BRPI9917755B1 - Recombinant dna molecule, a transgenic micro-organism and method for providing expression of gene increased in plants - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO E MÉTODO PARA PROVER EXPRESSÃO DE GENE AUMENTADA EM PLANTAS".

[001] Pedido Dividido do PI 9913690-2, depositado em 18/08/1999.

Campo dajnyenoig [002] A presente invenção refere-se em geral à engenharia genética de planta. Mais particularmente, ela refere-se a sistemas de expressão de gene aperfeiçoados para plantas transgênicas usando combinações diferentes de elementos genéticos em um cassete de expressão de planta. A presente invenção também refere-se a moléculas de DNA recombinante contendo os elementos genéticos, e a micro-organismos, células de planta e plantas transformadas com as moléculas de DNA.

Fundamentos da Invenção [003] Avanços recentes na engenharia genética proveram as ferramentas necessárias para transformar plantas de modo a conter genes estrangeiros. Ao construir um gene de planta recombinante desejado e introduzi-lo nas células da planta é possível gerar plantas transgênicas que têm características únicas de importância agronômica.

[004] Elementos genéticos compatíveis e confiáveis para uso na construção de genes de planta recombinantes são de grande valor na engenharia genética de planta. Muitos de tais elementos podem aperfeiçoar os níveis de expressão de gene de um gene de interesse em particular. Ao se fazer isso, esses elementos proveem várias vantagens. Primeiro, ao prover níveis de expressão aperfeiçoados, as combinações ótimas de elementos genéticos podem resultar em um fenótipo mais pronunciado. Isto é devido à relação observada em muitos casos entre o nível de expressão de transgene em uma planta transgenica e o grau até o qual uma característica de planta desejada é alterada.

[005] Segundo, elementos genéticos nâo-traduzidos que são capazes de aperfeiçoar a expressão podem minimizar algumas etapas de limite de taxa na produção de planta transgenica. Quanto maior os níveis de expressão atingidos, menores os números de plantas que precisam ser produzidas e avaliadas a fim de recuperar aquelas que produzem quantidades de proteína alvo ou molécula de DNA suficiente para resultar em fenótipo agro no mi ca mente desejável.

[006] Finalmente, a identificação de uma variedade de elementos genéticos alternativos provê a vantagem adicional de reduzir as redundâncias de elemento de vetor. Deste modo, uma vez que transgenes múltiplos, independentes, são construídos em linhagens de planta transgenica, o uso de elementos de vetor de expressão alternativos nos transgenes diferentes vai ajudar a minimizar a inibição dependente da homologia da expressão do gene.

Sumário da Invenção [007] A invenção aqui descrita provê novas combinações de elementos genéticos para uso na construção de moléculas de DNA recombinante, expressíveis em planta. Uma molécula de DNA recombinante contendo as combinações de elementos genéticos da presente invenção exibe níveis de expressão aperfeiçoados, conforme desejado para transformação e regeneração de plantas transgênicas. Os níveis de expressão aperfeiçoados conseguidos usando os elementos desta invenção proveem várias vantagens, tal como uma redução no processo de avaliação de trabalho intenso requerido para a produção de planta transgenica e fenõtipos aperfeiçoados de plantas assim produzidas. Além disso, os elementos são alternativos úteis para aumentar as capacidades de agrupamento de gene nas plantas transgênicas ao minimizar a repetição de sequências que foram associadas à instabilidade da expressão do transgene.

[008] Deste modo, de acordo com um aspecto da presente invenção, é provida uma molécula de DNA recombinante que compreende, operavelmente ligada à direção 5' a 3': (a) uma sequência de promotor; (b) uma sequência 5' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene de proteína de ligação a/b de clorofila de trigo, um gene de choque de calor de trigo, um gene de peroxidase de trigo, um gene de beta-tubulina de arroz e um gene de amilase de arroz; (c) uma sequência intermediária isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um íntron de actina de arroz, um íntron de sintase de sacarose de arroz, um íntron de liase de fenilalamina de amônia de arroz e um íntron de amilase de arroz; (d) uma sequência de codificação de DNA; e (e) uma região de terminação 3' isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de ubiquitina de trigo, um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene da glutelina de arroz, um gene de desidrogenase de lactato de arroz e um gene de beta-tubulina de arroz.

[009] Em um outro aspecto da invenção, é provido um método para o aperfeiçoamento da expressão do gene em plantas e aumento na diversidade do elemento genético que compreende: (a) transformação de células de plantas com uma molécula de DNA recombinante que compreende, operavelmente ligada à direção 5' a 3': (i) uma sequência de promotor, (ii) uma sequência 5’ não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene de proteína de ligação a/b de clorofila de trigo, um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de peroxidase de trigo, um gene de beta-tubulina de arroz, e um gene de amilase de arroz; (iii) uma sequência intermediária isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um intron de actina de arroz, um íntron de sintase de saca rose de arroz, um íntron de liase de fenilalanina de amônia de arroz e um íntron de amilase de arroz; (iv) uma sequência de codificação de D NA; e (a) uma sequência de DNA não-traduzida 3’ selecionada do grupo consistindo em um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de ubiquitina de trigo, um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene da glutelina de arroz, um gene de desidrogenase de lactato de arroz e um gene de beta-tubulina de arroz. (b) seleção das células de planta que foram transformadas; e (c) regeneração das ditas células de planta para prover uma planta diferenciada.

[0010] São ainda providas pela invenção células de plantas contendo moléculas de DNA da invenção e os tecidos, sementes e plantas diferenciadas produzidas a partir delas. Outros objetos, aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica em vista da descrição, exemplos e reivindicações que seguem.

Breve Descrição dos Desenhos [0011] Os desenhos que seguem formam parte do presente relatório e são incluídos para mostrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida através de referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.

Figura 1 ilustra o plasmídio pMON19469 Figura 2 ilustra o plasmídio pMON26052 Figura 3 ilustra o plasmídio pMON26055 Figura 4 ilustra o plasmídio pMON26054 Figura 5 ilustra o plasmídio pMON19433 Figura 6 ilustra o plasmídio pMON32502 Figura 7 ilustra o plasmídio pMON32506 Figura 8 ilustra o plasmídio pMON32509 Figura 9 ilustra o plasmídio pMON32510 Figura 10 ilustra o plasmídio pMON32513 Figura 11 ilustra o plasmídio pMON19437 Figura 12 ilustra o plasmídio pMON32515 Figura 13 ilustra o plasmídio pMON32516 Figura 14 ilustra o plasmídio pMON32517 Figura 15 ilustra o plasmídio pMON33216 Figura 16 ilustra o plasmídio pMON33210 Figura 17 ilustra o plasmídio pMON33220 Figura 18 ilustra o plasmídio pMON33219 Figura 19 ilustra o plasmídio pMON47901 Figura 20 ilustra o plasmídio pMON47906 Figura 21 ilustra o plasmídio pMON47907 Figura 22 ilustra o plasmídio pMON47915 Figura 23 ilustra o plasmídio pMON47916 Figura 24 ilustra o plasmídio pMON47917 Figura 25 ilustra o plasmídio pMON47919 Figura 26 ilustra o plasmídio pMON32648 Figura 27 ilustra o plasmídio pMON 18364 Figura 28 ilustra o plasmídio pMON 19568 Descrição Detalhada da Invenção [0012] A presente invenção provê elementos genéticos para expressão aperfeiçoada de genes de planta recombinantes compreendendo novas combinações de íntrons, e elementos genéticos não-traduzidos 5'e 3' descritos aqui. As sequências de DNA e os métodos da invenção permitem a produção de plantas transgênicas tendo altos níveis de uma molécula de RNA ou proteína desejada de interesse, desse modo, facilitando a introdução de tratos agro no mi ca mente desejáveis em plantas através de engenharia genética.

[0013] "Gene de planta recombinante" ou "molécula de DNA recombinante", conforme usado no contexto desta invenção, refere-se à combinação de elementos genéticos que estão operavelmente ligados de modo a ser capazes de expressar em uma célula de planta uma molécula de RNA e/ou de proteína desejada. As moléculas de DNA podem ser construídas usando técnicas padrão bem conhecidas aos indivíduos versados nesta técnica.

[0014] Em geral, um gene de planta recombinante compreende, operavelmente ligado a partir da extremidade 5' a 3': (1) uma região de promotor que causa a produção de uma molécula de RNA; (2) uma sequência 5’ não-traduzida; (3) uma sequência de codificação de DNA que codifica uma proteína de RNA e/ou proteína desejada e (4) uma região 3' não-traduzida.

[0015] A região de um gene referida como o "promotor" é responsável pela transcrição de regulagem de DNA em RNA. Os promotores compreendem a sequência de DNA, geralmente encontrada a montante (5‘) de uma sequência de codificação, que regula a expressão da sequência de codificação a jusante através do controle da produção de RN A mensageiro (mRNA) ao prover o local de reconhecimento para a polimerase de RN A e/ou outros fatores necessários para iniciar a transcrição no local correto. O promotor usado em um gene de planta recombinante da invenção é selecionado de modo a prover atividade de transcrição suficiente para se conseguir os níveis de expressão desejados do gene ou gene(s) de interesse.

[0016] Vários promotores de planta funcionais são conhecidos na técnica e podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes tal como plantas ou vírus de plantas e podem incluir, mas não estão limitados a, promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV) (Odell e outros, 1985) vírus de mosaico do figo (FMV) 35S (Sanger e outros, 1990), promotor do vírus bací li forme da cana-de-açúcar (Bouhida e outros, 1993), promotor do vírus comelina amarelo sarapintado (Medberry e Olszewski, 1993), promotor induzível pela luz de uma pequena subunidade da carboxilase de ribulose-1,5-bis-fosfato (ssRUBISCO) (Couzzi e outros, 1984), promotor de isomerase de triosefosfato citosólica de arroz (TPI) (Xu e outros, 1994), o promotor de fosforribossiItransferase de adenina (APRT) de Arabdopsis (Moffatt e outros, 1994), o promotor do gene I de actina de arroz (Zhong e outros, 1996) e os promotores de sintase de manopina e sintase de octopina (Ni e outros, 1995). Todos esses promotores foram usados para criar vários tipos de construções de DNA recombinante expressáveis pela planta. Análise comparativa de promotores constitutivos através da expressão de genes repórter tal como o gene uídA (β-glucuronidase) de E. coli foi realizada com muitos desses e outros promotores(Li e outros, 1997; Wen e outros, 1993). Outros promotores úteis incluem mas não estão limitados àqueles que são expressos de uma maneira específica de tecido, aperfeiçoada de tecido ou desenvolvimentalmente regulada. Exemplos desses tipos de promotores são também conhecidos na técnica.

[0017] Em adição à sequência de promotor que regula a expressão de sequências de DNA operavelmente ligadas, outros elementos genéticos podem desempenhar um papel no aperfeiçoamento da expressão do gene. Esses elementos incluem mas não estão limitados a regiões não-traduzidas e sequências intermediária (íntrons) que estão associadas aos genes aos quais elas estão operavelmente ligadas. Por "associado a" conforme aqui usado significa que o elemento genético é tipicamente encontrado associado a um gene durante o processamento do gene tal como durante o processo de transcrição ou tradução.

[0018] As regiões 5' não-traduzidas de mRNA podem desempenhar um papel importante no início da tradução e desse modo da regulagem da expressão do gene. Uma sequência líder não-traduzida 5' é caracterizada como a porção de molécula de mRNA que mais tipicamente se estende a partir do local 5' CAP até o códon de início de tradução de proteína AUG. Para a maioria dos mRNAs eucarióticos, a tradução começa com a ligação da proteína de ligação CAP à cobertura de mRNA. Isto é então seguido pela ligação de vários outros fatores de tradução, bem como o complexo de pré-iniciação de ribossoma 43S. Este complexo vai descendentemente pela molécula de mRNA enquanto procurando um códon de iniciação AUG em um contexto de sequência apropriado. Uma vez que isso foi verificado e com a adição da subunidade ribossômica 60S, o complexo de iniciação 80S completo inicia a tradução da proteína (Pain, 1986; Moldave, 1985; Kozak, 1986). Uma segunda classe de mRNAs foi identificada, a qual possui características de iniciação de tradução distintas. A tradução desses mRNAs inicia de uma maneira independente de CAP e é acreditada iniciar com a ligação de ribossoma a porções internas da sequência líder 5' não-traduzida (Sonenberg, 1990; Carrigton and Freed, 1990; Jackson e outros, 1990).

[0019] A eficiência do início da tradução pode ser influenciada pelas características da sequência líder não-traduzida 5', desse modo, identificação e otimização das sequências líder 5' podem prover níveis aperfeiçoados da expressão de gene em plantas transgênicas. Por exemplo, alguns estudos investigaram o uso de sequências líder não-traduzidas 5' de vírus de planta quanto aos seus efeitos sobre a expressão do gene de planta (Gallie e outros, 1987, Jobling e Gehrke, 1987; Skuzeski e outros, 1990). Aumentos na expressão do gene foram descritos usando a sequência líder de Vírus Ômega de Mosaico de Tabaco (TMV). Quando comparando com outras sequências líder virais, tal como o líder do Vírus de Mosaico de Alfafa RNA 4 (AMV), aperfeiçoamento de duas a três vezes nos níveis de expressão de gene foram observados usando sequência líder Ômega TMV (Gallie e outros, 1987; Skuzeski e outros, 1990). Sequências líder 5' não-traduzidas associadas a genes de proteína de choque de calor foram também mostradas aperfeiçoar significantemente a expressão de gene em plantas (ver, por exemplo, Patente U.S. 5.362.865).

[0020] A maioria das sequências 5' não-traduzidas são bastante ricas em A-U e são previstas não ter estrutura secundária significante. Uma das primeiras etapas no início da tradução é relaxamento ou desenrolamento da estrutura de mRNA secundária (Sonenberg, 1990). As sequências líder de RNA mensageiro com estrutura de mRNA secundária insignificante podem não necessitar desta etapa de desenrolamento e podem desse modo ser mais acessíveis aos componentes de iniciação de tradução. As sequências de introdução que formam estruturas secundárias estáveis podem reduzir o nível de expressão de gene (Kozak, 1988; Pelletier e Sonenberg, 1985). A habilidade de uma sequência líder 5' não-traduzida em interagir com os componentes de tradução pode desempenhar um papel chave ao afetar os níveis de expressão de gene subsequente.

[0021] As regiões 5' não-traduzidas que são empregadas nesta invenção são capazes de aumentar o nível de expressão de uma sequência que pode ser transcrita à qual elas estão operavelmente ligadas. A região 5' não-traduzida pode ser associada a um gene de uma fonte que seja nativa ou que seja heteróloga com relação aos outros elementos não-traduzidos e/ou traduzidos presentes no gene recombinante.

[0022] As sequências 5' não-traduzidas providas por esta invenção são sequências de ácido nucléico isoladas associadas a genes de planta, de preferência de monocotiledôneas incluindo mas não limitadas a trigo e arroz. As regiões 5' não-traduzidas particularmente preferidas associadas aos genes monocotiledôneos codificando proteínas de choque de calor, frutose-1,6-bifosfatases, proteínas de ligação a/b de clorofila, peroxidases, tubulinas e amilases. Essas regiões 5' não-traduzidas preferidas são exemplificadas aqui pela sequência 5' não-traduzida de choque de calor de trigo (líder Ta hsp 5') da SEQ ID NO:53, a sequência 5' não-traduzida associada ao gene frutose-1,6-bifosfatase de trigo (líder Ta fbp 5'), compreendendo a SEQ ID NO:54, a região 5' não-traduzida associada ao gene de proteína de ligação a/b de clorofila de trigo (líder T cab 5'), compreendendo SEQ ID NO:52, a região 5' não-traduzida associada ao gene de peroxidase de trigo (líder Ta per 5') compreendendo a SEQ ID NO:55, a região 5' não-traduzida associada ao gene de amilase de arroz (líder r amy 5') compreendendo a SEQ ID NO:57 e a região 5' não-traduzida associada ao gene de bubo de arroz (líder r btub 5') compreendendo a SEQ ID NO:56.

[0023] As sequências intermediárias aqui referidas como íntrons são também capazes de aumentar a expressão do gene. Os íntrons podem aperfeiçoar a eficiência de processamento de mRNA. Vários íntrons foram descritos para aumentar a expressão do gene, particularmente em monocotiledôneas. Em um relatório, a presença de íntron de catalase I (Tanaka, 1990) isolada da mamona resultou em um aumento da expressão do gene no arroz mas não no tabaco quando usando GUS como um gene marcador. Mais aperfeiçoamentos foram conseguidos, especialmente em plantas monocotiledôneas, através de construções de gene que têm íntrons no líder 5'não-traduzido posicionados entre o promotor e a sequência de codificação estrutural. Por exemplo, Callis e outros (1987) descreveram que a presença de íntrons de desidrogenase de álcool (Adh-I) ou íntrons Bronze-1 resultaram em níveis maiores de expressão. Mascarenkas e outros (1990) descreveram um aperfeiçoamento de 12 vezes da expressão de CAT através do uso do íntron Adh. Outros íntrons adequados para uso nas moléculas de DNA da invenção incluem, mas não estão limitados a, íntron de sintase de sacarose (Vasil e outros, 1989), o íntron ômega TMV (Gallie e outros, 1989), o íntron de milho hsp70 conforme mostrado na SEQ ID NO:47 (Patente U.S. n° 5.593.874 e Patente U.S. n° 5.859.347 aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade), e o íntron de actina de arroz (McElroy e outros, 1990). Vários fatores podem influenciar o grau de aperfeiçoamento da expressão de gene através de um íntron incluindo mas não limitado ao promotor (Jefferson e outros, 1987), sequências exon de flanqueamento e posicionamento e localização do íntron no relacionamento do gene (Mascerenhas e outros, 1990).

[0024] As sequências intermediária providas pela presente invenção estão associadas a um gene de planta, de preferência genes de planta monocotiledônea incluindo mas não limitada a trigo e arroz.

Particularmente preferidas são as sequências intermediária associadas a genes monocotiledôneos codificando proteínas de choque de calor, actinas, amilases, liases e sintases. Essas sequências intermediária preferidas são aqui exemplificadas através da sequência intermediária de uma proteína de choque de calor de milho compreendendo a SEQ ID NO:47, a sequência intermediária de um gene de actina de arroz compreendendo SEQ ID NO:50, a sequência intermediária de um gene de amilase de arroz compreendendo SEQ ID NO:49, a sequência intermediária de um gene de liase de fenilalanina de amônia de arroz compreendendo a SEQ ID NO:48, e a sequência intermediária de um gene de sintase de sacarose de arroz compreendendo a SEQ ID NO:51.

[0025] As sequências não-traduzidas localizadas na extremidade 3'de um gene podem também influenciar os níveis de expressão. Uma região não-traduzida 3' compreende uma região do mRNA geralmente começando com o códon de terminação de tradução e se estendendo pelo menos além do local de poliadenilação. Ingelbrecht e outros (Plant Cell I: 671-80, 1989) avaliaram a importância desses elementos e verificaram grandes diferenças na expressão em plantas estáveis dependendo da fonte da região 3' não-traduzida. Usando regiões 3' não-traduzidas associadas à sintase de octopina, proteína de semente 2S de Arabidopsis, subunidade pequena de rbcS de Arabidopsis, extensão de cenoura, e sintase de chalcona de Antirrhinium, uma diferença de 60 vezes foi observada entre o construto de melhor expressão (que continha a região rbc 3' não-traduzida) e o construto de expressão mais baixa (que continha a região 3' de sintase de chalcona). A região 3' não-traduzida do gene de sintase de nopalina da T-DNA em Agrobacterium tumefaciens (3' nos) compreendendo SEQ ID NO:46 foi também usada como uma região de terminação para a expressão de genes em plantas. Embora esteja claro que as regiões 3' não-traduzidas possam afetar significantemente a expressão de genes de planta recombinantes, seu papel preciso em como melhor identificar e otimizá-los para expressão máxima é uma área que não é bem entendida.

[0026] A sequência de codificação de DNA de uma molécula de DNA recombinante da invenção pode codificar qualquer sequência de ácido nucléico que pode ser transcrita incluindo mas não limitada àquelas codificando proteínas nativas, estrangeiras e/ou modificadas de interesse. A seleção desta sequência será dependente dos objetivos para uma dada aplicação. Tipicamente, a sequência de DNA estrutural codifica uma molécula de proteína capaz de modificar uma ou mais características da planta. Os genes estruturais adequados podem incluir, mas não estão limitados a, genes para o controle de insetos e outras pestes, genes para o controle de doenças microbianas e fúngicas, genes para tolerância herbicida e genes para aperfeiçoamentos de qualidade da planta, tal como aumentos no rendimento, tolerâncias ambientais e aperfeiçoamento nutricional. Os genes podem ser isolados de qualquer fonte incluindo mas não limitada a plantas e bactérias.

[0027] Alternativamente, a sequência de codificação de DNA pode realizar esses fenótipos ao codificar uma molécula de RNA que pode ser traduzida que causa a inibição marcada de expressão de um gene endógeno, por exemplo através de mecanismos mediados por anti-sentido ou co-supressão (ver, por exemplo, Schuch, 1991; Bird, 1991; Jorgensen, 1990). O RNA poderia ser uma molécula de RNA catalítica (isto é, uma ribozima) construída para clivar um produto de mRNA endógeno desejado (ver, por exemplo, Gibson, 1997).

[0028] A região não-traduzida 3'que é empregada em uma molécula de DNA descrita aqui geralmente causa a poliadenilação da extremidade 3' da sequência de mRNA transcrito e a terminação da transcrição. A região não-traduzida 3' pode ser associada a um gene de uma fonte que seja nativa ou que seja heteróloga com relação aos outros elementos não-traduzidos e/ou traduzidos presentes na molécula de DNA.

[0029] As sequências 3' não-traduzidas providas pela presente invenção estão associadas a um gene de planta, de preferência genes de planta monocotiledônea incluindo mas não limitada a trigo e arroz. Particularmente preferidas são as sequências 3' não-traduzidas isoladas de uma sequência de nucleotídeo associada a genes monocotiledôneos codificando uma frutose-1,6-bifosfatase de trigo (Ta fbp 3) compreendendo a SEQ ID NO:60, uma proteína de choque de calor de trigo (Ta hsp 3') compreendendo a SEQ ID NO:58, ubiquitina de trigo (Ta ubiq 3') compreendendo a SEQ ID NO:59, proteína da glutelina de arroz (r glut 3') compreendendo a SEQ ID NO:61, um desidrogenase de lactato de arroz (r lacd 3') compreendendo à SEQ ID NO:62 e uma beta-tubulina de arroz (r btub 3') compreendendo à SEQ ID NO:63).

[0030] As sequências 5' e/ou 3' não-traduzidas e as sequências intermediária desta invenção podem ser isoladas através de um ou mais dos vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica ou, alternativamente, podem ser geradas sinteticamente.

[0031] Em uma modalidade, o material de planta fonte é RNA de planta isolado de tecido de planta. Em uma outra modalidade, o material fonte é uma sequência de RNA sintética. Sequências padrão para os elementos genéticos incluem transcritos de DNA, sequências de cDNA ou DNA genômico. Em uma outra modalidade, os iniciadores de PCR são sintetizados para gerar os elementos genéticos da presente invenção. Os iniciadores de PCR podem ser sintetizados para corresponder ou ao terminal da região 5' não-traduzida ou região 3' não-traduzida dos transcriptos da planta alvo. Por exemplo, as reações PCR no primeiro filamento dos produtos de cDNA gerados através de transcrição reversa de RNA e fragmento de PCR contendo a porção desejada ou o elemento genético completo podem ser clonadas em um vetor de expressão para teste.

[0032] Métodos para isolamento de genes de elementos genéticos associados são conhecidos daqueles versados na técnica e incluiríam, por exemplo, os métodos de PCR aqui descritos. Uma variedade de métodos de amplificação é conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.683.195 e 4.683.202 e Innis e outros, 1990. Aqueles versados na técnica são familiares com os materiais fonte padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc), geração de organismos recombinantes e a avaliação e o isolamento de genes ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989; Mailga e outros, 1995; Birren e outros, 1996).

[0033] Métodos moleculares de planta foram também descritos em, por exemplo, Pouwels e outros, 1985, supp. 1987; Weissbach e Weissbach, 1989; e Gelvin e outros, 1990.

[0034] Além disso, uma pessoa versada na técnica vai reconhecer que as regiões não-traduzidas 5' e/ou 3' ou sequências intermediária da invenção podem ser modificadas, tal como através de adição, deleção, substituição, etc., enquanto ainda provendo os benefícios aqui descritos. Tais modificações são consideradas dentro do escopo desta invenção.

[0035] Um tipo de modificação, por exemplo, podería envolver mudanças na sequência de nucleotídeo do líder que leva a uma mudança na estrutura secundária. A estrutura secundária apropriada da sequência líder 5' pode ser necessária para expressão ótima. Como tal, a sequência de nucleotídeo específica do líder pode ser importante contanto que a estrutura secundária seja considerada. Deste modo, a sequência líder pode de fato tolerar modificações na sequência de nucleotídeo que não resultam em mudanças na estrutura secundária. Similarmente, os íntrons e as sequências não-traduzidas 3' da presente invenção podem ser modificados apropriadamente para aperfeiçoar a expressão do gene em um sistema particular.

[0036] As sequências que circundam o AUG de uma região 5' não-traduzida podem também afetar a eficiência de tradução. Por exemplo, uma sequência de consenso foi identificada em plantas que podem prover um ótimo contexto de AUG (Joshi e outros, 1987; Koziel e outros, 1996). Deste modo, esta região das sequências 5' não-traduzidas da invenção pode ser então modificada para otimizar mais os níveis de expressão de transgene. Em adição, modificações podem ser feitas em outros componentes genéticos incluindo mas não limitados, à região não-traduzida 3'ou sequências intermediária da molécula de DNA recombinante da invenção de modo que as novas combinações dos elementos no vetor de expressão sejam mais otimizadas.

[0037] Em adição àqueles elementos acima discutidos, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode também incluir outros elementos de regulagem tal como sequências de sequestro/marcação de cloroplasto, elementos aperfeiçoadores, etc (para revisão de otimização de expressão de transgene, ver Koziel e outros, 1996). Por exemplo, aperfeiçoamentos na expressão foram obtidos através do uso de sequências de aperfeiçoamento inseridas no promotor 5'.

[0038] Uma molécula de DNA recombinante da invenção pode também incluir um marcador selecionável. Esses marcadores são comumente usados para selecionar plantas transformadas ou células de planta que contêm o material genético exógeno de interesse, isto é, transgene. Exemplos de tais incluem, mas não estão limitados a, gene de fosfotransferase de neomicina (neo) (Potrykus e outros, 1985), que confere resistência à canamicina. Células expressando o gene de fosfotransferase de neomicina podem ser selecionadas usando um antibiótico apropriado tal como canamicina ou G418. Outros marcadores selecionáveis comumente usados incluem o gene bar que confere resistência ao bialafos; um gene de sintase de EPSP mutante (Hinchee e outros, 1988), que confere resistência ao glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência à bromoxinil (Stalker e outros, 1988); um gene de sintase de acetolactato mutante (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfoniluréia (Pedido de Patente Europeu 154.204,1985); e um gene DHFR de resistência a metotrexato (Thillet e outros, 1988).

[0039] Uma molécula de DNA recombinante da invenção pode também incluir um marcador analisável como um meio adicional através do qual a expressão do gene pode ser avaliada. Os marcadores avaliáveis comuns incluem uma β-glucuronidase ou gene uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson, 1987); Jefferson a outros, 1987); um gene de luciferase (Ow e outros, 1986), um gene de local R que codifica uma produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta ((Dellaporta 1988); um gene de β-lactamase (Sutcliffe e outros, 1978) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos(por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky e outros, 1983) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikatu e outros, 1990); um gene de tirosinase (Katz e outros, 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina para DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa para melanina; um gene de α-galactosidase que codifica uma enzima cujo substrato é a-galactose cromogênica, etc.

[0040] Os termos "selecionável" e "analisável" são também pretendidos compreender genes que codificam marcadores "scriptable" cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificar ou selecionar as células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno que pode ser secretado que pode ser identificado através de interação de anticorpo, ou até mesmo enzimas que podem ser secretadas que podem ser cataliticamente identificadas. As proteínas que podem ser secretadas se encaixam em várias classes, incluindo proteínas pequenas, que podem ser difundidas, por exemplo, através de ELISA, enzimas ativas pequenas detectáveis em uma solução extracelular (por exemplo, α-amilase, β-lactamase, transferase de fosfinotricina), ou proteínas que são inseridas ou presas na parede da célula (tal como proteínas que incluem uma sequência líder tal como aquela encontrada na unidade de expressão de extensina ou tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis/avaliáveis/scriptable possíveis ficarão aparentes para aqueles versados na técnica.

[0041] É entendido que as sequências de nucleotídeo em particular dos elementos 5' e 3' não-traduzidos descritos aqui são representativas no sentido que sequências equivalentes ou porções delas podem ser obtidas e/ou geradas de acordo com esta descrição. Por equivalente se quer dizer que o dito gene ou porção do mesmo funcionaria de uma mesma maneira substancialmente que o seu elemento ou porção aqui descrito, e proveria um benefício ou característica particular à planta substancialmente da mesma maneira.

[0042] Uma ampla variedade de métodos e ferramentas de clonagem está comercialmente disponível e foi extensivamente descrita ver, por exemplo, Sambrook e outros, 1989; Birren e outros, 1996). Tais métodos são bem conhecidos e podem ser prontamente usados por aqueles versados na técnica de construção de moléculas de DNA desta invenção.

[0043] Qualquer tipo de vetor pode ser usado na presente invenção, incluindo mas não limitado a um vetor de expressão de plasmídio E. coli. Com mais preferência, as combinações de elementos genéticos da presente invenção estão operavelmente ligadas em um vetor de transformação de planta. Ao construir uma molécula de DNA recombinante da invenção, seus vários componentes ou fragmentos são tipicamente inseridos usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica em um vetor de clonagem conveniente que é capaz de replicação em um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli. Vários vetores existem, os quais foram descritos na literatura. Após cada subclonagem, o vetor pode ser isolado e submetido à manipulação adicional, tal como digestão de restrição, inserção de novos fragmentos, ligação, deleção, novo secionamento, inserção, mutagênese in vitro, adição de fragmentos de poliligante e similar a fim de prover um vetor que vá satisfazer uma necessidade particular. Uma vez completo o construto, o construto pode ser transferido para um vetor apropriado para manipulação adicional de acordo com a maneira de transformação da célula da planta. Vários vetores de transformação de planta foram descritos, e o vetor particular pode ser modificado dependendo do método de transformação. Em uma modalidade, um vetor de transformação de planta adequado para a transformação de planta mediada por Agrobacterium pode ser usado. Em uma outra modalidade, um vetor de transformação de planta adequado para bombardeamento de partícula pode ser usado. Um vetor de expressão de planta típico para transformação de planta mediada por Agrobacterium, por exemplo, pode incluir vários componentes genéticos, incluindo, mas não limitado a um promotor, um ou mais genes de interesse, e uma sequência de terminação.

[0044] Por componente genético conforme aqui usado quer dizer qualquer sequência de ácido nucléico ou elemento genético que pode ser também um componente ou parte de um vetor. O vetor de expressão de planta pode também conter as funções para mobilização de E. coli a Agrobacterium e para a replicação do vetor nesses hospedeiros (isto é, E. coli e origem de replicação de faixa de hospedeiro ampla). Em adição a um ou mais gene(s) marcador(es) selecionável(eis) para a seleção de células bacterianas contendo o vetor e para a seleção de células de plantas contendo o DNA introduzido podem ser os componentes do vetor de expressão de planta. O vetor pode também conter tipicamente uma ou mais bordas de T-DNA que funcionam para transferir o DNA para a célula da planta. Vários vetores adequados para transformação estável de células de planta ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos em, por exemplo, Pouwels e outros, "Cloning Vetors: A Laboratory Manual", 1985, sup. 1987); Weissbach e Weissbach, "Methods for Plant Molecular Biology", Academic Press, 1989; Gelvin e outros, "Plant Molecular Biology Manual", Kluwer Academic Publishers, 1990; e R.R.D. Cray "Plant Molecular Biology" LabFax BIOS Scientific Publishers, 1993. O vetor de transformação de planta ótimo pode ser designado para o método de liberação de DNA particular e cultura alvo de interesse.

[0045] Células bacterianas ou virais que compreendem moléculas de DNA contendo as sequências não-traduzidas da presente invenção são também compreendidas pela presente invenção. A introdução de tais vetores no hospedeiro pode ser realizada usando métodos conhecidos daqueles de versados na técnica.

[0046] Uma molécula de DNA da presente invenção pode ser inserida no genoma de uma planta através de qualquer método adequado. Os métodos de transformação de planta adequados incluem transformação mediada por Agrobacterium, o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção de DNA livre, libertação de DNA livre através de bombardeamento de microprojétil, transformação usando vírus ou pólen, etc.

[0047] Métodos para transformar especificamente as dicotiledôneas usam principal mente Agrobacterium tumefaciens. Por exemplo, as plantas transgênicas descritas incluem mas não estão limitadas a algodão (Patente U.S. n° 5.004.863, Patente U.S. n° 5.159.135; Patente U.S. n° 5.518.908, WO 97/43430) e soja (Patente U.S. n° 5.569.834; Patente U.S. n° 5.416.011).

[0048] Similarmente, vários métodos de transformação e regeneração estão disponíveis para monocotiledôneas incluindo mas não limitadas a milho (Songstad e outros, 1995; Klein e outros, 1988); arroz (Toriyama e outros, 1986); e trigo (Cheng e outros, 1997; e Patente U.S. n° 5.631.152 aqui incorporada a título de referência em sua totalidade). É aparente para aqueles versados na técnica que várias metodologias de transformação e regeneração podem ser usadas e modificadas para a produção de plantas transgênicas estáveis de qualquer número de culturas alvo de interesse e métodos de transformação e regeneração de planta são bem àqueles versados na (por exemplo, ver Hinchee e outros (1994) e Ritchie & Hodges (1993) para revisões).

[0049] Avaliações quanto à expressão do gene com base na expressão transiente de construções de ácido nucléico clonados foram desenvolvidas através da introdução de moléculas de ácido nucléico em células de planta através de tratamento com polietileno glicol, eletroporação ou bombardeamento de partícula (Marcotte e outros (1988); Marcotte e outros (1989); McCarty e outros (1991); Hattori e outros (1992); Goff e outros (1990). Sistemas de expressão transientes podem ser usados para avaliar rapidamente os níveis de expressão de gene e separar funcionalmente para exame as construções do gene (Ver em geral, Mailga e outros (1995)).

[0050] A presente invenção também provê células de planta, cujos genomas contêm uma ou mais moléculas de DNA recombinante compreendendo uma sequência 5' e/ou 3'não-traduzida aqui descrita. As plantas diferenciadas compreendendo tais células terão características ou benefícios previstos pela expressão da sequência de codificação de DNA que está operavelmente ligada às ditas sequências. Tais plantas podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas, e podem incluir mas não estão limitadas a plantas pertencentes às famílias selecionadas de alfafa, maçã, Arabidopsis, cevada, Brassica, brócolis, repolho, citrus, milho, algodão, linho, alho, alface, aveia, óleo de semente de colza, cebola, canola linho, uma planta ornamental, ervilha, amendoim, pimenta, batata, arroz, centeio, sorgo, morango, soja, girassol, cana-de-açúcar, beterraba, tomate, tabaco, trigo, choupo, pinheiro, abeto, eucalipto, lentilha, uva, banana, chá, gramado. As plantas particularmente preferidas incluem alfafa, cevada, milho, algodão, canola, batata, arroz, centeio, soja, girassol, beterraba e trigo. As plantas ainda mais preferidas incluem monocotiledôneas tal como milho, trigo e arroz.

[0051] A invenção será mais facilmente entendida através da referência aos exemplos que seguem que são providos a título de ilustração, e não pretendem ser limitantes da presente invenção. Os exemplos que seguem são incluídos para mostrar exemplos de certas modalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam abordagens que os inventores verificaram que funcionam bem na prática da presente invenção, e desse modo podem ser consideradas constituir exemplos de modos preferidos para a sua prática. No entanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente descrição, reconhecer que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obter um resultado igual ou similar sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

[0052] Em adição aos procedimentos especificamente aqui feitos referência, os praticantes são familiares com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc), para a geração de organismos recombinantes e para a avaliação e isolamento de clones, ver, por exemplo, Sambrook e outros (1989); Mailga e outros (1995); Birren e outros (1996).

Exemplos Exemplo 1 [0053] Construção de Vetores de Expressão Contendo Combinações de Elementos Genéticos para Expressão de Transgene Aperfeiçoada [0054] A construção dos vetores de expressão contendo os cassetes do elemento genético compreendendo elementos de arroz ou trigo foi realizada através de anelamento de oligonucleotídeos sintéticos ou através de isolamento de PCR de mRNA de folha de trigo ou DNA genômico de arroz e ligação nos locais de restrição a montante e a jusante, respectivamente, do gene repórter GUS. Os plasmídeos usados para clonagem e construção dos vários cassetes de expressão são listados na Tabela 1. Todas as construções testadas tinham o promotor e35S que é o promotor para o RNA 35S de CaMV contendo uma duplicação da região -90 a 300. Outros elementos contidos nos plasmídeos incluem o que segue: origens de replicação (ori-M13 e ori-V), genes marcadores tal como GUS ou LUC que são as sequências de codificação para beta-glucuronidase e luciferase, respectivamente, e sequências de codificação para seleção de antibiótico (seleção bacteriana AMR), e KÂN (confere resistência a antibióticos aminoglicosídeos de neomicina e canamicina). O plasmídio pMON32648 (Fíg. 26) contém uma proteína antifúngica de fetusca alta (Tfe AFP) conforme descrito no pedido de patente 60/097150. Vetores de transformação típicos adicionais incluiríam mas não estão limitados a pMON18364 (figura 27) que é um vetor de transformação de Agrobacterium de borda dupla e pMON19568 (figura 28) que é um plasmídio que é linearizado antes para um método de transformação de bombardeamento de partícula. As condições de PCR usadas foram as recomendadas pelo fabricante ver, por exemplo, Strategene, La Jolla, CA, PE Biosystems, Foster City, CA). O DNA de plasmídio foi isolado e purificado usando kits comercial mente disponíveis ver, por exemplo, Qiagen, Valencia, CA). O DNA sintético foi comprado da Midland Certified Reagent Co., Midland, TX). TABELA 1. Construção de Vetores* " ngura ** Orientação diferente: í ntron/l íder/marcador/3* [0055] A sequência intermediária da proteína de choque de calor de milho (íntron hsp70) conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.593.874 e 5.859.347 aqui incorporadas a título de referência) é mostrada na SEQ ID NO:47, O líder de base sintético é mostrado na SEQ ID NO:45. A sequência líder 5’ não-traduzida do mRNA de trigo para proteína de choque de calor de trigo de baixo peso molecular putativa (5' Ta hsp17 L) (Número de Acesso Genebank X13431 .gb_pl( (SEQ ID NO:53) foi criada através de a nela mento da SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8. A extremidade 5' do fragmento resultante tem uma extremidade BamHI coesa seguida por um local de restrição Xbal, e a extremidade 3' tem um local Bglll seguido por uma extremidade Ncol coesa para propósitos de subclonagem. Este fragmento foi ligado com os fragmentos Bglll e Ncol de 5.676 kb de pMON19469 (figura 1) para criar o pMON26043.

[0056] O plasmídio pMON26052 (figura 2) foi criado através de subclonagem dos fragmentos Bglll e Ncol de 884 pb de pMON19469 (figura 1) nos locais Bglll e Ncol de pMON26043. PMON26043 continha ambos íntron HP70 e sequência líder de trigo 5' (líder Ta hsp).

[0057] Ο PMON26055 (figura 3) foi criado através de subclonagem do fragmentos Stul e Ncol de 0,449 pb contendo o íntron de actina de arroz (ract 1 íntron) (SEQ ID NO:50) (McElroy e outros, 1991) do pMON25454 nos locais Bglll e Ncol de pMON26043 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0058] O líder 5' não-traduzido do mRNA de trigo para frutose-1,6-bifosfatase (5' Ta fbp L) (Número de Acesso no Genebank X07780.gb_pl) (SEQ ID NO:54) foi criado através de anelamento da SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12. A extremidade 5' do fragmento resultante tem uma extremidade coesa BamHI seguida por um local de restrição Xbal e a extremidade 3' tem um local Bglll seguido por uma extremidade coesa Ncol para propósitos de subclonagem. Este fragmento estava ligado com fragmentos Bglll e Ncol de 5.676 kb de pMON19469 (figura 1) para criar pMON26045.

[0059] O plasmídio pMON26064 foi criado através de subclonagem do fragmento Hindlll e Bell de 1.095 kb contendo o íntron de actina de arroz (McElroy e outros, 1991) e o promotor e35S (Kay e outros, 1987) de pMON25456 nos locais Hindlll e Xbal de pMON26045 usando adaptadores para local Bell que cria uma extremidade complementar Xbal (SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14).

[0060] Ο ΡΜΟΝ26054 (figura 4) foi criado através de subclonagem do fragmentos Stul e Ncol de 0,449 kb contendo o íntron de actina de arroz (McElroy e outros, 1991) de pMON25454 nos locais Bglll e Ncol do pMON26045 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0061] O líder não-traduzido 5' da proteína de ligação a/b de clorofila principal (5' Ta cab L) (Número de Acesso no Genebank M10144.gb_pl) (SEQ ID NO:52) foi isolado através de transcrição reversa de RNA de folha de trigo seguida por 40 ciclos de PCR com uma temperatura de desnaturação de 94Ό por 1 minuto, uma temperatura de anelamento de 50Ό por 2 minutos, e uma temperatura de extensão de 72*0 por 3 minutos. Os iniciadores usados, SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, criam locais de restrição BamHI e Xbal na extremidade 5', e locais de restrição Bglll e Ncol na extremidade 3' para propósitos de subclonagem. O fragmento de 77 pares de base contendo o líder não-traduzido 5' da proteína de ligação a/b de clorofila principal foi então digerido com BamHI e Ncol e ligado com os fragmentos Bglll e Ncol de 5.676 kb de pMON19469 (figura 1) para criar pMON26038.

[0062] O plasmídio pMON26044 foi criado através de subclonagem dos fragmentos Stul e Ncol de 0,449 kb contendo o íntron de actina de arroz (McElroy e outros, 1991) de pMON25454 nos locais Bglll e Ncol do pMON26038 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0063] As regiões não-traduzidas 3' contendo terminador e sequências de poliadenilação foram isoladas e clonadas em pMON19433. O plasmídio pMON19433 é derivado de pUC119 e em adição contém o promotor 35S aperfeiçoado CAMV, o íntron hsp70, o gene repórter GUS, e a sintase de nopalina (nos) da sequência não- traduzida 3' (SEQ ID NO:46). Este vetor contém um local EcoRI e um local BamHI flanqueando o terminador 3' nos permitindo a remoção e substituição de sequências de terminação 3' alternativas. A síntese de cDNA foi realizada usando um iniciador oligo dT no tampão de reação de PCR com MgCI2, 0,2 mM de dATP, dCTP, dGTP e TTP. Cinco micro-organismos de RNA celular total de folha de trigo foram adicionados ao tampão de reação de PCR em um volume de 20 μΙ. A reação foi iniciada através da adição de 4 unidades de transcriptase reversa (Gibco BRL; Gaithersburg, MD) e incubada a 42Ό por 2 horas. A reação foi terminada com aquecimento e congelada a -20Ό.

[0064] Dois microlitros desta reação foram adicionados a cada tampão reagente de PCR contendo dNTPs conforme acima descrito em 100 microlitros contendo 0,5 unidade de polimerase de Taq de acordo com especificações do fabricante (Boerhinger Mannheimm Biochemicals; Inidianápolis, IN). A reação foi coberta com 50 microlitros de óleo mineral e ciclizada em um termociclizador a 94Ό por 1 minuto, 45Ό por 2 minutos e 72Ό por 2 minut os repetidamente por 40 ciclos. A região não-traduzida 3' do gene de ubiquitina de trigo (3' Ta ubiq) (SEQ ID NO:59) foi amplificada a partir de produtos de cDNA com sequências de iniciador SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16. A região 3' não-traduzida do gene de choque de calor de trigo (3' Ta hsp 17) (SEQ ID NO:58) foi amplificada conforme acima descrito usando sequências de iniciador SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18. A região não-traduzida 3' de bifosfatase de frutose (3' Ta fbp) (SEQ ID NO:60) foi amplificada conforme acima descrito usando sequências de iniciador SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20.

[0065] Os produtos de reação amplificados foram eletroforados em um gel de agarose e analisados quanto ao tamanho. Os fragmentos de PCR correspondendo a 3' Ta ubiq (-225 pb), 3' Ta hsp (-240 pb) e 3' ta fbp (-130 pb) foram digeridos com EcoRI e BamHI, gel purificado em um gel de agarose a 1 % e isolados através do uso de preparação de PCR Qiagen de acordo com a especificação do fabricante (Qiagen, Santa Clarita, CA). Os fragmentos de PCR de extremidade digerida foram clonados em um fragmento de 6,5 kb de vetor pMON 19433 de bases digeridas EcoRI e BamHI (figura 5). Os transformantes resultantes com inserções de regiões 3' não-traduzidas dos genes de trigo (Ta fbp, Ta hsp e Ta ubiq) foram verificados através de sequenciamento de DNA.

[0066] O vetor de expressão pMON32502 (figura 6) foi construído através de digestão do pMON26044 e pMON 18375 com EcoRI e Smal. O fragmento Ta hsp 3' de 0,24 kb de pMON 18375 estava ligado ao fragmento da estrutura principal do vetor de 6,0 kb de pMON26044 criando o pMON32502. Os produtos de ligação foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão, postos em placas de ágar LB contendo níveis seletivos de ampicilina (100 pg/ml).

[0067] O vetor de expressão pMON32506 (figura 7) foi construído através da digestão de pMON26055 (figura 3) e pMON 18375 com EcoRI e Smal. O fragmento Ta hsp 3' de 0,24 kb de pMON 18375 foi ligado aos fragmentos da estrutura principal do vetor de 5,9 kb pMON26055 (figura 3) criando o pMON32506. Os produtos de ligação foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão.

[0068] O vetor de expressão pMON32509 (figura 8) foi construído através da digestão de pMON26054 e pMON 18377 com EcoRI e Smal. O fragmento Ta ubiq 3' de 0,23 kb de pMON 18377 foi ligado ao fragmento da estrutura principal do vetor de 5,9 kb pMON26054 (figura 4) criando o pMON32509. Os produtos de ligação foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão.

[0069] O vetor de expressão pMON32510 (figura 9) foi construído através da digestão de pMON26055 (figura 3) e pMON 18377 com EcoRI e Smal. O fragmento Ta ubiq 3' de 0,23 kb de pMON 18337 foi ligado ao fragmento da estrutura principal do vetor de 5,9 kb pMON26055 criando o pMON32510 (figura 9). Os produtos de ligação foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão.

[0070] O vetor de expressão pMON32513 (figura 10) foi construído através da digestão de pMON26054 e pMON18379 com EcoRI e Smal. O fragmento da sequência GUS/Ta fbp 3' de 2,0 kb pMON18379 foi ligado ao fragmento da estrutura principal do vetor de 4,1 kb pMON26054 criando o pMON32513. Os produtos de ligação foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão.

[0071] Os plasmídeos pMON32515 (figura 12), pMON32516 (figura 13) e pMON32517 (figura 14) foram construídos através da digestão de pMON32502, pMON32509 e pMON32513 com Ncol e EcoRI. Em cada caso, o fragmento de aproximadamente 4,3 kb foi então ligado ao fragmento Ncol de luciferase de 1,8 kb criado através de uma digestão parcial com EcoRI de pMON 19437 (figura 11). Os produtos de ligação dessas ligações foram transformados em células alfa DH5 de E. coli através de procedimentos padrão.

[0072] A sequência líder não-traduzida 5' de beta-tubulina de arroz (5' r btub L) (Número de Acesso no Genebank L19598.gb_pl) (SEQ ID NO:56) foi criada através de quinase (reação usando quinase de polinucleotídeo T4 para adição de fosfatos 5' para etapas de ligação subsequentes) e anelamento (ebulição seguida por resfriamento lento) SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24. A extremidade 5' do fragmento resultante tinha uma extremidade sem ponta PMI I e a extremidade 3' tem uma extremidade coesa Bglll para propósitos de subclonagem. Este fragmento foi ligado aos fragmentos Pmll e Bglll de 6.507 kb de pMON33210 (figura 16) para criar o pMON33220 (figura 17).

[0073] A sequência líder não-traduzida 5' de um gene de peroxidase de trigo (5' Ta por L) (Número de Acesso no Genebank X56011.gb_pl) (SEQ ID NO:55) foi criada através de quinase e anelamento da SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28. A extremidade 5' do fragmento resultante tem uma extremidade coesa Bgllll seguida por um local de restrição Xbal e a extremidade 3' tem um local Bglll seguido por uma extremidade coesa Ncol para propósitos de subclonagem. O fragmento foi ligado aos fragmentos Bglll e Ncol de 5.676 kb do pMON19469 (figura 1) para criar o pMON26046.

[0074] A sequência líder não-traduzida 5' de um gene de amilase de arroz (Número de Acesso no Genebank M24287.gb_pl (5' r amy L) (SEQ ID NO:57) foi criada através de anelamento da SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 e SEQ ID NO:44, e fosforilação e ligação a um plasmídio linearizado pMON33200 digerido com Pml I e Bgi II, para criar o pMON33219.

[0075] O primeiro íntron do gene de amilase de arroz (r amy I íntron) (Número de Acesso no Genebank X16509.gb_pl) (SEQ ID NO:49) junto com 10 pares de base de sequência exon 5' e 3' de flanqueamento foi isolado através de PCR de DNA genômico de arroz (Oryza sativa), usando cerca de 1 pg de DNA. A amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:29 e SEQ IQ NO:30. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95Ό, a nelado por 2 minutos a 50Ό e estendido por 3 minutos a 72Ό por um total de 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Bglll e Xbal e ligado com o fragmento Bglll e Xbal de 5.687 kb de pMON33210 (figura 16) para criar o pMON33211.

[0076] O íntron de liase de amônia de fenilalanina de arroz (r pal íntron) (Zhu e outros, 1995) junto com 10 pares de base de sequência exon 5' e 3' de flanqueamento (SEQ ID NO:48) foi isolado através de PCR do DNA genômico de arroz. A amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:31 e SEQ ID NO:32. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95Ό, anelado por 2 minu tos a 50*0 e estendido por 3 minutos a 72Ό por um total de 30 c iclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Bglll e Xbal e ligado com os fragmentos Bglll e Xbal de 5.687 kb de pMON33210 (figura 16) para criar o pMON33226.

[0077] O primeiro íntron do gene de sintase de sacarose de arroz (íntron r ss I) (Wang e outros, 1992) junto com 10 pares de base de sequência exon 5' e 3' de flanqueamento (SEQ ID NO:51) foi isolado através de PCR do DNA genômico de arroz. A amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:34. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95Ό, a nelado por 2 minutos a 50Ό e estendido por 3 minutos a 72*C por um total de 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Bglll e Xbal e ligado com o fragmento Bglll e Xbal de 5.687 kb de pMON33210 (figura 16) para criar o pMON33228.

[0078] O terminador não-traduzido 3' do tipo II da glutelina de arroz (3' r glut) (Número de Acesso de Genebank X05664.gb_pl) (SEQ ID NO:61) foi isolado através de PCR de DNA genômico de arroz. Amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95Ό, anelado por 2 minutos a 50Ό e estendido por 3 minutos a 72*C por um total de 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Sphl e EcoRI. O pMON33225 contém a região de terminador não-traduzida r glut 3' de Sphl/EcoRI clonada.

[0079] O terminador não-traduzido 3' de desidrogenase de lactato de arroz (3' r lacd) (Número de Acesso de Genebank D13817.gb_pl) (SEQ ID NO:62) foi isolado através de PCR de DNA genômico de arroz. Amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:38. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95°C, anelado por 2 minutos a 40Ό e estendido por 3 m inutos a 72°C por um total de 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Sphl e EcoRI. Ο PMON33218 (figura 15) contém o fragmento de Sphl/EcoRI clonado inserido.

[0080] O terminador não-traduzido 3' de beta-tubulina de arroz (3' r btub) (Número de Acesso de Genebank L19598.gb_pl) (SEQ ID NO:63) foi isolado através de PCR de DNA genômico de arroz. Amplificação foi realizada usando sequências de iniciador SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:40. O DNA foi desnaturado por 1 minuto a 95Ό, anelado por 2 minutos a 40*C e estendido por 3 minutos a 72Ό por um total de 30 ciclos. O produto de PCR resultante foi digerido com Sphl e EcoRI. O pMON33216 (figura 13) contém o fragmento de Sphl/EcoRI clonado inserido.

[0081] PMON47901 (figura 19) foi construído através de ligação dos fragmentos de EcoRI e Pstl de 3.166 kb de pMON33225, os fragmentos de Pstl e Bglll de 0,71 kb de pMON26038 e os fragmentos de Bglll e EcoRI de 2,671 kb de pMON19433.

[0082] PMON47906 (figura 20) foi construído através de ligação dos fragmentos de Ncol e Bglll 5.748 kb de pMON47909 e os fragmento de Stul e Ncol de 0,449 kb de pMON33216 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0083] PMON47907 (figura 21) foi construído através de ligação dos fragmentos de Ncol e Bglll 5.743 kb de pMON47910 e os fragmentos de Stul e Ncol de 0,449 kb de pMON33216 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0084] ΡΜΟΝ47915 (figura 22) foi construído através de ligação dos fragmentos de Ncol e Bglll 5,758 kb de pMON47918 e os fragmentos de Stul e Ncol de 0,449 kb de pMON33216 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0085] PMON47916 (figura 23) foi construído através de ligação dos fragmentos de Ncol e Bglll 5,753 kb de pMON47919 (figura 26) e os fragmentos de Stul e Ncol de 0,449 kb de pMON33216 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0086] PMON47917 (figura 24) foi construído através de ligação dos fragmentos de Ncol e Bglll 5.895 kb de pMON47920 e os fragmentos de Stul e Ncol de 0,449 kb de pMON33216 usando adaptadores para o local Stul que criam uma extremidade complementar Bglll (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4).

[0087] PMON47919 (figura 25) foi construído através de ligação dos fragmentos de EcoRI e Pstl de 3.166 kb de pMON33225, os fragmentos de Pstl e Bglll de 0,726 kb de pMON26046 e os fragmentos de Bglll e EcoRI de 2.671 kb de pMON19433(figura 5).

[0088] Todos os plasmídeos foram verificados através de digestão de restrição com Bglll e foram testados em ensaios de expressão transiente em protoplastos derivados de caule de Mustang de trigo ou protopiastos derivados de caule BMS de milho ou foram testados como construções estável mente integrados em plantas transgênicas conforme descrito abaixo.

Exemplo 2 Transformações Transientes e Expressão de Gene Repórter em Trigo e Milho [0089] DNA de plasmídio purificado foi preparado através do procedimento de preparação Qiagen maxi de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Os plasmídeos GUS contendo líderes não-traduzidos 5' ou regiões de terminação não-traduzidas 3' e combinações de regiões não-traduzidas 5' e 3’ em DNAs de vetor e pMON19437 como o controle de luciferase interno foram misturados e eletroforados. Para experimentos reversos para examinar os aperfeiçoamentos com sequências de codificação adicionais, a luciferase era o gene repórter variável, GUS no pMON 19469 era o controle interno. As transformações foram realizadas em duplicata. Os elementos de região não-traduzidos 3’ em combinação com sequências líder não-traduzidas 5' foram também testados com relação ao vetor pMON 19469 de base de controle.

[0090] A análise de expressão dos genes em plantas foi bem documentada (Schledzewski e outros, 1994; Steinbiss e outros, 1991; Stefanov e outros, 1991). A análise de expressão dos protoplastos tal como aquela aqui descrita é muitas vezes uma previsão do desempenho de expressão de um gene recombinante em células de planta.

Análises de expressão de aene em protoplastos de tríao [0091] O método usado para o isolamento e preparação dos protoplastos de trigo foi realizado conforme descrito por Zhou e outros, 1993. O tampão de eletroporação usado foi anterior mente descrito (Li e outros, 1995). O meio de cultura usado era MSI WSM (4,4 g de sais Gibco MS/L, 1,25 ml de HCL de Tiamína (0,4 mg/ml), 1 ml de 2,4-D (1 mg/ml), 20 g/L de saca rose, 0,15 ml de asparagina (15 mg/ml), 0,75 g de MgCI2, 109 g/L de manitol 0,6M, pH 5,5.

[0092] As suspensões Mustang foram usadas para isolamento de protoplasto por cerca de quatro dias após subcultura. Rapidamente, 8 g de suspensão de célula de trigo foram vertidos em um tubo de cultura e as células foram deixadas assentar. O meio foi removido, e as células remanescentes ressuspensas com 40 ml de solução de enzima, transferidas para uma placa petrí, capturadas em folha, e incubadas a 26G por 2 horas em um girador de 40 rp m. A suspensão foi centrifugada a 200 g por 8 minutos, lavada duas vezes com centrifugação entre cada lavagem, ressuspensa em 10 ml de solução de lavagem e armazenada em gelo. O número de protoplastos foi determinado e o volume ajustado para uma concentração final de 4x106 de protoplasto/ml. Cerca de 0,75 ml de protoplastos foi adicionado a cada cuveta de eletroporação e até cerca de 50 pg de DNA de plasmídio em solução de 50 μΐ foram adicionados aos protoplastos. As condições de eletroporação eram 960 pFarads e 160 volts usando um Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As amostras permaneceram em gelo por 10 minutos antes e durante a eletroporação. Após a eletroporação, as amostras foram deixadas em gelo por cerca de 10 minutos e então removidas e deixadas aquecer para a temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. As células eletroporadas foram então pipetadas em um meio MSI WSM e incubadas no escuro por 18-22 horas a 24°C. As células foram colhidas através de centrifugação em 200-250 g por 8 minutos e congeladas em gelo seco para análises subsequentes quanto ao(s) gene(s) de interesse.

Análises de Expressão de Gene em Protoplastos de Milho [0093] Um sistema de ensaio transi ente de protoplasto de milho foi usado para avaliar a expressão GUS/LUX das várias construções. O isolamento e a eletroporação do protoplasto de folha de milho foram realizados conforme descrito por Sheen, 1991, com as mudanças que seguem: as sementes foram esterilizadas na superfície, germinadas em meio 1/2MS {2,2 g/L de sais MS, 0,25% gelrite) e cultivadas 5 dias a 26Ό em fotoperíodo de 16/8 dia/noite, 6 dias de completa escuridão, 26*C e 24 horas sob as primeiras condições de trata mento. A segunda folha verdadeira de cada planta foi cortada longitudinalmente e digerida por cerca de 2 horas na luz a 26Ό. Após d igestão, as placas foram giradas a 80-100 rpm por 20-30 segundos, e a solução de protoplastos/enzima pipetada através de um coletor de tecido de 190 μηι. Os protoplastos foram contados usando um hemacitômetro. Cuvetas pulsantes Bio-Rad Gene (Bio-Rad, Hercules, CA) com uma abertura de 0,4 cm e volume máximo de 0,8 ml foram usadas para as eletroforações. Dez a 100 pg de DNA de plasmídio em adição a 5 pg de DNA contendo o gene de luciferase como um controle interno foram adicionados à cuveta. As densidades de protoplasto final eram de cerca de 3 milhões por ml a 4,5 milhões por ml, com ajustes de eletroporação a uma capacitância de 125 pFarad e 200 volts. Os protoplastos foram incubados em gelo após ressuspensão em tampão de eletroporação e permaneceram no gelo até 10 minutos após eletroporação. Os protoplastos foram adicionados a cerca de 7 ml de meio MS modificado conforme descrito em Fromm e outros, 1987, com a adição de 0,6M de manitol em placas petri cobertas com o mesmo meio mais 1,5% de agarose SeqPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, ME)). Os protoplastos foram colhidos através de centrifugação 24 horas após a eletroporação e usados para análises de expressão subsequentes quanto ao(s) gene(s) de interesse.

Atividade GUS

[0094] A atividade GUS (β-glucuronidase) foi determinada a partir de 25 μΙ de extrato de célula de acordo com os métodos de Jefferson e outros (1987) usando 2 mM de MUG (4-metilumbeliferil-p-D-glucuronida) no tampão de extração anteriormente descrito. As fluorescência foi medida usando um Fluorômetro de DNA Hoescht (Modelo TKO 100). Uma curva padrão de metilumbeliferil (Sigma) foi gerada usando uma solução de 1μΜ.

Atividade de Luciferase [0095] Para determinar a atividade de luciferase, dez microlitros de cada extrato de proteína de teste bruta foram dispersos em uma placa de microtitulação. Vinte e cinco microlitros de tampão 2X (50 mM de Tricina (pH 7,8), 30 mM de MgCI2, 10 mM de ATP e 0,5 mg/mL) foram adicionados a cada cavidade contendo extrato. As reações foram iniciadas com a adição de 25 μ I de luciferin 10 mM, As amostras foram misturadas e a quimioluminescência de cada amostra foi quantificada em um contador de cintilação de microplaca Packard TopoCount usando um atraso de contagem de 5 minutos e tempo de contagem de 0,2 minuto.

[0096] Os resultados são expressos como uma razão de níveis de gene repórter experimental para controle interno dos níveis de gene repórter. O plasmídio de controle continha um gene repórter diferente e foi usado para corrigir quanto à variabilidade nos procedimentos de transformação e extração.

Tabela 2 Efeito de Líderes 5' Não-traduzidos sobre a Expressão GUS em Protoolastos de Mustana de Triao [0097] O efeito de Líderes 5' não-traduzidos sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Mustang de Trigo foi medido usando construções que continham vários líderes 5' não-traduzidos. O nível de expressão para o plasmídio de controle contendo a sequência 5’ de base sintética (SEQ ID NO:45), o íntron hsp 70 (SEQ ID NO:47) e a região de terminador 3' nos (SEQ ID NO;46) foram ajustados como 1,0. A expressão GUS foi aumentada nos protoplastos de trigo usando as sequências líderes 5' não-traduzidas de proteína de choque de calor de trigo (Ta hsp), frutose-1,6-bifosfatase de trigo (Ta fbp) ou proteína de ligação a/b de clorofila de trigo (Ta cab) comparada com as sequências de base sintética (Tabela 2). O efeito foi menos pronunciado nos protoplastos BMS de milho (Tabela 3).

Tabela 3 Efeito de Líderes 5' Não-traduzidos sobre a Exoressão GUS em Protoplastos de BMS de Milho [0098] A tabela 4 mostra o resultado GUS em protoplastos de Mustang de trigo usando construções que contêm sequências 3’ não-traduzidas de proteína de choque de trigo de trigo (3’ Ta hsp), frutose-1,6-bifosfatase de trigo de trigo (3' Ta fbp) ou ubiquitina de trigo (3’ Ta ubiq) em comparação com o vetor contendo a região 3' nos. Cada uma das regiões 3' não-traduzidas provê expressão GUS maior com relação àquela observada com a região 3* não-traduzida.

Tabela 4 Efeito dos Terminadores de Região Não-traduzida 3* sobre a Expressão GUS em Folha de Trigo Bombardeada [0099] Os efeitos de combinação das sequências 5' e 3' não-traduzidas descritas foram avaliados em protoplastos de Mustang de trigo. A expressão LUX foi medida em adição à expressão GUS para confirmar que os níveis de expressão maiores eram não-específicos de GUS. Ambos níveis de expressão de GUS e LUX foram quando aumentados usando as construções contendo os líderes 5' nâo-traduzidos Ta cab, Ta hsp ou Ta fbp e terminadores 3' não-traduzídos Ta ubiq, Ta fbp ou Ta hsp (Tabela 5).

Tabela 5 Efeitos Combinatórios das Sequências de Terminador Não-traduzídas 5' e 3' sobre as Expressões GUS e LUX em Protoplastos de Mustanq de Trigo [00100] Os efeitos combinados das sequências líder 5’ não-traduzidas e sequências de terminador 3’ não-traduzidas foram também medidos em protoplastos BMS de milho. A expressão GUS foi geral mente aumentada acima do controle de base {Tabela 6). Os resultados observados no carroborato de milho confirmam aqueles encontrados no trigo, demonstrando que os efeitos benéficos das sequências 5' e 3' não-traduzidas da invenção não são limitados a espécies a partir das quais as sequências não-traduzidas são derivadas. TABELA 6 Efeitos Combinatórios das Sequências de Terminador Não-traduzidas 5' e 3' sobre a Expressão GUS em Frotoplastos BMS de Milho Exemplo 3 í ransíormacáo bstável em Plantas de 1 riqo [00101] Os efeitos das sequências não-traduzidas 5’ e 3’ sobre a expressão GUS foram também avaliados em plantas de trigo transgênicas. O procedimento para transformação e regeneração de trigo foi conforme descrito na Patente U.S. 5.631.152, aqui incorporada a título de referência, mas foi modificado para seleção G418. Em resumo, embriões imaturos foram culturados em meio CM4C por 0-4 dias (componentes CM4C: 4,3 g/L sais MS Gibco, 10 ml/L de vitaminas MS(100X), 0,5 ml/L 2,4D, 40 g/L de maltose, 0,5 g/L de Glutamina, 0,75 g/L de cloreto de magnésio, 0,1 g/L de hidrolisato de caseína, 1,95 g/L de MES, 2 g/L de Phytagel); as culturas foram transferidas para meio CM4C Raff/mann por cerca de 4 dias, bombardeadas e transferidas para CM4C contendo 25 mg/L de G418 por cerca de 5 dias; as culturas foram regeneradas em MMS0.2C contendo G418 (25 mg/L) por cerca de 19 dias, regeneradas em MMSOC contendo 25mg/L de G418 por cerca de 33 dias e fixadas em MMSOC contendo 25 mg/L de G418 por cerca de 57 dias e subsequentemente transferidas para o solo em cerca de 75 dias. O meio CM4C (G418) continha 2,2 ml/L de picloram 1 mg/ml, 1ml/L de G418 (25 mg/ml) e 2 ml/L de ácido ascórbico (50 mg/ml de estoque). O CM4C Raff/Mann 0,25 continha os componentes que seguem: 4,4 g/L de sais MS, 10 ml/L de Vitaminas MS (100X), 0,5 ml/L de 2,4-D, 40 g/L de maltose, 74,3 g/L de rafinose, 22,78 g/L de manitol, 0,5 g/L de glutamina, 0,75 g/L de cloreto de magnésio, 1,95 g/L de MES, 0,1 g/L de hidrolisato de caseína, 2 g/L de Phytagel, 2,2 ml de picloram (1 mg/ml) e 2 ml de ácido ascórbico (50 mg/ml). O meio MMS0,2C continha 4,3 g/L de sais MS, 1,95 g/L de MES, 2 ml/L de vitaminas MMS, 0,2ml/L de 2,4-D, 40 g/L de maltose e 2 g/L de ágar (Schweizer Hall). O MM20,2C (G418) continha 1ml de 25 mg/ml de G418 e 2 ml de 50 mg/ml de ácido ascórbico. O MMS0C continha 4,3 g/L de sais MS, 1,95 g/L de MES, 2,0 ml/L de vitaminas MMS e 40 g/L de maltose. O MMS0C (G418) continha 1 ml adicional de 25 mg/ml de G418 e 2 ml de 50 mg/ml de ácido ascórbico. As linhagens transgênicas foram estabelecidas usando as construções de DNA descritas na Tabela 7 abaixo e as plantas foram avaliadas quanto aos níveis de atividade GUS.

[00102] Os níveis de GUS relativos eram comparáveis ou maiores do que o vetor de controle de base para muito das construções contendo os elementos não-traduzidos da invenção. Em particular, as construções contendo uma sequência líder 5' não-traduzida Ta cab ou Ta fbp em combinação com uma sequência de terminador 3' não-traduzida Ta hsp ou Tao fbp proveram os níveis de expressão mais altos. Um outro construto preferido continha um líder não-traduzido 5' Ta fbp e uma região de terminador nos não-traduzida 3'. TABELA 7 Efeito de Elementos Genéticos de Líder Não-traduzido 5' e Terminador Não-traduzido 3' sobre a Expressão GUS Estável em Plantas de Trigo Transqênicas [00103] Todos os valores de atividade GUS expressos como n-número de proteína pmoi/min/mg de plantas de trigo individuais avaliadas [00104] A porcentagem de casos positivos de GUS em plantas de trigo transgênicas foi usada para determinar o efeito das sequências líder 5' não-traduzidas e de terminador 3’ não-traduzidas sobre a recuperação de expressão GUS estável. As construções que proveram altos níveis de expressão de GUS na Tabela 7 também causaram uma alta porcentagem de casos de GUS positivos (Tabela 8). TABELA 8 Efeitos de Elementos Genéticos de Líder Não-traduzidos 5’ e Terminador Não-traduzidos 3' sobre a Recuperação e Expressão GUS Estável Acima do Níveis Limiares Anteriores em Plantas de Trigo Transaênicas lABhLA b> bteito aos uaeres £>' Nao-traauziaos sopre a Expressão GUS em Protoolastos de Folha de Milho TABELA 10 Efeito dos Líderes 5' Não-traduzidos sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Folha de Milho [00105] O efeito de vários líderes não-traduzidos 5’ sobre a expressão GUS nos protoplastos de folha de milho foi medido usando construções que continham vários líderes 5’ não-traduzidos (Tabelas 9 e 10). A expressão GUS foi aumentada nos protoplastos de folha de milho quando usando as sequências lideres 5' não-traduzidas de proteína de ligação a/b de clorofila de trigo (Ta cab), proteína de choque de calor de trigo (Ta hsp), peroxidase de trigo (Ta per) ou beta-tubulina de arroz (rbtub). TABELA 11 Efeito de íntrons sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Folha de Milho [00106] O efeito de vários íntrons sobre a expressão GUS em protoplastos de folha de milho foi medido usando construções que continham vários íntrons. A expressão GUS foi aumentada em protoplastos de folha de milho quando usando os íntrons da primeira amílase (r amy I), da liase de fenilalanina amônia (r pal) ou da primeira sintase de sacarose (ss1) de arroz. TABELA 12 Efeito de Terminador de Região 3’ Não-traduzida sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Folha de Milho [00107] O efeito de vários terminadores 3' não-traduzidos sobre a expressão GUS de protoplastos de folha de milho foi medido usando construções que continham vários terminadores 3' não-traduzidos. A expressão GUS foi aumentada em protoplastos de folha de milho usando os terminadores 3' não-traduzidos da glutelina de arroz do tipo ll (rbglut), desidrogenase de lactato de arroz {r lacd) ou beta-tubulina de arroz (r tub) comparada ao construto de controle que continha o terminador nos 3' não-traduzido. TABELA 13 Efeitos Combinatórios de Sequências 5’ e 3’ Não-traduzidas sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Folha de Milho TABELA 14 Efeitos de Várias Sequências Líderes sobre a Expressão GUS em Protoplastos de Folha de Milho [00108] O nível de aperfeiçoamento de expressão de DNAs estruturais pode variar devido a outras razões que não a sequência líder 5' não-traduzida, sequência de terminador 3’ não-traduzida ou sequências de íntron. Essas razões podem incluir locais de processamento de transcrição, locais de poliadenilação, sinais de terminação transcripcional, sinais de transporte dentro da região de codificação, etc. A mesma sequência pode prover níveis de expressão variáveis dependendo das espécies nas quais ela está sendo expressa e a composição precisa da sequência e pode requerer algum grau de otimização de rotina para melhores resultados em espécies de planta diferentes.

[00109] Certas características e subcombinações da presente invenção podem ser empregadas sem referência a outras características e subcombinações. Isto é considerado por e está dentro do escopo das reivindicações. Devido ao fato de muitas modalidades possíveis poderem ser feitas da invenção sem se afastar do escopo da mesma, é entendido que toda a matéria aqui descrita ou mostrada nos desenhos acompanhantes deve ser interpretada em um sentido ilustrativo e não limitante.

[00110] Todas as composições e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará aparente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas às moléculas de DNA e nas etapas ou nas sequências de etapas dos métodos aqui descritos sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, ficará aparente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos por agentes descritos aqui enquanto o mesmo resultado ou similares seriam conseguidos. Todos os substituintes e modificações similares aparentes paras aqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definidos pelas reivindicações apensas.

REFERÊNCIAS

As referências que seguem, até o ponto que elas fornecem detalhes de procedimento exemplares ou outros suplementares àqueles aqui descritos, são especificamente aqui incorporadas a título de referência.

Bird and Ray, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 9:207-27 (1991) Birren e outros, Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, Nova York (1996) Bouhida e outros, Journal General Virology (1993) vol. 74 pp. 15-22 Callis e outros, Genes and Develop, 1:1183-1200 (1987) Carrington e Freed, J. of Vir. 64, 1590-1597 (1990) Coruzzi e outros, EMBO J. (1984) vol. 3 pp. 1671-1679 Dellaporta e outros, Stadler Symposium 11:263-282 (1988) Dietrich e outros, J. Cell. Biol. 105, 67 (1978) Fromm e outros, Methods Enzymol, 153, 351-366 (1987) Gallie e outros, NAR 15, 8693-8711 (1987) Gallie e outros, The Plant Cell 1:301-311 (1989) Gelvin e outros, Em: Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1990) Gibson e Shillitoe, Molecular Biotech. 7(2) 125-37 (1997) Goff e outros, EMBO J.,9:2517-2522 (1990) Hattori e outros, Genes Dev. 6:609-618 (1992) Hinchee e outros, Bio/Technology 6:915-922 (1988) Hinchee e outros, Plant Transformation, Em PLANT CELL AND TISSUE CULTURE, 231-270, 1994, Vasil and Thorpe (Eds.), Dordrecht Publishing, Países Baixos Ikatu e outros, Bio/Technol 8:241-242 (1990) Innes e outros, Em: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990 Jackson e outros, TIBS15, 477-483 (1990) Jefferson e outros, EMBO J. 6:3901-3907 (1987) Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405 (1987) Jobling e Gehrke, Nature 325, 622-625 (1987) Jorgensen, Trends in Biotech 8(12) 340-44 (1990) Joshi, Nucl. Acids Res. 15:6643-6653, 1987 Katz e outros, J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714 (1983) Klein e outros, Bio/Technology 6:559-563 Kozak, Cell 44, 283-292 (1986) Kozak, Mol. And Cell. Biol. 8, 2737-2744 (1988) Koziel e outros, Plant Mol. Biol. 32:393-405 (1996) Li e outros, Molecular Breeding (1997) vol. 3 pp. 1-14 Mailga e outros, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995) Marcotte e outros, Nature, 335:454-457(1988) Marcotte e outros, Plant Cell, 1:523-532 (1989) Mascarenkas e outros, Plant Mol. Biol., 15, 913-920 (1990) McCarty e outros, Cell 66:895-905 (1991) McElroy e outros, Plant Cell, 2:163-71 (1990) McElroy e outros, Mol. Gen. Genet. 231:150-160 (1991) Medberry e Olszewski, Plant Journal (1993) vol. 3 pp. 619- 626 Moffatt e outros, Gene (1994) vol. 143 pp. 211-216 Moldave, Ann. Rev. Biochem. 54, 1109-1149 (1985) Ni e outros, Plant J. (1995) vol. 7 pp.661-676 Odell e outros, Nature (1985) vol. 313 pp. 810-812 Ow e outros, Science 234:856-859 (1986) Pain, Biochem. J„ 235, 625-637 (1986) Pelletier and Sonenberg, Cell 40, 515-526 (1985) Potrykus e outros, Mol. Gen. Genet., 199:183-188 (1985) Pouwels e outros, Em: Cloning Vectors, A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987 Ritchie e outros, Em TRANSGENIC PLANTS, Vol. 1, 147-177, 1993; Kung and Wu (Eds.), Academic Press Inc. Harcourt Brace Jovanovich Publishers Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989) Sanger e outros, Plant Mol. Biol. (1990) Vol. 14 pp. 433-443 Schledzewski e outros, Transgenic Research (1994) 3:249-255 Schuch, Symposia of the Society for Experimental Biology 45:117-27(1991) Sheen e outros, Plant Cell 3(3) 225-245 (1991) Skuzeski e outros, Plant Mol. Biol., 15, 65-79 (1990) Sonenberg, Curr. Top. Micro, and Imm., 161, 23-47 (1990) Songstad e outros, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 32:179-183 (1995) Stalker e outros, J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (1988) Stefanov e outros, Acta Biologica Hungarica (1991) 42:323-330 Steinbiss e outros, Subcellular Biochem. (1991)17:143-166 Sutcliffe e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 75:3737-3741 (1978) Tanaka, Nucl. Acids Res., 18:6767-6770, 1990 Thillet e outros, J. Biol. Chem., 263:12500-12508 (1988) Vasil e outros, Bio/Technology 10:667 (1992) Wang e outros, Plant Mol. Biol., 19:881-885 (1992) Weissbach and Weisbach, Em Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989 Wen e outros, Chinese J. of Bot. (1993) Vol. 5 pp 102-109 Xu e outros, Plant Physiology(1994) Vol. 106 pp. 459-467 Zhong e outros, Plant Science (1996) Vol. 116 pp. 73-84 Zhou, H. e outros, Plant Cell Reports (1993) 12:612-616 Zhu e outros, Plant Mol. Biol. 29:535-550 (1995) Zukowsky e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 80:1101-1105 (1983) REIVINDICAÇÕES

Claims (36)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende, operavelmente ligadas na direção 5' a 3': (a) uma sequência de promotor; (b) uma sequência líder 5' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo; em que a referida sequência tem a sequência de SEQ ID NO: 53; (c) uma sequência intermediária isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de actina de arroz, um gene de sintase de sacarose de arroz, um gene de liase de fenilalanina de amônia de arroz, e um gene de proteína de choque de calor de milho, em que a referida sequência intermediária compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51; (d) uma sequência de codificação de DNA; e (e) uma sequência de terminador 3' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeos associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de ubiquitina de trigo, um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene da glutelina de arroz, um gene de desidrogenase de lactato de arroz e um gene de beta-tubulina de arroz, em que a referida sequência de terminador 3' compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 58-63.

2. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de actina de arroz.

3. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de sintase de sacarose.

4. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de liase de de fenilalanina amônia de arroz.

5. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de amilase de arroz.

6. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de glutelina de arroz.

7. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de desidrogenase de lactato de arroz.

8. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de beta-tubulina de arroz.

9. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo.

10. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzido é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de ubiquitina de trigo.

11. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo.

12. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência líder 5' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo, a sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de actina de arroz, e a região 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo.

13. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor é constitutivo, induzível, desenvolvimentalmente regulado, quimicamente regulado, aperfeiçoador de tecido ou específico de tecido.

14. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de codificação de DNA está na orientação de sentido.

15. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de codificação de DNA está na orientação de anti-sentido.

16. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é inserida no genoma de uma planta, célula de planta ou semente.

17. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta é uma dicotiledônea.

18. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta é uma monocotiledônea.

19. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo em alfafa, cevada, aveia, milho, arroz, centeio e trigo.

20. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de trigo.

21. Molécula de DNA de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a planta é uma planta de milho.

22. Micro-organismo transgênico, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA recombinante operavelmente ligada à direção 5' a 3' (a) uma sequência de promotor; (b) uma sequência líder 5' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo; em que a referida sequência tem a sequência de SEQ ID NO: 53; (c) uma sequência intermediária isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de actina de arroz, um gene de sintase de sacarose de arroz, um gene de liase de fenilalanina de amônia de arroz, e um gene de proteína de choque de calor de milho, em que a referida sequência intermediária compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51; (d) uma sequência de codificação de DNA; e (e) uma sequência 3' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de ubiquitina de trigo, um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene de glutelina de arroz, um gene de desidrogenase de lactato de arroz e um gene de beta-tubulina de arroz, em que a referida sequência de terminador 3' compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 58-63.

23. Micro-organismo transgênico de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que é uma célula bacteriana ou viral.

24. Método para prover expressão de gene aumentada em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformação de células de plantas com uma molécula de DNA recombinante que compreende, operavelmente ligada à direção 5' a 3': (i) uma sequência de promotor, (ii) uma sequência líder 5' não-traduzida isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo; em que a referida sequência tem a sequência de SEQ ID NO: 53; (iii) uma sequência de codificação de DNA; (iv) uma sequência intermediária associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de actina de arroz, um gene de sintase de sacarose de arroz, e um gene de liase de fenilalanina de amônia de arroz, em que a referida sequência intermediária compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 47, 48, 50 e 51, (v) sequência de terminador 3' não-traduzida associada a um gene selecionado do grupo consistindo em um gene de proteína de choque de calor de trigo, um gene de ubiquitina de trigo, um gene de frutose-1,6-bifosfatase de trigo, um gene de glutelina de arroz, um gene de desidrogenase de lactato de arroz, e um gene de beta-tubulina de arroz, em que a referida sequência de terminador 3' compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 58-63; (b) seleção das células de planta que foram transformadas; e (c) regeneração das ditas células de planta para prover uma planta diferenciada.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de actina de arroz.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de sintase de sacarose de arroz.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência intermediária é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de liase de fenilalanina de amônia de arroz.

28. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de glutelina de arroz.

29. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de desidrogenase de lactato de arroz.

30. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de beta-tubulina de arroz.

31. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não- traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de proteína de choque de calor de trigo.

32. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de ubiquitina de trigo.

33. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de terminador 3' não-traduzida é isolada de uma sequência de nucleotídeo associada a um gene de frutose-1,6-bifosfato de trigo.

34. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de DNA está na orientação de sentido.

35. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de DNA está na orientação de anti-sentido.

36. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o promotor é constitutivo, induzível, desenvolvimentalmente regulado, quimicamente regulado, aperfeiçoador de tecido ou específico de tecido.