CN1231673A - 在植物中调节防御反应的多核苷酸及其用途 - Google Patents
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Abstract
克隆大麦Mlo基因、从包括水稻和拟南芥的其它物种中克隆mlo突变体和同源物,使得能够对植物中的病原体防御反应进行操作。将核酸和多肽用于产生其中病原体防御反应被调节、特别是被刺激的转基因植物。各种方法使得能够诊断测定植物中敏感性或抗性等位基因的存在。运用涉及Mlo或mlo蛋白或其片段的测定,可鉴别能够通过与Mlo或mlo蛋白的互作而调节防御反应的化合物。
Description
本发明涉及在植物中刺激一种防御反应，目的在于提供植物增强的病原体抗性。更确切地讲，它产生自对大麦Mol基因、各种突变mol等位基因以及一些不同物种同源物(homologue)的克隆，用定位克隆法已经分离出Mol基因，该方法以前从未在大麦中获得成功。详情及讨论见下文。野生型Mol在病原体防御反应方面发挥负调控功能，因此病原体不存在时突变体就显示防御反应。按照本发明，可将下调或竞争超过(out-competition)Mol功能用于在转基因植物中刺激防御反应，使病原体抗性增强。
已在数种植物中描述过对病原体的防御反应似乎是组成型表达的突变。突变所诱导的大麦Mol基因座的隐性等位基因(mol)显示出叶片损伤表型，并对白粉病病原体大麦白粉菌(Erysiphe graminis f sphordei)形成明显持久的广谱抗性。
已对白粉病病原体的抗性反应进行了充分的遗传学特征记述(Wiberg,1974；Sopgaard和Jφrgensen,1988；Jφrgensen,1994)。在所分析的大多数例子中抗性由遵守Flor氏的基因对基因假说(Flor，1971)的品种特异性抗性基因所确定。在这种类型的植物/病原体相互作用中，抗性由两个互补基因定义并依赖于两个互补基因的存在，一个来自宿主，而另一个来自真菌病原体。将所述互补基因分别称为操作性(病原体)抗性(“R”)基因和无毒性基因。大多数白粉病抗性基因(Mlx)作为显性或半显性性状起作用(Jφrgensen,1994)。
Mol基因座的隐性(mol)等位基因所介导的单基因抗性有所不同。除是隐性的以外，它与对单个病原体菌株的种属特异性抗性的不同之处在于(ⅰ)对几乎所有已知的病原体分离物形成广谱抗性；(ⅱ)mol抗性等位基因通过对任意检测到的敏感性野生型(Mol)品种进行诱变剂处理而获得，以及(ⅲ)病原体不存在时，mol抗性等位基因显示防御模拟表型(Wolter等，1993)。因此，遗传学数据表明Mol野生型等位基因对病原体侵袭的防御反应发挥负调控功能。
目前mol等位基因介导的抗性被广泛应用于大麦育种，并估计每年在欧洲用这种基因型种子种植1000万公顷。虽然在小麦(被小麦白粉菌(Erysiphe graminis f sp tritici)侵袭)、燕麦(被燕麦白粉菌(E.g.f sp avenae)侵袭)和黑麦(被黑麦白粉菌(E.g.f sp secalis)侵袭)中真菌是相关的病原体，但至今至尚未报道其它禾谷类植物中的对白粉病的“mol样”遗传性抗性。因为禾谷类在形态学、遗传学和生物化学方面彼此高度相关(Moore等，1995)，人们可预言在这些种中存在同源物。在小麦和燕麦中未发现“mol样”遗传性抗性大概要归因于它们的六倍体基因组，致使难于通过诱变在全部的六个基因考贝中获得缺陷型等位基因，并且这种突变在自然界发生的机会极少。在其它禾谷类中未发现Mol相当物的原因大概应归因于在这些种中进行突变分析的数量小以及它们杂交育种性质复杂性的结果(例如黑麦)。
先前在mol回交系样本(含有来自六个遗传背景的mol等位基因)的基础上，已鉴定了与大麦第4染色体上的Mol紧密连锁的RFLP标记(Hinze等，1991)。RFLP标记基础上的Mol的图谱位置与以前用形态学标记作图所确定的其染色体位置相一致(Jφrgensen,1977)。
在鉴定了含有以遗传学标记为边界的Mol的～3cM遗传学区间别之后，我们决定通过定位充隆法尝试分离该基因。
但是，并没有已经报道的对大麦基因进行成功定位克隆尝试的实例。我们面临许多困难。
首先，大麦基因组(5.3×109bp/单倍体基因组等价物；Bennett和Smith,1993)的大小几乎是人类基因组的两倍；并且由于总遗传学图谱覆盖约1.800cM(Becker等，1995)，我们要面对遗传学和物理距离非常不利的比率(1cM相当于～3Mb)。
第二，高分辨遗传图谱必须围绕Mol构建，使得连锁标记定位的精确性好于0.1cM。
第三，我们的目标是在单个较大插入基因组克隆上用物理方法给靶基因和两侧DNA标记定界，该方法后来被称作“染色体登陆”(Tanksley等，1995)。为了这个目的，必须用平均大小为500-600kb的插入片断构建来自大麦兆碱基DNA的完整大麦YAC文库，这尚未有先例。
第四，我们必须准备不寻常的遗传学工具，可使我们在物理界定区内鉴别Mol基因而无须花费时间产生大麦转基因植物以及检测不同候选基因。我们在研究中采用了10个鉴定的放射诱导或化学诱导的mol突变体(Jφrgensen,1992)。为获得基因分离的一系列确实的证据，我们泱定从鉴定的mol缺陷等位基因入手，根据野生型Mol等位基因的功能恢复。为了运个目的，我们进行了mol异源等位基因杂交并分离到敏感的基因内Mol重组体。对这些进行的序列分析证明了所描述基因的功能。
对大麦Mol基因以及同源物(包括来自其它植物种同源物)的克隆，引起一些实际应用，这反映在本发明的各个方面。
根据本发明的第一个方面，提供了含有其核苷酸序列编码具Mol功能肽的核酸分子。那些本领域技术人员会理解“Mol功能”是指抑制防御反应的能力，所述的防御反应与品种和/或病原体无关，并且对于病原体的存在是自主性的，例如大麦的Mol基因、拟南芥属(Arabidopsis)的Acd基因和Lsd基因。
下调或破坏野生型Mol序列功能表达的mol突变是隐性的，因此它们可被野生型序列的表达所互补。所以“Mol功能”可通过评估组成型防御反应的水平和/或植物对于病原体(例如白粉菌或锈菌，如条锈菌)的敏感性而测定。因此，具有Mol功能的推定核苷酸序列可以依靠适合的mol突变体的互补作用而检测。名词“mol功能”用于指赋予植物mol突变表型的序列。
有大写字母的“Mol”和无大写字母的“mol”于是被用于区别“野生型”和“突变体”的功能。
mol突变体表的特征在于对一种或多种病原体的抗性增强，它与品种和/或病原体无关，并且对于病原体的存在是自主性的。
测试植物可以是单子叶植物或双子叶植物。适合的单子叶植物包括大麦、水稻、小麦、玉米或燕麦，特别是大麦。适合的双子叶植物包括拟南芥属。
根据本发明的核酸可编码含有如图2所示氨基酸序列或其等位基因、变异体、衍生物或突变体或同源物的多肽。
根据本发明的核酸可以具有大麦Mol基因的序列，或者是该序列所提供的突变体、变异体(或衍生物)或等位基因或其同源物。优选的突变体、变异体以及等位基因编码这样一种序列的突变体、变异体或等位基因，该序列保留野生型基因的功能特性，尤其是抑制此处所讨论的防御反应的能力。其它优选的突变体、变异体或等位基因编码下述序列，该序列在纯合子中引起防御反应的组成型激活，或例如通过减小或者全部或部分地消除Mol功能，至少促进防御反应(如mol突变体序列)的激活。产生mol突变序列的优选突变示于表1。产生突变体、衍生物或变异体的序列变动可通过对核酸中一个或多个核苷酸进行一个或多个添加、插入、缺失或置换，而导致一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失和/或置换。当然，包括对所编码的氨基酸序列未造成差异的核酸变动。具体的变异体、突变体、等位基因和衍生物以及同源物在下文中将进一步讨论。
根据本发明一个方面的优选核酸序列以及预期的氨基酸序列示于图2。核酸可通过核苷酸置换和/或一个或多个核苷酸的添加、插入和/或置换的组合，同时改变或未改变所编码氨基酸序列(由于遗传密码子的简并性)而进行变动。
如下文所讨论的，本发明另一方面提供如图2所示的Mol序列，包括来自水稻(图5底线(botteom line)为基因组序列、图10为cDNA序列、图13为氨基酸序列)和大麦(图6底线为基因组序列，图11为cDNA序列，图14为氨基酸序列)同源物；以及表5B(核苷酸序列)和图5A(氨基酸序列)表示来自水稻和拟南芥属的同源EST的同源物。
本发明还提供包含具有任一所提供序列的核酸的载体，优选能够表达产物的载体。该载体最好适合于转化入植物细胞和/或微生物细胞。本发明还包括用这种载体转化的宿主细胞，特别是植物细胞或微生物细胞(如根癌农杆菌)。因此，提供了含有根据本发明的核酸的宿主细胞，如植物细胞。在该细胞内，该核酸可加入到核基因组中，即染色体内。在每个单倍体基因组中可以有一个以上的异源核苷酸序列。
含有本发明核酸的载体不必包括启动子，尤其是当该载体将用于将该核酸导入细胞中以重组到基因中时。
可提供的根据本发明的核酸分子和载体的方式有：从其天然环境中分离和/或纯化的形式、以基本上纯的或均质的形式，或者没有或基本没有目的物种或者非相关序列来源的核酸或基因。本发明的核酸可包括cDNA、RNA、基因组DNA，并可是全部或部分合成的。名词“分离物”可包含所有这些可能性。
本发明还包括任何公开的核酸序列的表达产物以及通过在合适的条件下在适合的宿主细胞(如大肠杆菌)中由编码核酸的表达制备表达产物的方法。那些本领域技术人员完全能够构建载体和设计方案，来进行重组基因表达产物的表达和回收。可以挑选或者构建适合的载体，所述载体含有一个或多个适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片断、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它适当的序列。关于进一步的细节可参见例如：分子克隆：实验室手册：第二版，Sambrook等，1989，冷泉巷实验室出版。转化方法取决于所采用的宿主，但这是广为人知的。例如制备核酸构成物、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达的核酸操作以及蛋白质分析的许多已知方法和方案Short Protocols in Moleculae Biology(第二版，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons,1992)中有详述。Sambrook等和Ausubel等的公开内容以及所有其它所提及的文献，一并通过引用结合到本文中。
纯化后的Mlo蛋白或其片段、突变体或突异体(如通过其编码核酸的表达而重组产生)可用本领域的标准技术产生抗体。可用抗体以及含有抗体的抗原结合片段的多肽从下文进一步描述的其它植物中鉴别同源物。
产生抗体的方法包括用该蛋白质或其片段免疫哺乳类动物(如人类、小鼠、大鼠、兔子、马、山羊、绵羊或猴子)。可从免疫动物中用任何种种本领域已知技术的方法获得抗体，并且可以筛选抗体，优选方法是利用抗体与目的抗原的结合。例如，可运用Western印迹技术或免疫沉淀法(Armitage等，1992,Nature 357:80-82)。抗体可以是多克隆的或单克隆的。
作为免疫动物的替代方法或补充，可从表达的免疫球蛋白可变域重组产生的文库中获得具有适当结合特异性的抗体，例如可采用λ噬菌体或丝状噬菌体，它们在其表面呈现功能性免疫球蛋白结合域，例如可参见WO 92/01047。
针对多肽或肽产生的抗体可用于鉴别和/或分离同源多肽，并进而鉴别和/或分离编码基因。因此，本发明提供鉴别或分离具Mlo或mlo功能多肽的方法(按照本文公开的实施方案)，包括用含有抗体(例如整个抗体或其片段)的抗原结合域的多肽筛选候选肽或多肽，其中所述抗原结合域能够结合Mlo或mlo肽、多肽或其片段、变异体，或者最好具有对于这种肽或多肽的结合特异性，例如具有本文鉴别的氨基酸酸列。特异性结合成员如这样的抗体和多肽，它们含有结合针对Mlo或mlo肽或多肽或其突变体、变异体或衍生物的抗体的抗原结合域，并最好对Mlo或mlo肽或多肽或其突变体、变异体或衍生物具有特异性，这些特异性成员以及它们的用途和使用它们的方法代表本发明的其它方面。
用来筛选的候选肽或多肽例如可以是用来自目的植物的核酸创建的表达文库的产物，或者可以是来自天然资源纯化过程的产物。
可将发现结合该抗体的肽或多肽进行分离，然后可以测氨基酸序列。任何适合的技术均可用于对该肽或多肽的全部或部分进行测序(如可以对多肽片段测序)。例如通过设计一个或多个寡核苷酸(如寡核苷酸的简并库)用作与候选核酸杂交的探针或引物，或者如以下详细讨论的一样，通过对计算机序列数据库检索，可以将氨基酸序列信息用于获得编码该肽或多肽的核酸的过程。
本发明的再一方面提供从包括除大麦以外物种的植物中鉴别并克隆Mlo同源物的方法，该方法采用得自图2所示核苷酸序列的核苷酸序列。另外的类似方面采用得自本文所提供的任何其它图的核苷酸序列。可用本领域技术人员所熟知的技术筛选核酸文库，由此鉴定同源序列，然后进行检测。正如本文所例举的，大麦Mlo基因和各种同源物序列信息的提供，使得从大麦和其它植物种中获得(obtention)同源序列成为可能。
此外，人们在推定的外显子序列的基础上能够容易衍生PCR引物，外显予序列可以通过与图2提供的Mlo序列相比较而被鉴别(其中突出了外显子部分)，并用来自目的植物(如大麦和水稻)的总RNART-PCR扩增同源物(如图5和图6所示)，cDNA和氨基酸序列示于本文其它图中。
根据图2所示大麦基因公开的内容给出的核苷酸序列及给出或可推断出的氨基酸序列同源物代表和提供本发明的其它方面。
本发明还延伸至编码Mlo同源物的核酸，它用来源于图2所示核苷酸序列或图2所示氨基酸序列而获得。最好是，该核苷酸序列和/或氨基酸序列与图2的核苷酸序列所编码的序列具有的同源性，优选为至少约50％，或至少约55％，或至少约60％，或至少约65％，或至少约70％，或至少约75％，或至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，最优选为至少约95％的同源性。与氨基酸序列相关连的“同源性”可用于指一致性或相似性，最好是一致性。高水平的氨基酸一致性可能局限于在功能上很重要的域或区。
根据本发明的突变、等位、变异或衍生的氨基酸序列可以包括在图2所示的序列中，相对于图2所示序列有一个氨基酸的变动，或者也可以有2、3、4、5、6、7、8或9个变动，约10、15、20、30、40或50个变动，或大于50、60、70、80或90个变动。除图2所示氨基酸序列中一个或多个变动外，突变、等位、变异或衍生的氨基酸序列在C-端和/或N-端可以包括额外的氨基酸。
正如人们充分理解的，氨基酸水平的同源性一般鉴于氨基酸的相似性或一致性。相似性允许“保守变异”，如巯水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)置换或另一疏水性残基，或一种极性残基置换另一种极性残基，如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸或谷氨酰置换精氨酰。相似性可如Altschul等(1990)(J.Mol.Biol.215:403-10)中的TBLASTN程序来定义和确定，该程序在本领域中按标准使用，或者，这可以是优选的标准程序BestFit，该程序是威斯康辛软件包(第八版，1994年9月)的一部分，(Genetics ComputerGroups,575 Science Drive，麦迪逊，威斯康辛，美国，威斯康辛53711)。BestFit可对两种序列间相似性的最佳片段做出最佳序列对比。可通过用Smith和Waterman的局部同源性运算法则插入间隙使匹配数目最大化而发现最佳序列对比。
同源性可以在本文所示相关序列的全长范围内，或者更优选与相关氨基酸序列或核苷酸序列(事实上可能如此)相比，在大约20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333、400、450、500、550、600或更长的相邻序列或密码子内。
本文所提供的EST序列与图2中的Mlo氨基酸序列有平均70％的相似性和50％的一致性。我们表明，水稻同源物(图5)和大麦同源物(图6)的氨基酸一致性为81％(氨基酸序列示于图13和图14)。
在某些实施方案中，特定序列的等位基因、变异体、衍生物、突变体或同源物与所述特定序列可能几乎不显示全面的同源性，可以说为约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％或约45％。但是，在功能上重要的域或区中，氨基酸同源性可能高得多。推定在功能上重要的域或区可用生物信息学方法进行鉴别，所述方法包括比较同源物的序列。可将不同多肽的功能重要的域或区组合在一起，作为融合蛋白从编码核酸进行表达。例如，将不同同源物特别有利或期望的特性组合在一个杂种蛋白中，使得产生的具有Mlo或mlo功能的表达产物可以包含各种亲本蛋白质的片段。
可将本文所提供的核苷酸序列信息或其任何一部分用于数据库检索中，以发现同源序列、可以检测Mlo或mlo功能的表达产物。这些序列可以具有在植物中互补mlo突变体表型的能力，或者在植物中表达时，可以赋予mlo表型。
最近我们在公共序列数据库中鉴别到图2中序列的几个同源物。我们已在水稻和大麦中以及双子植物拟南芥属中发现了同源物。
通过对同源物测序研究它们的表达模式并检查改变它们的表达的效果，可获得执行类似于大麦Mlo的功能的基因。当然，这些序列的突变体、变异体及等位基因如以上所讨论的大麦的情况一样，包括在本发明范围之内。
本文所述的同源物之间的同源性可在更多同源物鉴别的过程中加以利用，例如运用以序列保守性为基础设计的寡核苷酸(如简并库)。
本发明另一方面，提供例如从非大麦的物种中鉴别Mlo同源物的方法或克隆Mlo同源物的方法，该方法利用来自图2所示或本文任何其它图中所示的核苷酸序列。例如，这种方法可以利用包含一种或多种下述序列的一种或多种寡核苷酸来搜索同源物，所述序列在以下序列之间保守：图2序列和/或图5序列和/或图6序列和/或图10序列和/或图11序列和/或图12序列，或者编码在图2和/或图7和/或图13和/或图14和/或图15之间保守的氨基酸序列。因此，提供了获得核酸的方法，包括寡核苷酸或含有这种寡核苷酸的核酸分子与靶/候选核酸的杂交。靶核酸或候选核酸例如可以包括基因组文库或cDNA文库，这些文库可从已知含有或怀疑含有这种核酸的生物体中获得，生物体或者是单子叶的或者是双子叶的。可以鉴别成功的杂交，同时可分离出靶/候选核酸以供进一步调查和/或应用。
杂交涉及到制备核酸探针和在适当的严格条件(按照已知技术)下鉴别阳性杂交和/或在核酸扩增方法(如PCR)中将寡核苷酸用作引物。对于探针探测，优选条件是足够严格以使杂交图上只有少数鉴别为阳性杂交的简单带型，可用于进行深入研究。本领域熟知应逐步提高杂交严格性直至仅有少数阳性克隆存在。
作为探针探测的替代方法，虽然仍日利用核酸杂交，但可将设计用于扩增DNA序列的寡核苷酸以常规方法用于PCR反应或其它涉及核酸扩增的方法中。参见例如“PCR Protocols；A Guide to Methodsand Applications”,Innis等编辑，1990,Academic Press，纽约。
适用于设计某些用途的探针或PCR引物的优选氨基酸序列是那些至少在两个Mlo肽或在能够抑制植物防御反应的基因所编码的多肽(例如具有本文任何图中的任何氨基酸序列和/或由本文任何图中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列)之间保守的(完全、基本或部分保守)序列。
可在氨基酸序列信息的基础上，并考虑到遗传密码的简并性和衍生候选核酸的该生物体的密码子选择，来设计寡核苷酸探针或引物。
根据本发明中的某些实施方案(如用于核酸扩增)的寡核苷酸，其长度优选为多达约50个核苷酸，或约40个核苷酸或约30个或更少的核苷酸(如18、21或24)。
对于是否这种PCR产物与Mlo同源基因相对应，可通过多种途径来评估。这种反应中的一条PCR带可能含有产物的复杂混合物。可对单个产物进行克隆并逐个进行筛选。可以通过转化来进行分析，以评估对导入目的植物的功能。
正如所提及的，可用基于本文所提供的序列信息而设计作为探针或引物的寡核苷酸，获得根据本发明的核酸。可以在选择性杂交的条件下，探测从大麦或另一植物(见上文)的一个或多个细胞中分离并/或纯化的核酸，或者从该植物分离和/或纯化的核酸衍生的核酸文库(如衍生于从该植物中分离的mRNA的cDNA文库)，和/或经过特异性核酸的扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。在扩增反应中探测的或用作模板的核酸可以是基因组DNA、cDNA或RNA。如果需要，可将一个或多个基因片段连起来产生一个全长的编码序列。
我们已经对来源于本文公开的Mlo序列的几个PCR引物进行了检测，以用大麦基因组DNA和RT-PCR模板检测它们扩增根据本发明的核酸的特异性。可以由大麦polyA+RNA合成后者。在各种情况下，我们都能够扩增到如PCR产物的克隆及之后的DNA测序所显示出的预期的源于Mlo的基因片段。如果用RT-PCR产物作模板，则通过5’和3’RACE技术所描述方法可获得全长的cDNA克隆。
所检测的PCR引物的例子包括：25L 5’-GTG CAT CTG CGT GTG CGT A-3’25LN 5’-GTG TGC GTA CCT GGT AGA G-3’25R 5’-AAC GAC GTC TGG TGC GTG-3’33 5’-TGC AGC TAT ATG ACC TTC CCC CTC-3’37 5’-GGA CAT GCT GAT GGC TCA GA-3’38 5’-CAG AAC TTG TCT CAT CCC TG-3’38A 5’-GGC TAT ACA TTG GGA CTA ACA-3’38B 5’-CGA ATC ATC ACA TCC TAT GTT-3’39 5’-GCA AGT TCG ACT TCC AC-3’39A 5’-TCG ACT TCC ACA AGT ACA TCA-3’53 5’-AGC GTA CCT GCG TAC GTA G-3’已经检测了各种引物的组合：38/39A；38/39；38/33；38/37；38A/39A；38B/39A；38/25L；38/25LN；25R/25L；25R/25LN；25R/53。
本发明的各方面包括可获得的核酸、筛选存在目的核酸的材料(如细胞裂解液、核酸制剂)的方法、获得该核酸的方法以及以上给出的引物和引物组合物。
本文所提供的序列信息还允许设计诊断检测，以确定在任何给定植物、栽培品种、变种、群体、当地品种、家族的一部分中或育种程序中的其它筛选物或其它这种基因型中是否存在特定的mlo抗性等位基因或敏感性等位基因(如野生型)。诊断检测可以基于通过核酸或多肽的确定，确定特定等位基因的存在或缺少。
在核酸水平，这可以包括适合的寡核苷酸或多核苷酸(如Mlo基因的片段或其同源物，包括本文公开的任何同源物)或者任何特定等位基因(如产生mlo表型的等位基因，如本文公开的任何这种等位基因)的杂交。杂交可以包括设计从mlo的给定等位基因形式扩增产物的PCR，以及之后通过包括(但不限于)凝胶电泳、毛细管电泳、核苷酸序列探针直接杂交等等在内的多种可能方法的任一种探测扩增产物。诊断检测可以基于设计扩增Mlo基因座的各种等位基因或任何等位基因的PCR方法以及并通过下述种种可能方法中的任一种区别不同的可能性等位基因的检测，所述可能方法包括DNA片段大小、限制性位点的变异(如CAPS-切割的扩增多态位点)等等。诊断检测也可以分析核酸的大量可能性变异体为基础，该法对于本领域技术人员来说是显而易见的，例如把来自合成mlo的序列用作杂交探针。
从广义来说，所述方法划分为那些筛选核酸序列存在的方法和那些依赖于探测多肽存在或缺少的方法。所述方法中可利用来自一种或多种被怀疑为含有所述核酸序列或多肽的植物或细胞的生物样品。
检测核酸或多肽的典型方法包括分析植物或植物细胞样品，具体为：
(a)将该样品中的核酸序列与图7中所示的全部或部分核苷酸序列相比较，以确定是否来自病株的样品中含有突变；
(b)确定该样品中是否存在一种多肽，该多肽包括图2中所示的氨基酸序列或其片段；若存在，则确定该多肽是否是全长和/或是否已突变和/或是否以正常水平表达；
(c)制作DNA指纹图谱，将限制性酶在样品中切割核酸所产生的限制图谱与获自图7所示的核苷酸序列或获自其已知的突变体、等位基因或变异体的限制图谱相比较；
(d)将该样品与能够和下述核酸相结合的特异性结合成员相接触，所述核酸包括如图7中所列的核苷酸序列或其片段、或其突变体、等位基因或变异体；所述特异性结合成员包括能与图7中的序列相杂交的核酸、或者其包括的结合域对包括图7序列的核酸或该核酸编码的多肽或其突变形式具有特异性的多肽；并测定特异性结合成员的结合；
(e)进行涉及基于图7所示核苷酸序列的一个或多个引物的PCR，以筛选核酸样品，该核酸包括图7的核苷酸序列或其突变体、等位基因或变异体。
筛选抗性等位基因核酸时，首先例如用PCR法扩增该样品中的核酸，以与存在于该样品中的其它序列相比提高分析物的量。如果该样品中存在靶序列，则这允许以高灵敏度检测出靶序列。这个开头的步骤可用本领域越来越重要的高灵敏度排列(array)技术来取代。
与野生型序列(如示于表1的)相比，该基因的变异体形式可含有一个或多个核苷酸的一个或多个插入、缺失、置换和/或添加，这可能破坏或不破坏该基因功能。核酸水平的差异并不必然由所编码多肽的氨基酸序列的差异来体现。但是，基因中的突变或其它差异可能导致移码或产生终止密码子，运可能严重影响所产生多肽(若有的话)的性质，或者导致点突变或所编码多肽的严重的突变性改变，包括该多肽中一个或多个氨基酸或区域的插入、缺失、置换和/或添加。启动子序列或其它调控区的突变可能阻止或降低该基因的表达，或影响mRNA转录物的加工或稳定性。
可以对含基因组DNA、cDNA和/或mRNA的制剂进行检测。检测cDNA或mRNA的优势为由于不存在内含子序列而核酸的复杂性降低了，但是在制备该制剂中可能需要额外的时间和努力，这是可能不利的一面。由于RNA酶到处存在，RNA比DNA更难操作。
对检测样品中的核酸进行测疗，并将该序列与图2或本文其它图中所示序列相比较，以确定是否存在差异。如果有，就可将差异处与已知的敏感性等位基因(如表1所总结的)相比较，来确定是否受检测核酸含有一个或多个所示的变异，或者可调查该种差异与抗病性的关系。
然后如上所述对扩增的核酸测序，并/或用任何方法检测，来确定特定特征的存在或缺乏。供检测用的核酸可采用各种其它技术(如限制性酶消化和电泳)，从取自细胞或文库中的核酸制备。
核酸可用变异体特异性或等位基因特异性探针进行筛选。这种探针在序列上对应于该基因的一个区或其互补链，并含有已知与抗病性相关联的序列变动。在适当的严格条件下这种探针与所检测核酸的特异性杂交，表明在所检测核酸中存在序列变动。为了有效地筛选，在同一被检样品上可以使用一个以上的探针。
可将等位基因特异性或变异体特异性寡核苷酸同样地用于PCR中，以便特异性地扩增特定序列(如果该序列存在于被检样品中的话)。对于是否PCR条带中含有基因变异体的评估，可用本领域技术人员所熟知的多种方法进行。例如对PCR产物可用这种途径处理，即将它们在变性聚丙烯酰胺DNA测序凝胶上呈现该突变或多态性，而特异条带与所筛选的基因变异体连锁。
在被检样品中寻找变异序列是否存在的替代方法或补充方法是，例如采用一个合适的特异性寡核苷酸探针或引物寻找正常序列的存在。
可以运用依赖于探针和被检核酸的杂交以及之后的错配检测的方法。在适当的条件(温度、pH等)下，寡核苷酸探针将与不完全互补的序列杂交。尽管有错配，但这两个分子之间的碱基配对程度足以使它们退火。各种检测两个退火的核酸分子之间存在错配的方法是本领域熟知的。
例如，RNA酶A在错配位点切割。通过将相关探针已经与之退火的被检核酸电泳，并且寻找小于全长探针/被检杂种的分子(如具有较高电泳迁移率的分子)，能够检测切割情况。其它方法依赖于如解离酶或核酸内切酶等酶的使用。
因此，具有正常基因(无论有义链或反义链)的已知发生抗病性相关突变(如参见表1)的区域序列的寡核苷酸探针，可以与被检核酸退火并确定错配的存在或不存在。检测到错配的存在可以表明在被检核酸中存在与抗病性相关的突变。另一方面，具有该基因的包括与抗病性相关联突变的区序列的寡核苷酸探针，可以与被检核酸退火并确定错配的存在或不存在。错配的存在可以表明被检样品的核酸具有正常序列、或不同的突变序列或等位基因序列。在两种情况下，可采用针对该基因的不同区的一组探针。
核酸分子序列中差异的存在可通过限制性酶消化的方法进行检测，例如在DNA指纹法中，将用一种或多种限制性酶切割的核酸样品时所产生的限制图谱，与用相同的一种或多种酶消化的含正常基因或变异体或等位基因的样品所获得的图谱相比较。
通过测定转录产生的mRNA水平或从mRNA翻译产生的多肽水平，还可以估计启动子或其它调控序列中损伤的存在或缺乏。
从植物的一种或多种细胞分离和/或纯化的核酸，或来源于从细胞分离和/或纯化的核酸的核酸文库(如来源于从细胞分离的mRNA的cDNA文库)，可在选择性杂交条件下进行探测和/或经过特异的核酸扩增反应，如聚合酶链式反应(PCR)。
方法可以包括一种或多种(如两种)探针或引物与靶核酸的杂交。其中该核酸是双链DNA，通常在杂交之前先进行变性以便产生单链DNA。杂交可以作为PCR步骤的一部分，或作为不涉及PCR的探针探测方法的一部分。一个典型方法可以是PCR和低严格条件杂交的组合。用从本领域技术人员可利用的许多方法中挑选出的筛选方法，来鉴别成功杂交事件并分离杂交的核酸。
可用任何本领域技术人员使用的各种技术中的任一种测量探针与靶核酸(如DNA)的结合。例如，可以将探针以放射性标记、荧光标记或酶标记。其它不使用标记探针的方法包括限制性片段长度多态性的检测、用PCR扩增、RNA酶切割以及等位基因特异性寡核苷酸探针探测。
探针探测可以采用标准的Southern印迹技术。例如从细胞提取DNA并用不同的限制性酶消化。然后在变性并转到尼龙膜上之前，通过在琼脂糖凝胶上电泳分离限制性片段。标记探针与膜上的DNA片段杂交，并测定结合。来自细胞的RNA制备物可用于制备用于探针探测的DNA。
在低严格条件下，通过各种探针与用限制性酶消化的DNA的Southern印迹杂交进行预备实验。当获得大量杂交片段时，可达到合适条件，而杂交背景低。通过采用这些条件可以研究核酸文库，例如代表所表达序列的cDNA文库。
如上所述，考虑诸如寡核苷酸长度、碱基组成、温度等因素，本领域技术人员应能够采用选择性杂交的适合所需严格条件。
在按照本发明诊断测定的一些优选实施方案中，为图2所示任何序列片段的或者例如表Ⅰ中所鉴别的与抗病性相关的任何等位基因的按照本发明的寡核苷酸，它们的长度至少为大约10个核苷酸，更优选长度至少为大约15个核苷酸，更优选长度至少为大约20个核苷酸，更优选长度为至少大约30个核苷酸。这类片段本身独立代表本发明的各方面。如所讨论的，可将片段和其它的寡核苷酸用作引物或探针，但它们也可以在涉及在一测试样品中测定指示抗病性的序列存在的方法中产生(如通过PCR方法)。
有种类繁多的方法测定在一测试样品中存在或缺少一种特定多肽，例如具有图2或本发明其它图中所示氨基酸序列的多肽，或其氨基酸序列的突变体、变异体或其等位基因(如包括如表Ⅰ中所示的改变)。
可检测样品中诸如一种抗体(或抗体混合物)的特异性结合成员的结合伙伴的存在，该结合伙伴对于图2中所示多肽的一种或多种特定变异体(例如，参见表Ⅰ)是特异性的。
在这种情况下，可如下进行样品检测：在适当的可特异性结合的条件下使样品与诸如抗体的特异性结合成员接触，然后例如使用如所讨论的报告系统测定结合。在使用一组抗体时，对于每种抗体采用不同的报告标记，从而能够测定每种结合。
诸如抗体的特异性结合成员可用来从一测试样品中分离和/或纯化其结合伙伴多肽，便于进行该多肽的序列和/或生化分析，以确定是否该多肽具有野生型多肽或其特殊突变体、变异体或等位基因的序列和/或特性。用自动测序仪按本领域常规测定氨基酸序列。
mlo等位基因诊断性检测的应用均使得研究者或植物育种者能够满怀信心确定：目的植物(或其细胞)中是否存在所需等位基因，该植物是其它在遗传上相同的植物(如近交变种或栽培品种)集合体的代表、还是相关(如育种者的选择)或不相关植物样品中的一个个体，而无需进行耗费时间的抗性试验。赋予所需抗病性表型的mlo等位基因是隐性的，因此在存在野生型Mlo等位基因的杂合子条件下，在整个植物表型水平上检测不到。所以只有在mlo基因座纯合的材料上，才可能在表型上筛选这种隐性等位基因的存在；并由此在植物育种程序中实际上延迟筛选能够可靠、成本有效地应用的世代。在一个回交育种程序中，例如其中育种者的目的是将期望的mlo等位基因渐渗到优良的已适应的高性能(high performing)靶基因型中，mlo基因座将永久地处于杂合子环境中直至进行自交。对于隐性等位基因是否存在的核酸或多肽检测，避免了对回交一代个体的自交后代进行检测的必要，因此节省大量的时间和金钱。在基于所期望个体的选择和自交的其它类型育种方案中，在如本发明提供的高生产率、低成本的测定中诊断所期望mlo基因的核酸或多肽、对所期望mlo等位基因的可靠筛选，可以在较早世代和比其它可能情况更多的材料中进行。这样由于能够较早检测材料，赢得筛选的可靠性和节省时间并且没有昂贵的抗性表型筛选，在植物育种中具有重要价值。
作为核酸检测的例子，大麦mlo-5抗性等位基因的特征在于，Mlo基因的预期起始密码子中G-核苷酸置换为A-核苷酸(表1)。通过下述方法可容易地检测出该突变，即从基因组模板DNA中用下述引物通过标准PCR法扩增Mlo基因区段，所用引物为：
正向引物：5’-GTTGCCACACTTTGCCACG-3’
反向引物：5’-AAGCCAAGACGACAATCAGA-3’然后(例如)用限制性酶PshAⅠ消化。这产生用传统琼脂糖凝胶电泳可显示的酶切的扩增多态序列(CAPS)标记。存在769 bp片段表示存在mlo-5等位基因。
mlo-9抗性等位基因的特征是C-核苷酸置换为T-核苷酸(表1)。该等位基因值得特别关注，因为它被频繁用于育种材料中。用以下引物并随后用限制性酶HhaⅠ消化基因组扩增产物，可轻易地探测出突变事件，所述引物为：
正向引物：5’-GRRGCCACACTTTGCCACG-3’
反向引物：5’-AAGCCAAGACGACAATCAGA-3’这产生用传统琼脂糖凝胶电泳可显示的CAPS标记。存在374 bp片段表示存在mlo-9。
第三个尤其感兴趣的等位基因为mlo-12，其特征是残基240、特别是Phe240取代为亮氨酸。这可产生于编码核苷酸序列中的C720置换为A(表1)。这是目前唯一有报道的mlo等位基因，可得到该改动的蛋白质保留残余野生型活性的确实证据(Hertrich,1979,Arch.Züchtungsvorsch.,Berlin9,S.283-291)。mlo-12并未显示可探测的自发性细胞死亡反应，但赋予对例如白粉菌的病原体足够水平的抗性。因此如果在mlo抗性基因渐渗入优良育种系后最低限度的多效作用(自发细胞死亡)是所希望的，则mlo-12可能是育种计划中选择的等位基因。另外，Mlo蛋白中氨基酸置换的分子位点使得可以设计具有残余野生型活性的等位基因，并且还可获得互作和/或抑制的分子，从Mlo蛋白功能的完全丢失中降低不良的多效作用。
以核酸为基础的mlo等位基因存在或缺乏的测定可与用已建立的几组标记进行的侧翼连锁的基因组DNA和其它非连锁的基因组DNA的基因型的测定相结合，所述标记物例如有RFLP、微卫星或SSR、AFLP、RAPP等。这使得研究者或植物育种者不仅能够选出所希望的mlo等位基因的存在，而且还能够选出具有连锁的和非连锁的遗传背景的最佳组合的单个植物或植物家族。这种所希望材料的重组只在给定的分离育种群体或回交后代中偶然发生。本发明所提供的mlo基因座的直接测定，使得该研究者能够制订定一个逐步的方法，以固定(使之纯化)所希望的侧翼标记与mlo等位基因的组合，方法是首先鉴别一个侧翼标记固定的个体，然后鉴别一直在mlo基因座另一边固定并且确信所希望的mlo等位基因仍然存在的后代。
本说明书为本领域技术人员提供充足信息，以获得任何给定的新的或现有的mlo等位基因的基因组DNA序列，并设计适合的以核酸和/或多肽为基础的诊断测定。可应用的现有mlo等位基因包括例如mlo-1、mlo-3、mlo-4、mlo-5、mlo-6、mlo-7、mlo-8、mlo-9、mlo-10、mlo-12、mlo-13、mlo-16、mlo-17、mlo-26和mlo-28，本文提供所有这些序列信息(如参见图2和表1)。在设计一个核酸测定中，考虑到序列中鉴定特定变异等位基因特征的独特变异。因此，本发明延伸至mlo等位基因的寡核苷酸片段，较之其它mlo等位基因，该片段具有可使其与该等位基因特异杂交的一段序列。这样的一段寡核苷酸跨越发生mlo突变的核苷酸，并可以在其3’或5’端或朝向其3’或5’端包括该突变的核苷酸。这种寡核苷酸可以与有义链或反义链杂交。该变异可以在该mlo基因的编码序列之内，或可以位于一个内含子序列之内或非编码序列的上游或下游中，其中破坏影响或者与导致该霉病抗性表型的Mlo损害有关。
mlo-9等位基因被广泛地、但非唯一地应用在植物育种中(J HelmsJφrgensen-Euphytica(1992)63:141-152)，也应用mlo-11。在实际育种中mlo突变体的应用在很大程序上局限于春大麦，因为加入到高产冬大麦基因型中时，与许多突变等位基因相关的自发细胞死亡反应似乎代表对植物生长和行为表现的惩罚。但是不同的mlo等位基因与自发细胞死亡反应的相关程度不同，因此一些或者现有的或者由诱变程序新生成的、或作为自发突变体分离的mlo等位基因较之其它等位基因更适合于引入冬大麦背景中。mlo-12等位基因尤其适合，因为未发生可探测的多效作用，而赋予足够水平的抗病性。在冬大麦中较广泛地应用基于mlo的霉病抗性，将对大麦种植者具有重要价值和重要的经济、环境含意，例如降低杀真菌剂的投放使用以及它们所相关的处理费用。如本文所提供的核酸诊断措施，使得新的和现有mlo等位基因能够尽快和准确地配置到冬大麦种质中。
还提供包括本发明植物细胞的植物以及该植物的任何部位或繁殖体、种籽、自交或杂交子代和后代。按照本发明的植物可以是在一个或多个特性方面未真正育种的植物。可排除植物变种，特别是按照植物育种者的权利可登记的植物变种。注意到一个植物不必仅仅因为其基因组中稳定含有一个导入该植物细胞或其一个祖先细胞中的转基因，而将其看作“植物变种”。
除植物外，本发明提供这种植物的任何克隆、种籽、自交或杂交子代和后代、以及任何这些的任何部分，例如插条、种籽。本发明提供任何植物繁殖体，即可以用于有性繁殖或无性繁殖的任何部分，包括插条、种籽等等。本发明还包括为有性或无性繁殖子代的植物、这种植物的克隆或后代，或所述植物的任何部分或繁殖体、子代、克隆或后代。
本发明另一方面提供产生植物细胞的方法，包括将该序列(如作为一个合适载体的一部分)导入一个植物细胞，并引起或允许该载体与该植物细胞基因组之间的重组，将该核苷酸序列引入该基因组中。
植物细胞转化之后，可以再生植株。
本发明还提供调节Mlo在植物中表达的方法，该方法可以调节该植物的防御反应，包括在该植物的细胞中表达一段异源Mlo基因序列(或其突变体、等位基因、变异体或同源物，如所讨论的)。如本文进一步讨论的，植物组成型防御反应水平的调节或改变可以通过抑制、阻抑或降低(以野生型Mlo的方式)或启动、刺激、激活、提高、增强或增加(以突变体mlo的方式)进行。该防御反应的激活或增强可以赋予或提高该植物的病原体抗性，尤其是对抗白粉病和/或锈病(如条锈病)的抗性。
术语“异源性”可用于表明已经用遗传工程方法，即通过人类干预，将所述核苷酸的序列引入该植物或其祖先的所述细胞中。可以提供转基因植物细胞，即对于所述核酸为转基因的。该转基因可以位于一个基因组外的载体上或最好稳定地引入基因组中。一个异源基因可以取代一个内源的相当基因，即通常发挥相同或相似功能的基因，或可以将该插入序列附加于该内源基因或其它序列。引入异源基因的一个优势是能够将一段序列的表达置于所选启动子的控制之下，以便能够根据选择(preference)影响表达，所述选择例如为在特定发育的、空间性或暂时性控制下，或在诱导型启动子控制下。另外，例如较野生型具有更高或更低活性的该野生型基因的突变体、突异体和衍生物可用于置换内源基因。对于植物细胞为异源、外源或外来的核酸可以是在该类型、变种或物种的细胞中非自然存在的。因此，核酸可以包括置于不同类型或植物种或变种的植物细胞前后序列中的特定类型植物细胞或植物物种或变种的编码序列或来源于它们的编码序列。另一种可能性是一段核酸序列置于该核酸或同源物天然发现的细胞中，但其中该核酸序列与在该细胞、或那种类型或植物种或变种的细胞中非天然存在的核酸相连接和/或相邻，例如与一个或多个调控序列(如启动子序列)操作性相连以控制表达。植物或其它宿主细胞中的一段序列可为可鉴别的异源、外源或外来序列。
野生型Mlo基因功能的下调导致刺激组成型防御反应。如下文所描述，这可通过多种不同途径而达到。
可将本发明核酸置于诱导型基因启动子的控制之下，以便将表达置于使用者的控制下。
另一方面，本发明提供含有与本发明提供的核苷酸序列操作性相连的诱导型启动子的基因构成物。如所讨论的，运使得能够控制该基因的表达。本发明还提供用所述基因构成物转化的植物和下述方法，所述方法包括将这种构成物导入植物细胞和/或例如通过应用一种合适的刺激物，如一种有效的外源诱导剂或内源信号，在植物细胞中诱导构成物的表达。
应用于启动子的术语“诱导型”是本领域技术人员所充分理解的。实质上，受控于一个诱导型启动子的表达对所运用的刺激物的反应是“启动”或增加(刺激物可以产生于细胞内或由外部提供)。该刺激物的性质在启动子之间有所不同。缺乏适当的刺激物时，一些诱导型启动子引发小的或不可探测水平的表达(或无表达)。其它诱导型启动子在缺乏该刺激物时引发可探测的组成型表达。缺乏该刺激物时无论表达水平怎样，来自任何诱导型启动子的表达在正确的刺激物存在时均增加。优选状态是应用相关的刺激物时，表达水平以有效改变表型特性的量增加。因此可以采用这样一种诱导型(或“可开关”)启动子，在缺乏刺激物时，该启动子引发基础水平的表达，该表达水平太低，以至于不能产生所希望的表型(事实上可能为零)。应用该刺激物时，表达增加(或启动)至可以产生所希望表型的水平。
适合的启动子包括在事实上所有植物组织中均以高水平表达的花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)基因启动子(Benfey等，(1990a)EMBOJ 9:1677-1684)；在营养性顶端分生组织以及该植物机体的几种充分定位的位置(如内层韧皮部、花原基、根和茎干的分枝点)表达的花椰菜meri 5启动子(Medford,J.I.(1992)Plant Cell 4,1029-1039；Medford等，(1991)Plant Cell3,359-370)以及在花发育的很早期表达的拟南芥(Arabidopsis thaliana)LEAFY启动子(Weigel等，(1992)Cell 69,843-859)。
本发明的一个方面是按照本发明的核酸在产生转基因植物中的应用。
将选择的基因构成物引入细胞中时，必须考虑一些特定事项，本领域技术人员熟知这些。将要插入的核酸应当装配在含有将驱动转录的有效调节元件的构成物内。必定有将该构成物运送进该细胞中的可利用的方法。一旦该构成物位于该细胞膜内，将会发生或不发生整合入该内源染色体材料中。最后，就所关注的植物而言，靶细胞类型必须是细胞能够再生成整个植株的那种细胞。
用含有该序列的DNA区段转化的植物可通过植物遗传操作中早已熟知的标准技术产生。用任何合适的技术可将DNA转化入植物细胞中，所述技术例如利用其天然的基因转移能力的根癌农杆菌携带的卸甲Ti质粒载体(EP-A-270355、EP-A-0116718、NAR 12(22)8711-87215 1984)、粒子或微弹轰击(US 5100792、EP-A-444882、EP-A-434616)、微注射(WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Green等，(1987)Plant Tissue and Cell Culture,Academic Press)、电穿孔(EP 290395、WO 8706614)、其它形式的DNA直接摄入(DE 4005152、WO 9012096、US 4684611)、脂质体介导的DNA摄入(如Freeman等，Plant Cell Physiol.29:1353(1984))或涡旋方法(如Kindle,PAS U.S.A.87:1228(1990d),Oard(1991,Biotech.Adv.9:1-11)综述了植物细胞转化的物理方法。
本领域技术人员广泛采用农杆菌转化法转化双子叶植物种。最近，在几乎所有具有经济价值的相关单子叶植物中取得了常规产生稳定、可育转基因植物的实质性进展(Toriyama等，(1988)Bio/Teehnology 6,1072-1074；Zhang等，(1988),Plant Cell Rep.7,379-384；Zhang等，(1988)Theor Appl Genet 76,835-840；Shimamoto等，(1989)Nature 338,274-276；Datta等，(1990)Bio/Technology 8,736-740；Christou等，(1991)Bio/Teehnology9,957-962；Peng等，(1991)International Rice ResearchInstitute,Manila,Philippines 563-574；Cao等，(1992)PlantCell Rep.11,585-591；Li等，(1993)Plant Cell Rep.12,250-255；Rathore等，(1993)Plant Molocular Biology 21,871-884；Fromm等，(1990)Bio/Technology 8,833-839；Gordon-Kamm等，(1990)Plant Cell 2,603-618；D’Halluin等，(1992)Plant Cell 4，1495-1505；Walters等，(1993)Plant Molocular Biology 18,189-200；Koziel等，(1993)Biotechnology 11,194-200；Vasil,I.K.(1994)Plant Molecular Biology 25,925-937；Weeks等，(1993)Plant Physiology 102,1077-1084；Somers等，(1992)Bio/Technology 10,1589-1594；WO 92/14828)。特别是，农杆菌介导的转化法现在也已作为单子叶植物的替代高效转化方法出现(Hiei等，(1994)The Plant Journal 6,271-282)。
在禾谷类水稻、玉米、小麦、燕麦以及大麦中已经产生可育的转基因植株(综述文章Shimamoto,K.(1994)Current Opinion inBiotechnology 5,158-162.；Vasil等，(1992)Bio/Technology 10,667-674；Vain等，1995,Biotechnology Advances 13(4)；653-67l；Vasil,1996,Nature Biotechnology 14第702页)。
当农杆菌方法效率不高或无效时，优选微弹轰击法、电穿孔法和DNA直接摄入法。或者，可采用不同技术的组合以增强该转化过程的效率，例如用农杆菌包裹的微粒轰击(EP-A-486234)、或微弹轰击以诱导创伤然后与农杆菌共培养(EP-A-486233)。
转化之后，例如象本领域标准方法一样，可以从单个细胞、愈伤组织或叶圆盘再生植株。几乎任何植物均能够从该植物的细胞、组织和器官完全再生。可采用的技术综述于Vasil等，Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plant，第Ⅰ卷、第Ⅱ卷和第Ⅲ卷，Laboratory Procedures and Their Applications,Academic Press,1984；以及Weissbach和Weissbach,Methodsfor Plant MolecularBiology,Academic Press,1989。
一种转化技术的特殊选择将决定于其转化特定植物的效率以及用特定选择方法学实践本发明的人员的经验和喜好。很显然，对于本领域技术员来说，将核酸引入植物细胞中的转化系统的特殊选择对本发明并不重要或不是一种限制，对于植物再生技术的选择来说亦如此。
在本发明中，可通过将该核苷酸序列以有有义方向导入而达到表达。因此，本发明提供一种在植物中调节防御反应的方法，该方法包括引发或允许按照本发明的核酸在该植物细胞中表达。通常，人们希望刺激该防御反应，并且这可以通过破坏Mlo基因功能而实现。
可运用反义技术或“有义调节”(“共抑制”)而达到对靶基因表达的下调。
在运用反义基因或部分基因序列下调基因表达的过程中，将一段核苷酸序列以“反向”置于启动子的控制之下，使得转录产生与从该靶基因的“有义”链转录的普通mRNA互补的RNA。例如可参见Rothstein等，1987；Smith等，(1988)Nature 334,724-726；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4,1575-1588；English等，(1996)The Plant Cell8,179-188。反义技术也综述于Bourque,(1995)Plant Science 105,125-149，以及Flavecl,(1994)PNAS USA 91,3490-3496。
另一方法是运用以有义链方向插入的一个拷贝的靶基因的全部或部分，通过共抑制达到该靶基因表达的减少，其中有义链方向与该靶基因的方向相同。例如参见van der Krol等，(1990)The Plant Cell2,291-299；Napoli等，(1990)The Plant Cell 2,279-289；Zhang等，(1992)The Plant Cell 4,1575-1588，以及US-A-5,231,020。
不必使用与该编码序列(对于反义链是反向)相对应的完全序列。例如可使用足够长度的片段。对本领域技术人员来说，筛选各种大小的片段和从该编码序列的各种部分中筛选片断以使反义抑制的水平最佳化是一件常规之事。或许包括起始甲硫氨酸ATG密码子以及该起始密码子上游的一个或多个核苷酸是有益的。进一步的可能性是导向基因的一段保守序列，例如一个或多个基因的特征序列，如调节序列。反义构成物可能包含Mlo或同源物的3’端或5’端序列。在几个Mlo同源物存在于一个植物种的情况下，在该构成物中包括5’端和3’端非翻译序列将会增强沉默专一性。
所采用的序列可为大约500个核苷酸或更少，大概约为400个核苷酸，大约300个核苷酸，大约200个核苷酸，或大约100个核苷酸。有可能使用长度短得多的寡核苷酸，即14-23个核苷酸；虽然较长片段，且通常甚至比约500个核苷酸还长的片段在可能的情况下是优选的，例如长于约600个核苷酸，长于约700个核苷酸，长于约800个核苷酸，长于约1000个核苷酸，长于约1200个核苷酸，长于约1400个核苷酸或更多。
在用于下调靶序列表达的序列中存在完全的序列一致性可能最佳，虽然该靶序列的完全序列互补性或相似性并不重要。所用序列中的一个或多个核苷酸可以与该靶基因不同。因此，按照本发明，应用于下调基因表达中的一段序列可以是选自那些可利用的野生型序列(如基因)或通过插入、增添、缺失或置换一个或多个核苷酸产生的这种基因的突变体、衍生物、变异体或等位基因。该序列不必包括开放读框或指定一段可翻译的RNA。最好具有足够的同源性以便相应的反义和有义RNA分子杂交。甚至在所使用的序列和该靶基因之间存在大约5％、10％、15％或20％或更多错配之处，也可以有基因表达的下调。
通常，在如上所讨论的与对编码序列的改变和改变的序列的同源性相关的相似范围内，转录的核酸可代表Mlo基因的一个片段，例如包括图2所示的一段核苷酸序列或其互补序列，或可为其突变体、衍生物、变异体或等位基因。该同源性可足以使转录的反义RNA与该植物细胞内的核酸杂交，虽然不论在何处发生杂交，但所需的效果是基因表达的下调。
反义调节自身可通过在一适当构成物中运用诱导型启动子而被调节。
通过组成型表达的启动子(如CaMV 35S启动子)、组织特异性或细胞类型特异性启动子，或通过能够被一外部信号或因素激活的启动子，用该天然启动子可使构成物表达。已表明CaMV35S启动子以及水稻肌动蛋白1(actinl)和玉米遍在蛋白启动子在水稻中使报告基因高水平表达(Fnjimoto等，(1993)Bio/Technology 11,1151-1155；Zhang等，(1991)Plant Cell 3,1155-1165；Cornejo等，(1993)Plant Molecular Biology 23,567-581)。
为了在反义调节中应用，提供了包括一段与Mlo基因编码序列互补的核苷酸序列的核酸(即包括同源物)，或适用于反义调节表达的所述编码序列的一个片段。这可以是DNA，并在目的细胞中用于反义转录的一段适合的调节序列控制之下。
因此，本发明还提供赋予植物病原体抗性的方法，该方法包括在该植物的细胞内引发或允许从按照本发明的异源核酸的反义转录。
本发明还提供图2核苷酸序列或其片段、突变体、衍生物、等位基因、变异体或同源物的用途，例如本文所示或本文鉴定的任何序列，用于基因表达的下调，特别是Mlo基因或其同源物表达的下调，优选以赋予植物病原体抗性。
当靶基因的额外拷贝以与靶基因相同的方向的正向插入时，产生一系列表型，包括发生过量表达的个体和发生从靶基因不足量表达蛋白质的一些个体。当插入的基因仅为内源基因的一部分时，该转基因群体中表达不足的个体的数目增加。藉以发生有义调节、特别是下调的机制尚未理解透彻。但是，这项技术在科学和专利文献中报道甚多，并常规用于基因控制。参见例如van der Krol等，(1990)The PlantCell 2,291-229；Napoli等，(1990)The Plant Cell 2,279-289；Zhang等，1992The Plant Cell 4,1575-1588。
此外，片段、突变体及诸如此类可用于以上所描述的用于反义调节的类似范围内。
因此，本发明还提供赋予植物病原体抗性的方法，该方法包括引发或允许在该植物细胞内表达按照本发明的核酸。这可用于抑制Mlo活性。此处该产物的活性最好由于所述植物细胞内不足量表达而被抑制。
如所述的，Mlo的下调可以促使激活防御反应，这转而可以赋予或增加该植物的病原体抗性，特别是对白粉病和/或锈病(例如条锈病)的抗性。
因此，本发明还提供在植物中调节Mlo功能的方法，该方法包括引发或允许在该植物细胞内表达按照本发明的核酸，以抑制内源Mlo的表达。
可使用修饰形式的Mlo下调内源性Mlo的功能。例如可以应用突变体、变异体、衍生物等等。比如，一个mlo突变序列的高水平表达可以竞争超过内源Mlo的活性。
通过使用核酶，例如复制核酶(如锤头类)，可达到Mlo野生型活性的降低(Haseloff和Gerlach,1988,Natnre 334；585-591；Feyter等，Mol.,1996,Gen.Genet.250:329-338)。
降低植物中Mlo功能的另一种途径运用转座子诱变(0sborne等的综述，(1995)Current Opinion in Cell Biolegy 7,406-413)。通过一种“定向标记”方法已经证明基因的失活，该方法采用或者内源性可动因子或者在异种基因组中保留其迁移性的异源克隆转座子。通过使用在该插入序列和该Mlo同源物中均有结合特异性的PCR引物，可鉴定载有任何已知序列插入物的Mlo等位基因。“双因子系统(twoelement systems)”可以用于稳定失活等位基因中的该转座子。在该双因子方法中，构建携带一个非自主性转座子的T-DNA，该转座子含有插入一切除标记中的可选择或可筛选标记基因。带有这些T-DNA的植株与带有表达转座酶功能的第二T-DNA的植株杂交。对杂种双选择切除和转座子内的标记，产生具有转座的因子的F2代植株。该双因子方法对于玉米的Ac/Ds十分有益，因为转座的Ds可能与该转座酶不相连，有利于Ds插入物的异型杂交和稳定(Jones等，(1994)Science 266,789-793；Osborne等，(1995)Current Opinion in Cell Biology 7,406-413)。
基于mlo的白粉病抗性由Mlo野生型等位基因的失活而引起，导致隐性抗性表型。抑制Mlo野生型蛋白活性的物质可用于诱导该抗性表型。
诱变剂诱导的可能具有保留的残留野生型等位基因活性的mlo抗性等位基因的描述，提供这样一种重要的提示，即Mlo表达完全失活并非必需的且甚至有可能是有害的。这些等位基因未显示负面影响光合速率及产量的可探测的自发叶片坏死(Hentrich,W(1979)Arch.Zuchungsvorsch.,Berlin 9,S.283-291)。
预测Mlo蛋白通过七个跨膜螺旋而膜固定(参见例如图7)。这种结构预测已被最近对水稻和拟南芥中Mlo同源物的分析所加强。拟南芥同源物的结构预测也暗示存在七个跨膜螺旋。所述Mlo同源物的比较亦揭示；在推定的胞外噜朴环1和3中有保守的半胱氨酸残基，以及在与预测的跨膜螺旋3和4相邻接的第二胞内噜朴环中有两亲性螺旋的较高可能性。在Mol蛋白家族中的这些保守的结构基元是在哺乳动物系统中广泛描述的G蛋白偶联受体(GPCR)的痕迹。已知GSCP被配体激活并通过异三聚体G蛋白在胞内放大信号。预测Mlo激活异三聚体G蛋白的抑制性Gα亚基，由此导致尚未知的效应蛋白的下调，决没有提供对本发明任一方面的性质或范围的限制。
本文提供Mlo序列信息，使得能够鉴定Mlo蛋白功能(例如GPCP功能)的拮抗剂。Mlo的拮抗剂可以阻断其未知的真正配体对受体的激活，模拟Mlo基因中的隐性突变。这类Mlo拮抗剂可以用作例如外部施用于该植物或作物的作物保护化合物，或该化合物是通过生物学载体(例如在靶植物细胞中表达所述拮抗分子的重组感染型病毒粒子)或通过转基因途径(遗传修饰以表达该拮抗分子的植物或植物细胞)，或许在外部施用的化合物(例如玉米的GST-Ⅱ启动子-Jepson等，Plant Molecular Biology 26；1855-1866(1994))可诱导的启动子控制下，本质上为肽基内部传送的，其中所述启动子允许在表达mlo失活表型安排时间内进行控制。
可以用例如来自随机或组合化合物文库的一种测试物质，测试Mlo野生型植株的叶片片段用病原体(如白粉菌)攻击时的抗性。将分离的叶片片段测定用作标准的检测系统，来评价接种白粉菌孢子时的敏感性/抗性。可将基因型为Mlo RorⅠ的7天龄幼苗的叶片片段置于例如含有50μl琼脂的96孔微量滴定板的各个孔的琼脂上。将不同化合物以溶解于DMSO中大约1 ppm的浓度加到每孔的琼脂表面。用病原体(例如致病性强的白粉病分离菌的孢子)接种所述分离叶片片段大约七天后，通过微量滴定板中叶片片段上缺乏真菌菌丝体，可识别诱导抗性的化合物。
可用进一步的筛选以区别在该mlo途径中发挥作用的化合物和那些通过其它机制赋予抗性的化合物，或那些显示直接杀真菌毒性活性的化合物。为达到这个目的，可使用mlo抗性可能需要的基因(Ror基因)的突变体(Freialdenhoven等，(1996),The Plant Cell 8,5-14)。尽管存在mlo抗性等位基因，但这些基因的突变体赋予对白粉病侵袭的敏感性。例如，可以使用基因型为Mlo rorl的植物(野生型Mlo蛋白质和缺陷型Rorl基因)，例如以检测在Mlo Rorl基因型中诱导抗性、而在Mlo rorl基因型中显示敏感性的化合物，使得能够筛选候选Mlo拮抗剂。用叶片片段试验鉴定的测试候选化合物可在进一步的体外试验中用于大幅度减少候选化合物的数目。
候选拮抗剂的进一步筛选步骤可涉及Mlo蛋白或其片段的异源表达(例如在杆状病毒昆虫细胞系统中)，以及随后的与标记分子的结合测定。化合物与表达野生型Mlo蛋白的细胞系的特异性结合是它们的拮抗作用模式的良好指示。推断出的Mlo蛋白序列的分析已经提供了有力证据，即该蛋白通过七个跨膜螺旋锚着在该膜中，并可能代表所谓蛇根碱受体家族的一个新成员。得自在大麦、水稻和拟南芥属中鉴定的同源基因的该序列数据支持该结论。已表明七种跨膜蛋白在该杆状病毒/昆虫细胞系统中以高水平表达(每个细胞多达107个分子-Tate和Grisshamer,1996,TIBTECH 14:426-430)。由于Mlo蛋白家族似乎限于植物界，这为化合物测试提供一种低背景环境。可检测放射性或非放射性标记的候选化合物对用重组杆状病毒构成物感染后表达Mlo蛋白的Sf9昆虫细胞的特异性结合。通过载有鉴定的突变(例如表1中的突变)并导致活体抗性的突变mlo蛋白的Sf9表达，可进一步测试该结合的特异性。
因此，在各种其它方面，本发明涉及能够干扰Mlo功能(即赋予mlo突变体表型)的物质的测定、这种物质本身及其用途。
本发明还提供Mlo在鉴别和/或获得抑制Mlo功能的物质中的用途，也提供Mlo在鉴别和/或获得诱导植物病原体抗性的物质中的用途。
通过筛选技术可以鉴别按照本发明的有用因子，该技术涉及确定是否一种受测试的因子抑制或破坏Mlo功能以诱导mlo表型。候选抑制剂是结合Mlo的物质。
当然应当注意到，提到与测定和筛选有关的“Mlo”是指例如在包括水稻和小麦的其它物种中的同源物，而非仅在大麦中的同源物，还指适合的其片段、变异体、等位基因和衍生物。对一种测试物质是否能够结合该Mlo蛋白的评估不必需要使用全长Mlo蛋白。可使用适合的片段(或者适合的其类似物或变异体)。
适合的Mlo片段包括那些含有通过mlo突变等位基因(表1)鉴别的已知对Mlo功能很重要的残基的片段。同样可采用这种片段的较小片段、类似物和变异体，例如用诸如缺失人析或丙氨酸扫描技术来鉴别。
另外，能够用于破坏Mlo活性的一类因子是其肽片断。这类肽往往较短，长度可能约为40个氨基酸或更少，长度优选约35个氨基酸或更少，长度更优选约30个氨基酸或更少，更优选约25个氨基酸或更少，更优选约20个氨基酸或更少，更优选约15个氨基酸或更少，更优选约10个氨基酸或更少，或长度为9、8、7、6、5个氨基酸或更少。本发明也包括这样的肽类：它们是野生型Mlo序列的序列变异体或衍生物，但保留干扰Mlo功能的能力，例如以诱导mlo突变体表型。当包括一个或多个额外氨基酸时，这种氨基酸可以来自Mlo或可以对于Mlo是异源或外来的。肽也可以包括在一个较大的融合蛋白内，特别是当该肽融合于一段非Mlo(即异源或外来)序列时，所述序列如一段多肽或蛋白域。
可以通过化学合成全部或部分地生成肽。本发明的化合物能够按照已完善建立的、标准液相或优选固态肽合成方法轻易制备，所述方法的一般性描述可广泛获得(例如参见J.M.Stewart和J.D.Yang,Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984)；M.Bodanzsky和A.Bodanzsky,ThePractice of Peptide Synthesis,Springer Verlag，纽约(1984)；以及Applied Biosystems 430A Users Manual,ABI Inc.,Foster City，加州)；或者它们可在溶液中制备，通过液相方法或通过任何固相、液相和溶液化学的组合而制备，例如，首先完成各个肽部分，然后如果需要并合适，在除去任何存在的保护基团之后，通过相应的碳酸或磺酸或其反应衍生物的反应，引入残基X。
另一个产生按照本发明的肽基分子(肽或多肽)的便利方法是表达编码它的核酸，如本文别处探讨的，通过运用一个表达系统中的核酸来产生。这便于肽因子通过编码核酸的途径以转基因形式导入植物。如果与在使用者控制之下表达的诱导型启动子偶联，这为诱导mlo表型和病原体抗性提供了灵活性。这可以便于将干扰Mlo功能产生的副反应降低。
本发明总的方面提供能够与Mlo的相关区互作的物质的鉴定方法，该方法包括：
(a)使一种Mlo多肽或其肽片段、或其变异体、衍生物或类似物与一种测试化合物接触；并且
(b)测定所述多肽或肽与该测试化合物之间的互作或结合情况。
已发现与Mlo的相关区互作的测试化合物可如以上所讨论的检测其调节(例如破坏或干扰)Mlo功能的能力。
本发明另一个总方面提供鉴定能够在植物中诱导mlo突变表型的物质的方法，该方法包括：
(a)使植物或其部分(如叶片或叶片片段)与一种测试化合物接触；并且：
(b)测定该植物中的Mlo功能和/或病原体抗性和/或防御反应的刺激。
通过评估病原体的生长，例如白粉菌的存在或缺乏、或菌丝体生长的程度，可以确定对一种病原体的敏感性或抗性。
除一种测试化合物在植物中刺激防御反应的能力外，可以评估该测试化合物对一种多肽或肽的结合。这种测试可以平行进行，或可以在另一种测试中检测为阳性的物质上进行。
当然，本领域技术人员将会设计任何可用于比较测试测定中所获结果的适合的对照实验。
完成按照本发明的一个鉴定方法之后，可以分离和/或生产和/或使用在调节Mlo功能和/或诱导诸如对白粉病抗性的病原体抗性能力中检测为阳性的化合物、物质或分子。
本发明测定的确切形式可由那些本领域技术人员用常规技术和知识加以改变。例如，物质之间的互作可以通过用可探测标记进行标记并使其与在固相支持体上已经固定的其它物质相接触而进行体外研究。适合的特别是针对肽基物质的可探测性标记，包括可以掺入用重组法产生的肽类或多肽类中的35S-甲硫氨酸。用重组法产生的肽和多肽也可作为含有能够用抗体标记的表位的融合蛋白而表达。
根据本发明的测定也可以采取一种体内测定形式。该体内测定可在诸如酵母菌株或哺乳类细胞系的细胞系中实施，在所述细胞系中所述相关多肽或肽从引入该细胞中的一个或多个载体表达。
例如，可以将含有Mlo或公开的其肽基类似物或变异体的一个片段的多肽或肽与诸如酵母转录因子GAL 4的DNA结合域相融合。GAL 4转录因子包括两个功能域。这些域是DNA结合域(GAL4DBD)和GAL4转录激活域(GAL4TAD)。通过将这种多肽或肽与那些域中的一个融合，以及将另一多肽或肽与其相应的对应物融合，只有当两个目的多肽或肽互作时，功能性GAL 4转录因子才恢复。因此，可以通过使用一个可能与GAL 4 DNA结合位点相连接的报告基因来测定能够激活所述报告基因转录的所述多肽或肽的互作。这种测定形式描述于Fields和Song,1989,Nature 340；245-246。这种类型的测定形式在哺乳类细胞和酵母中均能使用。在本领域可获得DNA结合域与转录激活域的其它组合并优选之，如LexA DNA结合域和VP60转录激活域。
在寻找与Mlo互作的肽或其它物质时，可将该Mlo多肽或肽用作与(例如)LexA DNA结合域的融合体，以及测试多肽或肽(例如一个随机或组合肽文库)与(例如)VP60的融合体。报告基因表达的增加(例如在β-半乳糖苷酶的情况下为蓝色增强)是存在与Mlo互作的肽的结果，其互作是半乳糖苷酶基因的转录激活所需要的。
本发明测定中的测试物质或化合物的加入量通常根可以据所用化合物类型通过尝试法来决定。典型作法是，可使用约0.001 nM-1 mM或更高浓度的假定抑制剂化合物，例如0.01 nM-100 μM，如0.1-50μM，如约10μM。当肽是该测试物质时可使用更高浓度。甚至一个具有微弱效应的分子对于进一步的调查和发展可以是领头化合物。
可使用的化合物可以是在药物筛选程序中使用的天然或合成化学化合物。也可以使用含有几种鉴别或未鉴别成份的植物提取物。针对Mlo或其一个片段的抗体形成另一类假定抑制剂化合物。可以鉴定候选抑制剂抗体的特征并且测定它们的结合区，以便提供负责破坏该互作的单链抗体及其片段。其它候选抑制剂化合物可以基于模拟一个多肽或肽片断的三维结构并使用合理的药物设计，以为潜在抑制剂化合物提供特定的分子形状、大小和电荷特征。然而，值得注意的是，组合文库技术提供一个有效途径，以测试潜在的大量不同物质与一种多肽互作和/或调节该多肽活性的能力。其中，对于所有形式的天然产物、小分子和肽，这类文库及其用途是本领域已知的。在某些情况下，可优选使用肽文库。
鉴别调节或影响Mlo功能的物质或因子之后，可进一步调查该物质或因子。另外，还可以生产它和/或将其用于制备，即生产或配制一组合物以便在植物中诱导病原体抗性。可将这些应用于植物，以例如诱导诸如白粉病抗性的病原体抗性。本发明的另一方面提供在植物中诱导病原体抗性的方法，该方法包括将这种物质应用于该植物。如所提到的，通过从编码核酸进行表达，可将肽基分子以转基因方式应用于植物。
可将如本文公开的能够在植物中调节或干扰Mlo功能、诱导病原体抗性的多肽、肽或其它物质或编码这种肽基分子的核酸分子以试剂盒方式提供，例如封闭在合适的保护其内容物免遭外界环境影响的容器内。这种试剂盒可以包括使用说明。
本发明的其它方面和实施方案对于那些本领域技术人员来说是显而易见的。本发明现在将通过参考以下附图的描述而举例说明：
图1.Mlo的定位克隆。该Mlo基因座已用形态学标记、RFLP标记和AFLP标记在大麦第4染色体长臂上以增强的精确度作图。该图的上面部分代表这些标记相对于Mlo的遗传连锁图。除通过两点估计来计算的AFLP标记之间的遗传距离之外，所有的遗传距离以基于多点连锁分析的厘摩(cM)表示。形态学标记图谱(Jφrgensen,1977)将Mlo定位于距毛叶鞘(Hs)和光滑鞘/穗(gsl)20 cM以上的距离处。RFLP标记图谱基于对来源于Carlsberg Ⅱ Mlo Grannenlose Zweizeiligemlo-11杂交的257个F2代个体的分析。以前发表的该相同杂交的RFLP图谱(Hinze等，1991)仅仅以44个F2代个体为基础。该基因被界定在以标记bAO11和标记bAL88为边界的2.7cM的区间。按实验方法中的描述鉴定AFLP标记并为其作图。它们对于Mlo的遗传距离以IngridMlox BC7Ingrid mlo-3杂交为基础。AFLP分析的重要结果已经鉴别出两种标记：Bpm2和Bpm9，限定一个0.64 cM的区间，该区间包含该Mlo基因座和在大于4000次减数分裂事件基础上的一个与Mlo共分离的标记(Bpm16)。位于端粒方向距Mlo 0.1cM的Bxm2标记来源于BAC F15模板DNA(参见下文)。一个含有该共分离标记Bpm16和两个侧翼基因座(Bpm2和Bpm9)的YAC克隆YAC YHV303-46示于该图的中间部分。标记Bpm9的位置只在该YAC克隆内粗略估计，如箭头所示。BACF15的插入片断代表这个如该图较下面部分所示的YAC的60 kb亚片段。在BAC F15中鉴别AFLP标记Bpm2之后，发现标记Bxm2并将其定位于在端粒反向距Mlo 0.1cM处。标明了AFLP标记Bpm2、Bpm16和Bxm2(跨越大约30 kb的区间)的大致物理位置以及一些偶尔发生的限制性位点的位置。BAC F15 DNA示意图下面的虚线表示已建立的最大的DNA序列毗连群的位置。该图的底部图示Mlo基因的结构。外显子以黑框重点标明。为11个检测过的mlo等位基因标明突变事件的位置。在它们的核苷酸序列中携有缺失的突变等位基因用Δ符号标记；其余的突变等位基因代表在每种情况下导致氨基酸改变的单个核苷酸置换。
图2显示根据本发明的Mlo编码序列和所编码的氨基酸序列。显示由Ingrid Mlo的RT-PCR产物的DNA序列预测的氨基酸序列。核苷酸编号根据翻译起始位点而定。
图3为llo转录物积累的Norrhern印迹分析。分离一个野生型(栽培品种Ingrid Mlo)和两个突变(BC Ingrid mlo-1、BC Ingrldmlo-3)栽培品种七天龄未感染的大麦初生叶的总RNA(20μg)和poly(A)+RNA(5μg)，在1.2％甲醛凝胶上分离并转至硝酸纤维膜(Hybond)上。用来自Ingrid Mlo的放射标记的全长RT-PCR产物，在严格条件(Sambrook等，1989)下探测该滤膜(图7)。只在含有poly(A)+RNA的泳道中检测到清晰信号。该信号对应于大约2kb的大小。
图4为来源于mlo异源等位基因杂交的基因内重组体的Southern印迹分析。通过Southern印迹分析确定或者敏感性F2个体或者纯合敏感性和纯合抗性后代的在相反的两侧邻接Mlo的两个RFLP标记的等位基因。按照标准方法(Sambrook等，1989)，用PstⅠ(A)或Hae Ⅲ(B)消化所述个体的植物DNA(10μg)，并与放射性标记的RFLP标记WG114(上面一组；定位于以着丝粒方向距Mlo 3.1cM；参见图1)和ABG366(下面一组；定位于以端粒方向与Mlo相距0.7cM；参见图1)杂交。
A．检测亲本系mlo-8和mlo-1以及来源于两个敏感性F2代植株(命名为1和2)的两个纯合敏感性后代(S,Mlo Mlo)和两个抗性后代(R,mlo mlo)的DNA。泳道S和泳道R中的DNA代表从通过所述敏感性F2代个体1和2自交获得的F3代家族筛选的F3代个体。注意在这部分策略中，预期敏感性F2代个体在Mlo处为杂合的。用无毒mlo分离菌K1接种七天之后评价感染表型。来自这个异源等位因素杂交的第三个敏感性个体的DNA(参见图7)不包括在该图中。
B．检测亲本系mlo-5和mlo-1，以及来源于七个敏感性F2代植株(定义为1-7)的七个敏感性纯合后代(S,Mlo Mlo)和七个抗性后代(R,mlo mlo)的DNA。泳道S和泳道R中的DNA代表从通过所述敏感性F2代个体1至7自交的F3代家族筛选的F3代个体。只在F2代中从这种异源等位基因杂交的另外两个敏感性个体(8*和9*)中分析DNA。
图5显示覆盖大麦Mlo基因并通过与一个大麦基因特异性探针交叉杂交而分离的一个水稻同源物的基因组序列的序列比较。上面一行显示大麦Mlo基因纽DNA序列(外显子序列下面划线)。下面一行显示含有水稻Mlo同源物的基因组序列。
图6显示携有大麦Mlo基因并通过与一个大麦基因特异性探针交叉杂交而分离的一个大麦同源物的基因组序列的序列比较。上面一行显示大麦Mlo基因组DNA序列(外显子序列下面划线)。下面一行显示含有该大麦Mlo同源物的基因组序列。
图7为大麦Mlo cDNA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。该核苷酸序列和该推导的氨基酸序列以RT-PCR和用栽培品种Ingrid Mlo的RNA进行试验而获得的RACE的组合数据为基础。终止密码子用星号标记，推定的多腺苷酸化信号下面以划线表示，探测到的RACE产物末端以该序列上面的箭头表明。通过与相应的基因组克隆相比较而鉴别的内含子的位置用该核酸序列下面的三角形标记。根据MEMSAT算法(Jones等，1994)的六个预测的跨膜螺旋示于灰色框中。一个假定的核定位信号(K-K-K-V-R)和该蛋白羧基端一半的酪蛋白激酶Ⅱ位点(S-I-F-D)以粗体表示。
图8显示水稻(Oryza sativa)同源物的基因组序列，包括编码序列和侧翼序列。
图9显示大麦(Hordeum vulgare)同源物的基因组序列，包括编码序列和侧翼序列。
图10显示水稻同源物的cDNA序列。
图11显示大麦同源物的cDNA序列。
图12显示拟南芥同源物的cDNA序列。
图13显示水稻同源物的氨基酸序列。
图14显示大麦同源物的氨基酸序列。
图15显示拟南芥同源物的氨基酸序列。
图16显示Mlo、大麦、水稻和拟南芥属同源物氨基酸序列的相当框(pretty box)。
这份资料中所有提及的资料均通过引用结合到本文中。
实施例1一大麦Mlo的克隆与Mlo紧密连锁的AFLP标记的靶向搜寻
试图构建一个局部高分辨的遗传图谱来协助提高Mlo周围DNA标记密度的努力。另一种可能性可能是扩大鉴定的Carlsberg Ⅱ Mlo xGrannenlose Zweizeilige mlo-11杂交群的大小(Hinze等，1991)，但感觉到从现有的BC mlo品系及其回归亲本系开始建立的高分辨图谱具有优势。重要的是，与该回归亲本系相比较，该BC系的供体亲本代表一种不同的遗传背景。在该方面，搜寻连锁的AFLP标记可与从相同遗传系之间的杂交产生一个大作图群体平行开始。另外，从CarlsbergⅡ Mlo x Grannenlose Zweizeilige mlo-11杂交(Hinze等，1991)所测定，以该BC系为基础的杂交使得能够在Mlo附近检测DNA标记的共线性。对于新的杂交，使用已经经过七次回交而进入遗传背景Ingrid中的一个mlo-3回交(BC)系(BC7 Ingrid mlo-3；Hinze等，1991)。该系以前鉴定为在大麦第4染色体上携有一个相对小的基因渐渗DNA区段。另外，供体亲本系Malteria Heda mlo-3与来自回归亲本Ingrid的DNA相比显示多态性，大多数鉴别的RFLP基因座与Mlo连锁。因此，通过仅在来自品系Ingrid Mlo和BC7 Ingrid mlo-3的两个DNA模板之间搜寻多态性，我们希望以靶定的方式用AFLLP提高Mlo周围的DNA标记的密度。
将相同的两系杂交，为DNA标记的高分辩作图建立一个分离群，形式上代表一个eigth回交。用分离菌K1(在Ingrid Mlo上有毒，而在BC7 Ingrid mlo-3上无毒)进行白粉菌接种之后，评价F2代个体的mlo抗性。开始时，用侧翼RFLP标记只分析F2代(77个个体)的一小部分的重组事件。与以前所分析的杂交Carlsberg Ⅱ Mlo x GrannenloseZweizeilige mlo-11(Hinze等，1991)相比较，对四个已鉴别的重组体(命名为8-32-2、7-38-4、1-34-1和1-49-4)的分析表明在这种杂交中标记顺序的共线性。使77个F2代中显示敏感表型和所测试的侧翼DNA标记位点(bAO11、bAL88/2和bAP91；Hinze等，1991)杂合性的几株幼苗生长成熟，以提供在F3代中Mlo/mlo-3分离的进一步的自交种籽材料。收集叶片材料，总计从来源于或者自交F2代或者F3代的2,026个个体中进行高分辩标记作图。
通过分别测试延伸进基因组序列至核苷酸位置+2和+3位的所有可能的PstⅠ/MseⅠ引物组合(1024个)，鉴别AFLP标记候选者。同样地，分析了几乎1,900个Eco RⅠ/MseⅠ引物组合(+3/+3)。该分析中包括4种DNA模板：Ingrid Mlo、BC7 Ingrid mlo-3、两个表型为mlo抗性的F2代个体的DNA库、以及九个表型为敏感性的F2代个体的DNA库。作为DNA库包括在AFLP搜索中的所述抗性F2代个体和敏感性F2代个体选自以上所提及的77个F2代分离体的RFLP分析。该库中收集到的F2代DNA使得我们能够控制在来自亲本的模板DNA之间检测到的候选物多态性是否就是F2代中的可遗传形状。所有已鉴别的AFLP候选标记用8个DNA模板重新检查，这些模板是：Ingrid Mlo、BC7Tngri mlo-3、来自根据K1接种试验表型为纯合敏感性(Mlo Mlo)的三个F3代家族的个体的DNA库、三个抗性F2代个体的DNA。以该筛选程序为基础，证实了总共18个PstⅠ/MseⅠ和20个Eco RⅠ/MseⅠ的引物。
鉴别的AFLP标记数目使其可用于在Mlo周围的RFLP图谱的基础上将它们首先粗略地定位至标记区间。人们希望，该法应该能够评估以前鉴别的靠近Mlo的RFLP区间之中的AFLP的分布，以及能够选择一对侧翼AFLP标记，用所述侧翼AFLP标记能够在所述2,026个分离体中鉴别重组体。对于AFLP定位，我们使用那些已用RFLP标记鉴别过的、以上所提及的来自Ingrid Mlo x BC7 Ingrid mlo-3杂交的77个F2代分离体的小样本之外的四个重组体(两个重组体在bAP91-bAL88区间中，一个在Mlo-bA011中，另一个在bA011-ABG 366中)。总共发现18个AFLP定位于一段包括Mlo的大约3.5cM的遗传距离内。Mlo周围的一个高分辩AFLP图谱的构建
运用一种两步方法构建该高分辩AFLP图谱。首先，在Mlo相对两侧的两个AFLP标记之间筛选所有2,026个分离体的重组事件，之后仅仅使用少数鉴别的重组体在该3.5cM的靶区间内对所有鉴别的AFLP作图。选择AFLP标记Bpm1和Bpm9，在Ingrid Mlo和BC7 Ingrid mlo-3中检测每种等位基因的DNA片段，它们定位于Mlo两侧，以筛选所述分离体DNA模板的重组事件。或者，用侧翼RFLP标记bAO11和bAL88或许已进行重组体进行搜寻。但是，虽然对于两个标记来说，向切割扩增多态位点(CAPS)的转变是成功的，但面临从粗纯化基因组DNA同时表现这两个基因座等位基因的困难。用AFLP标记Bpm1和Bpm9同时筛选总共2,026个个体(F2代或F3代的分离体)，鉴别出98个重组体。之后用所述重组体的98个DNA模板的每一个进行AFLP分析，以鉴别每个鉴别的AFLP基因座的等位基因。所述重组体已经自交，用每个重组体家族的至少25个个体实施白粉病分离菌K1的接种试验，以推导Mlo基因座处的上一代的等位基因。所获数据使得能够在大于4,000次减数分裂事件的基础上在Mlo附近构建一个高分辩图谱以及通过两点评估得到的至少0.025cM的分辨率。重要结果是鉴别与Mlo(Bpm16)共分离的一个DNA标记以及分别在0.25 cM和0.4 cM距离处的两个侧翼标记(Bpm2和Bpm9)(图1)。一个大的插入大小的大麦YAC文库的构建，含有Bpm16的YAC的分离，以及Mlo的物理界定
遗传学证据表明，mlo抗性归功于在Mlo野生型等位基因功能的丧失。因此，决定在载体pYAC4中建立一个来自栽培品种Ingrid Mlo大插入大小的YAC文库(Burke等，1987；Hieter,1990)。根据Siedler和Graner(1991)描述的修改方法，以毫克级的量从五天龄幼苗的叶肉原生质体制备适合YAC克隆实验的兆碱基DNA。在存在Eco RⅠ甲基转移酶的情况下用Eco RⅠ部分消化该DNA，以便制备性脉中电场凝胶电泳(PFGE)之后获得在大小范围为500-600 kb的DNA片段。与用Eco RⅠ消化的pYAC4连接之后，将该DNA转化进酵母菌菌株AB1380中，并在缺乏色氨酸和尿嘧啶的固化合成型完全培养基(Sherman等，1986)上筛选携带重组pYAC4 DNA的克隆。在Southern实验中，用标记的大麦基因组DNA测试40个随机挑选的酵母克隆中大麦DNA的存在。在PFGE分离之后，发现所述YAC插入片断的大小在500 kb和800kb之间变动。预期单独的重组YAC克隆上出现平均为0.2 cM的遗传距离。已经产生了总共～40,000个代表4个大麦基因组等价物的克隆。
用与Mlo共分离的标记Bpm16已经分离出四个YAC克隆(命名为303A6、322G2、400H11和417D1)。通过PFGE测定的其插入片断大小分别为650 kb、710 kb、650 kb和820kb。AFLP分析已经表明,这些克隆之中的三个(303A6、322G2和417D1)还含有两边侧翼标记基因座，而克隆400H1只含有基因座Bpm16和Bpm2。这些发现有力地提示，Mlo基因已被物理界定在重组YAC克隆303A6、322G2和417D1上。
选择YAC 303A6进行实验，将其亚克隆进含有一个唯一Eco RⅠ位点的BAC载体pECSBAC4中(Shiznya等，1992；载体pECSBAC4由Frjters和Michelmore所描述，1996；已提交)。用Eco RⅠ部分消化该克隆的总酵母DNA，以获得平均大小为50 kb的DNA片段，并将其连接进用Eco RⅠ消化并去磷酸化的BAC载体中。通过影印菌落杂交(replica colony hybridization)实验，鉴别在pECSBAC4中含有YAC303A6来源DNA的细菌菌落。含有一套菌落的膜与标记的酵母AB1380DNA相杂交，而该套影印物与标记的PFGE纯化的YAC303A6 DNA相杂交。随后在菌落杂交实验中，用克隆的108 bp的PstⅠ/MseⅠ基因组Bpm16片段作为探针，鉴别含有AFLP基因座Bpm16的重组BAC克隆。
挑选一个含有～60 kb插入片断的BAC克隆BAC F15进行深入研究。发现该重组BAC克隆还含有AFLP标记基因座Bpm2，而不含Bpm9。从这点来说，BAC F15插入片断DNA表明在端粒方向成功地物理界定，但是否该插入片断在着丝粒方向含有邻接序列仍是一个悬而未决的问题。在Bpm16和Bpm9之间构建一个BAC毗连群的取代做法是，选择从BAC F15挑选开发多态性标记。在亲本系Ingrid Mlo和BC7 Ingridmlo-3之间鉴别出一个等位基因的XbaⅠ/MseⅠ多态性(命名为Bxm2)。
对在含有Mlo的区间Bpm2-Bpm9内携有重组事件的25个重组个体所进行的分析，使得能够将Bxm2在着丝粒方向定位于距Mlo 0.1cM的地方。只在Bpm9-Mlo区间中的16个现有重组体的4个中发现在Bxm2和Mlo之间显示重组事件，而在Mlo-Bpm2区间中的9个重组体中均没有发现。可以得出结论：Mlo已被物理界定在标记基因座Bpm2和Bxm2之间的BAC 15上(图1)。Mlo基因和mlo突变体的鉴别
在鉴别和展示标记Bxm2之前，开始一项随机测序计划以确定BACF15的～60 kb插入片断的序列毗连群，以便在端粒方向界定该基因。同时，产生物理图谱(图1)。该物理图谱表明，侧翼标记Bpm2和Bxm2物理上分开～30 kb。运用STADEN程序包的UNIX版本搜寻所述序列毗连群中的高编码机率的区域。只有一个几乎为6 kb、包括共分离标记Bpm16的序列毗连群显示具有广泛的高编码机率区。
使用一系列推导自显示高编码机率区的引物，用来自栽培品种Ingrid Mlo的叶片总RNA进行RT-PCR反应，各获得一独特的扩增产物。分析最大的RT-PCR产物序列，显示出一个单独的1,602 bp的广泛开放读框(图2)。所推导的假定533个氨基酸的蛋白质具有60.4kDal的分子量。该～1.7 kb的RT-PCR产物被用作杂交探针，探测到一个单独的～1.9 kb长的RNA转录物(图3)。对比该基因组序列和最大的RT-PCR片段，揭示出12个外显子和11个内含子，每个均与特征性的剪接位点序列相邻接(图1)。
由于Bpm16标记位于上述基因(外显子11)的3’端并与Mlo基因座共分离，我们开始对各种可得到的诱变剂诱导的mlo抗性等位基因进行直接PCR测序。我们鉴别了导致该野生型序列单个氨基酸改变、缺失或移码的15个受测试突变等位基因核苷酸变动中的14个(表1)。我们怀疑突变等位基因mlo-2位于启动子序列或5’非翻译序列之内。该区很难通过直接PCR测序法从基因组DNA模板测序，但是用一系列嵌套引物的实验可能解泱这个问题。总之，来自各种突变mlo系及其相应的Mlo野生型栽培品种的基因组的比较性测序，提供了Mlo已被鉴别的有力证据。基因内重组体
目的是为不依赖于通过转基因大麦植株的互补实验而分子分离Mlo提供一系列证据。我们选择开发一个异常的遗传学工具，以确认已鉴别的基因代表Mlo。原因在于如果在上述基因中观察到的突变引起对白粉病真菌的抗性，则突变等位基因位点之间的重组事件应当恢复野生型序列。预测那些基因内重组体在白粉菌侵袭时会显示敏感性。
设计一个涉及mlo抗性等位基因mlo-1、mlo-5和mlo-8的杂交策略。所述突变等位基因源于Haisa(mlo-1)和CarlsbergⅡ(mlo-5和mlo-8)的遗传背景。接表2所示进行突变体之间的杂交，每种情况产生至少10株F1代植株。通过白花授粉获得F2代群体。用在每种亲代Mlo野生型栽培品种上有毒性的白粉病分离菌K1接种之后，筛选F2代幼苗中罕见的敏感性个体。以～6×10-4的频率鉴别敏感性F2代个体。相对而言，如果来自每个所述mlo突变体自交物的相当数目的后代被检测出对K1的抗性，则没有鉴别出敏感性幼苗。这个发现有力地表明，来自所述突变体之间杂交的大多数敏感性个体不是由于所述突变mlo等位基因的自发回复事件引起的。
在F3代家族中自交之后，测试敏感性F2代个体的遗传性。每个F2代个体分均离出敏感性F3代个体和抗性F3代个体，表明在F2代中赋予抗性/敏感性的等位基因的杂合性。通过F3代个体的自交及其后只检测到敏感性个体的F4代家族的鉴别，分离出大多数敏感性F2代个体的纯合敏感性F3代后代。
使用已知在Mlo基因座两例紧密连锁(＜3cM)的RFLP标记(图4)，对敏感性个体进行分子分析。RFLP标记WG114定位在相对于Mlo的着丝粒方向，标记ABG366定位在端粒方向。显示突变体间的杂交mlo-8x mlo-1(A)和mlo-1×mlo-5(B)的检测到的RFLP等位基因。从或者敏感性F2代个体(以*表示)或者得自自交敏感性F2代个体的纯合敏感性(S)F3代后代和纯合抗性(R)F3代后代中分析DNA。
来自mlo-8×mlo-1杂交(图4)的敏感性F2代植株#1的纯合敏感性F3代后代揭示，WG114等位基因来源于以着丝粒方向紧接Mlo的mlo-1亲本，而ABG366等位基因来源于相对Mlo而言是端粒方向的mlo-8亲本。相反，来自杂交F2代植株#1的纯合抗性F3代后代只揭示来源于亲本mlo-1的侧翼标记等位基因。该发现强烈暗示，F2代植株#1中的敏感性由一条染色体前面的减数分裂中的一个交换型重组引起，这导致Mlo野生型等位基因的恢复，而个体1中的第二条F2代染色体含有一个在功能上未改变的mlo-1等位基因。来自敏感性F2代植株#2的纯合敏感性F3代后代的该RFLP基因座的等位基因型与以上所描述的#1个体的一致。但是，来自该个体的纯合抗性F3代后代的侧翼标记等位基因在两种情况下均来源于mlo-8亲本。得出的结论是，一个交换型重组再次地在敏感性F2代个体#2中恢复一个Mlo野生型等位基因。
从杂交mlo-1×mlo-5回收九个敏感性F2代个体(图4)。对敏感性F2代个体#1至#7的纯合敏感性F3代后代和纯合抗性F3代后代均在DNA水平上作了分析。注意到在个体#8和#9(用*标明)的情况下，只分析了来自杂合敏感性F2代个体的DNA。观察到下列关于侧翼RFLP基因座的等位基因图型：(ⅰ)纯合敏感性F3代后代在Mlo的两侧显示或者仅仅来自mlo-1亲本(个体#1、#3、#6、#7)的基因座WG114和ABG366的等位基因型，或者仅仅来自mlo-5亲本(个体#2、#4、#5)的两个基因座的等位基因型。(ⅱ)相反，纯合敏感性F3代后代显示或者仅仅均来自mlo-5亲本(# 3、#5、#6号)的两个基因座的等位基因型，或者它们在Mlo两侧显示不同的等位基因型(个体#1、#2、# 4、#7)。(ⅲ)在两侧具有不同等位基因型的纯合敏感性F3代后代在着丝粒方向含有来自mlo-1的WG114等位基因，在端粒方向含有来自mlo-5的ABG366等位基因。(ⅳ)杂合敏感性F2代个体#8仅揭示紧接Mlo的两侧来自亲本mlo-5的等位基因。杂合敏感性个体#9揭示来源于亲本mlo-1以及亲本mlo-5的着丝粒方向的等位基因，而在端粒方向只检测到mlo-5来源的等位基因。对该数据的综合解释暗示，F2代个体#1、#2、#4、#7及#9中的敏感性由恢复Mlo野生型等位基因的一个交换型重组引起。非交换型重组有可能已经在个体第# 3、#5、#6和#8中恢复Mlo野生型等位基因。
所有分离的敏感性F2代个体或纯合F3代后代的检测到的侧翼RFLP等位基因汇编示于表3中。注意到杂交mlo-8×mlo-1的个体#3未示于图4。该汇编揭示，(ⅰ)发现交换型重组(CO)和非交换型重组(NCO)的比率为7∶5，(ⅱ)交换型重组以单向决定，以及(ⅲ)未观察到具有与亲本mlo-1连锁的RFLP等位基因的NCO重组体。
将分离自异源等位基因mlo杂交的CO型基因内重组体用于测试是否该Mlo候选基因的野生型序列已被恢复。对于三个相关的等位基因mlo-1、mlo-5、mlo-8，已鉴别出等位基因候选突变位点(表1和表4)。对来源于异源等位基因杂交mlo-1×mlo-8和mlo-1×mlo-5的敏感性基因内重组体的基因组DNA的直接PCR测序，揭示野生型序列的恢复(表4)。该观察有力地暗示，基因内交换事件在前一种杂交中发生于核苷酸-1和+483之间，在后一种杂交中发生于核苷酸+3和+483之间(根据翻译起始位点)。因此，对来自两种异源等位基因杂交的7个基因内重组体的分析，提供以上所述的候选基因代表Mlo的最终证明。实施例2-该鉴别的Mlo基因的同源物
在Oryzae Sativa(水稻)和拟南芥的现有表达序列标记(EST)数据库中检索同源物的蛋白序列。鉴别了5个拟南芥属的cDNA克隆，其推导的氨基酸序列显示与Mlo蛋白的基本同一性。值得注意的是cDNA克隆205N12T7，它揭示1.2 e-45的机率。另外，在水稻(OSR16381A)中发现至少一个重要的同源物。
已经用含有Mlo的一个标记的大麦基因组片段筛选一个水稻BAC文库(Wang等，1995)。分离出一个含有～23 kb插入片断的BAC克隆。之后的亚克隆使得能够分离一个显示与该大麦Mlo基因探针强杂交的2.5 kb PatⅠ水稻基因组片段。对该片段的DNA测序揭示出大麦Mlo基因外显子序列内明显的DNA序列相似性(图5)。
最后，用一个含有Mlo的标记的大麦基因组片段分离出一个来源于栽培品种Igri(Stratagene)的13 kbλ基因组大麦克隆。来自亚克隆的2.6 kb SacⅠ片段的核苷酸序列再次揭示与该Mlo基因的广泛序列相似性(图6)。该大麦Mlo同源物在该基因组中的位置不在BACF15 DNA中。
总之，具有Mlo同源物存在于单子叶植物种和双子叶植物种中的结论性证据。讨论
任何关于Mlo和mlo的核酸和多肽作用模式的推究都不应当对本发明任何方面或实施方案的性质或范围予以限制。
在植物中，病原体抗性常常由显性抗性基因所决定，假定其产物识别病原体来源的无毒性基因产物。这种病原体防御的模式遵从Flor的基因对基因假说(Flor,1971)。最近，已经在分子水平上分离出几个“基因对基因”类型的抗性基因(Martin等，1993；Bent等，1994；Jones等，1994,Mindrinos等，1994；Whitham等，1994；Grant等，1995；Lawrence等，1995；Song等，1995)。令人惊奇的发现是，所推导出的蛋白质享有重要的类似结构域，虽然它们触发对诸如病毒、真菌和细菌的病原体的抗性反应(Dangl,1995；Staskawicz等，1995)。所分离的基因编码的蛋白或者含有一富含亮氨酸区(LRR)，有或无附加的预示配体结合和蛋白-蛋白互作的核苷酸结合位点(NBS)；或者所分离的基因编码一个简单的丝氨酸/苏氨酸激酶。LRR与该激酶域的结构组合在从水稻Xa21抗性基因(Song等，1995)推导出的蛋白质中已有报道。在“基因对基因”防御中的抗性基因结构相似性得出似乎存在一个普通的潜在抗性机制。
由该Mlo基因的隐性抗性等位基因所介导的抗性在许多方面不同于“基因对基因”抗性(见上文的介绍性描述)。此处所描述的该Mlo基因的分子分离和各种突变诱导的mlo等位基因的测序，证实以前来自突变研究和孟德尔遗传研究相结合的解释(Hentrich,1979；Jφrgensen,1983)。得出结论：该Mlo基因座的缺陷型等位基因介导针对病原体(诸如白粉病病原体)的广谱抗性。这与所涉及为品种特异性的抗性基因所提出的一种病原体来源产物的特异性识别事件相悖。
mlo等位基因的多效作用为所观察到的广谱抗性反应的分子概念的发展提供了一些线索。
首先，无菌生长的mlo植株以高频率显示在叶片表皮细胞中自发形成细胞壁敷着(cell wall apposition)(CWA)(Wolter等，1993)。那些CWA通常是对病原体企图直接从该真菌附着胞下面穿入所作反应而形成的。认为CWA形成对抗病原体入侵的一个物理障碍，并被重复牵涉于mlo介导的抗性中(Baylers,1990)。
其次，在一个较晚阶段，这些植株大范围地生成可测的叶片坏死斑。已经用独特收集的95个化学性诱导的mlo等位基因对这种自发的叶片坏死反应做了广泛研究(Hentrich,1979)。这些等位基因被归入当感染九个白粉病分离菌混合物时还显示一种逐渐不同的感染表型的一类中。那些引起中间感染表型(即接种时形成可观数量的形成孢子的真菌菌落)的mlo等位基因未显示可测的自发叶片坏死，而最具抗性效应的一类等位基因却在缺乏该病原体的情况下显示显著的坏死。因此，有确凿的证据证明，前一类mlo等位基因保留残留的野生型等位基因活性，且那些等位因基似乎未显示出可测的自发叶片坏死。
第三，在无霉病条件下生长的mlo幼苗中已经观察到防御相关基因的组成型表达-在10-11天龄的初生叶中；这包括PR-1家族、几丁质酶和过氧化物酶的基因。
我们已表明，在防御相关基因开始组成型表达开始(10-11天龄的mlo幼苗)之后，当将滑石粉和孢子以1∶1的混合物喷洒(aviblow)至mlo大麦植株叶片上时，大麦中的mlo赋予对不同类型条锈菌(Puccinia struciformis)增强的抗性。
因此，似乎多个防御相关的反应在mlo植物中以组成型形式表达。
这些事件的短暂关系是十分有趣的：组成型防御相关转录物的开始积累在11天龄的幼苗中可测到，并且在CWA形成之前，在CWA形成之后出现大范围的可见叶片坏死。然而，重要的是，mlo抗性能够早在5天龄幼苗中通过试验检测到，并在这个时间有完全的功能。我们总结为：该Mlo蛋白在植物防御中具有负调节功能，并且具有缺陷蛋白的植物被“引发”开始防御反应。
Mlo的推导氨基酸序列未揭示出与至今所描述的任何植物抗性基因有明显的同源性，运支持存在独特分子抗性机制的观念。该Mlo基因也未显示与各种数据库中任何已鉴定的植物或哺乳动物基因的序列有显著相似性。但是，在来自水稻和拟南芥的EST和基因组数据库中已鉴另出高度显著的同源序列(表5和图5)。这强烈地暗示该Mlo蛋白代表一个新蛋白质家族的成员。在外显子12中发现一个假定的核定位基序(NLS)，显示该蛋白的核定位(KEKKKVR；Nigg等，1991)。该基序的重要性由位于NH2-末端方向的14个氨基酸的一个酪蛋白激酶Ⅱ基序(SIFD；Rihs等，1991)所支持。功能测试可以检查该Mlo蛋白的假定亚细胞定位。
在其它植物种中也描述了其中对病原体的防御反应似乎是组成型表达的突变(Walbot等，1983；Pryor,1987；Jones,1994)。已经提示，命名为损伤模仿体(Les)或坏死型突变体(nec)的这类突变体影响对植物防御反应的控制。在拟南芥中已系统分析了隐性遗传的损伤模仿型突变体(Greenberg和Ausubel；1993；Dietrich等，1994；Greenberg等，1994；Weymann等，1995)。所影响的基因已命名为acd(加速型细胞死亡；acd1和acd2)或lsd(刺激抗病反应的损伤；从lsd1至lsd7)。
在病原体不存在时，每个突变体显示诸如植物细胞壁修饰和防御相关基因转录物积累的HR特征。acd2突变体的叶片已经显示积累高水平的水杨酸和拟南芥属的植物抗毒素、camelexin(Tsuji等，1992)。重要的是，acd突变体和lsd突变体均显示对细菌(P.syringae)和真菌(P.parasitica)病原体的抗性提高。lsd1突变体除外，因为它在一种预损伤状态中赋予显著的病原体抗性，与只在损伤阳性状态显示病原体抗性提高的其它缺陷性基因座相反。在该方面，lsd1与大麦中的mlo突变体相似。lsd1的另一个显著特征是其损伤扩散的不确定性，与损伤生长是确定的其它突变体相反。实验方法植物材料
在该研究中所分析的mlo突变体及其母本变种的汇编已由Jφrgense(1992)[mlo-1、mlo-3、mlo-4、mlo-5、mlo-7、mlo-8,mlo-9、mlo-10、mlo-11]及Habekuses和Hentrich(1988)[栽培品种Plena 2018(mlo-13)、2034(mlo-17)、2118中的突变体]进行了描述。由于突变体2118迄至尚未分配一个等位基因号，因此我们按照GrainGene数据库(gopher：∥greengenes.cit.cornell.edu:70/77/.graingene.ndx/index?mlo)中目前的编号，在此定义该等位基因为mlo-26。
高分辩图谱以Ingrid Mlo×BC7 Ingrid mlo-3之间的杂交为基础。使F1代植株自交，产生一个大约有600株植株的F2代分离群。使在Mlo两侧显示RFLP标记杂合性的、表型为敏感性的F2代植株自交，并在F3代中产生进一步的分离体用于高分辩作图。白粉病感染测试
真菌分离菌K1(Hinze等，1991)对该项研究所采用的所有携有该Mlo等位基因的栽培品种均有毒性，对所有测试的mlo基因型均无毒性。按以前的描述方法(Freialdenhoven等，1996)使植物生长并用大麦白粉菌接种植物。在自交和随后在包含至少24个个体的F3代或F4代家族中进行接种实验之后，测定用于高分辩作图的重组体Mlo处的基因型。AFLP分析
按照Stewart和Via(1993)的方法分离用于AFLP分析的基因组DNA。用对Vos等(1995)所描述方法略作修改的方法进行AFLP分析。为了筛选与Mlo连锁的AFLP标记，我们在扩增片段的基因序列中采用了PstⅠ/MstⅠ酶组合以及分别携有+2和+3选择性碱基(selectivebases)的扩增引物。对于Eco RⅠ/MseⅠ扩增引物，我们分别采用+3和+3选择性碱基。使用了一组四个DNA的模板：来自敏感性亲本栽培品种Ingrid Mlo、抗性亲本BC7 Ingrid mlo-3、源于Ingrid Mlo x BC7Ingrid mlo-3杂交的两个抗性F2代个体(mlo-3 mlo-3)库和九个敏感性F2代个体(Mlo Mlo)库。代表AFLP标记Bpm2、Bpm9和Bpm16(图1)的扩增基因片段如以下方法进行克隆和测序：通过放射自显影鉴别含有所述扩增基因组片段的凝胶片(通过真空干燥固定于Whatmam 3MM纸上)，之后将其切下。加入100μl水，煮沸10分钟。离心之后，取5μl上清液用作模板，用所述选择性AFLP引物进行非放射性再扩增(30个循环)。琼脂糖凝胶电泳之后，用DNA分离试剂盒(Jetsorb,GenomedInc.,USA)分离扩增产物。用Klenow聚合酶和T4多核苷酸激酶作用于(reat)DNA，然后将其克隆至pBluescript SK(Stratagene)的EcoRⅤ位点中。用染料终止剂循环测序反应试剂盒(dye terminator cyclesequencing reaction kit)(Perkin Elmer)进行测序反应，并在ABI 373或377型(Applied Biosystems)自动测序仪上进行分辩。大麦YAC文库和YAC YHV303-A6的BAC亚文库的构建
运用pYAC4载体(Burke等，1987；Kuhn和Ludwig,1994)和酵母菌株AB 1380建立大麦栽培品种Ingrid的YAC文库。该文库构建的细节及其特征鉴定将在别处描述。通过AFLP分析筛选含有标记Bpm16的YAC克隆。为构建YAC YHV303-A6的一个BAC亚文库，采用该酵母克隆的总DNA。EcoRⅠ部分消化和制备性脉中电场凝胶电泳之后，回收大小范围为50 kb的DNA片段，并亚克隆至载体pECSBAC4中。携带YHV303-A6来源插入片断的克隆通过两步菌落杂交方法鉴别。首先，将非重组酵母菌株AB 1380的标记总DNA用作探针，以排除大多数携有来源于该宿主菌株插入DNA的克隆。在接下来的杂交步骤中，其余的克隆经制备性脉中电场凝胶电泳的富集之后，用标记的重组染色体YHV303-A6进行探测。BAC F15的DNA测序
按照Sambrook等(1989)的碱裂解大规模质粒制备法分离BAC F15的DNA。将50 μg纯化的DNA在一个反应室中用氨气高压处理使之雾化150秒。通过在反应中用T4 DNA聚合酶介导的填补，使剪切并重沉淀的DNA末端平端化。用个DNA分离试剂盒(Jetsorb,Genomed Inc.,USA)，从琼脂糖凝胶中分离大小范围在800 bp和3 kb之间的DNA片段，将其克隆进pBluescrip SK载体(Stratagene)中，并在大肠杆菌DH5α中繁殖。用BAC F15的剪切DNA作为探针，通过杂交筛选携有BACF15来源插入片断的克隆。按以上描述进行测序反应。通过面向Vnix用户的STAOEN软件包(第4版，1994)，进行该测序数据的评价、序列毗连群的构建以及编码可能性的评估。编码可能性的估测基于所考查毗加群中不规则的位置性碱基频率、位置性碱基偏好以及大麦密码子选择情况的组合评估。用BLAST软件完成同源性检索。基于PCR的Mlo处等位基因的测序
按照Chunwongse等(1993)的方法分离用于该目的的植物染色体DNA。该研究使用的不同大麦变种、mlo突变体、BC系以及基因内重组体的Mlo等位基因的DNA序列，通过以PCR为基础的测序而获得。该基因的七个重叠亚片段(每个长400 bp-600 bp)用数套特异引物进行PCR扩增(35个循环，退火温度为60℃)。制备性琼脂糖凝胶电泳和用Jetsorb试剂盒(Genomed Ine.,USA)分离扩增产物之后，再次扩增片段以增强特异性。然后从核苷酸和寡核苷酸(Jetpure,GenomedInc.,USA)中纯化所得到的产物，并在DNA测序反应(参见上文)中用作模板。突变等位基因和亲本系的相应区以及基因内重组体的所有DNA序列均来源于两条链，并在独立的数组实验中经两次确认。另外，还在栽培品种Ingrid的相应BC系中证实了突变等位基因mlo-1、mlo-3、mlo-4、mlo-5、mlo-7、mlo-8、mlo-9和mlo-10。RT-PCR和cDNA末端的快速扩增(RACE)
采用SUPERSCRIPT预扩增系统进行RT-PCR，以合成cDNA第一条链(Gibco BRL)。将7天龄的大麦初生叶(栽培品种Ingrid)的总RNA(1μg)用作模板。cDNA第一条链的合成用寡聚(dT)引物来引发。然后在一个单个扩增步骤(35个循环，退火温度为60℃)中，用寡核苷酸25L(GTGCATCTGCGTGTGCGTA)和寡核苷酸38(CAGAAACTTGTCTCATCCCTG)扩增假定的Mlo基因编码区。通过直接测序分析所得到的产物。用MARATHON cDNA扩增试剂盒(Clontech)通过RACE(Frohman等，1988)确定该Mlo cDNA的3’端和5’端。相应的实验方法主要按照制造商的说明来进行。为获得特异性RACE产物，两轮连续扩增(35个循环，退火温度为55℃)是必需的。为达此目的，两套嵌套引物与该试剂盒的适配引物(adaptor primer)联合使用，所述适配引物为：用于5’端的寡核苷酸46(AGGGTCAGGATCGCCAC)和寡核苷酸55(TTGTGGAGGCCGTGTTCC)以及用于3’端的引物33(TGCAGCTATATGACCTTCCCCCTC)和引物37(GGACATGCTGATGGCTCAGA)。将RACE产物亚克隆进pBluescript SK(Stratagene)中。选出10个5’端克隆和8个3’端克隆进行DNA序列分析。
名词“AFLP”在此用于指“AFLP标记”
表1总结该Mlo基因内所鉴别出的各种突变体的突变位点。标出了该突变在氨基酸水平上的起源、诱变剂以及预期效应。
表2显示异源等位基因型mlo杂交和各个mlo系自交以分离基因内重组事件的结果。
表3总结来自突变体间杂交的敏感性F2代或纯合F3代后代中于侧翼RFLP标记的基因型。C0和NCO表明得自侧翼分子标记交换的交换型重组体和非交换型重组体。表3总结了敏感性基因内交换型重组体(来自纯合敏感性F3后代)和相应的亲本mlo突变体系的DNA序列分析。示出邻接已鉴别突变位点的序列。
表4显示来源于mlo-1×mlo-8和mlo-1×mlo-5两种异源等位基因杂交的敏感性基因内重组体基因组DNA的直接PCR测序结果，揭示野生型序列的恢复。
表5显示几种拟南芥和两种水稻表达的与该Mlo蛋白具有同源性的序列标记(EST)。
表5A显示氨基酸序列，以“查询(querry)”表明已发现与其同源性的该Mlo蛋白序列的一部分，并以“对象(subject)”标明每个鉴别的EST的预期氨基酸序列。
表5B显示编码表5A中所示氨基酸序列的EST核苷酸序列。显示Genbank登记号T22145(命名为4153的拟南芥cDNA克隆97N8T7,NCBISeq ID 932185)、登记号T22146(命名为4153拟南芥cDNA克隆97N9T7,NCBI Seq ID 932186)、登记号N37544(命名为18771拟南芥cDNA克隆205N12T7,NCBI Seq ID 1158686)、登记号T88073(命名为11769拟南芥cDNA克隆115I23T7,NCBI Seq ID 935932)、登记号H76041(命名为17746拟南芥cDNA克隆193P6 T7,NCBI Seq ID1053292)、登记号D24287(水稻cDNA部分序列R1638_1A,nID g428139)以及登记号D24131(水稻cDNA部分序列R1408_1A,nID g427985)。所述拟南芥序列来自Newman等的(1994)Plant Physiol.,106 1241-55。所述水稻序列来自Minobe,Y和Sasaki,T.1993年十一月二日提交DDBJ。
表1．mlo突变等位基因等位基因 母本变种 诱变剂 Mlo处的突变事件mlo-1 Haisa X-射线 T484→Amlo-3 Melteria Heda γ-射线 2个核苷酸缺失(1188-1189)mlo-4 Foma X-射线 11个核苷酸缺失(478-488)mlo-5 Carlsberg Ⅱ EMS G3→Amlo-7 Carlsberg Ⅱ EMS G677→Amlo-8 Carlsberg Ⅱ EMS A1→Gmlo-9 Diamant EMS C28→Tmlo-10 Foma γ-射线 6个核苷酸缺失(543-548)mlo-12 Elgina NMU C720→Amlo-13 Plena EMS T89-Amlo-16 Alsa EMS G1917*→Amlo-17 Plena EMS C92→Tmlo-26 Plena EMS T809→Amlo-28 Nadja NaN3 C665→T核苷酸和氨基酸的编号根据Mlo cDNA序列的翻译起始位点而定。核苷酸编号根据基因组Mlo DNA序列的翻译起始位点。EMS=乙基甲磺酸盐，NMU=亚硝基甲基脲，NaN3=叠氮化钠U下一个起始密码子位于核苷酸位置79-81处，并在该编码序列的读框中。
表2突变体间杂交和自交的F2代后代
| 测交 | 抗性 | 敏感性 | 敏感性F2代后代的频率 |
| mlo-8×mlo-1mlo-5×mlo-1mlo-5×mlo-1 | 5.28191514,474 | 309 | 5,7×10-4---6,2×10-4 |
| 自交 | 抗性 | 敏感性 | |
| mlo-1mlo-5mlo-8 | 12,6345,4988.435 | 000 |
表3．在来源于异源等位基因mlo杂交的敏感性后代中侧翼RFLP标记处的基因型测交 敏感性 在Mlo1着丝粒方向 在Mlo2端粒方向 重组类型
植株 的亲本基因型 的亲本基因型mlo-8×mlo-1 1 mlo-1 mlo-8 CO
2 mlo-1 mlo-8 CO
3 mlo-8 mlo-8 NCOmlo-1×mlo-5 1 mlo-1 mlo-5 CO
2 mlo-1 mlo-5 CO
3 mlo-5 mlo-5 NCO
4 mlo-1 mlo-5 CO
5 mlo-5 mlo-5 NCO
6 mlo-5 mlo-5 NCO
7 mlo-1 mlo-5 CO
8* mlo-5 mlo-5 NCO
9* mlo-1+mlo-5 mlo-5 CO从RFLP标记WG114(参见图1)的等位基因中推导2从RFLP标记ABG366(参见图1)的等位基因中推导CO=交换型，NCO=非重组交换型*侧翼RFLP标记的基因型已在杂合敏感性F2代个体中确定；在所有的其它情况下，测试来源于敏感性F2代个体的纯合敏感性F3代后代
表4．通过基因内重组事件的Mlo野生型序列的恢复
侧翼突变位点1的核苷酸序列
基因型 核苷酸-3至+3 核苷酸481至486Haisa Mlo CCGATG AATGGG
mlo-l CCGATG AAAGGGCarlsbergⅡ Mlo CCGATG AATGGG
mlo-5 CCGATA AATGGG
mlo-8 CCGGTG AATGGG基因内重组体 mlo-1×mlo-8 1 CCGATTG AATGGG
2 CCGATG AATGGG
mlo-1×mlo-5 1 CCGATG AATGGG
2 CCGATG AATGGG
4 CCGATG AATGGG
7 CCGATG AATGGG
9 CCGATG AATGGG1核苷酸编号根据翻译起始位点而定(参见图2)
表5A＞EM EST1:AT1452 T22145 4153拟南芥cDNA克隆97N8T7.11/95
长度=382正链HSPs：记录值=248(115.9比特)，预期值=2.9e-27,P=2.9e-27同一性=47/100(47％)，阳性= 67/100(67％)，框架=+2查询：242 KYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWGVAILTLFLDINGVGTLIWISFIPLVILLCVGTKLEMI 301
KY+ R++EDDFK VVGIS LW ++ L++NG T WI+FIP +LL VGTKLE +对象： 2 KYMMRALEDDFKQVVGISWYLWXFVVIFXLLNVNGWHTYFWIAFIPFXLLLAVGTKLEHV 181查询：302 IMEMALEIQDRASVIKGAPVVEPSNKFFWFHRPDWVLFFI 341
I ++A E+ ++ I+G VV+P .+ FWF +P VL+ I对象：182 IAQLAHEVAEKHVAIEGDLVVKPXXEHFWFSKPQIVLYLI 301＞EM EST1:AT1462 T22146 4154 拟南芥cDNA克隆97N9T7.11/95
长度=390正链HSPs：记录值=212(99.1比特)，预期值=4.2e-26，总和P(2)=4.2e-26同一性=41/83(49％)，阳性=58/83(69％)，框架=+2查询：242 KYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWGVAILTLFLDINGVGTLIWISFIPLVILLCVGTKLEMI 301
KY+ R++EDDFK VVGIS LW ++ L L++NG T WI+FIP +LL VGTKLE +对象： 2 KYMMRALEDDFKQVVGISWYLWXFVVIFLLLNVNGWHTYFWIAFIPFALLLAVGTKLEHV 181查询 302 IMEMALEIQDRASVIKGAPVVEP 324
I ++A E+ ++ I+G VV+P对象：182 IAQLAHEVAEKHVAIEGDLVVKP 250记录值=52(24.3比特)，预期值=1.9，总和P(2)=0.85同一性=9/32(28％)，阳性=16/32(50％)，框架=+2查询： 18 WAVAVVFAAMVLVSVLMEHGLHKLGHWFQHRH 49
W +FA ++ V +EH + +L H +H对象：122 WIAFIPFALLLAVGTKLEHVIAQLAHEVAEKH 217记录值=49(22.9比特)，预期值= 4.2e-26，总和P(2)=4.2e-26同一性=8/17(47％)，阳性=12/17(70％)，框架=+1查询：323 EPSNKFFWFHRPDWVLF 339
E S++ FWF +P VL+对象：244 ETSDEHFWFSKPQXVLY 294
表5A(接上页)＞EM EST1:AT54418 N37544 18771拟南芥cDNA克隆205N12T7.1/96长度=585正链HSPs：记录值=277(129.5比特)，预期值=1.2e-45，总和P(2)=1.2e-45同一性-=51/96(53％)，阳性=71/96(73％)，框架=+1查询：236 SKFDFHKYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWGVAILTLFLDINGVGTLIWISFIPLVILLCVG 295
S+FDF KYI+RS+E DFK VV.IS +W VA+L L + G+ + +W+ FIPLV++L VG对象：127 SRFDFRKYIQRSLEKDFKTVVEISPVIWFVAVLFLLTNSYGLRSYLWLPFIPLVVILIVG 306查询：296 TKLEMIIMEMALEIQDRASVIKGAPVVEPSNKFFWF 331
TKLE+II ++ L IQ+ V++GAPVV+P + FWF对象：307 TKLEVIITKLGLRIQEEGDVVRGAPVVQPGDDXFWE 414记录值=121(56.6比特)，预期值=1.2e-45，总和P(2)=1.2e-45同-性=25/45(55％)，阳性=29/45(64％)，框架=+1查询：196 SSTPGIRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSQNSKFDF 240
S T W+V FFRQFF SVTKVDYL L GFI AH + ++ F对象： 1 SKTRVTLWIVCFFRQFFGSVTKVDYLALXHGFIMAHFAPGNESRF 135＞EM EST1:AT04117 H76041 17746.拟南芥cDNA克隆193P6T7.11/95
长度=476正链HSPs：记录值=210(98.2比特)，预期值=9.0e-36，总和P(2)=9.0e-36同-性=43/86(50％)，阳性=58/86(67％)，框架=+1查询：196 SSTPGIRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSQNSKFDFHKYIKRSMEDDFKVV 255
++TP V FFRQFF SV + DYLTLR GF +AHL+ KF+F +YIK S+EDDFK+V对象：124 TTTPFXFNVGCFFAQFFVSVERTDYLTLRHGFXSAHLAPGRKFNFQRYIKXSLEDDFKLV 303查询：256 VGISLPLWGVAILTLFLDINGVGTLI 281
VGI LW ++ L + +GT++对象：304 VGIXPVLWASFVIFLAVQX*WLGTIV 381记录值=119(55.6比特)，预期值=9.0e-36，总扣P(2)=9.0e-36同一性=24/57(42％)，阳性= 32/57(56％)，框架=+1查询：156 MRTWKKWETETTSLEYQFANDPARFRETHQTSFVKRHLGLSSTPGIRWVVAFFRQFF 212
+R WKKWE T S-+Y F D +R R TH+TSFV+ H +T +V F + F对象： 1 IRGWKKWEQXTLSNDYXFXIDHSRLRLTHETSFVREHTSFWTTTPFXFNVGCFFRQF 171记录值=40(18.7比特)，预期值=1.2e-08，总和P(2)=1.2e-08同一性=8/19(42％)，阳性=10/19(52％)，框架=+2查询：269 TLFLDINGVGTLIWISFIP 287
+L + NG G L W S P对象：344 SLLFNXNGWGPLFWASVPP 400
表5A(接上页)＞EM EST1:AT0739 T88073 11769拟南芥cDNA克隆155123T7.11/95
长度=460正链HSPs：记录值=175(81.8比特)，预期值=1.2e-24，总和P(2)=1.2e-24同一性=31/67(46％)，阳性=43/67(64t)，框架=+1查询：146 VITIALSRLKMRTWKKWETETTSLEYQFANDPARFRFTHQTSFVKRHLGLSSTPGIRWVV 205
++T A ++KMRTWK WE ET ++EYQ++NDP RFRF TSF +RHL S + +对象： 4 IVTYAFGKIKMRTWKSWEEETKTIEYQYSNDPERFRFARDTSFGRRHLNFWSKTRVTLWI 183记录值=121(56.6比特)，预期值=1.4e=14，总和P(2)=1.4e-14同一性=25/45(55％)，阳性=29/45(64％)，框架=+1查询：196 SSTPGIRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSQNSKFDF 240S T W+V FFRQFF SVTKVDYL L GFI AH + ++ F对象：157 SKTRVTLWIVCFFRQFFGSVTKVDYLALXHGFIMAHFAPGNESRF 291记录值=75(35.1比特)，预期值=1.2e-24，总和P(2)=1.2e-24同一性=14/21(66％)，阳性=17/21(80％)，框架=+1查询：236 SKFDFHKYIKRSMEDDFKVVV 256
S+FDF KYI+RS+ DFK VV对象：283 SRFDFRKYIQRSLXXDFKTVV 345＞EM EST5:OSR16381A D24287水稻cDNA，部分序列(R1638_1A).5/95
长度=400正链HSPs：记录值=147(68.7比特)，预期值=1.9e-16，总和P(2)=1.9e-16同一性=26/53(49％)，阳性=35/53(66％)，框架=+1查询：236 SKFDFHKYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWGVAILTLFLDINGVGTLIWISFIPL 288
++F+F KYIKR +EDDFK VVGIS P W A++ +++G L W S PL对象：202 TRFNFRKYIKRXLEDDFKTVVGISAPXWASALAIMLFNVHGWHNLFWFSTXPL 360记录值=45(21.0比特)，预期值=1.9e-16，总和P(2)=1.9e-16同一性=9/15(60％)，阳性=11/15(73％)，框架=+2查询：287 PLVILLCVGTKLEMI 301
PL + L VGTKL+ I对象：356 PLXVTLAVGTKLQAI 400＞EM ESTS:OSS1692A D39989水稻cDNA，部分序列(S1692_1A).11/94
长度=343正链HSPs：记录值=95(44.4比特)，预期值=0.00059,P=0.00059同一性=24/58(41％)，阳性=31/58(53％)，框架=+3查询：43 HWFQHRHKKALWEALEKMKAELMLVGFISLLLIVTQDPIIAKICISEDAADVMWPCKR 100
H + H+ L +A+EKMK E+ML+GFISLLL T I S+ PC R对象： 3 HXSEKTHRNPLHKAMEKMKEEMMLLGFISLLLAATSRIISGICIDSKYYNSNFSPCTR 176
表5BGenBank登记号T221451 caagtatatg atgcgcgctc tagaggatga tttcaaacaa gttgttggta ttagttggta61 tctttggntc tttgtcgtca tctttttnct gctaaatgtt aacggatggc acacatattt121 ctggatagca tttattccct ttnctttgct tcttgctgtg ggaacaaagt tggagcatgt181 nattgcacag ttagctcatg aagttgcaga gaaacatgta gccattgaag gagacttagt241 ggtgaaaccc ncanatgagc atttctggtt cagcaaacct caaattgttc tctacttgat301 cccattttat cctctttccc agaatgcntt ttnagantgc nttttttnnt tttggnnttt361 ggggtaanan annggtttcg ncGenBank登记号T221461 caagtatatg atgcgcgctc tagaggatga tttcaaacaa gttgttggta ttagttggta61 tctttggntc tttgtcgtca tctttttgct gctaaatgtt aacggatggc acacatattt121 ctggatagca tttattccct ttgctttgct tcttgctgtg ggaacaaagt tggagcatgt181 nattgcacag ttagctcatg aagttgcaga gaaacatgta gccattgaag gagacttagt241 ggtgaaacct cagatgagca tttctggttc agcaaacctc aaantgttct ctactngatc301 cnctttatcc cccttccaga atgccttttt nangattcnn ntttttcctt nttgganntt361 ttgggnnnnc aaacgggntt nggacctccgGenBank登记号N375441 agcaagacga gagtcacact-atggattgtt tgttttttta gacagttctt tggatctgtc61 accaaagttg attacttagc actaagncat ggtttcatca tggcgcattt tgctcccggt121 aacgaatcaa gattcgattt ccgcaagtat attcagagat cattagagaa agacttcaaa181 accgttgttg aaatcagtcc ggttatctgg tttgtcgctg tgctattcct cttgaccaat241 tcatatggat tacgttctta cctctggtta ccattcattc cactagtcgt aattctaata301 gttggaacaa agcttgaagt cataataaca aaattgggtc taaggatcca agaggaaggt361 gatgtggtga gaggcgcccc agtggttcag cctggtgatg accncttctg gtttngnaan421 cacgnttcaa tnttttccnt antcacttng gcctttttan gggtgaattt caacttcatn481 ctttncctgg ggncggatga ttcaatccaa naatnttccc ctgaagnctn caagtttggg541 cataggcttt nggtgggntt ttcaganttt nagtttggct tnccc
表5B(接上页)GenBank登记号T880731 tgcattgtta cttatgcttt cggaaagatc aagatgagga cgtggaagtc gtgggaggaa61 gagacaaaga caatagagta tcagtattcc aacgatcctg agaggttcag gtttgcnagg121 gacacatctt ttgggagaag acatctcaat ttctggagca agacgagagt cacactatgg181 attgtttgtt tttttagaca gttctttgga tctgtcacca aagttgatta cttagcacta241 agncatggtt tcatcatggc gcattttgct cccggtaacg aatcaagatt cgatttccgc301 aagtatattc agagatcatt agngnaagac ttcaaaaccg ttgtttgaaa tcagtccggt361 tatctggttt gtcggctgtg ctattccnct tgaccaattc atatggntnc ggtnttncnc421 tggtaccatt attcnctagc ggaatntaaa agttggcngaGenBank登记号H760411 attcgtggat ggaaaaagtg ggagcaagan acattatcta atgactatna gtttnctatt61 gatcattcaa gacttaggct cactcatgag acttcttttg tnagagaaca tacaagtttc121 tggacaacaa cncctttctn ctttaacgtc ggatgcttct ttaggcagtt ctttgtatct181 gtngaaagaa ccgactactt gactctgcgc catggattca nctctgccca tttagctcca241 ggaagaaagt tcaacttcca gagatatatc aaangatctc tcgaggatga tttcaagttg301 gtagttggaa taagnccagt tctttgggca tcatttgtaa tcttccttgc tgttcaatgn361 taatggctgg ggaccattgt tttgggcntc ggtaccgcct ntactcanaa ncccaggctt421 ttggccaagg ttcaaggaat ttngggacaa tggggtagaa tcgtgggcnc atnnggGenBank登记号D242871 tcntntttnn ttttcgnntn cntccacccc tnnnntnctc nancncnttn nnnttatctc61 tnttnttntc ncntntcccn ncaccaccnn ncgacgggcn tggactnngc ccnnngttcg121 aggctgccca ctgncgtctg agacctacct tgncatttga cggcacngga cttcanttgc181 tgctcacttt atctctacgg gactaggttc aattttcgga aatacatcaa aaggncactg241 gaggacgatt ttaagacagt tgttggcatt agtgcacccn tatgggcttc tgcgttggcc301 attatgctct tcaatgttca tggatggcat aacttgttct ggttctctac aatncccctt361 gntagtaact ttagcagttg gaacaaagct gcaggctataGenBank登记号D241311 cagactacct gactttgagg cacggattca ttgctgctca tttatctcta gggactaggt61 tcaattttcg gaaatacatc aaaaggtcac tggaggacga ttttaagaca gttgttggca121 ttagtgcacc cttatgggct tctgcgttgg ccattatgct cttnaatgtt catggatggc181 ataacttgtt ctggttctct acaatccccc ttgtagtaac tttagcagtt ggaacaaagc241 tgcaggctat aattgcaatg atggctgttg aaattaaaga gaggcataca gtaattcaag301 gaatgccggt ggtgaactca gtgat
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Claims (73)
1．分离的多核苷酸，它编码包括示于图2中的氨基酸序列的多肽。
2．按照权利要求1的多核苷酸，其中所述编码序列是示于图2中的编码序列。
3．按照权利要求1的多核苷酸，其中所述编码序列是通过添加、缺失、置换和/或插入一或多个核苷酸而形成的图2所示编码序列的突变体、等位基因、变异体或衍生物。
4．分离的多核苷酸，它在转基因植物中表达时对所述植物的病原体防御反应发挥负调节作用，所述种防御反应与病原体无关并对于病原体存在为自主性的，所述多核苷酸编码这样的多肽，所述多肽所包括的氨基酸序列为图2所示大麦Mlo序列的突变体、等位基因、变异体或衍生物，或者是另一种植物种的同源物或其突变体、等位基因、变异体或衍生物，其氨基酸序列通过添加、置换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸而与图2中所示的氨基酸序列不同。
5．按照权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸编码包括图13中所示氨基酸序列的多肽。
6．按照权利要求5的多核苷酸，其中所述编码序列是示于图10中的编码序列。
7．按照权利要求5的多核苷酸，其中所述编码序列是通过添加、缺失、置换和/或插入一个或多个核苷酸而形成的图10中所示编码序列的突变体、等位基因、变异体或衍生物。
8．按照权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸编码包括图14中所示氨基酸序列的多肽。
9．按照权利要求8的多核苷酸，其中所述编码序列是图11中所示的编码序列。
10．按照权利要求8的多核苷酸，其中所述编码序列是通过添加、缺失、置换和/或插入一个或多个核苷酸而形成的图11中所示编码序列的突变体、等位基因、变异体或衍生物。
11．按照权利要求4的多核苷酸，所述我核苷酸编码包括图15中所示氨基酸序列的多肽。
12．按照权利要求11的多核苷酸，其中所述编码序列是示于图12中的编码序列。
13．按照权利要求11的多核苷酸，其中所述编码序列是通过添加、缺失、置换和/或插入一个或多个核苷酸而形成的图12中所示编码序列的突变体、等位基因、变异体或衍生物。
14．按照任一前述权利要求的与用于表达的调节序列操作性相连接的多核苷酸。
15．编码多肽的分离多核苷酸，所述多核苷酸在转基因植物中表达时，产生能够刺激或维持所述植物中防御反应的多肽，所编码的多肽包括下述氨基酸序列，所述氨基酸序列是图2中所示的大麦Mlo序列的或者是另一种植物种的同源物的突变体、等位基因、变异体或衍生物，所述氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的添加、置换、缺失和/或插入而与图2中所示的氨基酸序列不同。
16．按照权利要求15的多核苷酸，所述多核苷酸在所述植物中以纯合表达时刺激或维持所述植物的所述防御反应。
17．按照权利要求15的多核苷酸，其中所述氨基酸序列包括表1中所鉴别的一种改变。
18．按照权利要求17的多核苷酸，其中所述氨基酸序列是图2中的氨基酸序列，包括在残基240处的一个置换。
19．按照权利要求17的多核苷酸，其中所述氨基酸序列包括在残基240处的亮氨酸。
20．按照权利要求15至19中任一项的多核苷酸，它与用于表达的调节序列操作性地连接。
21．分离的多核苷酸，它具有权利要求1至13中任一项的核苷酸序列的至少约600个相邻核苷酸或其互补物。
22．按照权利要求21的多核苷酸，它与用于转录的调节序列操作性地连接。
23．分离的多核苷酸，它具有权利要求1至13中任一项的序列的至少约300个相邻核苷酸，或其互补核苷酸，并操作性地与用于转录的调节序列相连接。
24．按照权利要求22或23的多核苷酸，其中所述调节序列包括一个诱导型启动子。
25．核酸载体，它适合于转化宿主细胞并且包括按照任一前述权利要求的多核苷酸。
26．按照权利要求25的核酸载体，其中所述宿主细胞是一种微生物细胞。
27．按照权利要求25的核酸载体，其中所述宿主细胞是一种植物细胞。
28．宿主细胞，它含有异源多核苷酸或按照任一前述权利要求的核酸载体。
29．按照权利要求28的细胞，所述细胞是微生物细胞。
30．按照权利要求28的细胞，所述细胞是一种植物细胞。
31．按照权利要求30的细胞，它具有加入其基因组内的所述异源多核苷酸。
32．按照权利要求31的细胞，所述细胞的每个单倍体基因组中具有一个以上的所述多核苷酸。
33．按照权利要求30至32中任一项的细胞，所述细胞包含于植物中。
34．包括按照权利要求30至32中任一项的细胞的植物。
35．植物或所述植物的任何部分或繁殖体、子代、克隆或后代，所述植物是以有性或无性方式所繁殖的权利要求34中的植物的子代。
36．按照权利要求35的植物的一部分或繁殖体。
37．按照权利要求34的植物，所述植物未真正育种。
38．产生一种植物的方法，所述方法包括将按照权利要求1至14中任一项的异源多核苷酸加入植物细胞中，并由所述植物细胞再生植株。
39．产生一种植物的方法，所述方法包括将按照权利要求15至20中任一项的异源多核苷酸加入植物细胞中，并由所述植物细胞再生植株。
40．产生一种植物的方法，所述方法包括将按照权利要求21至24中任一项的异源多核苷酸加入植物细胞中，并由所述植物细胞再生植株。
41．按照权利要求38至40中任一项的方法，所述方法包括以有性或无性方法繁殖或生长所述植物的子代或后代。
42．在植物中刺激防御反应的方法，所述方法包括引发或允许在所述植物细胞内从按照权利要求1至14中任一项的异源多核苷酸进行转录。
43．在植物中刺激防御反应的方法，所述方法包括引发或允许在所述植物细胞内从按照权利要求15至20中任一项的异源多核苷酸进行转录。
44．刺激植物防御反应的方法，所述方法包括引发或允许在所述植物细胞内从按照权利要求21至24中任一项的异源多核苷酸处转录。
45．产生编码多肽的多核苷酸的方法，所述多核苷酸在转基因植物中表达时，产生能够刺激或维持所述植物的防御反应的多肽；所述方法包括按照权利要求1至14中任一项的多核苷酸的核苷酸序列的改变。
46．按照权利要求45的方法，所述方法涉及位点特异性序列突变。
47．按照权利要求45的方法，所述方法涉及细胞内同源重组。
48．一种方法，其中按照权利要求45中的方法改变核苷酸序列之后，将包括所述改变后核苷酸序列的多核苷酸引入宿主细胞中。
49．按照权利要求48的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。
50．一种方法，其中在按照权利要求49的方法将多核苷酸引入植物细胞后，从包括改变的核苷酸序列的细胞或其后代再生植株。
51．按照权利要求1至14中任一项的多核苷酸用于在植物中刺激防御反应的用途。
52．按照权利要求15至20中任一项的多核苷酸用于在植物中刺激防御反应的用途。
53．按照权利要求21至24中任一项的多核苷酸用于在植物中刺激防御反应的用途。
54．按照权利要求21至24中任一项的多核苷酸在下调一种基因表达中的用途，所述基因由按照权利要求1至14中任一项的多核苷酸编码。
55．按照权利要求1至14中任一项的多核苷酸在产生转基因植物中的用途。
56．按照权利要求15至20中任一项的多核苷酸在产生转基因植物中的用途。
57．按照权利要求21至24中任一项的多核苷酸在产生转基因植物中的用途。
58．在植物或植物细胞中确定一种病原体抗性或敏感性等位基因存在的方法，所述方法包括通过以下步骤分析所述植物或植物细胞的样品；
(a)将所述样品中的核酸序列与图7中所示核苷酸序列的全部或部分相比较，以确定是否来自所述病株的样品含有一个突变；
(b)确定所述样品中存在包括图7所示氨基酸序列的多肽或其片段，如果存在，确定是否所述多肽为全长的和/或已突变、和/或以正常水平表达；
(c)进行DNA指纹分析，以比较当一种限制性酶切割所述样品中的核酸时产生的限制性图谱与从图7所示核苷酸的序列或从其已知的其突变体、等位基因或变异体获得的限制性图谱；
(d)将所述样品与一个能够结合包括图7中所提出核苷酸序列的核酸或其片段、或其突变体、等位基因或变异体的特异性结合成员相接触，所述特异性结合成员包括可与图7中序列相杂交的核酸、或其包括的结合域对包括图7序列的核酸或该核酸编码的多肽或其突变形式有特异性的多肽，并确定所述特异性结合成员的结合；
(e)进行涉及一种或多种基于图7所示核苷酸序列的引物的PCR，以就包括图7核苷酸序列或其突变体、等位基因或变异体的核酸筛选所述样品。
59．在植物或植物细胞中确定靶核酸存在的方法，所述方法包括将包括图7所示核苷酸序列或其寡核苷酸片段的核酸分子与来自所述植物或植物细胞样品中的核酸相接触，并检测所述核酸分子与所述样品中核酸的杂交。
60．按照权利要求59的方法，所述方法涉及与所述核酸分子相杂交的核酸的扩增。
61．按照权利要求59或60的方法，其中所述核酸分子包括与图7中所示的核苷酸序列或其相应片段相比的序列改变。
62．按照权利要求61的方法，其中所述改变选自表1中所示的那些改变。
63．一种测定方法，用于鉴别能够结合由按照权利要求1至14中任一项或随权利要求15至20中任一项的多核苷酸编码的多肽的化合物，所述方法包括：
(a)使测试化合物与所述多肽或其片段相接触，并
(b)测定所述多肽或其片段与所述测试化合物之间的互作或结合。
64．按照权利要求63的测定方法，其中鉴别能够结合其氨基酸序列示于图2的多肽的化合物。
65．测定方法，用于鉴别通过与按照权利要求1至14中任一项或按照权利要求15至20中任一项的多核苷酸编码的多肽互作而能够在植物中刺激防御反应的化合物，所述方法包括：
(a)使植物或植物部分与测试化合物相接触，并测定对防御反应的刺激；以及
(b)使所述多肽或其片段与测试化合物相接触，并测定所述多肽或其片段与所述测试化合物之间的互作或结合；
用步骤(a)中检测阳性的测试化合物实施步骤(b)，或者用步骤(b)中检测阳性的测试化合物实施步骤(a)，或者步骤(a)和(b)平行实施。
66．按照权利要求65的测定方法，其中防御反应的刺激通过监测病原体在所述植物或植物部分上的生长和/或生存力而确定。
67．按照权利要求65或66的测定方法，其中鉴别能够与其氨基酸序列示于图2中的多肽结合的化合物。
68．按照权利要求65或67中任一项的测定方法，其中鉴别能够在大麦中刺激对白粉病的抗性的化合物。
69．一种方法，该方法包括在按照权利要求65至68中任一项的方法鉴别能够刺激植物防御反应的化合物后，配制所述化合物，或者可选地如果所述化合物是肽基化合物，则将编码它的核酸配制到至少包括另一组分的组合物中。
70．一种方法，该方法在按照权利要求56至58中任一项鉴别能够在植物中刺激防御反应的化合物后，将所述化合物应用于植物，或可选地如果所述化合物为肽基化合物，则将编码它的核酸应用于植物。
71．由按照权利要求1至14中任一项的多核苷酸编码的多肽的用途，即用于筛选能够在植物中刺激防御反应的化合物。
72．由按照权利要求15至20中任一项的多核苷酸编码的多肽的用途，即用于筛选能够在植物中刺激防御反应的化合物。
73．通过按照权利要求63至68中任一项的方法鉴别的能够在植物中刺激防御反应的化合物。
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