ES2651911T3 - Métodos mejorados de silenciamiento génico - Google Patents

Abstract

Un método para reducir la expresión de un ácido nucleico diana en una célula vegetal o planta, que comprende la etapa de introducir una combinación de al menos dos moléculas de ARN inhibidor cada una capaz de reducir la expresión de un primer ácido nucleico diana en dicha célula vegetal o planta, en el que una de dichas moléculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente vía DCL1, y la otra de dichas moléculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente vía DCL4 o DCL3 o DCL2, y en el que una de dichas moléculas de ARN inhibidor es una molécula de miARN, una molécula de pre-microARN, o una molécula de pri-miARN, capaz de reducir la expresión del primer ácido nucleico diana, y en el que dicha otra molécula de ARN inhibidor es una molécula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda región complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo dicha primera región de ARN al menos 19 nucleótidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotídica del primer ácido nucleico diana, y comprendiendo dicha segunda región de ARN al menos 19 nucleótidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica del primer ácido nucleico diana, en el que dichas regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sí con al menos 18 o 19 pares de bases.

Description

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DESCRIPCION

Metodos mejorados de silenciamiento genico Campo de la invencion

La invencion se refiere al campo de tecnologfa de ADN recombinante, mas particularmente a la modificacion de la expresion de acidos nucleicos en plantas mediante la provision de moleculas de ARN inhibidor. Se describen metodos para modificar el silenciamiento genico en plantas al proporcionar a la planta mas de un tipo de ARN inhibidor, mediante lo cual dichos tipos diferentes de ARN inhibidor se procesan a traves de diversas rutas de silenciamiento genico. La invencion se puede aplicar en agricultura.

Tecnica antecedente

El silenciamiento genico es un fenomeno comun en eucariotas, mediante el cual se reduce la expresion de genes particulares, o incluso se anula, a traves de un numero de mecanismos diferentes que oscilan desde la degradacion del ARNm (silenciamiento post-transcripcional) pasando por la represion de la smtesis de protemas hasta la remodelacion de la cromatina (silenciamiento transcripcional).

El fenomeno del silenciamiento genico se ha adoptado rapidamente para manipular la expresion de diferentes moleculas diana. Inicialmente se conocieron dos metodos predominantes para la manipulacion de la expresion genica en organismos eucariotas, que se denominan en la tecnica como disminucion “antisentido” o disminucion “sentido”.

En la ultima decada, se ha demostrado que la eficiencia del silenciamiento se podna mejorar enormemente tanto a nivel cuantitativo como cualitativo usando constructos quimericos que codifican ARN capaz de formar un ARN bicatenario mediante emparejamiento de bases entre las secuencias nucleotidicas de ARN antisentido y sentido respectivamente complementarias y homologas a las secuencias diana. Tal ARN bicatenario (ARNbc) tambien se denomina como ARN de horquilla (ARNh).

Las siguientes referencias describen el uso de tales metodos: Fire et al., 1998 (Nature 391, 806-811) describen la interferencia genetica espedfica mediante introduccion experimental de ARN bicatenario en Caenorhabditis elegans.

El documento WO 99/32619 proporciona un procedimiento para introducir un ARN en una celula viva para inhibir la expresion genica de un gen diana en esa celula. El procedimiento se puede poner en practica ex vivo o in vivo. El aRn tiene una region con estructura bicatenaria. La inhibicion es espedfica de la secuencia por cuanto las secuencias nucleotfdicas de la region duplex del ARN y o una porcion del gen diana son identicas.

Waterhouse et al. 1998 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964) describen que la resistencia a virus y el silenciamiento genico en plantas se puede inducir mediante expresion simultanea de ARN sentido y antisentido. El ARN sentido y antisentido puede estar localizado en un transcrito que tiene autocomplementariedad.

Hamilton et al. 1998 (Plant J. 15: 737-746) describen que un transgen con ADN repetido, es decir, copias invertidas de su region no traducida de 5', provoca la supresion post-transcripcional, de alta frecuencia, de la expresion de ACC-oxidasa en tomate.

El documento WO 98/53083 describe constructos y metodos para potenciar la inhibicion de un gen diana en un organismo, que implican insertar en el vector del silenciamiento genico una secuencia repetida invertida de toda o parte de una region polinucleotfdica en el vector.

El documento WO 99/53050 proporciona metodos y medios para reducir la expresion fenotfpica de un acido nucleico de interes en celulas eucariotas, particularmente en celulas vegetales, introduciendo genes quimericos que codifican moleculas de ARN sentido y ARN antisentido dirigidas contra el acido nucleico diana. Estas moleculas son capaces de formar una region de aRn bicatenario mediante emparejamiento de bases entre las regiones con la secuencia nucleotfdica sentido y antisentido, o introduciendo las propias moleculas de ARN. Preferiblemente, las moleculas de ARN comprenden simultaneamente tanto secuencias nucleotfdicas sentido como antisentido.

El documento WO 99/49029 se refiere generalmente a un metodo para modificar la expresion genica, y a genes sinteticos para modificar la expresion de genes endogenos en una celula, tejido u organo de un organismo transgenico, en particular a un animal o planta transgenica. Tambien se proporcionan genes sinteticos y constructos geneticos, capaces de formar un ARNbc, que son capaces de reprimir, retrasar o de otro modo reducir la expresion de un gen endogeno o un gen diana en un organismo cuando se introducen en el.

El documento WO 99/61631 se refiere a metodos para alterar la expresion de un gen diana en una planta usando fragmentos de ARN sentido y antisentido del gen. Los fragmentos de ARN sentido y antisentido son capaces de emparejarse y formar una molecula de ARN bicatenario, alterando de ese modo la expresion del gen. La presente invencion tambien se refiere a plantas, a su progenie y a semillas de las mismas obtenidas usando estos metodos.

El documento WO 00/01846 proporciona un metodo para identificar ADN responsable de conferir un fenotipo

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particular en una celula, metodo el cual comprende a) construir un ADNc o genoteca genomica del ADN de la celula en un vector adecuado en una orientacion con respecto a (a) promotor o promotores capaces de iniciar la transcripcion del ADNc o ADN en ARN bicatenario (bc) al unir un factor de transcripcion apropiado al promotor o promotores; b) introducir la genoteca en una o mas celulas que comprenden el factor de transcripcion, y c) identificar y aislar un fenotipo particular de una celula que comprende la genoteca, e identificar el fragmento de ADN o ADNc de la genoteca responsable de conferir el fenotipo. Usando esta tecnica, tambien es posible asignar una funcion a una secuencia de ADN conocida a) identificando homologos de la secuencia de ADN en una celula, b) aislando el homologo u homologos de ADN relevantes o un fragmento de los mismos, de la celula, c) clonando el homologo o fragmento del mismo en un vector apropiado en una orientacion con respecto a un promotor adecuado capaz de iniciar la transcripcion del ARNbc a partir de dicho homologo de ADN o fragmento al unir un factor de transcripcion apropiado al promotor, y d) introduciendo el vector en la celula de la etapa a) que comprende el factor de transcripcion.

El documento WO 00/44914 tambien describe composicion y metodos para la atenuacion in vivo e in vitro de la expresion genica usando ARN bicatenario, particularmente en pez cebra.

El documento WO 00/49035 describe un metodo para silenciar la expresion de un gen endogeno en una celula, implicando el metodo sobreexpresar en la celula una molecula de acido nucleico del gen endogeno y una molecula antisentido que incluye una molecula de acido nucleico complementaria a la molecula de acido nucleico del gen endogeno, en el que la sobreexpresion de la molecula de acido nucleico del gen endogeno y la molecula antisentido en la celula silencia la expresion del gen endogeno.

Smith et al., 2000 (Nature 407: 319-320), asf como el documento WO 99/53050, describen que el intron que contiene ARNbc incremento adicionalmente la eficiencia del silenciamiento. El intron que contiene ARN de horquilla tambien se denomina a menudo como ARNhi.

Aunque el silenciamiento genico fue pensado inicialmente como una consecuencia de la introduccion de moleculas de ARN aberrantes, tal como al introducir transgenes (transcritos en moleculas de ARN antisentido sentido o bicatenario), recientemente esta claro que estos fenomenos no son solamente artefactos experimentales. El silenciamiento genico mediado por ARN en eucariotas parece desempenar un papel importante en diversos procesos biologicos, tales como la regulacion espacial y temporal del desarrollo, la formacion de heterocromatina, y la defensa antivmca.

Todos los eucariotas poseen un mecanismo que genera ARN pequenos, que entonces se usan para regular la expresion genica al nivel transcripcional o post-transcripcional. Diversos sustratos de ARN bicatenario se procesan en moleculas pequenas de ARN de 21-24 nucleotidos de longitud, a traves de la accion de ribonucleasas espedficas (protemas Dicer o similares a Dicer (DCL)). Las protemas de union a ARNbc dedicadas (DRB) se asocian con protemas DCL para optimizar el procesamiento de sus diversos sustratos de ARNbc en ARN pequenos de un tamano espedficamente dimensionados. Estos ARN pequenos sirven como moleculas grna incorporadas en complejos proteicos (complejos del silenciamiento inducido por ARN (RISC)) que contienen ademas un miembro de la familia conservada de protemas Argonautas (AGO), que conducen a los diversos efectos logrados a traves del silenciamiento genico. Las plantas, tales como Arabidopsis, tienen un espectro amplio de rutas de silenciamiento por ARN endogenas, debido a la presencia de varias protemas DCL especializadas (cuatro en Arabidopsis) y paralogos de AGO distintos (diez en Arabidopsis).

Los ARN pequenos implicados en la represion de la expresion genica en eucariotas a traves de interacciones espedficas de la secuencia con ARN o ADN se subdividen generalmente en dos clases: microARN (miARN) y ARN pequenos de interferencia (ARNpi). Estas clases de moleculas de ARN pequeno se distinguen por la estructura de sus precursores y por sus dianas. Los miARN se escinden del tronco corto, imperfectamente emparejado, de un transcrito plegado mucho mas grande, y regulan la expresion de transcritos a los que pueden tener similitud limitada. Los ARNpi surgen de un ARN bicatenario largo (ARNbc), y tfpicamente dirigen la escision de transcritos a los que son completamente complementarios, incluyendo el transcrito a partir del que derivan (Yoshikawa et al., 2005, Genes & Development, 19: 2164-2175).

El numero de miembros de la familia Dicer vana enormemente entre organismos. En seres humanos y C. elegans, solamente hay un Dicer. En Drosophila, Dicer-1 y Dicer-2 son ambas requeridas para la escision del ARNm dirigida por ARN pequeno de interferencia, mientras que Dicer-1, pero no Dicer-2, es esencial para la represion dirigida por microARN (Lee et al., 2004 Cell 75:843-854, Pham et al., 2004 Cell 117: 83-94).

Las plantas, tales como Arabidopsis, parecen tener al menos cuatro protemas similares a Dicer (DCL), y se ha sugerido en la bibliograffa cientffica que estas DCLs estan funcionalmente especializadas (Qi et al., 2005 Molecular Cell, 19, 421-428).

DCL1 procesa los miARN procedentes de los ARN precursores con estructura en tallo-bucle parcialmente bicatenarios transcritos a partir de genes MIR (Kurihara y Watanabe, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 1275312758).

DCL3 procesa los ARNpi derivados de la region intergenica y repetida endogenos que dependen de ARN polimerasa

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2 dependiente de ARN, y esta implicada en la acumulacion de los ARNpi de 24 nt en ADN y metilacion de histona (Xie et al., 2004, PLosBiology, 2004, 2, 642-652).

DCL2 parece funcionar en la respuesta de silenciamiento antivmco para algunos virus vegetales, pero no para todos (Xie et al., 2004, PLosBiology, 2004, 2, 642-652).

Varias publicaciones han adscrito un papel a DCL4 en la produccion de los ARNpi que actuan en trans (ARNpi-at). Los ARNpi-at son una clase especial de los ARNpi endogenos codificados por tres familias conocidas de genes, designadas TAS1, TAS2 y TAS3 en Arabidopsis thaliana. La ruta de biogenesis para los ARNpi-at implica la escision, espedfica del sitio, de transcritos primarios guiada por un miARN. El transcrito procesado se convierte entonces en ARNbc a traves de las actividades de RDR6 y SGS3. La actividad de DCL4 cataliza entonces la conversion del ARNbc en la formacion del duplex de ARNpi en incrementos de 21 nt (Xie et al. 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 12984-12989; Yoshikawa et al., 2005, Genes & Development, 19: 2164-2175; Gasciolli et al., 2005 Current Biology, 15, 1494-1500). Como se indica en Xie et al. 2005 (mas arriba), esta todavfa por determinar si DCL4 es necesaria para el silenciamiento transgenico y antiviral.

Dunoyer et al. 2005 (Nature Genetics, 37 (12) p. 1356 a 1360) describen que DCL4 es necesaria para la interferencia de ARN, y produce el componente de ARN pequeno de interferencia de 21 nucleotidos de la senal de silenciamiento celula a celula de la planta.

Dunoyer et al. 2007 (Nature Genetics 39 p. 848-856) resume las diferentes rutas en Arabidopsis como sigue: DCL1, junto con la protema de DRB HYL1, cataliza la liberacion de los miARN de transcritos precursores plegados imperfectos. En general, AGO1 cargada con miARN promueve entonces la escision de transcritos celulares que portan secuencias diana de miARN8. DCL3 produce los ARNpi asociados a repeticiones de ADN de 24 nt que grnan la formacion de heterocromatina al reclutar AGO4 y/o AGO6. DCL4, junto con DRB4, genera los ARNpi que actuan en trans de 21 nt (ARNpiat) que requieren que AGO1 o AGO7 funcionen para mediar el silenciamiento post- transcripcional de genes que controlan la heteroblastia y la polaridad de la hoja. Finalmente, DCL2 produce los ARNpi de transcritos antisentido naturales que orquestan las respuestas a estres16.

La solicitud PCT sin publicar PCT/AU07/000583 describe una modulacion de y demuestra la implicacion de DCL4 en el procesamiento de moleculas de ARN de horquilla largas en componentes de ARN de interferencia que finalmente efectuan el silenciamiento genico.

Aunque el silenciamiento genico mediado por ARNi se ha convertido en una herramienta de investigacion aceptada, asf como una herramienta para desarrollar rasgos particulares, hay informes relacionados que plantean cuestiones sobre la estabilidad a largo plazo del silenciamiento genico en condiciones particulares, o a lo largo del tiempo de vida de varias generaciones, particularmente en celulas vegetales y plantas. Por ejemplo, Szittya et al. 2003 (EMBO Journal 22, p. 633 a 640) dieron a conocer que una temperatura baja inhibe la defensa mediada por silenciamiento de ARN mediante el control de la generacion de ARNpi. Karmeda et al. 2004 dan a conocer un silenciamiento genico sensible a la temperatura mediante una repeticion invertida expresada en Drosophila (Biochem. Biophys. Res. Comm. 315, 599-602). Niu et al. 2006 (Nature Biotechnology 24, 1420 - 1428) describen que los sistemas de infeccion vmcos mediante smtomas de TYMV en plantas de Arabidopsis fueron mas graves a 15°C que a 24°C, y que las plantas transgenicas que comprenden microARN dirigido a disminuir la expresion del virus exhibieron una resistencia al virus espedfica mediada por miARN artificial estable, mantenida a 15°C.

Ademas, algunas aplicaciones de interferencia por (ARNi), particularmente como una herramienta de desarrollo de rasgos, requieren una disminucion seria del gen diana, preferiblemente incluso la disminucion casi completa o completa, para todos los medios y fines practicos, de la funcion del gen diana.

La aplicacion de ARNi a diferentes genes diana usando diferentes genes quimericos o moleculas de ARN que se procesan via la misma ruta productora de la molecula de ARNpi puede conducir a una saturacion de tales rutas.

En consecuencia, se describen aqrn en lo sucesivo, en las diferentes realizaciones, ejemplos y reivindicaciones, metodos y medios para el silenciamiento genico que resuelven los problemas mencionados anteriormente, proporcionando y usando al menos dos moleculas de ARN inhibidor o genes que codifican tales moleculas de ARN dirigidas al mismo acido nucleico diana, con lo que las moleculas de aRn inhibidor dan como resultado el silenciamiento genico a traves de dos o mas rutas distintas que procesan el ARNi en moleculas de ARNpi, habitualmente mediado mediante diferentes protemas Dicer o protemas similares a Dicer (opcionalmente en combinacion con diferentes protemas de union a ARNbc y/o miembros de la familia Argonauta), y que finalmente conducen al silenciamiento genico. Para aliviar el problema de la saturacion de las rutas de procesamiento de ARNi, se describen metodos y medios que proporcionan y usan al menos dos moleculas de ARN inhibidor o genes que codifican tales moleculas de ARN dirigidas a diferentes acidos nucleicos diana, con lo que las moleculas de ARN inhibidor dan como resultado el silenciamiento genico a traves de dos o mas rutas distintas que procesan el ARNi en moleculas de ARNpi.

Sumario de la invencion

En una realizacion, la invencion proporciona un metodo para reducir la expresion de un acido nucleico diana en una

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celula vegetal o planta, que comprende la etapa de introducir una combinacion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor, cada una capaz de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en una celula vegetal o planta, en el que una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2, y en el que una de las moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN o una molecula de pri- miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en el que la otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda region complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo la primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica del primer acido nucleico diana, y comprendiendo la segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del primer acido nucleico diana, en el que las regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.

En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para reducir la expresion de los acidos nucleicos diana primero y segundo en una celula vegetal o planta, que comprende la etapa de introducir una combinacion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor, en el que una de las moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana en la celula vegetal o planta, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del segundo acido nucleico diana en la celula vegetal o planta, en el que una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2, y en el que una de las moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en el que la otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una region primera y segunda complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo la primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica del primer o segundo acido nucleico diana, y comprendiendo la segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del primer o segundo acido nucleico diana, en el que las regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.

Las dos moleculas de ARN inhibidor se pueden expresar a partir de diferentes promotores, tal como una de las moleculas de ARN inhibidor se puede transcribir a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa II, y el otro ARN inhibidor se puede transcribir a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa III.

La molecula de ARN bicatenario puede ser una horquilla corta con una secuencia nucleotfdica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la primera region de 20-30 nucleotidos del gen diana, y una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica al complemento de la primera region del gen diana, estando unidas covalentemente las secuencias sentido y antisentido mediante una region espaciadora de 3-20 nucleotidos.

La molecula de miARN puede ser una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 20-25 nucleotidos consecutivos, al menos 95% identica al complemento de una segunda region de 20-30 o 20-25 nucleotidos del gen diana, pero que tiene una secuencia nucleotfdica sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que es como maximo 60-95% identica en secuencia a la segunda region del gen diana.

En una realizacion de la invencion, el ARN de horquilla corto se expresa a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa III, y la molecula de miARN se transcribe a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa II como un pri-miARN o pre-microARN.

La invencion tambien proporciona una celula vegetal que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en la celula vegetal, en la que una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2, en la que una de las moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en la que la otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una region primera y segunda complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo la primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica del primer acido nucleico diana, y comprendiendo la segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica complementaria a la secuencia nucleotfdica del primer acido nucleico diana, en la que las regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.

En todavfa otra realizacion, la invencion proporciona una celula vegetal que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion de acidos nucleicos diana primero y segundo en la celula vegetal, en la que una de las moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana en la celula vegetal, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del segundo acido nucleico diana en la celula vegetal, en la que una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente

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via DCL1, y la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente v^a DCL4 o DCL3 o DCL2, y en la que una de las moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en la que la otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una region primera y segunda complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo la primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica del acido nucleico diana primero o segundo, y comprendiendo la segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica complementaria a la secuencia nucleotfdica del acido nucleico diana primero o segundo, en la que las regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.

En una celula vegetal segun la invencion, las dos moleculas de ARN inhibidor se pueden expresar a partir de diferentes promotores, tal como una de las moleculas de ARN inhibidor se puede transcribir a partir de un gen que codifica aRn inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa II, y la otra molecula de ARN inhibidor se puede transcribir a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa III. La molecula de ARN bicatenario puede ser una horquilla corta con una secuencia nucleotfdica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la primera region de 20-30 nucleotidos del gen diana, y una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica al complemento de la primera region del gen diana, estando unidas covalentemente las secuencias sentido y antisentido mediante una region espaciadora de 3-20 nucleotidos, y la molecula de miARN puede ser una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 20-25 nucleotidos consecutivos, al menos 95% identica al complemento de una segunda region de 20-30 o 20-25 nucleotidos del gen diana, pero que tiene una secuencia nucleotfdica sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que es como maximo 60-95% identica en secuencia a la segunda region del gen diana, en la que el ARN de horquilla corto se expresa a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa III, y la molecula de miARN se transcribe a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa II como un pri-miARN o pre- microARN.

La invencion tambien proporciona plantas que consisten esencial o completamente en las celulas descritas aqrn.

En todavfa otra realizacion de la invencion, se proporciona una composicion de materia que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor como se describen aqrn, capaces de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en una celula vegetal, o de un primer y un segundo acido nucleico diana en una celula vegetal.

La invencion proporciona ademas un kit que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor como se describen aqrn, como una preparacion combinada para el uso simultaneo, separado o secuencial en la reduccion de la expresion de un primer acido nucleico diana en una celula vegetal, o de un primer y segundo acido nucleico diana en una celula vegetal.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1.

Panel A: Los ARNh cortos derivados de transgenes de PDShp42 dirigidos mediante CaMV35S (reconocido por Pol II) y AtU6 (reconocido por Pol III) se procesan de forma diferente: los patrones tanto de las especies de ARN intermedias como de los ARNpi son diferentes entre las estirpes 35S y U6. Lmeas 1-6: analisis Northern de especies de ARN pequeno en diferentes estirpes vegetales que comprenden los transgenes de PDS hp42 dirigidos por CaMV35S; lmeas 7-12: analisis Northern de especies de ARN pequeno en diferentes estirpes vegetales que comprenden los transgenes de PDS hp42 dirigidos por AtU6.

Panel B: Silenciamiento de la expresion de PDS en diferentes estirpes transgenicas que comprenden los transgenes de PDS hp42 dirigidos por CaMV35S (35S-X; parte superior de cada placa), los transgenes de PDS hp42 dirigidos por AtU6 (U6-XX; parte inferior de cada placa), y estirpes vegetales que comprenden ambos transgenes (35S-X x U6-XX; parte central de cada placa).

Figura 2. Analisis de transferencia Northern que muestra el procesamiento diferencial de ARNh derivado de los transgenes 35S-GUShp93 y U6-GUShp93 en Arabidopsis. Panel A. Deteccion de los ARNpi. Notese la diferencia global en los patrones del tamano de ARNpi entre las estirpes 35S y U6. Panel B. Mejores separaciones de los ARNpi. Se separaron subconjuntos de las muestras de ARN pequeno en A en gel de poliacrilamida al 15% (panel izquierdo) o al 18% (derecho), y se hibridaron con la misma sonda que para A. Observese que los ARNpi de las estirpes 35S tienen predominantemente un tamano de 21 nt, mientras que los ARNpi de las estirpes U6 tienen un tamano de 22 y/o 24 nt. Panel C. Analisis de transferencia Northern de los ARN intermedios en plantas de Arabidopsis 35S-GUShp93 y U6-GUShp93. Los ARN pequenos totales se separaron en geles de 5% de formaldehndo-agarosa (NuSieve 3:1), y se hibridaron con ARN de GUS antisentido de longitud completa marcado con 32P (panel superior). Panel D. Cuatro de las muestras de ARN pequeno total mostradas en C (#4, #6, #17 y #21) se dejaron sin tratar (-) o se trataron (+) con ARNasa I, se separaron en gel de 5% de formaldetndo-agarosa (NuSieve 3:1), y se hibridaron con ARN sentido marcado

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con 32P, que corresponde al tallo y bucle del ARN de GUShp93 (es dedr, nt. 512-697 del ORF de GUS), que debena detectar el ARN de longitud completa y el tallo del ARNbc, pero no el fragmento de bucle, del transcrito de GUShp93. N-35S y N-U6 son preparaciones de ARN nuclear de las plantas 35S-GUShp93 y U6- GUShp93 reunidas, respectivamente. Panel E. Las mismas cuatro muestras se dejaron sin tratar (-) o se trataron (+) con ARNasa I, se separaron en gel de 5% de formaldetndo-agarosa (NuSieve 3:1), y se hibridaron con ARN antisentido marcado con 32P, que corresponde al bucle de ARN de GUShp93 (es decir, nt. 605-697 del ORF de GUS). Observese que el intermedio de ARN derivado de 35S-GUShp93 se hibrido solamente con las sondas antisentido (C y E) pero no con la sonda sentido (D), indicando que la banda hibridante fue el fragmento del bucle.

Figura 3. Analisis de la expresion de GUS en diferentes estirpes transgenicas que contienen el gen quimerico de 35S-GUShp93 o el gen quimerico de AtU6hp93, o ambos.

Figura 4.

Panel A: Analisis Northern de moleculas de ARN corto en estirpes transgenicas que contienen un ARNh dirigido a la region promotora y transcrita de EIN2 (hp); un ARN sentido dirigido contra el promotor de EIN2 (s), o estirpes transgenicas que comprenden ambos tipos de transgenes (hp x s).

Panel B: Silenciamiento de EIN2 en diferentes estirpes transgenicas que comprenden un transgen que codifica un ARN inhibidor sentido dirigido contra la region promotora del gen endogeno EIN2 (s); en estirpes transgenicas que comprenden un transgen que codifica un ARN inhibidor bicatenario contra la region promotora del gen endogeno EIN2, asf como la 5' UTR de la region codificante de ARNm del gen endogeno EIN2 (hp); y en estirpes que comprenden ambos transgenes (s x hp). Se siembran semillas en medio que contiene ACC, y se hacen crecer en la oscuridad. Cuanto mas alargado esten los hipocotilos, mas fuerte sera el silenciamiento de la expresion del gen EIN2.

Descripcion detallada de diferentes realizaciones de la invencion

La actual invencion se basa en la demostracion por los inventores que exhibe una reduccion de la expresion de un acido nucleico diana particular cuando se proporciona con al menos dos moleculas de ARN inhibidor dirigidas contra el acido nucleico diana particular, ejerciendo cada una de las moleculas de ARN inhibidor su efecto final a traves de una ruta de silenciamiento genico diferente, mas pronunciada y mas estable que la reduccion en la expresion del acido nucleico diana observada en celulas vegetales provistas de solamente una de las moleculas inhibidoras.

En particular, se demostro que el silenciamiento genico logrado por genes quimericos que codifican una molecula de ARN bicatenario (particularmente un ARNh) en celulas vegetales estaba mas potenciado cuando se proporciono una combinacion de un gen quimerico que codifica un ARNh bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa II y un gen quimerico que codifica un ARNh bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa III, particularmente el promotor de tipo 3. De forma similar, se pudo observar una reduccion potenciada en la expresion del acido nucleico diana mediante la provision de dos genes quimericos independientes, codificando uno de los genes quimericos un ARN inhibidor (denominado constructo de cosupresion o de silenciamiento genico sentido) dirigido contra la region promotora, y codificando el otro gen quimerico un ARN inhibidor (ARNh) dirigido tambien contra la region transcrita del acido nucleico diana. Adicionalmente, se espera una reduccion potenciada de la expresion a partir de la combinacion de un gen quimerico que codifica microARN y un gen que codifica ARNh. Tambien se espera que tales combinaciones seran eficaces en otras celulas eucariotas tales como celulas de animales.

En consecuencia, la invencion proporciona un metodo para reducir la expresion de un acido nucleico diana en una celula vegetal o planta, mediante el cual se introducen en una celula vegetal dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion de un acido nucleico diana presente en la celula vegetal, y mediante el cual las moleculas de ARN inhibidor se procesan en oligonucleotidos de 21 a 24 nucleotidos de longitud via diferentes rutas de procesamiento de la molecula de ARNi. Tales metodos dan inesperadamente como resultado una reduccion incrementada de la expresion del acido nucleico diana. Ademas, puesto que las moleculas de ARN inhibidor dan como resultado el efecto final del silenciamiento genico a traves de diferentes rutas, los metodos son menos propensos a estfmulos externos que interfieren con una de las rutas de procesamiento, pero no con la otra.

Como se usa aqrn, “efecto del silenciamiento genico” se refiere a la “reduccion de expresion de un acido nucleico diana” en una celula vegetal, que se puede lograr introduciendo un ARN de silenciamiento. La “expresion de un acido nucleico diana” se refiere a la transcripcion del acido nucleico en la celula, y la expresion reducida se puede observar o medir mediante un nivel reducido de produccion o acumulacion del transcrito o de un producto procesado, por ejemplo de un ARNm, o de un producto de traduccion del ARNm. El transcrito se puede procesar o no, por ejemplo mediante eliminacion de intrones, y se puede traducir o no; “expresion” engloba la transcripcion con o sin tales procesos. La reduccion de la expresion puede ser el resultado de la reduccion de la transcripcion, incluyendo via metilacion de remodelacion de cromatina, o modificacion post-transcripcional de las moleculas de ARN, incluyendo via degradacion del ARN, o ambas. El silenciamiento genico no se debena de interpretar necesariamente como una abolicion de la expresion del acido nucleico diana o del gen. Es suficiente que el nivel de

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expresion del acido nucleico diana en presencia del ARN de silenciamiento sea menor que en su ausencia. El nivel de expresion se puede reducir en al menos alrededor de 10%, o al menos alrededor de 15%, o al menos alrededor de 20%, o al menos alrededor de 25%, o al menos alrededor de 30%, o al menos alrededor de 35%, o al menos alrededor de 40%, o al menos alrededor de 45%, o al menos alrededor de 50%, o al menos alrededor de 55%, o al menos alrededor de 60%, o al menos alrededor de 65%, o al menos alrededor de 70%, o al menos alrededor de 75%, o al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 85%, o al menos alrededor de 90%, o al menos alrededor de 95%, o al menos alrededor de 100%. Como se usa aqm, excepto que se senale lo contrario, la frase “alrededor de” se refiere a cualquier intervalo razonable a la luz del valor en cuestion. En una realizacion preferida, el termino “alrededor de” se refiere a +/-1% del valor especificado. Como se usa aqm, “en un mayor grado” se refiere a un incremento en el efecto de al menos 10% con respecto a la referencia. Los acidos nucleicos diana pueden incluir genes endogenos, transgenes, o genes vmcos, o genes introducidos por vectores vmcos. El acido nucleico diana puede incluir ademas genes que se introducen de forma estable en el genoma de la celula del hospedante, preferiblemente en el genoma nuclear de la celula del hospedante.

Como se usa aqm, “ARN de silenciamiento” o “molecula de ARN de silenciamiento”, tambien denominados aqm como “ARN inhibidor” o “molecula de ARN inhibidor”, indica cualquier molecula de ARN que, al introducirla en una celula hospedante, preferiblemente una celula vegetal, reduce la expresion de un gen diana, particularmente a traves del silenciamiento transcripcional y/o post-transcripcional. Tal ARN de silenciamiento se puede denominar, por ejemplo, “ARN antisentido”, mediante el cual la molecula de ARN comprende una secuencia de al menos 20 nucleotidos consecutivos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia del acido nucleico diana, preferiblemente la secuencia codificante del gen diana. Sin embargo, el ARN antisentido tambien se puede dirigir contra secuencias reguladoras de genes diana, incluyendo las secuencias promotoras y las senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion. El ARN de silenciamiento incluye ademas el denominado “ARN sentido”, mediante el cual la molecula de ARN comprende una secuencia de al menos 20 nucleotidos consecutivos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia del acido nucleico diana. El ARN sentido tambien se puede dirigir a secuencias reguladoras de genes diana, incluyendo las secuencias promotoras y las senales de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion.

Por supuesto, el ARN sentido o antisentido mencionado puede ser mas largo, y puede tener alrededor de 30 nt, alrededor de 50 nt, alrededor de 100 nt, alrededor de 200 nt, alrededor de 300 nt, alrededor de 500 nt, alrededor de 1000 nt, alrededor de 2000 nt, o incluso alrededor de 5000 nt o mayor en longitud, teniendo cada uno una identidad de secuencia global de respectivamente alrededor de 40 %, 50%, 60 %, 70%, 80%, 90 % o 100% con la secuencia nucleotidica del acido nucleico diana (o su complemento). Cuanto mas larga sea la secuencia, menos restrictivo es el requisito para la identidad de secuencia global. Sin embargo, las moleculas de ARN sentido o antisentido mas largas con menos identidad de secuencia global debenan comprender al menos 20 nucleotidos consecutivos que tienen al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia del acido nucleico diana o su complemento, y pueden comprender al menos 20 nucleotidos consecutivos que tienen 100% de identidad de secuencia con la secuencia del acido nucleico diana o su complemento. La longitud del ARN sentido o antisentido puede estar entre cualquier combinacion de las cifras anteriores. En una realizacion, preferida para uso en celulas de animales, particularmente celulas de mairnferos, la longitud del ARN sentido o antisentido esta entre 20 y 30 nucleotidos. En realizaciones, la longitud del ARN sentido o antisentido es 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29 nucleotidos. Cuando el ARN de silenciamiento incluye ARN tanto sentido como antisentido, la longitud de cada uno puede ser independientemente cualquier cifra como se menciona anteriormente. En una realizacion preferida, las longitudes de los ARN sentido y antisentido son las mismas, o difieren hasta 10% o 20%, no mas.

Las dos moleculas de ARN inhibidor pueden seleccionar como diana la misma region, regiones que se solapan, o preferiblemente regiones que no se solapan del acido nucleico diana. Como se usa aqm, “que se solapan” significa que las dos regiones se solapan con al menos 2 nucleotidos consecutivos en comun. En una realizacion mas preferida, particularmente para uso en celulas de animales, tales como celulas de mamnferos, una de las dos moleculas de ARN inhibidor es un ARN de horquilla corto, que puede estar poliadenilado, pero preferiblemente no esta poliadenilado, que tiene una secuencia nucleotidica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la primera region de 20-30 nucleotidos del gen diana, y una secuencia nucleotidica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica al complemento de la primera region del gen diana, estando unidas covalentemente las secuencias sentido y antisentido mediante una region espaciadora de 3-20 nucleotidos, y la segunda de las dos moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN que tiene una secuencia nucleotidica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 20-25 nucleotidos consecutivos, al menos 95% identica al complemento de una segunda region de 20-30 o 20-25 nucleotidos del gen diana, pero que no tiene una secuencia nucleotfdica sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la segunda region del gen diana. La molecula de miARN puede tener o no una secuencia nucleotidica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos que es 60-95% identica en secuencia a la segunda region del gen diana. Las regiones primera y segunda del gen diana no son preferiblemente las mismas, y mas preferiblemente no se solapan. Preferiblemente, el ARN de horquilla corto se expresa a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa III (ARN Pol III), y la molecula de miARN se transcribe a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN Pol II como un ARN precursor (pri-miARN o pre-microARN), que se procesa subsiguientemente en la celula.

Otro ARN de silenciamiento puede ser “ARN no poliadenilado”, que comprende al menos 20 nucleotidos consecutivos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el complemento de la secuencia del acido

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nucleico diana, tal como se describe en los documentos WO01/12824 o US6423885 (ambos documentos se incorporan aqm como referencia). Aun otro tipo de ARN de silenciamiento es una molecula de ARN como se describe en los documentos WO03/076619 o WO2005/026356 (ambos documentos se incorporan aqm como referencia) que comprende al menos 20 nucleotidos consecutivos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia del acido nucleico diana o su complemento, y que comprende ademas una region enormemente bicatenaria como se describe en el documento WO03/076619 o WO2005/026356 (incluyendo regiones enormemente bicatenarias que comprenden una senal de localizacion nuclear a partir de un viroide del tipo de viroide del tuberculo fusiforme de la patata, o que comprende repeticiones de trinucleotidicas CUG). El ARN de silenciamiento tambien puede ser un ARN bicatenario que comprende una hebra sentido y antisentido como se define aqm, en el que la hebra sentido y antisentido son capaces de emparejar las bases entre sf para formar una region de ARN bicatenario (preferiblemente, los mencionados al menos 20 nucleotidos consecutivos del ARN sentido y antisentido son complementarios entre sf). La region sentido y antisentido tambien pueden estar presentes en una molecula de ARN, de manera que se puede formar un ARN de horquilla (ARNh) cuando la region sentido y antisentido forman una region de ARN bicatenario. El ARNh es bien conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento WO99/53050, incorporado aqm como referencia). El ARNh se puede clasificar como ARNh largo, que tiene regiones sentido y antisentido largas que son enormemente complementarias, pero no necesitan ser totalmente complementarias (tfpicamente mayores que alrededor de 200 pb, oscilando entre 200-1000 pb). El ARNh tambien puede ser mas bien pequeno, oscilando en tamano desde alrededor de 30 hasta alrededor de 42 pb, pero no mucho mas largo que 94 pb (vease el documento WO04/073390, incorporado aqm como referencia). Las moleculas de ARN de silenciamiento tambien podnan comprender el denominado microARN o moleculas de microARN sintetico o artificial, o sus precursores, como se describe, por ejemplo, en Schwab et al. 2006, Plant Cell 18(5):1121-1133.

El ARN de silenciamiento se puede introducir directamente en la celula vegetal, o indirectamente a traves de la transcripcion de un “gen quimerico de silenciamiento genico” introducido en la celula vegetal. El gen quimerico de silenciamiento genico se puede introducir de forma estable en el genoma de la celula vegetal, preferiblemente genoma nuclear, o se puede introducir de forma transitoria.

Todo ARN de silenciamiento como se define aqm tiene una fase intermedia en la que la molecula de ARN de silenciamiento comprende una region de ARN bicatenario. Una “region de ARN bicatenario”, como se usa aqm, tiene dos hebras de ARN que se hibridan mediante emparejamiento de bases. Las dos hebras pueden ser hebras independientes (no unidas covalentemente), o pueden estar unidas covalentemente via una region espaciadora o de bucle como partes de un ARN autocomplementario individual. “Emparejamiento de bases”, en este contexto, incluye pares de bases G:U, asf como el emparejamiento de Watson-Crick estandar. El ARN monocatenario se convierte parcial o completamente en un ARN bicatenario a traves de la accion de, por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente de ARN, o la molecula de ARN inhibidor introducida o transcrita es capaz por sf misma de formar tal region de ARN bicatenario. Si el organismo eucariota contiene mas de una protema Dicer o similar a Dicer (tal como, por ejemplo, en celulas vegetales), las diferentes protemas Dicer o similares a Dicer pueden tener una preferencia por los sustratos de ARN bicatenario, y tambien pueden diferir en longitud de los ARN interferentes cortos producidos, y es esta diferencia en el procesamiento mediante diferentes protemas Dicer o similares a Dicer, o a traves de diferentes actividades de las protemas Dicer o similares a Dicer, lo que se denomina como “diferentes rutas de procesamiento de la molecula de ARNi”. Tal diferencia en la actividad y especificidad por un sustrato de ARNbc particular se puede extender ademas al asociarlo con diferentes protemas de union a ARN bicatenario dedicadas, asf como mediante la incorporacion de las moleculas de ARN pequeno de interferencia generadas en diferentes complejos de RISC que comprenden diferentes protemas similares a argonauta.

Como se usa aqm, una “protema Dicer” es una protema que tiene actividad de ribonucleasa que esta implicada en el procesamiento de moleculas de ARN bicatenario en ARN de interferencia corto (ARNpi). La actividad de ribonucleasa se denomina actividad de ribonucleasa III, que escinde predominante o preferentemente sustratos de ARN bicatenario en vez de regiones de ARN monocatenario, seleccionando de ese modo como diana la porcion bicatenaria de la molecula de ARN. Como se usa aqm, el termino “predominantemente” significa al menos 51% hasta e incluyendo 100%, o que tiene mayor actividad de un tipo que de otro. El termino Dicer incluye protemas similares a Dicer (DCL). Las protemas Dicer estan implicadas preferentemente en el procesamiento de los sustratos de ARN bicatenario en moleculas de ARNpi de alrededor de 21 a 24 nucleotidos de longitud. Como se usa aqm, una protema “dicer vegetal” o “similar a dicer” vegetal es una protema que tiene actividad de ribonucleasa sobre sustratos de ARN bicatenario (actividad de ribonucleasa III) que se caracteriza por la presencia de al menos los siguientes dominios: un a dominio DExD o DExH (dominio DEAD/DEAH), un dominio de Helicasa-C, preferiblemente un dominio Duf283 que puede estar ausente, un dominio PAZ, dos dominios de ARNasa III, y al menos un y preferiblemente 2 dominios dsRB.

Helicasa C: El dominio que define este grupo de protemas se encuentra en una amplia variedad de helicasas y protemas relacionadas con helicasas. Puede ser que esta no sea una unidad que se pliega autonomamente, sino una parte integral de la helicasa (PF00271; IPR001650).

Dominio PAZ: Este dominio se nombra tras las protemas Piwi Argonaut y Zwille. Tambien se encuentra en la protema CAF de Arabidopsis thaliana. La funcion del dominio es desconocida, pero se ha encontrado en la region media de un numero de miembros de la familia de protemas Argonauta, que tambien contiene el dominio Piwi en su

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region C-terminal. Varios miembros de esta familia han estado implicados en el desarrollo y mantenimiento de celulas madre a traves de los mecanismos de represion genica mediada por ARN asociados con la protema Dicer. (PF02170; IPR003100)

Duf283: Este dominio putativo se encuentra en miembros de la familia de protemas Dicer. Esta protema es una ARNbc nucleasa que esta implicada en ARNi y procedimientos relacionados. Este dominio de alrededor de 100 aminoacidos no tiene funcion conocida, pero contiene 3 ligandos de cinc posibles. (PF03368, IPR005034).

DExD: Los miembros de esta familia incluyen las helicasas de la caja DEAD y DEAH. Las helicasas estan implicadas en el desenrollamiento de acidos nucleicos. Las helicasas de la caja DEAD estan implicadas en diversos aspectos del metabolismo del ARN, incluyendo transcripcion nuclear, preayuste de ARNm, biogenesis de ribosomas, transporte nucleocitoplasmico, traduccion, degradacion del ARN y expresion genica organular (PF00270, IPR011545).

ARNasa III: firma de las protemas ribonucleasa III (PF00636, IPR000999)

DsRB (motivo de union a ARN bicatenario): Secuencias reunidas para semillas mediante el motivo putativo HMM_iterative_training compartido por protemas que se unen a ARNbc. Al menos algunas protemas DSRM parecen unirse a dianas de ARN espedficas. Ejemplificadas por Staufen, que esta implicada en la localizacion de al menos cinco ARNm diferentes en el embrion prematuro de Drosophila. Tambien en seres humanos mediante protema cinasa inducida por interferon, que es parte de la respuesta celular a ARNbc (PF00035, IPR001159).

Estos dominios se pueden reconocer facilmente mediante busquedas basadas en ordenador usando, por ejemplo, los perfiles de PROSITE PD0C50821 (dominio PAZ), PDOC00448 (dominio de ARNasa III), PDOC50137 (dominio de dsRB) y PDOC00039 (dominio DExD/DexH) (PROSITE esta disponible en
www.expasy.ch/prosite). Como alternativa, se puede usar la base de datos y el algoritmo de BLOCKS (blocks.fhcrc.org) para identificar los dominios PAZ(IPB003100) o DUF283(IPB005034). Tambien estan disponibles otras bases de datos y algoritmos (pFAM:
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ INTERPRO:
http://www.ebi.ac.uk/interpro/; los numeros PF citados anteriormente se refieren a la base de datos pFAM y al algoritmo, y los numeros IPR se refieren a la base de datos pFAM y al algoritmo de INTERPRO).

Tfpicamente, en plantas, una protema DCL2 procesara ARN bicatenario en moleculas de ARN de interferencia corto de alrededor de 22 nucleotidos, una protema DCL3 procesara ARN bicatenario en moleculas de ARN de interferencia corto de alrededor de 24 nucleotidos, y una protema DCL4 procesara ARN bicatenario en moleculas de ARN de interferencia corto de alrededor de 21 nucleotidos. DCL1 esta implicada en el procesamiento de los microARN a partir de moleculas pre-microARN. Sin pretender limitar la invencion a un modo particular de accion, se piensa generalmente que los oligonucleotidos de 24 nucleotidos de longitud median la metilacion y el modelado de cromatina, mientras que los oligonucleotidos de 21 y 22 nucleotidos de longitud median tipicamente la degradacion del ARN espedfica de la secuencia (tanto en combinacion con otras protemas como polipeptidos).

Las protemas similares a dicer son bien conocidas en la tecnica. Las enzimas similares a dicer 3 son aquellas que codifican una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos alrededor de 60% o al menos alrededor de 65% o al menos alrededor de 70% o al menos alrededor de 75% o al menos alrededor de 80% o al menos alrededor de 85% o al menos alrededor de 90% o al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia, o que son esencialmente identicas a las protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos disponible de las bases de datos con los siguientes numeros de acceso: NP_189978.

Las protemas similares a dicer 4 son aquellas que codifican una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos alrededor de 60% o 65% o 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% de identidad de secuencia, o que son esencialmente identicas a las protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos disponible de las bases de datos con los siguientes numeros de acceso: AAZ80387; P84634.

Las protemas similares a dicer 2 son aquellas que codifican una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos alrededor de 60% o 65% o 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% de identidad de secuencia, o que son esencialmente identicas a las protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos disponible de las bases de datos con los siguientes numeros de acceso: NP_001078101.

Las protemas similares a dicer 1 son aquellas que codifican una protema que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos alrededor de 60% o 65% o 70% o 75% u 80% u 85% o 90% o 95% de identidad de secuencia, o que son esencialmente identicas a las protemas que comprenden una secuencia de aminoacidos disponible de las bases de datos, por ejemplo con los siguientes numeros de acceso: Q9SP32.

En Lamontagne et al., Mol Cell Biol. febrero de 2000; 20(4): 1104-1115, por ejemplo, se describe un ensayo enzimatico que se puede usar para detectar la actividad enzimatica de ARNasa III. Los productos de escision resultantes se pueden analizar posteriormente segun los metodos estandar en la tecnica para la generacion de los ARNpi de 21-24 nt.

Para los fines de la invencion, la “identidad de secuencia” de dos secuencias nucleotfdicas o de aminoacidos

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relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al numero de posiciones en las dos secuencias alineadas optimamente que tienen restos identicos (x100) dividido entre el numero de posiciones comparadas. Un espacio, es decir, una posicion en un alineamiento en el que un resto esta presente en una secuencia pero no en la otra se considera como una posicion con restos no identicos. El alineamiento de las dos secuencias se lleva a cabo mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). El alineamiento de secuencias asistido por ordenador anterior se puede llevar a cabo convenientemente usando un programa de software estandar, tal como GAP, que es parte del Wisconsin Package Version 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, USA), usando la matriz de puntuacion por defecto con una penalizacion de creacion de espacio de 50 y una penalizacion de extension de salto de 3. Las secuencias se indican como “esencialmente similares” cuando tal secuencia tiene una identidad de secuencia de al menos alrededor de 75%, particularmente al menos alrededor de 80%, mas particularmente al menos alrededor de 85%, bastante particularmente alrededor de 90%, especialmente alrededor de 95%, mas especialmente alrededor de 100%, muy especialmente son identicas. Esta claro que cuando las secuencias de ARN son esencialmente similares o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con las secuencias de ADN, se considera que la timina (T) en la secuencia de ADN es igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. De este modo, cuando en esta solicitud se senala que una secuencia de 19 nucleotidos consecutivos tiene al menos 94% de identidad de secuencia con una secuencia de 19 nucleotidos, esto significa que al menos 18 de los 19 nucleotidos de la primera secuencia son identicos a 18 de los 19 nucleotidos de la segunda secuencia.

De este modo, la invencion proporciona metodos para reducir la expresion de un acido nucleico diana en una celula vegetal (o planta u organismo eucariota) mediante la introduccion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion del mismo acido nucleico diana presente en la celula vegetal, por lo cual una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1 o una ARNasa similar, mientras que la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o una ARNasa similar. Sin pretender limitar la invencion, tal metodo se puede llevar a cabo introduciendo en una celula un microARN dirigido contra el acido nucleico de interes y un ARN de horquilla bicatenario, particularmente un ARNh mas largo (que comprende, por ejemplo, una region de ARN bicatenario de al menos 50, 60, 90, 120, 150, 300 nucleotidos), dirigido contra el mismo acido nucleico de interes.

Este documento tambien describe metodos para reducir la expresion de un acido nucleico diana en una celula vegetal (o planta) mediante la introduccion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion del mismo acido nucleico diana presente en la celula vegetal, por lo que una de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL3 o una ARNasa similar, mientras que la otra de las moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o una ARNasa similar. Sin pretender limitar la invencion, tal metodo se puede llevar a cabo introduciendo en una celula un ARN inhibidor dirigido contra las regiones reguladoras de un gen diana (tal como la region promotora), mientras que el otro ARN inhibidor se dirige contra la region transcrita del gen diana. De otro modo, tal metodo se puede llevar a cabo proporcionando a la celula dos genes quimericos que codifican el ARN inhibidor, dirigiendose la expresion de un gen quimerico mediante un promotor reconocido por una ARN polimerasa II dependiente de ADN, mientras que la expresion del otro gen quimerico esta dirigida por un promotor reconocido por una ARN polimerasa III dependiente de ADN, tal como un promotor del subtipo 3.

De forma similar, se describen otras combinaciones de ARN inhibidor, tales como:

• Un ARN inhibidor escindido predominantemente mediante DCL1 o una ARNasa similar, y un ARN inhibidor escindido predominantemente por DCL2 o una ARNasa similar;

• Un ARN inhibidor escindido predominantemente mediante DCL1 o una ARNasa similar, y un ARN inhibidor escindido predominantemente por DCL3 o una ARNasa similar;

• Un ARN inhibidor escindido predominantemente mediante DCL2 o una ARNasa similar, y un ARN inhibidor escindido predominantemente por DCL3 o una ARNasa similar;

• Un ARN inhibidor escindido predominantemente mediante DCL2 o una ARNasa similar, y un ARN inhibidor escindido predominantemente por DCL4 o una ARNasa similar.

Como se usa aqrn, el termino “promotor” significa cualquier ADN que es reconocido y es unido (directa o indirectamente) mediante una ARN polimerasa dependiente de ADN durante el inicio de la transcripcion. Un promotor incluye el sitio de iniciacion de la transcripcion, y sitios de union para factores de iniciacion de la transcripcion y para ARN polimerasa, y puede comprender otros diversos sitios (por ejemplo, potenciadores), a los cuales se pueden unir las protemas reguladoras de la expresion genica.

La expresion “region reguladora”, como se usa aqrn, significa cualquier ADN que esta implicado en conducir la transcripcion y controlar (es decir, regular) el momento y nivel de transcripcion de una secuencia de ADN dada, tal como un ADN que codifica una protema o polipeptido. Por ejemplo, una secuencia reguladora de 5' (o “region promotora”) es una secuencia de ADN situada en direccion 5' (es decir, 5') de una secuencia codificante, y que comprende el promotor y la secuencia lfder no traducida de 5'. Una region reguladora de 3' es una secuencia de ADN situada en direccion 3' (es decir, 3') de la secuencia codificante, y que comprende senales de terminacion (y/o

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regulacion) de la transcripcion adecuadas, incluyendo una o mas senales de poliadenilacion.

En una realizacion de la invencion, el promotor es un promotor reconocido por ARN polimerasa II. Los promotores de ARN PolII incluyen los promotores mas habitualmente conocidos. En otra realizacion de la invencion, el promotor es un promotor reconocido por ARN polimerasa III. Como se usa aqm, “un promotor reconocido por la ARN polimerasa III dependiente de ADN” es un promotor que dirige la transcripcion de la region asociada del ADN a traves de la accion de polimerasa de la ARN polimerasa III. Estos incluyen genes que codifican ARN 5S, ARNt, ARN 7SL, ARNnp U6, y unos pocos ARN estables pequenos, muchos implicados en el procesamiento del ARN. La mayona de los promotores usados por Pol III requieren elementos de secuencia en direccion 3' de +1, en la region transcrita. Sin embargo, una minona de moldes de pol III carecen de cualquier requisito de elementos promotores intragenicos. Estos se denominan como promotores de tipo 3. En otras palabras, los “promotores de Pol III de tipo 3” son aquellos promotores que son reconocidos por ARN polimerasa III y contienen todos los elementos que actuan en cis, que interaccionan con la ARN polimerasa III en direccion 5' de la region normalmente transcrita por ARN polimerasa III. Tales promotores de Pol III de tipo 3 se pueden combinar asf facilmente en un gen quimerico con una region heterologa, cuya transcripcion se desea, tal como las regiones codificantes de ARNbc de la actual invencion.

Tfpicamente, los promotores de Pol III de tipo 3 contienen una caja TATA (situada entre -25 y -30 en el gen de ARNnp U6 humano) y un elemento de secuencia proximal (PSE; situado entre -47 y -66 en el ARNnp U6 humano). Tambien pueden contener un Elemento de Secuencia Distal (DSE; situado entre -214 y -244 en ARNnp U6 humano).

Los promotores de Pol III de tipo 3 se pueden encontrar asociados, por ejemplo, con los genes que codifican ARN 7SL, ARNnp U3 y ARNnp U6. Tales secuencias se han aislado de Arabidopsis, arroz y tomate, y se pueden encontrar en bases de datos de secuencias nucleotfdicas bajo las entradas para el gen de A. thaliana AT7SL-1 para ARN 7SL (X72228), el gen de A. thaliana AT7SL-2 para ARN 7SL (X72229), el gen de A. thaliana AT7SL-3 para ARN 7SL (AJ290403), el gen de Humulus lupulus H17SL-1 (AJ236706), el gen de Humulus lupulus H17SL-2 (AJ236704), el gen de Humulus lupulus H17SL-3 (AJ236705), el gen de Humulus lupulus H17SL-4 (AJ236703), el gen de A. thaliana de ARNnp U6-1 (X52527), el gen de A. thaliana de ARNnp U6-26 (X52528), el gen de A. thaliana de ARNnp U6-29 (X52529), el gen de A. thaliana de ARNnp U6-1 (X52527), el gen de Zea mays de ARNnp U3 (Z29641), el gen de Solanum tuberosum de ARNnp U6 (Z17301; X 60506; S83742), el gen de tomate de ARN nuclear pequeno U6 (X51447), el gen de A. thaliana de ARNnp U3C (X52630), el gen de A. thaliana de ARNnp U3B (X52629), el promotor de Oryza sativa de ARNnp U3 (X79685), el gen del tomate de ARN nuclear pequeno U3 (X1441l), el gen de Triticum aestivum de ARNnp U3 (X63065), el gen de Triticum aestivum de ARNnp U6 (X63066).

No hace falta decir que los promotores de Pol III de tipo 3 variantes se pueden aislar de otras variedades de tomate, arroz o Arabidopsis, o de otras especies vegetales, con poca experimentacion. Por ejemplo, se pueden aislar bibliotecas de clones genomicos de tales plantas usando como sonda secuencias codificantes de ARNnp U6, ARNnp U3 o ARN 7SL (tales como las secuencias codificantes de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente identificadas mediante su numero de acceso, y adicionalmente la secuencia codificante de ARNnp U6 de Vicia faba (X04788), el ADN de mafz para ARNnp U6 (X52315). o el ADN de mafz para ARN 7SL (X14661)), y las secuencias en direccion 5', preferiblemente en la direccion 5' de alrededor de 300 a 400 pb de las regiones transcritas, se pueden aislar y usar como promotores de Pol III de tipo 3. Como alternativa, para aislar las secuencias genomicas, incluyendo las secuencias promotoras adyacentes a regiones transcritas conocidas, se pueden usar tecnicas a base de PCR, tales como PCR inversa o PCR TAIL®. Ademas, cualquiera de las secuencias de los promotores de PolIII de tipo 3 anexas, o de las secuencias promotoras mencionadas anteriormente, identificadas mediante sus numeros de acceso, se pueden usar como sondas en condiciones de hibridacion restrictivas o como una fuente de informacion para generar cebadores de PCR para aislar las secuencias promotoras correspondientes de otras variedades o especies vegetales.

“Condiciones de hibridacion restrictivas”, como se usa aqm, significa que la hibridacion se producira generalmente si hay al menos 95%, y preferiblemente al menos 97% de identidad de secuencia entre la sonda y la secuencia diana. Los ejemplos de condiciones de hibridacion restrictivas son incubacion durante toda la noche en una disolucion que comprende 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisodico 15 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), disolucion de Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 |ig/ml de ADN portador desnaturalizado y cizallado, tal como ADN de esperma de salmon, seguido del lavado del soporte de hibridacion en 0,1 x SSC a aproximadamente 65°C. Otras condiciones de hibridacion y de lavado son bien conocidas, y se ejemplifican en Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el capftulo 11.

Aunque los promotores de Pol III de tipo 3 no tienen ningun requisito de elementos que actuan en cis situados en la region transcrita, esta claro que las secuencias normalmente situadas en direccion 3' del sitio de iniciacion de la transcripcion se pueden incluir no obstante en los constructos quimericos de la invencion.

Tambien se ha observado que los promotores de Pol III de tipo 3 aislados originalmente de plantas monocotiledoneas se pueden usar con buenas consecuencias tanto en celulas vegetales y plantas dicotiledoneas como monocotiledoneas, mientras que los promotores de Pol III de tipo 3 aislados originalmente de plantas dicotiledoneas solamente se pueden usar eficientemente en celulas vegetales y plantas dicotiledoneas. Ademas, el

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silenciamiento genico mas eficiente se ha obtenido cuando se usaron genes quimericos que comprenden un promotor de Pol III de tipo 3 derivado de la misma especie o de especies estrechamente relacionadas.

Tfpicamente, las regiones terminadoras para la transcripcion mediada por Pollll polimerasa constituyen un tramo de oligo dT, un tramo de restos T consecutivos que comprenden al menos 4 restos de T, pero obviamente puede contener mas restos de T.

En una realizacion de la invencion, el promotor es un promotor constitutivo. En otra realizacion de la invencion, la actividad promotora esta potenciada por estfmulos externos o internos (promotor inducible), tal como, pero sin limitarse a, hormonas, compuestos qmmicos, impulsos mecanicos, condiciones de estres abiotico o biotico. La actividad del promotor tambien se puede regular de una manera temporal o espacial (promotores espedficos de los tejidos; promotores regulados mediante el desarrollo).

En una realizacion particular de la invencion, el promotor es un promotor expresable en una planta. Como se usa aqrn, la expresion “promotor expresable en una planta” significa una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) transcripcion en una celula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero tambien cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripcion en una celula vegetal, es decir, ciertos promotores de origen vmco o bacteriano tal como el CaMV35S (Hapster et al., 1988 Mol. Gen. Genet. 212, 182-190), el promotor del virus del trebol subterraneo n° 4 o n° 7 (documento WO9606932), o los promotores del gen de ADN-T, pero tambien los promotores espedficos de tejidos o promotores espedficos de organos, incluyendo, pero sin limitarse a, promotores espedficos de semillas (por ejemplo, documento WO89/03887), promotores espedficos de los primordios de un organo (An et al., 1996 The Plant Cell 8, 15-30), promotores espedficos del tallo (Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), promotores espedficos de la hoja (Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12: 579-589), promotores espedficos del mesofilo (tales como los promotores Rubisco inducibles por la luz), promotores espedficos de la rafz (Keller et al.,1989 Genes Devel. 3: 1639-1646), promotores espedficos del tuberculo (Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323-1330), promotores espedficos del tejido vascular (Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotores selectivos del estambre (documentos WO 89/10396, WO 92/13956), promotores espedficos de la zona de dehiscencia (documento WO 97/13865), y similares.

La invencion tambien contempla el uso de moleculas de microARN artificiales o hechas por el hombre, en combinacion con un ARN inhibidor procesado predominantemente via una ruta de procesamiento de ARNi diferente de la ruta de procesamiento de microARN. En plantas, esto se refiere a una ruta de procesamiento de ARNi diferente de la actividad de ARNasa III de protema similar a Dicer 1. La generacion de moleculas de microARN artificiales dirigidas contra un acido nucleico diana particular ya esta bastante consolidado en la tecnica.

Como se usa aqrn, un “miARN” es una molecula de ARN de alrededor de 20 a 22 nucleotidos de longitud que se puede cargar en un complejo de RISC y dirige la escision de otra molecula de ARN, en el que la otra molecula de ARN comprende una secuencia nucleotfdica esencialmente complementaria a la secuencia nucleotfdica de la molecula de miARN, por lo que se pueden producir uno o mas de los siguientes emparejamientos erroneos:

• un emparejamiento erroneo entre el nucleotido en el extremo 5' de dicho miARN y la secuencia nucleotidica correspondiente en la molecula de ARN diana;

• un emparejamiento erroneo entre uno cualquiera de los nucleotidos en la posicion 1 a la posicion 9 de dicho miARN y la secuencia nucleotidica correspondiente en la molecula de ARN diana;

• tres emparejamientos erroneos entre uno cualquiera de los nucleotidos en la posicion 12 a la posicion 21 de dicho miARN y la secuencia nucleotidica correspondiente en la molecula de ARN diana, con la condicion de que no haya mas de dos emparejamientos erroneos consecutivos.

• No se permite ningun emparejamiento erroneo en las posiciones 10 y 11 del miARN (todas las posiciones de miARN se indican partiendo del extremo 5' de la molecula de miARN).

Un miARN se procesa a partir de una molecula de “pre-miARN” mediante protemas, tales como protemas DCL, presentes en cualquier celula vegetal y cargadas en un complejo de RISC, en el que puede guiar la escision de las moleculas de ARN diana.

Las moleculas de pre-microARN se procesan habitualmente a partir de moleculas de pri-microARN (transcritos primarios). En animales, la maduracion de microARN se inicia mediante el complejo de Drosha-DGCR8 mediante escision precisa de los tallos-bucles que estan embebidos en los transcritos primarios. Los segmentos de ARN monocatenario que flanquean el pre-microARN son importantes para el procesamiento del pri-miARN en el premiARN. El sitio de escision parece que esta determinado por la distancia de la union del tallo-ARNmc (Han et al. 2006, Cell 125, 887-901, 887-901).

Como se usa aqrn, una molecula de “pre-miARN” es una molecula de ARN de alrededor de 100 a alrededor de 200 nucleotidos, preferiblemente alrededor de 100 a alrededor de 130 nucleotidos, que puede adoptar una estructura secundaria que comprende un tallo de ARN bicatenario y un bucle de ARN monocatenario, y que comprende ademas la secuencia nucleotidica del miARN (y su secuencia complemento) en el tallo del aRn bicatenario.

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Preferiblemente, el miARN y su complemento estan situados alrededor de 10 a alrededor de 20 nucleotidos desde los extremos libres del tallo de ARN bicatenario de miARN. La longitud y la secuencia de la region del bucle monocatenaria no son cnticas, y pueden variar considerablemente, por ejemplo entre 30 y 50 nt en longitud. Preferiblemente, la diferencia en energfa libre entre la estructura de ARN no emparejado y emparejado esta entre - 20 y -60 kcal/mol, particularmente alrededor de -40 kcal/mol. La complementariedad entre el miARN y el miARN* no necesita ser perfecta, y se pueden tolerar alrededor de 1 a 3 protuberancias de nucleotidos sin emparejar. La estructura secundaria adoptada por una molecula de ARN se puede predecir mediante algoritmos de ordenador convencionales en la tecnica, tal como mFOLD. La hebra particular del tallo de ARN bicatenario del pre-miARN, que se libera mediante la actividad de DCL y se carga en el complejo de RISC, se determina mediante el grado de complementariedad en el extremo 5', con lo que la hebra que en su extremo 5' es la menos implicada en el enlazamiento de hidrogeno entre los nucleotidos de las diferentes hebras del tallo de ARNbc escindido se carga en el complejo de RISC y determinara la especificidad de secuencia de la degradacion de la molecula de ARN diana. Sin embargo, si empmcamente la molecula de miARN procedente de una molecula de pre-miARN sintetico particular no es funcional (debido a que la hebra “erronea” se carga en el complejo de RISC), inmediatamente sera evidente que este problema se puede resolver intercambiando la posicion de la molecula de miARN y su complemento en las hebras respectivas del tallo de ARNbc de la molecula de pre-miARN. Como se sabe en la tecnica, la union entre A y U que implica dos enlaces de hidrogeno, o G y U que implica dos enlaces de hidrogeno, es menos fuerte que entre G y C, que implica tres enlaces de hidrogeno.

Las moleculas de miARN de origen natural pueden estar comprendidas en sus moleculas de pre-miARN de origen natural, pero tambien se pueden introducir en armazones de moleculas de pre-miARN existentes intercambiando la secuencia nucleotidica de la molecula de miARN normalmente procesada de tal molecula de pre-miARN existente por la secuencia nucleotidica de otro miARN de interes. El armazon del pre-miARN tambien puede ser completamente sintetico. Igualmente, las moleculas de miARN sinteticas pueden estar comprendidas en, y procesarse a partir de, armazones de moleculas de pre-miARN existentes o armazones de pre-miARN sinteticos. De forma interesante, se ha observado que algunos armazones de pre-miARN pueden ser preferidos con respecto a otros por su eficiencia para ser procesados correctamente en los microARN designados, particularmente cuando se expresan como un gen quimerico en el que otras regiones de ADN, tales como secuencias lfder no traducidas o regiones de terminacion de la transcripcion y de poliadenilacion, se incorporan en el transcrito primario, ademas del pre-microARN. En particular, se ha encontrado que la transcripcion de un transcrito primario que comprende un pre- microARN y otras regiones mas o menos complementarias puede interferir con el procesamiento correcto del transcrito primario en pre-microARN, y finalmente en el micro-ARN designado. Otros armazones de pre-microARN, tales como, por ejemplo, premicroARN398, pueden ser menos propensos a tal procesamiento incorrecto. Se espera que la presencia de una o mas regiones monocatenarias no estructuradas, en una localizacion fija particular desde el sitio de escision de la molecula de pre-miARN en una region global de ARN mayoritariamente bicatenaria, influya en el procesamiento correcto de las moleculas de pre-miARN designadas, y contribuya al hecho de que, por ejemplo, el procesamiento de armazones derivados de pre-miR398 del transcrito primario sea menos propenso a errores que, por ejemplo, el procesamiento de armazones derivados de pre-miR171 de transcritos primarios.

Estara inmediatamente claro para el experto que la presencia de secuencias adicionales puede tener una influencia sobre el plegamiento de la molecula de ARN del transcrito primario en una estructura de ARN secundaria, y particularmente en la presencia y localizacion de protuberancias o estructuras de ARN monocatenarias en (sub)estructuras de tallo de ARN de otro modo bicatenario. La localizacion de estructuras de ARN monocatenario o de protuberancias con respecto al pre-miARN, es decir, la distancia en nucleotidos, se debena mantener cuidadosamente. Las estructuras de aRn secundarias para una secuencia nucleotfdica de ARN particular se pueden predecir facilmente usando herramientas de software y algoritmos bien conocidos en la tecnica, tal como MFOLD (Zucker et al. 2003 Nucleic Acids Research 31, 3406-3415). Ademas, esta dentro de la pericia de la tecnica disenar o modificar un nucleotido sustituyendo nucleotidos en una secuencia nucleotfdica, de manera que los nucleotidos recientemente introducidos exhiben mas o menos complementariedad con otra parte de la secuencia nucleotfdica, y de este modo influyen en la generacion de bucles de ARN bicatenario o de protuberancias de ARN monocatenario.

Tambien es un objeto de la invencion proporcionar celulas vegetales o plantas que contienen la combinacion de moleculas de ARN inhibidor segun la invencion. Tambien se incluyen dentro del alcance de la presente invencion los gametos, semillas, embriones, ya sea cigoticos o somaticos, la progenie o los hfbridos de las plantas que comprenden la combinacion de moleculas de ARN inhibidor de la presente invencion, que se producen mediante metodos de reproduccion tradicionales.

Como se usa aqrn, “molecula de ARNbc introducida artificialmente” se refiere a la introduccion directa de una molecula de ARNbc, que puede ocurrir, por ejemplo, exogena o endogenamente mediante transcripcion de un gen quimerico que codifica tal molecula de ARNbc; sin embargo, no se refiere a la conversion de una molecula de ARN monocatenario en un ARNbc en el interior de la celula vegetal.

Se cree que los metodos y medios descritos aqrn son adecuados para todas las celulas vegetales y plantas, gimnospermas y angiospermas, celulas vegetales y plantas tanto dicotiledoneas como monocotiledoneas, incluyendo, pero sin limitarse a, Arabidopsis, alfalfa, cebada, haba, mafz o mafz, algodon, lino, avena, guisante, colza, arroz, centeno, alazor, sorgo, soja, girasol, tabaco y otras especies de Nicotiana, incluyendo Nicotiana benthamiana, trigo, esparrago, remolacha, brocoli, repollo, zanahoria, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga,

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cebolla, colza, pimiento, patata, calabaza, rabano, espinaca, calabacm, tomate, calabacm, almendra, manzana, albaricoque, banana, mora, arandano, cacao, cereza, coco, arandano rojo, datil, uva, pomelo, guayaba, kiwi, limon, lima, mango, melon, nectarina, naranja, papaya, fruta de la pasion, melocoton, cacahuete, pera, pina, pistacho, ciruela, frambuesa, fresa, mandarina, nuez y sandfa, vegetales de Brassica, cana de azucar, vegetales (incluyendo endibia, lechuga, tomate), Lemnaceae (incluyendo especies de los generos Lemna, Wolffiella, Spirodela, Landoltia, Wolffia), y remolacha.

La introduccion de genes quimericos (o moleculas de ARN) en la celula hospedante se puede lograr mediante una variedad de metodos, incluyendo transfeccion mediante fosfato calcico, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, electroporacion, bombardeo con microproyectiles, microinyeccion en nucleos, y similares.

Los metodos para la introduccion de genes quimericos en plantas son bien conocidos en la tecnica, e incluyen transformacion mediada por Agrobacterium, suministro mediante pistola de partfculas, microinyeccion, electroporacion de celulas intactas, transformacion de protoplastos mediada por polietilenglicol, electroporacion de protoplastos, transformacion mediada por liposomas, transformacion mediada por triquitos de silicio, etc. Las celulas transformadas obtenidas de esta manera se pueden regenerar entonces en plantas fertiles maduras.

Tambien se incluyen dentro del alcance de la presente invencion los gametos, semillas, embriones, progenie, hforidos de plantas que comprenden los genes quimericos de la presente invencion, que se producen mediante metodos de reproduccion tradicionales.

Como se usa aqm, “la secuencia nucleotfdica del gen de interes” se refiere habitualmente a la secuencia nucleotfdica de la hebra de ADN que corresponde en secuencia a la secuencia nucleotfdica del ARN transcrito a partir de tal gen de interes, excepto que se especifique de otro modo.

Estara claro que los metodos anteriores se pueden aplicar a celulas vegetales in vivo o in vitro.

Los siguientes Ejemplos no limitantes describen metodos y medios segun la invencion. Excepto que se senale de otro modo en los Ejemplos, todas las tecnicas de ADN recombinante se llevan a cabo segun protocolos estandar como se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Closing: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los Volumenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y metodos estandar para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications, UK. Otras referencias para tecnicas de biologfa molecular estandar incluyen Sambrook y Russell (2001) Molecular Closing: A Laboratory Manual, Tercera Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edicion, Academic Press (UK). Los materiales y metodos estandar para reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, Primera Edicion, Springer Verlag, Alemania.

Ejemplos

Ejemplo 1: Combinacion de genes quimericos transcritos mediante PolII y transcritos mediante PolIII dirigidos contra un gen informador (para referencia solamente).

Para evaluar si una combinacion de transgenes que codifican ARNh que comprenden uno expresado a partir de un promotor reconocido por ARN polimerasa II (por ejemplo, un promotor de CaMV35S) y otro expresado a partir de un promotor reconocido por ARN polimerasa III (por ejemplo, un promotor de AtU6) potenciana la eficacia del silenciamiento de un gen diana, se realizaron cruces entre plantas de Arabidopsis que comprenden transgenes que codifican ARN inhibidor de 35S- o AtU6-PDShp42, y se identificaron plantas de progenie que comprenden ambos transgenes, y el grado de silenciamiento del gen diana de PDS se comparo con plantas que contienen solamente uno de los transgenes. De forma similar, se realizaron cruces entre plantas de Arabidopsis que expresan transgenes de ARNh de GUS dirigidos por 35S o AtU3, para comparar la eficacia de la combinacion comparada con los transgenes individuales.

a) Genes quimericos

Las estirpes transgenicas de Arabidopsis que comprenden los transgenes de PDShp42 dirigido por 35S o AtU6 y de hpGUS dirigido por 35S o AtU3 se han descrito con detalle en el documento WO2004/073390 (incorporado aqm como referencia; vease particularmente el Ejemplo 2 y el Ejemplo 5).

De forma breve, para producir los genes quimericos de PDShp42, se hibridaron oligonucleotidos para generar un fragmento de ADN bicatenario que cuando se transcribiera producina un transcrito de ARN que tiene autocomplementariedad (regiones sentido y antisentido de complementariedad, cada una de 42 nucleotidos), de manera que el transcrito al plegarse tuvo una region bicatenaria (duplex) de 42 pares de bases contiguos unidos mediante un bucle monocatenario de 9 nt. La secuencia nucleotfdica de la region sentido correspondio a parte de la secuencia (nucleotidos 1570 a 1611 de AT4G14210.2 disponible en

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http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=locus&name=AT4G14210) del gen de fitoeno-desaturasa de Arabidopsis, y la region antisentido correspondio al complemento de los 42 nucleotidos. El fragmento de ADN se enlazo operablemente a una secuencia promotora de CaMV35S y una region terminal de 3' de octopina sintasa (senal de terminacion de la transcripcion/poliadenilacion), o a un promotor del gen de ARN pequeno U6 de A. thaliana y una secuencia oligo dT (8 T) que fue capaz de funcionar como un terminador de la transcripcion para un promotor de tipo Pol III. Cuando los constructos de silenciamiento se transfirieron a A. thaliana, la disminucion eficaz de la expresion del gen de PDS endogeno dio como resultado el hecho de que las hojas exhibiesen un fotoblanqueamiento (vease, por ejemplo, la Figura 1B). El grado de fotoblanqueamiento fue indicativo del grado de silenciamiento genico, y por lo tanto de la eficacia del constructo o constructos de silenciamiento.

Para producir los genes quimericos que codifican GUShp92, se sintetizo una secuencia de ADN repetida invertida de GUS que comprendio 186 nucleotidos que corresponden a la secuencia sentido del gen de GUS (nt 512-697 del ORF de GUS), fusionada en el extremo 3' con una secuencia antisentido que corresponde a los primeros 93 nucleotidos del fragmento de 186 nt (nucleotidos 512-604 del ORF de GUS). Por lo tanto, la transcripcion de la secuencia repetida invertida de GUS produjo un ARN con regiones sentido y antisentido de la complementariedad, capaz de hibridarse para formar una region duplex de 93 pares de bases, unida mediante un bucle monocatenario. Esta secuencia repetida invertida se enlazo operablemente a una secuencia promotora de CaMV35S y una region terminal de 3' de octopina sintasa, o a un promotor del gen de ARN pequeno U3 de A. thaliana y una secuencia oligo dT (9 T) para la terminacion de la transcripcion, o a un promotor del gen de ARN pequeno U6 de A. thaliana y una secuencia oligo dT. Cuando se transfirio a A. thaliana que comprende un transgen de CaMV35S-GUS como un gen diana, la eficiencia de la disminucion del gen de GUS mediante los genes quimericos que codifican ARN inhibidor o su combinacion se midio usando ensayos de GUS convencionales que usan MUG como sustrato.

b) Analisis Northern

Un analisis de transferencia Northern mostro que los ARNh producidos a partir de los dos tipos de transgenes de GUShp93 se procesaron diferentemente en formas mas cortas en las plantas transgenicas (Figura 2). Las estirpes 35S mostraron predominantemente la especie de 21 nt (Figura 2, panel A, lmeas 1-6, panel B, lmeas 1, 2, 4, 6), mientras que las estirpes U6 mostraron las especies 24 nt y/o 22 nt (Figura 2, panel A, 7-22, panel B, 8, 9, 10, 11, 12, 15-18 y 22). Ademas, se observaron diferencias en los patrones de las especies de procesamiento del ARN intermedias. Las estirpes de 35S-GUShp93 mostraron una especie de ARN predominante de ~90 nt, que corresponde al bucle del ARN GUShp93, mientras que las estirpes U6-GUShp93 mostraron que el fragmento predominante fue el ARN de GUShp93 de longitud completa.

De forma similar, un analisis de transferencia Northern mostro que los ARNh producidos a partir de los dos tipos de transgenes de PDShp42 tambien se procesaron diferentemente en formas mas cortas (Figura 1A). De hecho, las lmeas 1-6 (que corresponden a plantas que comprenden el transgen conducido por el promotor de 35S) mostraron especies de ARNpi de 24 nt y 21 nt de longitud, mientras que las lmeas 7-12 (que corresponden a plantas que comprenden el transgen de PDShp42 dirigido por el promotor U6) mostraron solamente la especie de 24 nt. Ademas, se observaron diferencias en los patrones de la especie de procesamiento del ARN intermedia.

Tomados juntos, estos resultados indicaron que los ARNh transcritos mediante U6 y 35S se procesaron de forma diferente, siendo el transcrito conducido por U6 procesado predominantemente, si no totalmente, por la ruta de procesamiento dependiente de DCL3 y/o DCL2, mientras que el transcrito conducido por 35S se proceso predominantemente mediante las rutas de DCL4 y/o DCL3. Esto tambien indico que el silenciamiento dirigido por ARNh de 35S y de AtU6 funciono a traves de diferentes rutas. Por lo tanto, se analizaron las plantas para establecer si la combinacion de los dos tipos de constructos proporcionana un silenciamiento mejorado en grado y/o duracion y/o estabilidad.

c) Analisis fenotfpico de plantas que comprenden ambos tipos de transgenes hp.

Plantas parentales heterocigotas que contienen el transgen 35S-PDShp42 (masculino) se cruzaron con plantas parentales heterocigotas para el transgen AtU6-PDShp42 (femenino), y se obtuvieron plantas de la progenie F1 que comprenden ambos transgenes y se compararon con las plantas parentales que contienen uno o el otro de los transgenes.

Estirpe PolII

Estirpe Pollll Semilla F1 obtenida

35S-PDShp42

AtU6-PDShp42 35S-2 X U6-32 35S-2 X U6-36 35S-7 X U6-33 35S-7 X U6-40 35S-16 X U6-33 35S-16 X U6-40 35S-19 X U6-32 35S-19 X U6-36

En base a la intensidad del blanqueamiento de la hoja, las plantas F1 de al menos cuatro de los cruces mostraron un mayor grado de silenciamiento genico de PDS en comparacion con las estirpes U6 parentales (Figura 1B).

De forma similar, las plantas que contienen los transgenes 35S-GUShp93 se cruzaron con plantas que contienen el transgen AtU6-GUShp93 o AtU3-GUShp93, y se obtuvo una progenie que comprende ambos transgenes. Las 5 estirpes F2 que resultan de la autofecundacion de la poblacion F1 se identificaron mediante PCR a partir de los cruces entre las estirpes de GUShp93 dirigidas por 35S y AtU3/AtU6, que conteman el transgen individual dirigido por 35S o por Pol III, o ambos tipos de transgenes. Las estirpes F2 habnan sido homocigotas o heterocigotas (segregantes) para los genes que codifican los ARN inhibidores. Aunque no se pudieron excluir en este experimento los efectos del numero de copias, se pudo determinar un grado promedio de silenciamiento analizando suficientes 10 estirpes.

Estirpe PolII

Estirpe PolIII F1 obtenida F2 obtenida

35S-GUShp93 (pMBW479)

AtU6+20-GUShp93 (pMBW488) 479-A X 488-6 488-13 X 479-1 479-1 X 488-6 479-4 X 488-1 488-1 X 479-2 479-A X 488-6 488-13 X 479-1 479-4 X 488-1 488-1 X 479-2

35S-GUShp93 (pMBW479)

AtU6-GUShp93 (pMBW486) 479-5 X 486-2 486-2 X 479-4 486-2 X 479-4

35S-GUShp93 (pMBW479)

AtU3+136-GUShp93 (pMBW480) 479-1 X 480-2 479-4 X 480-6 479-1 X 480-2

35S-GUShp93 (pMBW479)

AtU3-GUShp93 (pMBW481) 479-2X481-1 479-5 X 481-8 479-5 X 481-8

Las diferentes plantas transgenicas que comprenden transgenes individuales o la combinacion de los mismos se analizan para determinar la expresion de GUS. El analisis de plantas F3 procedentes de un cruce (479-A X 488-6) revelo que estas plantas parecen tener un silenciamiento mas uniforme que aquellas que contienen solamente un 15 transgen. Los resultados del ensayo de MUG para diferentes plantas F3 de un cruce 35S-GUShp93 x U6-GUShp93 se representan graficamente en la Figura 3.

Las diferencias en las rutas de procesamiento usadas mediante los transcritos de PolII y Pollll estaban aparentemente relacionados no solo con los diferentes promotores usados - los promotores de Pollll son activos preferentemente en la region nucleolar del nucleo, mientras que los promotores de PolII son activos en otras 20 regiones del nucleo - sino tambien con la estructura de los transcritos. Los transcritos de PolII tambien contienen una porcion lfder en 5' derivada de la transcripcion del promotor 35S que se uso para obtener el constructo, asf como una region 3' UTR derivada mediante transcripcion del terminador ocs de 3' que se uso, y una cola de poliA. Estas secuencias de 5' y 3' adicionales sumaron hasta 200-300 nt para el transcrito de polII producido mediante el constructo de 35S. Por el contrario, los constructos de U6 que se obtuvieron expresaron un transcrito que 25 comprende la porcion de horquilla (region duplex mas el bucle monocatenario) con una region de 5' adicional de aproximadamente 20 nt, pero sin ninguna cola de poliA. Por lo tanto, los transcritos de PolII y de PolIII se pleganan en estructuras bastante diferentes. Se piensa que los transcritos de ARN estan unidos mediante protemas de union a ARN bicatenario (DRBP) poco despues de la transcripcion, y que los diferentes transcritos se pueden unir mediante diferentes DRBP, conduciendo a un acceso diferencial a protemas DCL y a la incorporacion en diferentes 30 tipos de complejos de RISC. A su vez se esperaba que esto condujera a diferentes contribuciones al silenciamiento genico transcripcional (TGS), que implica en particular metilacion de regiones promotoras, y PTGS. Se piensa que los transcritos dirigidos por PolIII que producen 24meros que corresponden a las regiones promotoras son particularmente eficaces en la mediacion de TGS.

Ejemplo 2: Combinacion de microARN y ARNh dirigida contra genes endogenos de PHYB

35 Se construyo un primer gen quimerico que codifica un ARNh inhibidor dirigido contra una region codificante de fitocromo B de Arabidopsis usando tecnicas de ADN recombinante convencionales enlazando operablemente las siguientes regiones de ADN por orden: una region promotora, una region de ADN que, cuando se transcribe, produce una molecula de ARN sentido, que corresponde a la secuencia de la region codificante de PHYB desde el nucleotido 789 al nucleotido 809 del numero de Acceso EF193580, y una molecula de ARN antisentido 40 complementaria a la molecula de ARN sentido, y una region terminal de 3'.

Usando tecnicas de ADN recombinante convencionales, se construyo un segundo gen quimerico que comprende una region transcrita que codifica un armazon de miR159 pri-microARN, en el que la region de microARN se adapto para comprender una secuencia nucleotidica (TTATAAGTTTCATGAAGATGA) de la region codificante de PHYB, y se realizaron cambios correspondientes en la region de microARN*. La region codificante del pre-microARN se

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enlazo operablemente a una region promotora expresable en planta y a una region de terminacion de la transcripcion.

Los genes quimericos se introdujeron por separado en vectores de ADN-T, acompanados mediante un gen marcador seleccionable, y se produjeron plantas transgenicas de Arabidopsis que comprendieron los genes quimericos (Figura ZZ). Las plantas F1 transgenicas que comprenden ambos genes quimericos tambien se generaron cruzando los transformantes iniciales. Estas plantas se autofecundaron entonces para producir la semilla F2, que se analizara para determinar el grado de silenciamiento. El grado de silenciamiento se puede determinar midiendo la longitud de los hipocotilos de plantulas que se hacen crecer a partir de la semilla bajo luz blanca. Cuanto mas largos son los hipocotilos, mas fuerte es el grado de silenciamiento del gen de PHYB, puesto que PHYB es un represor de la extension de los hipocotilos bajo luz blanca.

Las plantas que contienen ambos transgenes exhiben un mayor grado de silenciamiento del gen de PHYB que las plantas que contienen cada uno de los transgenes por separado.

Ejemplo 3: Combinacion de ARN sentido dirigido contra la region promotora de EIN2 y ARNh dirigido contra la region codificante de EIN2, y promotor (para referencia solamente).

Para examinar si la coexpresion de transgenes que codifican ARN sentido y que codifican ARNh introducina un silenciamiento del promotor (TS) mas fuerte que cualquier constructo solo, se produjeron dos constructos. Ambos seleccionaron como diana la region promotora del gen de EIN2 de Arabidopsis; sin embargo, el constructo de ARNh comprendio ademas parte de la region transcrita del gen de EIN2 en la porcion del duplex. Plantas transgenicas que comprenden el constructo promotor de ARNh se cruzaron con plantas que comprenden el constructo promotor sentido. El grado de silenciamiento de EIN2 se evaluo en la poblacion F2 mediante comparacion con las estirpes parentales. Los resultados indicaron que la combinacion de los transgenes de EIN2 sentido y de ARNh dirigidos contra la region promotora de EIN2 produjo un mayor silenciamiento que el transgen que codifica ARNh o que codifica ARN sentido solo (Figura 2).

a) Genes quimericos

Se construyo un primer gen quimerico que codifica un ARN sentido dirigido contra el promotor del gen de EIN2 usando tecnicas de ADN recombinante convencionales, y comprendio las siguientes regiones de ADN enlazadas operablemente: una region promotora, una region de ADN que cuando se transcribio produjo una molecula de ARN que corresponde a nt. 1-1217 de la secuencia de longitud completa del gen de EIN2 (numero de Acceso AF141202) - incluyendo parte de la region promotora (~810 pb) -, y una region terminal de 3' para el gen de octopina sintasa.

Se construyo un segundo gen quimerico que codifica un ARN de horquilla dirigido contra el promotor del gen de EIN2, que comprende las siguientes regiones de ADN enlazadas operablemente: una region promotora, una region de ADN que cuando se transcribe produce una molecula de ARN sentido que corresponde a la secuencia del gen de EIN2 (desde el nucleotido 1 al nucleotido 1217), que incluye parte de la region promotora y parte de la region del ADN transcrito, y una molecula de ARN antisentido complementaria a la molecula de ARN sentido, y una region terminal de 3' de ocs.

Los genes quimericos se insertaron en un vector de ADN-T acompanados de un gen marcador seleccionable (neomicina fosfotransferasa o higromicina transferasa), y se generaron plantas transgenicas de A. thaliana que comprenden los genes quimericos.

b) Analisis fenotfpico

El silenciamiento de la expresion de EIN2 se evaluara haciendo germinar semillas transgenicas que comprenden uno de los transgenes o una combinacion de ambos en medio que contiene ACC (acido aminociclopropano-1- carboxflico) en la oscuridad. Los resultados de tales ensayos se indican en la Figura 4B, indicando que el grado de silenciamiento de EIN2 se potencio en algunos de los cruces de sentidoxARNh cuando se compara con el silenciamiento logrado en las estirpes parentales.

c) Analisis Northern

El analisis de transferencia Northern de los ARN pequenos aislados de las plantas transgenicas mostro que los ARNpi se acumularon en presencia de los constructos dirigidos contra el promotor de EIN2 (Figura 4A), indicando que los constructos del promotor de EIN2 se obtuvieron correctamente y se expresaron apropiadamente. De forma interesante, en dos de los cuatro grupos de estirpes sentido, ARNh y sentidoxARNh analizados, los cruces de sentidoxARNh (hp-2xs-2 y hp-3xs-3, indicados por flechas) parecieron acumular mas los ARNpi que sus estirpes parentales sentido (s) y ARNh (hp) correspondientes (Figura 4a). Esto fue consistente con los resultados fenotfpicos para el silenciamiento de EIN2 mostrados en la Figura 4B, en la que el silenciamiento de EIN2 se potencio en algunas de las plantas de la progenie producidas a partir de los cruces de sentidoxARNh.

Una posible mejora en la estrategia de combinacion de ARNh y sentido es usar promotores diferentes para conducir la expresion de transgenes de ARNh y sentido respectivamente. Esto puede minimizar el silenciamiento

transcripcional de los transgenes, lo que es mas probable que ocurra si se usa el mismo promotor para ambos transgenes.

Claims (16)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para reducir la expresion de un acido nucleico diana en una celula vegetal o planta, que comprende la etapa de introducir una combinacion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor cada una capaz de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en dicha celula vegetal o planta,

   en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2,

   y en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN, o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana,

   y en el que dicha otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda region complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo dicha primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica del primer acido nucleico diana, y comprendiendo dicha segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del primer acido nucleico diana, en el que dichas regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.
2. 2. Un metodo para reducir la expresion de un primer y un segundo acidos nucleicos diana en una celula vegetal o planta, que comprende la etapa de introducir una combinacion de al menos dos moleculas de ARN inhibidor,

   en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana en dicha celula vegetal o planta, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del segundo acido nucleico diana en dicha celula vegetal o planta,

   en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es escindida predominantemente via DCL1, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor es escindida predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2,

   y en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN, o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en el que dicha otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda region complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo dicha primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica del primer o segundo acido nucleico diana, y comprendiendo dicha segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del primer o segundo acido nucleico diana, en el que dichas regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que las dos moleculas de ARN inhibidor se expresan a partir de promotores diferentes.
4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una de dichas moleculas de ARN inhibidor se transcribe a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa II, y dicho otro ARN inhibidor se transcribe a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa III.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha molecula de ARN bicatenario es una horquilla corta con una secuencia nucleotfdica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la primera region de 20-30 nucleotidos del gen diana, y una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica al complemento de la primera region del gen diana, estando unidas covalentemente las secuencias sentido y antisentido mediante una region espaciadora de 3-20 nucleotidos.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que la molecula de miARN tiene una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 20-25 nucleotidos consecutivos, al menos 95% identica al complemento de una segunda region de 20-30 o 20-25 nucleotidos del gen diana, pero que tiene una secuencia nucleotfdica sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que es como maximo 60-95% identica en secuencia a la segunda region del gen diana.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que el ARN de horquilla corto se expresa a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa III, y la molecula de miARN se transcribe a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa II como un pri-miARN o pre-microARN.
8. 8. Una celula vegetal que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en dicha celula vegetal, en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2,

   en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN, o

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   una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en la que dicha otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda region complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo dicha primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica del primer acido nucleico diana, y comprendiendo dicha segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica complementaria a la secuencia nucleotfdica del primer acido nucleico diana, en la que dichas regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.
9. 9. Una celula vegetal que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor capaces de reducir la expresion de acidos nucleicos diana primero y segundo en dicha celula vegetal, en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana en dicha celula vegetal, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor es capaz de reducir la expresion del segundo acido nucleico diana en dicha celula vegetal,

   en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL1, y la otra de dichas moleculas de ARN inhibidor se escinde predominantemente via DCL4 o DCL3 o DCL2,

   y en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor es una molecula de miARN, una molecula de pre-microARN, o una molecula de pri-miARN, capaz de reducir la expresion del primer acido nucleico diana, y en la que otra molecula de ARN inhibidor es una molecula de ARN bicatenario de horquilla que comprende una primera y segunda region complementaria o esencialmente complementaria, comprendiendo dicha primera region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotfdica del primer o segundo acido nucleico diana, y comprendiendo dicha segunda region de ARN al menos 19 nucleotidos consecutivos que corresponden a una secuencia nucleotidica complementaria a la secuencia nucleotidica del primer o segundo acido nucleico diana, en la que dichas regiones de ARN primera y segunda se hibridan entre sf con al menos 18 o 19 pares de bases.
10. 10. La celula vegetal segun la reivindicacion 8 o 9, en la que las dos moleculas de ARN inhibidor se expresan a partir de diferentes promotores.
11. 11. La celula vegetal segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que una de dichas moleculas de ARN inhibidor se transcribe a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa II, y dicho otro ARN inhibidor se transcribe a partir de un gen que codifica ARN inhibidor bajo el control de un promotor reconocido por ARN polimerasa III.
12. 12. La celula vegetal segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que dicha molecula de ARN bicatenario es una horquilla corta con una secuencia nucleotfdica sentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica a la primera region de 20-30 nucleotidos del gen diana, y una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos al menos 95% identica al complemento de la primera region del gen diana, estando unidas covalentemente las secuencias sentido y antisentido mediante una region espaciadora de 320 nucleotidos.
13. 13. La celula vegetal de la reivindicacion 12, en la que la molecula de miARN tiene una secuencia nucleotfdica antisentido de 20-30 nucleotidos consecutivos, preferiblemente 20-25 nucleotidos consecutivos, al menos 95% identica al complemento de una segunda region de 20-30 o 20-25 nucleotidos del gen diana, pero que tiene una secuencia nucleotfdica sentido de al menos 20 nucleotidos consecutivos que es como maximo 60-95% identica en secuencia a la segunda region del gen diana, en la que el ARN de horquilla corto se expresa a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa III, y la molecula de miARN se transcribe a partir de un gen quimerico que tiene un promotor de ARN polimerasa II como un pri-miARN o un pre-microARN.
14. 14. Una planta que consiste esencial o completamente en las celulas segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.
15. 15. Una composicion de materia que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, capaz de reducir la expresion de un primer acido nucleico diana en una celula vegetal, o de un primer y un segundo acidos nucleicos diana en una celula vegetal.
16. 16. Un kit que comprende al menos dos moleculas de ARN inhibidor como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como una preparacion combinada para uso simultaneo, separado o secuencial en la reduccion de la expresion de un primer acido nucleico diana en una celula vegetal, o de un primer y un segundo acido nucleico diana en una celula vegetal.