteria en las hojas inoculadas. Las curvas de crecimiento resultantes se muestran en la figura 2C. Como ocurre con P. parasítica, la velocidad de crecimiento de Pst DC3000 en plantas ocp3 no fue significativamente diferente de la observada en las plantas de tipo silvestre. Por lo tanto, la susceptibilidad de la planta de tipo silvestre y del mutante ocp3 también sigue casi intacta tras la inoculación local con este patógeno. Para determinar si la mutación ocp3 podría provocar cambios en la susceptibilidad a patógenos necrotróficos, se inocularon plantas con Botrytis cinérea. La enfermedad se evaluó entre 5 y 10 días después de la inoculación siguiendo el grado de necrosis y la muerte que aparecía en las hojas inoculadas. Como era de esperar, las plantas de tipo silvestre eran muy susceptibles a Botrytis, y todas las plantas inoculadas mostraron necrosis acompañada de una proliferación extensiva del micelio fúngico (figura 2F-G). Sin embargo, y en un marcado contraste, ninguna de las plantas ocp3 que se inocularon con los mismos hongos mostraron una necrosis extendida en las hojas inoculadas (figura 2F-G). Además, en plantas ocp3 se inhibió drásticamente la proliferación del micelio fúngico. Esto indica que la resistencia a este patógeno necrotrófico en el mutante ocp3 estaba espectacularmente potenciada, o la susceptibilidad bloqueada. Para ensayar si la susceptibilidad alterada a las enfermedades de ocp3 es específica para Botrytis, se expusieron a las plantas a Plectosphaerella cucumerina, otro necrótrofo. La infección de las plantas de tipo silvestre con P. cucumerina también condujo a una fuerte degradación del tejido de la hoja, manifestado como lesiones extendidas y clorosis que aumenta en diámetro según progresa la infección a lo largo de la hoja inoculada (figura 2D). Al contrario, las plantas ocp3 mostraron un alto grado de resistencia a este patógeno fúngico, ya que se redujo drásticamente la necrosis visible y medible de las hojas inoculadas (figura 2D-E), y también se inhibió drásticamente la proliferación del micelio fúngico. Basándose en estos resultados, puede concluirse que la susceptibilidad a hongos necrotróficos es un rasgo característico asociado con el locus OCP 3, y la mutación identificada en este locus produce una mayor resistencia a los mismos patógenos. Esta consideración también concuerda con la observación de que PDFl.2, un gen marcador cuya expresión es inducible para la ruta de defensa de respuesta a ET/JA contra patógenos fúngicos necrotróficos (Turner et al, 2002), se expresa constitutivamente en plantas ocp3 (figura IF).
La mayor resistencia de plantas ocp3 a hongos necrotróficos requiere ácido jasmónico (JA) pero no ácido salicílico (SA) o etileno (ET)
La expresión constitutiva en plantas ocp3 del gen GST6 inducible por H2O2 y el PDF 1.2 por JA, pero no del gen PR-I inducible por SA, (figura IF), sugiere una asociación entre el estrés oxidativo y la señalización con JA, que aparentemente es independiente de SA. En la compleja trama de interacciones que tienen lugar durante las respuestas de resistencia de las plantas, desde hace mucho tiempo se ha documentado una relación antagonista entre la ruta de SA y JA/ET (Kunkely Brooks, 2002) e indica que en plantas ocp3, la activación constitutiva de la ruta que conduce a la expresión del gen PDF 1.2 podría ser la negación de la expresión de genes dependientes de SA. Sin embargo, la aplicación exógena de SA promueve la expresión del gen marcador PR- 1 tanto en plantas ocp3 como en plantas de tipo silvestre (figura IF), indicando que las plantas ocp3 no están afectadas en la percepción de SA, y coincide con la observación de que la respuesta de resistencia a patógenos biotróficos también está intacta en este mutante (figura 2 A-C). Además, la aplicación exógena de SA anula la expresión constitutiva de PDF1.2 que tiene lugar en plantas ocp3 (figura IF). Este efecto antagonista de SA fue específico para la expresión de PDF 1.2, ya que la expresión de GST6 no se reprimía en ocp3 tras el tratamiento con SA. En su lugar, SA promovió la activación de GSTl en plantas de tipo silvestre (figura IF). Esta última observación refuerza la asociación existente entre SA y ROS como se ha documentado previamente por otros autores (Mur et al, 2000; Shirasu et al, 1997; Tierens et al, 2002), pero también indica que el estrés oxidativo que media la expresión de GSTl en plantas ocp3 y la expresión conjunta de PDF 1.2 podría ser independiente de SA.
Para evaluar más directamente si SA pudiese contribuir al fenotipo de plantas ocp3 en relación con la resistencia observada a patógenos necrótrofos, cruzamos el transgen nahG en ocp3. nahG codifica una salicilato hidroxilasa que bloquea la ruta de SA por medio de la degradación de SA (Delaney, T.P., Uknes, S., Vernooij, S., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gutrella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science, 266, 1247-1250.) Las plantas ocp3 nahG retenían la resistencia a las infecciones por B. cinérea (figura 3A-B) y P. cucumerina (figura 3C) a niveles similares a los de las plantas ocp3. De forma similar, cuando plantas pad4, que también están afectadas en la acumulación de SA después del ataque por patógenos (Zhou, N, Tootle, T.L., Tsui, F., Klessig, D.F., and Glazebrook, J. (1998). PAD4 functions upstream from salicylic acid to control defense responses in Arabidopsis. Plant CeIl 10, 1021-1030.), se sometieron a introgresión en plantas ocp3, las plantas ocp3 pad4 resultantes permanecieron tan resistentes a B. cinérea (figura 3A-B) o a P. cucumerina (figura 3C) como las plantas ocp3. Para ampliar adicionalmente estos estudios, se creó un mutante doble ocp3 nprl-1. El mutante nprl-1 se identificó originalmente por su insensibilidad a SA y actualmente se considera el regulador principal de las respuestas mediadas por SA (Durrant y Dong, 2004). Como se observa para plantas ocp3 nahG y ocp3 pad4, la resistencia de plantas ocp3 nprl-1 a hongos necrotróficos también se mantuvo invariable con respecto a la observada en plantas ocp3 (figura 3A-C). De esta manera, todos estos resultados indican que parece ser que SA no se requiere para mejorar la resistencia a patógenos necrotróficos atribuibles a la mutación ocp3.
Como alternativa a SA, se evaluó la importancia de JA en la contribución al fenotipo de plantas ocp3. Se ensayó si un defecto en la percepción de esta hormona puede afectar a la mejor resistencia observada de plantas ocp3 a hongos necrotróficos. El mutante coil de Arabidopsis es totalmente insensible a JA y se requiere la proteína COIl para todas las respuestas dependientes de JA identificadas hasta ahora. COIl codifica una proteína F-box implicada en la degradación mediada por ubiquitina de la señalización por JA por medio de la formación de complejos de ubiquitina ligasa de tipo E3 funcionales (Xie, D.X., Feys, B.F., James, S., Nieto-Rostro, M., and Turner, J.G. (1998). COIl: An Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility. Science 280, 1091-1094. ; Devoto, A., Nieto-Rostro, M., Xie, D., ElUs, C, Harmston, R., Patrick, E., Davis, J., Sharratt, L., Coleman, M., and Turner, J.G. (2002). COIl links jasmonate signalling and fertility to the SCF ubiquitin-ligase complex in Arabidopsis. Plant J. 32, 457-466). Además, las plantas coil no pueden expresar PDFl.2 y muestran una mayor sensibilidad a hongos necrotróficos (Thomma et al., 1998; Turner et al. 2002). Todo esto indica la importancia de JA en la resistencia de plantas a este tipo de patógenos, y justifica la introgresión de coil en ocp3 para generar plantas imitantes dobles ocp3 coil (figura 4). De manera importante, la mayor resistencia observada en plantas ocp3 a B. cinérea y P. cucumerina se anula cuando está presente la mutación coil (figura 4 A-C). Las plantas ocp3 coil se comportan como plantas coil, que están muy afectadas tras la infección con cualquier hongo, extendiéndose las lesiones necróticas a lo largo de las hojas inoculadas como se ejemplifica en la figura 4C para la respuesta a P. cucumerina. Además, de coil, se consideró el estudio de jinl, otro mutante insensible a JA (Berger, S., Bell, E., and Mullet, J.E. (1996).Two Methyl Jasmonate-Insensitive Mutants Show Altered Expression of AtVsp in Response to Methyl Jasmonate and Wounding. Plant Physiol. 111, 525-531.) en relación con el mutante ocp3. JINl es un factor de transcripción de tipo MYC del tipo bHLHzip que funciona de una manera dependiente de COIl (Lorenzo et ai, 2004). A diferencia de lo que ocurre con coil y a pesar del defecto en la señalización con JA, las plantas jinl muestran una mayor resistencia a patógenos necrotróficos, indicando que JINl puede funcionar como represor de la resistencia a este tipo de patógenos. De manera interesante, las plantas imitantes dobles ocp3 jinl se mantuvieron muy resistentes cuando se ensayaron contra la infección por B. cinérea (figura 4A) y a niveles comparables a los conseguidos por las plantas ocp3 o jinl. Es importante mencionar que la mutación ocp3 ni confiere sensibilidad a JA (de acuerdo con el ensayo de inhibición de crecimiento de las raíces en presencia de JA) ni es alélica a jinl. Esto indica que podría haber una cierta redundancia o solapamiento de funciones para los dos imitantes en consideración, para mejorar la resistencia a B. cinérea que finalmente se induce por JA y se controla por COIl. También se ha demostrado que el etileno (ET) media ciertos aspectos de las respuestas de las plantas a patógenos (Berrocal-Lobo, M., Molina, A., and Solano, R. (2002). Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J. 29, 23-32.; Thomma et al., 2001). Sin embargo, la señalización con ET también puede funcionar independientemente de JA, o incluso inhibir respuestas dependientes de JA (ElHs, C. and Turner, J.G. (2001). The Arabidopsis mutant cevl has constitutively active jasmonate and ethylene signal pathways and enhanced resistance to pathogens. Plant CeIl, 13, 1025-1033.; Thomma et al, 2001). Para ensayar la importancia de ET en la respuesta de resistencia mediada por la mutación ocp3, se cruzaron plantas ocp3 con el mutante ein2 insensible a ET (Alonso, J.M., Hirayama, T, Román, G., Nourizadeh, S. andEcker, J.R. (1999) EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284, 2148-2152) para generar el mutante doble ocp3 ein2. Como se observa en la figura 2B- C, la resistencia de plantas ocp3 ein2 a P. cucumerina se mantuvo invariable en comparación con la observada en plantas ocp3 (figura 4A-C), indicando de esta manera que para la resistencia observada mediada por ocp3, es dispensable la hormona vegetal ET.
Aislamiento de OCP3
Para determinar la naturaleza de la mutación, se realizó un retrocruzamiento entre plantas ocp3/ocp3 y plantas OCP3/OCP3 de tipo silvestre que contenían el transgen Ep5C-GUS y se analizó la descendencia. En las plantas Fl resultantes de este cruce, estaba ausente la expresión constitutiva de la actividad GUS en las 21 plántulas ensayadas, y en las plantas F2, la expresión estaba presente en 31 de 118 plántulas. La relación de segregación de F2 del fenotipo conferido por ocp3 fue 1:3 (expresadores constitutivos: no expresadores, α2 = 1,48 (0,1 > P > 0,5)), indicando una sola mutación recesiva. El mutante ocp3 se sometió a retrocruzamiento con Lansberg erecta de tipo silvestre (Ler) para generar una población de mapeo de F2 y las plántulas recombinantes se identificaron por medio del uso de marcadores de polimorfismos de longitud en las secuencias simples (SSLP) (Bell, CJ. , and Ecker, J.R. (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.). Se aisló ADN, inicialmente, a partir de 38 plantas homocigotas ocp3 y la segregación de los marcadores SSLP indicó que ocp3 mostraba una asociación al marcador Nga249 en el cromosoma 5, donde de los 76 alelos analizados todos fueron alelos CoI-O (0 erecta: 76 Col-0). Otro análisis de las plantas ocp3 seleccionadas con marcadores adicionales disponibles para el cromosoma 5 identificaron los marcadores SSLP Nga249 y ca72 como marcadores más próximos que flanqueaban la mutación ocp3 en cada lado (figura 5A). La selección de 1100 plantas elegidas aleatoriamente de una población de mapeo F2 Ler x ocp3 con los marcadores SSLP Nga249 y ca72 identificó 29 plantas que tenían una recombinación en el intervalo. Usando estas 29 plantas recombinantes, se vio que OCP3 estaba localizado a 4 cM de Nga249 y a 1,9 cM de ca72. Se diseñaron otros marcadores polimórficos para la región comprendida entre Nga249 y ca72 y la posición de OCP3 se estrechó hasta una región genómica que incluía el extremo del clon artificial bacteriano (BAC) T5KB y el comienzo del clon BAC F2I11. En la secuencia comentada comprendida dentro de estos dos clones BAC están presentes 19 genes (figura 5B). Se amplificó la región codificante entera de cada uno de estos genes en plantas ocp3 y se determinaron las secuencias de los productos de PCR. La secuencia correspondiente al gen At5gl l270 se identificó como la única que mostraba una sola substitución de nucleótidos (de G a A en la cadena codificante (exón 3)) que producía una sola substitución de aminoácidos (de Ala a Thr) (figura 5C). No se encontró ninguna mutación en los dieciocho genes restantes. At5gl l270 contiene dos intrones y codifica una proteína de 553 aminoácidos.
Para asignar inequívocamente At5gl l270 como OCP3, se introdujo un fragmento de 3,2 Kb que contenía At5gl l270 en ocp3 por transformación mediada por Agrobacterium. Se ensayaron tres líneas transgénicas con respecto a la expresión constitutiva de GUS y con respecto a la resistencia a B. cinérea y P. cucumerina. En todas ellas, la expresión constitutiva de GUS estaba anulada y se había recuperado la susceptibilidad normal a los patógenos fúngicos, demostrando que At5gl 1270 es OCPS (la figura 5D-E resume el resultado de esta complementación para una de las líneas transgénicas generadas; línea 2AT).
La expresión de OCP3 se reprime parcialmente por infección fúngica
Se analizó la expresión de OCP3 en respuesta a la infección con un patógeno fúngico necrotrófico en plantas de tipo silvestre a diferentes intervalos de tiempo después de la infección. En ningún tejido analizado se pudieron detectar niveles de ARNm de OCP 3 por análisis de transferencia de Northern, indicando que el gen OCPS se transcribe a una velocidad muy baja. Para solucionar esta dificultad, se estudió la presencia de ARNm de OCPS por RT-PCR. Estos análisis revelaron que OCPS se expresa constitutivamente en tejido de hoja de plantas sanas. La figura 6 demuestra que después de la infección con P. cucumerina hay una reducción en el nivel de acumulación de los ARNm de OCPS, sien do más evidente a las 72 horas después de la infección. Conjuntamente con esta reducción, y correlacionado inversamente, el gen marcador inducible por JA y por hongos PDF 1.2 está regulado positivamente tras la infección con P. cucumerina. En etapas posteriores de la infección, también tiene lugar una expresión inducida del gen PRl relacionado con la defensa y es indicativo del deterioro de tejidos que se produce como resultado del hábito de crecimiento del hongo. La regulación negativa de OCP3 tras la infección fúngica, su correlación inversa con la expresión inducida de PDF 1.2 y la naturaleza recesiva de la mutación ocp3 favorece la interpretación de que OCP3 funciona como un represor de la respuesta de resistencia a patógenos fúngicos en plantas de tipo silvestre.
Procesamiento aberrante de ARNm de At5gll270 en el mutante ocp3 Para identificar la estructura del gen OCP3 y su alelo mutante ocp3, se amplificó un fragmento de 1,2 Kb por reacción en cadena de la polimerasa mediada por la transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de plantas de tipo silvestre y imitantes ocp3, usando cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia comentada del gen At5gl l270. La secuenciación directa y la comparación de los productos de RT-PCR revelaron que el ADNc derivado de ocp3 lleva una deleción interna de 36 nucleótidos en lugar de la substitución esperada de un solo nucleótido, identificada en las secuencias genómicas (figura 7). Esta deleción corresponde a los primeros 36 nucleótidos del exón III. De esta manera, la transición de G a A identificada a nivel genómico en la cadena codificante del alelo de ocp3 (figura 5C) provoca una alteración en el procesamiento normal para el ARNm derivado de ocp3. Esta corta deleción provoca un desplazamiento de fase en el marco de lectura abierta de ocp3 que tiene como resultado la generación de un codón de terminación en fase que produce una proteína truncada de 210 restos aminoacídicos en lugar de los 354 restos de la proteína de tipo silvestre (véase más adelante, figura 8). Esta deleción se confirmó adicionalmente en diferentes plantas ocp3 por RT-PCR, usando una serie de cebadores internos^ y diseñados a partir de la secuencia genómica (figura 7A). Se obtuvieron productos de longitudes esperadas en todas las reacciones, excepto cuando se usaba el cebador interno a la secuencia delecionada, que no tuvo como resultado ningún producto de RT-PCR en muestras derivadas de plantas ocp3 (figura 7B). De esta manera, la falta de función atribuida genéticamente a la mutación ocp3 recesiva, no se debe a un cambio de aminoácido debido a la única substitución de nucleótidos observada en la secuencia genómica; en su lugar, reside en un procesamiento anormal del ARNm transcrito a partir de la versión mutada de ocp3, que tras la traducción produce una proteína truncada que carece de 144 residuos aminoa cídicos de la parte C-terminal (figura 7 y 8).
OCP3 codifica un factor de transcripción homeobox
La secuenciación del ADN demostró que el ADNc de OCPS codifica una proteína de
354 restos aminoacídicos (figura 8A) de 39111 D y un pl de 4,53. OCP3 contiene diferentes características destacables. Cerca del extremo C-terminal se identifica un dominio de 60 aminoácidos (posición 284 a 344) que se parece al de un homeodominio (HD) codificado por genes homeobox de diversos organismos (Gehring, W.J., Affolter, M. and Bürglin, T. (1994). Homeodomain proteins. Annu Rev Biochem, 63, 487-526.). El homeodominio de OCP3 comparte la mayor parte de los aminoácidos muy conservados que constituyen la firma característica del módulo HD de 60 aminoácidos. La conservación de estos restos críticos (por ejemplo, L- 16, Y-20 en lugar de F-20, 1/L- 34, I/L/M-40, W-48, F-49 y R-53) se identifica fácilmente en comparación con diferentes proteínas que contienen homeodominios de Arabidopsis que pertenecen a diferentes subgrupos de proteínas (figura 8C). La inspección de la secuencia de aminoácidos de OCP3 también reveló la presencia de dos señales de localización nuclear (NLS) bipartitas canónicas (Dingwall, C, and Laskey, R.A. (1991). Nuclear targeting sequencesa consensus? Trenas Biochem. Sci. 16, 478-481.; Nigg, E.A. (1997). Nucleocytoplasmic transport: signáis, mechanism and regulation. Nature 386: 779- 787.), RK -(X)io-KKNKKK en las posiciones 64-81, y KK-(X)iO-RRSKR en las posiciones 294-310, estando ésta última escondida dentro del homeodominio (figura 8A). Estas características podrían estar mediando una dirección de la proteína al núcleo. Otra característica destacable de OCP3 es la presencia de una región extendida rica en restos ácidos (posiciones 84-181), una característica común a varios activadores de la transcripción (Cress, W. D., and S. J. Triezenberg. 1991. Critical structural elements of the VP 16 transcriptional activation domain. Science 251 : 87-90.). La última característica identificable dentro de OCP3 es la presencia del motivo LxxLL canónico en las posiciones 101-105 (figura 8A). Este motivo es una secuencia característica que facilita la interacción de diferentes co -activadores de la transcripción a receptores nucleares y, de esta manera, es una característica de definición identificada en varias proteínas nucleares (Heery, D.M., E, Kalkhoven, S. Hoare, and M. G. Parker. 1997. A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors. Nature 387: 733-736.) Todos estos motivos estructurales, indican firmemente que OCP3 es una proteína nuclear implicada en la regulación de la transcripción en Arabidopsis. De acuerdo con un esquema de clasificación general para genes homeobox (http://www.homeobox.cjb.net/) OCP3 es único ya que se distingue de las clases principales de proteínas que contienen homeodominios encontradas en plantas, incluyendo KNOX o HD-ZIP. Además, OCP3 está presente como un gen de una sola copia en el genoma de Arabidopsis. Las búsquedas de secuencias en las bases de datos reveló una identidad extensiva de OCP3 con otras seis proteínas - de tomate (número de acceso del GenBank AW223899, identidad del 48,9%), patata (número de acceso del GenBank BQl 12211, identidad del 48,3%), uvas (número de acceso del GenBank CD003732, identidad del 51,5%), arroz (número de acceso del GenBank AY224485, identidad del 49,5%), trigo (número de acceso del GenBank CK205563, identidad del 49,4%) y maíz (número de acceso del GenBank BG840814, identidad del 51,3%) - que, según se vio, tenían un alto grado de similitud de secuencia con OCP3 y con la conservación de los principales motivos estructurales mostrados anteriormente. Esto indica que la función de este tipo de regulador de la transcripción ha estado muy conservada en plantas a lo largo de la evolución.
Los datos presentados en la presente invención proporcionan evidencias de un papel de OCP3 en la regulación de resistencia a microorganismos patógenos necrotróficos. Una mutación recesiva en el gen OCPS tu vo como resultado una mayor resistencia de plantas ocp3 a los patógenos füngicos Botrytis cinérea y Plectosphaerella cucumerina, mientras que la resistencia a la infección por el oomicete Peronospora parasítica o la bacteria Pseudomonas syringae DC3000 se mantuvo invariable en las mismas plantas. De manera interesante, el gen OCP3 se expresa a niveles muy bajos en plantas sanas y esta expresión constitutiva se reprime parcialmente durante el curso de la infección con un necrótrofo füngico. Además, el fenotipo de resistencia conferido por la mutación ocp3 se bloquea cuando se ensaya en el mutante coil como organismo base, reteniendo las plantas dobles mutantes ocp3 coil la mayor sensibilidad a los necrótrofos atribuible a coil. Esto implica que OCP3 participa en la respuesta de defensa regulada por JA. De hecho, la mutación ocp3 recesiva confiere expresión constitutiva del gen PDF 1.2, que codifica una proteína de defensa con un papel definido en la respuesta de defensa de las plantas mediada por JA (Thomma et ai, 1998). Como la expresión de PDFl.2 es completamente dependiente de COIl (Turner et ai, 2002) y está en plantas mutantes ocp3 sanas, se refuerza la consideración de que OCP3 esté funcionando de una manera dependiente de COIl actuando como regulador negativo de la respuesta de defensa mediada por JA a patógenos necrotróficos. Otra característica importante de ocp3 es la mayor acumulación de H2O2 que se observa que se produce en condiciones de reposo en las hojas de plantas ocp3, que va seguida de la expresión constitutiva del gen marcador inducible por H2O2 GSTl (Levine et ai, 1994; Alvar ez et al, 1998) pero sin síntomas indicativos de muerte celular. El H2O2 y otras moléculas ROI normalmente se producen en altos niveles durante la infección tanto por patógenos biotróficos como por patógenos necrotróficos y se han implicado como señales reguladoras para la respuesta de resistencia basal a estos patógenos βfengiste, T, Chen, X., Salmerón, J.M., and Dietrich, R.A. (2003). The BOSl gene encodes an R2R3MYB transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis. Plant CeIl 15, 2551-2565; Tiedemann, A. V. (1997). Evidence for a primary role of active oxygen species in induction of host cell death during infection of bean leaves with Botrytis cinérea. Physiol. Mol. Plant Pathol. 50, 151-166.) Sin embargo, de los patógenos ensayados en plantas ocp3, sólo se observó un aumento de la resistencia hacia patógenos necrotróficos, mientras que la resistencia a patógenos biotróficos permaneció intacta. Esta diferencia significativa indica que la mutación ocp3 puede afectar a funciones específicas relacionadas con ROI por medio de la regulación de ciertas moléculas efectoras dirigidas hacia la sensibilización e identificación de un necrótrofo. De manera interesante, se ha demostrado que SA y H2O2 forman un circuito que es un bucle de retroalimentación durante el curso de una interacción planta- patógeno (Shirasu et al., 1997; Draper, J. (1997). Salicylate, superoxide synthesis and cell suicide in plant defence. Trenas Plant ScL 2, 162-165.), y hay indicios que sugieren que SA puede ser necesario para una respuesta local a un necrótrofo tal como Botrytis en el punto de infección (Govrin, E.M., and Levine, A. (2000). The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinérea. Curr. Biol. 10, 751-757; Ferrari, S., Plotnikova, J.M., De Lorenzo, G., and Ausubel, FM. (2003). Arabidopsis local resistance to Botrytis cinérea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. Plant J. 35, 193-205.)
Sin embargo, la síntesis y acumulación de SA ni se aumenta ni se reprime en plantas ocp3. Además, el análisis de plantas imitantes dobles para ocp3 y reguladores clave de la acumulación y percepción de SA, tales como los imitantes dobles ocp3 pad4, ocp3 nahG u ocp3 nprl generados en la presente invención, indica que SA no se requiere para la resistencia a necrótrofos mediada por ocp3. Además, la hormona vegetal etileno (ET) no parece ser necesaria para conseguir la mayor resistencia de ocp3. Aquí, la falta de percepción de esta hormona, como se estudió con las plantas imitantes dobles ocp3 ein2, no reprime ni reduce la resistencia característica de las plantas ocp3 a P. cucumerina. Como JA y ET pueden funcionar en asociación o independientemente para la activación de rutas de señalización específicas (Thomma et ai, 2001, ElHs y Turner, 2001), la resistencia independiente de ET de ocp3 indica que OCP3 regula una ramificación específica de la ruta de JA. Además, esta ramificación parece ser independiente de la otra que se ha propuesto que se controla por el factor de transcripción JINl regulado por JA (Lorenzo et al., 2004), ya que no se encontró epistasis entre ocp3 y jinl al menos cuando se ensayó la resistencia a B. cinérea. De esta manera, todas estas observaciones confirman el importante papel de OCP3 en la regulación específica de una resistencia dependiente de COIl a patógenos necrotróficos. OCP3 es un miembro de la familia de genes homeobox. Las proteínas homeobox son ubicuas en organismos superiores y representan cambios maestros de control implicados en procesos de desarrollo y en la adaptación celular a cambios en el medio. Funcionan como reguladores de la transcripción que se caracterizan por la presencia de un homeodominio (HD) conservado evolutivamente responsable de la unión específica al ADN (Gehring et al., 1994). En las plantas, se han identificado dos clases principales de genes que codifican HD: la clase de HD representada por KNOTTEDl (Vollbrecht, E., Veit, S., Sinha, N. and Hake, S. (1991). The developmental gene Knotted-1 is a member ofa maize homeobox gene family. Nature 350, 241-243.) y la familia de proteínas HD- Zip (Schena, M., andDavis, R. W. (1992). HD-Zip proteins: members of an Arabidopsis homeodomain superfamily. Proc Nati Acad Sd USA, 89, 3894-3898.) La última está caracterizada por un motivo de cremallera de leucina adicional, adyacente al HD que facilita la homo y heterodimerización de los reguladores de la transcripción. La caracterización funcional de algunos miembros de la familia homeobox, confirma un papel para algunos de ellos como reguladores clave de la señalización con hormonas (Himmelbach, A., Hoffmann, T., Laube, M., Hohener. B., and GrM, E. (2002). Homeodomain protein ATHB6 is a target of the protein phosphatase ABIl and regulates hormone responses in Arabidopsis. EMBO J 21: 3029-3038.), en respuestas de adaptación a parámetros ambientales (Steindler,C, Matteucci,A., Sessa,G, Weimar,T., Ohgishi,M., Aoyama,T., Morelli,G. and RubertiJ. (1999). Shade avoidance responses are mediated by the ATHB-2 HD-Zip protein, a negative regulator of gene expression. Development, 126, 4235-4245. ; Zhu, J., Shi, H, Lee, B-h., Damsz, B., Cheng, S., Stirm, V., Zhu J-K., Hasegawa, P., Bressan, R.A. (2004). An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway. Proc. Nati. Acad. ScL USA 101, 9873-9878.) y en procesos de señalización derivados de patógenos (Mayda, E., Tornero., P., Conejero, V., and Vera, P. (1999). A tomato homeobox gene (HD-Zip) is involved in limiting the spread of programmed cell death. PlantJ. 20, 591-600.). La mutación puntual identificada en ocp3 tiene como resultado un procesamiento anormal del transcrito correspondiente que provoca una deleción interna donde los primeros 36 nucleótidos del exón III ya no están presentes en el ARNm de ocp3 maduro. Esta corta deleción provoca un desplazamiento de fase en la ORF de ocp3 que tiene como resultado la generación de un codón de terminación prematuro. De esta manera, esta mutación produce una proteína ocp3 truncada que consta de 210 restos aminoacídicos en lugar de los 354 restos aminoacídicos característicos de OCP 3. El dominio de 60 aminoácidos previsto correspondiente al homeodominio (HD) está localizado dentro del dominio C-terminal de 144 aminoácidos que falta en ocp3. Como este dominio es determinante para que las proteínas homeobox funcionen como reguladores de la transcripción, ya que es el sitio donde se establece el contacto con el ADN, principalmente a través de la hélice 3 del dominio HD, que se dirige al surco principal de la hélice de ADN presente en la región promotora de genes cadena abajo (Gehring et al. 1994), es concebible que la proteína ocp3 mutada ya no funcione como un regulador de la transcripción. Por tanto, OCP3 funciona como un factor de transcripción específico de la ruta de transducción de señales de células vegetales dependiente de COIl y mediada por JA y modula la transcripción de genes importantes para la respuesta o respuestas de defensa a patógenos necrotróficos. La identificación de genes diana de OCP3 y la interacción con moléculas de proteínas asociadas es nuestro reto para el futuro. Además, la posible interacción de OCP3 con otros reguladores de la transcripción implicados en la respuesta de defensa a patógenos necrotróficos tales como la proteína JINl relacionada con MYC {Lorenzo et al, 2004), la proteína ERFl de tipo AP2 (Lorenzo, O., Piqueras, R., Sánchez-Serrano, J. J., and Solano, R. (2003). ETHYLENE RESPONSE FACTORl integrates signáis from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15, 165-178.), la proteína BOSl relacionada con MYB (Mengiste et al., 2003) o el factor de transcripción WRKY70 (Li et al., 2004), y cómo funcionan de una manera coordinada para regular la transcripción es otro reto interesante para el futuro. Todas estas estrategias deben ayudar a entender el mecanismo regulador de la función de OCP3 y cómo se puede explotar esta función para generar plantas más resistentes a patógenos fúngicos sin afectar a las respuestas de defensa frente a otros tipos de patógenos. Manipulando genéticamente el gen OCP3 mediante mecanismos de genética reversa en plantas transgénicas que repriman o alteren la expresión génica de OCP3, o bien alteren su funcionalidad como factor de transcripción, permitirá explotar agronómicamente la función de OCP3 en la regulación de la respuesta defensiva de las plantas frente a dichas agresiones patogénicas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Caracterización de plantas ocp3 y comparación con plantas de tipo silvestre.
(A) Una comparación del aspecto externo de plantas ocp3 (a la derecha) y las plantas de tipo silvestre parentales (wt) (a la izquierda). Las plantas se fotografiaron a las 3,5 semanas de edad.
(B) Tinción histoquímica de actividad GUS dirigida por el promotor de Ep5C en una plántula transgénica de tipo silvestre de 10 días (a la izquierda) y plántulas ocp3 (a la derecha) cultivadas en medio de agar MS. La flecha indica una zona de tejido discreta en la unión del hipocotilo y la raíz donde se observa actividad GUS en las plántulas de tipo silvestre.
(C) Hojas en roseta totalmente expandidas de plantas transgénicas de tipo silvestre (a la izquierda) y de plantas ocp3 (a la derecha) teñidas para determinar la actividad GUS.
(D) Producción de H2O2 en plantas de tipo silvestre (a la izquierda) y plantas ocp3 (a la derecha). La producción de H2O2 se ensayó usando 3,3'-diaminobencidina. La coloración pardo-rojiza indica la polimerización de 3,3'-diaminobencidina en el sitio de producción de H2O2. (E) Tinción de tejido de hoja de plantas de tipo silvestre (a la izquierda) y plantas ocp3 (a la derecha) con azul trípano en la búsqueda de signos de muerte celular. La ausencia de colapso celular se revela por la falta de manchas de color azul intenso después de la tinción con azul trípano. (F) Expresión de genes marcadores PR-I, PDFl.2 y GSTl en plantas de tipo silvestre y ocp3 36 horas después de que las plantas se pulverizaran con (+SA) o sin (-SA) una solución tampón que contenía ácido salicílico (SA) 0,3 mM. Figura 2. Resistencia de plantas ocp3 a patógenos necrotrófícos pero no a patógenos biotróficos.
(A) Respuesta de resistencia de plantas Arabidopsis de tipo silvestre y imitantes ocp3 a Peronospora parasítica virulento. Siete días después de la inoculación por pulverización de plantas de 2 semanas de edad con 105 conidiosporas por mililitro de Peronospora, las hojas se tiñeron con lactofenol-azul trípano y se visualizaron con un microscopio para revelar el crecimiento extensivo característico de las hifas y las conidiosporas.
(B) Para cuantificar la resistencia a P. parasítica, la producción de conidiosporas se cuantificó siete días después de la inoculación con la ayuda de un hemocitómetro. Las plantas que llevaban la mutación ocp3 fueron tan resistentes a este patógeno como las plantas de tipo silvestre.
(C) Crecimiento de Pseudomonas syringae pw. tomato DC3000 en plantas de tipo silvestre y ocp3. En plantas de 4 semanas de edad se infiltró una suspensión bacteriana, y se determinó la titulación bacteriana, medida como c.f.u. por peso fresco, a los 0, 3 y 5 días después de la infección en plantas de tipo silvestre (líneas continuas) y ocp3 (líneas discontinuas.) Las barras de error representan los límites de confianza del 95% de los datos transformados en logaritmos. Se tomaron 8 muestras para cada genotipo en cada punto de tiempo. El experimento se repitió 3 veces obteniéndose resultados similares. (D) Hojas representativas de plantas de tipo silvestre y ocp3 4 días después de la inoculación con una gota de 6 μl de una suspensión de esporas (5 x 106 esporas/ml) de P. cucumerina.
(E) Los síntomas de la enfermedad medidos como el tamaño de la lesión se evaluaron 6 días después de la inoculación con P. cucumerina determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión ± SE de las medidas.
(F) Hojas representativas de plantas de tipo silvestre y ocp3 4 días después de la inoculación con una gota de 6 μl de esporas de Botrytis cinérea (2,5 x 104 conidios/ml).
(G) El tamaño de la lesión generada por Botrytis cinérea se midió 6 días después de la inoculación. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión ± SE de las medidas para un mínimo de 30 lesiones.
Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares, wt, tipo silvestre. Figura 3. Efecto de mutaciones relacionadas con SA sobre la respuesta de resistencia a enfermedades de plantas ocp3
(A) Respuesta de resistencia de imitantes dobles ocp3 nahG, ocp3 nprl y ocp3 pad4 a Botrytis cinérea en comparación con la de genotipos imitantes simples y plantas de tipo silvestre. Las plantas se inocularon y los síntomas de la enfermedad se evaluaron como se describe en la figura 2 determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.
(B) Hojas representativas de cada genotipo que muestran síntomas de la enfermedad observadas 5 días después de la inoculación con una gota de 6 μl de esporas de Botrytis cinérea (2,5 x 104 conidios/ml).
(C) Respuesta de resistencia de imitantes dobles ocp3 nahG, ocp3 nprl y ocp3 pad4 a Plectosphaerella cucumerina en comparación con la de genotipos imitantes simples y plantas de tipo silvestre. Las mediciones de la lesión se realizaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión ± SE de las medidas.
Figura 4. Efecto de mutaciones relacionadas con JA y ET sobre la respuesta de resistencia a enfermedades de plantas ocp3.
(A) Respuesta de resistencia de imitantes dobles ocp3 coil y ocp3 jinl a Botrytis cinérea en comparación con la de genotipos imitantes simples y plantas de tipo silvestre. Las plantas se inocularon y los síntomas de la enfermedad se evaluaron como se describe en la figura 2 determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.
(B) Respuesta de resistencia de imitantes dobles ocp3 coil y ocp3 jinl a Plectosphaerella cucumerina en comparación con la de genotipos imitantes simples y plantas de tipo silvestre. Los síntomas de la enfermedad se evaluaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.
(C) Hojas representativas de cada genotipo que muestran síntomas de la enfermedad observadas 7 días después de la inoculación con una gota de 6 μl de esporas de P. cucumerina (5 x 106 esporas/ml). Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión ± SE de las medidas. Figura 5. Clonación posicional de ocp3 y complementación inversa
(A) Región de 0,6 Mb en la parte superior del cromosoma 5 con BAC solapantes flanqueados por los marcadores SSLP Nga249 y ca72 usados para la selección de recombinaciones en 2200 cromosomas. (B) Localización de OCP 3 en el clon BAC secuenciado F2I11. OCP 3 se colocó entre dos marcadores SSLP que comprendían una región de 67,2 Kb de BAC F2I11. Los 19 genes mencionados incluidos en esta región están indicados.
(C) Estructura de exones/intrones de OCP3. Las regiones codificantes están indicadas con líneas gruesas. El inserto presenta el cambio de nucleótidos y su influencia sobre la secuencia de la proteína. El alelo mutante está indicado debajo de la secuencia del tipo silvestre. Las letras minúsculas marcan secuencias de nucleótidos al principio del exón 3. La transición de G a A debida al mutágeno está indicada en mayúsculas y en negrita. Las secuencias de aminoácidos deducidas están indicadas en el código de una sola letra con mayúsculas debajo de cada triplete de nucleótidos y las letras en negrita marcan los cambios de aminoácidos (de Ala a Thr) en las secuencias de las proteínas.
(D) Respuesta de resistencia de plantas ocp3 transgénicas (línea 2AT) transformadas de manera estable con una secuencia de ADN genómico de 3,2 Kb que incluye el gen At5gl l270 entero y comparación con la respuesta de resistencia observada en las plantas de tipo silvestre y en el mutante ocp3. Las plantas se inocularon como se describe en la figura 2 con B. cinérea (a la derecha) y P. cucumerina (a la izquierda) y los síntomas de la enfermedad se evaluaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión ± SE de las medidas.
(E) Tinción histoquímica de la actividad GUS dirigida por el promotor de Ep5C en hojas en roseta totalmente expandidas obtenidas a partir de plantas ocp3 (a la izquierda) y de plantas ocp3 transgénicas transformadas con el gen At5gl l270 (línea 2AT) (a la derecha).
Figura 6. Expresión de OCP3 y genes marcadores de respuesta de defensa después de la infección con P. cucumerina Análisis de RT-PCR de la expresión de OCP3, PDF1-2 y PR-I en tejidos de hoja infectados con P. cucumerina. Se inocularon plantas de tipo silvestre por pulverización con una suspensión de 105 esporas/ml, y el tejido se congeló para la extracción del ARN. Los números indican horas después de la inoculación. Los geles de la parte inferior muestran RT-PCR para el gen interno elF4α usado como control de carga. El experimento se repitió dos veces obteniéndose resultados similares. Figura 7. Análisis de ADNc de OCP3y de ocp3
(A) Diagrama de estructura de exones/intrones de OCPS. Los exones se indican con líneas gruesas. En el inserto se indica la secuencia de nucleótidos en la unión de empalme en el exón 3. Las letras minúsculas marcan secuencias de intrones, las letras mayúsculas indican secuencias de exones, las letras mayúsculas en negrita indican aminoácidos y las flechas indican la substitución de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente. Las flechas en la parte superior del gen esquematizado indican la diferente posición de los cebadores usados en los experimentos de RT-PCR.
PfullDl está localizado al principio del exón 1; pfullRl está localizado el final del exón 4; pDl al final del exón 2; pD2 al principio del exón 3 y pRl en medio del exón 3. D indica la orientación directa (de 5' a 3') mientras que R denota la orientación inversa (de 3' a 5'). (B) Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR obtenidos cuando se usa ARNm de plantas de tipo silvestre (wt) y ocp3 y diferente combinación de cebadores. Obsérvese la reducción del peso molecular y, de esta manera, la migración más rápida de la banda amplificada procedente de plantas ocp3 con cebadores pDl+pRl en comparación con la obtenida de plantas de tipo silvestre. Obsérvese también la ausencia del producto de ADN amplificado cuando se usan cebadores pD2+pRl y ARNm transcrito con transcriptasa inversa procedente de plantas ocp3, pero no de plantas de tipo silvestre. La ausencia de producto amplificado indica una falta de reconocimiento por uno de los dos cebadores en la plantilla de ADNc generada a partir de plantas ocp3. El experimento se repitió varias veces con ARNm derivado de 4 plantas de tipo silvestre y ocp3 diferentes.
(C) Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos derivada de clones de ADNc derivados de ARNm aislado a partir de plantas de tipo silvestre (OCP3) y imitantes (ocp3). Los productos transcritos de forma inversa se amplificaron con cebadores pfullDl y pfullRl y se secuenciaron completamente las dos cadenas. Obsérvese la deleción interna de 36 nucleótidos en todos los ADNc de ocp3 secuenciados. Esta subrayada la secuencia de nucleótidos común a los ADNc derivados de ocp3 y OCP3. La deleción interna en los ADNc de ocp3 influye sobre la secuencia de aminoácidos derivada y provoca un desplazamiento de fase que genera un codón de terminación prematuro en la proteína ocp3. Las letras mayúsculas en negrita marcan aminoácidos y los asteriscos indican un codón de terminación. La flecha indica la presencia y posición del nucleótido (G) en el ADNc de OCP3 que si se muta produce el fenotipo ocp3. Los resultados se reprodujeron varias veces con ARNm derivado de diferentes plantas de tipo silvestre y ocp3 y en diferentes fases de crecimiento.
Figura 8. Proteína OCP3 y comparación con otras proteínas que contienen homcodominios de Arabidopsis.
(A) Secuencia de aminoácidos prevista de OCP3. El homeodominio se muestra en negrita. Las dos señales de identificación conservadas para la localización nuclear están subrayadas. El dominio ácido se muestra en cursiva y el dominio que interacciona con la proteína nuclear (LxxLL), incluido dentro de esta región acida, se muestra subrayado.
(B) Estructura proteica prevista de OCP3. Se indica la posición relativa de señales de localización nuclear (NLS), del dominio de interacción con la proteína nuclear (LxxLL), del dominio ácido y del homeodominio (HD). (C) Alineación de secuencias que muestra la secuencia de aminoácidos C-terminal de OCP3 con el homeodominio de diferentes genes homeobox de Arabidopsis incluyendo miembros de la familia KN y HD-Zip. El asterisco encima de las alineaciones corresponde a posiciones de aminoácidos en el HD que están muy conservadas en todos los organismos y define la señal de identificación del homeodominio. El sombreado negro indica aminoácidos conservados en todas las entradas, y el sombreado gris indica aminoácidos con características fisicoquímicas muy similares.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE UN MODO DE REALIZACIÓN Plantas, condiciones de crecimiento y tratamientos Se cultivaron plantas Arabidopsis thaliana en substrato o en placas que contenían medio de Murashige y Skoog (MS) como se ha descrito previamente (Mayda et ai, 2000). El mutante ocp3 se aisló en una investigación de expresadores constitutivos del gen indicador Ep5C-GUS en plantas transgénicas Columbia (Col-0) mutagenizadas con metanosulfonato de etilo (EMS), como se ha descrito previamente para otro mutante (Mayda et al., 2000). La línea mutante ocp3 usada en estos experimentos se sometió tres veces a retrocruzamiento con la línea parental de tipo silvestre. Se cultivaron las plantas en una cámara de crecimiento a 20-220C, humedad relativa del 85%, y 100 μEm"2 seg"1 de iluminación fluorescente, en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Para todos los experimentos se usaron hojas completamente expandidas de plantas de cuatro semanas de edad (a menos que se indique otra cosa). Se realizó la tinción para determinar la presencia de H2O2 a través del método de captación de 3,3'- diaminobencidina (DAB), tal y como se ha descrito anteriormente {Thordal-Christensen et al, 1997). Se realizó la tinción para determinar la presencia de actividad GUS como se ha descrito previamente (Mayda et al, 2000).
Infección con patógenos
Se cultivó Pseudomonas syringae pw. tomato DC3000 (P.s. tomato DC3000) y se preparó para la inoculación como se ha descrito previamente (Mayda et al. 2000). Se determinó la densidad de las poblaciones de bacterias cultivando diluciones en serie en medio B de King suplementado con rifampicina (50 μg/ml) a 28°C y contando las unidades formadoras de colonias. Se presentaron los datos como medias y desviaciones típicas del logaritmo (cfu/crn2) de al menos seis réplicas. Para los experimentos de resistencia a Peronospora parasítica, se pulverizaron plantas de tres semanas de edad con una suspensión de conidios de P. parasítica (10 5 conidiosporas mi"1 de agua corriente) como se ha descrito previamente (Mayda et al, 2000). Se evaluó en el séptimo día, la densidad de las esporas en las plántulas (siete macetas por tratamiento, cada maceta tratada por separado) usando un hemocitómetro. Como alternativa, se tiñeron las muestras de hoja con lactofenol-azul trípano en diferentes días tras la inoculación y se examinaron con el microscopio como se ha descrito anteriormente (Mayda et al, 2000). Para la resistencia a Plectosporium y Botrytis, se trasplantaron plántulas de tres semanas a macetas individuales y se cultivaron a 22°C durante el día/18°C durante la noche, con doce horas de luz por 24 horas. Cuando las plantas tenían seis semanas, se inocularon aplicando gotas de 6 mi de suspensión de esporas de Plectosphaerella cucumerina (5 x 106 esporas mi"1) o Botrytis cinérea (2,5 x 104 conidios mi"1) a 3 hojas completamente expandidas por planta. Se aisló P. cucumerina a partir de Arabidopsis infectada de manera natural (acceso Landsberg erecta) y se cultivó en agar de patata-dextrosa de 19,5 g/1 (Difco, Detroit) a temperatura ambiente durante 2 semanas antes de recoger las esporas y de suspenderlas en MgSO4 10 mM. B. cinérea (cepa BMMl, aislada a partir de Pelargonium zonale) se cultivó en agar de patata-dextrosa de 19,5 g/1 (Difco, Detroit) a 200C durante 10 días. Se recogieron los conidios y se suspendieron en PDS estéril (12 g I"1, Difco). Las plantas se mantuvieron con una humedad relativa del 100% y los síntomas de la enfermedad se evaluaron de 4 a 10 días después de la inoculación determinando el diámetro medio de la lesión en 3 hojas de 5 plantas.
Análisis genético
Se realizaron cruces emasculando capullos no abiertos y usando los pistilos como receptores de polen. Se realizaron retrocruzamientos con la línea transgénica parental usando plantas Ep5C-GUS como donantes de polen. También se realizaron los cruces recíprocos. Se cultivaron plantas Fl y F2 en placas MS y se ensayaron con respecto a la actividad GUS. La segregación del fenotipo en la generación F2 se analizó con un ensayo chi-cuadrado para comprobar la calidad del ajuste.
Mapeo basado en PCR
Una planta ocp3 (en Columbia como base) se cruzó con Landsberg erecta y se usó para el mapeo la descendencia que segregaba imitantes homocigotos ocp3 tras la autofecundación. Se seleccionaron plántulas de la población F2 para la extracción del
ADN y las plántulas recombinantes se identificaron usando marcadores de polimorfismos de longitud en las secuencias simples (SSLP) por el protocolo descrito por Bell y Ecker (1994) y con nuevos marcadores como se indica en el sitio web de la base de datos de Arabidopsis (http://genome-www.stanford.edu).
Generación de Mutantes Dobles
Los alelos mutantes usados a lo largo de esta invención fueron nprl-7 (Cao et al., 1997), pad4-l (Zhou et ai, 1998), coil-1 (Xie et ai, 1998), ein2-5 (Alonso et ai, 1999) y jinl-1 (Lorenzo et ai, 2004). Se han descrito las plantas transgénicas (en el ecotipo Columbia) que expresaban el gen nahG bacteriano (Reuber et al. 1998). Los mutantes dobles ocp3 nprl, ocp3 pad4, ocp3 coil, ocp3 ein2, ocp3 jinl y ocp3 nahG se generaron usando ocp3 como receptor del polen. La homocigosidad de los loci se confirmó usando marcadores moleculares para cada uno de los alelos en poblaciones de segregación. Todos los mutantes dobles se confirmaron en la generación F3, excepto las plantas ocp3 coil que fueron estériles y no pudieron propagarse en heterocigosidad para coil. Para el mutante doble que contenía ein2-5, las semillas F2 se cultivaron en placas con MS que contenían ácido 1-amino-ciclopropano-l-carboxílico (ACC) 20 μM y se pusieron en una cámara de crecimiento. Después de tres días en la oscuridad, las plántulas se evaluaron con respecto a la presencia o ausencia de la respuesta triple inducida por etileno (ET) (Guzman y Ecker 1990). El mutante ein2, que era insensible a ET, no presenta la respuesta triple. Se recogieron plantas F2 que carecían de la respuesta triple y se transfirieron al substrato para evaluar la homocigosidad para ocp3.
Clonación de ADN genómico y ADNc
La secuencia genómica se usó como base para la clonación de ADNc y clones genómicos. Se aisló ARN poli(A*) a partir de diferentes plantas de tipo silvestre y ocp3 y se transcribió con transcriptasa inversa usando cebadores oligo (dT) como se ha descrito (Mayda et ai, 1999). Éstos se usaron como plantillas para amplificar ADNc de OCP3 y de ocp3 usando diferentes combinaciones de los cebadores con especificidad de gen con sentido y antisentido: pfulldl (5'-GAATTCATGATAAAAGCCATGG-S'), pfuIIRl (5'-GTTAACTCTAGATCTTTCCGGAG-S'), pDl (5'-GGTGATGTTGATGTTGATGTTG-3'), pRl (5'-CTTAGGTTCGACCACAACATCTTCAG-S') y pD2 (5'-ATCTGGCAGCTGAGGTTTGTCTTG-S').
Complementación Inversa
Se amplificó la región genómica de OCP3 por PCR usando cebadores con especificidad de gen diseñados para incluir la región de 1,5 Kb cadena arriba del codón de iniciación y una parte de la región 3' que sigue al codón de terminación. Las secuencias de los cebadores genómicos de avance e inverso de OCP3 usados fueron: (5'-GAGATTGGAACGTGGGTCGACTTTAG-S) y
(5'-TTCCTGAATTCATACTTTATCATAG-S'), respectivamente. Se obtuvo un fragmento genómico de 3,2 Kb que contenía el gen At5gl l270 de tipo silvestre por PCR usando cebadores y se clonó en pCAMBIA1300 para producir el clon pCAMBIAOCP3 que se transfirió a Agrobacterium y se usó para transformar plantas ocp3 por el método de inmersión floral (Bechtold, K, ElHs, J. And Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plañís. C. R. Acad. Sd. Paris Life ScL 316, 1194-1199.) Análisis de Expresión
Para analizar el nivel de expresión génica por PCR mediada por transcriptasa inversa, se prepararon muestras de ARN total a partir de tejidos de hoja usando el kit Totally RNA de Ambion (Austin TX). La transcripción inversa se realizó usando el kit de RT para PCR de Clontech {Palo Alto, CA).
La serie de cebadores oligonucleotídicos (50 pmol cada uno) usadas para amplificar
OCP3 fueron: OCP3PCRl(5'-GCTTAAAAGACTGGCTTATGCATTG-3')/OCP3PCR2
(5'-GCTTTGGAGCGGGTCACGAAG-S').
Los cebadores usados para amplificar PDF 1.2 fueron PDF1.2PCR1 (5'- ATGGCTAAGTTTGCTTCCAT-3')/PDF 1.2PCR2(5'- ACATGGGACGTAACAGATAC-3').
Los cebadores usados para amplificar PRl fueron PRlPCRl (5'- ATGAATTTTACTGGCTATTC-3')/PRlPCR2 (5'-AACCCACATGTTCACGGCGGA- 3').

Claims

REIVINDICACIONES
1. Gen de Arabidopsis thaliana denominado OCP3, caracterizado por codificar un factor de transcripción de tipo homeobox y por su secuencia de nucleótidos SEC. ID. No. 1.
2. Gen OCP3 según reivindicación 1, caracterizado por ser un represor activo de la respuesta de resistencia a patógenos fúngicos necrotróficos
3. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque su ADNc codifica una proteína de 354 restos aminoacídicos de 3911 ID y un pl de 4,53.
4. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta cerca del extremo C-terminal un homeodominio de 60 aminoácidos en las posiciones 284 a 344.
5. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta dos señales de localización nuclear bipartitas canónicas:
a) RK-(X)10-KKNKKK en las posiciones 64-81 , y b) KK-(X)10-RRSKR en las posiciones 294-310, estando ésta dentro del homeodominio.
6. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta una región extendida rica en restos ácidos en las posiciones 84-181.
7. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta un motivo LxxLL canónico en las posiciones 101-105, el cual es una secuencia característica que facilita la interacción de diferentes co-activadores de la transcripción a receptores nucleares.
8. Gen OCP3 según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque funciona como regulador negativo de la respuesta de defensa mediada por el ácido jasmónico, a patógenos füngicos necrotróficos.
9. Gen OCP3 según reivindicación anterior, caracterizado porque funciona como un factor de transcripción específico de la ruta de transducción de señales de células vegetales, dependiente de COIl y mediada por el ácido jasmónico.
10. Mutación recesiva en el gen OCP3 caracterizada por conferir una mayor resistencia a las plantas imitantes ocp3, a los patógenos fúngicos necrotróficos.
11. Mutación recesiva ocp3 según la reivindicación 10, caracterizada por conferir expresión constitutiva del gen PDF 1.2 que codifica una proteína de defensa en la respuesta de defensa de las plantas mediada por el ácido jasmónico.
12. Mutación recesiva ocp3 según la reivindicación 11, caracterizada porque el gen PDF 1.2 es utilizado como marcador de la respuesta fisiológica/molecular de las plantas, mediada por el ácido jasmónico.
13. Mutación recesiva ocp3 según reivindicaciones 10, 11 y 12 caracterizada porque su ADNc presenta una deleción interna correspondiente a los primeros 36 nucleótidos del exón III.
14. Mutación recesiva ocp3 según reivindicación 13, caracterizada porque produce una proteína truncada con 210 restos aminoacídicos en lugar de los 354 restos animoacídicos de OCP3.
15. Utilización del gen OCP3 en especies vegetales de interés agronómico, para la obtención de plantas transgénicas resistentes a patógenos fúngicos necrotróficos.
16. Plantas transgénicas caracterizadas por incorporar el gen OCP3 según las reivindicaciones anteriores, en las que el gen OCP3 incorporado se ha manipulado genéticamente de forma que se reprime o altera su expresión génica o bien su funcionalidad como factor de transcripción, confiriéndolas una mayor resistencia a patógenos fúngicos necrotróficos.
PCT/ES2006/070050 2005-04-22 2006-04-20 GEN OCP3 DE ARABIDOPSIS THALIANA Y SU MUTACIÓN RECESIVA ocp3, Y SU USO COMO REGULADOR DE LA RESISTENCIA EN PLANTAS A ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS NECROTRÓFICOS WO2006114470A2 (es)

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