ES2308869B2 - Gen ocp3 de arabidopsis thaliana y su mutacion recesiva ocp3, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patogenos fungicos necrotroficos. - Google Patents

Abstract

Gen OCP3 de Arabidopsis thaliana y su mutación recesiva ocp3, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos fúngicos necrotróficos.

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al gen OCP3 de Arabidopsis y su mutación ocp3, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos necrotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas transgénicas resistentes a este tipo de patógenos.

Description

Gen OCP3 de Arabidopsis thaliana y su mutación recesiva ocp3, y su uso como regulador de la resistencia en plantas a enfermedades producidas por patógenos fúngicos necrotróficos.

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de la biotecnología vegetal, y en concreto se refiere al gen OCP3 de Arabidopsis y su mutación ocp3, así como su función en la regulación de la resistencia a enfermedades producidas por patógenos necrotróficos, y sus aplicaciones en la generación de plantas transgénicas resistentes a este tipo de patógenos.

Estado de la técnica

Las plantas reaccionan al ataque por microorganismos fitopatógenos con una serie de respuestas inducibles que conducen a la expresión local y sistémica de un amplio espectro de defensas antimicrobianas. Estas incluyen el fortalecimiento de barreras mecánicas, estallido oxidativo, producción de novo de compuestos antimicrobianos y la inducción del mecanismo de respuesta hipersensible (HR), donde el tejido que rodea al sitio de infección muere y a su vez limita el crecimiento del patógeno impidiendo su extensión (Hammond-Kosack y Parker, (2003) Deciphering plant-pathogen communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding. Curr. Op. Biotechnol. 14, 177-193).

Nuestra comprensión de cómo las plantas activan las respuestas de defensa se ha desarrollado substancialmente, y esto en parte se ha facilitado por la clonación y caracterización de factores de resistencia a enfermedades de las plantas que reconocen los factores avirulentos correspondientes del patógeno para inducir la respuesta hipersensible o HR (Dangl y Jones, (2001) Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411, 826-33).

La inducción de la respuesta hipersensible a menudo está asociada con el desarrollo de resistencia sistémica adquirida (SAR), otra respuesta de defensa bien estudiada que proporciona una protección duradera en toda la planta contra un amplio espectro de patógenos (Durrant y Dong, (2004) Systemic acquired resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 42, 185-209).

El aislamiento y análisis de mutantes con respuestas de defensa alteradas (Durrant y Dong, 2004; Kunkel y Brooks, (2002) Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr. Op. Plant Biol. 5, 325-331) están ayudando a la caracterización de componentes celulares implicados en la transducción de señales y a la comprensión del papel de las moléculas señal de defensa de las plantas. Estos estudios tienen una importancia primordial para comprender el acoplamiento de reconocimiento de patógenos a la activación de respuestas de defensa en la planta. El ácido salicílico (SA), un derivado de ácido benzoico, es una molécula señal central que media diferentes aspectos de las respuestas HR y SAR. Desde hace mucho tiempo se ha demostrado que la síntesis y acumulación del ácido salicílico es indispensable para crear una respuesta de defensa eficaz contra oomicetes y patógenos bacterianos (Gaffney, T., Friedrich, L., Vernooij, B., Negretto, D., Nye, G., Uknes, S., Ward, E., Kessmann, H., and Ryals, J. (1993). Requirement of salicylic acid for induction of systemic acquired resistance. Science 261, 754-756). y su señalización está mediada en su mayor parte por una proteína de repetición de anquirina, NPRI/NIM1 (Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J.D., Volko, S., and Dong, X (1997). The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cell 88, 57-63) aunque, se han propuesto y se han identificado genéticamente rutas independientes de NPR1 para canalizar la señalización por ácido salicílico (Clarke, J.D., Liu, Y., Klessig, D.F., and Dong, X (1998). Uncoupling PR gene expression from NPRI and bacterial resistance: Characterization of the dominant Arabidopsis cpr6-1 mutant. Plant Cell 10, 557-569; Clarke, J.D., Volko, S.M., Ledford, H., Ausubel, F.M., and Dong, X (2000). Roles of Salicylic Acid, Jasmonic Acid, and Ethylene in cpr-Induced Resistance in Arabidopsis. Plant Cell 12, 2175-2190; Mayda, E., Mauch-Mani, B., and Vera, P. (2000). The Arabidopsis dth9 mutant is compromised in systemic acquired resistance without affecting SA-dependent responses. Plant Cell 12, 2119-2128; Shah, J., Kachroo, P., and Klessig, D.F. (1999). The Arabidopsis ss1 mutation restores pathogenesis-related gene expression in npr1 plants and renders defensin gene expression salicylic acid dependent. Plant Cell 11, 191-206).

Además del ácido salicílico, se ha demostrado que otras moléculas de señalización tales como el ácido jasmónico (JA) y el etileno (ET), solos o en combinación concertada, regulan otros aspectos distintos de las respuestas de defensa de las plantas (Kunkel y Brooks, 2002; Turner, J.G., Ellis, C., and Devoto, A. (2002). The jasmonate signal pathway. Plant Cell (suppl), S153-S164.), y también se han proporcionado indicios genéticos de esta implicación en la respuesta a patógenos fúngicos. Por ejemplo, ciertos mutantes de Arabidopsis que no pueden producir ácido jasmónico (por ejemplo, un mutante triple fad3 fad7 fad8), o que no pueden percibir esta hormona (por ejemplo, coi1, jin1 o jar1/jin4) tuvieron una susceptibilidad alterada a diferentes patógenos necrotróficos (Kunkel y Brooks, 2002; Lorenzo O., Chico, J.M., Sanchez-Serrano, J.J., Solano, R. (2004). JASMONATE-INSENSITIVE1 Encodes a MYC Transcription Factor Essential to Discriminate between Different Jasmonate-Regulated Defence Responses in Arabidopsis. Plant Cell 16, 1938-1950; Staswick, P.E., Yuen, G.Y., and Lehman, C. C. (1998). Jasmonate signaling mutants of Arabidopsis are susceptible to the soil fungus Pythium irregulare. Plant J. 15, 747-54; Thomma, B.P.H.J., Eggermont, K. Penninckx, I.A.MA., Mauch-Mani, B., Vogelsang, R., Cammue, B.P.A. and Broekaert, WF. (1998). Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 15107-11; Thomma, B,P., Penninckx, LA., Broekaert, W.F., and Cammue, B.P. (2001). The complexity of disease signaling in Arabidopsis. Curr Opin Immunol. 13, 63-68; Vijayan P, Shockey J, Levesque CA, Cook RJ. Browse J. (1998). A role for jasmonate in pathogen defense of Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 7209-7214).

Además, durante la respuesta de resistencia a enfermedades, se ha descrito una relación antagonista mutua entre las rutas de señalización por ácido salicílico y ácido jasmónico (Kunkel y Brooks, 2002). A este respecto, los mutantes de Arabidopsis con deficiencias en la acumulación de ácido salicílico (SA) (por ejemplo, pad4 y eds1) o con una alteración en la respuesta al ácido salicílico (por ejemplo, npr1) presentan una mejor inducción de genes que responden al ácido jasmónico (JA) (Penninckx, I.A., Eggermont, K., Terras, F.R., Thomma, B.P., De Samblanx, G. W, Buchala, A., Metraux, J.P., Manners, J.M., Broekaert, WF. (1996). Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway. Plant Cell 8, 2309-23; Clarke et al., 1998; Gupta, V, Willits, M G., and Glazebrook, J. (2000). Arabidopsis thaliana EDS4 contributes to salicylic acid (SA)-dependent expression of defense responses: evidence for inhibition of jasmonic acid signaling by SA. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 503-511).

Se ha postulado que la supresión normal de los genes de respuesta a JA por SA se regula por la diferente localización celular de la proteína NPR1 (Spoel, S.H., Koornneef, A., Claessens, S.M.C., Korzelius, J.P., van Pelt, J.A., Mueller, M.J., Buchala, A.J., Metraux, J., Brown, R., Kazan, K., Van Loon, L. C., Dong, X, and Pieterse, C.M.J. (2003). NPR1 modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol. Plant Cell 15; 760-770).

De forma similar, ciertos estudios genéticos proporcionan indicios que indican que la señalización con JA también puede controlar negativamente la expresión de genes que responden a SA en Arabidopsis (Petersen, M, Brodersen, P., Naested, H., Andreasson, E., Lindhart, U., Johansen, B., Nielsen, H.B., Lacy, M., Austin, M.J., Parker, J.E., Sharma, S.B., Klessig, D.F., Martienssen, R., Mattsson, O., Jensen, A.B., and Mundy J. (2000). Arabidopsis MAP Kinase 4 Negatively Regulates Systemic Acquired Resistance. Cell 103, 1111-1120; Kloek et al., 2001; Li, J., Brader, G., and Palva, E.T. (2004). The WRKY70 Transcription Factor: A Node of Convergence for Jasmonate-Mediated and Salicylate-Mediated Signals in Plant Defense. Plant Cell 16, 319-333).

El mecanismo molecular que explica tal réplica de ruta sigue sin entenderse bien. Por lo tanto, la caracterización de componentes moleculares que finalmente coordinan las rutas de señalización por SA y JA es primordial para la compresión, y finalmente la creación por ingeniería genética, de mecanismos de resistencia muy regulados que proporcionan una protección eficaz a subseries específicas de patógenos. Además de las moléculas señal mencionadas anteriormente, desde hace mucho tiempo se ha reconocido la producción y acumulación de especies oxígeno reactivas (ROS), principalmente superóxido (O_{2}^{-}) y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}), durante el curso de una interacción planta-patógeno (Apostol, I., Heinstein, F.H., Low. P.S. (1989). Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116.; Baker, C.J., and Orlandi, E. W. (1995). Active oxygen species in plant pathogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 33, 299-321).

Los indicios sugieren que el estallido oxidativo y la señalización redox afín asociada posteriormente, pueden jugar un papel central en la integración de una diversa serie de respuestas de defensa de las plantas (Alvarez ME, Pennell RI, Meijer PI, Ishikawa A, Dixon RA, Lamb C. (1998). Reactive oxygen intermediates mediate a systemic signal network in the establishment of plant immunity. Cell 92, 773-784; Grant, J.J., and Loake, G. J. (2000). Role of reactive oxygen intermediates and cognate redox signaling in disease resistance. Plant Physiol, 124, 21-29). Además, también se ha documentado en plantas, una réplica entre respuestas de defensa dependientes de ROS y SA (Kauss, H., Jeblick, W. (1995). Pretreatment of Parsley Suspension Cultures with Salicylic Acid Enhances Spontaneous and Elicited Production of H_{2}O_{2}. Plant Physiol. 108. 1171-1178.; Mur, L.A., Brown, I.R., Darby, R.M., Bestwick, C.S., Bi, Y.M., Mansfield, J. W, Draper, J. (2000). A loss of resistance to avirulent bacterial pathogens in tobacco is associated with the attenuation of a salicylic acid potentiated oxidative burst. Plant J. 23, 609-621; Shirasu, K., Nakajima, H., Rajasekhar, V.K, Dixon, R.A., and Lamb, C. (1997). Salicylic acid potentiates an agonist-dependent gain control that amplifies pathogen signals in the activation of defense mechanisms. Plant Cell. 9, 261-70; Tierens, K.F., Thomma, B.P., Bari, R.P., Garmier, M, Eggermont, K., Brouwer, M, Penninckx, LA., Broekaert, W.F., and Cammue, B.P. (2002). Esa1, an Arabidopsis mutant with enhanced susceptibility to a range of necrotrophic fungal pathogens, shows a distorted induction of defense responses by reactive oxygen generating compounds. Plant J. 29, 131-40), pero sigue sin entenderse bien el mecanismo exacto y los componentes que asocian una señalización redox con la respuesta de defensa inducida.

Recientemente, se ha identificado el gen Ep5C de plantas de tomate, que codifica una peroxidasa catiónica, y se ha usado como marcador para respuestas tempranas dependientes de la transcripción, controladas por H_{2}O después de la percepción de un patógeno, y con un modo de activación génica conservado tanto en tomate como en plantas Arabidopsis (Coego, A., Ramirez, V., Ellul, P., Mayda, E., and Vera, P. (2005). The H_{2}O_{2}-regulated Ep5C gene encodes a peroxidase required for bacterial speck susceptibility in tomato. Plant J. "in press"). Como la expresión inducida por patógenos de Ep5C se basa en la producción y acumulación de H_{2}O_{2} por la célula vegetal afectada, esto apunta a Ep5C como marcador para buscar nuevos componentes de defensa que finalmente participan en las rutas relacionadas con la defensa en las plantas. Para este fin, en la presente invención se describe el aislamiento y caracterización del mutante ocp3 de Arabidopsis thaliana desregulado en la expresión del gen Ep5C inducible por H_{2}O_{2} identificado previamente. Se demuestra que OCP3 codifica un factor de transcripción de tipo homeobox que regula diferentes aspectos de la respuesta de defensa. Por medio del análisis de plantas mutantes ocp3 y el análisis de epistasis con otros mutantes relacionados con la defensa, se propone que OCP3 controla aspectos críticos de la ruta mediada por JA en patógenos necrotróficos.

Descripción de la invención Aislamiento y caracterización del mutante ocp3 de Arabidopsis

Tal y como se ha comentado anteriormente, el gen Ep5C codifica una peroxidasa catiónica extracelular y se activa transcripcionalmente por el H_{2}O_{2} generado durante el curso de interacciones planta-patógeno (Coego et al., 2005). Para identificar señales y mecanismos implicados en la inducción del gen Ep5C y probar el impacto que puede tener esta ruta en la resistencia a enfermedades, se realizó una búsqueda de mutantes usando plantas transgénicas de Arabidopsis que llevan una construcción génica Ep5C-GUS (el gen GUS codifica para la enzima \beta-Glucoronidasa). La base lógica de la presente investigación fue que buscando mutantes que mostraran una expresión constitutiva del gen indicador en plantas cultivadas en condiciones no inductivas, se identificarían mutaciones que afectan a la regulación de esta ruta de-señalización. Por lo tanto, se mutagenizó una de nuestras líneas transgénicas de Arabidopsis Ep5C-GUS, previamente caracterizada con metanosulfonato de etilo (EMS) y se usaron plantas M2 (segunda generación de un mutantes inducido, en el presente caso por agentes químicos o físicos) para determinar la existencia de cualquier expresador constitutivo de GUS en ausencia de cualquier amenaza por patógenos. De aproximadamente 10.000 plantas M2 investigadas, se identificaron 18 expresadores constitutivos de GUS que se dejó que produjeran semillas. La actividad GUS se ensayó de nuevo en la descendencia de todos estos supuestos mutantes para confirmar si el fenotipo era heredable. Ocho líneas, correspondientes a seis grupos de complementación mantuvieron la actividad constitutiva GUS en generaciones posteriores. Se denominó a estos mutantes ocp (del inglés Overexpression of Cationic Peroxidase gene promoter) y el mutante seleccionado para el análisis adicional fue ocp3 (figura 1). Macroscópicamente, las plantas ocp3 no fueron muy distintas de las plantas de tipo silvestre tanto en términos de la arquitectura de la planta como en términos del hábito de crecimiento (figura 1A). Sin embargo, en fases tempranas del desarrollo de las plantas, las plantas ocp3 muestran un retraso en la velocidad de crecimiento en comparación con las plantas de tipo silvestre. Este retraso en la velocidad de crecimiento también va acompañado de la presencia de un color verde menos intenso en las hojas jóvenes. Se realizó una tinción histoquímica para investigar el modelo de expresión del gen indicador constitutivo en los mutantes ocp3 en comparación con las plantas parentales de tipo silvestre no mutagenizadas. Como se muestra en la figura 1B, en las plántulas parentales no se detectó actividad GUS excepto en una zona discreta en la unión entre la raíz y el tallo (véase la flecha del panel izquierdo de la figura 1B). Al contrario, en las plántulas ocp3 se detectó actividad GUS en las hojas en expansión así como en los cotiledones y en el tallo, pero se detectó muy poca actividad en las raíces. De la misma manera, en las hojas en roseta de las plantas ocp3, la actividad GUS se distribuyó a lo largo de todo el haz de la hoja, mientras que las hojas de las plantas parentales no mostraron una expresión de GUS detectable (figura 1C).

Como se propuso que el H_{2}O_{2} era la molécula señal que desencadenaba la activación de la transcripción de Ep5C después de la percepción del patógeno (Coego et al., 2005), se hipotetizó que la acumulación de H_{2}O_{2} aumenta en plantas ocp3 o, como alternativa, el mutante ocp3 debe ser hipersensible a ROS. Para examinar si las plantas ocp3 mostraban algún fenotipo en relación con esto, se estudió la sensibilidad al H_{2}O_{2} o a reactivos que generan directa o indirectamente H_{2}O_{2}. Se dejaron germinar semillas de ocp3 y de la línea parental en medio MS (Murashige y Skoog) que contenía diferentes cantidades de H_{2}O_{2} y el crecimiento se registró a diferentes intervalos de tiempo. No se encontraron diferencias significativas en la inhibición del crecimiento para ocp3 con respecto a las plántulas parentales. De manera similar, la inhibición del crecimiento fue parecido en las plántulas de tipo silvestre y ocp3 cuando se ensayó con luz en presencia de las moléculas generadoras de ROS, con rosa de bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína) o paraquat (metil viologen). De esta manera, según estos ensayos, la mutación ocp3 no confiere un aumento de sensibilidad o una mayor resistencia al estrés oxidativo. Sin embargo, el análisis de transferencia de Northern con ARNm de plantas de tipo silvestre y plantas ocp3 reveló (figura 1F; calles de la derecha) que las plántulas mutantes expresaban constitutivamente GST6, un gen que como se había demostrado previamente se controlaba por H_{2}O_{2} (Alvarez et al., 1998; Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R., and Lamb, C. (1994). H_{2}O_{2} from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell 79, 583-93.). Esto refleja que las plantas ocp3 pueden estar produciendo y/o acumulando mayores niveles de H_{2}O_{2} que los encontrados normalmente en las plantas de tipo silvestre. Para ensayar esto, se tiñeron hojas in situ con 3,3'-diaminobencidina (DAB), un reactivo histoquímico que en presencia de H_{2}O_{2}, se polimeriza para producir un precipitado pardo-rojizo visible (Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y, and Collinge, D.B. (1997). Subcellular localization of H_{2}O_{2} in plants. H_{2}O_{2} accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J. 11, 1187-1194.). En las hojas de las plantas de tipo silvestre pudo observarse muy poca tinción con DAB (figura 1D, izquierda). Al contrario, las hojas de plantas ocp3 mostraron distintos focos de tinción con DAB esparcidos a lo largo de todo el haz de la hoja (figura 1D, a la derecha). Además, las plantas ocp3 no mostraron ningún signo de muerte celular o colapso celular, como se reveló después de la tinción con azul tripano (figura 1E) y no mostró diferencias con el tipo silvestre cuando se ensayó la producción de aniones superóxido (O_{2}^{-}) por tinción con nitroazul de tetrazolio.

De esta manera, la mayor acumulación observada de H_{2}O_{2} y la inducción de GST6 en plantas ocp3, sugiere que la mutación produce una señal relacionada con el estrés oxidativo, pero no induce una respuesta de muerte celular. Esto concuerda con la observación previa en la que el H_{2}O_{2}, cuando se genera durante una interacción de planta-patógeno o cuando se genera in situ por infiltración con diferentes sistemas de generación de H_{2}O_{2}, es la señal que desencadena la activación de la transcripción de Ep5C-GUS, característica en plantas transgénicas de Arabidopsis (Coego et al., 2005). Por lo tanto, en el mutante ocp3 concurren tanto la generación de H_{2}O_{2} como la activación del mecanismo de señalización que conduce a la activación de la transcripción de Ep5C.

El mutante ocp3 tiene una mayor resistencia a patógenos necrotróficos, pero no a patógenos biotróficos

Para estudiar una relación causal entre la ruta de señalización que media la activación de Ep5C-GUS en ocp3, y la que media la susceptibilidad a enfermedades, se ensayó la respuesta de este mutante a diferentes patógenos que generan enfermedades en Arabidopsis. En la figura 2 se muestra la respuesta de plantas ocp3 al oomicete biótrofo virulento obligado Peronospora parasitica y su comparación con la respuesta de plantas parentales de tipo silvestre. El crecimiento del patógeno se ensayó por observación directa de hifas teñidas en hojas infectadas (figura 2A) y por el recuento de las esporas producidas en las hojas infectadas (figuras 2B). Usando estas dos medidas, no hubo ninguna diferencia significativa en el crecimiento de patógenos entre las plantas de tipo silvestre y las plantas ocp3. Se produjo esporulación en el 50% de las hojas tanto de plantas de tipo silvestre como de plantas ocp3. Por lo tanto, la mutación ocp3 no afecta a la susceptibilidad de la planta a la colonización por P. parasitica.

Se investigaron adicionalmente los cambios en la susceptibilidad de plantas ocp3 a patógenos, usando el patógeno bacteriano virulento Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) y controlando la velocidad de crecimiento de esta bacteria en las hojas inoculadas. Las curvas de crecimiento resultantes se muestran en la figura 2C. Como ocurre con P. parasitica, la velocidad de crecimiento de Pst DC3000 en plantas ocp3 no fue significativamente diferente de la observada en las plantas de tipo silvestre. Por lo tanto, la susceptibilidad de la planta de tipo silvestre y del mutante ocp3 también sigue casi intacta tras la inoculación local con este patógeno.

Para determinar si la mutación ocp3 podría provocar cambios en la susceptibilidad a patógenos necrotróficos, se inocularon plantas con Botrytis cinerea. La enfermedad se evaluó entre 5 y 10 días después de la inoculación siguiendo el grado de necrosis y la muerte que aparecía en las hojas inoculadas. Como era de esperar, las plantas de tipo silvestre eran muy susceptibles a Botrytis, y todas las plantas inoculadas mostraron necrosis acompañada de una proliferación extensiva del micelio fúngico (figura 2F-G). Sin embargo, y en un marcado contraste, ninguna de las plantas ocp3 que se inocularon con los mismos hongos mostraron una necrosis extendida en las hojas inoculadas (figura 2F-G). Además, en plantas ocp3 se inhibió drásticamente la proliferación del micelio fúngico. Esto indica que la resistencia a este patógeno necrotrófico en el mutante ocp3 estaba espectacularmente potenciada, o la susceptibilidad bloqueada.

Para ensayar si la susceptibilidad alterada a las enfermedades de ocp3 es específica para Botrytis, se expusieron a las plantas a Plectosphaerella cucumerina, otro necrótrofo. La infección de las plantas de tipo silvestre con P. cucumerina también condujo a una fuerte degradación del tejido de la hoja, manifestado como lesiones extendidas y clorosis que aumenta en diámetro según progresa la infección a lo largo de la hoja inoculada (figura 2D). Al contrario, las plantas ocp3 mostraron un alto grado de resistencia a este patógeno fúngico, ya que se redujo drásticamente la necrosis visible y medible de las hojas inoculadas (figura 2D-E), y también se inhibió drásticamente la proliferación del micelio fúngico.

Basándose en estos resultados, puede concluirse que la susceptibilidad a hongos necrotróficos es un rasgo característico asociado con el locus OCP3, y la mutación identificada en este locus produce una mayor resistencia a los mismos patógenos. Esta consideración también concuerda con la observación de que PDF1.2, un gen marcador cuya expresión es inducible para la ruta de defensa de respuesta a ET/JA contra patógenos fúngicos necrotróficos (Turner et al., 2002), se expresa constitutivamente en plantas ocp3 (figura 1F).

La mayor resistencia de plantas ocp3 a hongos necrotróficos requiere ácido jasmónico (JA) pero no ácido salicílico (SA) o etileno (ET)

La expresión constitutiva en plantas ocp3 del gen GST6 inducible por H_{2}O_{2} y el PDF1.2 por JA, pero no del gen PR-1 inducible por SA, (figura 1F), sugiere una asociación entre el estrés oxidativo y la señalización con JA, que aparentemente es independiente de SA. En la compleja trama de interacciones que tienen lugar durante las respuestas de resistencia de las plantas, desde hace mucho tiempo se ha documentado una relación antagonista entre la ruta de SA y JA/ET (Kunkel y Brooks, 2002) e indica que en plantas ocp3, la activación constitutiva de la ruta que conduce a la expresión del gen PDF1.2 podría ser la negación de la expresión de genes dependientes de SA. Sin embargo, la aplicación exógena de SA promueve la expresión del gen marcador PR-1 tanto en plantas ocp3 como en plantas de tipo silvestre (figura 1F), indicando que las plantas ocp3 no están afectadas en la percepción de SA, y coincide con la observación de que la respuesta de resistencia a patógenos biotróficos también está intacta en este mutante (figura 2A-C). Además, la aplicación exógena de SA anula la expresión constitutiva de PDF1.2 que tiene lugar en plantas ocp3 (figura 1F). Este efecto antagonista de SA fue específico para la expresión de PDF1.2, ya que la expresión de GST6 no se reprimía en ocp3 tras el tratamiento con SA. En su lugar, SA promovió la activación de GSTI en plantas de tipo silvestre (figura 1F). Esta última observación refuerza la asociación existente entre SA y ROS como se ha documentado previamente por otros autores (Mur et al., 2000; Shirasu et al., 1997; Tierens et al., 2002), pero también indica que el estrés oxidativo que media la expresión de GSTI en plantas ocp3 y la expresión conjunta de PDF1.2 podría ser independiente de SA.

Para evaluar más directamente si SA pudiese contribuir al fenotipo de plantas ocp3 en relación con la resistencia observada a patógenos necrótrofos, cruzamos el transgen nahG en ocp3. nahG codifica una salicilato hidroxilasa que bloquea la ruta de SA por medio de la degradación de SA (Delaney, T.P., Uknes, S., Vernooij, S., Friedrich, L., Weymann, K., Negrotto, D., Gaffney, T., Gutrella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science, 266, 1247-1250).

Las plantas ocp3 nahG retenían la resistencia a las infecciones por B. cinerea (figura 3A-B) y P. cucumerina (figura 3C) a niveles similares a los de las plantas ocp3. De forma similar, cuando plantas pad4, que también están afectadas en la acumulación de SA después del ataque por patógenos (Zhou, N., Tootle, T.L., Tsui, F., Klessig, D.F., and Glazebrook, J. (1998). PAD4 functions upstream from salicylic acid to control defense responses in Arabidopsis. Plant Cell 10, 1021-1030.), se sometieron a introgresión en plantas ocp3, las plantas ocp3 pad4 resultantes permanecieron tan resistentes a B. cinerea (figura 3A-B) o a P. cucumerina (figura 3C) como las plantas ocp3.

Para ampliar adicionalmente estos estudios, se creó un mutante doble ocp3 npr1-1. El mutante npr1-1 se identificó originalmente por su insensibilidad a SA y actualmente se considera el regulador principal de las respuestas mediadas por SA (Durrant y Dong, 2004). Como se observa para plantas ocp3 nahG y ocp3 pad4, la resistencia de plantas ocp3 npr1-1 a hongos necrotróficos también se mantuvo invariable con respecto a la observada en plantas ocp3 (figura 3A-C). De esta manera, todos estos resultados indican que parece ser que SA no se requiere para mejorar la resistencia a patógenos necrotróficos atribuibles a la mutación ocp3.

Como alternativa a SA, se evaluó la importancia de JA en la contribución al fenotipo de plantas ocp3. Se ensayó si un defecto en la percepción de esta hormona puede afectar a la mejor resistencia observada de plantas ocp3 a hongos necrotróficos. El mutante coi1 de Arabidopsis es totalmente insensible a JA y se requiere la proteína COII para todas las respuestas dependientes de JA identificadas hasta ahora. COI1 codifica una proteína F-box implicada en la degradación mediada por ubiquitina de la señalización por JA por medio de la formación de complejos de ubiquitina ligasa de tipo E3 funcionales (Xie, D.X., Feys, B.F., James, S., Nieto-Rostro, M., and Turner, J.G. (1998). COI1: An Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility. Science 280, 1091-1094.; Devoto, A., Nieto-Rostro, M, Xie, D., Ellis, C., Harmston, R., Patrick, E., Davis, J., Sharratt, L., Coleman, M., and Turner, J.G. (2002). COI1 links jasmonate signalling and fertility to the SCF ubiquitin-ligase complex in Arabidopsis. Plant J. 32, 457-466). Además, las plantas coi1 no pueden expresar PDF1.2 y muestran una mayor sensibilidad a hongos necrotróficos (Thomma et al., 1998; Turner et al. 2002). Todo esto indica la importancia de JA en la resistencia de plantas a este tipo de patógenos, y justifica la introgresión de coi1 en ocp3 para generar plantas mutantes dobles ocp3 coi1 (figura 4). De manera importante, la mayor resistencia observada en plantas ocp3 a B. cinerea y P. cucumerina se anula cuando está presente la mutación coi1 (figura 4A-C). Las plantas ocp3 coi1 se comportan como plantas coi1, que están muy afectadas tras la infección con cualquier hongo, extendiéndose las lesiones necróticas a lo largo de las hojas inoculadas como se ejemplifica en la figura 4C para la respuesta a P. cucumerina.

Además, de coi1, se consideró el estudio de jin1, otro mutante insensible a JA (Berger, S., Bell, E., and Mullet, J.E. (1996). Two Methyl Jasmonate-Insensitive Mutants Show Altered Expression of AtVsp in Response to Methyl Jasmonate and Wounding. Plant Physiol. 111, 525-531.) en relación con el mutante ocp3. JIN1 es un factor de transcripción de tipo MYC del tipo bHLHzip que funciona de una manera dependiente de COI1 (Lorenzo et al., 2004). A diferencia de lo que ocurre con coi1 y a pesar del defecto en la señalización con JA, las plantas jin1 muestran una mayor resistencia a patógenos necrotróficos, indicando que JIN1 puede funcionar como represor de la resistencia a este tipo de patógenos. De manera interesante, las plantas mutantes dobles ocp3 jin1 se mantuvieron muy resistentes cuando se ensayaron contra la infección por B. cinerea (figura 4A) y a niveles comparables a los conseguidos por las plantas ocp3 o jin1. Es importante mencionar que la mutación ocp3 ni confiere sensibilidad a JA (de acuerdo con el ensayo de inhibición de crecimiento de las raíces en presencia de JA) ni es alélica a jin1. Esto indica que podría haber una cierta redundancia o solapamiento de funciones para los dos mutantes en consideración, para mejorar la resistencia a B. cinerea que finalmente se induce por JA y se controla por COI1.

También se ha demostrado que el etileno (ET) media ciertos aspectos de las respuestas de las plantas a patógenos (Berrocal-Lobo, M, Molina, A., and Solano, R. (2002). Constitutive expression of ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 in Arabidopsis confers resistance to several necrotrophic fungi. Plant J. 29, 23-32.; Thomma et al., 2001). Sin embargo, la señalización con ET también puede funcionar independientemente de JA, o incluso inhibir respuestas dependientes de JA (Ellis, C. and Turner, J.G. (2001). The Arabidopsis mutant cev1 has constitutively active jasmonate and ethylene signal pathways and enhanced resistance to pathogens. Plant Cell, 13, 1025-1033.; Thomma et al., 2001). Para ensayar la importancia de ET en la respuesta de resistencia mediada por la mutación ocp3, se cruzaron plantas ocp3 con el mutante ein2 insensible a ET (Alonso, J.M., Hirayama, T., Roman, G., Nourizadeh, S. and Ecker, J.R. (1999) EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284, 2148-2152) para generar el mutante doble ocp3 ein2. Como se observa en la figura 2B-C, la resistencia de plantas ocp3 ein2 a P. cucumerina se mantuvo invariable en comparación con la observada en plantas ocp3 (figura 4A-C), indicando de esta manera que para la resistencia observada mediada por ocp3, es dispensable la hormona vegetal ET.

Aislamiento de OCP3

Para determinar la naturaleza de la mutación, se realizó un retrocruzamiento entre plantas ocp3/ocp3 y plantas OCP3/OCP3 de tipo silvestre que contenían el transgen Ep5C-GUS y se analizó la descendencia. En las plantas F1 resultantes de este cruce, estaba ausente la expresión constitutiva de la actividad GUS en las 21 plántulas ensayadas, y en las plantas F2, la expresión estaba presente en 31 de 118 plántulas. La relación de segregación de F2 del fenotipo conferido por ocp3 fue 1:3 (expresadores constitutivos: no expresadores, \alpha^{2} = 1,48 (0,1 > P > 0,5)), indicando una sola mutación recesiva. El mutante ocp3 se sometió a retrocruzamiento con Lansberg erecta de tipo silvestre (Ler) para generar una población de mapeo de F2 y las plántulas recombinantes se identificaron por medio del uso de marcadores de polimorfismos de longitud en las secuencias simples (SSLP) (Bell, C.J., and Ecker, J.R. (1994). Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics 19, 137-144.). Se aisló ADN, inicialmente, a partir de 38 plantas homocigotas ocp3 y la segregación de los marcadores SSLP indicó que ocp3 mostraba una asociación al marcador Nga249 en el cromosoma 5, donde de los 76 alelos analizados todos fueron alelos Col-0 (0 erecta: 76 Col-0). Otro análisis de las plantas ocp3 seleccionadas con marcadores adicionales disponibles para el cromosoma 5 identificaron los marcadores SSLP Nga249 y ca72 como marcadores más próximos que flanqueaban la mutación ocp3 en cada lado (figura 5A). La selección de 1100 plantas elegidas aleatoriamente de una población de mapeo F2 Ler x ocp3 con los marcadores SSLP Nga249 y ca72 identificó 29 plantas que tenían una recombinación en el intervalo. Usando estas 29 plantas recombinantes, se vió que OCP3 estaba localizado a 4 cM de Nga249 y a 1,9 cM de ca72. Se diseñaron otros marcadores polimórficos para la región comprendida entre Nga249 y ca72 y la posición de OCP3 se estrechó hasta una región genómica que incluía el extremo del clon artificial bacteriano (BAC) T5KB y el comienzo del clon BAC F2I11. En la secuencia comentada comprendida dentro de estos dos clones BAC están presentes 19 genes (figura 5B). Se amplificó la región codificante entera de cada uno de estos genes en plantas ocp3 y se determinaron las secuencias de los productos de PCR. La secuencia correspondiente al gen At5g11270 se identificó como la única que mostraba una sola substitución de nucleótidos (de G a A en la cadena codificante (exón 3)) que producía una sola substitución de aminoácidos (de Ala a Thr) (figura 5C). No se encontró ninguna mutación en los dieciocho genes restantes. At5g11270 contiene dos intrones y codifica una proteína de 553 aminoácidos.

Para asignar inequívocamente At5g1270 como OCP3, se introdujo un fragmento de 3,2 Kb que contenía At5g11270 en ocp3 por transformación mediada por Agrobacterium. Se ensayaron tres líneas transgénicas con respecto a la expresión constitutiva de GUS y con respecto a la resistencia a B. cinerea y P. cucumerina. En todas ellas, la expresión constitutiva de GUS estaba anulada y se había recuperado la susceptibilidad normal a los patógenos fúngicos, demostrando que At5g11270 es OCP3 (la figura 5D-E resume el resultado de esta complementación para una de las líneas transgénicas generadas; línea 2AT).

La expresión de OCP3 se reprime parcialmente por infección fúngica

Se analizó la expresión de OCP3 en respuesta a la infección con un patógeno fúngico necrotrófico en plantas de tipo silvestre a diferentes intervalos de tiempo después de la infección. En ningún tejido analizado se pudieron detectar niveles de ARNm de OCP3 por análisis de transferencia de Northern, indicando que el gen OCP3 se transcribe a una velocidad muy baja. Para solucionar esta dificultad, se estudió la presencia de ARNm de OCP3 por RT-PCR. Estos análisis revelaron que OCP3 se expresa constitutivamente en tejido de hoja de plantas sanas. La figura 6 demuestra que después de la infección con P. cucumerina hay una reducción en el nivel de acumulación de los ARNm de OCP3, siendo más evidente a las 72 horas después de la infección. Conjuntamente con esta reducción, y correlacionado inversamente, el gen marcador inducible por JA y por hongos PDF1.2 está regulado positivamente tras la infección con P. cucumerina. En etapas posteriores de la infección, también tiene lugar una expresión inducida del gen PR1 relacionado con la defensa y es indicativo del deterioro de tejidos que se produce como resultado del hábito de crecimiento del hongo.

La regulación negativa de OCP3 tras la infección fúngica, su correlación inversa con la expresión inducida de PDF1.2 y la naturaleza recesiva de la mutación ocp3 favorece la interpretación de que OCP3 funciona como un represor de la respuesta de resistencia a patógenos fúngicos en plantas de tipo silvestre.

Procesamiento aberrante de ARNm de At5g11270 en el mutante ocp3

Para identificar la estructura del gen OCP3 y su alelo mutante ocp3, se amplificó un fragmento de 1,2 Kb por reacción en cadena de la polimerasa mediada por la transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de plantas de tipo silvestre y mutantes ocp3, usando cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia comentada del gen At5g11270. La secuenciación directa y la comparación de los productos de RT-PCR revelaron que el ADNc derivado de ocp3 lleva una deleción interna de 36 nucleótidos en lugar de la substitución esperada de un solo nucleótido, identificada en las secuencias genómicas (figura 7). Esta deleción corresponde a los primeros 36 nucleótidos del exón III. De esta manera, la transición de G a A identificada a nivel genómico en la cadena codificante del alelo de ocp3 (figura 5C) provoca una alteración en el procesamiento normal para el ARNm derivado de ocp3. Esta corta deleción provoca un desplazamiento de fase en el marco de lectura abierta de ocp3 que tiene como resultado la generación de un codón de terminación en fase que produce una proteína truncada de 210 restos aminoacídicos en lugar de los 354 restos de la proteína de tipo silvestre (véase más adelante, figura 8). Esta deleción se confirmó adicionalmente en diferentes plantas ocp3 por RT-PCR, usando una serie de cebadores internos, y diseñados a partir de la secuencia genómica (figura 7A). Se obtuvieron productos de longitudes esperadas en todas las reacciones, excepto cuando se usaba el cebador interno a la secuencia delecionada, que no tuvo como resultado ningún producto de RT-PCR en muestras derivadas de plantas ocp3 (figura 7B). De esta manera, la falta de función atribuida genéticamente a la mutación ocp3 recesiva, no se debe a un cambio de aminoácido debido a la única substitución de nucleótidos observada en la secuencia genómica; en su lugar, reside en un procesamiento anormal del ARNm transcrito a partir de la versión mutada de ocp3, que tras la traducción produce una proteína truncada que carece de 144 residuos aminoacídicos de la parte C-terminal (figura
7 y 8).

OCP3 codifica un factor de transcripción homeobox

La secuenciación del ADN demostró que el ADNc de OCP3 codifica una proteína de 354 restos aminoacídicos (figura 8A) de 39111 D y un pI de 4,53. OCP3 contiene diferentes características destacables. Cerca del extremo C-terminal se identifica un dominio de 60 aminoácidos (posición 284 a 344) que se parece al de un homeodominio (HD) codificado por genes homeobox de diversos organismos (Gehring, W.J., Affolter, M. and Bürglin, T. (1994). Homeodomain proteins. Annu Rev Biochem, 63, 487-526.). El homeodominio de OCP3 comparte la mayor parte de los aminoácidos muy conservados que constituyen la firma característica del módulo HD de 60 aminoácidos. La conservación de estos restos críticos (por ejemplo, L-16, Y-20 en lugar de F-20, I/L-34, I1L/M-40, W-48, F-49 y R-53) se identifica fácilmente en comparación con diferentes proteínas que contienen homeodominios de Arabidopsis que pertenecen a diferentes subgrupos de proteínas (figura 8C). La inspección de la secuencia de aminoácidos de OCP3 también reveló la presencia de dos señales de localización nuclear (NLS) bipartitas canónicas (Dingwall, C., and Laskey, R.A. (1991). Nuclear targeting sequencesa consensus? Trends Biochem. Sci. 16, 478-481.; Nigg, E.A. (1997). Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanism and regulation. Nature 386: 779-787.), RK-(X)_{10}-KKNKKK en las posiciones 64-81, y KK-(X)10-RRSKR en las posiciones 294-310, estando ésta última escondida dentro del homeodominio (figura 8A). Estas características podrían estar mediando una dirección de la proteína al núcleo. Otra característica destacable de OCP3 es la presencia de una región extendida rica en restos ácidos (posiciones 84-181), una característica común a varios activadores de la transcripción (Cress, W. D., and S. J. Triezenberg. 1991. Critical structural elements of the VP16 transcriptional activation domain. Science 251:87-90.). La última característica identificable dentro de OCP3 es la presencia del motivo LxxLL canónico en las posiciones 101-105 (figura 8A). Este motivo es una secuencia característica que facilita la interacción de diferentes co-activadores de la transcripción a receptores nucleares y, de esta manera, es una característica de definición identificada en varias proteínas nucleares (Heery, D.M., E, Kalkhoven, S. Hoare, and M.G. Parker. 1997. A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors. Nature 387: 733-736). Todos estos motivos estructurales, indican firmemente que OCP3 es una proteína nuclear implicada en la regulación de la transcripción en Arabidopsis. De acuerdo con un esquema de clasificación general para genes homeobox (http://www.homeobox.cjb.net/) OCP3 es único ya que se distingue de las clases principales de proteínas que contienen homeodominios encontradas en plantas, incluyendo KNOX o HD-ZIP. Además, OCP3 está presente como un gen de una sola copia en el genoma de Arabidopsis. Las búsquedas de secuencias en las bases de datos reveló una identidad extensiva de OCP3 con otras seis proteínas - de tomate (número de acceso del GenBank AW223899, identidad del 48,9%), patata (número de acceso del GenBank BQ112211, identidad del 48,3%), uvas (número de acceso del GenBank CD003732, identidad del 51,5%), arroz (número de acceso del GenBank AY224485, identidad del 49,5%), trigo (número de acceso del GenBank CK205563, identidad del 49,4%) y maíz (número de acceso del GenBank BG840814, identidad del 51,3%) - que, según se vio, tenían un alto grado de similitud de secuencia con OCP3 y con la conservación de los principales motivos estructurales mostrados anteriormente. Esto indica que la función de este tipo de regulador de la transcripción ha estado muy conservada en plantas a lo largo de la evolución.

Los datos presentados en la presente invención proporcionan evidencias de un papel de OCP3 en la regulación de resistencia a microorganismos patógenos necrotróficos. Una mutación recesiva en el gen OCP3 tuvo como resultado una mayor resistencia de plantas ocp3 a los patógenos fúngicos Botrytis cinerea y Plectosphaerella cucumerina, mientras que la resistencia a la infección por el oomicete Peronospora parasitica o la bacteria Pseudomonas syringae DC3000 se mantuvo invariable en las mismas plantas. De manera interesante, el gen OCP3 se expresa a niveles muy bajos en plantas sanas y esta expresión constitutiva se reprime parcialmente durante el curso de la infección con un necrótrofo fúngico. Además, el fenotipo de resistencia conferido por la mutación ocp3 se bloquea cuando se ensaya en el mutante coi1 como organismo base, reteniendo las plantas dobles mutantes ocp3 coi1 la mayor sensibilidad a los necrótrofos atribuible a coi1. Esto implica que OCP3 participa en la respuesta de defensa regulada por JA. De hecho, la mutación ocp3 recesiva confiere expresión constitutiva del gen PDF1.2, que codifica una proteína de defensa con un papel definido en la respuesta de defensa de las plantas mediada por JA (Thomma et al., 1998). Como la expresión de PDF1.2 es completamente dependiente de COI1 (Turner et al., 2002) y está en plantas mutantes ocp3 sanas, se refuerza la consideración de que OCP3 esté funcionando de una manera dependiente de COI1 actuando como regulador negativo de la respuesta de defensa mediada por JA a patógenos necrotróficos. Otra característica importante de ocp3 es la mayor acumulación de H_{2}O_{2} que se observa que se produce en condiciones de reposo en las hojas de plantas ocp3, que va seguida de la expresión constitutiva del gen marcador inducible por H_{2}O_{2} GST1 (Levine et al., 1994; Alvarez et al., 1998) pero sin síntomas indicativos de muerte celular. El H_{2}O_{2} y otras moléculas ROI normalmente se producen en altos niveles durante la infección tanto por patógenos biotróficos como por patógenos necrotróficos y se han implicado como señales reguladoras para la respuesta de resistencia basal a estos patógenos (Mengiste, T., Chen, X., Salmeron, J. M., and Dietrich, R.A. (2003). The BOS1 gene encodes an R2R3MYB transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis. Plant Cell 15, 2551-2565; Tiedemann, A.V. (1997). Evidence for a primary role of active oxygen species in induction of host cell death during infection of bean leaves with Botrytis cinerea. Physiol. Mol. Plant Pathol. 50, 151-166). Sin embargo, de los patógenos ensayados en plantas ocp3, sólo se observó un aumento de la resistencia hacia patógenos necrotróficos, mientras que la resistencia a patógenos biotróficos permaneció intacta. Esta diferencia significativa indica que la mutación ocp3 puede afectar a funciones específicas relacionadas con ROI por medio de la regulación de ciertas moléculas efectoras dirigidas hacia la sensibilización e identificación de un necrótrofo. De manera interesante, se ha demostrado que SA y H_{2}O_{2} forman un circuito que es un bucle de retroalimentación durante el curso de una interacción planta-patógeno (Shirasu et al., 1997; Draper, J. (1997). Salicylate, superoxide synthesis and cell suicide in plant defence. Trends Plant Sci. 2, 162-165.), y hay indicios que sugieren que SA puede ser necesario para una respuesta local a un necrótrofo tal como Botrytis en el punto de infección (Govrin, E.M., and Levine, A. (2000). The hypersensitive response facilitates plant infection by the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. Curr. Biol. 10, 751-757; Ferrari, S., Plotnikova, J.M., De Lorenzo, G., and Ausubel, F. M. (2003). Arabidopsis local resistance to Botrytis cinerea involves salicylic acid and camalexin and requires EDS4 and PAD2, but not SID2, EDS5 or PAD4. Plant J. 35, 193-205).

Sin embargo, la síntesis y acumulación de SA ni se aumenta ni se reprime en plantas ocp3. Además, el análisis de plantas mutantes dobles para ocp3 y reguladores clave de la acumulación y percepción de SA, tales como los mutantes dobles ocp3 pad4, ocp3 nahG u ocp3 npr1 generados en la presente invención, indica que SA no se requiere para la resistencia a necrótrofos mediada por ocp3. Además, la hormona vegetal etileno (ET) no parece ser necesaria para conseguir la mayor resistencia de ocp3. Aquí, la falta de percepción de esta hormona, como se estudió con las plantas mutantes dobles ocp3 ein2, no reprime ni reduce la resistencia característica de las plantas ocp3 a P. cucumerina. Como JA y ET pueden funcionar en asociación o independientemente para la activación de rutas de señalización especificas (Thomma et al., 2001, Ellis y Turner, 2001), la resistencia independiente de ET de ocp3 indica que OCP3 regula una ramificación específica de la ruta de JA. Además, esta ramificación parece ser independiente de la otra que se ha propuesto que se controla por el factor de transcripción JIN1 regulado por JA (Lorenzo et al., 2004), ya que no se encontró epistasis entre ocp3 y jin1 al menos cuando se ensayó la resistencia a B. cinerea. De esta manera, todas estas observaciones confirman el importante papel de OCP3 en la regulación específica de una resistencia dependiente de COI1 a patógenos necrotróficos. OCP3 es un miembro de la familia de genes homeobox. Las proteínas homeobox son ubicuas en organismos superiores y representan cambios maestros de control implicados en procesos de desarrollo y en la adaptación celular a cambios en el medio. Funcionan como reguladores de la transcripción que se caracterizan por la presencia de un homeodominio (HD) conservado evolutivamente responsable de la unión específica al ADN (Gehring et al., 1994). En las plantas, se han identificado dos clases principales de genes que codifican HD: la clase de HD representada por KNOTTED I (Vollbrecht, E., Veit, S., Sinha, N. and Hake, S. (1991). The developmental gene Knotted-1 is a member of a maize homeobox gene family. Nature 350, 241-243), y la familia de proteínas HD-Zip (Schena, M., and Davis, R. W. (1992). HD-Zip proteins: members of an Arabidopsis homeodomain superfamily. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 3894-3898). La última está caracterizada por un motivo de cremallera de leucina adicional, adyacente al HD que facilita la homo y heterodimerización de los reguladores de la transcripción. La caracterización funcional de algunos miembros de la familia homeobox, confirma un papel para algunos de ellos como reguladores clave de la señalización con hormonas (Himmelbach, A., Hoffmann, T, Laube, M., Hohener. B., and Grill, E. (2002). Homeodomain protein ATHB6 is a target of the protein phosphatase ABI1 and regulates hormone responses in Arabidopsis. EMBO J 21: 3029-3038.), en respuestas de adaptación a parámetros ambientales (Steindler, C., Matteucci, A., Sessa, G., Weimar, T., Ohgishi, M., Aoyama, T., Morelli, G. and Ruberti, I. (1999). Shade avoidance responses are mediated by the ATHB-2 HD-Zip protein, a negative regulator of gene expression. Development, 126, 4235-4245.; Zhu, J., Shi, H., Lee, B-h., Damsz, B., Cheng, S., Stirm, V., Zhu J-K, Hasegawa, P., Bressan, R.A. (2004). An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 9873-9878), y en procesos de señalización derivados de patógenos (Magda, E., Tornero., P., Conejero, V., and Vera, P. (1999). A tomato homeobox gene (HD-Zip) is involved in limiting the spread of programmed cell death. Plant J. 20, 591-600.).

La mutación puntual identificada en ocp3 tiene como resultado un procesamiento anormal del transcrito correspondiente que provoca una deleción interna donde los primeros 36 nucleótidos del exón III ya no están presentes en el ARNm de ocp3 maduro. Esta corta deleción provoca un desplazamiento de fase en la ORF de ocp3 que tiene como resultado la generación de un codón de terminación prematuro. De esta manera, esta mutación produce una proteína ocp3 truncada que consta de 210 restos aminoacídicos en lugar de los 354 restos aminoacídicos característicos de OCP3. El dominio de 60 aminoácidos previsto correspondiente al homeodominio (HD) está localizado dentro del dominio C-terminal de 144 aminoácidos que falta en ocp3. Como este dominio es determinante para que las proteínas homeobox funcionen como reguladores de la transcripción, ya que es el sitio donde se establece el contacto con el ADN, principalmente a través de la hélice 3 del dominio HD, que se dirige al surco principal de la hélice de ADN presente en la región promotora de genes cadena abajo (Gehring et al. 1994), es concebible que la proteína ocp3 mutada ya no funcione como un regulador de la transcripción. Por tanto, OCP3 funciona como un factor de transcripción específico de la ruta de transducción de señales de células vegetales dependiente de COI1 y mediada por JA y modula la transcripción de genes importantes para la respuesta o respuestas de defensa a patógenos necrotróficos.

La identificación de genes diana de OCP3 y la interacción con moléculas de proteínas asociadas es nuestro reto para el futuro. Además, la posible interacción de OCP3 con otros reguladores de la transcripción implicados en la respuesta de defensa a patógenos necrotróficos tales como la proteína JIN1 relacionada con MYC (Lorenzo et al., 2004), la proteína ERFI de tipo AP2 (Lorenzo, O., Piqueras, R., Sanchez-Serrano, J.J., and Solano, R. (2003). ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 15, 165-178.), la proteína BOS1 relacionada con MYB (Mengiste et al., 2003) o el factor de transcripción WRKY70 (Li et al., 2004), y cómo funcionan de una manera coordinada para regular la transcripción es otro reto interesante para el futuro. Todas estas estrategias deben ayudar a entender el mecanismo regulador de la función de OCP3 y cómo se puede explotar esta función para generar plantas más resistentes a patógenos fúngicos sin afectar a las respuestas de defensa frente a otros tipos de patógenos. Manipulando genéticamente el gen OCP3 mediante mecanismos de genética reversa en plantas transgénicas que repriman o alteren la expresión génica de OCP3, o bien alteren su funcionalidad como factor de transcripción, permitirá explotar agronómicamente la función de OCP3 en la regulación de la respuesta defensiva de las plantas frente a dichas agresiones patogénicas.

Descripción de las figuras

Figura 1

Caracterización de plantas ocp3 y comparación con plantas de tipo silvestre

(A) Una comparación del aspecto externo de plantas ocp3 (a la derecha) y las plantas de tipo silvestre parentales (wt) (a la izquierda). Las plantas se fotografiaron a las 3,5 semanas de edad.

(B) Tinción histoquímica de actividad GUS dirigida por el promotor de Ep5C en una plántula transgénica de tipo silvestre de 10 días (a la izquierda) y plántulas ocp3 (a la derecha) cultivadas en medio de agar MS. La flecha indica una zona de tejido discreta en la unión del hipocotilo y la raíz donde se observa actividad GUS en las plántulas de tipo silvestre.

(C) Hojas en roseta totalmente expandidas de plantas transgénicas de tipo silvestre (a la izquierda) y de plantas ocp3 (a la derecha) teñidas para determinar la actividad GUS.

(D) Producción de H_{2}O_{2} en plantas de tipo silvestre (a la izquierda) y plantas ocp3 (a la derecha). La producción de H_{2}O_{2} se ensayó usando 3,3'-diaminobencidina. La coloración pardo-rojiza indica la polimerización de 3,3'-diaminobencidina en el sitio de producción de H_{2}O_{2}.

(E) Tinción de tejido de hoja de plantas de tipo silvestre (a la izquierda) y plantas ocp3 (a la derecha) con azul trípano en la búsqueda de signos de muerte celular. La ausencia de colapso celular se revela por la falta de manchas de color azul intenso después de la tinción con azul trípano.

(F) Expresión de genes marcadores PR-1, PDF1.2 y GST1 en plantas de tipo silvestre y ocp3 36 horas después de que las plantas se pulverizaran con (+SA) o sin (-SA) una solución tampón que contenía ácido salicílico (SA) 0,3 mM.

Figura 2

Resistencia de plantas ocp3 a patógenos necrotróficos pero no a patógenos biotróficos

(A) Respuesta de resistencia de plantas Arabidopsis de tipo silvestre y mutantes ocp3 a Peronospora parasitica virulento. Siete días después de la inoculación por pulverización de plantas de 2 semanas de edad con 10^{5} conidiosporas por mililitro de Peronospora, las hojas se tiñeron con lactofenol-azul trípano y se visualizaron con un microscopio para revelar el crecimiento extensivo característico de las hifas y las conidiosporas.

(B) Para cuantificar la resistencia a P. parasitica, la producción de conidiosporas se cuantificó siete días después de la inoculación con la ayuda de un hemocitómetro. Las plantas que llevaban la mutación ocp3 fueron tan resistentes a este patógeno como las plantas de tipo silvestre.

(C) Crecimiento de Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 en plantas de tipo silvestre y ocp3. En plantas de 4 semanas de edad se infiltró una suspensión bacteriana, y se determinó la titulación bacteriana, medida como c.f.u. por peso fresco, a los 0, 3 y 5 días después de la infección en plantas de tipo silvestre (líneas continuas) y ocp3 (líneas discontinuas). Las barras de error representan los límites de confianza del 95% de los datos transformados en logaritmos. Se tomaron 8 muestras para cada genotipo en cada punto de tiempo. El experimento se repitió 3 veces obteniéndose resultados similares.

(D) Hojas representativas de plantas de tipo silvestre y ocp3 4 días después de la inoculación con una gota de 6 \mul de una suspensión de esporas (5 x 10^{6} esporas/ml) de P. cucumerina.

(E) Los síntomas de la enfermedad medidos como el tamaño de la lesión se evaluaron 6 días después de la inoculación con P. cucumerina determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión \pm SE de las medidas.

(F) Hojas representativas de plantas de tipo silvestre y ocp3 4 días después de la inoculación con una gota de 6 \mul de esporas de Botrytis cinerea (2,5 x 10^{4} conidios/ml).

(G) El tamaño de la lesión generada por Botrytis cinerea se midió 6 días después de la inoculación. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión \pm SE de las medidas para un mínimo de 30 lesiones.

Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares. wt, tipo silvestre.

Figura 3

Efecto de mutaciones relacionadas con SA sobre la respuesta de resistencia a enfermedades de plantas ocp3

(A) Respuesta de resistencia de mutantes dobles ocp3 nahG, ocp3 npr1 y ocp3 pad4 a Botrytis cinerea en comparación con la de genotipos mutantes simples y plantas de tipo silvestre. Las plantas se inocularon y los síntomas de la enfermedad se evaluaron como se describe en la figura 2 determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.

(B) Hojas representativas de cada genotipo que muestran síntomas de la enfermedad observadas 5 días después de la inoculación con una gota de 6 \mul de esporas de Botrytis cinerea (2,5 x 10^{4} conidios/ml).

(C) Respuesta de resistencia de mutantes dobles ocp3 nahG, ocp3 npr1 y ocp3 pad4 a Plectosphaerella cucumerina en comparación con la de genotipos mutantes simples y plantas de tipo silvestre. Las mediciones de la lesión se realizaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión \pm SE de las medidas.

Figura 4

Efecto de mutaciones relacionadas con JA y ET sobre la respuesta de resistencia a enfermedades de plantas ocp3

(A) Respuesta de resistencia de mutantes dobles ocp3 coi1 y ocp3 jin1 a Botrytis cinerea en comparación con la de genotipos mutantes simples y plantas de tipo silvestre. Las plantas se inocularon y los síntomas de la enfermedad se evaluaron como se describe en la figura 2 determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.

(B) Respuesta de resistencia de mutantes dobles ocp3 coi1 y ocp3 jin1 a Plectosphaerella cucumerina en comparación con la de genotipos mutantes simples y plantas de tipo silvestre. Los síntomas de la enfermedad se evaluaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas.

(C) Hojas representativas de cada genotipo que muestran síntomas de la enfermedad observadas 7 días después de la inoculación con una gota de 6 \mul de esporas de P. cucumerina (5 x 10^{6} esporas/ml).

Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión \pm SE de las medidas.

Figura 5

Clonación posicional de ocp3 y complementación inversa

(A) Región de 0,6 Mb en la parte superior del cromosoma 5 con BAC solapantes flanqueados por los marcadores SSLP Nga249 y ca72 usados para la selección de recombinaciones en 2200 cromosomas.

(B) Localización de OCP3 en el clon BAC secuenciado F2111. OCP3 se colocó entre dos marcadores SSLP que comprendían una región de 67,2 Kb de BAC F2111. Los 19 genes mencionados incluidos en esta región están indicados.

(C) Estructura de exones/intrones de OCP3. Las regiones codificantes están indicadas con líneas gruesas. El inserto presenta el cambio de nucleótidos y su influencia sobre la secuencia de la proteína. El alelo mutante está indicado debajo de la secuencia del tipo silvestre. Las letras minúsculas marcan secuencias de nucleótidos al principio del exón 3. La transición de G a A debida al mutágeno está indicada en mayúsculas y en negrita. Las secuencias de aminoácidos deducidas están indicadas en el código de una sola letra con mayúsculas debajo de cada triplete de nucleótidos y las letras en negrita marcan los cambios de aminoácidos (de Ala a Thr) en las secuencias de las proteínas.

(D) Respuesta de resistencia de plantas ocp3 transgénicas (línea 2AT) transformadas de manera estable con una secuencia de ADN genómico de 3,2 Kb que incluye el gen At5g11270 entero y comparación con la respuesta de resistencia observada en las plantas de tipo silvestre y en el mutante ocp3. Las plantas se inocularon como se describe en la figura 2 con B. cinerea (a la derecha) y P. cucumerina (a la izquierda) y los síntomas de la enfermedad se evaluaron determinando los diámetros medios de la lesión en 3 hojas de 8 plantas. Los puntos de datos representan el tamaño medio de la lesión \pm SE de las medidas.

(E) Tinción histoquímica de la actividad GUS dirigida por el promotor de Ep5C en hojas en roseta totalmente expandidas obtenidas a partir de plantas ocp3 (a la izquierda) y de plantas ocp3 transgénicas transformadas con el gen At5g11270 (línea 2AT) (a la derecha).

Figura 6

Expresión de OCP3 y genes marcadores de respuesta de defensa después de la infección con P. cucumerina

Análisis de RT-PCR de la expresión de OCP3, PDF1-2 y PR-1 en tejidos de hoja infectados con P. cucumerina. Se inocularon plantas de tipo silvestre por pulverización con una suspensión de 10^{5} esporas/ml, y el tejido se congeló para la extracción del ARN. Los números indican horas después de la inoculación. Los geles de la parte inferior muestran RT-PCR para el gen interno elF4\alpha usado como control de carga. El experimento se repitió dos veces obteniéndose resultados similares.

Figura 7

Análisis de ADNc de OCP3 y de ocp3

(A) Diagrama de estructura de exones/intrones de OCP3. Los exones se indican con líneas gruesas. En el inserto se indica la secuencia de nucleótidos en la unión de empalme en el exón 3. Las letras minúsculas marcan secuencias de intrones, las letras mayúsculas indican secuencias de exones, las letras mayúsculas en negrita indican aminoácidos y las flechas indican la substitución de nucleótidos y de aminoácidos correspondiente. Las flechas en la parte superior del gen esquematizado indican la diferente posición de los cebadores usados en los experimentos de RT-PCR.

PfullD1 está localizado al principio del exón 1; pfullR1 está localizado el final del exón 4; pD1 al final del exón 2; pD2 al principio del exón 3 y pR1 en medio del exón 3. D indica la orientación directa (de 5' a 3') mientras que R denota la orientación inversa (de 3' a 5').

(B) Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT-PCR obtenidos cuando se usa ARNm de plantas de tipo silvestre (wt) y ocp3 y diferente combinación de cebadores. Obsérvese la reducción del peso molecular y, de esta manera, la migración más rápida de la banda amplificada procedente de plantas ocp3 con cebadores pD1+pR1 en comparación con la obtenida de plantas de tipo silvestre. Obsérvese también la ausencia del producto de ADN amplificado cuando se usan cebadores pD2+pR1 y ARNm transcrito con transcriptasa inversa procedente de plantas ocp3, pero no de plantas de tipo silvestre. La ausencia de producto amplificado indica una falta de reconocimiento por uno de los dos cebadores en la plantilla de ADNc generada a partir de plantas ocp3. El experimento se repitió varias veces con ARNm derivado de 4 plantas de tipo silvestre y ocp3 diferentes.

(C) Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos derivada de clones de ADNc derivados de ARNm aislado a partir de plantas de tipo silvestre (OCP3) y mutantes (ocp3). Los productos transcritos de forma inversa se amplificaron con cebadores pfullD1 y pfullR1 y se secuenciaron completamente las dos cadenas. Obsérvese la deleción interna de 36 nucleótidos en todos los ADNc de ocp3 secuenciados. Esta subrayada la secuencia de nucleótidos común a los ADNc derivados de ocp3 y OCP3. La deleción interna en los ADNc de ocp3 influye sobre la secuencia de aminoácidos derivada y provoca un desplazamiento de fase que genera un codón de terminación prematuro en la proteína ocp3. Las letras mayúsculas en negrita marcan aminoácidos y los asteriscos indican un codón de terminación. La flecha indica la presencia y posición del nucleótido (G) en el ADNc de OCP3 que si se muta produce el fenotipo ocp3. Los resultados se reprodujeron varias veces con ARNm derivado de diferentes plantas de tipo silvestre y ocp3 y en diferentes fases de crecimiento.

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Figura 8

Proteína OCP3 y comparación con otras proteínas que contienen homeodominios de Arabidopsis

(A) Secuencia de aminoácidos prevista de OCP3. El homeodominio se muestra en negrita. Las dos señales de identificación conservadas para la localización nuclear están subrayadas. El dominio ácido se muestra en cursiva y el dominio que interacciona con la proteína nuclear (LxxLL), incluido dentro de esta región ácida, se muestra subrayado.

(B) Estructura proteica prevista de OCP3. Se indica la posición relativa de señales de localización nuclear (NLS), del dominio de interacción con la proteína nuclear (LxxLL), del dominio ácido y del homeodominio (HD).

(C) Alineación de secuencias que muestra la secuencia de aminoácidos C-terminal de OCP3 con el homeodominio de diferentes genes homeobox de Arabidopsis incluyendo miembros de la familia KN y HD-Zip. El asterisco encima de las alineaciones corresponde a posiciones de aminoácidos en el HD que están muy conservadas en todos los organismos y define la señal de identificación del homeodominio. El sombreado negro indica aminoácidos conservados en todas las entradas, y el sombreado gris indica aminoácidos con características fisicoquímicas muy similares.

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Exposición detallada de un modo de realización Plantas, condiciones de crecimiento y tratamientos

Se cultivaron plantas Arabidopsis thaliana en substrato o en placas que contenían medio de Murashige y Skoog (MS) como se ha descrito previamente (Mayda et al., 2000). El mutante ocp3 se aisló en una investigación de expresadores constitutivos del gen indicador Ep5C-GUS en plantas transgénicas Columbia (Col-0) mutagenizadas con metanosulfonato de etilo (EMS), como se ha descrito previamente para otro mutante (Mayda et al., 2000). La línea mutante ocp3 usada en estos experimentos se sometió tres veces a retrocruzamiento con la línea parental de tipo silvestre. Se cultivaron las plantas en una cámara de crecimiento a 20-22ºC, humedad relativa del 85%, y 100 \muEm^{-2} seg^{-1} de iluminación fluorescente, en un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Para todos los experimentos se usaron hojas completamente expandidas de plantas de cuatro semanas de edad (a menos que se indique otra cosa). Se realizó la tinción para determinar la presencia de H_{2}O_{2} a través del método de captación de 3,3'-diaminobencidina (DAB), tal y como se ha descrito anteriormente (Thordal-Christensen et al., 1997). Se realizó la tinción para determinar la presencia de actividad GUS como se ha descrito previamente (Mayda et al., 2000).

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Infección con patógenos

Se cultivó Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (P.s. tomato DC3000) y se preparó para la inoculación como se ha descrito previamente (Mayda et al. 2000). Se determinó la densidad de las poblaciones de bacterias cultivando diluciones en serie en medio B de King suplementado con rifampicina (50 \mug/ml) a 28ºC y contando las unidades formadoras de colonias. Se presentaron los datos como medias y desviaciones típicas del logaritmo (cfu/cm^{2}) de al menos seis réplicas. Para los experimentos de resistencia a Peronospora parasitica, se pulverizaron plantas de tres semanas de edad con una suspensión de conidios de P. parasitica (10^{5} conidiosporas ml^{-1} de agua corriente) como se ha descrito previamente (Mayda et al., 2000). Se evaluó en el séptimo día, la densidad de las esporas en las plántulas (siete macetas por tratamiento, cada maceta tratada por separado) usando un hemocitómetro. Como alternativa, se tiñeron las muestras de hoja con lactofenol-azul tripano en diferentes días tras la inoculación y se examinaron con el microscopio como se ha descrito anteriormente (Mayda et al., 2000). Para la resistencia a Plectosporium y Botrytis, se trasplantaron plántulas de tres semanas a macetas individuales y se cultivaron a 22ºC durante el día/18ºC durante la noche, con doce horas de luz por 24 horas. Cuando las plantas tenían seis semanas, se inocularon aplicando gotas de 6 ml de suspensión de esporas de Plectosphaerella cucumerina (5 x 10^{6} esporas ml^{-1}) o Botrytis cinerea (2,5 x 10^{4} conidios ml^{-1}) a 3 hojas completamente expandidas por planta. Se aisló P. cucumerina a partir de Arabidopsis infectada de manera natural (acceso Landsberg erecta) y se cultivó en agar de patata-dextrosa de 19,5 g/l (Difco, Detroit) a temperatura ambiente durante 2 semanas antes de recoger las esporas y de suspenderlas en MgSO_{4} 10 mM. B. cinerea (cepa BMM1, aislada a partir de Pelargonium zonale) se cultivó en agar de patata-dextrosa de 19,5 g/l (Difco, Detroit) a 20ºC durante 10 días. Se recogieron los conidios y se suspendieron en PDS estéril (12 g l^{-1}, Difco). Las plantas se mantuvieron con una humedad relativa del 100% y los síntomas de la enfermedad se evaluaron de 4 a 10 días después de la inoculación determinando el diámetro medio de la lesión en 3 hojas de 5 plantas.

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Análisis genético

Se realizaron cruces emasculando capullos no abiertos y usando los pistilos como receptores de polen. Se realizaron retrocruzamientos con la línea transgénica parental usando plantas Ep5C-GUS como donantes de polen. También se realizaron los cruces recíprocos. Se cultivaron plantas F1 y F2 en placas MS y se ensayaron con respecto a la actividad GUS. La segregación del fenotipo en la generación F2 se analizó con un ensayo chi-cuadrado para comprobar la calidad del ajuste.

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Mapeo basado en PCR

Una planta ocp3 (en Columbia como base) se cruzó con Landsberg erecta y se usó para el mapeo la descendencia que segregaba mutantes homocigotos ocp3 tras la autofecundación. Se seleccionaron plántulas de la población F2 para la extracción del ADN y las plántulas recombinantes se identificaron usando marcadores de polimorfismos de longitud en las secuencias simples (SSLP) por el protocolo descrito por Bell y Ecker (1994) y con nuevos marcadores como se indica en el sitio web de la base de datos de Arabidopsis (http://genome-www.stanford.edu).

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Generación de Mutantes Dobles

Los alelos mutantes usados a lo largo de esta invención fueron npr1-1 (Cao et al., 1997), pad4-1 (Zhou et al., 1998), coi1-1 (Xie et al., 1998), ein2-5 (Alonso et al., 1999) y jin1-1 (Lorenzo et al., 2004). Se han descrito las plantas transgénicas (en el ecotipo Columbia) que expresaban el gen nahG bacteriano (Reuber et al. 1998). Los mutantes dobles ocp3 npr1, ocp3 pad4, ocp3 coi1, ocp3 ein2, ocp3 jin1 y ocp3 nahG se generaron usando ocp3 como receptor del polen. La homocigosidad de los loci se confirmó usando marcadores moleculares para cada uno de los alelos en poblaciones de segregación. Todos los mutantes dobles se confirmaron en la generación F3, excepto las plantas ocp3 coi1 que fueron estériles y no pudieron propagarse en heterocigosidad para coi1. Para el mutante doble que contenía ein2-5, las semillas F2 se cultivaron en placas con MS que contenían ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico (ACC) 20 \muM y se pusieron en una cámara de crecimiento. Después de tres días en la oscuridad, las plántulas se evaluaron con respecto a la presencia o ausencia de la respuesta triple inducida por etileno (ET) (Guzman y Ecker 1990). El mutante ein2, que era insensible a ET, no presenta la respuesta triple. Se recogieron plantas F2 que carecían de la respuesta triple y se transfirieron al substrato para evaluar la homocigosidad para ocp3.

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Clonación de ADN genómico y ADNc

La secuencia genómica se usó como base para la clonación de ADNc y clones genómicos. Se aisló ARN poli(A^{\text{*}}) a partir de diferentes plantas de tipo silvestre y ocp3 y se transcribió con transcriptasa inversa usando cebadores oligo (dT) como se ha descrito (Mayda et al., 1999). Éstos se usaron como plantillas para amplificar ADNc de OCP3 y de ocp3 usando diferentes combinaciones de los cebadores con especificidad de gen con sentido y antisentido:

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1

Complementación Inversa

Se amplificó la región genómica de OCP3 por PCR usando cebadores con especificidad de gen diseñados para incluir la región de 1,5 Kb cadena arriba del codón de iniciación y una parte de la región 3' que sigue al codón de terminación. Las secuencias de los cebadores genómicos de avance e inverso de OCP3 usados fueron:

2

Se obtuvo un fragmento genómico de 3,2 Kb que contenía el gen At5g11270 de tipo silvestre por PCR usando cebadores y se clonó en pCAMBIA1300 para producir el clon pCAMBIAOCP3 que se transfirió a Agrobacterium y se usó para transformar plantas ocp3 por el método de inmersión floral (Bechtold, N., Ellis, J. And Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci. 316, 1194-1199).

Análisis de Expresión

Para analizar el nivel de expresión génica por PCR mediada por transcriptasa inversa, se prepararon muestras de ARN total a partir de tejidos de hoja usando el kit Totally RNA de Ambion (Austin TX). La transcripción inversa se realizó usando el kit de RT para PCR de Clontech (Palo Alto, CA).

La serie de cebadores oligonucleotídicos (50 pmol cada uno) usadas para amplificar OCP3 fueron: OCP3PCRI(5'-GCTTAAAAGACTGGCTTATGCATTG-3')/OCP3PCR2 (5'-GCTTTGGAGCGGGTCACGAAG-3').

Los cebadores usados para amplificar PDF1.2 fueron PDF1.2PCR1 (5'-ATGGCTAAGTTTGCTTCCAT-3')/
PDF1.2PCR2(5'-ACATGGGACGTAACAGATAC-3').

Los cebadores usados para amplificar PR1 fueron PR1PCR1 (5'-ATGAATTTTACTGGCTATTC-3')/PR1PCR2 (5'-AACCCACATGTTCACGGCGGA-3').

<110> Universidad Politécnica de Valencia

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<120> Gen OCP3

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<130> P-INCI-N-05-0039

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<160> 1

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 354

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 1

3

4

Claims (1)

1. Utilización del gen OCP3 en especies vegetales de interés agronómico, para la obtención de plantas transgénicas resistentes a patógenos fúngicos necrotróficos.