ES2568693B1

ES2568693B1 - Método para incrementar la fertilidad de las plantas

Info

Publication number: ES2568693B1
Application number: ES201431459A
Authority: ES
Inventors: Mohamad Abbas; David ALABADÍ DIEGO; Miguel Ángel BLAZQUEZ RODRÍGUEZ
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia
Priority date: 2014-10-02
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2017-02-13
Anticipated expiration: 2034-10-02
Also published as: WO2016051009A1; ES2568693A1

Abstract

Método para incrementar la fertilidad de las plantas.#La presente invención se relaciona con un método para incrementar la fertilidad de una planta que comprende inhibir, disminuir o bloquear la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 con respecto a un control o la actividad de la proteína IAMT1, y la planta derivada de la aplicación de dicho método, así como el uso de gen que codifica la proteína IAMT1 para incrementar de fertilidad de la planta.

Description

La presente invención se refiere a un metodo para incrementar la fertilidad de las plantas y a las plantas obtenidas mediante dicho método. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la agricultura.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El calentamiento global tiene un impacto negativo sobre la agricultura, por ejemplo contrarrestando los efectos positivos que el aumento de C02 podría tener sobre la fisiología de las plantas. Por ejemplo, la producción de granos de arroz desciende un 10% por cada 1°C que aumenta la temperatura nocturna, y se estima que cada aumento de 1°C por encima de los 15°C reduce la producción de trigo en un 3-4%, mientras que cada día que el maíz pasa por encima de 30°C reduce el rendimiento un 1%. Uno de los problemas más graves que provocan las altas temperaturas sobre los cultivos es el descenso de la fertilidad del polen, documentado ya en varias especies como el tomate, el algodón, la cebada o el arroz. El efecto dañino sobre el polen parece deberse a la combinación de una menor dehiscencia de las anteras, menor producción de granos de polen, esterilidad del polen, y reducida germinación del polen in vivo. Por este motivo, la investigación de tratamientos o variedades que permitan a las plantas seguir siendo fértiles en altas temperaturas es muy activa.

Varios compuestos han sido probados con éxito en el laboratorio para mejorar la fertilidad del polen, como el etileno, los brasinosteroides o las auxinas, mientras que la obtención de nuevas variedades se realiza tanto con abordajes de mejora tradicional como mediante aplicaciones biotecnológicas basadas en la genética molecular.

La solicitud de patente EP2394513A1 describe un método para restaurar la esterilidad masculina en plantas gramíneas que comprende la administración de auxinas a las plantas.

La solicitud de patente EP2054516B1 describe plantas modificadas genéticamente que presentan características fenotípicas mejoradas, como un incremento en la producción de semillas y la tolerancia al estrés abiótico. Este documento describe plantas que tienen una expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un pOlipéptido PRC (Proteínas Relacionada con el Crecimiento) y el procedimiento para obtener dichas plantas.

La patente ES2334539B1 describe el uso del gen que codifica la enzima PPAT (fosfopanteteína adeniltransferasa) para la obtención de plantas transgénicas que presentan una mayor crecimiento vegetativo y reproductivo, mayor producción de semillas, disminución del tiempo de floración, mayor resistencia al estrés osmótico y salino, aumento del contenido de ácidos grasos en semillas y composición aminoacídica modificada.

Liao, P. y col. 2014 (PLoS One, 9(5):e98264) describen un mutante de 3-hidroxi-3metilglutaril-coenzima A sintetasa (HMGS), la segunda enzima de la vía del mevalonato (MVA), que mejora el rendimiento en la producción de semillas cuando se sobreexpresa en una planta.

No obstante, todavía existe en el estado de a técnica la necesidad de proporcionar plantas cuya fertilidad esté incrementada o no se vea mermada en condiciones de estrés.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que la inhibición o el bloqueo de la metilación del ácido indol acético (AlA) en las plantas provoca un mayor crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas en las que dicha metilación no está inhibida o bloqueada. Como consecuencia de este crecimiento, la fertilidad de las plantas se ve incrementada, llegando incluso a ser restaurada en aquellas plantas en las que debido a condiciones de estrés, como las altas temperaturas o la escasez de agua, su fertilidad se ve mermada. Los inventores llegaron a esta conclusión tras truncar en Arabidopsis thaliana el gen que codifica la proteína ácido indolacético-carboximetiltransferasa 1 (IAMT1 ), enzima encargada de metilar el AlA para dar lugar al AIA-metilado (Me-AlA), y observar que la pérdida de la función de esta enzima origina acelera el crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas control (ver Ejemplo 1 y Figuras 5 y 6). Por lo tanto, se puede concluir que la inhibición de la metilación del AlA da lugar a un incremento en la

fertilidad de las plantas, lo que se traduce en un mayor rendimiento de los cultivos al obtener plantas que generan más semillas y con ello, más frutos.

Así, en el contexto de la presente invención, se contempla una planta que comprende la ruta de metilación del AlA bloqueada o inhibida. Como entiende el experto en la materia, el bloqueo o la inhibición de una ruta metabólica puede llevarse a cabo a diferentes niveles: puede inhibirse o bloquearse la expresión del gen que codifica la enzima IAMT1 , por ejemplo, mediante el empleo de moléculas que impidan la unión de la ANR polimerasa, mutando el promotor para que no sea reconocido por los factores de transcripción, empleando inhibidores de la transcripción como ARNs de interferencia, mutando la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína para que se exprese una enzima no funcional, etc., puede inhibirse o bloquearse la propia enzima IAMT1 mediante el empleo de compuestos agentes inhibidores que se unan a la enzima e impidan que realice su función (también denominados agentes inhibidores), etc. Independientemente del procedimiento empleado, la consecuencia es que no se produce la metilación del AlA y con ello, se incrementa la fertilidad de la plantas. A la vista de este descubrimiento, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán descritos en detalle a continuación.

Planta de la invención

En vista de lo anteriormente expuesto, en un aspecto la presente invención se relaciona con una planta, de aquí en adelante "planta de la invención", que comprende el gen que codifica la proteína IAMT1 , caracterizada porque dicha proteína IAMT1:

(i): está ausente o en unos niveles no detectables por técnicas conocidas, o

(ii): no es funcional, es decir, no es capaz de metilar el AlA, o

(iii) se presenta en la planta en unos niveles inferiores con respecto a la planta control, siendo dicha diferencia estadísticamente significativa, de forma que se observa el fenotipo descrito en la planta de la presente invención, y

(iv) dicha la planta no pertenece a la especie Arabidopsis thaliana.

Particularmente, la planta de la invención se caracteriza porque la

(i): la expresión de dicho gen está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control, o da lugar a una proteína no funcional, y

(ii): dicha la planta no pertenece a la especie Arabidopsis thaliana.

Excepto A. thaliana , cualquier planta puede ser objeto de la presente invención, tanto mono-como dicotiledónea. En la presente invención, dentro del término planta se incluyen plantas completas, antecesores y progenies de las plantas y partes de las plantas incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos mencionados comprende disminuida, bloqueada o inhibida la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 ,

o una proteína IAMT1 no funcional.

Las plantas incluidas en la presente invención pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, seleccionadas de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp. , Agave sisalana, Agropyron spp. , Agrostis stolonifera, Allium spp. , Amaranthus spp., Am mophila arenaria, Ana nas com osus, Annona spp., Ap ium graveolens, Arachis sp p, Artocarpus spp., Asparagus officinaJis, Ave na spp. (e. g. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzanlina, Avena fatua varo saliva , Avena hybrida), Averrhoa cara mbola, Ba mbusa sp., Beninca sa hispida, BerthoJletia excelsea, 8 eta vulgaris, Brassica spp. (e.g. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, oilseed rape, turnip rape]), Cadaba f arinosa, Ca mellia sinen sis, Canna indica, Can nabis saliva , Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanat us, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandru m sativum, Corylus spp., Crataegu s spp., Crocu s sat ivus, Cucurbita spp. , Cucumis spp ., Cynara spp. , Oaucus car ota, Desmodium spp., Oim ocarpus Ion gan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., E/aeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), E/eusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotryajaponica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, FortuneJla spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. ( e.g. Glycin e max, Soja hispida or Soja max), Gossypiu m hirsutum, HeJianthus spp. (e.g. He/ianthus annuus), HemerocaJlis fulva, Hibiscus spp. , Hordeum spp_ (e.g. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp. , Lens culinaris, Linum usitatissimum, Utchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylva tica, Lycopersicon spp. (e.g . Lycopersicon esculentum, Lycopersicon Iycop ersicum, Lycopersicon p yriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Ma mmea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota , Medicago sativa, Melilotus sPP., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotia na spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (e.g. Oryza saliva, Oryza latifoJia), Panicu m miliaceum, Panicum virgatu m, Passiflora edu lis, Pastina ca sativa , P ennisetum sp. , Persea spp. , Pelroselin um crispum, Phalaris a rundinacea, Phaseolus spp., Phle um pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp. , Raphanus sativus, Rhe um rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus ca mmunis, Ru bus spp., Saccharum s pp., Salix sp., Sa mbucus spp., Secale cerea/e, Sesamum spp., Sinap is sp., Solanu m spp. (e.g. Sola num tuberosum, So/anum integrifolium or Solan um Iycoper sicum), Sorghu m bicolor, Spinacia spp. , Syzygium spp., Tagetes spp. , Tamarindus indica, The obroma cacao, Trifolium spp. , Tripsac[upsiJon}m dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (e. g. Triticum aestivum , Triticum duru m, Triticum turgidum , Triticum hybern um, TriUcu m macha, Triticum sativum, Triticu m monococcum or Triti cum vulgare), TropaeoJum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp. , Vign a spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. , entre otras.

Ejemplos de plantas objeto de la presente invención incluyen, sin limitar a, plantas de interés agronómico, tales como plantas de cereales (trigo, centeno, cebada, etc), árboles frutales, plantas forrajeras (por ejemplo, las leguminosas, berenjenas, pimientos, melones, sandías, pepinos, calabacines, judías, guisantes, habas, cebollas, col china, perejil, rabanito, etc.), y plantas ornamentales.

No obstante, en una realización particular, la planta de la presente invención pertenece al género Solanum sp., en particular es una tomatera. La tomatera de la presente invención puede seleccionarse, por ejemplo, de entre Solanum Iycopersicum, Solanu m peruvianum , Solanum p impinellifolium, Solanu m Iycopersicoides, Solanu m sitiens, Solanu m juglandifolium, Solanu m ochranthu m, Solanum cheesmaniae o Solanum galapagense .. Preferiblemente la tomatera es de la especie Solanum Iycopersicum , o sus sinónimos Lycopersicon esculent um, Lycopersicon esculentu m Mil!., Lycopersicon e sculentum var. esculentum, Solanum escu/entum, Solanum escu/entum Duna!. Más preferiblemente, la variedad de tomatera puede ser seleccionada de la lista de Anna russian, Applause, Aussie, Baladre, Bella rosa, Black cherry, Black russian, Blondkopfchen, Brandywine, Carbon, Ceylan, Cherokee purple, Cherry, Cherry Redondo, Tomate Cherry Pera Amarillo, Comanche, Costoluto genovese, Ditmarcher, Eros, Gallician, Glacier, Gartenperle, Green sausage, Grushovka, Harzfeuer, Hugh, Japanesse black, Jersey devil, Kosovo, Krim black, Kumato, Liguria, Limachino, Lime green salad, Manitoba, Marvel stripe, Moneymaker, Muchamiel, Estrella, Opalka, RAF, Black Pear, Piña Hawaiana, Rio grande, San marzano, Siberian, Sprite, Sugary, Sun sugar, Tigerella, White Queen, Raf Claudia, Roma, Valenciano, Pera de Girana, Montserrat, Corazón de Buey, Angela, Colgar en Rama, Ciruela Negro, Optima, Pata Negra, Copia, Velasco, Montenegro, Vertyco, Ventero, Ramyle, Pitenza, Paladium, Mayoral, Razymo, Matta, Caniles, Byelsa, Royalty, Trujillo, Delizia, Dumas Duratom, Larguero, Torry, Tovistar, Pintón, Grueso, Larga Vida, Marenza o Window box Roma.

La planta de la presente invención se puede obtener mediante múltiples procesos, entre los cuales están las técnicas de mejora genética clásica de cruce y selección o los procedimientos microbiológicos como la obtención de cíbridos o la fusión de células somáticas.

La planta de la invención comprende el gen que codifica la proteína IAMT1. La proteína IAMT1 es la ácido indolacético-carboximetiltransferasa 1, enzima encargada de metilar el AlA para dar lugar al AIA-metilado (Me-AlA). En una realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 50% con la SEa ID NO: 1. La secuencia SEa ID NO: 1 corresponde la proteína IAMT1 procedente de A. thaliana cuyo número de acceso al NCBI es NP_200336.1, versión es NP_200336.1 GI: 15240487.

Las secuencias con al menos un 50% de identidad con SEa ID NO: 1 son secuencias homólogas de la proteína IAMT1. Las secuencias homólogas se refieren a secuencias de especies distintas con expresiones fenotípicas similares que proceden de una secuencia ancestral común. Dentro de la homología de secuencia se distinguen dos tipos de homología: la ortología y la paralogía. Las secuencias ortólogas pertenecen a especies que tienen un antepasado común. Las secuencias parálogas son aquellas que se encuentran en el mismo organismo y una procede de la duplicación de la otra.

SEO ID NO: 1

rngskgdnvav cnmklerlls mkggkgqdsy annsqaqarnh arsmlhllee tlenvhlnss aspppftavd 19cssgantv hiidfivkhi skrfdaagid ppeftaffsd l psndfntlf qllpplvsnt cmeeclaadg nrsyfvagvp gsfyrrlfpa rtidffhsaf slhwlsqvpe svtdrrsaay nrgrvfihga gektttaykr qfqadlaefl raraaevkrg gamflvclgr tsvdptdqgg agllfgthfq dawddlvreg lvaaekrdgf nipvyapslq dfkevvdang sfaidklvvy kggsplvvne pddasevgra fasscrsvag vlveahigee l snklfsrve

sratshakdv lvnlqffhiv aslsft

En la presente invención se entiende por "identidad" o "identidad de secuencia" al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo Needleman y Wunsch (1970, J Mol Bio 48: 443-453) para encontrar el alineamiento de las dos secuencias que maximizan el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. El algoritmo BLAST [Altschul S.F. el al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Ocl 5; 215(3):403-10] calcula el porcentaje de

identidad de secuencias y desarrolla un análisis estadístico de similitud entre las dos secuencias. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN , son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

En una realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 60%, 70%, 80%, 90% o 100% con la SEO ID NO: 1. En otra realización todavía más particular, la proteína IAMT1 comprende un 72% con la SEO ID NO: 1 que, en otra realización aún

más particular, comprende la secuencia SEO ID NO: 2 correspondiente a la proteína IAMT1 de tomate (N' de acceso NCBI: XP_004251920.1 versión XP_004251920.1 GI:460413073).

SEO ID NO: 2

rnatlgdnkdn vvvsnlkler rnlsrnkggkge asyvnnsqaq gqharsrnlhl l ketldgvql irssdnddip fvivdlgcsc gsntvyiidv ivehrnrkrfe kadqqipefs affcdlpsnd fntlfqllpp lanngrneecl asnshrsyfa agvpgsfyrr lfparsidvf ysafslhwls qvpdvvldkq nvaynkgriy ihganesttk aykkqfqsdl anflcarske mkrggsrnflv clgrtsmdpi dqggagllfg thfqdawddl vqeglitsek rdnfnipvya psiqdfkevv eangsftinn lqvfrggspl vvnhpddaae vgralaiscr svsgvlvdah igeqlgdelf trverraarh akelieklqf fhivaslslv

Ejemplos de proteínas IAMT1 de otras especies incluyen, pero no se limitan a (la identidad de secuencia (BLAST) con la SEO ID NO: 1 se muestra entre corchetes), la secuencia SEa ID NO: 3 procedente de Brassica na pus (nO acceso a NCBI: CDY19899.1) [95%], la secuencia SEa ID NO: 4 de Cucumis melo (nO de acceso

NCBI: XP_008447710. 1) [77%], la secuencia SEa ID NO: 5 de Cucumis sativus (n' de acceso NCBI: XP _004151408.1) [78%], la secuencia SEa ID NO: 6 de Fragaria vesca (n' de acceso a NCBI: XP _004294422.1) [76%], la secuencia SEa ID NO: 7 de G/ycine max (n' de acceso a NCBI: XP _003551758.1) [76%], la secuencia SEa ID NO: 8 de So/anum tuberosum (n' de acceso a NCBI: XP_006344874.1) [72%], la

secuencia SEO ID NO: 9 de Malus domestica (nO de acceso NCBI: XP _008364459.1) [74%], la secuencia SEO ID NO: 10 de Jatropha curcas (nO de acceso NCBI: KDP39201.1) [75%], la secuencia SEa ID NO: 11 de Prunuspersica (nO de acceso

NCBI: XP_007211413.1) [74%], la secuencia SEa ID NO: 12 de Theobroma cacao (n' de acceso NCBI: XP _007020694.1) [74%], la secuencia SEa ID NO: 13 de Citrus sinensis (nO acceso NCBI: XP _006474991.1) [71 %], la secuencia SEa ID NO: 14 de

Vitis vinifera (n' de acceso a NCBI: XP_002277167.1) [72%] Y la secuencia SEa ID NO: 15 de Oryza sativa (n' de acceso BNCI : NP_001054175.1) [63%].

La planta de la invención se caracteriza por tener inhibida la ruta de metilación del AlA, es decir, la cantidad de Me-AlA que la planta es capaz de producir está disminuida respecto a una planta control que no presenta inhibida dicha ruta metabólica. Tal como se ha explicado anteriormente, la metilación del AlA se lleva a cabo, principalmente, por la enzima IAMT1. Por lo tanto, inhibiendo la expresión o la función de dicha enzima, se inhibe o inactiva la metilación del AlA. Por otro lado, como entiende el experto en la materia, también cabe la posibilidad de eliminar o delecionar el gen completo (o parte) que codifica la proteína IAMT1, de forma que dicha proteína está ausente en la planta (o en unos niveles no detectables por técnicas conocidas).

En una realización particular, la planta de la invención se caracteriza porque la expresión del gen que codifica la IAMT1 está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control, o da lugar a una proteína no funcional.

En la presente invención se entiende que la expresión de un gen está disminuida/reducida, bloqueada o inhibida/eliminada respecto a un control, cuando los niveles de la proteína codificada por el gen y/o la actividad de la prote ína son menores en comparación una planta control (planta silvestre o wild type). Así, en el contexto de

la presente invención se entiende por "control" a una planta silvestre o wild type. La reducción o eliminación de la expresión o la actividad de la proteína está en orden

aumentado de preferencia por lo menos de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Un ensayo sobre cómo se puede determinar la actividad de la proteína IAMT1 se describe en el ejemplo 1 de la presente solicitud (e.g. midiendo la cantidad de AlA-Me).

Las distintas técnicas que pueden emplearse para disminuir, bloquear o inhibir la expresión de un gen son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y su uso es práctica de rutina para el experto en la materia.

Para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos. Para realizar el silenciamiento génico, este puede ser tan pequeño como 20, 19, 18,17,16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos 50 nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5' y/o 3', ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede derivar del gen que codifica la proteína de interés (gen diana que, en la presente invención es el gen que codifica la proteína IAMT1 ), o de cualquier gen que codifique una proteína con una identidad de secuencia del 50% con la SEO ID NO: 1.

Un procedimiento para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión del gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (AON no codificante). En dicho procedimiento, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través del silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo, preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende las secuencias de control. Una secuencia de AoN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNhp). El ARNhp se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, reduciendo por lo tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles generales adicionales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).

La realización de los procedimientos como se describe en el presente documento no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de "silencia miento génico" bien conocidos para lograr los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión del gen (regulación por disminución). El silenciamiento en este caso se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos, denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silencia miento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcrito de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados del gen de interés) en una orientación en sentido en una planta. "Orientación en sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reduciría la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introducen diversas copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de la co-supresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de las

secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de "ácidos nucleicos

antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una

secuencia de ácidos nucleicos "en sentido" que codifica una proteína, es decir,

5: complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario o

complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos

nucleicos antisentido es preferentemente complementaria al gen endógeno a silenciar.

La complementariedad puede localizarse en la "región codificante" y/o en la "región no

codificante" de un gen. La expresión "región codificante" se refiere a una región de la

1 O: secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de

aminoácido. La expresión "región no codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3'

que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en

aminoácidos (denominado también regiones no traducidas 5' y 3').

15: Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las

normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos

nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos

completa, pero también puede ser un oligonucleótido que es antisentido para solo a

una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5' y 3' del ARNm).

20: Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a

la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un transcripto de ARNm que

cod ifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido

adecuada se conoce en la técnica y puede iniciar de aproximadamente 50, 45, 40, 35,

30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos

25: nucleicos antisentido como se describe en el presente documento puede construirse

usando síntesis química y las reacciones de ligamiento enzimático utilizando los

procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos

nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido)

puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios

30: nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las

moléculas o para el aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las

secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden utilizarse

derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen

bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar las

35: secuencias de ácidos nucleicos antisentido.

La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interes). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador. Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los procedimientos descritos en el presente documento (tanto si se introduce en una planta como se genera in situ) se hibridan con o se unen a los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser cualquier complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a los receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, al ligar la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento.

La disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, tal como un ARNm, en el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591 ) pueden utilizarse para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente por tanto el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo: Cech y col. Patente de Estados Unidos N° 4.987.071; Y Cech y col. Patente de Estados Unidos N° 5.116.742). Como alternativa, los transcriptos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos pueden utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad específica de ribonucleasa de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Seienee 261,1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es ampliamente conocido en el estado de la técnica.

El silenciamiento génico también puede producirse por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de AON-T o inserción de transposón) o mediante estrategias como describen, entre otros, Angell y Baulcombe «1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083) o Bauleombe (documento WO 99115682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede estar provocada por una proteína no funcional. Por ejemplo, la proteína puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que es aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden exhibir su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para el silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C., Anticancer Orug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y col., Ann. NY. Aead. SeL 660, 27-361992; Y Maher, L.J. Bioassays 14, 807-15, 1992. Las expresiones "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" se utilizan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término "promotor" típicamente se refiere a una secuencia de control de ácidos nucleicos localizada en dirección 5' del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo de este modo la transcripción de un ácido nucleico unido operativa mente.

Incluidas en los términos anteriormente mencionados se encuentran las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariota clásico (que incluye la caja TATA que es necesaria para el inicio de transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras en dirección 5', potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o en una forma específica de tejido. También se incluye dentro del término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10. La expresión "elemento regulador" también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. Los promotores en la dirección 5' de la secuencia de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Readi ng Fra me) o la región reguladora e 3' tal como terminadores u otras regiones reguladores 3' que se ubican lejos de la ORF. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a o comprender un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido. La expresión "unido operativamente" como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Un experto conocerá otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que un polipéptido está implicado. En particular, se puede prever que las moléculas fabricadas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana. Como alternativa, puede establecerse un programa de detección hasta identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden utilizarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga. Para desactivar la expresión génica y/o traducción de ARNm pueden utilizarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 1924 nucleótidos. Principalmente funcionan para regular la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayor parte de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana.

Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamiento erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Oieer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) al unirse a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento de bases con ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN se reflejan frecuentemente en niveles de ARNm reducidos de los genes diana. Los microARN artificiales (amiARN ), que típicamente tienen 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden utilizarse para ayudar en el diseño de los amiARN específicos (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Están disponibles para el público las herramientas convenientes para el diseño y la generación de los amiARN y sus precursores (Schwab y col., Planl Ce1118, 1121-1133,2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico utilizadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta dada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que exista una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la disminución/reducción, bloqueo o inhibición/eliminación de la expresión en una planta

de un gen endógeno. Un experto en la técnica será capaz de adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma a través del uso de un promotor apropiado.

Por otro lado, también se contempla la posibilidad de llevar modificaciones posttraduccionales para ¡nactivar la proteína IAMT1 y que ésta no pueda llevar a cabo la metilación del AlA. La modificación postraduccional de una proteína es un cambio químico ocurrido en ésta después de su síntesis. Las modificaciones postraduccionales ocurren mediante cambios químicos de los aminoácidos que constituyen las proteínas y pueden ser de muchos tipos. Ejemplos de modificación postraducciones incluyen, sin limitar a, acilación, fosforilación, metilación, hidroxilación, glicosilación, glicación, sulfonilación, prenilación, nitrosilación y nitración.

En resumen, la planta puede ser manipulada genéticamente para obtener plantas en la que el promotor que regula la transcripción del gen en cuestión esté inactivo (por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones en el genoma), administrar compuestos que impidan la transcripción del gen y/o la traducción del ARNm , tales como ARN de interferencia (siARN, miARN o piARN), etc. Por otro lado, la planta de la invención también puede caracterizarse por que la expresión del gen que codifica la IAMT1 da lugar a una proteína no funcional (en la presente invención, la proteína IAMT1 no puede llevar a cabo la metilación del AlA). Como en el caso anterior, técnicas de ingeniería genética pueden emplearse para expresar proteínas no funcionales, por ejemplo, introducción de truncaciones, mutaciones, deleciones, inserciones, etc. que originan que la proteína IAMT1 no pueda desempeñar su función, es decir, no puedan reconocer al sustrato (AlA) y metitarlo. Adicionalmente, técnicas para obtener las plantas de la invención incluyen, pero no se limitan a, la técnica de Tilfing y la técnica de CRISPRJCAR.

La técnica de Tilling (del inglés Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) es una técnica de genética molecular emplea una mutagénesis química inducida, por ejemplo mediante etilmetanosulfonato o naranja de acridina, sobre un grupo de individuos y tras este protocolo, se detecta mediante la técnica adecuada la presencia de mutaciones en el gen deseado. El TlLLlNG combina mutagénenis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimientos. La técnica de TILLlNG es ampliamente conocida en el estado de la técnica (McCallum y col. 2000, Nat Biotecnol

18: 455-457; revisado por Stemple 2004, Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

La técnica de CRISPR (del inglés de Clustered Regularly Inte rspaced Short Palindromic Repeats ) puede usarse para introducir mutaciones genéticas en localizaciones específicas del ADN genómico, tal como se describe en la solicitud de patente US20 14273235A1.

En una realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEa ID NO: 1. Sin querer estar vinculados a ninguna teoría, se cree que debido a esta deleción, la proteína IAMT1 no es capaz de unirse al AlA (el sustrato) y llevar a cabo su metilación.

Adicionalmente, en el contexto de la presente invención, también se contemplan agentes inhibidores, inactivadores o bloqueadores de la propia proteína IAMT1 (tal como se ha mencionado previamente), y su uso para el incremento o la restauración de la fertilidad de las plantas, consiguiendo con ello una mayor producción de semillas y frutos.

Como se ha explicado previamente, una característica de la planta de la invención es que ésta presenta una fertilidad incrementada con respecto a una planta control, es decir, puede producir más semillas y más frutos que una planta control, tanto en condiciones óptimas como en condiciones de estrés abiótico, tanto por sequía como por altas temperaturas. Así, en una realización particular, la planta presenta un incremento de la fertilidad en condiciones de estrés hídrico (escasez de agua) o térmico (altas temperaturas), más en particular, el incremento de la fertilidad se produce a una temperatura de entre 15°C y 37°C, preferiblemente, de entre 20°C y 29°C, más preferiblemente, en días largos, es decir, en presencia de más de 12 horas de luz.

Como entiende el experto en la materia, la planta de la invención comprende en su genoma el gen que codifica la proteína IAMT1 , en donde la expresión de dicho gen está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un control o da lugar a una proteína no funcional. Como se ha explicado anteriormente, dicha expresión disminuida, bloqueada o inhibida o de lugar a una proteína no funcional puede conseguirse mediante técnicas de silencia miento genético que conlleven la introducción de modificaciones genéticas en el gen que codifica dicha la proteína IAMT1. Por este motivo, dentro de la presente invención, también se contempla el germoplasma derivado de la planta de la invención que lleva incorporado en su genoma la modificación genética que origina que su expresión este disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un controlo da lugar a una proteína no funcional.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un germoplasma procedente de la planta de la invención en donde dicho germoplasma (i) se selecciona del grupo que consiste en una célula, una célula germinal (polen) y una semilla procedente de dicha planta , y (ji) comprende una modificación genética en el gen que codifica la proteína IAMT1 que origina que su expresión esté disminuida, bloqueada o inhibida o de lugar a una proteína no funcional. En la presente invención se entiende por "germoplasma" el material biológico que contiene la variabilidad genética intraespecífica o a los materiales genéticos que pueden perpetuar una especie o una población de un organismo.

El término "célula~ tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una célula vegetal. Así pues, el término célula comprende, al menos, una célula del parénquima, célula meristemática o de cualquier tipo, diferenciada o indiferenciada. Asimismo, también se incluye en esta definición un protoplasto (célula de una planta que carece de pared celular).

En una realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.

Método de la invención

Tal como se ha explicado anteriormente, los inventores han descubierto que la inhibición de la metilación del AlA da lugar a un incremento en la fertilidad de las plantas. Así, en el contexto de la presente invención, se contempla un método para incrementar o restaurar la fertilidad de una planta que comprende inhibir, disminuir o bloquear la ruta de metilación del AlA. Los métodos y técnicas para inhibir, disminuir

o bloquear la ruta de metilación del AlA han sido descritos previamente y son aplicables al presente aspecto inventivo. Entre dichas técnicas, se encuentra la

inhibición, la dism inución o el bloqueo de la enzima encargada de metilar el AlA, es decir, la proteína IAMT1.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona se relaciona con un método para incrementar la fertilidad de una planta, de aquí en adelante método de la invención, que comprende inhibir, disminuir o bloquear

(i): la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 con respecto a un controlo

(ii): la actividad de la proteína IAMT1 .

Los términos "inhibir" , "disminuir" y "bloquear" han sido definidos y explicados previamente en la presente descripción , así como los métodos que existen en el estado de la técnica para inhibir, disminuir o bloquear la expresión de genes o la actividad de las enzimas. Dichas definiciones y explicaciones son aplicables al presente aspecto inventivo.

Así, en una realización particular, la planta pertenece al género Solanum sp., en particular, a la especie Solanum Iycopersicum (tomate).

En otra realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, una identidad de secuencia del 50% con la SEO ID NO: 1.

En otra realización particular, el gen que codifica la proteína IAMT presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, la inhibición, la disminución o el bloqueo de la expresión del gen o de la actividad de la proteína se lleva a cabo mediante la técnica CRISPR o T ILLlNG .

En otra realización particular, se produce un incremento de fertilidad en condiciones de estrés hídrico o estrés térmico.

Todas estas realizaciones particulares han sido descritas en detalle previamente en el presente documento y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Uso del gen que codifica la proteína IAMT1

Tal como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la pérdida de la función de la enzima IAMT1 acelera el crecimiento de los tubos polínicos en comparación con plantas control (ver Ejemplo 1 y Figuras 5 y 6) Y con ello, se incrementa la fertilidad de las plantas, lo que se traduce en un mayor rendimiento de los cultivos al obtener plantas que generan más semillas y con ello, más frutos.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso del gen que codifica la proteína IAMT1 para incrementar de fertilidad de la planta.

En la presente invención, se entiende por "incrementar la fertilidad" a la mayor producción de semillas con respecto a una planta control, tanto en condiciones óptimas como en condiciones de estrés abiótico, tanto por sequía como por altas temperaturas. En una realización particular, dicho incremento de fertilidad se produce por inhibición , bloqueo o disminución de la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 , o por la expresión de dicho gen de una proteína IAMT1 no funcional.

En otra realización particular, la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 50% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

Todas estas realizaciones particulares así como los términos empleados han sido definidos y/o explicados en los aspectos inventivos anteriores.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la

invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Descripción molecular de los alelos mutantes de IAMT1 en Arabidopsis thaliana. (A) Esquema de las inserciones de T-DNA que dan lugar a los alelos iamt1-1 (linea SALK_072125) e iamtl-2 (linea GT_5_41946). (B) Productos de PCR obtenidos por la combinación de oligonucleótidos indicada en cada caso. (C) Nivel de expresión, medido por RT-qPCR, del alelo silvestre del gen fAMT1 en plantas de A. thaliana de 10 días de edad cultivadas en luz continua.

Figura 2. Cuantificación de los niveles de Me-AlA en plántulas silvestres (Col-O) y del mutante iamt1-1 cultivadas durante diez días en luz continúa. La diferencia entre ambos es estadísticamente significativa (p<0,01 ) (t-student).

Figura 3. Aspecto general de las plantas silvestres (Col-O) y del mutante iamt1-1 cultivadas durante 35 días en días largos (16 horas de luz, 8 horas de oscuridad).

Figura 4. Actividad DR5::GUS en ovarios de plantas silvestres (Col-O) y del mutante iamt1-1. Las flechas indican las regiones más activas, que corresponden a las que muestran mayor actividad de auxinas (AlA).

Figura 5. Tubos polínicos en ovarios de plantas silvestres (Col-O) y del mutante iamt11 polinizados manualmente con polen silvestre. Los tubos se visualizan mediante la tinción de la calosa que se acumula a su paso. Las flechas indican hasta donde alcanzan los tubos polínicos en cada ovario, 2 horas después de la polinización.

Figura 6. Producción de silicuas (frutos) en plantas silvestres (Col-O) y del mutante iamt1-1 , cuando éstas son cultivadas constantemente a la temperatura óptima de crecimiento (20°C), a una temperatura alta que provoca estrés (29°C), o cuando se cultivan a 20°C pero se transfieren a 29°C en el momento de la floración. Los resultados son la media de frutos producidos por planta, después de analizar 36 plantas de cada genotipo en cada condición de crecimiento. La diferencia entre ambos genotipos es estadísticamente significativa (p<0,001 ) (t-student).

Figura 7. Producción de semillas en plantas silvestres (Col-O) y del mutante iamt1-1, cuando éstas son cultivadas constantemente a la temperatura óptima de crecimiento (20°C), a una temperatura alta que provoca estrés (29°C), o cuando se cultivan a 20°C pero se transfieren a 29°C en el momento de la floración. Los resultados son la media de frutos producidos por planta, después de analizar 36 plantas de cada genotipo en cada condición de crecimiento. La diferencia entre ambos genotipos es

estadísticamente significativa (p<O,001) (t-student).

Figura 8. Producción de frutos de tomate en plantas sometidas a estrés por sequía y altas temperatura tratadas con auxinas. Las plantas se cultivaron a 25°C en invernadero hasta el momento de comenzar la floración, cuando se transfirieron a una cabina a 37°C y se cesó el riego. La mitad de las plantas fueron rociadas con AlA 100 IJM Y produjeron frutos, mientras que la otra mitad sin AlA no produjeron frutos.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

Ejemplo 1 Con el fin de analizar el efecto de la mutación del gen IAMT1 en Arabidopsis thaliana, se obtuvieron del centro de germoplasma de Nottinghem (NASC) semillas portadoras de inserciones de T-DNA en la región codificante de dicho gen (Fig. 1A). Éstas correspondían a los códigos SALK_072125 (que se renombró iamt1-1) y GT_5_ 41946 (que se renombró iamt1-2). Se seleccionaron plantas homozigotas para cada una de las inserciones (Fig. 1 B) mediante PCR (ver Técnica 1) utilizando como cebadores los oligonucleótidos indicados en la Tabla 1. En las plantas homozigotas se determinó mediante RT-qPCR (ver Técnica 2 y Tabla 1) el nivel de expresión de un ARNm completo correspondiente a IAMT1 en plantas silvestres (accesión Col-O) y del mutante iamt1-1 en el mismo fondo genético (Fig. 1C). Teniendo en cuenta la sensibilidad de la técnica, y que se detectan una expresión más de 1000 veces menor en el mutante iamt1-1, el resultado indica que dicho mutante no puede sintetizar una proteína IAMT1 completa en ningún caso. De hecho la mutación iamt1-1 se predice que provocaría en cualquier caso la aparición de una proteína truncada en la que no estaría presente el posible centro activo de la proteína, al faltar varios aminoácidos clave, como la Gly-226.

La determinación, mediante la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) (ver Técnica 3), del Me-AlA producido en plántulas cultivadas en luz continua durante diez días indicó que el mutante iamt1-1 no ha perdido completamente la actividad carboximetil transferasa a pesar de no expresar el alelo silvestre del gen IAMT1 (Fig . 2). A pesar del defecto en IAMT1 , el aspecto general de las plantas mutantes iamt1-1 era indistinguible del de plantas control (ColO) (Fig. 3). Sin embargo, en ovarios del mutante sí que fue posible encontrar una mayor acumulación de AlA libre asociada a la falta de metilación del AlA, como indica de forma indirecta la tinción de f1-glucuronidasa (GUS) en plantas expresando el gen GUS bajo el control del promotor DR5, que es inducible por auxinas (AlA) (Fig. 4) (ver Técnica 4).

Para estudiar el efecto de la mutación de IAMT1 sobre la capacidad reproductiva de las plantas, se analizó mediante tinción con azul de anilina (Técnica 5) la deposición de calosa en ovarios polinizados manualmente con polen silvestre. Esta tinción permite visualizar los tubos polínicos mientras atraviesan el ovario hasta alcanzar los óvulos. Dos horas después de la polinización, los tubos polínicos apenas habían atravesado el estilo de ovarios de plantas silvestres (Col-O), mientras que en los ovarios del mutante iamt1-110s tubos polínicos habían alcanzado ya la posición de los primeros óvulos (Fig. 5).

El crecimiento más rápido de los tubos polínicos en el mutante iamt1-1 sugería que esta característica podría conferir una ventaja al mutante en condiciones ambientales en las que la viabilidad del polen está comprometida, como en casos de sequía o de elevadas temperaturas. Para comprobar esta hipótesis, se cultivaron plantas del mutante iamt1-1 y de su parental silvestre (Col-O) hasta completar su ciclo vital en varios regímenes de temperatura (conseguidos en fitotrones regulados a 20°C, o a 29°C). Al finalizar la floración se determinó el número de frutos y de semillas totales por planta. El mutante iamt1-1 produjo siempre más frutos (Fig. 6) Y más semillas (Fig. 7) que el control de plantas silvestres en todas las condiciones: (1) cuando las plantas eran cultivadas en días largos a 20°C; (2) cuando las plantas se cultivaron en días largos a 29°C desde la germinación; y (3) cuando las plantas se cultivaron en días largos a 20°C y fueron transferidas, justo en el momento de comenzar la floración, a una cámara con igual luminosidad pero a 29°C. Estos resultados indican que las plantas con una capacidad reducida de metilar el AlA muestran una mayor capacidad

reproductiva que las silvestres incluso en condiciones de estrés térmico, posiblemente por el crecimiento acelerado de los tubos polinicos en sus ovarios.

Ejemplo 2 Para comprobar que el enriquecimiento en AlA observado en los ovarios del mutante iamt1-1 de A. thaliana es responsable de su mayor capacidad reproductiva en condiciones de estrés, y para averiguar si este efecto podría extenderse a otras especies vegetales, se realizó un análisis de fertilidad en plantas de tomate (Solanum Iycopersicum cv Moneymaker) en condiciones de estrés.

Se cultivaron 16 plantas de tomate a 26°C en invernadero, y en el momento de florecer se transfirieron todas a una cabina a 37°C y se cesó el riego, al tiempo que se rociaban 8 de las plantas con una solución de AlA 100 IJM, Y las 8 restantes sólo con agua. El tratamiento se mantuvo durante dos semanas cada 2 días, y al cabo de ese tiempo se comprobó que ninguna de las plantas tratadas con agua habían producido frutos, mientras que todas las plantas tratadas con AlA habían producido frutos de tamaños variables (Fig. 8). Este resultado está de acuerdo con informes públicos previos utilizando plantas de arroz, y también apoya la idea de que el mayor nivel de AlA en ovarios del mutante iamt1 es la causa probable del mantenimiento de la capacidad reproductiva en condiciones de estrés térmico y de sequía.

METODOS

TÉCNICA 1. Genotipado por PCR de las inserciones de T-DNA. Se extrajo el ADN de las plantas empleando el método descrito en Edwards K, Johnstone C, Thompson C (1991), Nucleic Acids Res 19: 1349, usando los cebadores indicados en la Tabla 1 en las combinaciones indicadas en la figura 1, se realizó la reacción estándar de PCR empleando la enzima ExTaq (Takara) y un programa de 30 ciclos (30 segundos a 95°C, 1 minuto a 56°C, 1 minuto a 68°C)

Tabla 1. Oligonucleótidos usados como cebadores en reacciones de PCR

Nombre: ecuencia SEQIO NO: Aplicación

F1: TGCCGGAGAGAAGACAACAAC 16 Genotipado alelos iarnt1

R1: TTAAAGAGAGGTGGGGCCATG 17 Genotipado alelos iarnt1

F2: CGCCAACGGCTCATTTG 18 Genotipado alelos iarnt1

R2: CATCAGAAGTTGGTCGTGCCT 19 Genotipado alelos iarnt1

F3: TGTTCTCACGAGTTGAAAGCCGAGC 20 Genotipado alelos iarnt1

R3: AAACTAAAATAGATAAAGTCTTTGTACC 21 Genotipado alelos iamt1

LP: ATTTTGCCGATTTCGGAAC 22 Genotipado alelos iarnt1

SP: TACGAATAAGAGCGTCCATTTTAGAGT 23 Genotipado alelos iamt1

qRT1: TTAAAGAGAGAAGGAGAGATCCATAGAGA 24 Análisis expresión IAMT1

qRT2: GCCACCTTTCATGCTGAGAAG 25 Análisis expresión IAMT1

EF-F: ATTGGAAACGGATATGCTCCA 26 Expresión del gen control

EF1a

EF-R: CCTTACCTGAACGCCTGTCA 27 Expresión del gen control

EF1a

TÉCNICA 2. RT -qPCR de IAMT1 en el mutante iam t1-1_ Se extrajo el ARN de las plantas empleando el Mini kit RNAeasy (QIAgen) siguiendo

5 el protocolo indicado por la casa comercial. La síntesis del cDNA se realizó a partir de 1 1-19 de ARN mediante el kit Superscript 111 (LifeTechnologies), siguiendo las instrucciones de la casa comercial, y la qPCR de IAMT1 y del gen control EF1 a se efectuó con los cebadores indicados en la Tabla 1 y el kit SY8R Green Quantitative (Sigma).

10 TÉCNICA 3. Cuantificación del Me-AlA. Se recogieron plántulas de Arabidopsis thaliana de diez días cultivadas en luz continua y se congelaron en nitrógeno líquido. La extracción se realizó a partir de 100 mg de tejido, con tres réplicas biológicas en paralelo para cada genotipo. Se 15 añadieron 1 mL de metanol y 50 pmol de 2H-Me-AIA, se calentó la mezcla durante 2 minutos a 60°C y después se mantuvo durante al menos 1 hora a temperatura ambiente hasta que todo el metanol se evaporó. El sedimento se disolvió en 2 mL de tampón fosfato sódico (50 mM, pH 7.0) conteniendo 5% de metanol, y se sometió a 10 minutos de tratamiento de ultrasonidos (Branson B55100TH, Branson Ultrasonics,

20 Ounbury, EEUU). A continuación se ajustó el pH a 2,5 con ácido clorhídrico 1M, y se purificó la muestra mediante extracción en fase sólida usando columnas Oasis HLB 1 mL / 30 mg (Waters Corporation, Milford, EEUU) acondicionadas con 1 mL de metanol y 1 mL de agua, y equilibradas con 0,5 mL de tampón fosfato sódico (50 mM, pH 2,5). Tras la aplicación de la muestra, la columna se lavó dos veces con 1 mL de metanol

25 5%, Y se eluyó con 2 mL de metanol 80%. El eluído se secó completamente usando un concentrador a vacío (Vacufuge plus, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). A cada extracto se le añadió entonces 20 !JI de N,O-bis (trimetilsilil trifluoroacetamida con 1% de trimetilclorosilano (BSTFA+ TMCS, 99:1 (v/v), Supelco, Belletonte, EEUU). Se transfirieron los extractos a viales de 400 !JI de GC-MS, y se incubaron durante 70 minutos a 60°C.

Para analizar el Me-AlA, se inyectó 1 1-11 de cada muestra mediante un autoinyector CombiPAL (eTC Analytics, Zwingen, Suiza) a un cromatógrafo de gases Bruker Scion-455 (BRUKER Daltonics, Bremen, Alemania) equipado con una columba de 30 m x 0,25 mm con una fase estacionaria de 0,25 mm Z835 (Phenomenex, Torrance, EEUU). Como fase móvil se usó helio a un flujo de 1 mUminuto. La temperatura del inyector era de 250°C, y la temperatura de la columna se mantuvo a 50°C durante 1,20 minutos. A partir de ahí, la temperatura de la columna fue aumentando a 30°C/minuto hasta alcanzar 120°C, y después a 10°C/minuto hasta los 325°C, manteniéndola a esa temperatura durante 5 minutos más. El efluente de la columna se introdujo en la fuente iónica de un espectrómetro de masas triple cuadrupolo Bruker Scion-TQ, usándolo en modo EI-MRM. La temperatura de transferencia se fijó a 250°C, y la temperatura de la fuente iónica a 200°C. Los iones se generaron con -70 eV en una corriente de emisión de 80 ~A. El tiempo de permanencia fue de 100 ms, y se registraron las reacciones mIz 261 a 202 (Me-AlA endógeno) y mIz 266 a 207 (2HMe-AlA estándar). Como gas de colisión se usó argón a 1,5 mTorr. La cantidad del compuesto endógeno se calculó a partir del cociente entre la señal del compuesto no marcado y el fragmento conteniendo el isótopo estable.

TÉCNICA 4. Evaluación de la señalización de auxinas mediante DR5::GUS Se introdujo mediante cruces genéticos el marcador DR5::GUS en el fondo iamt1-1 y en las flores de plantas adultas de este mutante y de su parental en Col-O se examinó la expresión de este marcador mediante el protocolo estándar de tinción de GUS descrito en Blázquez MA, Soowal L, Lee 1, Weigel D (1997), Development 124: 3835

3844.

TÉCNICA 5. Visualización de los tubos polinicos Se siguió al pie de la letra lo especificado en la publicación Mari T, Kuroiwa H, Higashiyama T, Kuroiwa T (2006), Nat. Cell Biol. 8: 64-71 .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una planta que comprende el gen que codifica la proteína IAMT1 , caracterizada porque dicha proteína IAMT1:

(i)

está ausente o en unos niveles no detectables por tecnicas conocidas, o

(ii)

no es funcional o

(iii) se presenta en la planta en unos niveles inferiores con respecto a la planta control, siendo dicha diferencia estadísticamente significativa, de forma que se obselVa el fenotipo descrito en la planta de la presente invención, y

(iv) dicha la planta no pertenece a la especie Arabidopsis thaliana.
2. Planta según la reivindicación 1, en la que

(i) la expresión de dicho gen está disminuida, bloqueada o inhibida con respecto a un controlo da lugar a una proteína no funcional.
3.

Planta según la reivindicación 1 ó 2, en la que la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos con , al menos, un 50% de identidad con la SEO ID NO: 1.
4.

Planta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEO ID NO: 1.
5.

Planta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la planta pertenece al género SoJanum sp., en particular, a la especie SoJanum Jycopersicum.
6.

Un germoplasma procedente de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho germoplasma:

(i)

se selecciona del grupo que consiste en una célula, una célula germinal y una semilla procedente de dicha planta, y

(ii)

comprende una modificación genética en el gen que codifica la proteína IAMT1 que origina que su expresión esté disminuida, bloqueada o inhibida o de lugar a una proteína no funcional.
7.

Método para incrementar la fertilidad de una planta que comprende inhibir, disminuir

o bloquear

(i)

la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1 con respecto a un control o

(ii)

la actividad de la proteína IAMT1 .
8.

Método según la reivindicación 7, en el que la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 50% de identidad con la SEO ID NO: 1.
9.

Método según la reivindicación 7 u 8, en la que el gen que codifica la proteína IAMT1 presenta una deleción que origina la pérdida en la proteína del aminoácido Gly en la posición correspondiente al aminoácido 226 con respecto a la secuencia SEO ID NO: 1.
10.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la planta pertenece al género SoJanum sp. , en particular, a la especie SoJanum Jycopersicum.
11.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que se produce un incremento de fertilidad en condiciones de estrés hídrico o estrés térmico.
12.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que la inhibición, la disminución o el bloqueo de la expresión del gen o de la actividad de la proteína se lleva a cabo mediante la técnica CRISPR o TILLlNG.
13.

Uso del gen que codifica la proteína IAMT1 para incrementar de fertilidad de la planta.
14.

Uso según la reivindicación 13, en la que dicho incremento de fertilidad se produce por inhibición, bloqueo o disminución de la expresión del gen que codifica la proteína IAMT1, o por la expresión de dicho gen de una proteína IAMT1 no funcional.
15.

Uso según la reivindicación 13 o 14, en la que la proteína IAMT1 comprende una secuencia de aminoácidos con, al menos, un 50% de identidad con la SEO ID NO: 1.