KR102403071B1 - 호르데인 수준이 매우 낮은 보리 - Google Patents

호르데인 수준이 매우 낮은 보리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복강 질환을 앓는 대상체가 섭취하는 데 적합한 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 호르데인 수준이 매우 낮은 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 곡물을 생산하는 보리 식물을 제공한다.

Description

호르데인 수준이 매우 낮은 보리 {BARLEY WITH VERY LOW LEVELS OF HORDEINS}
본 발명의 기술분야
본 발명은 복강(coeliac) 질환을 앓는 대상체가 섭취하는 데 적합한 식품 또는 맥아 베이스(malt-based) 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 호르데인(hordein) 수준이 매우 낮은 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 곡물을 생산하는 보리 식물을 제공한다.
본 발명의 배경기술
복강 질환 (CD)은 곡물, 예컨대, 밀, 보리 및 호밀로부터의 프롤라민 섭취에 의해 유발되는 T 세포 매개 장질환이다. CD의 임상 증상으로는 피로감, 설사, 복부 팽만, 체중 감소, 빈혈증 및 신경 장애를 포함한다 (문헌 [Green et al., 2006]). CD는 예컨대, 장암 위험의 10배 증가, 비호지킨 림프종 위험의 3 내지 6배 증가, 및 T 세포 림프종 위험의 28배 증가와 같은, 장 악성 종양 비율 증가 (문헌 [Green et al., 2009) 뿐만 아니라, 빈혈증, 골다공증, 신경 결핍 및 추가의 자가면역 장애, 예컨대, 당뇨병 비율 증가 (문헌 [Skovbjerg et al., 2005])와 관련되어 왔다. 가장 많이 연구된 프롤라민인 α-글리아딘의 경우, 독성은 대개 영양소 흡수를 감소시키고, 건강에 영향을 주면서, 결국에는 소장 융모를 손상시키는 반응의 파괴적 캐스케이드를 일으키는 단일 펩티드 중의 단일 글루타민에 의해 매개된다 (문헌 [Anderson et al., 2000]; [Shan et al., 2002]). 현재 밀, 보리 및 호밀로부터의 공지된 모든 프롤라민 단백질에 대한 복강 독성 에피토프는 밀, 보리 및 호밀을 이용한 단기간의 식이 요법 도전 이후 HLA-DQ2+　복강의 말초 혈액으로부터 단리된 비편향된 T 세포 집단을 사용하여 광범위하게 지도화되어 왔다 (문헌 [Tye-Din et al., 2010]).　 놀랍게도, α-글리아딘 (ELQPFPQPELPYPQPQ, 서열번호: 1), ω-글리아딘/C-호르데인 (EQPFPQPEQPFPWQP, 서열번호: 2), 및 B-호르데인 (EPEQPIPEQPQPYPQQ, 서열번호: 3)으로부터 유래된 고도로 면역원성인 단 3개의 펩티드만이 밀, 보리 및 호밀 단백질의 완전한 상보체에 의해 유도되는 복강 특이 반응의 90%의 이유가 될 수 있다.
CD에 대한 유일의 현 치료법은 밀 (글리아딘, 글루테닌), 호밀 (세칼린), 보리 (호르데인), 및 귀리 (아베닌)에서 발견되는 유사 단백질 패밀리로 구성된 식이 글루텐을 일생 동안 피하는 것이다. 그러나, 그러한 섭식은 비용이 많이 들고 (문헌 [Lee et al., 2007), 소량의 섬유 및 높은 당 섭취와 관련이 있으며 (문헌 [Kupper et al., 2005]; [Wild et al., 2010]; [Ohlund et al., 2010]), 그 자체가 건강상 위험 요인이다. 식이 글루텐을 피하는 것이 모두는 아니지만, 대부분의 복강에서의 보건 통계의 정규화를 이끈다 (문헌 [Lanzini et al., 2009]; [Rubio-Tapia et al., 2010). 전세계 대부분의 집단 중 대략 1%가 복강 질환을 앓고 있지만, 성인 중 최대 50%가 여전히 미확진 상태이거나, 또는 현성 증상을 보이지 않고 있다 (문헌 [Catassi et al., 1994]; [Fowell et al., 2006]).
트리티세아에(Triticeae)의 시리얼 중의 종자 단백질의 주요 패밀리는 알부민, 글로불린 및 글루텐 유사 단백질이며, 이는 총칭하여 프롤라민으로 불린다 (문헌 [Shewry and Tatham, 1990]). 알부민 및 글로불린은 꽃 식물 사이에 널리 분포되어 있지만, 프롤라민은 목초, 특히 푸이데아에(Pooideae) 아과로 한정된다 (문헌 [Hausch et al., 2002]). 아미노산 프롤린 및 글루타민을 고비율로 함유하기 때문에 이와 같이 명명되는 프롤라민은 소화 동안 단백질 분해에 대하여 저항성을 띤다 (문헌 [Hausch et al., 2002]). α-글리아딘 유전자는 클로닝된 첫번째 프롤라민 유전자이며, 현재는 복강 질환에서의 상기 단백질의 역할에 대해 많이 알려져 있다 (문헌 [Kasarda et al., 1984]). 상기 프롤라민의 독성은 단일 펩티드 57-QLQPFPQPQLPYPQPQS-73 (서열번호: 4)에 집중되어 있으며, 글루타민 잔기 Q65가 중요한 아미노산이다. 예를 들어, 상기의 단일 글루타민을 리신으로 돌연변이화시키면 상기 프롤라민의 복강 독성은 제거된다 (문헌 [Anderson et al., 2000]). 부분적으로 가수분해된 펩티드는 비공지된 기전에 의해 상피를 통과하여 고유판에 접근하고; 여기서, Q65는 조직 트랜스글루타미나제 (tTG)에 의해 E65 (글루타메이트)로 탈아미드화되어 펩티드의 면역자극성 잠재능을 증가시킨다 (문헌 [Skovbjerg et al., 2004]). 음전하는 항원 제시 세포 표면 상의 DQ2 (또는 덜 공통적으로는 DQ8) 수용체에의 펩티드의 결합을 촉진시킴으로써 장으로 표적화되는 펩티드가 특정 글루텐 특이, DQ2 제한 CD4+ T 세포에 제시될 수 있도록 한다. 따라서, 활성화된 CD4-T 세포가 클론 확장되어, 결국에는 글루텐-특이- 및 TG2-특이-B 세포의 확장을 지원하며, 결과적으로 복강 질환의 특징이 되는 항-TG2 및 항-글루텐 항체가 제조된다. 또한 염증성 사이토카인의 분비를 통해 세포 매개 Th1 반응도 발생하게 된다 (문헌 [Tjon et al., 2010]). 따라서, 단일의 음으로 하전된 잔기의 도입에 의해 촉진되는 단순 단백질 상호작용이 일련의 특이적이고, 표적화된 캐스케이드를 개시하여, 궁극적으로 장 융모를 파괴시키게 된다.
보리 (호르데움 불가레 L.(Hordeum vulgare L.))는 양조업용 및 식품업용 맥아를 생산하는 데 사용되는 널리 재배되는 시리얼이다. 맥아 보리는 발효의 탄수화물 공급원을 공급하는, 맥주의 주요 성분이다. 불행하게도, 복강의 경우, 보리 맥주는 또한 낮지만 복강 독성을 띠는 수준으로 호르데인 (글루텐)을 함유한다 (문헌 [Dostalek et al., 2006]). 호르데인은 보리 곡물 단백질의 절반을 차지하며 (문헌 [Moravcova et al., 2009]), 4개의 다중 유전자 패밀리로 이루어져 있으며: B-호르데인 (30-45 kDa; 호르데인 함량의 70%) 및 C-호르데인 (45-75 kDa; 호르데인 함량의 20%)이 곡물 호르데인에서 지배적인 반면, D-호르데인 (105 kDa) 및 γ-호르데인 (35-40 kDa)은 소수 성분이다 (문헌 [Shewry et al., 1999]). 맥아 수수, 기장, 및 메밀은 맥주 제조용의 글루텐을 함유하지 않는 대체 물질로서 사용되지만 (문헌 [Wijngaard et al., 2007]), 상기 곡물을 사용하여 보리 맥주를 고품질로 및 저비용으로 제조하는 것을 재현하기는 어렵다.
2008년 국제 식품 규격 위원회(Codex Alimentarius)에 의해 채택된 글루텐을 함유하지 않는 식품에 대한 WHO 표준 정의는 시리얼, 예컨대, 밀 및 보리로부터 제조되는 식품은 "글루텐을 함유하지 않는" 것으로 라벨을 가지도록 글루텐을 20 mg/kg (20 ppm) 미만으로 함유할 것으로 요구한다. 질량 분석법을 이용하여 식품 및 음료의 글루텐 함량을 평가하는 정확한 정량 방법은 문헌 [Colgrave et al. (2012)]에 의해 보고되었다.
WO2009/021285에서는 호르데인 함량이, 특히, 호르데인 B 및 C 함량이 야생형 수준의 10% 미만으로 감소된 보리 곡물 생산이 기술되었다. 그러나, CD를 앓는 인간이 섭취할 수 있는 식품 및 음료 제조를 위한, 호르데인 수준이 훨씬 더 낮은 곡물이 여전히 요구되고 있다.
그러므로, CD에 걸리기 쉬운 대상체용 식품 및 음료 제품에서 사용될 수 있는, CD 유도성 호르데인의 수준이 실질적으로 더 낮은 보리가 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 발명자들은 호르데인 수준이 매우 낮은 보리 곡물을 생산하게 되었다. 상기 곡물은 복강 질환을 앓는 대상체가 섭취할 수 있는 매우 다양한 식물 및 맥아 베이스 음료를 제조하는 데 사용될 수 있다.
제1 측면에서, 본 발명은 (i) 보리 곡물을 가공 처리하여 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계, 및/또는 (ii) 보리 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 적어도 1종의 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하여 식품 또는 맥아 베이스 음료 성분, 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 보리 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 것인, 식품 또는 맥아 베이스 음료 성분, 또는 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물을 가공 처리하여 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계, 및/또는 (ii) 보리 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 적어도 1종의 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하여 식품 또는 맥아 베이스 음료 성분, 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 보리 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 것인, 식품 또는 맥아 베이스 음료 성분, 또는 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 약 20 ppm 이하, 약 10 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 0.05 ppm 내지 약 50 ppm, 또는 약 0.05 ppm 내지 약 20 ppm, 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 약 0.05 ppm 내지 약 5 ppm, 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm, 약 3.9 ppm, 또는 약 1.5 ppm 호르데인을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 곡물의 평균 중량은 적어도 약 35 mg, 적어도 약 39 mg, 적어도 약 41 mg, 적어도 약 47 mg, 약 35 mg 내지 약 60 mg, 약 40 mg 내지 약 60 mg, 약 45 mg 내지 약 60 mg, 약 39.1 mg, 약 41.8 mg 또는 약 47.2 mg이다.
추가의 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 20 ppm 이하의 호르데인을 포함하고, 곡물의 평균 중량은 약 40 mg 내지 약 60 mg이다. 또 다른 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 20 ppm 이하의 호르데인을 포함하고, 곡물의 평균 중량은 약 45 mg 내지 약 60 mg이다. 상기 조합물에 대한 구체적인 언급이 상기 특징의 다른 조합을 배제시키는 것은 아니다.
추가의 실시양태에서, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 약 80% 내지 적어도 약 98%, 또는 약 80% 내지 약 93%의 곡물은 2.8 mm 시브(sieve)를 통과하지 못한다.
추가의 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 20 ppm 이하의 호르데인을 포함하고, 곡물의 평균 중량은 약 40 mg 내지 약 60 mg이고, 적어도 약 80%의 곡물이 2.8 mm 시브를 통과하지 못한다. 또 다른 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 20 ppm 이하의 호르데인을 포함하고, 곡물의 평균 중량은 약 45 mg 내지 약 60 mg이고, 적어도 약 80%의 곡물이 2.8 mm 시브를 통과하지 못한다. 상기 조합물에 대한 구체적인 언급이 상기 특징의 다른 조합을 배제시키는 것은 아니다.
다른 추가의 실시양태에서, 곡물은 수확 지수(harvest index)가 적어도 40%, 약 40% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 55%, 또는 약 40% 내지 약 50%인 식물로부터의 것이다. 바람직한 실시양태에서, 곡물은 수확 지수가 약 40% 내지 약 50%인 식물로부터의 것이다.
또 다른 실시양태에서, 곡물의 두께에 대한 길이의 비는 약 5 미만, 약 4 미만, 약 3.8 미만, 약 2 내지 약 5, 또는 약 2.5 내지 약 3.8이다.
추가의 실시양태에서, 곡물로부터 제조된 곡분 또는 전립분은 약 10 ppm 이하, 약 5 ppm 이하, 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 또는 약 0.05 ppm 내지 약 5 ppm, 약 3.9 ppm, 또는 약 1.5 ppm의 호르데인을 포함한다.
한 실시양태에서, 맥아 또는 곡물로부터 제조된 맥아즙은 약 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만의 호르데인을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은
i) 서열번호: 53으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
ii) 서열번호: 54로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
iii) 서열번호: 55로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 C-호르데인, 및
iv) 서열번호: 56으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 D-호르데인 중 하나, 또는 1 초과, 또는 그들 모두를 야생형 수준의 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준으로 포함하거나, 또는 그를 포함하지 않으며,
여기서, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준은 각각 보리 품종 보미(Bomi), 슬루프(Sloop), 보딘(Baudin), 예간(Yagan), 하인드마시(Hindmarsh), 또는 코맨더(Commander)의 야생형 보리 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분에 대해 상대적인 것이다.
한 실시양태에서, B-호르데인은 적어도 B1 호르데인 (예를 들어, 서열번호: 78로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 것) 및 B3 호르데인 (예를 들어, 서열번호: 79로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 것)이다. 추가의 일례에서, C-호르데인은 서열번호: 80으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 또 다른 일례에서, D-호르데인은 서열번호: 76으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은
i) 서열번호: 57로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 γ-호르데인, 및/또는
ii) 서열번호: 52로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 아베닌 유사(avenin-like) A 단백질을 야생형 수준의 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준으로 추가로 포함하거나, 또는 추가로 그를 포함하지 않으며,
여기서, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준은 각각 보리 품종 보미, 슬루프, 보딘, 예간, 하인드마시, 또는 코맨더의 야생형 보리 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분에 대해 상대적인 것이다. 일례에서, γ-호르데인은 서열번호: 81로서 제공되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 또 다른 일례에서, 아베닌 유사 A 단백질은 서열번호: 84로서 제공되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게, 상기 실시양태에서, γ-호르데인은 γ1-호르데인 및 γ2-호르데인이다.
한 실시양태에서, 곡물은 B-호르데인 코딩 유전자 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성이거나, 또는 여기서, 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 B-호르데인 코딩 유전자 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자를 포함하는 DNA를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 곡물은 Hor3 유전자좌에서 D-호르데인을 코딩하는 유전자의 널(null) 대립유전자에 대하여 동형접합성이거나, 또는 여기서, 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 D-호르데인을 코딩하는 유전자의 널 대립유전자를 포함하는 DNA를 포함하며, 널 대립유전자는 바람직하게 종결 코돈, 스플라이스 부위 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 삽입, 결실 또는 절두된 D-호르데인 코딩을 포함하거나, 여기서, D-호르데인 코딩 유전자 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있다.
추가의 실시양태에서, 절두된 D-호르데인은 아미노산 번호 150을 코딩하는 트리플렛(triplet)에 종결 코돈을 가진다.
또 다른 실시양태에서, 곡물은 C-호르데인을 포함하지 않는 곡물을 생성하는 보리의 Lys3 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성이거나, 또는 여기서, 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 Lys3 유전자좌의 대립유전자를 포함하는 DNA를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 상응하는 야생형 보리 식물로부터의 곡물, 또는 상응하는 야생형 보리 식물로부터의 곡물로부터 같은 방식으로 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분과 비교하였을 때, 약 1% 이하, 약 0.01% 이하, 약 0.007% 이하, 약 0.0027% 이하, 약 0.001% 내지 약 1%, 약 0.001% 내지 약 0.01%, 약 0.007%, 또는 약 0.0027%인 수준으로 호르데인을 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 곡물은 야생형 보리 식물의 곡물 수율의 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 약 60% 내지 100%, 약 70% 내지 100%, 약 80% 내지 100%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%를 가지는 식물로부터의 것이다.
또 다른 실시양태에서, 곡물의 평균 중량은 야생형 보리 식물의 곡물의 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100%이다.
다른 추가의 실시양태에서, 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 하기
i) 서열번호: 53으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
ii) 서열번호: 54로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
iii) 서열번호: 55로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 C-호르데인, 및
iv) 서열번호: 56으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 D-호르데인 중 하나, 또는 1 초과, 또는 그들 모두를 상응하는 야생형 보리 식물과 비교하였을 때 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 2% 이하, 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 하기
i) 서열번호: 57로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 γ-호르데인, 및/또는
ii) 서열번호: 52로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 아베닌 유사 A 단백질을 상응하는 야생형 보리 식물과 비교하였을 때 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 1% 이하, 약 0.1% 내지 약 10%, 또는 약 0.1% 내지 약 10%로 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 곡물, 또는 상기 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 γ3-호르데인을 상응하는 야생형 보리 식물 중의 양과 비교하였을 때 약 60% 이하인 양으로 추가로 포함하며, γ3-호르데인은 서열번호: 58로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하고, 예컨대, γ3-호르데인은 서열번호: 83으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함한다.
야생형 보리 식물의 예로는 보미, 슬루프, 보딘, 예간, 하인드마시, 또는 코맨더를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 곡물의 전분 함량은 적어도 약 50%(w/w)이다. 더욱 바람직하게, 곡물의 전분 함량은 약 50% 내지 약 70%(w/w)이다.
추가의 실시양태에서, 곡물로부터 제조된 곡분의 복강 독성은 상응하는 야생형 보리 식물의 곡물로부터 제조된 곡분의 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만이다.
추가의 실시양태에서, 평균 곡물 중량은
i) B-호르데인 코딩 유전자 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성,
ii) C-호르데인을 포함하지 않는 곡물을 생성하는 보리의 Lys3 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성, 및
iii) 전장의 단백질을 코딩하는 D-호르데인의 야생형 대립유전자에 대하여 동형접합성인 곡물보다 적어도 1.05배, 적어도 1.1배, 또는 1.05 내지 1.3배 더 높다.
다른 추가의 실시양태에서, 곡물은
i) B-호르데인 코딩 유전자 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성,
ii) C-호르데인을 포함하지 않는 곡물을 생성하는 보리의 Lys3 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성, 및
iii) 전장의 단백질을 코딩하는 D-호르데인의 야생형 대립유전자에 대하여 동형접합성인 식물로부터의 곡물 수율보다 적어도 1.20배, 또는 적어도 1.35배, 또는 1.2 내지 1.5배, 또는 1.2 또는 2.0배 더 높은 곡물 수율을 가지는 식물로부터의 것이다.
예를 들어, 상기 두 실시양태와 관련하여, i) 내지 iii)에서 정의된 특징을 가지는 곡물은 WO 2009/021285에 기술된 G1* 곡물일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 보리 곡물의 게놈 중 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%이 보리 야생형 재배종, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 슬루프, 하인드마시, 옥스포드(Oxford) 또는 마라타임(Maratime)의 게놈과 동일하다.
한 실시양태에서, 곡물은 비트랜스제닉(non-transgenic) 식물로부터의 것이다.
대체 실시양태에서, 곡물은 트랜스제닉 식물로부터의 것이다.
추가의 실시양태에서, 식물은 곡물 중 적어도 하나의 호르데인의 생산을 하향 조절하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함한다. 바람직하게, 본 실시양태의 폴리뉴클레오티드는 호르데인을 코딩하는 한 유전자 또는 바람직하게 그 초과의 유전자의 발현을 하향 조절하는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 촉매성 폴리뉴클레오티드, 인공 마이크로RNA 또는 이중체 RNA 분자이다.
또 다른 실시양태에서, 본 방법은 곡물로부터 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 방법은 곡물로부터 맥아를 제조하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 맥아 베이스 음료는 맥주이고, 본 방법은 곡물, 또는 그로부터 유래된 분쇄 곡물을 발아시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 건조된 발아된 곡물을 배유 분획물, 내피층 분획물, 겉껍질 분획물, 유아초 분획물, 및 맥아 잔뿌리 분획물 중 둘 이상의 것으로 분획화하는 단계; 및 분획물 중 둘 이상의 것을 기결정된 양으로 조합하고 블렌딩시키는 단계를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 곡물 중 적어도 약 50%이 침지 후 3일 이내에 발아된다.
추가의 실시양태에서, 식품 성분 또는 맥아 베이스 음료 성분은 곡분, 전분, 맥아, 또는 맥아즙이거나, 또는 여기서, 식품은 발효 또는 무발효 빵, 파스타, 국수, 아침 식사용 시리얼, 스낵 식품, 케이크, 패스트리 또는 곡분 베이스 소스를 함유하는 식품이다.
한 실시양태에서, 맥아 베이스 음료는 맥주 또는 위스키이다.
한 실시양태에서, 식품 또는 맥아 베이스 음료는 인간 섭취용인 것이다.
추가의 실시양태에서, 식품 또는 음료 섭취 후 복강 질환의 하나 이상의 증상이 상기 질환을 앓는 대상체에 의해 발생되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 곡물을 생산하는 보리 식물을 제공한다.
본 발명의 보리 식물의 곡물 또한 제공한다.
본 발명의 곡물, 및/또는 본 발명의 보리 식물의 곡물은 상기 정의된 특징 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 보리 곡물은 본 발명의 보리 식물을 생산할 수 있다.
한 실시양태에서, 곡물은 발아되지 못하도록 공정된 것이다.
한 실시양태에서, 곡물은 외피가 없는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 본 발명의 보리 식물을 재배하는 단계,
b) 곡물을 수확하는 단계, 및
c) 임의적으로 곡물을 가공 처리하는 단계를 포함하는, 보리 곡물을 생산하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 면적이 적어도 1 헥타르인 밭에서 적어도 10,000개의 식물을 재배하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 본 발명의 곡물을 수득하는 단계, 및
b) 곡물을 가공 처리하여 곡분, 전립분, 전분, 맥아, 맥아즙 또는 다른 생성물을 제조하는 단계를 포함하는, 곡분, 전립분, 전분, 맥아, 맥아즙 또는 곡물로부터 수득되는 다른 생성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 보리 식물 또는 본 발명의 곡물로부터 제조되는 생성물 또한 제공한다.
한 실시양태에서, 생성물은 식품 성분, 맥아 베이스 음료 성분, 식품 제품 또는 맥아 베이스 음료 제품이다.
한 실시양태에서, 맥아 베이스 음료 제품은 맥주 또는 위스키이다.
추가의 실시양태에서, 생성물은 비-식품 제품이다. 그 예로는 필름, 피복제, 접착제, 건축 자재 및 포장재를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법을 사용하여 제조된 식품 또는 맥아 베이스 음료 또한 제공한다.
또 다른 측면에서, 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 0.9 ppm 미만의 호르데인을 포함하는 맥주를 제공한다.
한 실시양태에서, 맥주는 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 또는 적어도 약 5%의 에탄올을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 약 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만의 호르데인을 포함하는 곡분 또는 전립분을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 약 50 ppm 미만, 또는 약 20 ppm 미만의 호르데인을 포함하는 맥아 또는 맥아즙을 제공한다.
추가의 측면에서,
i) 보리 식물로부터 핵산을 포함하는 샘플을 수득하는 단계, 및
ii) D-호르데인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 450번 위치의 구아닌 잔기의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 분석하는 단계를 포함하고,
여기서, 구아닌이 존재한다면, 이는 D-호르데인 유전자가 절두된 D-호르데인을 코딩한다는 것을 시사하는 것인, 절두된 D-호르데인을 코딩하는 보리 D-호르데인 유전자의 대립유전자를 확인하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 단계 b)는 프라이머 GGCAATACGAGCAGCAAAC (서열번호: 66) 및 CCTCTGTCCTGGTTGTTGTC (서열번호: 67), 또는 그 중 하나 또는 그 둘 모두의 변이체를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시키는 단계, 및 증폭 생성물을 제한 효소 KpnI와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서, 절단 부재는 D-호르데인 유전자가 절두된 D-호르데인을 코딩한다는 것을 시사하는 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 식품 또는 맥아 베이스 음료, 또는 본 발명의 곡물을 경구적으로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 복강 질환의 발병 또는 중증도 감소는 대상체에게 야생형 보리 곡물로부터 제조된 상응하는 식품 또는 맥아 베이스 음료를 동일한 양으로 경구적으로 투여하였을 때에 대해 상대적인 것인, 대상체에서 복강 질환의 발병 또는 중증도를 막거나 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
복강 질환의 발병 또는 중증도를 막거나 또는 감소시키기 위해 대상체에게 경구적으로 투여하기 위한 식품 또는 음료 제조를 위한 본 발명의 식품 또는 맥아 베이스 음료, 또는 본 발명의 곡물의 용도 또한 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은
a) 하기 물질:
i) 곡물을 생산할 수 있는 식물로부터의 샘플,
ii) 곡물,
iii) 곡물로부터 제조된 맥아, 및/또는
iv) 상기 곡물의 추출물 중 하나 이상의 것을 수득하는 단계,
b) 단계 a)로부터의 물질을 B, C 및 D-호르데인, B, C 및 D-호르데인으로부터의 펩티드의 수준에 대해, 및/또는 B, C 및 D-호르데인 유전자의 대립유전자에 대해 분석하는 단계,
c) 복강 질환을 앓는 대상체가 섭취하기 위한 식품 및/또는 맥아 베이스 음료를 제조하기 위한 것으로 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 곡물을 선별하는 단계를 포함하는, 복강 질환을 앓는 대상체가 섭취하기 위한 식품 및/또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 데 사용될 수 있는 보리 곡물을 확인하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 단계 a)로부터의 물질은 게놈 DNA를 포함하고, 단계 b)는
i) 서열번호: 53으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
ii) 서열번호: 54로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
iii) 서열번호: 55로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 C-호르데인, 및
iv) 서열번호: 56으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 D-호르데인 중 하나 이상, 또는 그들 모두를 코딩하는 유전자의 대립유전자의 존재 또는 부재를 확인하는 단계를 포함하고,
여기서, 대립유전자의 부재를 통해 약 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 곡물을 확인한다.
본원의 임의의 실시양태는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 임의의 다른 실시양태에 준용되어야 한다.
본 발명은 단지 예시 목적의 것인 본원에 기술된 구체적인 실시양태에 의해 그 범주가 제한되지 않는다. 기능상 등가인 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 범주 내에 명백하게 포함된다.
본 명세서 전역에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 또는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계들로 이루어진 군 또는 물질의 조성물들로 이루어진 군에 대한 언급은 하나 및 복수 개의(즉, 하나 이상의) 상기 단계, 물질의 조성물, 단계들로 이루어진 군 또는 물질의 조성물들로 이루어진 군을 포함하는 것으로 한다.
이하, 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해, 및 첨부된 도면을 참조로 하여 기술된다.
첨부된 도면에 대한 간단한 설명
도 1. 보리 염색체 1을 나타낸 개략도이다.
도 2. 맥주 중의 상대적인 호르데인 정량화이다. 가장 풍부한 호르데인을 나타내는 선별된 펩티드 또는 맥주에서 검출된 관련된 폴리펩티드 (A) 아베닌 유사 A 단백질을 나타내는 QQCCQPLAQISEQAR (서열번호: 5); (B) B1 호르데인을 나타내는 VFLQQQCSPVR (서열번호: 53); (C) B3 호르데인을 나타내는 VFLQQQCSPVPMPQR (서열번호: 54); (D) D-호르데인을 나타내는 ELQESSLEACR (서열번호: 56); 및 (E) γ-호르데인-3을 나타내는 QQCCQQLANINEQSR (서열번호: 58)의 피크 면적. 이들 대표 펩티드를 사용하여 야생형 (슬루프) 및 각각 Risø 56 및 Risø 1508로부터 제조된 2개의 호르데인 결실 맥주 중, 및 60종의 상업용 맥주 중의 주요 호르데인 단백질의 상대적인 양을 예시하였다. 글루텐을 함유하지 않는 17, 47, 49-52, 54번 맥주에 대해 관찰된 작은 피크 면적은 호르데인 검출에 기인하는 것이 아니라, 신호에 있어 낮은 수준의 잡음에 기인하는 것이었다.
도 3. 슬루프 (야생형) 및 에티오피아(Ethiopia) R118 (널)로부터의 D-호르데인 아미노산 서열 비교.
도 4. 슬루프 (야생형) 및 에티오피아 R118 (널)로부터의 D-호르데인 아미노산 및 코딩 뉴클레오티드 서열 비교. 오직 야생형 서열에만 존재하는 Kpn1 절단 부위와 함께 각 대립유전자 검출을 위한 프라이머 위치가 제시되어 있다.
도 5. 피크 면적에 의한, MRM MS에 의해 이루어진 ULG3.0 계통의 호르데인 함량 측정으로, 이는 슬루프 (100%)에 대한 상대적인 비율(%)을 나타낸다.
도 6. 피크 면적에 의한, MRM MS에 의해 이루어진 ULG3.0 계통의 호르데인 함량 측정으로, 이는 슬루프 (100%)에 대한 상대적인 비율(%)을 나타낸다.
도 7. 정의된 펩티드에 대한 피크 면적으로서의, MRM MS에 의한 ULG3.0 맥주의 호르데인 함량 측정. 피크 면적이 제시되어 있으며, 이는 슬루프 (100%)에 대한 상대적인 비율(%)로 제시되어 있다.
도 8. MRM MS에 의한, 야생형 변종 슬루프, 보딘, 코맨더 및 하인드마시와의 비교로 나타낸, ULG3.0 (T2-4-8) 및 ULG3.2 후보 계통으로부터의 곡분 중의 호르데인 및 호르데인 유사 단백질의 검출. 각 그래프는 각 호르데인 패밀리로부터의 대표 펩티드의 합산된 피크 면적 (3개의 MRM 전이)에 대한 평균 +/- SD를 보여주는 것이다. 각 경우에서, 펩티드 (그래프에서 열거된 것과 같은 서열)는 아베닌 유사 A 단백질, B1-, B3-, C-, D-, γ1- 또는 γ3-호르데인으로 지도화된다. 유니프로트(Uniprot) 수탁 번호는 범례에 제시되어 있다 (예컨대, 첫번째 일례에서 F2EGD5).
서열 목록에 대한 설명
서열번호: 1 내지 4 - 밀 α-글리아딘 펩티드.
서열번호 2, 3, 6 내지 11, 16 내지 59 및 85 - 보리 호르데인 펩티드.
서열번호: 5 - 밀 아베닌 유사 A 펩티드.
서열번호 12 내지 15 - 호밀 프롤라민 펩티드.
서열번호 60 내지 71 - 올리고뉴클레오티드 프라이머.
서열번호: 72 - 보리 cv. 슬루프 D-호르데인을 코딩하는 게놈 영역.
서열번호: 73 - 보리 cv. 에티오피아 R118 D-호르데인 (널)을 코딩하는 게놈 영역.
서열번호: 74 - 보리 cv. 슬루프 D-호르데인.
서열번호: 75 - 보리 cv. 에티오피아 R1118 D-호르데인.
서열번호: 74 - 보리 cv. 슬루프 D-호르데인.
서열번호: 75 - 보리 cv. 에티오피아 R118 D-호르데인.
서열번호: 76 - 보리 cv. 슬루프 D-호르데인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임.
서열번호: 77 - 보리 cv. 에티오피아 R118 D-호르데인을 코딩하는 오픈 리딩 프레임.
서열번호: 78 - 야생형 보리 B1 호르데인의 일례 (수탁: Q40020).
서열번호: 79 - 야생형 보리 B3 호르데인의 일례 (수탁: Q4G3S1).
서열번호: 80 - 야생형 보리 C-호르데인의 일례 (수탁: Q40055).
서열번호: 81 - 야생형 보리 γ1-호르데인의 일례 (수탁: P17990).
서열번호: 82 - 야생형 보리 γ2-호르데인의 일례 (수탁: Q70IB4).
서열번호: 83 - 야생형 보리 γ3-호르데인의 일례 (수탁: P80198).
서열번호: 84 - 야생형 보리 아베닌 유사 A 단백질의 일례 (수탁: F2EGD5).
본 발명의 상세한 설명
일반 기법 및 정의
구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계 (예컨대, 식물 육종학, 식품 공학, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 단백질 화학, 및 생화학 분야)의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 가지는 것으로 이해되어야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기법은 당업자에게 공지된 표준 방법이다. 상기 기법은 예컨대, [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 [F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지의 모든 업데이트 포함)], [Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함)]와 같은 자료 문헌 전역에 기술되어 있고, 설명되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "보리"라는 용어는 호르데움(Hordeum) 속의 임의의 종 (그의 조상 뿐만 아니라, 다른 종과의 교배에 의해 생산된 그의 자손 포함)을 의미한다. 보리의 바람직한 형태는 호르데움 불가레 종이다. 오늘날 전세계에서 상업적으로 재배되는 대부분의 보리 재배종의 곡물은, 외부 겉겨 및 내부 속겨인, 소위 외피라 불리는 것이 성숙하였을 때 과피 표피에 결합되어 있는 겉보리 (외피가 있는 보리) 곡과이다. 외피가 없는 보리 또는 쌀보리로 명명되는 다른 재배종은 탈곡할 필요가 없으며, 외피는 탈곡 공정에서 쉽게 제거된다. 비록 외피가 있는 곡물은 마피 이후에 사용될 수 있기는 하지만, 인간이 섭취하는 데 쌀보리 곡물이 바람직한 반면, 외피가 있는 보리 곡물은 양조 산업 및 동물 사료로 바람직하다. 외피가 없는 곡물 소질은 염색체 7H의 긴 아암 상에 위치하는 nud로 지정된 단일의 열성 유전자에 의해 제어된다 (문헌 [Kikuchi et al., 2003]).
복강 질환(coeliac disease 또는 celiac disease)은 영아 초기 단계 이후의 모든 연령군의 유전적 성향을 띠는 개체에서 발생하는 소장의 자가면역 장애이다. 비록 상당수는 진단받지 않기는 하였지만, 인도-유럽 집단 중 대략 1%가 앓고 있다. 복강 질환은 밀에서 발견되는 글루텐 단백질인 글리아딘 (및 다른 재배종, 예컨대, 보리 및 호밀을 포함하는 트리티세아에의 유사 단백질)에 대한 반응에 의해 유발된다. 글리아딘에의 노출시, 효소 조직 트랜스글루타미나제는 단백질을 변형시키고, 면역계는 장 조직과 교차 반응하여 염증성 반응을 유발한다. 이로 인해 소장 내층은 편평화되어 영양분의 흡수를 방해하게 된다. 유일의 효과적인 치료법은 평생 글루텐을 함유하지 않는 섭식을 하는 것이다. 이러한 병증은 복강 질환 (결찰 포함), 복강 스프루, 비열대 스프루, 풍토성 스프루, 글루텐 장질환 또는 글루텐 민감성 장질환, 및 글루텐 불내성을 비롯한, 여러 다른 명칭을 가진다. 복강 질환의 증상은 사람마다 광범위하게 달라진다. 복강 질환의 증상으로는 하기: 가스, 반복성 복부 팽만감 및 통증, 만성 설사, 변비, 창백, 악취, 또는 지방변, 체중 감소/체중 증가, 피로감, 원인불명 빈혈증 (피로감을 유발하는 낮은 적혈구 계수), 골 또는 관절 통증, 골다공증, 골감소증, 거동상 변화, (신경 손상으로 인해) 다리가 따끔거리고 저린 것, 근육 경련, 발작, (대개는 과도한 체중 감소로 인하) 월경 기간 놓침, 불임, 반복성 유산, 성장 지연, 영아의 성장 장애, 구강내 옅은 궤양 (아프타 궤양으로 불림), 치아 변색 또는 법랑질 손실, 및 소양성 피부 발진 (포진 피부염으로 불림) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 더욱 일반적인 증상들 중 일부로는 피로, 간헐적 설사, 복통 또는 경련통, 소화 불량, 고창, 팽만감; 및 체중 감소를 포함한다. 복강 질환은 예를 들어, WO 01/025793에 기술된 바와 같이 진단될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "Hor3 유전자좌의 D-호르데인을 코딩하는 유전자의 널 대립유전자"라는 용어는 D-호르데인 단백질을 코딩하지 않는 상기 유전자좌의 임의의 대립유전자, 또는 단백질이 코딩될 경우에는 복강 질환을 앓는 대상체에 대하여 면역원성을 띠지 않는 것 (예컨대, 도 3에 제공된 절두된 D-호르데인)을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 언급된 물질과 관련하여 본원에서 사용되는 "~을 포함하지 않는"이라는 용어는 물질이 본 발명의 보리 곡물에, 또는 그로부터 유래된 생성물에 존재하지 않거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 물질에 대한 검정법을 수행하였을 때, 물질이 본 발명의 곡물 또는 생성물에서 검출되지 않는다는 것을 의미한다. 즉, 물질은 검출하는 데 불충분한 수준으로, 또는 상기 물질에 대한 검정에 대하여 표준 오차 범위 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 언급된 호르데인과 관련하여, "~을 포함하지 않는"이라는 용어는 특이 호르데인이 검정법, 예를 들어, MRM MS 검정법, ELISA 검정법, 또는 2D-겔 전기영동 검정법, 예컨대, 본원에서 예시된 것에서 검출되지 않는다는 것을 의미한다. 포함하지 않는 물질은 한가지 유형의 검정법에서 또는 다중 유형의 검정법에서 검출되지 않을 수 있다. 당업계에 공지된 검정법에 의해 쉽게 측정되는 바와 같이, 본 발명의 곡물 또는 생성물 중에 없다는 것으로 언급된 물질은 상응하는 야생형 곡물 또는 생성물 중에 존재한다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바, "호르데인"이라는 용어, 예를 들어, "약 50 ppm 이하의 호르데인"이라는 어구 및 유사 어구에서 사용될 때 상기 용어는 B-, C-, D- 및 γ-호르데인을 비롯한 총 호르데인을 의미한다.
"종자" 및 "곡물"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "곡물"이란 일반적으로 성숙한, 수확된 곡물을 의미할 뿐만 아니라, 그 문맥에 따라 가공 처리, 예컨대, 제분, 또는 도정 이후의 곡물 (여기서, 곡물 대부분은 무손상인 상태 그대로 유지된다), 또는 침지 또는 발아 이후의 곡물을 의미할 수 있다. 성숙한 곡물의 수분 함량은 보통 약 18-20% 미만이다. 야생형 보리 곡물 (전곡)은 9-12% 단백질을 함유하고, 그 중 약 30-50%, 전형적으로 35%는 프롤라민이며, 따라서, 따라서, 야생형 보리 곡물은 약 3-4중량%의 프롤라민을 포함한다. 프롤라민은 거의 전적으로 배유에서 발견되는 데, 이는 전곡 중량의 약 70%이다.
본원에서 사용되는 바, "수확 지수"란 식물 총 중량의 비율(%)로서 수확된 곡물의 중량을 나타낸 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "상응하는 야생형" 보리 식물이라는 용어는 본 발명의 식물의 유전자형의 적어도 50%, 더욱 바람직하게, 적어도 75%, 더욱 바람직하게, 적어도 95%, 더욱 바람직하게, 적어도 97%, 더욱 바람직하게, 적어도 99%, 및 더욱더 바람직하게 99.5%를 포함하지만, 변형되지 않은 호르데인 수준으로 곡물을 생산하는 식물을 의미한다. 한 실시양태에서, "상응하는 야생형" 보리 식물은 곡물에서 호르데인 생산을 감소시키는 유전적 변이체를 도입하는 식물 육종 실험에서 사용되는 재배종이다. 또 다른 실시양태에서, "상응하는 야생형" 보리 식물은 곡물에서 호르데인 생산을 감소시키는 트랜스진이 도입되는 모체 재배종이다. 추가의 실시양태에서, "상응하는 야생형" 보리 식물은 출원일에 보리 곡물의 상업적 생산을 위해 사용된 재배종으로서, 예를 들면, 제한 없이, 보미, 슬루프, 칼스버그(Carlsberg) II, K8, L1, 블라밍(Vlamingh), 스털링(Stirling), 하멜린(Hamelin), 스쿠너(Schooner), 보딘, 코맨더, 게어드너(Gairdner), 불로케(Buloke), WI3586-1747, WI3416, 플래그쉽(Flagship), 코와비(Cowabbie), 플랭클린(Franklin), 슬루프SA, 슬루프Vic, 퀘이사(Quasar), VB9104, 그리메트(Grimmett), 카메오*아루포(Cameo*Arupo) 31-04, 프리오르(Prior), 스쿠너, 유니콘(Unicorn), 해링튼(Harrington), 토렌스(Torrens), 갈레온(Galleon), 모렉스(Morex), 도우(Dhow), 캡스탄(Capstan), 플리트(Fleet), 킬(Keel), 마리타임(Maritime), 야라(Yarra), 대쉬(Dash), 두럽(Doolup), 피츠제럴드(Fitzgerald), 몰로이(Molloy), 문다(Mundah), 옥스포드, 온슬로우(Onslow), 스키프(Skiff), 유니콘, 예간, 케벡(Chebec), 하인드마시, 채리옷(Chariot), 디아만트(Diamant), 코랄(Koral), 루빈(Rubin), 보너스(Bonus), 제니트(Zenit), 악센트(Akcent), 포럼(Forum), 아물렛(Amulet), 톨라(Tolar), 헤리스(Heris), 마레시(Maresi), 란도라(Landora), 카루소(Caruso), 미라릭스(Miralix), 위킨게트 브리세(Wikingett Brise), 카루소, 포테르(Potter), 패서디나(Pasadena), 안나벨(Annabell), 마우드(Maud), 익스트랙트(Extract), 살룬(Saloon), 프리스티지(Prestige), 아스토리아(Astoria), 엘로(Elo), 코르크(Cork), 익스트랙트, 라우라(Laura)가 있다. 한 실시양태에서, "상응하는 야생형" 보리 식물은 Hor2, Hor1, Hor3, 및 Hor5 유전자좌에 의해 코딩되는 B, C, D 및 γ-호르데인을 비롯한, 기능성 호르데인 단백질을 코딩하는 기능성 호르데인 유전자의 완전한 상보체를 포함하기 때문에 변형되지 호르데인 수준으로 곡물을 생산한다.
본원에서 사용되는 바, "하나 이상의 보리 곡물 단백질"이라는 용어는 호르데인 이외의, 보리 곡물에 의해 생산된 자연적으로 발생된 단백질을 의미한다. 상기 단백질의 예는 당업자에게 공지되어 있다. 구체적인 예로는 보리 알부민, 예컨대, 9 kDa 지질 전달 단백질 1 (LTP1) (리뷰를 위해 문헌 [Douliez et al. (2000)], 및 일례로서 스위스-프로트(Swiss-prot) 수탁 번호 P07597 참조), α-아밀라제 트립신 억제제 (CMd, CMb, CMa), 단백질 Z (문헌 [Brandt et al. (1990)] 및 진뱅크 수탁 번호 P06293 참조), 및 문헌 [Colgrave et al. (2012)]에서 확인된 단백질 (그의 프로세싱된 (성숙한) 형태 포함) 뿐만 아니라, 본 발명의 맥아, 곡분, 전립분, 식품 또는 맥아 베이스 음료의 생산 결과로서 제조된 그의 변성된 형태 및/또는 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "곡물의 평균 중량"은 바람직하게 식물 (또는 같은 조건하에서 재배된 유전적으로 동일한 식물)로부터 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개, 더욱 바람직하게, 적어도 약 100개의 개별 곡물을 수득하고, 곡물의 평균 중량을 측정함으로써 측정된다.
본원에서 사용되는 바, 맥아, 곡분, 전립분 또는 맥주가 보리 이외의 다른 공급원으로부터 유래된다고 명확하게 언급되는 경우를 제외하면, "맥아"라는 용어는 보리 맥아를 의미하는 것으로 사용되고, "곡분"은 보리 곡분을 의미하는 것으로 사용되고, "전립분"은 보리 전립분을 의미하는 것으로 사용되고, "맥주"는 발효가능한 탄수화물을 제공하는 그의 주성분으로서 보리를 사용하여 제조되는 맥주를 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, "맥아즙"이란 맥주 또는 위스키를 양조하는 동안 매싱 공정으로부터 추출되는 액체를 의미한다. 맥아즙은 양조 효모에 의해 발효되어 알콜을 생산하는 당을 함유한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 맥아, 맥아즙, 곡분, 맥주, 전립분, 식품 제품 등의 공급원은 보리 곡물의 가공 처리 (예를 들어, 제분 및/또는 발효)로부터의 것이다. 본 발명의 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분, 전립분 또는 맥주는 보리로부터 유래되지 않은 것인 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분, 전립분 또는 맥주와 혼합 또는 블렌딩될 수 있다. 상기 용어는 보리를 포함하는 곡물 혼합물로부터 제조되는 맥아, 맥아즙, 곡분, 맥주, 전립분, 식품 제품 등을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 맥아, 맥아즙, 곡분, 맥주, 전립분, 식품 제품 등을 제조하는 데 사용되는 곡물 중 적어도 10% 또는 적어도 50%은 보리 곡물이다.
본원에서 명사로서 사용되는 "식물"이라는 용어는 전체 식물, 예컨대, 상업용 보리 생산을 위해 밭에서 생장하는 식물을 의미한다. "식물 부분"은 식물 생장 구조 (예를 들어, 잎, 줄기), 뿌리, 꽃 기관/구조, 종자 (배아, 배유, 및 종피 포함), 식물 조직 (예를 들어, 유관속 조직, 기본 조직 등), 세포, 전분립 또는 그의 자손을 의미한다.
"트랜스제닉 식물," "유전적으로 변형된 식물" 또는 그의 변이란 동일 종, 변종 또는 재배종의 야생형 식물에서는 발견되지 않는 유전자 구축물 ("트랜스진")을 함유하는 식물을 의미한다. 본원에서 의미하는 바와 같이 "트랜스진"은 생명 공학 분야에서 일반적인 의미를 가지며, 재조합 DNA 또는 RNA 기술에 의해 제조되거나, 또는 변경되거나, 식물 세포 내로 도입된 유전적 서열을 포함한다. 트랜스진은 식물 세포로부터 유래된 유전적 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 트랜스진은 인간 조작에 의해, 예를 들어, 형질전환에 의해 식물 내로 도입되었지만, 당업자가 이해하는 바와 같이 임의의 방법도 사용될 수 있다.
"핵산 분자"란 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA, RNA 또는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이는 게놈 또는 합성 기원의, 이중 가닥 또는 단일 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있고, 본원에서 정의된 특정 활성을 수행하기 위하여 탄수화물, 지질, 단백질, 또는 다른 물질과 조합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이란 2개 이상의 핵산 (예컨대, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 의미한다. 전형적으로, 전사 조절 요소 (프로모터)와 전사되는 서열 사이의 기능적 관계를 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 적절한 세포에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나, 또는 그를 조절한다면, 프로모터는 코딩 서열, 예컨대, 본원에서 정의되는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 요소는 전사되는 서열에 물리적으로 인접하게 위치하며, 즉, 상기 프로모터 전사 조절 요소는 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 요소, 예컨대, 인핸서는 그가 전사를 증진시켜 주는 코딩 서열에 물리적으로 인접해 있거나, 아주 근접하게 위치해 있을 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바, "유전자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하며, 구조 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 어느 한 단부에, 적어도 약 2 kb의 거리로 5' 및 3' 단부, 둘 모두에 코딩 영역에 인접하게 위치하며, 상기 유전자의 발현에 관여하는 서열을 포함하는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고, mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열로 지칭된다. 코딩 영역의 3' 또는 그의 하류에 위치하고, mRNA 상에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열로 지칭된다. "유전자"란 용어는 cDNA 및 유전자의 게놈 형태, 둘 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론," 또는 "개입 영역" 또는 "개입 서열"로 명명되는 비코딩 서열로 중단될 수도 있는 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 세그먼트이고; 인트론은 조절 요소, 예를 들어, 인핸서를 함유할 수도 있다. 인트론은 핵 또는 1차 전사체로부터 제거되거나, 또는 "스플라이싱"되고; 따라서, 인트론은 메신저 RNA (mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 발생 폴리펩티드 중의 아미노산의 서열 또는 순서를 명시하는 작용을 한다. "유전자"라는 용어는 본원에 기술된 본 발명의 단백질 모두 또는 그의 일부를 코딩하는 합성 또는 융합 분자 및 상기 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "다른 식품 또는 음료 성분"이라는 용어는 식품 또는 음료의 일부로서 제공되었을 때, 동물이 섭취하는 데 적합한 임의의 물질, 바람직하게, 인간이 섭취하는 데 적합한 임의의 물질을 의미한다. 그 예로는 물은 제외한, 다른 식물 종으로부터의 곡물, 당 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식물은 전형적으로 각각이 적어도 1개의 호르데인, 더욱 바람직하게, 적어도 B, C 및 D-호르데인의 수준을 감소시키는 것인 하나 이상의 유전적 변이를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "각각이 적어도 1개의 호르데인의 수준을 감소시키는 유전적 변이"라는 용어는 호르데인 생산을 감소시키는 보리 식물의 임의의 다형성을 의미한다. 유전적 변이로는 예를 들어, 호르데인 유전자(들) 또는 그의 일부의 결실, 또는 보리 유전자 전사를 감소시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 유전적 변이의 예는 Risø 56, Risø 527 및 Risø 1508 및 에티오피아 R118에 존재한다. 그러므로, 상기 식물은 본 발명의 식물을 제조하기 위한 모체 식물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 식물은 상기 보리 돌연변이체 중 임의의 것 사이의 교배로부터 얻은 자손으로부터 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 식물은 상기 계통에 존재하는 hor2 및 lys3 돌연변이를 포함하는 Risø 56 및 Risø 1508 사이의 교배로부터 얻은 자손이 아니며, D-호르데인을 코딩하는 유전자에 대하여 야생형인 자손도 아니다. 한 실시양태에서, 식물은 서열번호: 58로서 제공되는 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 γ3-호르데인, 예컨대, 서열번호: 83으로서 제공되는 서열을 가지는 아미노산을 포함하는 γ3-호르데인을 코딩한다. 예를 들어, 식물은 기능성인 야생형 γ3-호르데인 유전자, 예컨대, 보리 재배종 보미, 슬루프, 보딘, 예간, 하인드마시, 또는 코맨더의 γ3-호르데인 유전자를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 식물은 Risø 527과 Risø 1508 사이의 교배로부터 얻은 자손이 아니다.
본원에서 사용되는 바, 반대로 언급되지 않는 한, "약"이라는 어구는 해당 값을 고려하여 임의의 합리적인 범위를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "약"이라는 용어는 명시된 값의 +/-10%, 더욱 바람직하게, +/-5%, 더욱 바람직하게, +/-1%를 지칭한다.
달리 언급되지 않는 한, 중량 및 비율(%)을 언급할 때, 단위는 w/w이다.
"및/또는", 예컨대, "X 및/또는 Y"란 용어는 "X 및 Y," 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해하여야 하며, 상기 두 의미 모두 또는 그 중 한 의미를 명백하게 지지하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"이라는 파생어는 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제시킨다는 것이 아니라, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함한다는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
프롤라민 및 호르데인
(밀에서는 글리아딘으로, 보리에서는 호르데인으로, 호밀에서는 세칼린으로, 귀리에서는 아베닌으로, 및 옥수수에서는 제인으로 알려져 있는) 시리얼 프롤라민은 귀리 및 쌀을 제외한 모든 시리얼 곡물에서 주된 배유 저장 단백질이다 (문헌 [Shewry and Halford, 2002]). 호르데인은 보리 종자에서 총 단백질의 35-50%를 차지한다 (문헌 [Jaradat, 1991]). 이는 4개의 군인, 이동성 감소순으로 A (γ 호르데인으로도 공지됨), B, C, 및 D로 분류된다 (문헌 [Field et al., 1982]). B, C, D 및 γ-호르데인은 각각 도 1에 개략적으로 제시되어 있는 염색체 1H 상의 Hor2, Hor1, Hor3, 및 Hor5 유전자좌에 의해 코딩된다.
B-호르데인은 주요 단백질 분획물로서, 이는 그의 황 함량에 있어 C-호르데인과 상이하다 (문헌 [Kreis and Shewry, 1989]). B-호르데인은 전체의 70-80%를 차지하고, C-호르데인은 10-20%를 차지한다 (문헌 [Davies et al., 1993]). A 호르데인은 일반적으로는 저장 분획물로 간주되지 않는 반면, D-호르데인은 고분자량 글루테닌과 상동성이다. 나머지 관련 시리얼 프롤라민과 함께 호르데인은 다른 저장 단백질, 예컨대, 나핀과 달리, 접합성 배아 그 자체에서는 발현되지 못하고; 종자 발생 중 중기 내지 후기 동안 오직 전분성 배유에서만 발현되는 것으로 여겨진다.
보리 호르데인 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 유전자의 예는 WO 2009/021285에 제공되어 있다.
맥아 제조
본 발명에 의해 제공되는 맥아 베이스 음료는 알콜 음료 (증류주 포함) 및 그의 출발 물질의 일부 또는 전체로서 맥아를 사용함으로써 제조되는 비알콜 음료를 포함한다. 예로는 맥주, 발포주 (저맥아 맥주 음료), 위스키, 저알콜 맥아 베이스 음료 (예컨대, 알콜을 1% 미만으로 함유하는 맥아 베이스 음료), 및 비알콜 음료를 포함한다.
맥아 제조는 보리 곡물의 침지 및 발아, 이어서, 건조시키는 공정이다. 이러한 순서의 이벤트는 주로 사멸된 배유 세포벽을 해중합시키고, 곡물 영양소를 동원하는 공정인, 곡물 변형을 유발하는 다수의 효소의 합성에 중요하다. 후속되는 건조 공정에서, 화학적 갈변 반응에 기인하여 풍미 및 색상이 생성된다. 맥아의 1차 용도는 음료 생산이지만, 이는 또한 다른 산업적 공정에서, 예를 들어, 제빵 산업에서 효소 공급원으로서, 또는 식품 산업에서 향미제 및 착색제로서, 예를 들어, 맥아 또는 맥아 곡분으로서, 또는 간접적으로는 맥아 시럽 등으로서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 맥아 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 바람직하게
(i) 본 발명의 보리 식물의 곡물을 제공하는 단계,
(ii) 상기 곡물을 침지시키는 단계,
(iii) 침지된 곡물을 기결정된 조건하에서 발아시키는 단계, 및
(iv) 상기 발아된 곡물을 건조시키는 단계를 포함한다.
예를 들어, 문헌 [Hoseney (Principles of Cereal Science and Technology, Second Edition, 1994: American Association of Cereal Chemists, St. Paul, Minn.)]에 기술된 방법 중 임의의 것에 의해 맥아를 제조할 수 있다. 그러나, 맥아를 제조하는 데 있어 임의의 다른 적합한 방법, 예컨대, 맥아를 로스팅하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 전문 맥아 제조 방법이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 비제한적인 일례는 실시예 6에 기술되어 있다.
맥아는 본 발명의 보리 식물로부터 제조된 곡물만을 사용하여, 또는 다른 곡물을 포함하는 혼합물에서 제조될 수 있다.
맥아는 주로 맥주를 양조하는 데 사용되지만, 증류주를 제조하는 데에도 사용된다. 양조는 맥아즙 제조, 본 발효 및 2차 발효, 및 후처리를 포함한다. 먼저 맥아를 제분하고, 물에서 교반하고, 가열한다. 상기 "매싱" 동안, 맥아 제조에서 활성화된 효소는 커널의 전분을 발효가능한 당으로 분해한다. 제조된 맥아즙을 정화시키고, 효모를 첨가하고, 혼합물을 발효시키고, 후처리를 수행한다.
또 다른 실시양태에서, 맥아로부터 맥아즙 조성물을 제조할 수 있다. 상기 맥아즙은 1차 및/또는 2차 및/또는 추가의 맥아즙일 수 있다. 일반적으로, 맥아즙 조성물은 고함량의 아미노 질소 및 발효가능한 탄수화물, 주로 말토스를 포함할 것이다. 전형적으로, 맥아즙은 맥아를 물과 함께 인큐베이션시킴으로써, 즉, 매싱에 의해 제조된다. 매싱하는 동안, 맥아/물 조성물을 추가의 탄수화물이 풍부한 조성물, 예를 들어, 보리, 옥수수 또는 쌀 보조제로 보충될 수 있다. 맥아가 첨가되지 않은 시리얼 보조제는 일반적으로 활성 효소를 함유하지 않으며, 따라서, 당 전화에 필요한 효소를 제공하기 위하여 맥아 또는 외인성 효소에 의존한다.
일반적으로, 맥아즙 제조 공정에서 제1 단계는 매싱 단계에서 물이 곡물 입자에 접근할 수 있도록 하기 위한 맥아 제분으로서, 이는 기본적으로 기질의 효소적 해중합화를 포함하는 맥아 제조 공정의 연장이다. 매싱 동안, 제분된 맥아를 액체 분획, 예컨대, 물과 함께 인큐베이션시킨다. 온도를 일정하게 유지시키거나 (등온 매싱), 또는 점진적으로 승온시킨다. 어느 경우에든, 맥아 제조 및 매싱에서 제조된 가용성 물질을 상기 액체 분획 내로 추출한 후, 여과에 의해 맥아즙으로 분리하고, 남은 고체 입자는 사용한 폐 곡물로 언급된다. 상기 맥아즙은 또한 제1 맥아즙으로 언급될 수 있다. 여과 후, 제2 맥아즙을 수득한다. 상기 방법을 반복함으로써 추가의 맥아즙을 제조할 수 있다. 맥아즙을 제조하는 데 적합한 방법에 관한 비제한적인 예는 문헌 [Hoseney (상기 문헌 동일)]에 기술되어 있다.
맥아즙 조성물은 또한 본 발명의 보리 식물 또는 그의 일부를 하나 이상의 적합한 효소, 예컨대, 효소 조성물 또는 효소 혼합물을 조성물 예를 들어, 울트라플로(Ultraflo) 또는 세레플로(Cereflo) (노보자임즈(Novozymes))와 함께 인큐베이션시킴으로써 제조될 수 있다. 맥아즙 조성물은 또한 맥아 및 맥아가 첨가되지 않은 보리 식물 또는 그의 일부의 혼합물을 사용하여 제조될 수 있으며, 임의적으로는 상기 제조 동안 하나 이상의 적합한 효소를 첨가할 수 있다. 추가로, 복강 질환에 관여하는 독성 아미노 연관을 특이적으로 파괴시키는 프롤릴-엔도펩티다제 효소를 맥아즙 발효 동안 첨가하여 잔류 호르데인의 독성을 감소시킬 수 있다 (문헌 [De Angelis et al., 2007]; [Marti et al., 2005]; [Stepniak et al., 2006]).
곡물 가공 처리
본 발명의 보리 곡물을 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 가공 처리하여 식품 성분, 음료 성분, 식품 또는 음료, 또는 비식품(non-food) 제품을 제조할 수 있다.
한 실시양태에서, 생성물은 전곡 곡분 (초미 제분된 전곡 곡분, 예컨대, 초미 제분된 전곡 곡분; 전곡 곡분, 또는 약 100%의 곡물로부터 제조된 곡분)이다. 전곡 곡분을 정련된 곡분 성분 (정련된 곡분 또는 정련된 곡분) 및 조립질 분획 (초미 제분된 조립질 분획)을 포함한다.
정련된 곡분은 예를 들어, 세정된 보리를 분쇄하고 볼팅함으로써 제조된 곡분일 수 있다. 미국 식품 의약청(Food and Drug Administration: FDA)은 곡분이 정련된 보리 곡분의 카테고리에 포함되기 위해서는 특정 입자 크기 표준을 충족시킬 것을 요한다. 정련된 곡분의 입자 크기는 적어도 98%이 "212 ㎛ (미국 와이어(U.S. Wire) 70)"로 지정된 편조형 직물의 것보다 더 크지 않은 개구를 가지는 직물을 통과하는 곡분으로 기술된다.
조립질 분획은 겨 및 발아 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 발아는 보리 커널 내에서 발견되는 배아 식물이다. 배아는 지질, 섬유, 비타민, 단백질, 미네랄 및 피토뉴트리언트, 예컨대, 플라보노이드를 포함한다. 겨는 여러 세포층을 포함하고, 상당량의 지질, 섬유, 비타민, 단백질, 미네랄 및 피토뉴트리언트, 예컨대, 플라보노이드를 포함한다. 추가로, 조립질 분획은 지질, 섬유, 비타민, 단백질, 미네랄 및 피토뉴트리언트, 예컨대, 플라보노이드 또한 포함하는 호분층을 포함할 수 있다. 기술상 배유의 일부분인 것으로 간주되는 호분층은 겨와 동일한 특징들 다수를 보이며, 그러므로, 이는 전형적으로 제분 공정 동안 겨 및 발아와 함께 제거된다. 호분층은 단백질, 비타민 및 피토뉴트리언트, 예컨대, 페룰산을 함유한다.
추가로, 조립질 분획을 정련된 곡분 성분과 블렌딩할 수 있다. 바람직하게, 조립질 분획을 정련된 곡분 성분과 균질하게 블렌딩한다. 조립질 분획과 정련된 곡분 성분을 균질하게 블렌딩하는 것이 운송하는 동안 크기에 의한 입자의 계층화를 감소시키는 데 도움을 줄 수 있다. 조립질 분획을 정련된 곡분 성분과 혼합하여 전곡 곡분을 형성함으로써 정련된 곡분과 비교하여 영양가, 섬유 함량, 및 항산화제 능력이 증가된 전곡 곡분을 제공할 수 있다. 예를 들어, 조립질 분획 또는 전곡 곡분은 베이킹 제품, 스낵 제품, 및 식품 제품에서 다양한 양으로 정련된 또는 전곡 곡분을 대체하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 전곡 곡분 (즉, 초미 제분된 전곡 곡분) 또한 그의 수재 베이킹 제품에서 사용하기 위해 소비자에게 직접 판매될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 전곡 곡분의 과립화 프로파일은 전곡 곡분 중 98중량%의 입자가 212 ㎛ 미만이 되도록 한다.
추가의 실시양태에서, 전곡 곡분 및/또는 조립질 분획을 안정화시키기 위해 전곡 곡분 및/또는 조립질 분획의 겨 및 발아 내에서 발견되는 효소를 불활성화시킨다. 불활성화라는 것은 또한 억제, 변성 등을 의미할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 고려된다. 안정화는 증기, 열, 방사선, 또는 겨 및 발아 층에서 발견되는 효소를 불활성화시키는 다른 처리를 이용하는 공정이다. 겨 및 발아 중의 자연적으로 발생된 효소는 곡분의 조리 특징 및 저장 수명에 악영향을 미치면서, 곡분 중의 화합물에의 변화를 촉매화시킬 것이다. 불활성화된 효소는 곡분 중에서 발견된 화합물에의 변화를 촉매화시키지 못하는 바, 따라서, 안정화된 곡분은 그의 조리 특징을 그대로 유지하고, 보다 장기간의 저장 수명을 가지게 된다. 예를 들어, 본 발명은 조립질 분획을 분쇄시키기 위해 2류 제분 기법을 수행할 수 있다. 일단 조립질 분획을 분리하고 안정화시키고 나면, 이어서, 조립질 분획을 분쇄기, 바람직하게, 갭 제분기를 통해 분쇄하여 입자 크기 분포가 약 500 ㎛ 이하인 조립질 분획을 형성한다. 예시적인 실시양태에서, 갭 제분기 선단 속도는 보통 115 m/초 내지 144 m/초로 작동하며, 고 선단 속도를 통해 열이 발생하게 된다. 상기 공정 동안 발생된 열과 기류가 조립질 분획의 미생물 부하를 감소시킨다. 추가의 실시양태에서, 갭 제분기에서 분쇄하기 전, 조립질 분획의 평균 호기성 플레이트 계수는 95,000개의 콜로니 형성 단위/그램 (cfu/g)이고, 평균 콜라이형 계수는 1,200 cfu/g일 수 있다. 갭 제분기 통과 후, 조립질 분획의 평균 호기성 플레이트 계수는 10,000 cfu/g이고, 평균 콜라이형 계수는 900 cfu/g일 수 있다. 따라서, 미생물 부하는 본 발명의 조립질 분획에서 뚜렷이 감소될 수 있다. 시프팅 후, 입자 크기가 500 ㎛ 초과인 임의의 분쇄된 조립질 분획을 추가 제분을 위해 상기 공정으로 복귀시킬 수 있다.
추가의 실시양태에서, 전곡 곡분 또는 조립질 분획은 식품 제품의 성분일 수 있다. 예를 들어, 식품 제품은 베이글, 비스킷, 빵, 번, 크로와상, 만두, 잉글리쉬 머핀, 머핀, 피타 빵, 퀵 브레드, 냉장/냉동 도우 제품, 도우, 베이크 빈스, 부리토, 칠리, 타코, 타말레, 토르티야, 포트 파이, 즉석 시리얼, 즉석 밀, 소, 전자렌지용 밀, 브라우니, 케이크, 치즈케이크, 커피 케이크, 쿠키, 디저트, 패스트리, 스위트 롤, 캔디바, 파이 크러스트, 파이 속, 이유식, 제빵용 믹스, 배터, 브레딩, 그레이비 믹스, 육류 증량체, 육류 대체품, 시즈닝 믹스, 수프 믹스, 그레이비, 루, 샐러드 드레싱, 수프, 사워 크림, 국수, 파스타, 라면 국수, 차우멘 국수, 로메인 국수, 아이스크림 함유물, 아이스크림 바, 아이스크림 콘, 아이스크림 샌드위치, 크래커, 크루통, 도넛, 에그롤, 압출 스낵, 과일 및 곡물 바, 전자렌지용 스낵 제품, 영양바, 팬케이크, 파베이킹 빵 제품, 프레첼, 푸딩, 그래놀라를 재료로 한 제품, 스낵 칩, 스낵 식품, 스낵 믹스, 와플, 피자 크러스트, 동물용 사료 또는 애완 동물용 사료일 수 있다.
대체 실시양태에서, 전곡 곡분 또는 조립질 분획은 영양 보충제의 성분일 수 있다. 예를 들어, 전형적으로, 비타민, 미네랄, 허브, 아미노산, 효소, 항산화제, 허브, 향신료, 프로바이오틱스, 추출물, 프리프로바이오틱스 및 섬유를 비롯한 하나 이상의 성분을 함유하는 섭식에 첨가되는 제품일 수 있다. 본 발명의 전곡 곡분 또는 조립질 분획은 비타민, 미네랄, 아미노산, 효소, 및 섬유를 포함한다. 예를 들어, 조립질 분획은 농축된 양의 식이 섬유 뿐만 아니라, 보건식에 필수적인 다른 필수 영양소, 예컨대, B 비타민, 셀레늄, 크롬, 망간, 마그네슘, 및 항산화제를 함유한다. 예를 들어, 22 g의 본 발명의 조립질 분획은 섬유에 대한 개인의 1일 권장 섭취량의 33%를 전달한다. 추가로, 14 g은 섬유에 대한 개인의 1일 권장 섭취량의 20%를 전달하는 데 요구되는 전량이다. 따라서, 조립질 분획은 개인의 섬유 요구량 섭취를 위해 탁월한 보충원이다. 그러므로, 본 실시양태에서, 전곡 곡분 또는 조립질 분획은 영양 보충제의 성분일 수 있다. 영양 보충제는 개인의 전반적인 건강 상태를 지원하는 임의의 공지된 영양 성분을 포함할 수 있고, 그 예로는 비타민, 미네랄, 다른 섬유 성분, 지방산, 항산화제, 아미노산, 펩티드, 단백질, 루테인, 리보스, 오메가-3 지방산, 및/또는 다른 영양 성분을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가의 실시양태에서, 전곡 곡분 또는 조립질 분획은 섬유 보충제 또는 그의 성분일 수 있다. 다수의 현 섬유 보충제, 예컨대, 사일리움 곡피, 셀룰로스 유도체, 및 가수분해된 구아 검은 그의 섬유 함량 초과의 제한된 영양가를 가진다. 별법으로 다수의 섬유 보충제의 질감은 바람직하지 않고, 맛은 좋지 않다. 전곡 곡분 또는 조립질 분획으로부터 제조된 섬유 보충제는 섬유 뿐만 아니라, 단백질 및 항산화제의 전달에 도움을 줄 수 있다. 섬유 보충제는 제한하는 것은 아니지만, 하기 형태로 전달될 수 있다: 인스턴트 음료 믹스, 즉석 음료, 영양바, 웨이퍼, 쿠키, 크래커, 겔 쇼트, 캡슐, 츄, 추어블정, 및 환. 한 실시양태는 가향 쉐이크 또는 맥아 타입 음료 형태로 섬유 보충제를 전달하고, 상기 실시양태는 특히 어린이용 섬유 보충제로서 관심의 대상이 될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 제분 공정은 다중 곡물 곡분, 다중 보리 곡분, 또는 다중 곡물 조립질 분획을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 유형의 보리로부터의 겨 및 발아를 분쇄하고, 또 다른 유형의 보리의 분쇄된 배유 또는 전곡 보리 곡분과 블렌딩할 수 있다. 별법으로, 한 유형의 곡물의 겨 및 발아를 분쇄하고, 또 다른 유형의 곡물의 분쇄된 배유 또는 전곡 곡분과 블렌딩할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 제1 유형의 보리 또는 곡물의 겨 및 발아를 제2 유형의 보리 또는 곡물로부터의 겨 및 발아와 블렌딩하여 다중 곡물 조립질 분획을 제조할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 곡물의 겨, 배아, 배유, 및 전곡 곡분 중 하나 이상의 것으로 이루어진 임의의 조합물을 혼합하는 것을 포함한다는 것을 고려한다. 이러한 다중 곡물, 다중 보리 접근법을 사용하여 주문형 곡분을 제조할 수 있고, 하나의 곡분을 제조하기 위해 다중 유형의 곡물 또는 보리의 품질 및 영양소 함량을 이용할 수 있다.
본 발명의 전곡 곡분은 다양한 제분 공정을 통해 제조될 수 있다. 예시적인 실시양태는 곡물의 배유, 겨, 및 발아를 분리하지 않고 단일 스트림 중의 곡물을 별도의 스트림으로 곡물을 분쇄하는 것을 포함한다. 깨끗하고 템퍼링된 곡물을 제1 통과 분쇄기, 예컨대, a 해머밀, 롤러 제분기, 핀 제분기, 충격 제분기, 디스크 제분기, 공기 마찰 제분기, 갭 제분기 등으로 운반한다. 한 실시양태에서, 분쇄기는 갭 제분기일 수 있다. 분쇄 후, 곡물을 배출하여 시프터로 운반한다. 당업계게 공지된 분쇄된 입자 시프팅용의 임의의 시프터가 사용될 수 있다. 시프터의 스크린을 통해 통과하는 물질은 본 발명의 전곡 곡분이며, 추가의 가공 처리를 필요로 하지 않는다. 스크린 상에 그대로 남아있는 물질은 제2 분획으로 지칭된다. 제2 분획은 추가의 입자 축소를 필요로 한다. 따라서, 상기 제2 분획을 제2 통과 분쇄기로 운반할 수 있다. 분쇄 후, 제2 분획을 제2 시프터로 운반할 수 있다. 제2 시프터의 스크린을 통해 통과하는 물질은 본 발명의 전곡 곡분이다. 스크린 상에 그대로 남아있는 물질은 제4 분획으로 지칭되며, 입자 크기 축소를 위해 추가의 가공 처리를 필요로 한다. 피드백 루프를 통한 추가의 가공 처리를 위해 제2 시프터의 스크린 상의 제4 분획을 다시 제1 통과 분쇄기 또는 제2 통과 분쇄기로 운반한다. 본 발명의 대안적 실시양태에서, 공정은 더 높은 시스템 능력을 제공하기 위해 복수 개의 제1 통과 분쇄기를 포함할 수 있다.
본 발명의 전곡 곡분, 조립질 분획 및/또는 곡물 생성물은 당업계에 공지된 임의의 제분 공정에 의해 제조될 수 있다는 것을 고려한다. 추가로, 본 발명의 전곡 곡분, 조립질 분획 및/또는 곡물 생성물은 다수의 다른 공정, 예컨대, 발효, 인스턴트화, 압출, 캡슐화, 토스팅, 로스팅 등에 의해 변형되거나, 개량될 수 있다는 것을 고려한다.
호르데인의 생산을 하향조절하는 폴리뉴클레오티드
한 실시양태에서, 본 발명의 곡물, 및/또는 본 발명의 방법에서 사용되는 곡물은 곡물 중 적어도 1개의 호르데인의 생산을 하향조절하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 보리 식물로부터의 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 예로는 안티센스 폴리뉴클레오티드, 센스 폴리뉴클레오티드, 촉매성 폴리뉴클레오티드, 인공 마이크로RNA 또는 이중체 RNA 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 곡물 중에 존재할 때, 이들 폴리펩티드들은 각각 번역에 이용가능한 호르데인 mRNA를 감소시킨다.
안티센스 폴리뉴클레오티드
"안티센스 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 호르데인을 코딩하는 특이 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적이고, 전사 후 이벤트, 예컨대, mRNA 번역을 간섭할 수 있는 분자인, DNA 또는 RNA, 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 안티센스 방법의 사용은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [G. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)] 참조). 식물에서의 안티센스 기법 사용은 문헌 [Bourque (1995)] 및 [Senior (1998)]에 리뷰되어 있다. 문헌 [Senior (1998)]에는 안티센스 방법이 현재 유전자 발현을 조작하는 데 있어 매우 잘 확립된 기법이라고 언급되어 있다.
본 발명의 보리 식물에서 안티센스 폴리뉴클레오티드는 생리학적 조건하에서 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 것이다. 본원에서 사용되는 바, "안티센스 폴리뉴클레오티드가 생리학적 조건하에서 하이브리드화한다"라는 용어는 (완전히 또는 부분적으로 단일 가닥인) 폴리뉴클레오티드가 적어도 보리 세포에서 정상적인 조건하에서 단백질, 예컨대, 보리 호르데인을 코딩하는 mRNA와 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다는 것을 의미한다.
안티센스 분자는 구조 유전자에 상응하는 서열, 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱 이벤트를 제어하는 서열에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 서열은 본 발명의 유전자의 표적화된 코딩 영역, 또는 5'-비번역 영역(UTR) 또는 3'-UTR 또는 이의 조합에 상응할 수 있다. 부분적으로는 전사 동안 또는 그 이후에 스플라이싱될 수 있는 인트론 서열에 부분적으로 상보적일 수 있고, 바람직하게는 오직 표적 유전자의 엑손 서열에만 상보적일 수 있다. UTR의 발산이 일반적으로 더 크다는 점에 비추어 볼 때, 상기 영역을 표적화하는 것은 더욱 큰 유전자 억제 특이성을 제공한다.
안티센스 서열의 길이는 적어도 19개의 인접한 뉴클레오티드, 바람직하게, 적어도 50개의 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게, 적어도 100, 200, 500 또는 1,000개의 뉴클레오티드 길이여야 한다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장의 서열이 사용될 수 있다. 가장 바람직한 길이는 100-2,000개의 뉴클레오티드 길이이다. 표적화된 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 90%, 및 더욱 바람직하게 적어도 95-100%이어야 한다. 안티센스 RNA 분자는 물론 상기 분자를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 비관련된 서열도 포함할 수 있다.
촉매성 폴리뉴클레오티드
촉매성 폴리뉴클레오티드/핵산이라는 용어는 상이한 기질을 특이적으로 인식하고, 상기 기질의 화학적 변형을 촉매화하는 DNA 분자 또는 DNA 함유 분자 (이는 또한 "데옥시리보자임"으로도 공지됨), 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자 (이는 또한 "리보자임"으로도 공지됨)를 의미한다. 촉매성 핵산 중의 핵산 염기는 염기 A, C, G, T (및 RNA인 경우, U)일 수 있다.
전형적으로, 촉매성 핵산은 표적 핵산의 특이적인 인식, 및 핵산 절단 효소 활성에 대한 안티센스 서열 (이는 또한 본원에서 "촉매성 도메인"으로도 지칭된다)을 함유한다. 본 발명에서 특히 유용한 리보자임의 유형으로는 해머헤드형 리보자임 (문헌 [Haseloff and Gerlach, 1988], [Perriman et al., 1992]) 및 헤어핀 리보자임 (문헌 [Shippy et al., 1999])이 있다.
본 발명의 보리 식물 중의 리보자임 및 상기 리보자임을 코딩하는 DNA는 당업계에 주지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 리보자임은 또한 RNA 폴리머라제 프로모터, 예컨대, T7 RNA 폴리머라제 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터에 작동가능하게 연결된 (전사시, RNA 분자를 생성하는) DNA 분자로부터 제조될 수 있다. 벡터가 DNA 분자에 작동가능하게 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터fmf 또한 함유할 때, 리보자임은 RNA 폴리머라제 및 뉴클레오티드와 함께 인큐베이션시켰을 때 시험관내에서 제조될 수 있다. 별도의 실시양태에서, DNA는 발현 카세트 또는 전사 카세트 내로 삽입될 수 있다. 합성 후, RNA 분자는 리보자임을 안정화시킬 수 있고, RN아제에 대해 저항성을 띠도록 만들 수 있는 DNA 분자에의 결합에 의해 변형될 수 있다.
본원에 기술된 안티센스 폴리뉴클레오티드와 같이, 촉매성 폴리뉴클레오티드는 또한 "생리학적 조건," 즉, 보리 세포 내의 조건하에서 표적 핵산 분자 (예를 들어, 보리 호르데인을 코딩하는 mRNA)와 하이브리드화할 수 있다.
RNA 간섭
RNA 간섭 (RNAi)은 특정 단백질의 생산을 특이적으로 억제시키는 데 특히 유용하다. 비록 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 문헌 [Waterhouse et al. (1998)]에서는 dsRNA (이중체 RNA)를 사용하여 단백질 생산을 감소시킬 수 있는 기전에 대한 모델이 제공되었다. 상기 기술은 관심의 대상이 되는 유전자 또는 그의 일부의 mRNA, 이 경우, 본 발명에 따를 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 본질적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게, dsRNA는 재조합 벡터 또는 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 제조될 수 있으며, 여기서, 센스 및 안티센스 서열은 상기 센스 및 안티센스 서열이 하이브리드화하여 비관련 서열과 함께 dsRNA 분자를 형성함으로써 루프 구조를 형성하게 하는 비관련 서열 측면에 위치한다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 디자인 및 제조는 특히, 문헌 [Waterhouse et al. (1998)], [Smith et al. (2000)], WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, 및 WO 01/34815을 감안하면, 당업자의 능력 범위 내에 충분히 포함되어 있다.
일례에서, 불활성화시키고자 하는 표적 유전자와 상동성인 적어도 부분적으로 이중 가닥인 (이중체) RNA 생성물(들)의 합성을 지시하는 DNA를 도입한다. 그러므로, DNA는, RNA로 전사되었을 때, 하이브리드화하여 이중 가닥 영역을 형성할 수 있는 센스 및 안티센스, 둘 모두를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 센스 및 안티센스는 RNA로 전사될 때, 스플라이싱되는 인트론을 포함하는 스페이서 영역에 의해 이격되어 있다. 이러한 배열은 유전자 침묵화의 효율을 증가시키는 것으로 나타났다. 이중 가닥 영역은 한 DNA 영역 또는 둘 모두로부터 전사된 1 또는 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. 이중 가닥 분자가 존재한다면, 표적 유전자의 활성을 효율적으로 감소시키거나, 또는 제거하면서, 이중 가닥 RNA 및 또한 표적 식물 유전자로부터의 상동성 RNA 전사체, 둘 모두를 파괴시키는 반응을 내인성 식물 시스템으로부터 유발하는 것으로 간주된다.
하이브리드화하는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 적어도 각각 19개의 인접한 뉴클레오티드 길이, 바람직하게, 적어도 30 또는 50개의 뉴클레오티드 길이, 및 더욱 바람직하게, 적어도 100, 200, 500 또는 1,000개의 뉴클레오티드 길이여야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장의 서열이 사용될 수 있다. 가장 바람직한 길이는 100-2,000개의 뉴클레오티드 길이이다. 표적화된 전사체에 대한 센스 및 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90% 및 더욱 바람직하게 95-100%이어야 한다. 물론 RNA 분자는 상기 분자를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 비관련 서열도 포함할 수 있다. RNA 분자는 RNA 폴리머라제 II 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 제어하에 발현될 수 있다. 후자의 예로는 tRNA 또는 snRNA 프로모터를 포함한다.
바람직한 작은 간섭 RNA ("siRNA") 분자는 표적 mRNA의 약 19-21개의 인접한 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 표적 mRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작되며, 그의 GC 함량은 약 30-70% (바람직하게, 30-60%, 더욱 바람직하게 40-60% 및 더욱 바람직하게, 약 45%-55%)이고, 예컨대, 표준 BLAST 검색에 의해 측정된 바, 그가 도입되는 보리 식물 게놈 중 표적 이외의 다른 임의의 뉴클레오티드 서열과는 높은 동일성(%)을 가지지 않는다.
마이크로RNA
마이크로RNA 조절은 종래 RNAi/PTGS로부터 분기되어 유전자 조절 쪽으로 진화된 RNA 침묵화 경로의 명백한 전문 분야이다. 마이크로RNA는 특징적인 도립 반복부로 조직화된 유전자 유사 요소 중의 코딩되는 특정 부류의 소형 RNA이다. 전사시, 마이크로RNA 유전자는 스템 루프 전구체 RNA를 생성하고, 이어서, 그로부터 마이크로RNA가 프로세싱된다. 마이크로RNA의 길이는 전형적으로 약 21개의 뉴클레오티드 길이다. 방출된 miRNA는 서열 특이 유전자를 억제시키는 아르고노트 단백질의 특정 서브세트르 함유하는 RISC 유사 복합체로 도입된다 (예를 들어, 문헌 [Millar and Waterhouse, 2005]; [Pasquinelli et al., 2005]; [Almeida and Allshire, 2005]).
공동 억제
사용될 수 있는 또 다른 분자생물학적 접근법은 공동 억제이다. 공동 억제의 기전에 대해서는 잘 이해되고 있지 못하지만, 전사 후 유전자 침묵화 (PTGS)에 관여하는 것으로 간주되고 있으며, 상기와 관련하여, 안티센스 억제에 대한 많은 일례와 매우 유사할 수 있다. 이는 유전자 또는 그의 단편의 추가 카피를 그의 발현을 위한 프로모터에 대하여 센스 배향으로 하여 식물 내로 도입하는 것을 포함한다. 센스 단편의 크기, 표적 유전자 영역에 대한 그의 상응성, 및 표적 유전자와의 그의 서열 동일성 정도는 상기 기술된 안티센스 서열에 대한 것과 같다. 일부 경우에서, 유전자 서열의 추가 카피는 표적 식물 유전자의 발현을 간섭한다. 공동 억제 접근법을 수행하는 방법에 대해서는 WO 97/20936 및 EP 0465572를 참조할 수 있다.
핵산 구축물
트랜스제닉 식물을 제조하는 데 유용한 핵산 구축물은 표준 기법을 사용하여 쉽게 제조될 수 있다.
mRNA를 코딩하는 영역을 삽입할 때, 구축물은 인트론 서열을 포함할 수 있다. 상기 인트론 서열은 식물에서 트랜스진의 발현에 도움을 줄 수 있다. "인트론"이라는 용어는 그의 일반적인 의미로 전사는 되지만, 단백질을 코딩하지 않으며, 번역 이전에 RNA에서 스플라이싱되어 제거되는 유전적 세그먼트를 의미하는 것으로 사용된다. 인트론은 트랜스진이 번역된 생성물을 코딩하는 경우에는 5'-UTR 또는 코딩 영역으로 도입될 수 있거나, 또는 그렇지 않을 경우에는 번역 영역 어디에나 도입될 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 임의의 폴리펩티드 코딩 영역은 단일 오픈 리딩 프레임으로서 제공된다. 숙련된 수신자가 이해하는 바와 같이, 상기와 같은 오픈 리딩 프레임은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 역전사시킴으로써 수득할 수 있다.
관심의 대상이 되는 mRNA를 코딩하는 유전자가 확실하게 적절히 발현될 수 있도록 하기 위해, 핵산 구축물은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서 뿐만 아니라, 전사 종결 또는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 상기 요소는 당업계에 주지되어 있다.
조절 요소(들)를 포함하는 전사 개시 영역이 식물에 조절된 발현 또는 구성적 발현을 위해 제공될 수 있다. 바람직하게, 발현은 적어도 종자의 세포에서 일어난다.
식물 세포에서 활성을 띠는 다수의 구성적 프로모터가 기술되었다. 식물에서 구성적 발현에 적합한 프로모터로는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 (FMV) 35S, 사탕수수 간균형 바이러스 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스(FWV) 35S, 사탕수수 바실리폼 바이러스 프로모터, 코멜리나 황색 반점 바이러스 프로모터, 리뷸로스-1,5-비스-포스페이트 카복실라제의 작은 서브유닛으로부터의 광 유도성 프로모터, 벼 시토졸 트리오스포스페이트 아이소머라제 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 프로모터, 벼 액틴 1 유전자 프로모터, 만노핀 신타제 및 옥토핀 신타제 프로모터, Adh 프로모터, 수크로스 신타제 프로모터, R 유전자 복합체 프로모터, 및 클로로필 α/β 결합 단백질 유전자 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 프로모터들은 식물에서 발현되는 DNA 벡터를 생성하는 데 사용되어 왔다; 예컨대, WO 84/02913을 참조할 수 있다. 상기 프로모터들은 모두 다양한 유형의 식물 발현가능한 재조합 DNA 벡터를 생성하는 데 사용되어 왔다.
프로모터는 인자, 예컨대, 온도, 빛, 또는 스트레스에 의해 조절될 수 있다. 보통 조절 요소는 발현시키고자 하는 유전자 서열의 5'로 제공될 수 있다. 구축물은 또한 전사를 증진시키는 다른 요소, 예컨대, nos 3' 또는 ocs 3' 폴리아데닐화 영역 또는 전사 종결인자를 함유할 수 있다.
5' 비번역 리더 서열은 이종성 유전자 서열을 발현시키기 위해 선택된 프로모터로부터 유래될 수 있고, 원하는 경우, mRNA의 번역을 증가시키기 위해 특이적으로 변형될 수 있다. 트랜스진의 발현을 최적화시키는 것에 관한 리뷰를 위해, 문헌 [Koziel et al. (1996)]을 참조할 수 있다. 5' 비번역 영역은 또한 식물 바이러스 RNA (특히, 담배 모자이크 바이러스, 담배 부식 바이러스, 옥수수 오갈병 모자이크 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스)로부터, 적합한 진핵생물 유전자, 식물 유전자 (밀 및 옥수수 클로로필 a/b 결합 단백질 유전자 리더)로부터, 또는 합성 유전자 서열로부터 수득될 수 있다. 본 발명은 비번역 영역이 프로모터 서열을 수반하는 5' 비번역 서열로부터 유도된 구축물을 사용하는 것으로 제한되지 않는다. 리더 서열은 또한 관련이 없는 프로모터 또는 코딩 서열로부터 유래될 수도 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 리더 서열은 옥수수 Hsp70 리더 (US 5,362,865 및 US 5,859,347) 및 TMV 오메가 요소를 포함한다.
전사의 종결은 키메라 벡터에서 관심의 대상이되는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 3' 비번역 DNA 서열에 의해 달성된다. 재조합 DNA 분자의 3' 비번 영역은 식물에서 RNA의 3' 단부에 아데닐레이트 뉴클레오티드를 부가하는 작용을 하는 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 3' 비번역 영역을 식물 세포에서 발현된 다양한 유전자로부터 수득할 수 있다. 노팔린 신타제 3' 비번역 영역, 완두콩 작은 서브유닛 루비스코 유전자로부터의 3' 비번역 영역, 대두 7S 종자 저장 단백질 유전자로부터의 3' 비번역 영역이 상기 능력에 통상적으로 사용된다. 아그로박테리움(Agrobacterium) 종양-유도(Ti) 플라스미드 유전자의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 전사된, 비번역 영역 또한 적합하다.
전형적으로, 핵산 구축물은 선별가능한 마커를 포함한다. 선별가능한 마커는 외인성 핵산 분자로 형질전환된 식물 또는 세포를 확인 및 스크리닝하는 데 도움을 준다. 선별가능한 마커 유전자는 보리 세포에 항생제 또는 제초제 저항성을 제공할 수 있거나, 또는 기질, 예컨대, 만노스가 이용될 수 있도록 허용할 수 있다. 선별가능한 마커는 바람직하게 보리 세포에 히그로마이신 저항성을 제공한다.
바람직하게, 핵산 구축물은 식물 게놈 내로 안정하게 도입된다. 따라서, 핵산은 분자가 게놈 내로 도입될 수 있도록 허용하는 적절한 요소를 포함하거나, 구축물은 식물 세포의 염색체 내로 도입될 수 있는 적절한 벡터에 배칭된다.
본 발명의 한 실시양태는 숙주 세포 내로 핵산 분자를 전달할 수 있는 임의의 벡터 내로 삽입된 본원에서 개요된 트랜스진을 적어도 포함하는 재조합 벡터의 용도를 포함한다. 상기 벡터는 자연적으로는 본 발명의 핵산 분자에 인접해 있지 않은 것으로 발견되고, 바람직하게는 핵산 분자(들)의 유래 기점이 되는 종 이외의 다른 종으로부터 유래되는 핵산 서열인 이종성 핵산 서열을 함유한다. 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵성 또는 진행성일 수 있고, 전형적으로는 바이러스 또는 플라스미드이다.
식물 세포의 안정한 형질감염 또는 트랜스제닉 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터들이 예컨대, 문헌 [Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987]; [Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989]; 및 [Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990]에 기술되었다. 전형적으로, 식물 발현 벡터는 예를 들어 5' 및 3' 조절 서열의 전사 제어하에 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자 및 우세한 선별가능한 마커를 포함한다. 상기와 같은 식물 발현 벡터는 또한 프로모터 조절 영역 (예컨대, 유도성 또는 구성적, 환경적으로 또는 발생적으로 조절된, 또는 세포 또는 조직 특이성 발현을 제어하는 조절 영역), 전사 개시 출발 부위, 리보솜 결합 부위, RNA 프로세싱 신호, 전사 종결 부위, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다.
트랜스제닉 식물
본 발명과 관련하여 정의된 바와 같이 트랜스제닉 보리 식물은 원하는 식물 또는 식물 기관에서 적어도 1종의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 생산하도록 재조합 기법을 사용하여 유전적으로 변형된 식물 (뿐만 아니라, 상기 식물의 부분 및 세포) 및 그의 자손을 포함한다. 트랜스제닉 식물은 당업계에 공지된 기법, 예컨대, 일반적으로 문헌 [A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plant, Oxford University Press (2003)], 및 [P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)]에 기술된 것을 사용하여 제조될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 자손이 원하는 표현형에 대해 분리되지 않도록 도입된 각각의 모든 유전자 (트랜스진)에 대해 동형접합성이다. 트랜스제닉 식물은 또한 예를 들어, 하이브리드 종자로부터 재배된 F1 자손에서 도입된 트랜스진(들)에 대해서 이형접합성일 수 있다. 상기와 같은 식물은 당업계에 공지된, 예컨대, 잡종 강세와 같은 이점을 제공할 수 있다.
유전자를 세포 내로 직접 전달하는 4가지 일반 방법으로 (1) 화학적 방법 (문헌 [Graham et al., 1973]); (2) 물리적 방법, 예컨대, 미세주입 (문헌 [Capecchi, 1980]); 전기천공 (예를 들어, WO 87/06614, US 5,472,869, 5,384,253, WO 92/09696 및 WO 93/21335 참조); 및 유전자 총 (예를 들어, US 4,945,050 및 US 5,141,131 참조); (3) 바이러스 벡터 (문헌 [Clapp, 1993]; [Lu et al., 1993]; [Eglitis et al., 1988]); 및 (4) 수용체 매개 기전 (문헌 [Curiel et al., 1992]; [Wagner et al., 1992])이 기술되어 있다.
사용될 수 있는 가속화 방법으로는 예를 들어, 미세입자 투사법 등을 포함한다. 형질전환 핵산 분자를 식물 세포로 전달하는 방법의 일례로는 미세발사체 충격법이 있다. 상기 방법은 문헌 [Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)]에 리뷰되어 있다. 비-생물학적 입자 (미세발사체)는 핵산으로 코팅될 수 있고, 추진력에 의해 세포내로 전달될 수 있다. 예시적인 입자로는 텅스텐, 금, 백금 등으로 구성된 것들을 포함한다. 미세발사체 충격법의 특정한 이점은 상기가 외떡잎식물을 재현가능하게 형질전환시키는 효과적인 수단이라는 점 이외에도, 원형질체의 단리도, 아그로박테리움 감염에 대한 감수성도 요구되지 않는다는 점이다. 가속화에 의해 DNA를 지아 메이스(Zea mays) 세포 내로 전달하는 방법의 예시적인 실시양태는 현탁액 중에서 배양된 옥수수 세포로 덮인 필터 표면 상에서 스크린, 예컨대, 스테인리스 스틸또는 나이텍스(Nytex) 스크린을 통과하도록 DNA로 코팅된 입자를 추진시키는 데 사용될 수 있는 바이오리스틱스 α-입자 전달 시스템이다. 본 발명에서 사용되는 데 적합한 입자 전달 시스템은 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)로부터 이용가능한 헬륨 가속화 PDS-1000/He 총이다.
충격법을 위해, 현탁액 중 세포를 필터 상에서 농축시킬 수 있다. 충격 처리하고자 하는 세포를 함유하는 필터를 미세발사체 정지 플레이트 아래에 적절한 거리를 두고 배치한다. 원하는 경우, 하나 이상의 스크린 또한 총과, 충격 처리하고자 하는 세포 사이에 배치한다.
별법으로, 미성숙한 배아 또는 다른 표적 세포를 고체 배양 배지 상에 배열할 수 있다. 충격 처리하고자 하는 세포를 미세발사체 정지 플레이트 아래에 적절한 거리를 두고 배치한다. 원하는 경우, 하나 이상의 스크린 또한 가속화 장치와, 충격 처리하고자 하는 세포 사이에 배치한다. 본원에 기술된 기법을 사용함으로써 마커 유전자를 일시적으로 발현하는 세포를 최대 1,000개 이상의 포커스로 수득할 수 있다. 충격법 후 48시간 경과하였을 때 외인성 유전자 생성물을 발현하는 세포 포커스 개수는 대개 1 내지 10 범위이고, 평균은 1 내지 3이다.
충격 형질전환에서, 최대 개수의 안정적인 형질전환체를 수득하기 위해 충격법 수행 이전 배양 조건 및 충격법 파라미터를 최적화시킬 수 있다. 충격법을 위한 물리학적 및 생물학적 파라미터, 둘 모두가 본 기술에서 중요하다. 물리적 인자는 DNA/미세발사체 침전물을 조작하는 것을 포함하는 것, 또는 거대발사체 또는 미세발사체의 비행 및 속도에 영향을 주는 것이다. 생물학적 인자로는 충격법 수행 이전 및 그 직후 세포 조작에 관여하는 모든 단계, 충격법과 관련된 외상을 경감시키는 데 도움을 주는 표적 세포의 삼투 조절, 및 또한 형질전환 DNA, 예컨대, 선형화된 DNA 또는 무손상 슈퍼코일드 플라스미드의 성질을 포함한다. 미성숙한 배아의 성공적인 형질전환을 위해서는 충격법 수행 이전 조작이 특히 중요한 것으로 여겨진다.
또 다른 대체 실시양태에서, 색소체가 안정적으로 형질전환될 수 있다. 개개시된 고등 식물에서의 색소체 형질전환 방법으로는 선별가능한 마커를 함유하는 DNA의 입자 총 전달 및 상동성 재조합을 통한 색소체 게놈으로의 DNA 표적화를 포함한다 (U.S. 5, 451,513, U.S. 5,545,818, U.S. 5,877,402, U.S. 5,932479, 및 WO 99/05265).
따라서, 조건을 완전하게 최적화시키기 위하여 소규모 연구에서 충격법 파라미터의 다양한 조건들을 조정하기를 희망할 수 있음을 고려한다. 특히, 물리적 파라미터, 예컨대, 갭 거리, 비행 거리, 조직 거리, 및 헬륨압을 조정하고자 할 수 있다. 또한, 수혜자 세포의 생리학적 상태에 영향을 미치며, 따라서, 형질전환 및 통합 효율에도 영향을 미칠 수 있는 조건을 변형시킴으로써 외상 감소 인자를 최소화할 수 있다. 예를 들어, 최적의 형질전환을 위해 삼투 상태, 조직 수화 및 수혜자 세포의 계대배양 단계 또는 세포 주기가 조정될 수 있다. 통상의 다른 조정을 수행하는 것은 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 공지될 것이다.
아그로박테리움 매개 전달은 DNA를 전체 식물 조직 내로 도입시킴으로써 원형질체로부터 무손상 식물을 재분화시켜야 할 필요를 회피하기 때문에, 유전자를 식물 세포 내로 도입시키는 데 널리 적용되는 시스템이다. DNA를 식물 세포에 도입시키기 위한 아그로박테리움 매개 식물 통합 벡터의 용도는 당업계에 주지되어 있다 (예를 들어, US 5,177,010, US 5,104,310, US 5,004,863, US 5,159,135 참조). 추가로, T-DNA의 통합은 거의 재배열을 생성시키지 않는 비교적 정밀한 프로세스이다. 전달하고자 하는 DNA 영역은 경계 서열에 의해 정의되고, 개입 DNA가 일반적으로 식물 게놈 내로 삽입된다.
현 아그로박테리움 형질전환 벡터는 기술된 바와 같이, E. 콜라이(E. coli) 뿐만 아니라, 아그로박테리움에서 복제가 가능하며, 이로써 편리한 조작이 이루어질 수 있다 (문헌 [Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985]). 또한, 아그로박테리움 매개 유전자 전달을 위한 벡터의 기술적 진보를 통해 벡터 중의 유전자 및 제한 부위의 배열이 개선되었으며, 이로써 다양한 폴리펩티드 코딩 유전자를 발현할 수 있는 벡터의 구축이 촉진되었다. 기술된 벡터는 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접적인 발현을 위해 프로모터 및 폴리아데닐화 부위 측면에 위치하는 편리한 다중 링커 영역을 가지며, 이는 본 목적에 적합하다. 추가로, 아암 및 디스아암(disarmed) Ti 유전자, 둘 모두를 함유하는 아그로박테리움이 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 아그로박테리움 매개 형질전환이 효율적인 상기 식물 변종에서, 유전자 전달의 용이하고, 한정된 성질에 기인하여 상기가 최선의 방법이다.
아그로박테리움 형질전환 방법을 사용하여 형성된 트랜스제닉 식물은 전형적으로는 한 염색체 상에 단일 유전자 유전자좌를 함유한다. 상기 트랜스제닉 식물은 부가된 유전자에 대해 반접합성인 것으로 지칭될 수 있다. 부가된 구조 유전자에 대해 동형접합성인 트랜스제닉 식물; 즉, 하나의 염색체 쌍의 각각의 염색체 상의 동일한 유전자좌에 한 유전자씩인, 2개의 부가된 유전자를 함유하는 트랜스제닉이 더욱 바람직하다. 동형접합성 트랜스제닉 식물은 단일의 부가된 유전자를 함유하는 독립 분리체 트랜스제닉 식물을 유성 생식으로 교배시키고 (자가 수분시키고), 생산된 종자 중 일부를 발아시키고, 생성된 식물을 관심의 대상이 되는 유전자에 대해 분석함으로써 수득할 수 있다.
2개의 상이한 트랜스제닉 식물을 또한 교배시켜 2개의 독립적으로 분리되는 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생산할 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다. 적절한 자손을 자가 수정시킴으로써 두 외인성 유전자 모두에 대해 동형접합성인 식물들을 생산할 수 있다. 모체 식물에 대한 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종교배은 영양 번식인 바, 이 또한 고려된다. 상이한 특성 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법들에 대한 설명은 문헌 [Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)]에서 살펴볼 수 있다.
식물 원형질체의 형질전환은 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공, 및 상기 처리의 조합에 기초한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 상기 시스템을 상이한 식물 변종에 적용시키는 것은 원형질체로부터 특정의 식물 계통을 재분화시킬 수 있는 능력에 의존한다. 원형질체로부터 시리얼을 재분화시키는 예시적인 방법은 기술되어 있다 (문헌 [Fujimura et al., 1985]; [Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986]).
다른 세포 형질전환 방법도 사용될 수 있으며, 이는 화분 내로의 직접적인 DNA 전달에 의해, 식물의 생식 기간 내로의 직접적인 DNA 주입에 의해, 또는 미성숙한 배아의 세포 내로의 직접적인 DNA 주입 후, 건조된 배아의 재수화에 의한 식물 내로의 DNA 도입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단일 식물 원형질체 형질전환체로부터의, 또는 다양한 형질전환된 외식체로부터의 식물의 재분화, 발생, 및 재배는 당업계에 주지되어 있다 (문헌 [Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)]). 이러한 재분화 및 성장 과정은 전형적으로 형질전환된 세포의 선택 단계, 전형적으로 형질전환된 세포의 선택, 뿌리내린 묘목 단계를 거쳐 진행되는 배아 발생의 통상적인 단계를 통해 개별화된 세포들을 배양하는 단계를 포함한다. 트랜스제닉 배아 및 종자는 유사하게 재분화된다. 이후, 생성된 트랜스제닉 뿌리내린 새싹을 적절한 식물 성장 배지, 예컨대, 토양에 심는다.
외래, 외인성 유전자를 함유하는 식물의 발생 또는 재분화는 당업계에 주지되어 있다. 바람직하게, 재분화된 식물을 자가 수분시켜 동형접합성 트랜스제닉 식물을 제공한다. 다르게는, 재분화된 식물로부터 수득된 화분을 작물학상 중요한 계통의 종자 재배된 식물과 교배시킨다. 반대로, 상기 중요한 계통의 식물로부터 얻은 화합물을 사용하여 재분화된 식물을 수분시킨다. 원하는 외인성 핵산을 함유하는 본 발명의 트랜스제닉 식물은 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 재배된다.
목화 (U.S. 5,004,863, U.S. 5,159,135, U.S. 5,518,908); 대두 (U.S. 5,569,834, U.S. 5,416,011); 브라시카 (U.S. 5,463,174); 땅콩 (문헌 [Cheng et al., 1996]); 및 완두콩 (문헌 [Grant et al., 1995])에 대한 방법으로서, 주로 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 쌍떡잎식물을 형질전환시키고, 트랜스제닉 식물을 수득하는 방법이 공개되어 있다.
외인성 핵산의 도입에 의해 식물 내로 유전적 변이를 도입하기 위해, 및 원형질체 또는 미성숙한 식물 배아로부터 식물을 재분화시키기 위해 시리얼 식물, 예컨대, 보리를 형질전환시키는 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어, CA 2,092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6,100,447, PCT/US97/10621, US 5,589,617, US 6,541,257, 및 WO 99/14314를 참조할 수 있다. 바람직하게, 트랜스제닉 보리 식물은 아그로박테리움 투머파시엔스 매개 형질전환 방법에 의해 생산된다. 원하는 핵산 구축물을 포함하는 벡터를 조직 배양된 식물 또는 외식체의 재분화 가능한 보리 세포, 또는 적합한 식물 시스템, 예컨대, 원형질체 내로 도입시킬 수 있다.
재분화 가능한 보리 세포는 바람직하게 미성숙한 배아로부터의 배반, 성숙한 배아, 상기로부터 유래된 캘러스, 또는 분열 조직으로부터의 것이다.
트랜스제닉 세포 및 식물 중의 상기 트랜스진의 존재를 확인하기 위해, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 또는 써던 블럿 분석을 수행할 수 있다. 트랜스진의 발현 생성물을 생성물의 성질에 따라 다양한 방식들 중 임의의 것으로 검출할 수 있으며, 상기 방식은 웨스턴 블럿 및 효소 검정법을 포함한다. 단백질 발현을 정량화하고, 다른 식물 조직에서 복제를 검출하는 데 특히 유용한 한 방법은 리포터 유전자, 예컨대, GUS를 사용하는 것이다. 일단 트랜스제닉 식물을 수득하고 나면, 상기 식물을 재배하여 원하는 표현형을 가지는 식물 조직 또는 부분을 생산할 수 있다. 식물 조직 또는 식물 부분을 수확하고/거나, 종자를 수집할 수 있다. 종자는 상기 원하는 특징을 가지는 조직 또는 부분을 포함하는 추가의 식물을 재배하기 위한 공급원으로서의 역할을 할 수 있다.
돌연변이체 식물 생산
내인성 호르데인 유전자를 돌연변이화시켜 호르데인의 수준이 감소된 보리를 제조하는 데 사용될 수 있는 다수의 기법이 당업계에 공지되어 있으며, 그러한 기법으로는 TILLING, 아연 핑거 뉴클레아제, TAL 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 및 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복부 클러스터 (CRSPR)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
TILLING
본 발명의 식물은 TILLING (게놈내 표적화 유도성 국부 병반(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))으로도 알려져 있는 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다. 제1 단계에서, 종자 (또는 화분)를 돌연변이 유발원으로 처리한 후, 식물을 돌연변이가 안정하게 유전되는 세대로 진행시킴으로써 도입된 돌연변이, 예컨대, 신규한 단일 염기쌍 변이를 식물 집단 내에 유도한다. DNA를 추출하고, 종자를 상기 집단의 모든 구성원으로부터 저장하여 시간이 경과함에 따라 반복적으로 접근가능한 공급원을 생성한다.
TILLING 검정을 위하여, 관심의 대상이 되는 단일 유전자 표적을 특이적으로 증폭시키기 위한 PCR 프라이머를 디자인한다. 특이성은 표적이 유전자 패밀리의 구성원이거나, 또는 배수체 게놈의 일부인 경우 특히 중요하다. 이어서, 염료 표지된 프라이머를 이용하여 다중 개체의 풀링된 DNA로부터 PCR 생성물을 증폭시킬 수 있다. 상기 PCR 생성물을 변성시키고, 재어닐링시켜 미스매칭된 염기쌍이 형성될 수 있도록 한다. 미스매치, 또는 이종이중체는 자연적으로 발생하는 단일 염기 다형성 (SNP) (즉, 상기 집단으로부터의 수개의 식물이 동일한 다형성을 가질 가능성이 있다) 및 유도된 SNP (즉, 개별 식물이 돌연변이를 나타낼 가능성은 극히 드물다), 둘 모두를 나타낸다. 이종이중체 형성 후, 미스매칭된 DNA를 인식하고, 절단하는 엔도뉴클레아제, 예컨대, Cel I를 이용하는 것이 TILLING 집단 내에서 새로운 SNP를 발견하는 데에 있어 열쇠가 된다.
이러한 접근법을 이용하여, 수천 개의 식물을 스크리닝하여 임의의 유전자 또는 게놈의 특정 영역 내에 단일 염기 변이 뿐만 아니라, 작은 삽입 또는 결실 (1-30 bp)을 가지는 임의의 개체를 확인할 수 있다. 검정되는 게놈 단편의 크기는 0.3 내지 1.6 kb 범위일 수 있다. 8배 풀링, 1.4 kb 단편 (잡음으로 인해 SNP 검출이 문제가 되는 단편의 단부는 무시) 및 1회 검정당 96 레인일 때, 이러한 조합으로 단일 검정당 최대 백만 개의 게놈 DNA 염기쌍을 스크리닝할 수 있으며, 이로써 TILLING 고처리량 기법이 된다.
TILLING은 문헌 [Slade and Knauf (2005) and Henikoff et al., (2004)]에 추가로 기술되어 있다.
고처리량 TILLING 기술은 돌연변이를 효율적으로 검출할 수 있도록 하는 것 이외에도, 천연 다형성을 검출하는 데 이상적이다. 그러므로, 공지된 서열에 대하여 이종이중체를 형성하여 비공지의 상동성 DNA에 대한 정보를 얻음으로써 다형성 부위의 개수 및 위치를 알 수 있다. 적어도 일부의 반복수 다형성을 비롯한, 뉴클레오티드 변이 및 작은 삽입 및 결실 둘 모두를 확인할 수 있다. 이는 에코틸링(Ecotilling)으로 명명되었다 (문헌 [Comai et al., 2004]).
각 SNP는 수개의 뉴클레오티드 내의 그의 대략적인 위치에 의해 기록된다. 따라서, 각 일배체형은 그 이동성에 근거하여 기록 보관될 수 있다. 서열 데이터는 미스매치 절단 검정법에 사용되는 동일한 증폭된 DNA 분취물을 이용하여 비교적 조금씩 점증하는 노력으로 수득할 수 있다. 단일 반응을 위한 좌측 또는 우측 서열분석 프라이머는 그의 다형성에의 근접성에 의하여 선택한다. 서열분석기 소프트웨어는 다중 정렬을 수행하고, 염기 변이를 발견하며, 각각의 경우에 이를 통해서 겔 밴드를 확인하였다.
에코틸링은 현재 대부분의 SNP 발견을 위하여 사용되는 방법인 전체 서열분석보다 더 저렴하게 수행될 수 있다. 돌연변이 유발된 식물로부터의 DNA 풀보다는 어레이된 생태형 DNA를 함유하는 플레이트를 스크리닝할 수 있다. 검출이 거의 염기쌍 분해와 함께 겔 상에서 이루어지며, 배경 패턴이 레인 간에 균일하기 때문에, 동일한 크기의 밴드가 매칭될 수 있고, 따라서, SNP를 단일 단계로 발견하고, 유전자형을 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, SNP의 최종적인 서열분석은 간단하고, 효율적이며, 스크리닝을 위하여 사용되는 동일한 PCR 생성물의 분취물에 대해 DNA 서열분석을 수행할 수 있다는 사실에 기인하여 더욱 간단하고 효율적인 것이 된다.
부위-특이 뉴클레아제를 이용하는 게놈 교정
게놈 교정은 비특이 DNA 절단 모듈에 융합된 서열 특이 DNA 결합 도메인으로 구성된 조작된 뉴클레아제를 이용한다. 이러한 키메라 뉴클레아제는 유도된 파괴를 수복시키는 세포의 내인성 세포 DNA 수복 기전을 자극하는 표적화된 DNA DNA 이중 가닥 파괴를 유도함으로써 효율적이고, 정확한 유전자 변형을 수행할 수 있다. 상기 기전으로는 예를 들어, 오류 유발 비상동성 단부 연결 (NHEJ) 및 상동성 지정 수복 (HDR)을 포함한다.
상동성 아암이 연장되어 있는 도너 플라스미드의 존재하에서, HDR은 단일 또는 다중의 트랜스진을 도입하여 현존 유전자를 교정하거나, 대체할 수 있다. 도너 플라스미드의 부재하에서, NHEJ 매개 수복은 표적의 작은 삽입 또는 결실 돌연변이를 일으켜 유전자 파괴를 유발한다.
본 발명의 방법에서 유용한 조작된 뉴클레아제로는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성인자 유사 (TAL) 효과기 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한다.
전형적으로, 뉴클레아제 코딩 유전자는 플라스미드 DNA, 바이러스 벡터, 또는 시험관내 전사된 mRNA에 의해 세포 내로 전달된다. 또한 형광성 대용 리포터 벡터를 사용함으로써 ZFN- 및 TALEN-변형된 세포를 강화시킬 수 있다. ZFN 유전자 전달 시스템에 대한 대안으로서, 세포막을 통과할 수 있고, 내인성 유전자 파괴를 유도할 수 있는 정제된 ZFN 단백질과 세포를 접촉시킬 수 있다.
복합체 게놈은 대개 의도된 DNA 표적과 동일하거나, 또는 고도로 상동성인 다중 카피의 서열을 함유하며, 잠재적으로 이는 비표적 활성 및 세포 독성을 일으킨다. 이를 처리하기 위해, 구조 (문헌 [Miller et al., 2007]; [Szczepek et al., 2007]) 및 선택 기반 (문헌 [Doyon et al., 2011]; [Guo et al., 2010]) 접근법을 사용함으로써 절단 특이성이 최적화되고, 독성이 감소된, 개선된 ZFN 및 TALEN 이종이량체를 생성할 수 있다.
아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)는 DNA 결합 도메인 및 DNA 절단 도메인을 포함하며, 여기서, DNA 결합 도메인은 1개 이상의 아연 핑거로 구성되고, DNA 절단 도메인에 작동적으로 연결된다. 아연 핑거 DNA 결합 도메인은 단백질의 N 말단에 위치하고, DNA 절단 도메인은 상기 단백질의 C 말단에 위치한다.
ZFN은 적어도 1개의 아연 핑거를 가져야 한다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포 또는 유기체에서 표적화된 유전적 재조합에 유용한 충분한 특이성을 가지도록 하기 위해 적어도 ZFN은 3개의 아연 핑거를 가질 것이다. 전형적으로, 3개 초과의 아연 핑거를 가지는 ZFN은 각 추가의 아연 핑거를 가짐에 따라 점진적으로 더욱 큰 특이성을 가지게 될 것이다.
아연 핑거 도메인은 임의 부류 또는 유형의 아연 핑거로부터 유도된 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 아연 핑거 도메인은 매우 일반적으로는 예를 들어, 아연 핑거 전사 인자 TFIIIA 또는 Sp1이 나타내는 Cis2His2 유형의 아연 핑거를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 아연 핑거 도메인은 3개의 Cis2His2 유형의 아연 핑거를 포함한다. ZFN의 DNA 인식 및/또는 결합 특이성은 세포 DNA 중 임의의 선택된 부위에서의 표적화된 유전적 재조합을 달성하기 위해 변경될 수 있다. 상기와 같은 변형은 공지된 분자 생물학 및/또는 화학적 합성 기법을 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bibikova et al., 2002] 참조).
ZFN DNA 절단 도메인은 비특이 DNA 절단 도메인 부류, 예를 들어, II형 제한 효소, 예컨대, FokI의 DNA 절단 도메인으로부터 유도된 것이다 (문헌 [Kim et al., 1996]). 다른 유용한 엔도뉴클레아제로는 예를 들어, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI, 및 AlwI를 포함할 수 있다.
ZFN의 절단 및 인식 도메인 사이에 링커가 존재할 경우, 이러한 링커는 생성된 링커가 가요성이 되도록 선택된 아미노산 잔기의 서열을 포함한다. 또는 표적 부위 특이성을 최대화시키기 위해 링커가 없는 구축물도 제조된다. 링커가 없는 구축물은 6 bp만큼 이격되어 있는 인식 부위 사이에 결합한 후, 이를 절단하는 것에 대해 강한 선호도를 띤다. 그러나, 링커 길이가 0 내지 18개의 아미노산 길이인 경우, ZFN 매개 절단은 5 내지 35 bp만큼 이격되어 있는 인식 부위 사이에서 일어난다. 링커 길이가 주어진 경우, 결합 및 이량체, 둘 모두와 일치하는 인식 부위 사이의 거리에 한계가 있을 것이다 (문헌 [Bibikova et al., 2001]). 바람직한 실시양태에서, 절단 도메인과 인식 도메인 사이에 링커는 존재하지 않으며, 표적 유전자좌는 6 뉴클레오티드 스페이서에 의해 이격되어 있는, 서로에 대하여 역전된 배향으로 2개의 9 뉴클레오티드 인식 부위를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따른 유전적 재조합 또는 돌연변이를 표적화하기 위해서는 숙주 DNA 중의 2개의 9 bp 아연 핑거 DNA 인식 서열을 확인하여야 한다. 상기 인식 부위는 서로에 대하여 역전된 배향으로 존재할 것이며, 이는 약 6 bp DNA만큼 이격되어 있을 것이다. 이어서, 표적 유전자좌에 특이적으로 결합하는 아연 핑거 조합을 디자인하고, 제조한 후, 아연 핑거를 DNA 절단 도메인에 연결시킴으로써 ZFN을 생성한다.
뉴클레아제 발현 수준을 증가시키고 (문헌 [Doyon et al., 2010]), DNA 단부 프로세싱 효소와 부위 특이 뉴클레아제의 공동 전달 (문헌 [Certo et al., 2012])을 증가시키기 위해 일시적인 저온 배양 조건을 사용함으로써 ZFN 활성을 개선시킬 수 있다. ZFN 매개 게놈 교정의 특이성은 오류 유발 NHE-J 수복 경로의 활성화 없이 HDR을 자극하는 아연 핑거 니카나제 (ZFN이카제)의 사용에 의해 개선될 수 있다 (문헌 [Kim et al., 2012]; [Wang et al., 2012]; [Ramirez et al., 2012]; [McConnell Smith et al., 2009]).
전사 활성인자 유사 (TAL) 효과기 뉴클레아제 (TALEN)는 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인를 포함한다.
TAL 효과기는 병원체에 의해 식물 세포 내로 주입되는 식물 병원성 박테리아의 단백질로서, 이는 식물 세포에서 핵으로 이동하여 전사 인자로서 작용함으로써특이 식물 유전자의 작동시킨다. TAL 효과기의 1차 아미노산 서열은 그의 결합이 이루어지는 뉴클레오티드 서열을 지시한다. 따라서, 표적 부위는 TAL 효과기에 대해 예측될 수 있고, TAL 효과기는 특정 뉴클레오티드 서열에의 결합 목적으로 조작되고, 생성될 수 있다.
뉴클레아제, 또는 뉴클레아제의 일부를 코딩하는 서열, 전형적으로, II형 제한 엔도뉴클레아제, 예컨대, FokI로부터의 비특이 절단 도메인이 TAL 효과기 코딩 핵산 서열에 융합된다 (문헌 [Kim et al., 1996)]. 다른 유용한 엔도뉴클레아제는 예를 들어, HhaI, HindIII, Nod, BbvCI, EcoRI, BglI, 및 AlwI를 포함할 수 있다. 일부 엔도뉴클레아제 (예컨대, FokI)는 단지 이량체로서만 작용한다는 사실은 TAL 효과기의 표적 특이성을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 각 FokI 단량체는 상이한 DNA 표적 서열을 인식하는 TAL 효과기 서열에 융합될 수 있고, 오직 두 인식 부위가 아주 근접하게 위치할 때에만 불활성 단량체는 함께 하나가 됨으로써 기능성 효소를 생성하게 된다. 뉴클레아제를 활성화시키기 위해 DNA 결합을 요구함으로써 고도로 부위 특이성인 제한 효소를 생성할 수 있다.
서열-특이 TALEN은 세포에 존재하는 미리 선택된 표적 뉴클레오티드 서열 내의 특정 서열을 인식할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 표적 뉴클레오티드 서열을 뉴클레아제 인식 부위에 대하여 스캐닝할 수 있고, 특정 뉴클레아제는 표적 서열에 기초하여 선별될 수 있다. 다른 경우에, TALEN은 특정 세포 서열을 표적화하도록 조작될 수 있다.
프로그램 가능한 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제를 이용하는 게놈 교정
상기 기술된 부위-특이 뉴클레아제와 달리, 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조 반복부 클러스터 (CRISPR)/Cas 시스템은 표적화된 유전적 변경을 유도하기 위한 ZFN 및 TALEN에 대한 대안을 제공한다. 박테리아에서, CRISPR 시스템은 RNA-유도 DNA 절단을 통한 침입 외래 DNA에 대한 후천성 면역을 제공한다.
CRISPR 시스템은 침입 외래 DNA의 서열-특이 침묵화를 위해 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스활성화 키메라 RNA (tracrRNA)에 의존한다. 3가지 유형의 CRISPR/Cas 시스템이 존재한다: II형 시스템에서, Cas9는 crRNA-tracrRNA 표적 인식시 DNA를 절단하는 RNA-유도 DNA 엔도뉴클레아제로서의 역할을 한다. CRISPR RNA 염기는 tracrRNA와 쌍을 형성하여 절단을 위한 상보적인 DNA 부위로 Cas9 엔도뉴클레아제를 유도하는 2-RNA 구조를 형성한다.
CRISPR 시스템은 Cas 엔도뉴클레아제 및 필수 crRNA 성분을 발현하는 플라스미드의 공동 전달에 의해 식물 세포으로 이식될 수 있다. Cas 엔도뉴클레아제는 니카나제로 전환됨으로써 DNA 수복의 기전에 대해 추가로 제어할 수 있다 (문헌 [Cong et al., 2013]).
CRISPR 유전자좌는 최초로 E. 콜라이에서 인식된 다른 부류의 산재되어 있는 짧은 서열 반복부 (SSR)이다 (문헌 [Ishino et al., 1987]; [Nakata et al., 1989]). 유사한 산재되어 있는 SSR이 할로페락스 메디테르라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 아나바에나(Anabaena), 및 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다 (문헌 [Groenen et al., 1993]; [Hoe et al., 1999]; [Masepohl et al., 1996]; [Mojica et al., 1995]).
CRISPR 유전자좌는 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 반복부 (SRSR)로 명명되는 반복부 구조에서 다른 SSR과 상이하다 (문헌 [Janssen et al., 2002]; [ Mojica et al., 2000]). 반복부는 일정한 길이의 독특한 개재 서열에 의해 항상 주기적으로 간격을 띠고 분포하는, 클러스터로 존재하는 짧은 요소이다 (문헌 [Mojica et al., 2000]). 비록 균주들 사이에서 반복부 서열이 고도로 보존되고 있지만, 산재되어 있는 반복부의 개수 및 스페이서 영역의 서열은 균주마다 다르다 (문헌 [van Embden et al., 2000]).
CRISPR 유전자좌의 공통된 구조적 특징은 (i) 주어진 유전자좌 내에 서열 변이를 보이지 않거나, 거의 보이지 않는, 다중의 짧은 직렬 반복주의 존재; (ii) 크기가 유사한 반복부 사이에 비반복적 스페이서 서열의 존재; (iii) 다중 CRISPR 유전자좌를 포함하는 대부분의 종에서 수백개의 염기쌍으로 이루어진 공통 리더 서열의 존재; (iv) 유전자좌 내에 긴 오픈 리딩 프레임의 부재; 및 (v) 하나 이상의 cas 유전자의 존재로서 문헌 [Jansen et al., (2002)]에 기술되어 있다.
CRISPR은 전형적으로 최대 11 bp의 내부 및 말단 역전된 반복부를 함유하는 24-40 bp의 부분적으로 회문구주를 가지는 짧은 서열이다. 비록 단리된 요소가 검출되기는 하였지만, 이는 일반적으로는 독특한 개재 20-58 bp 서열에 의해 이격되어 있는 반복된 단위로 이루어진 (게놈 1개당 최대 약 20개 이상) 클러스터로 배열되어 있다. CRISPR은 일반적으로 주어진 게놈 내에서 균질성이고, 그들 대부분은 동일한 것이다. 그러나, 예를 들어, 고세균에는 불균질성의 예가 존재한다 (문헌 [Mojica et al., 2000]).
본원에서 사용되는 바, "cas 유전자"라는 용어는 일반적으로 측면에 위치하는 CRISPR 유전자좌와 회합식으로 커플링되어 있거나, 또는 그에 인접해 있거나, 그 인근에 위치하는 하나 이상의 cas 유전자를 의미한다. Cas 단백질 패밀리에 관한 종합적인 리뷰는 문헌 [Haft et al. (2005)]에 제시되어 있다. 주어진 CRISPR 유전자좌에서 cas 유전자의 개수는 종마다 다를 수 있다.
실시예
실시예 1. 물질 및 방법
식물 물질
보리 계통 cv 슬루프 (야생형)를 오스트랠리언 윈터 시리얼즈 콜렉션(Australian Winter Cereals Collection) (오스트레일리아 탬워스)로부터 입수하였다. Risø 56 (B-호르데인 발현하지 않음) 및 Risø 1508 (C-호르데인은 발현하지 않고, D- 및 B-호르데인은 감소된 수준으로 발현) (문헌 [Doll, 1973]; [Doll, 1983])은 노르딕 점플라즈마 뱅크(Nordic Germplasm Bank) (스웨덴 알나르프)로부터 입수하였다. Risø 1508은 염색체 5H 상에 C-호르데인의 축적을 감소시킨 lys3a 유전자의 돌연변이를 포함하는 에틸렌이민 유도성 돌연변이체였다. 상기 계통은 각각 공개적으로 이용가능하다. 식물을 낮에는 25℃에서 및 밤에는 20℃에서 온실 조건하에 재배하고, 오염을 검사 결과 배제하는 것으로 나타난 종자를 수확하였다. 맥아 제조 및 양조 실험을 위해, 재배종 슬루프, Risø 56 및 Risø 1508 식물을 CSIRO 기닌데라 엑스페리먼털 스테이션(CSIRO Ginninderra Experimental Station: 캔버라)에 있는 밭에서 나란히 함께 재배하고, 각각 10 kg 곡물을 수확하였다. 표준 기법을 사용하여 곡물의 맥아를 제조하고, 20 L 배치의 맥주를 양조하였다.
곡분으로부터의 프롤라민 추출
프롤라민 (알콜 가용성 단백질)을 추출하기 위해, 표준 기법을 사용하여 곡물을 전립분으로 제분하였다. 수성 세척된 전립분 (10 g) 중의 프롤라민을 65℃에서 45 분동안 인큐베이션시켜 55% (v/v) 프로판-2-올 (HPLC 등급), 2% (w/v) 디티오트레이톨 (DTT)에 용해시키고, -20℃에서 밤새도록 2 부피의 프로판-2-올로 침전시켰다. 침전된 프롤라민을 8 M 우레아, 1% DTT, 25 mM 트리에탄올아민-HCl (pH 6)에 용해시키고, 30 mL 선형 구배 (2 mL/분)의 1% (v/v) 트리플루오로아세트산 (TFA) 중의 3% 내지 60% 아세토니트릴로 용리된 4 mL 리소스(Resource) RPC 칼럼 (GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 오스트레일리아 NSW 시드니)) 상에서 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 의해 정제하였다.
필터-지원 샘플 제조 ( FASP ) 방법
50 ㎕의 호르데인 추출물을 PALL 나노셉(Nanosep) 10 MWCO 필터로 옮겼다. 0.1 M 트리스/HCl (pH 8.5) 중 200 ㎕의 8 M 우레아 (시그마(Sigma)) (UA)를 첨가하고, 혼합물을 약 20℃에서 15 분동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 튜브로부터의 통과액을 폐기하였다. 추가의 200 ㎕의 UA를 필터 유닛에 첨가하고, 15 분동안 14,000 rpm으로 다시 원심분리하였다. 100 ㎕ IAA 용액 (UA 중 0.05 M 요오도아세트아미드)을 첨가하고, 샘플을 써모 믹서에서 약 20℃에서 1 분동안 600 rpm으로 혼합한 후, 20 분동안 혼합하지 않고 인큐베이션시켰다. 100 ㎕의 UA를 필터 유닛에 첨가하고, 15 분동안 14,000 x g로 원심분리하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 물 중 100 ㎕의 0.05 M NH4HCO3 (중탄산암모늄, ABC)을 필터 유닛에 첨가하고, 10 분동안 14,000 x g로 원심분리하였다. 이 단계를 2회 반복하였다. 15 ㎕의 트립신 스톡 (1.5 ㎍/㎕, 시그마)을 포함하는 40 ㎕ ABC를 첨가하고, 각 샘플을 써모 믹서에서 1 분동안 600 rpm으로 혼합하였다. 효소 분해를 위해 필터 유닛을 37℃에서 4 - 18시간동안 습식 챔버에서 인큐베이션시켰다. 필터 유닛을 새 수집관으로 옮기고, 10 분동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 40 ㎕ ABC를 첨가하고, 필터 유닛을 10 분동안 14,000 rpm으로 다시 원심분리하였다. 이 단계를 1회 반복하였다. 15 ㎕의 5% 포름산을 첨가하여 통과액 분획을 산성화시키고, 동결 건조시켰다. 추출되고, 건조된 펩티드를 MRM에 의한 분석을 위해 30 ㎕ 0.5 % 포름산 중에 재현탁시켰다.
맥아즙 및 맥주 제조
보리를 죠 화이트 마이크로몰팅 시스템(Joe White Micromalting System) 중 수개의 800 g짜리 주석 용기에서 맥아 제조하였다. 침지 방법은 17℃에서 8시간동안 침지, 9시간동안 휴지, 5시간동안 침지(슬루프); 17℃에서 8시간동안 침지, 10시간동안 휴지, 17℃에서 5시간동안 침지 (Risø 56); 및 7시간동안 침지, 8시간동안 휴지, 17℃에서 3시간동안 침지 (Risø 1508)를 포함하였다. 슬루프의 경우, 16℃에서, 및 두 호르데인 결실 돌연변이체의 경우에는 15℃에서 94시간동안에 걸쳐 발아가 일어났다. 건조(kiln) 프로그램은 50-80℃에서 21시간동안 진행되었다. 문헌 [Colgrave et al. (2012)]에 상세하게 설명되어 있는 바와 같이 건조된 맥아를 매싱하였다. 명시된 아밀라제 휴지 기간 경과 후, 매시를 비등시키고, 1시간동안 비등시켜 맥아즙을 제조하였다. 비등시키는 동안, 테트낭(Tettnang) 홉으로 비등 맥아즙에 쌉쌀한 맛을 가미하여 21-22 IBU를 달성하였다. 맥아즙을 밤새도록 20℃로 냉각시킨 후, 18-20℃에서 퍼멘티스(Fermentis) US-05 효모로 발효시켜 약 2주 후에는 완성하였다. 여과되지 않은 맥주를 맥주 저장용 작은 통에 넣고, 병에 담기 전 가압식으로 탄산을 포화시켰다.
맥주 분석
문헌 [Colgrave et al. (2012).]의 보충 표 1에 열거된 바와 같이 엄선된 60종의 상업용 맥주를 입수하였다. 각 다른 병 2개로부터 3중의 샘플 (1 mL)을 취하고, 감압하에 탈기시켜 CO2를 제거하였다. 분취량 (100 ㎕)의 탈기된 맥주를 취하고, 60℃에서 30 분동안 N2하에 20 ㎕의 50 mM DTT를 첨가하여 환원시켰다. 상기 용액에 20 ㎕의 100 mM 요오도아세트아미드 (IAM)를 첨가하고, 샘플을 실온에서 15 분동안 인큐베이션시켰다. 각 용액에 5 ㎕의 1 mg/mL 트립신 (시그마) 또는 키모트립신 (시그마)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 분해된 펩티드 용액을 10 ㎕의 5% 포름산을 첨가하여 산성화시키고, 10 kDa MW 필터 (팔(Pall: 오스트레일리아))를 통해 통과시켰다. 여액을 동결 건조시키고, 1% 포름산 중에서 재구성하고, 분석할 때까지 4℃에서 보관하였다.
분해되지 않은 맥아즙 및 맥주 분석
야생형 (슬루프) 보리 및 호르데인 결실 돌연변이체로부터 유래된 맥아즙 및 맥주 (0.1 mL)를 30 분동안 14,000 rpm으로 원심분리하여 10 kDa 분자량 컷 오프 필터 (팔)를 통해 통과시켜 LC-MS/MS 수행이 가능한 펩티드 분획을 수득하였다. 펩티드 분획 (10 ㎕)을 Q스타 엘리트(QStar Elite) 질량 분석계에서 분석하였다.
Q- TOF MS
샘플을 3 ㎕/분의 유속으로 20 분동안에 걸쳐 2-42% 용매 B의 선형 구배를 이용하여 입자 크기가 5 ㎛인 바이닥(Vydac) MS C18 300 Å, 칼럼 (150 mm x 0.3 mm) (그레이스 데이비슨(Grace Davison: 미국 데어필드))을 사용함으로써 시마즈(Shimadzu) 나노 HPLC 시스템 (시마즈 사이언티픽(Shimadzu Scientific: 오스트레일리아 라이댈미어)) 상에서 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이동상은 용매 A (0.1% 포름산) 및 용매 B (0.1% 포름산/90% 아세토니트릴/10% 물)로 구성되었다. Q스타 엘리트 QqTOF 질량 분석계 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 나노-전자분무 이온화 발생원과 함께 표준 MS/MS 데이터 종속형 획득 모드로 사용하였다. 1초동안 관측 MS 스펙트럼을 수집한 후 (m/z 400-1,800), 제조사의 '스마트 엑시트(Smart Exit)'를 사용하여 강도가 가장 큰 모체 이온 3개에 대하여 3회의 MS/MS 측정을 수행하였다 (MS/MS를 위해 10개의 계수/초 역치, 2+ 내지 5+ 전하 상태, 및 m/z 100-1600 질량 범위). 사전에 표적화된 모체 이온은 30초 동안 반복 MS/MS 획득으로부터 배제시켰다 (100 mDa의 질량 허용).
선형 이온 트랩 (삼중 사극자 ) MS
환원되고, 알킬화된 트립신 펩티드를 양이온 모드로 작동하는 터보V(TurboV) 이온화 발생원이 장착된 어플라이드 바이오시스템즈 4000 QTRAP 질량 분석계 (어플라이드 바이오시스템즈: 미국 매사추세츠주 프레이밍햄) 상에서 분석하였다. 샘플을 400 ㎕/분의 유속으로 15 분동안에 걸쳐 5-45% 아세토니트릴 (ACN)의 선형 구배로 페노메넥스 키네텍스(Phenomenex Kinetex) C18 (2.1 mm x 10 cm) 칼럼을 사용함으로써 시마즈 넥세라(Shimadzu Nexera) UHPLC (시마즈)) 상에서 크로마토그래피에 의해 분리하였다. HPLC로부터의 용리제를 질량 분석계에 직접 커플링시켰다. 데이터를 획득하고, 애널리스트(Analyst) 1.5 소프트웨어™를 이용하여 프로세싱하였다. 관측 스캔으로서 질량 범위 350-1,500에 걸친 향상된 MS (EMS) 스캔을 이용하여 정보 종속 획득(Information Dependent Acquisition: IDA) 분석을 수행하고, 탠덤 질량 스펙트럼을 획득할 수 있도록 하였다. 정의된 역치 값 (100,000개의 계수)을 초과한, 전하 상태 2-5의 상위의 두 이온을 선택하고, 먼저 향상된 해상도 (ER) 스캔을 수행한 후, 질량 범위 125-1,600에 걸쳐 향상된 생성물 스캔 (EPI)을 획득하였다.
질량 스펙트럼 분석 및 데이터베이스 검색
단백질 확인을 위해 파라곤 알고리즘(Paragon Algorithm)과 함께 프로테인파일럿(ProteinPilot)™ 4.0 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하였다. 유니프로트 (2011년 5월 버전) 및 NCBI (2011년 5월 버전) 데이터베이스의 트리티세아에 단백질의 인실리코 트립신 또는 키모트립신 분해물에 대하여 탠덤 질량 분석 데이터를 검색하였다. 분해 효소로서 트립신 또는 키모트립신을 이용하면서, 모든 검색 파라미터는 시스테인 알킬화로 변형된 요오도아세트아미드로서 정의하였다. 변형은 126개의 가능한 변형, 예를 들어, 아세틸화, 메틸화 및 인산화로 구성된 것인, 상기 소프트웨어 패키지와 함께 제공되는 "일반 후처리" 및 "생물학적" 변형 세트로 설정하였다. 일반 후처리 변형 세트는 예를 들어, 산화, 탈수 및 탈아미드화와 같이 샘플 처리 결과로서 발생할 수 있는 51개의 잠재적인 변형을 포함한다. 절단이 하나 누락된 펩티드도 분석에 포함되었다.
주문 제작된 시리얼 데이터베이스 구축 및 적용
트리쿰(Triticum), 호르데움, 아베나(Avena), 세칼레(Secale), 및 트리티코세칼레(Triticosecale) 종에 속하는 NCBI, TIGR 진 인디시스(TIGR Gene Indices), 또는 TIGR 플랜트 트랜스크립트 어셈블리즈(TIGR Plant Transcript Assemblies) 중의 뉴클레오티드 엔트리로부터 보고된 모든 단백질 서열을 포함시킴으로써 비중복 주문형 시리얼 종자 저장 단백질 데이터베이스를 구축하였다. 가장 긴 오픈 리딩 프레임만을 유지하도록 트리밍된 6개의 프레임 내에서 상기 종에 대한 뉴클레오티드 서열을 번역시켰다. 이어서, 생성된 단백질 서열 세트를 비중복식으로 만들었다. 모든 변이를 유지하도록 하기 위해 출발점에서부터 종료점까지 100% 매칭되는 서열만을 함께 붕괴시켰다. 마지막으로, 상기 파일을 필터링하여 오직 글루텐, 글리아딘, 글루테닌, 호르데인, 아베닌 또는 세칼린이라는 단어를 포함하는 엔트리만을 보유하도록 하였다. 주문형 시리얼 데이터베이스에 대해 탠덤 질량 분석법 데이터를 검색하였다.
단백질 정렬 및 원형 펩티드 확인
유니프로트 데이터베이스 중의 공지된 모든 호르데인 단백질 및 TIGR 데이터베이스 중의 예측 호르데인 단백질을 정렬하였다. 각 패밀리 (B, C, D 또는 γ) 내에서, 공통 펩티드를 패밀리를 대표하는 것으로 선택하였다. 각 펩티드에 대하여 MRM 전이를 측정하였는데, 여기서, 전구체 이온 (Q1) m/z는 크기 및 예상 전하에 기초하였고, 단편 이온 (Q3) m/z 값은 공지된 단편화 패턴 및/또는 특징 규명 워크플로우에서 수집된 데이터를 이용하여 예측하였다. 예비 분석에서는 최대 6개의 전이가 사용되었고, MRM 전이를 정제하고, 최종 방법에서 사용하기 위해 펩티드당 상위의 두 MRM 전이를 선택하였으며, 상기 최종 방법에서는 강도가 가장 큰 MRM 전이가 정량자로서 사용되었고, 강도가 두번째로 가장 큰 전이는 한정자로서 사용되었다.
MRM 질량 분석법
호르데인 유래 트립신 펩티드 정량화를 위해 MRM 실험을 사용하였다. IDA- 및 MRM-유발 MS/MS 실험, 둘 모두를 위해, 스캔 속도를 1,000 Da/초로 설정하고, 전구체 이온의 크기 및 전하에 의존하는 회전 충돌 에너지를 사용하여 질소 기체가 있는 충돌실에서 펩티드를 단편화하였다. 각 MRM 전이당 120s 검출 윈도우 및 1s 사이클 시간을 이용하여 예정된 MRM 스캐닝 실험을 사용함으로써 호르데인 펩티드 정량화를 달성하였다. 제1 사극자를 사용하여 소위 전구체 이온으로 불리는 분석물의 질량 대 전하 비 (m/z)를 선별하였다. 전구체 이온이 충돌실 (제2 사극자)로 전달되었다. 충돌 유도성 해리 (CID)가 일어났고, 그 결과, 단편 이온이 생성되었으며, 이는 제3 사극자로 전달되었다. 공지된 단편 이온의 m/z 값을 특이적으로 표적화하면서 제2 단계의 집단 선별이 진행된다. 두 집단 선별 단계는 그가 존재하는 사극자를 지칭하는 Q1 및 Q3으로 공지되어 있다. 따라서, Q1에서 Q3으로의 전이가 MRM 전이로서 알려져 있으며, 이는 선택 분석물에 대하여 고도로 특이적이고, 선택성을 띤다.
호르데인의 상대적 정량화
각 펩티드에 대하여 강도가 가장 큰 MRM 전이의 피크 면적을 적분함으로써 각 호르데인에 대한 상대적인 정량화를 수행하였다. (생물학적 복제물을 나타내는) A병 및 B병으로부터의 (다른 날에 진행된) 2개의 복제 주입의 평균을 구하여 평균 피크 면적을 측정하였다. 결과는 글루텐 함유 맥주 모두의 평균 호르데인 함량에 대해 상대적인 값으로서의 각 호르데인 단백질의 비율(%)로서 제시되어 있다.
실시예 2. 보리 곡분 중 호르데인의 특징 규명
알콜 용액으로 가용화시켜 보리 곡분 (야생형 cv 슬루프)으로부터 추출된 호르데인을 실시예 1에 기술된 바와 같이 FPLC에 의해 정제하였다. 정제된 호르데인 분획을 환원시키고, 알킬화시키고, 트립신 또는 키모트립신 분해시켰다. 효소 분해 후, 10 kDa 이하의 분획을 LC-MS/MS에 의해 분석하여 곡분으로부터 정제된 프롤라민 분획 중에 존재하는 호르데인을 확인함으로써 상기 곡분으로부터 양조된 맥주 중에서 발견될 것으로 예측될 수 있는 완전한 호르데인 단백질 세트를 수득하였다. 1%의 오류 발견율 (FDR)을 사용하였을 때, 트립신 분해 후 총 144개의 단백질이 확인되었고, 키모트립신 분해 후 총 55개의 단백질이 확인되었다.
하기 표 1에는 트립신 분해 후 곡분으로부터 검출된 호르데인 단백질 생성물이 열거되어 있다. 검출된 것 중 가장 풍분한 단백질 중에는 앞서 보고된 B3 호르데인 (수탁 번호 P06471, 문헌 [Kristoffersen et al., 2000]), γ-3 호르데인 (P80198, 문헌 [Fasoli et al., 2010]) 및 예측된 γ-1 호르데인 (P17990, 문헌 [Cameron-Mills et al., 1988])이 있다. 유사하게, D-호르데인 (유니프로트: Q84LE9, 문헌 [Gu et al., 2003])이 풍부하게 검출되었다. NCBI 또는 유니프로트 데이터베이스 (표 1)에는 존재하지 않는 2개의 γ-호르데인 및 B1 호르데인을 비롯한, 덜 풍부한 다른 단백질도 검출되었다. 상기 단백질은 번역된 시리얼 단백질을 포함하는 주문 제작된 데이터베이스를 NCBI, TIGR 진 인디시스, 또는 TIGR 플랜트 트랜스크립트 어셈블리즈 중 뉴클레오티드 엔트리로부터 검색함으로써 확인되었다. 예측된 (밀로부터의) γ-글리아딘 및 글루테닌, 및 (밀 및 염소풀(jointed goatgrass)로부터의) 아베닌 유사 단백질-A에 매칭되는 수개의 펩티드가 검출되었다. SDS-PAGE에 의해 단리된 16-17 kDa 단백질 밴드의 트립신 분해로부터 생성된 15 아미노산 펩티드 (QQCCQPLAQISEQAR, 서열번호: 5) 검출에 기초하였을 때, 아베닌 유사 A 단백질이 맥주 중에 존재하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Picariello et al., 2011]). BLASTp 검색에 의해 측정된 바, 펩티드 서열은 동일한 예측 단백질 서열 (유니프로트: F2EGD5)에 매칭되는 추가의 13 아미노산 (aa) 펩티드와 함께, 보리로부터의 단일 단백질 중의 서열에 매칭되었다. 아에길로프스 사일린드리카(Aegilops cylindrica) (염소풀)로부터의 아베닌 유사 A 단백질 (유니프로트: Q2A782)로 지도화되는 11 aa (MVLQTLPSMCR, 서열번호: 6) 펩티드 또한 검출되었다. 번역된 EST 데이터베이스 (TIGR)의 후속 검색을 통해 11 aa 펩티드를 설명하는 H. 불가레 단백질이 밝혀졌다. 예측된 아베닌 유사 단백질-A와 γ-호르데인 단백질 사이의 상동성에 기초하여, 상기의 것이 후속 분석에 포함되었다.
단일 펩티드 확인은 호르데인 분획물 내의 C-호르데인의 존재를 암시하였지만, 공지된 C-호르데인 단백질의 서열 정렬은 상기의 글루타민이 풍분한 단백질 내의 트립신 절단 부위의 부재를 나타내었다. 결과적으로, 호르데인 분획의 키모트립신 분해를 통해 최대 80%이 서열 적용 범위로 C-호르데인이 확인되었고 (하기 표 2), 이는 상기 부류의 호르데인의 특징을 규명하기 위해서는 대안적인 분해 전략법이 요구된다는 것을 강조하는 것이다.
Figure 112016000306000-pct00001
Figure 112016000306000-pct00002
실시예 3. 맥아즙 및 맥주 중 호르데인의 특징 규명
이어서, 양조하는 동안 매싱 공정으로부터 추출된 액체인 맥아즙, 및 맥주에 대한 분석을 수행하였고, 유사한 프롤라민 세트가 확인되었다 (하기 표 3). 맥아즙 중에서는 총 27개의 단백질이 확인되었고, 맥주 중에서는 79개가 확인되었으며, 가장 풍부한 단백질은 비-특이 지질 전달 단백질 1 (LTP1) 및 α-아밀라제 트립신 억제제 (CMd, CMb, CMa)였다. 맥아즙 중에서 확인된 글루텐 단백질로는 앞서 농축 호르데인 분획 중에서 관찰되었던 아베닌 유사 A 단백질 (18 펩티드), γ-호르데인-3 (10 펩티드) 및 D-호르데인 (4 펩티드)을 포함하였다. 그러나, 흥미롭게도, 펩티드의 >50%가 반트립신 분해성인 것으로 (한쪽 단부에서 Lys/Arg 이외의 부위에서 절단된 것으로) 나타났고, 이는 단백질의 상당수의 분해는 양조 공정 동안 발생하였다는 것을 시사하는 것이다. EST 데이터베이스 검색으로부터 확인된 아베닌 유사 A 단백질 (진뱅크 수탁 번호 BE195337)은 >60% 서열 적용 범위 (12 펩티드)인 것으로 검출되었고, 이는 상기 단백질 확인의 신뢰도를 증가시킨다.
C-호르데인 단백질은 맥주에는 뚜렷하게 존재하지 않았지만, 이는 트립신 부위 개수가 적은 것에 기인하여 일어난 위양성이 아니라는 것을 확실하게 하기 위해, 키모트립신 분해를 수행하였고, 이로써 맥주 중에는 C-호르데인이 존재하지 않음을 단언할 수 있었다 (하기 표 3). 가정컨대, C-호르데인의 부재는 그의 수불용성과 관련이 있었다. C-호르데인은 PQQPFPQQ (서열번호: 7)의 컨센서스 서열을 포함하는 다중의 옥타펩티드 반복부로 구성되며, 이로 인해 고도의 불용성을 띠게 된다. 다수의 C-호르데인 분해 생성물이 맥아즙에서 확인되지만, 맥주를 생산하는 양조 및 여과 단계에서는 그대로 유지되지 못하였다.
펩티드 단편의 특징을 규명하기 위해, 맥아즙 및 맥주를 10 kDa 분자량 컷 오프 필터를 통해 통과시키고, 효소 분해하지 않고 분석하였다. 1D-PAGE 분석 결과, 맥주로부터 단백질을 제거하는 데 있어 여과 단계가 효율적인 것으로 나타났다. MS 분석 결과, 수개의 절두된 또는 분해된 호르데인 생성물이 존재하는 것으로 나타났다. 하기 표 4에는 확인된 펩티드 단편이 열거되어 있다. 호르데인 펩티드 이외에도, 세르핀-Z4, 비-특이 지질 전달 단백질 1, α-아밀라제, β-아밀라제, 호르도인돌 (B1, B2) 및 GAPDH를 비롯한, 다수의 보리 단백질로부터 유래된 펩티드가 맥아즙 및 맥주에서 확인되었다 (문헌 [Colgrave et al., 2012]의 표 4 및 보충 표 2에 열거). 흥미롭게도, 맥아즙 중에서 다수의 C-호르데인 단편이 관찰되었고, 맥주에서는 C-호르데인 펩티드가 오직 미량 수준으로만 검출되었다.
효소 분해의 부재하에서 맥주의 특징을 규명함에 따라 무손상 호르데인 이외에도 다수의 부분적으로 분해된 호르데인 단편이 존재하고, 이는 또한 복강독성의 원인이 될 수 있다는 것이 명확하게 입증되었다. 다수의 상기 펩티드 단편은 복강에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 Gln 및 Pro 런(runs)을 함유하였다. 검출된 잠재적인 면역원성 펩티드의 예로는 FVQPQQQPFPLQPHQP (아베닌 유사 A; 진뱅크: TA31086, 서열번호: 8), YPEQPQQPFPWQQPT (γ-1 호르데인; P17990, 서열번호: 9), LERPQQLFPQWQPLPQQPP (γ-3 호르데인; P80198, 서열번호: 10) 및 LIIPQQPQQPFPLQPHQP (C-호르데인; P17991, 서열번호: 11) (여기서, 밑줄로 표시된 서열은 앞서 보고된 (문헌 [Tye-Din et al., 2010]; [Kahlenberg et al., 2006]) 면역원성 펩티드와 높은 상동성을 가지는 것이다)가 있다.
Figure 112016000306000-pct00003
Figure 112016000306000-pct00004
Figure 112016000306000-pct00005
Figure 112016000306000-pct00006
Figure 112016000306000-pct00007
실시예 4. MRM 질량 분석법에 의한 맥주 중 호르데인의 상대적인 정량화
실시예 2 및 3에서의 정제된 호르데인 및 맥주에 관한 프로테옴 특징 규명을 통해서 주요 호르데인 단백질이 보리 중에 존재한다는 것을 설명할 수 있었다. 다중 반응 모니터링 (MRM)은 펩티드 및 단백질의 정량화에 유용한 도구인 것으로 확인되었다. 본 방법에서, 단백질의 트립신 분해 이후, 단백질 분해 단편을 HPLC에 의해 크로마토그래피로 분리시키고, MRM 질량 분석법에 의해 분석하였다. 제1 사극자 (Q1)가 제1 펩티드 m/z 값을 선별하고 (전구체 집단), 상기 이온을 충돌실 (Q2)로 전달하였다. 충돌 유도성 해리가 일어났고, 그 결과, 단백질 분해 단편의 아미노산 서열과 관련된 단편 이온 시리즈가 생성되었다. 이어서, 제3 사극자 (Q3)에서 진단적 단편 이온을 선별하고, 검출기로 전송하여 관심의 대상이 되는 펩티드를 정량화하였다. 전형적으로, 펩티드당 3개의 MRM 전이, 및 적어도 단백질당 2개의 펩티드가 사용되었다.
각 단백질 패밀리로부터 단일 이소폼을 선택하여 선택적으로 육종된 보리 계통으로부터 양조된 맥주의 글루텐 함량을 모니터링하였다 (하기 참조). 정량적 검정법 개발을 위해 다중의 트립신 펩티드 (>2개 펩티드/단백질)를 선택하였다. 상기 펩티드가 발견 실험에서 사전에 검출된 것인 경우, 펩티드 m/z 및 단편 이온 정보를 사용하여 사용하고자 하는 MRM 전이를 결정하였다. 단백질당 최소 2개의 펩티드가 사용될 수 있도록 초기에 확인되지 않은 다수의 펩티드를 MRM 검정법에 포함시켰다. 이러한 경우, 보유 시간은 공지되지 않았고, MRM 전이는 1차 통과 실험에서 계획될 수 없었다. 펩티드 보유 시간을 측정하고, 후속 실험에서는 예정된 MRM 전이를 사용하였다.
MRM 방법의 개발 및 개량을 위해 단일의 엘리트 오스트레일리아의 맥아 제조 보리 ("슬루프")로부터 유래된 맥주를 사용하였는데, 그 이유는 상기의 것은 호르데인 단백질의 완전한 보체를 함유하는 반면, 보리 변이체 (Risø 56 및 Risø 1508)는 B- 및 C-호르데인을 소량 함유하거나, 또는 그를 함유하지 않는 것으로 예상되었기 때문이다. 야생형 및 두 호르데인 돌연변이체 보리 곡물 (Risø 56 및 Risø 1508) 샘플로부터 양조된 맥주를 MRM 분석법을 이용하여 분석하였을 때, 야생형 보리 맥주의 경우, 선별된 8개의 펩티드 (펩티드당 3개의 MRM 전이)가 모두 뚜렷하게 관찰되었다. Risø 56 맥주는 D-호르데인 펩티드의 양이 대략 3배 감소된 것으로 나타났고, B-호르데인 펩티드는 분명 존재하지 않았다. Risø 1508 맥주에서는 각 펩티드의 측정량이 추가로 감소된 것으로 나타난 반면, 미량의 아베닌 유사 A 단백질이 관찰되었다.
단일 재배종 보리 맥주 ("슬루프")를 조사함으로써 분석 방법의 재현가능성에 대해 평가하였다. 첫번째로, 맥주에 대해 다회에 걸쳐 냉동-해동 사이클 (1, 10, 20 또는 50 사이클)을 수행하였고, 심지어 50 사이클 후에도 각 모니터링된 MRM 전이에 대한 피크 면적에 있어서 어떤 유의적인 변화 (변동 계수 (CV) <15%)도 관찰되지 않았다. 두번째로, 6개의 복제물 분해에 의해 분해 효율을 조사하여 CV <15%를 수득하였다. 각 분해물의 4개의 복제물 주입을 수행함으로써 분석적 재현가능성을 평가하였고, CV <15%를 수득하였다. 마지막으로, 호르데인 함량에 있어서 2개의 상이한 맥주 병 사이의 차이를 평가하였고, 이는 <10%인 것으로 나타났다.
상업용 맥주 분석
저글루텐 함유 및 글루텐을 함유하지 않는 것이라는 라벨이 달린 맥주를 포함하는, 엄선된 60종의 상업용 맥주의 글루텐 함량을 분석함으로써 맥주 중의 호르데인을 정량화하는 MRM 방법을 추가로 검증하였다. 별개의 병으로부터 얻은 이중 샘플을 환원, 알킬화, 및 분해에 의해 처리하고 (실시예 1), MRM 질량 분석법에 의해 분석하였다. 도 2에는 슬루프에 대해 상대적인 값으로서의, 상업용 맥주 중의 아베닌 유사 A 단백질 (A), B-호르데인 (B, C), D-호르데인 (D) 및 γ-호르데인 (E)의 상대적인 정량화가 제시되어 있다. 비-글루텐을 함유하지 않은 맥주에 대한 평균값에 대한 상대적인 값으로, 상업용 맥주는 유형 (존재하는 호르데인 패밀리) 및 양 (임의의 주어진 호르데인 단백질에 대한 평균과 비교하였을 때, 1-380%)에 있어 다양한 것으로 관찰되었다. 8개의 맥주 (번호 17, 47, 49, 50, 51, 52, 58 및 60번)는 수수 맥아, 테프, 쌀, 기장 또는 옥수수로부터 양조된 것이기 때문에, 글루텐을 함유하지 않은 것으로 라벨을 붙였다. 상기 시리얼에는 보리 및 밀에 존재하는 글루텐 단백질이 없다. MRM 검정법을 통해 상기 시리얼에는 표적화된 호르데인 단백질 및 호르데인 관련 단백질 (아베닌 유사 A)이 없다는 것을 확인하였다. 17 및 50-52번 맥주는 수수 베이스인 것이고, 47번 맥주는 그의 재료가 명시되지 않았고, 49번 맥주는 기장 베이스인 것이고, 58번 맥주는 수수 맥아, 테프 및 쌀로부터 양조된 것이고, 60번 맥주는 비시리얼 유래 맥주였다. 저글루텐 (<10 ppm)인 것으로 분류된 2개의 맥주 (57 및 59)를 조사하였을 때, 상대적인 호르데인 함량은 시험된 다양한 맥주 간이 평균 호르데인 함량과 다르지 않았다. 57번 맥주는 낮은 아베닌 유사 A 단백질 수준을 보였지만 (평균과 비교하여 ~50%), 놀랍게도 유의적인 수준의, B1-호르데인 (평균과 비교하여 >300%), D-호르데인 (~105%) 및 γ3-호르데인 (~62%)으로부터 유래된 펩티드를 나타내었다. 59번 맥주는 낮지만, 유의적인 수준의, B1-, D- 및 γ-호르데인 (각각 55%, 42% 및 92%), 및 글루텐 함유 맥주에서 관찰된 것과 등가 수준의 아베닌 유사 A 단백질을 나타내었다.
결론
보리로부터 제조된 맥주는 양조 공정에서 사용된 곡물로부터 유래된 글루텐을 함유하였다. 맥주 중의 글루텐 수준은 ELISA를 사용하여 측정할 수 있지만, 현 ELISA 기술을 사용하여 호르데인을 정확하게 측정하는 것과 관련하여 많은 한계가 있다. 상기 실시예에서는, 정제된 호르데인 시료, 맥아즙 및 맥주 중의 완전한 호르데인 세트의 특징을 규명하고, 가장 풍부한 호르데인의 상대적인 정량화를 수행하기 위해 질량 분석 검정법을 개발하였다. 질량 분석법을 이용하는 검정법은 곡분, 맥아즙 및 맥주 중의 호르데인 (글루텐)을 측정하는 데 있어 견실하고 감수성이고, 맥아에 쉽게 적용될 수 있다.
실시예 5. 보리의 Hor3 유전자 중 널 돌연변이 확인
105 kDa의 보리 D-호르데인 폴리펩티드는 염색체 1H의 긴 아암 상의 Hor3 유전자에 의해 코딩된다 (문헌 [Gu et al., 2003]). 에티오피아 R118로 지정된 야생종 보리는 D-호르데인을 축적하지 않는 것으로 확인되었고 (문헌 [Brennan et al., 1998]), 더 존 인네스 센터 퍼블릭 콜렉션(The John Innes Centre Public Collections)의 공개적으로 이용가능한 생식질 수집소로부터 입수하였다 (수탁 번호 3771). 상기 계통은 곡물의 상업적 제조를 위해서는 매우 부적합한 야생종 보리였다.
에티오피아 R118의 곡물을 온실에 파종하였다. 생성된 식물은 2조 및 6조 표현형에 대하여 및 검은색, 유색 종자 및 녹색 종자에 대하여 분리형인 것으로 관찰되었다. 녹색 종자를 생산하는 2조 계통은 선택하여 cv 슬루프와 교배시켰다. D-호르데인 생산에 대해 음성을 띠는 F2 종자 절반부를 선택하였다. 상기 계통의 식물을 야생형 슬루프와 역 교배시키고, D-호르데인에 대하여 널인 F2 식물을 다시 선택하였다. 상기 식물을 슬루프와 역 교배시키고, 자손 식물을 다시 역 교배시켜, 유전적 배경에서 D-호르데인 생산에 대해 음성을 띠며, 슬루프 게놈의 약 87.5%를 가지는 BC2 계통을 제조하였다.
슬루프 BC2, 에티오피아 R118로부터 유래된 D-호르데인 음성 식물 및 야생형 슬루프 각각의 것으로부터 단리된 게놈 DNA로부터 D-호르데인 코딩 유전자를 증폭시켰다. 이는 표준 조건하에 PCR에 의해 이루어졌고, 이를 통해서 일련의 3개의 중복 단편이 생성되었다. 증폭에 사용된 프라이머 쌍은 하기와 같았다:
Figure 112016000306000-pct00008
.
증폭 생성물을 정제하고, 각 뉴클레오티드 서열을 측정하였다. 슬루프로부터 조립된 서열의 길이는 2,838 bp 길이 (서열번호: 72)이고, 에티오피아 R118로부터 유래된 서열의 길이는 2,724 bp 길이 (서열번호: 73)였다. 상기 두 단백질 모두에 대한 예측된 ATG 번역 출발 코돈은 각 서열의 398-400번 위치에 있었다. 슬루프의 경우, 종결 코돈은 747개의 아미노산 잔기로 이루어진 단백질을 코딩하는, 뉴클레오티드 위치 2641-2643에 있었다. 에티오피아 R118로부터의 서열 분석 결과, 슬루프와 비교하였을 때, 프레임내 TAG 종결 코돈을 Hor3 유전자 내로 도입하여 단백질 150번 위치에서 폴리펩티드를 절두시키는 848번 위치 (출발 코돈에 대해 450번 위치)에 C에서 G로의 변이가 존재하는 것으로 밝혀졌다 (도 3). 이는 복강에 대하여 면역원성을 띠는 것으로 확인된 에피토프를 함유하는, 프롤린 및 글루타민이 풍부한 도메인 앞에서 D-호르데인 폴리펩티드를 절두시켰다.
이러한 뉴클레오티드 치환은 재배종 슬루프 중의 야생형 뉴클레오티드 서열에 존재하는 KpnI 부위를 폐기하였고, 공우성 CAPS 마커의 개발을 허용하였다. 상기 목적을 위해, 272 bp의 DNA 단편을 프라이머 5' Dhor-마커 (GGCAATACGAGCAGCAAAC, 서열번호: 66) 및 3' Dhor-마커 (CCTCTGTCCTGGTTGTTGTC, 서열번호: 67)를 사용하여 증폭시켰다 (도 4). 이어서, 증폭 생성물을 제한 효소 KpnI와 함께 인큐베이션시키고, 아가로스 겔 상에서 전기영동시켰다. 야생형 보리 슬루프로부터의 단편을 KpnI에 의해 분해하여 164 bp 및 108 bp인 2개의 단편을 제조하였다. 대조적으로, D 널 에티오피아 R118로부터의 272 bp 단편은 분해되지 않았다. 그러므로, 상기 방법은 D-호르데인을 코딩하는 유전자에 대하여 야생형 및 널 대립유전자를 뚜렷이 구별하였다.
실시예 6. 보리의 Hor2 유전자좌에서의 결실 돌연변이에 대한 분자 마커 확 인
보리 중 염색체 1H의 짧은 아암 상의 Hor2 유전자좌는 각각 크기가 약 36-45 kDa 범위인 B-호르데인을 코딩하는 것인 약 20-30개의 유전자로 이루어진 패밀리를 포함한다 (문헌 [Anderson et al., 2013]). Risø 56은 B-호르데인 유전자를 모두 또는 거의 모두 포함하는 약 86 kb의 결실을 포함하는 감마선 유도 돌연변이이다 (문헌 [Kreis et al., (1983)]). 앞서 문헌 [Tanner et al. (2010)]에 기술된 바와 같이 상기 돌연변이를 사용하여 현저히 감소된 수준으로 총 호르데인을 발현하는 Hor2-lys3a 이중 돌연변이를 생성하였다.
분자 마커를 디자인하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 하기와 같이, 시험하여 야생형 Hor2 유전자좌를 검출하고, 이를 Hor2 결실 유전자좌로부터 구별지었다. 800 bp의 B1 호르데인 PCR 밴드가 존재하지 않는 것은 Hor2 유전자좌의 부재 (결실)를, 즉, Hor2에 돌연변이체 대립유전자가 존재함을 진단하는 도움이 되었다. 증폭에 사용된 프라이머 쌍은 하기와 같았다:
Figure 112016000306000-pct00009
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하기 프라이머 쌍을 사용하여 대조군 PCR 반응 또한 수행하였으며, 이를 통해 감마 호르데인 유전자좌의 존재를 시사하는 것인 450 bp에 특징적인 PCR 밴드가 생성되었으며, 이로써 샘플 DNA의 품질은 Hor2 반응에 충분하였다는 것을 확신할 수 있었다:
Figure 112016000306000-pct00010
.
실시예 7. 삼중 널 보리 돌연변이체 생성
WO2009/021285에서 G1*로서 확인된 Hor2-lys3a 이중 돌연변이체 보리 계통의 F5 식물을 온실에서 재배하여 F6 자손을 생산하였다. 이어서, F6 식물을 밭에서 재배하여 F7 자손을 생산하였다. Hor2-lys3a 돌연변이를 Hor3 널 돌연변이와 조합하기 위해 F7 세대 식물을 에티오피아 R118 (실시예 5)로부터 유래된 D-호르데인 음성 BC2 식물 및 자가 수분된 F1 자손과 교배시켜 F2 종자를 생산하였다. F2 종자를 반으로 잘라 배아 절반부를 발아시키고, 묘목을 실시예 5 및 6에서와 같이 B- 및 D-호르데인 PCR에 의해, 및 감마 호르데인에 대하여 스크리닝하였다. 배유를 포함하는 각 종의 각 종자의 나머지 절반부를 8 M 우레아, 1% DTT를 함유하는 용액 중에서 분쇄하였고, 추출된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 대략 50 kDa의 특징적인 단백질 밴드가 존재하지 않는다는 것은 C-hor 단백질이 존재하지 않는다는 것을 시사한다. 약 300개의 F2 종자로부터 T1, T2, 및 T3으로 지정된 3개의 호르데인 삼중 널이 확인되었다. 멘델의 유전학(Mendelian genetics)에 의해, 각각 동형접합성 상태인 3개의 열성 돌연변이의 조합에 대한 예측 빈도는 1/64였으며, 이로써 Hor2 (B-호르데인) 및 Hor3 (D-호르데인) 유전자좌는 쉽게 재조합될 수 있을 만큼 염색체 1H 상에 충분한 거리를 두고 멀리 떨어져 분리되어 있는 것으로 추정된다.
T1, T2, 및 T3으로 지정된 3개의 돌연변이 (Hor2-lys3a - Hor2) 각각에 대하여 동형접합성인 3개의 식물을 유지시키고, 단일 종자 계통의 최대 3세대를 걸쳐 번식시켜 각 세대에서 가장 무거운 종자 12개를 선별하였다. 상기 계통으로부터 얻은 F3 종자의 평균 종자 중량은 T1, 38.2 mg; T2, 37.0 mg; T3, 39 mg이었다. 계통당종자 수율 (이삭 20기당 종자의 그램) 및 식물 높이를 측정하였다. 충분히 차있지 않은 이삭을 생산한 식물은 폐기하였다. 2개의 F4 계통: T2-4-8 및 T2-6-A5를 선택하고, 밭에서 시험하였다. 이들 중 곡물 수율이 약간 더 우수한 T2-4-8을 선별하고, 보리 ULG3.0으로 지정하였다.
곡물 크기 및 형상 및 곡물 수율 지표와 관련하여 보리 곡물에 대해 중요한 표현형은 메시 크기가 2.8, 2.5, 2.2 및 2.0 mm인 시브, 특히, 2.8 mm 시브를 통과하지 못한 곡물의 비율(%)이다. 곡물 크기가 더 작을수록 야생형 보리와 비교하여 가공 및 맥아 제조 효율은 더 작아진다. 상기 표현형은 "2.8 mm 스크리닝"으로 지칭되며, 이는 특정 시브를 통과하지 못한 곡물의 비율(%)로서 제시된다. 야생형 재배종, 예컨대, 슬루프의 경우, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 전형적으로 95-98%이다. 호르데인 결핍 계통, 예컨대, Hor2-lys3a 이중 돌연변이체 (ULG2.0)의 경우, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 일반적으로 약 53%였다. 종종, 성장 조건, 예컨대, 가뭄에 따라, 상기 파라미터는 10% 미만이었고, 대다수의 곡물이 2.5 mm 시브를 통과할 수 있었다. ULG3.0의 경우, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 약 54%였다. 밭에서 재배된 곡물의 평균 중량 (mg)는 하기와 같았다: 슬루프, 53.6+/-0.9, ULG2.0, 33.5+/-0.4; ULG3.0, 39.1+/-0.3. 그러므로, ULG3.0은 야생형 슬루프 (100%)에 대하여 상대적인 값으로 50%인 ULG2.0과 비교하여 69%의 곡물 수율을 제공하였다. 그러므로, ULG3.0은 ULG2.0 계통과 비교하여 곡물 수율에 있어 실질적인 개선이 이루어졌음을 나타내었다. 그러나, 보리 ULG3.0의 경우, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 여전히 문제로 남았다.
실시예 8. 수율이 증가된 추가의 삼중 널 보리 돌연변이체 생성
ULG3.0 보리 계통이 ULG2.0과 비교하여 곡물 수율을 증가시켰지만, 상기 수율을 추가로 증가시키는 것이 여전히 바람직할 것이다. 이에, ULG3.0 식물을 야생형 재배종 슬루프, 보딘 및 예간과, 및 각 모체 생식질의 50%를 함유하는 것으로 확인된 호르데인 삼중 널 계통 식물과 교배시켰다. 상기 호르데인 삼중 널 계통을 이종 교배시키고, 또한 야생형 재배종 하인드마시 및 코맨더와 교배시켰다. 3개의 널 돌연변이 모두를 포함하는 자손을 2회에 걸쳐 슬루프, 보딘, 하인드마시 및 코맨더 식물 및 단일 종자 계통에 의해 생산된 더욱 큰 동형접합성을 띠는 계통과 역교배시켰다. 생산된 다수의 계통 중 하나의 생성된 계통을 선택하여 보리 ULG3.1로 지정하였다.
슬루프, 예간 및 보딘 식물과의 이종 교배로부터 2회차 이종 교배를 수행하여 각각이 삼중 널 돌연변이를 포함하는 식물로부터 출발하여 3개의 모체 재배종 모두의 유전적 배경을 조합하였다. 이종 교배된 F1 식물로부터의 자손들 모두 3개의 돌연변이 모두를 포함하는 것으로 예측되었다. 계통당 약 1,000개의 F2 종자를 밭에 여러 줄로 심고, 상대적으로 더 짧고, 잘 채워진 이식을 가진, 더 큰 F3 종자를 생산하는 F2 식물을 선별하였다. 조숙 및 만숙 식물, 둘 모두를 선택하였다. 밭에서 재배된 후속 세대에서, 추가로 상대적으로 높은 곡물 아밀라제, 상대적으로 높은 수확 지수 및 이삭 길이, 최적의 높이 (반왜성), 흰가루병에 대한 병해 저항성을 보인 계통을 선별하였다. 1,500개의 패밀리로부터 약 20개의 최상의 계통을 선별하였다. 20개의 최상의 계통에 대한 데이터는 하기 표 5에 제공되어 있다. 개별 종자 중량 (커널 중량)은 41.8 mg/종자인 ULG 3.0의 것에 비하여 개선되었으며, 계통 P12072-2의 경우, 최고 종자 중량은 48.4 mg/종자인 것으로 관찰되었다. 이러한 종자 크기 개선은 40% 초과의, 종자 형성률의 척도인 수확 지수 증가를 동반하였으며, 계통 P12124-1에서 최고 수확 지수는 46.5%인 것으로 측정되었다. 가장 중요하게, 2.8 mm 스크리닝 비율(%)도 ULG3.0의 경우, 53.5%에서 80% 초과로 개선되었으며, 계통 P12140-1의 경우, 97.3%로 높았다.
선택된 한 계통을 단일 종자 세대에 의해 고정시켜 에Hor2-lys3a - Hor3에서 3개의 널 대립유전자에 대해 동형접합성인 식물을 생산하고, ULG3.2로 지정하였다. 밭에서 재배되었을 때, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 슬루프는 약 97%, 하인드마시는 85%, 야생형 재배종 옥스포드는 96%, 및 마라타임은 98%인 것과 비교하여 ULG3.2의 경우, 2.8 mm 스크리닝 파라미터는 수회 반복 실험에서 80-93% 범위였다.
평균 종자 중량 및 두께는 ULG2.0, 33.4 mg, 2.4 mm; ULG3.0, 41.8 mg, 2.5 mm; ULG3.2, 47.2 mg, 2.8 mm였다.
Figure 112016000306000-pct00011
실시예 9. 삼중 널 보리 돌연변이체 중의 호르데인 수준 측정
다중 반응 모니터링 질량 분석법 ( MRM MS)에 의한 ULG3 . 0 곡분의 호르데인 함량 측정
호르데인 함량을 정확하게 측정하기 위해, 하기와 같이 MRM MS 검정법을 사용하였다. 곡물 또는 곡물 절반을 제분하여 전립분으로서 전체 곡물과 동일한 조성을 가지는 곡분을 제조하였다. 55 % (v/v) 이소프로판올 및 2% (w/v) 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 200 ㎕의 용액을 사용하여 20 mg 곡분 샘플로부터 프롤라민 폴리펩티드를 추출하였다. 10 kDa MW 컷 오프 필터 유닛을 이용하여 3회에 걸쳐 원심분리하여 5 mg 곡분과 등가인 분취량의 추출물에 대해 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) 중 8 M 우레아로의 완충제 교환을 수행하였다. 100 ㎕의 50 mM 요오도아세트아미드를 첨가하고, 실온에서 1시간동안 인큐베이션시켜 폴리펩티드 중의 시스테인을 알킬화시켰다. 완충제를 100 ㎕의 50 mM 중탄산암모늄 (pH 8.5)으로 교환하고, 폴리펩티드를 37℃에서 18 시간동안 10 ㎕ (20 ㎍)의 트립신으로 분해하였다. 10 kDa 필터를 통해 여과하여 펩티드를 수집하고, 건조시키고, 30 ㎕의 1% (v/v) 포름산 중에서 재구성하였다. 0.4 mL/분유속으로 10 분동안에 걸쳐 5% B → 40% B 구배로 페노메넥스 칼럼 (키네텍스, 1.7 ㎛, C18, 100 x 2.1 mm)을 이용하여 상에서 액체 크로마토그래피에 의해 펩티드를 분리하였다. 용매 A는 0.1% (v/v) 수성 포름산이고, 용매 B는 0.1% (v/v) 포름산을 함유하는 90% (v/v) 아세토니트릴이었다. HPLC 용리액을 질량 분석계에 직접 커플링시키고, 호르데인 유래 트립신 펩티드를 표적화하는 4000 QTRAP 질량 분석계 상에서 MRM 분석을 수행하였다. (피크 면적 적분을 이용하여) 멀티콴트(MultiQuant) v2.0.2 소프트웨어 및 애널리스트 v1.5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
도 5에는 선택된 B-호르데인, C-호르데인, D-호르데인, 감마-3 호르데인 (G3) 및 감마-1 호르데인 (G1)에 대하여 수득된 데이터가 제시되어 있다. 도 5에는 대조군 보리 (야생형, cv 슬루프), 호르데인 단일 널 계통: Risø 56, Risø 1508 및 에티오피아 R118로부터 유래된 D 널 계통, 호르데인 이중 널 계통 ULG2.0 및 삼중 널 계통 T2-4-8 및 T2-6-A5 (동그라미 표시)로부터의 각 곡물 절반부로부터 유래된 4개의 복제 주입물에 대한, 슬루프에서의 수준 (100%)으로 정규화된 평균 피크 면적이 제시되어 있다. 각 호르데인 패밀리를 나타내는 한 원형 펩티드: 즉, B-호르데인의 경우, TLPTMCSVNVPLYR (서열번호: 48); D-호르데인의 경우, DVSPECRPVALSQVVR (서열번호: 49); C-호르데인의 경우, LPQKPFPVQQPF (서열번호: 50); G3 호르데인의 경우, QQCCQQLANINEQSR (서열번호: 50) 및 G1 호르데인의 경우, CTAIDSIVHAIFMQQGR (서열번호: 51)을 선택하였다. 상기 펩티드는 야생형 보리에 빈번하게, 및 상대적으로 높은 존재비로 출현하였고, 이에 기초하여 선택되었다.
계통 T2-4-8로부터의 삼중 널 ULG3.0 곡물, 및 제2 삼중 널 계통 T2-6-A5는 검출가능한 수준의 B-, C-, D-호르데인, 또는 가장 놀랍게는 감마-1 호르데인을 포함하지 않는 것으로 관찰되었다. 즉, 야생형에 대해 상대적인 양으로 1% 미만의 수준이 관찰되었다. 동일한 방식으로, ULG3.0 곡물에서는 감마-2 호르데인이 검출되지 않았다. 슬루프에서의 G3의 수준과 비교하여 약 20% 수준으로 비교적 낮은 수준의 감마-3 호르데인 (동그라미 표시)이 존재하였다. 감마-3 호르데인은 소수의 호르데인이고; 슬루프의 감마-3 호르데인 함량은 호르데인 총함량의 1%보다 훨씬 더 적다. 단일 널 및 이중 널 곡물은 적절한 호르데인을 축적하지 않았으며, 예컨대, Risø56 및 ULG2.0은 예상대로 B-호르데인을 축적하지 않았고, Risø1508 및 ULG2.0은 예상대로 C-호르데인을 축적하지 않았다. D 널 곡물은 야생형 수준의 B- 및 C-호르데인을 보였지만, D-호르데인을 축적하지는 않았다.
B-호르데인 돌연변이체에서 종결 코돈 위치 다음의 훨씬 후에 존재하는 수개의 상이한 펩티드 서열, 특히, 야생형 D-호르데인 단백질에서 C-말단 방향으로 존재하는 D-호르데인 펩티드 AQQLAAQLPAMCR (서열번호: 85)을 사용하여 반복하여 분석하였을 때, 유사한 결과를 수득하였다 (도 6). 아베닌 유사 A 단백질 또한 곡분에는 존재하지 않았다.
호르데인 삼중 널 T2-4-8 및 T2-6-A5로부터 수득된 곡물은 검출가능한 수준의 B-, C-, D-호르데인 및 선택된 감마-1 (P17990) 및 감마-2 호르데인을 함유하지 않았다는 것은 명백하였다. 삼중 널 돌연변이체 계통은 상응하는 유전자를 전체적으로 침묵화시키는 임의의 돌연변이를 함유한다고 알려져 있지 않은 바, 감마-1 및 감마-2 호르데인에 대한 관찰 결과는 본 발명자들이 가장 예상하지 못했던 결과였다.
MRM에 의해 측정된 바 호르데인 함량이 낮은 ULG3.0 곡물을 하기와 같이 2차원 겔 전기영동 방법에 의해 확인하였다. 각각의 것에 1 ㎍의 랜드마크 폴리펩티드 표준 BSA, 대두 트립신 억제제 및 말 미오글로빈이 첨가된, 각 호르데인 널 계통 T2-4-8 및 T2-6-A5 뿐만 아니라, 대조군 보리 cv Risø 56으로부터의 곡분 추출물로부터 50 ㎍의 알콜 가용성 단백질을 문헌 [Tanner et al. (2013)]에 따라 콜로이달 쿠마시 G250(Colloidal Coomassie G250)으로 염색하고, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 및 kDa (M; 벤치마크 단백질 래더(Benchmark Protein Ladder), 인비트로겐(Invitrogen))의 표준 단백질과 비교하였다. 스폿을 2D 겔로부터 절단하였고, 트립신 펩티드의 질량 분석법에 의해 대조군 Risø 56으로부터 하기 단백질이 확인되었다: C-호르데인, 감마-2 호르데인 (γ2), 감마-3 호르데인 (γ3) 및 감마-1 호르데인 (γ1). 겔에서의 ULG3.0 곡물로부터의 감마-1-, 감마-2, 및 감마-3 호르데인의 예상 위치는 Risø 56 겔과의 비교에 의해 확인하였다. ULG3.0 곡분에서는 오직 감마-3 호르데인만이 관찰된 반면, 나머지 다른 3개의 폴리펩티드는 검출되지 않았다. 각 스폿의 감마-3 호르데인의 농도를 3가지 방법: 1) 50 ㎍의 단백질로부터의 전체 스폿 부피의 비율(%)로서 (ULG3.0 평균 γ3 함량은 13.5±1.6 ppm이었다); 2) 1 ㎍의 BSA의 스폿 강도에 대한 상대적인 값으로서 (ULG3.0 평균 γ3 함량은 10.9±1.3 ppm이었다); 3) 1 ㎍ 의 BSA의 스폿 (강도 x 면적)에 대한 상대적인 값으로서 (ULG3.0 평균 γ3 함량은 3.4±0.41 ppm이었다) 측정하였다
MRM에 의해 측정된 바 호르데인 함량이 낮은 ULG3.0 곡물을 하기와 같이 ELISA 방법에 의해 추가로 확인하였다. 20 mg의 전립분 샘플 또는 곡물 배유 절반부를 파쇄시키고, 96 웰 바이브레이션 밀(Vibration Mill) (레치 게엠베하(Retsch Gmbh: 라이니쉐)) 중에서 3 x 30 초동안 30/초ec로 진탕시켜 0.5 ml의 밀리Q(MilliQ) 수 중에서 3회에 걸쳐 세척하고, 5 분동안 14,000 rpm으로 원심분리시켰다. 대조군 계통 슬루프, Risø56, Risø1508에 대한, 및 ULG2.0, 호르데인 삼중 널 계통 T1, T2, 및 T3, 및 T2-4-8 및 T2-6-A5로부터의 단일 종자 계통 자손에 대한 곡분 중 프롤라민을 0.5 ml의 50% (v/v) 이소프로판올/1% (w/v) DTT로 구성된 알콜 용액으로 추출하였다. 문헌 [Bradford (1976)]에 따라 단백질 농도를 측정하고, 초기 추출물로부터 남아 있는 임의의 DTT를 소광시키기 위해 첨가된 일정 과량의 0.2 mM H2O2와 함께 ELISA 시스템 희석제를 함유하는 용액으로 40 ng (삼중 널 곡물의 경우, 1,900 ng)의 알콜 가용성 단백질을 희석하였다. 희석된 단백질 용액을 ELISA 플레이트 웰 (ELISA시스템즈(ELISASystems: 오스트레일리아 퀸즐랜드 윈저))에 첨가하고, 세척하고, 제조사의 설명서에 따라 37℃에서 15분 동안 현상시켰다. 대조군 추출물 중의 호르데인의 양을 0-50 ng의 슬루프의 총 호르데인인 표준에 대해 보정하였다. 삼중 널의 호르데인의 양을 0-5 ng의 ULG2.0 총 호르데인인 표준에 대해 보정하였다. 슬루프 및 ULG2.0 호르데인은 문헌 [Tanner et al. (2010)]에 기술된 바와 같이 제조하였다.
ELISA 방법에 의해, 이중 널 곡분 샘플의 총 호르데인 함량은 야생형 cv 슬루프에 대한 상대적인 값으로 2.9%인 반면, 2개의 선택된 호르데인 삼중 널 계통, T2-4-8 및 T2-6-A5의 남은 호르데인 함량은 3.9 및 1.5 ug/g (백만분율, ppm; 하기 표 6)이었고, 이 둘 모두는 글루텐 무함유 식품 중 글루텐의 경우, 20 ppm인 FSANZ 제정 수준보다 유의적으로 낮은 수준이고, 야생형 cv 슬루프 곡물 중의 것보다 대략 대략 15,000배 더 낮은 수준이었다.
다중 반응 모니터링 질량 분석법 ( MRM MS)에 의한 ULG3 .0 맥주의 호르데인 함량 측정
실시예 3 및 4에 기술된 방법을 약간 변형하여 사용함으로써 특이 펩티드 서열을 검출하면서, MRM MS에 의해 보리 ULG3.0 곡물로부터 양조된 맥주의 호르데인 함량을 측정하였다. 데이터는 도 7에 제시되어 있다. 검정 결과, 아베닌 유사 A 단백질, B1- 및 B3-호르데인, D-호르데인은 존재하지 않았고, 질량 분석법에서 배경 잡음보다 높은 것으로 검출되지 않았는 바, 감마-1 호르데인 및 감마-3 호르데인은 감소된 수준으로 나타났다 (도 7). 검정 결과 또한 C-호르데인도 존재하지 않는 것으로 나타났다.
Figure 112016000306000-pct00012
MRM MS에 의한 ULG3 .1 및 ULG3 . 2 곡분의 호르데인 함량 측정
ULG3.0 곡물에 대해 기술된 바와 같이 ULG3.1 계통의 곡물 및 ULG3.2에 대한 10개의 후보 계통의 곡물로부터 제분된 곡물의 호르데인 함량을 MRM MS에 의해 측정하였다. 상기 기술된 바와 같이, 곡물 절반부를 곡분으로 제분하고, 20 mg 곡분으로부터의 프롤라민 단백질 (n = 4개의 복제물)을 추출하고, 알킬화하고, 트립신으로 분해하고, MRM MS에 의해 분석하였다. 데이터는, 각각이 ULG3.1 및 043-2 - 148-2로 지정된 이중 모체 이종 교배 계통으로부터 발생된 계통의 곡물 절반부로부터의 것인 각 펩티드에 대한 평균 피크 면적 (3회 MRM 전이의 총합)을 제시하는 도 8에 플롯팅되어 있다. 대조군 보리 (야생형 재배종 슬루프, 보딘, 코맨더 및 하인드마시) 및 삼중 널 계통 T2-4-8과의 비교로 플롯팅되어 있다. 피크 면적은 각 호르데인 패밀리를 대표하고, 유니프로트 수탁 및 아미노산 서열은 하기와 같은 선택된 원형 펩티드에 대해 제시되어 있다:
Figure 112016000306000-pct00013
Figure 112016000306000-pct00014
도 8에 제시된 이중 모체 이종 교배 곡물 중의 D-호르데인 수준은 거의 0에 가까운 값으로, ULG2.0 및 호르데인 삼중 널 계통 T2-4-8 및 T2-6-A5로부터의 곡물 중의 것과 유사하였으며, 이를 통해 D-호르데인이 T2-4-8 및 T2-6-A5 계통으로부터의 곡물 중에서는 검출되지 않았다는 2D PAGE에 의한 관찰 결과를 확인할 수 있었다. 상기의 이중 모체 이종 교배된 곡물 중 감마-1 호르데인의 수준 또한 ULG2.0 및 호르데인 삼중 널 계통 T2-4-8 및 T2-6-A5의 것과 유사하였다. 여러 ULG3.2 계통의 펩티드 APFVGVVTGVGGQ (서열번호: 59)의 수준은 거의 0에 가까웠다. 감마-1 호르데인은 T2-4-8 및 T2-6-A5 계통의 2D PAGE에 의해 검출되지 않았다. 이중 모체 이종 교배 곡물 중의 감마-3 호르데인 수준 또한 ULG2.0 및 호르데인 삼중 널 계통의 것과 유사하였지만, 단, 예외적으로, 계통 124.1 (ULG3.2)의 경우, 그 수중는 매우 낮았다. 감마-3 호르데인은 또한 T2-4-8 및 T2-6-A5 계통의 2D PAGE에 의해 감소된 수준으로 검출되었다.
흥미롭게도, 비록 Hor3 돌연변이 (D-호르데인)는 존재하지 않았지만, ULG2.0에서 D-호르데인 함량을 감소시키는 데 있어 Hor2 및 lys3a 돌연변이의 시너지 효과가 관찰되었다. 유사한 방식으로, 3개의 돌연변이 모두가 존재하는 경우 (Hor2 -lys3a-Hor3), 상기 펩티드에 의해 정의된 바와 같은 감마-1- 및 감마-2 호르데인의 축적을 감소시키는 데 있어 시너지 효과가 있었다.
실시예 10. 외피가 없는 삼중 널 보리 돌연변이체의 생성
선택물 ULG3.0, ULG3.1 및 ULG3.2에 대한 보리 곡물은 모두 외피가 있었는데, 이는 사용한 폐 곡피가 맥아즙 여과 (라우터링)의 최종 단계 동안 여과층을 형성하기 때문에 양조 산업에 유익하다. 그러나, 보리 곡물 외피는 다수의 작은 실리카 이식을 가지는 바, 이에 외피는 인간이 섭취하기 이전에 마피에 의해 제거되어야 한다. 대안적 접근법은 유전적 수단에 의해 외피가 없는 곡물을 제조하는 것이다. 이에, ULG3.0 식물을 발리맥스(Barleymax) II로 지정된 외피가 없는 보리 품종 (WO2011/011833), 및 SSIIa 유전자에 대해 야생형인 것으로 선택된, 외피가 없는, 호르데인 B-, C-, D- 삼중 널 돌연변이체 (Hor2 - lys3a - Hor3) 식물과 교배시켰다.
일부 F6 호르데인 삼중 널 외피가 없는 선택물 (예컨대, A7_1)은 3회의 단일 종자 계통 이후 곡분 중에 총 호르데인을 0.1 ppm 미만으로 함유하였다.
실시예 11. 보리의 돌연변이유발
보리 중 선택된 유전자의 돌연변이체를 단리시키기 위해 문헌 [Caldwell (2004)]에 기술된 바와 같이 에틸메탄술포네이트 (EMS) 돌연변이유발법을 수행하였다. ULG3.0의 대략 45,000개의 (1.5 kg) 곡물을 하기와 같이 돌연변이화시켰다: 곡물을 통기하에 실온에서 4 시간동안 2.5 L 증류수 중에 침지시켰다. 침지시키는 동안 매시간마다 물을 교체해 주었다. 이어서, 종자를 통기하에 실온에서 16 시간동안 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 7) 중 새로 제조된 30 mM EMS 2.5 L 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 종자를 실온에서 10 분동안 2.5 L의 100 mM 소듐 티오술페이트로 세척하였다. 티오술페이트로 세척하는 단계를 반복한 후, 곡물을 통기하에 실온에서 30 분동안 2 x 2L 증류수로 철저히 세정하였다. 종자를 다음날 밭에 심기 전에 기류 유동하에 흡수 여과지 상에서 밤새도록 대기 건조시켰다. 벌크 M2 종자를 수확하고, 풀링하고, 돌연변이체에 대해 분석하였다. 상기 처리 후 돌연변이 빈도는 종자 1,000개당 관심의 대상이 되는 유전자의 돌연변이체는 대략 1개 정도였다. 감마-3 호르데인 특이 단일클론 항체를 이용하여 곡물 절반부에 대해 도트 블롯을 수행함으로써 감마-3 호르데인 발현 손실에 대해 종자를 스크리닝하였고, 수만개의 M2 곡물로부터 음성 신호를 생성한 곡물 40개가 확인되었다. 상기 곡물 중에 감마-3 호르데인이 없는 것은 단일클론 항체를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, 및 특이 펩티드 (서열번호: 58)에 대한 질량 분석법에 의해 확인하였다. 각 음성 곡물로부터의 배아를 포함하는 곡물 절반부를 배지에 심고 발아시켰다. 곡물 절반부 중 대부분에서 배아는 발아되지 못하였지만, 일부는 발아되었다.
실시예 12. 낮은 호르데인 보리로부터의 맥주 제조
포준 방법에 의해 ULG2.0 곡물로부터 제조된 맥아를 이용하여 양조 시험을 수행하고, 대조군 야생형 보리 cv. 게어드너와 비교하였다. 게어드너는 오스트레일리아의 시리얼 배지 지역 전역에 걸쳐 광범위하게 재배되는 고수율의 중간 성숙 내지 만숙의 반왜성 2조 보리 품종이다. 이는 바람직한 조건하에서는 우수한 곡물 크기를 생산하며, 이로써 중간 정도의 추출 수준, 발효성, 및 당화력을 얻을 수 있는 바, 산업 "표준"을 나타내고, 이에 양조 평가 시험에서 대조군으로서 그를 사용하는 것이 이상적이다. ULG2.0으로부터 제조된 맥아는 게어드너 맥아 (5.0%)와 비교하여 수분 함량이 5.7%로 약간 더 높았고, 곡물은 오목형이고, 주름이 있다는 점에서 외관은 게어드너 맥아와 유의적인 차이를 보였다. ULG2.0 맥아의 당화력 (DP)은 54 WK로, 299 WK인 게어드너의 DP보다 훨씬 더 낮았다. 맥아 보리의 DP는 일반적으로 적어도 250 KW이다. 그러나, ULG2.0 맥아는 20 min의 매시 시간 경과 후 전분에 대하여 음성을 띠었고, 1.7° 플라토인 LG 결과를 달성하였다.
맥아를 2-롤러 제분기를 통해 2회 통과시켜 제분하고, 곡물을 만족할 만큼 충분히 크래킹하였다. 맥아는 그의 곡물 형태에 기인하여 6 롤러 제분기에서 더욱 복합적으로 제분하는 데 가장 적합할 것이다. 별법으로, 맥아즙 분리를 위해서는 여과조보다는 매시 필터가 결합된 해머 제분기가 사용될 수 있다. 추가의 스파징용 리큐어를 첨가하면서, 제분된 생성물을 초기 온도 65℃에서 20 분동안, 이어서, 74℃에서 5 분동안 표준 방법에 의해 매시하였다. 전반적으로, 주름이 있는 ULG2.0 맥아의 형태로 인해 일반 맥아와 비교하였을 때, 만족할 만큼 충분히 제분하고 매시하기는 어려웠다. 이어서, 매시된 생성물을 라우터링하였고, 이 경우에도 주름이 있는 ULG2.0 맥아의 형태로 인해 수행하기 어려웠다. 채널링시 라우터링 층은 부서졌고, 이에 유출을 중단시켜야 했고, 라우터링 층을 다시 레이킹(re-raked)하였다. 비효율적인 제분으로 인해 라우터링 공정 동안 상당량의 잠재 추출물이 손실되었고, 표적이 14° 플라토를 달성하는 것일 때, 상기는 모두 10.96° 및 11.12° 플라토인 케틀 값을 달성하였다. pH, EBC 색상 및 베타-글루칸 수준은 허용가능한 것이었다. 제분에 결함이 있다는 것은 또한 필터 매체로서의 역할을 하는 곡피 층이 효율적으로 형성되지 못하였다는 것을 의미하며, 이는 예측 추출물을 감소시키는 원인이 된다. 맥아즙 투명도는 30 L의 유출에 의해 허용가능할 정도로 개선되었지만, 유출액의 투명도는 초기에는 층 형성이 충분히 이루어지지 않았기 ‹š문에 매우 혼탁하였다.
생성된 맥아즙을 8.5℃에서 120 시간동안 효모 균주 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum A)으로 발효시켰다. 발효 프로파일은 정상적이었고, 비록 심지어는 발효 그래비티 종점에의 도달 후 연장된 디아세틸 휴지기가 이어진 후에도 상당 수준의 디아세틸이 여전히 남아 있었지만, 발효 출발시 연장된 유도기는 없었다. 디아세틸 휴지는 맥주를 0℃로 냉각시키기 이전에 효모가 디아세틸을 재흡수하고, 대사시킬 수 있도록 보다 고온의 발효 온도에 맥주를 그대로 남겨둠으로써 이루어진다. 일반적으로, 효소 시간을 통해 생성물을 분해시킬 수 있도록 하기 위해서는 발효 종료시 24시간이 소요된다. 두 ULG2.0 시험 브루, 둘 모두에서는 일어나지 않았다. 이성질화된 홉 추출물을 30 mg/L로 첨가하고, 실리카 하이드로겔(Silica Hydrogel)을 첨가하여 리큐어를 정화시켰다. 가공 공정 처리가 완료된 브라이트 맥주의 물리적 안정성은 대조군 브루보다 더 낮았다. 초기 칠리 헤이즈는 높은 것으로 간주되었고, 강제 칠리 헤이즈 결과는 정규 규격 범위 밖이었다. 그러나, 칠리 헤이즈는 미립자를 형성하지는 않았다.
숙련된 맥주 양조업자에 의해 가공 공정 처리가 완료된 맥주에 대하여 관능 분석을 수행하였고, 제분 및 라우터링 공정에 있어 난관이 있기는 하였지만, 맥아의 양조 성능과 관련된 그 문제들을 고려해 볼 때, 결과는 놀랍게도 우수하였다. DMS (디메틸 술피드)는 두드러진 풍미를 나타내는 것이었다; 그러나, 이는 불쾌한 것으로 나타나지는 않았다. DMS가 존재하는 것은 대개 오스트레일리아 맥주에서는 풍미에 결함이 있는 것으로 간주되지만, 일반적으로는 유럽에서는, 특히 독일 맥주에서는 충분히 허용되는 것이다. ULG2.0 맥주는 대조군 맥주와 너무 많이 다르지 않았고, 맥주만큼 목 넘김이 매우 좋았고, 독일 맥주를 연상시켰다는 맥주 양조업자의 평가가 있었다. "글루텐 무함유"로 시판된 상업용 맥주를 대표할 수 있는 것과 같이, ULG2.0 맥주의 경우, 명백한 "곡물향의" 또는 "시리얼" 타입의 풍미는 없었고, 깔깔한 맛 또는 떫은 맛도 없었다. 전반적으로, 풍미 프로파일은 허용가능하고, 적정하였다.
ULG2.0과 동일한 방법에 의해 ULG3.0의 보리 곡물로부터 맥주를 제조하고, ULG3.2의 보리 곡물로부터 맥주를 제조하였다. 대개는 곡물에 주름이 더 적게 존재하였기 때문에 제분 단계가 개선되었는 바, ULG3.0 곡물의 맥아 제조는 ULG3.0 곡물에 비하여 개선되었다. ULG3.0으로부터 제조된 맥주는 허용가능하고, 적정한 풍미를 가진 우수한 품질의 것이었다. ULG3.2로부터의 곡물의 개선된 곡물 형태 (크기 및 형상)를 통해 양조 공정에서 제분 및 라우터링은 더욱 용이하게 수행할 수 있으며, 이로써 총 호르데인이 1 ppm 미만인 맥주를 제조할 수 있다.
실시예 13. ULG 보리를 이용한 식품 제조
ULG3.0 및 ULG3.2 보리 계통을 이용하여 소규모 (10 g) 빵 2개를 베이킹하였다. 시험 목적으로 소규모로 빵 덩어리를 베이킹하였지만, 본 방법은 상업적인 양으로 쉽게 규모를 확장시킬 수 있다. 빵 하나는 곡분 성분으로서 상기 기술된 바와 같이 제분된 100% ULG 보리 곡분을 이용하여 제조한 반면, 두번째 빵은 곡분 성분으로서 30% 곡분과, 70% 시판용 비글루텐 곡분, 예컨대, 미분의 블렌드를 이용하여 제조하였다. 35 g 믹소그래프에서 최대 도우 발생 시점까지 곡분 (13.02 g) 및 다른 성분을 혼합하여 도우를 만들었다. 각 경우에 13.02 g의 곡분에 기초하여 사용된 레시피는 하기와 같았다: 곡분 100%, 염 2%, 건조 효모 1.5%, 식물성 오일 2%, 및 개량제 1.5%. 물 첨가 수준은 전체 제법에 맞게 조정되는 마이크로 Z-아암 수분 흡수 값에 기초하였다. 40℃ 및 85%의 실내 습도에서 2단계식 가공 단계로 몰딩 및 패닝을 수행하였다. 베이킹은 190℃에서 14 분동안 로텔(Rotel) 오븐에서 수행하였다.
빵은 20 ppm 미만의 함량으로 글루텐을 포함하였고, 이는 CD를 앓는 대상체인 인간이 섭취하기에 적합하였다.
광범위하게 기술된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범주로부터 벗어남 없이 구체적인 실시양태에 제시된 바와 같이 본 발명에 대하여 다수의 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 그러므로, 본 실시양태는 모든 면에서 예시적이고, 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.
본 출원은 2013년 6월 13일 출원된 AU 2013902140 및 2013년 7월 11일 출원된 AU 2013902565로부터 우선권을 주장하며, 상기 두 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본원에 논의되고/거나, 참조된 모든 공개 문헌은 그 전문이 본원에 포함된다.
본 명세서에 포함된 서류, 행위, 물질, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 오직 본 발명에 대한 배경을 제공하기 위한 것이다. 이들 자료 모두가 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 것으로서 종래 기술 토대의 부분을 형성하거나 본 발명과 관련된 분야의 통상적인 일반 지식임을 인정하는 것으로서 간주해서는 안된다.
참고 문헌
Figure 112016000306000-pct00015
Figure 112016000306000-pct00016
Figure 112016000306000-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Grains Research and Development Corporation <120> Barley with very low levels of hordeins <130> IPA151287-AU <150> AU 2013902140 <151> 2013-06-13 <150> AU 2013902565 <151> 2013-07-11 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 1 Glu Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 2 Glu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Glu Gln Pro Phe Pro Trp Gln Pro 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 3 Glu Pro Glu Gln Pro Ile Pro Glu Gln Pro Gln Pro Tyr Pro Gln Gln 1 5 10 15 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 4 Gln Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ser <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 5 Gln Gln Cys Cys Gln Pro Leu Ala Gln Ile Ser Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 6 Met Val Leu Gln Thr Leu Pro Ser Met Cys Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 7 Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 8 Phe Val Gln Pro Gln Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro His Gln Pro 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 9 Tyr Pro Glu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Trp Gln Gln Pro Thr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 10 Leu Glu Arg Pro Gln Gln Leu Phe Pro Gln Trp Gln Pro Leu Pro Gln 1 5 10 15 Gln Pro Pro <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 11 Leu Ile Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro His 1 5 10 15 Gln Pro <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 12 Gln Gln Pro Phe Pro 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 13 Gln Gln Gln Phe Pro 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 14 Leu Gln Pro Phe Pro 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Secale cereale <400> 15 Gln Leu Pro Phe Pro 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 16 Arg Val Val Asp Gln Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 17 Val Val Asp Gln Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 18 Val Val Asp Gln Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 19 Val Val Asp Gln Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 20 Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 21 Gln Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 22 Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 23 Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 24 Leu Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 25 Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 26 Val Gly Gln Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> HexNAc <400> 27 Gln Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Met Cys Arg Leu Glu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 28 Val Val Arg Gln Tyr Glu Gln Gln Thr Glu Val Pro Ser Lys Gly Gly 1 5 10 15 Ser Phe Tyr Pro Gly Gly Thr Ala Pro Pro 20 25 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 29 Phe Val Leu Pro Gln Gln Gln Ala Gln Phe Lys Val Val Gly Ser 1 5 10 15 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 30 Phe Val Leu Pro Gln Gln Gln Ala Gln Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 31 Ala Ile Val Met Gln Gln Gln Val Gln Gln Gln Val Gly His Gly Phe 1 5 10 15 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 32 Leu Glu Arg Pro Gln Gln Leu Phe Pro Gln Trp Gln Pro Leu Pro Gln 1 5 10 15 Gln Pro Pro <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 33 Leu Phe Pro Gln Trp Gln Pro Leu Pro Gln Gln Pro Pro 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 34 Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Met Pro Ile Gln Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 35 Val Val Gly Ser Leu Val Ile Gln Thr 1 5 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 36 Leu Gln Gln Pro Gln His Gln Phe Pro Gln Pro Thr Gln Gln Phe Pro 1 5 10 15 Gln Arg Pro <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 37 Tyr Pro Glu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Trp Gln Gln Pro Thr 1 5 10 15 <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 38 Gly Val Val Gln Pro Gln Gln Leu Ala Gln Met Glu 1 5 10 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Pyroglutamic acid <400> 39 Gln Pro Gln His Gln Phe Pro Gln Pro Thr Gln Gln Phe Pro Gln Arg 1 5 10 15 Pro <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 40 Phe Val Gln Pro Gln Gln Gln Val Pro Val Glu Ile Thr Arg 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 41 Phe Val Gln Pro Gln Gln Gln Val Pro Val Glu Ile 1 5 10 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 42 Leu Ile Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro His 1 5 10 15 Gln Pro <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 43 Ile Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro His Gln 1 5 10 15 Pro <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 44 Val Gln Val Gln Ile Pro Phe Val His Pro Ser Ile 1 5 10 <210> 45 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 45 Ser Phe Gly Gln Pro Gln Gln Gln Val Pro Val Glu Val Met Arg 1 5 10 15 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 46 Ile Ile Pro Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro Gln Pro Phe Pro Gln 1 5 10 15 Gln Pro Gln Gln Pro Leu Pro Gln Pro Gln Gln Pro 20 25 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> dansyl-glutamic acid (DEA) <400> 47 Ile Pro Leu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln Pro Pro 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 48 Thr Leu Pro Thr Met Cys Ser Val Asn Val Pro Leu Tyr Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 16 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 49 Asp Val Ser Pro Glu Cys Arg Pro Val Ala Leu Ser Gln Val Val Arg 1 5 10 15 <210> 50 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 50 Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asn Ile Asn Glu Gln Ser Arg 1 5 10 15 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 51 Cys Thr Ala Ile Asp Ser Ile Val His Ala Ile Phe Met Gln Gln Gly 1 5 10 15 Arg <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 52 Gln Gln Cys Cys Gln Pro Leu Ala Gln Ile Ser Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 53 Val Phe Leu Gln Gln Gln Cys Ser Pro Val Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 54 Val Phe Leu Gln Gln Gln Cys Ser Pro Val Pro Met Pro Gln Arg 1 5 10 15 <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 55 Gln Leu Asn Pro Ser His Gln Glu Leu Gln Ser Pro Gln Gln Pro Phe 1 5 10 15 Leu Lys <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 56 Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 57 Ala Pro Phe Val Gly Val Val Thr Gly Val Gly Gly Gln 1 5 10 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 58 Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asn Ile Asn Glu Gln Ser Arg 1 5 10 15 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 59 Ala Pro Phe Val Gly Val Val Thr Gly Val Gly Gly Gln 1 5 10 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 60 gacacatatt ctgccaaaac ccc 23 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 61 acgagggcga cgattaccgc 20 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 62 gagatcaatt cattgacagt ccacc 25 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 63 cttgtcctga ctgctgcgga gaaa 24 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 64 gcaacaagga cactacccaa gtatg 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 65 gctgacaatg agctgagaca tgtag 25 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 66 ggcaatacga gcagcaaac 19 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 67 cctctgtcct ggttgttgtc 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 68 tcgcaggatc ctgtacaacg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 69 caacaatgaa gaccttcctc 20 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 70 cgagaaggta ccattactcc ag 22 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 71 agtaacaatg aaggtccatc g 21 <210> 72 <211> 2838 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 72 gacacatatt ctgccaaaac cccagaacaa taatcacttc tcgtagatga agagaacaga 60 ccaagataca aacgtccacg cttcagcaaa cagtacccca gaactaggat taagccgatt 120 acgcggcttt agcagaccgt ccaaaaaaac tgttttgcaa agctccaatt cctccttgct 180 tatccaattt cttttgtgtt ggcaaactgc acttgtccaa ccgattttgt tcttcccgtg 240 tttcttctta ggctaactaa cacagccgtg cacatagcca tggtccggaa tcttcacctc 300 gtccctataa aagcccagcc aatctccaca atctcatcat caccgagaac accgagaacc 360 acaaaactag agatcaattc attgacagtc caccgagatg gctaagcggc tggtcctctt 420 tgtggcggta atcgtcgccc tcgtggctct caccaccgct gaacgtgaga tcaatgggaa 480 caacattttc cttgatagcc gctctaggca gctacagtgt gagcgcgagc tccaggagag 540 ctcgctcgag gcgtgccggc gggtcgtgga ccaacagctg gttggccagc tgccatggag 600 cacggggctc cagatgcagt gctgccagca gcttcgggac gtcagccccg agtgccgccc 660 cgtcgccctc agccaggtcg tgaggcaata cgagcagcaa accgaggtgc catccaaggg 720 aggatccttc tacccgggcg ggaccgcacc gccgctgcag caaggaggat ggtggggaac 780 ctctgtaaaa tggtactacc cagaccaaac ttcttcgcaa cagtcatggc aagggcaaca 840 agggtaccac caaagcgtaa cttcttccca gcagccagga caagggcagc aagggtccta 900 cccaggttca actttcccgc agcagccagg acaaggacaa caaccaggac agaggcagcc 960 atggtcctat ccaagtgcaa ctttcccaca acagccaggg caagggcaag ggcaacaagg 1020 gtactaccca ggcgcaactt ccctgctgca gccaggacaa gggcaacaag ggccctacca 1080 gagtgcaact tctccacagc agccaggaca aggacaggga caccaagaga cctatcaatt 1140 tgcaacttcc ccgcatcagc caggacaatg gcaacaacca ggacaagggc aacaagggta 1200 ctacccaagt gtaacttctc cacaacagtc gggacaaggg caaacagggt acccaagtac 1260 aacttctcca caacaatcgg ggcaagggca acagctggga caagggcaac aaccaggaca 1320 agggcaacaa gggtacccaa gtgcaacttt tccacaacag ccaggacaat ggcaacaagg 1380 gtcctaccca agtacaactt ctccgcagca gtcaggacaa gggcaacaag ggtacaaccc 1440 aagtggaact tctacgcagc agccgggaca agtgcaacag ttgggacaag ggcaacaagg 1500 gtactaccca attgcaactt ctccgcagca gccaggacaa gggcaacagc taggacaagg 1560 gcaacaacca ggacatgggc aacagctagt gcaagggcaa caacaaggac aagggcaaca 1620 aggacactac ccaagtatga cttctccgca ccaaacagga caagggcaaa aaggatacta 1680 cccaagtgca atttctccgc agcagtcagg acaaggacaa caaggatacc agcctagtgg 1740 agcttcttca caggggtcgg tgcaaggggc gtgccagcac agcacatctt ctccgcagca 1800 gcaagcacaa gggtgccaag cttcttcacc aaagcaaggg ctagggtcgt tgtactaccc 1860 gagtggagct tatacacaac agaaaccagg gcaagggtac aacccaggtg gaacttctcc 1920 gctgcaccag caagggggag ggttcggcgg cgggttaacg acggagcaac cgcagggagg 1980 aaagcagcca ttccattgcc agcaaaccac tgtctcccct caccagggtc agcaaaccac 2040 tgtttcccct catcagggtc agcaaaccac tgtctcccct catcagggtc agcaaaccac 2100 tgtctcccct caccagggtc agcaaaccac cgtctcccct caccagggtc agcaaaccac 2160 cgtctcccct catcagggtc agcaaaccac tgtctcccct catccgggtc agcaaaccac 2220 tgtctcccct catcagggtc agcaaaccac tgtctcccct catccgggtc agcaaaccac 2280 tgtctcccct catcagggtc agcaaaccac tgtctcccct catcagggtc agcaaaccac 2340 cgtctcccct catcagggtc agcaaaccac cgtctcccct catcagggtc agcaaaccac 2400 cgtctcccct catcagggtc agcagcccgg cgagcagcct tgcggtttcc ctggccagca 2460 aaccaccgtg tctctgcacc atggtcagca gtccaacgag ttgtactacg gcagcccata 2520 ccatgttagc gtggagcagc cgtcggccag cctaaaggta gcaaaggcgc agcagctcgc 2580 ggcgcagctg ccggcaatgt gtcggctgga gggcggcggc ggcctgttgg ccagccagta 2640 gtagaactct ggcagctcgc atggtgcttg ggcatgcatg catcttagct atacaataaa 2700 cgtgacgtgt gcttgcagtt tttcatgtaa ctagggtaaa acccaacaat aatgcaaaac 2760 ggaaagcttc tccatccaaa aaaagaacaa aactggtgct atatatagta tgcgctacat 2820 gtctcagctc attgtcag 2838 <210> 73 <211> 2724 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 73 gacacatatt ctgccaaaac cccagaacaa taatcacttc tcgtagatga agagaacaga 60 ccaagataca aacgtccacg cttcagcaaa cagtacccca gaactaggat taagccgatt 120 acgcggcttt agcagaccgt ccaaaaaaac tgttttgcaa agctccaatt cctccttgct 180 tatccaattt cttttgtgtt ggcaaactgc acttctccaa ccgattttgt tcttcccatg 240 tttcttctta ggctaactaa cacagccgtg cacatagcca tggtccggaa ccttcacctc 300 gtccctataa aagcccagcc aatctccaca atctcatcat caccgagaac accgagaacc 360 acaaaactag agatcaattc attgacagtc caccgagatg gctaagcggc tggtcctctt 420 tgtggcggta atcgtcgccc tcgtggctct caccaccgct gaacctgaga tcaatgggaa 480 caacattttc cttgatagcc gctctgggca gctacagtgt gagcgcgagc tccaggagag 540 ctcgctcgag gcgtgccggc gggtcgtgga ccaacagctg gttggccagc tgccatggag 600 cacggggctc cagatgcagt gctgccagca gcttcgggac gtcagccccg agtgccgccc 660 cgtcgccctc agccaggtcg tgaggcaata cgagcagcaa accgaggtgc catccaaggg 720 aggatccttc tacccgggcg ggaccgcacc gccgctgcag caaggaggat ggtggggaac 780 ctctgtaaaa tggtactacc cagaccaaac ttcttcgcaa cagtcatggc aagggcaaca 840 agggtagcac caaagcgtaa cttcttccca gcagccagga caagggcagc aagggtccta 900 cccaggttca actttcccgc agcagccagg acaaggacaa caaccaggac agaggcagcc 960 atggtcctat ccaagtgcaa ctttcccaca acagccaggg caagggcaag ggcaagggca 1020 acaagggtac tacccaggcg caacttccct gctgcagcca ggacaagggc aacaagggcc 1080 ctaccaaagt gcaacttctc cacagcagcc aggacaagga cagggacaac aagagcccta 1140 tccaattgca acttccccgc atcagccagg acaatggcaa caaccaggac aagggcaaca 1200 agggtactac ccaagtgtaa cttctccaca acagtcggga caagggcaac aagggtaccc 1260 aagtacaact tctccacaac aatcggggca agggcaacag ctgggacaag ggcaacaacc 1320 aggacaaggg caacaagggt acccaagtgc aacttttcca caacagccag gacaatggca 1380 acaagggtcc tacccaagta caacttctcc gcagcagtca ggacaagggc aacaagggta 1440 caacccaagt ggaacttcta cgcagcagcc gggacaagtg caacagttgg gacaagggca 1500 acaagggtac tacccaattg caacttctcc gcagcagcca ggacaagggc aacagctagg 1560 acaagggcaa caaccaggac atgggcaaca gctagtgcaa gggcaacaac aaggacaagg 1620 gcaacaagga cactacccaa gtatgacttc tccgcaccaa acaggacaag ggcaaaaagg 1680 atactaccca agtgcaattt ctccgcagca gtcaggacaa ggacaacaag gataccagcc 1740 tagtggagct tcttcacagg ggtcggtgca aggggcgtac cagcacagca catcttctcc 1800 gcagcagcaa gcacaagggt gccaagcttc ttcaccaaag caagggctag ggtcgttgta 1860 ctacccgagt ggagcttata cacaacagaa accagggcaa gggtacaacc caggtggaac 1920 ttctccgctg caccagcaag ggggagggtt cggcggcggg ttaacgacgg agcaaccgca 1980 gggaggaaag cagccattcc attgccagca aaccactgtc tcccctcacc agggtcagca 2040 aaccactgtc tcccctcatc agggtcagca aaccactgtc tcccctcatc agggtcagca 2100 aaccactgtc tcccctcacc agggtcagca aaccactgtc tcccctcatc cgggtcagca 2160 aaccactgtc tcccctcatc agggtcagca aaccactgtc tcccctcatc cgggtcagca 2220 aaccaccgtc tcccctcatc agggtcagca aaccaccgtc tcccctcatc agggtcagca 2280 aaccaccgtc tcccctcacc agggtcagca gcccggcgag cagccttgcg gtttccctgg 2340 ccagcaaacc accgtgtctc tgcaccatgg tcagcagtcc aacgagttgt actacggcag 2400 cccataccat gttagcgtgg agcagccgtc ggccagccta aaggtagcaa aggcgcagca 2460 gctcgcggca cagctgccgg caatgtgtcg gctggagggc ggcggcggcc tgttggccag 2520 ccagtagtag aactctggca gctcgcatgg tgcttgggca tgcatgcacc ttagctatac 2580 aataaacgtg acgtgtgctt gcagtttttc atgtaactag ggtaaaaccc aacaataatg 2640 caaaacggaa agcttctcca tccaaaaaaa gaacaaaact ggtgctatat atagtatgcg 2700 ctacatgtct cagctcattg tcag 2724 <210> 74 <211> 747 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 74 Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Ile Val Ala Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile Asn Gly Asn Asn Ile Phe Leu 20 25 30 Asp Ser Arg Ser Arg Gln Leu Gln Cys Glu Arg Glu Leu Gln Glu Ser 35 40 45 Ser Leu Glu Ala Cys Arg Arg Val Val Asp Gln Gln Leu Val Gly Gln 50 55 60 Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Gln Cys Cys Gln Gln Leu Arg 65 70 75 80 Asp Val Ser Pro Glu Cys Arg Pro Val Ala Leu Ser Gln Val Val Arg 85 90 95 Gln Tyr Glu Gln Gln Thr Glu Val Pro Ser Lys Gly Gly Ser Phe Tyr 100 105 110 Pro Gly Gly Thr Ala Pro Pro Leu Gln Gln Gly Gly Trp Trp Gly Thr 115 120 125 Ser Val Lys Trp Tyr Tyr Pro Asp Gln Thr Ser Ser Gln Gln Ser Trp 130 135 140 Gln Gly Gln Gln Gly Tyr His Gln Ser Val Thr Ser Ser Gln Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gln Gly Gln Gln Gly Ser Tyr Pro Gly Ser Thr Phe Pro Gln Gln 165 170 175 Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Pro Trp Ser Tyr Pro 180 185 190 Ser Ala Thr Phe 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Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ser Met Thr Ser 405 410 415 Pro His Gln Thr Gly Gln Gly Gln Lys Gly Tyr Tyr Pro Ser Ala Ile 420 425 430 Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Gln Pro Ser Gly 435 440 445 Ala Ser Ser Gln Gly Ser Val Gln Gly Ala Cys Gln His Ser Thr Ser 450 455 460 Ser Pro Gln Gln Gln Ala Gln Gly Cys Gln Ala Ser Ser Pro Lys Gln 465 470 475 480 Gly Leu Gly Ser Leu Tyr Tyr Pro Ser Gly Ala Tyr Thr Gln Gln Lys 485 490 495 Pro Gly Gln Gly Tyr Asn Pro Gly Gly Thr Ser Pro Leu His Gln Gln 500 505 510 Gly Gly Gly Phe Gly Gly Gly Leu Thr Thr Glu Gln Pro Gln Gly Gly 515 520 525 Lys Gln Pro Phe His Cys Gln Gln Thr Thr Val Ser Pro His Gln Gly 530 535 540 Gln Gln Thr Thr Val Ser Pro His Gln Gly Gln Gln Thr Thr Val Ser 545 550 555 560 Pro His Gln Gly Gln Gln Thr Thr Val Ser Pro His Gln Gly Gln Gln 565 570 575 Thr Thr Val Ser Pro His Gln Gly Gln Gln Thr Thr Val Ser Pro His 580 585 590 Gln Gly Gln Gln Thr Thr Val Ser Pro His Pro Gly Gln Gln Thr Thr 595 600 605 Val Ser Pro His Gln 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taacttcttc ccagcagcca 480 ggacaagggc agcaagggtc ctacccaggt tcaactttcc cgcagcagcc aggacaagga 540 caacaaccag gacagaggca gccatggtcc tatccaagtg caactttccc acaacagcca 600 gggcaagggc aagggcaaca agggtactac ccaggcgcaa cttccctgct gcagccagga 660 caagggcaac aagggcccta ccagagtgca acttctccac agcagccagg acaaggacag 720 ggacaccaag agacctatca atttgcaact tccccgcatc agccaggaca atggcaacaa 780 ccaggacaag ggcaacaagg gtactaccca agtgtaactt ctccacaaca gtcgggacaa 840 gggcaaacag ggtacccaag tacaacttct ccacaacaat cggggcaagg gcaacagctg 900 ggacaagggc aacaaccagg acaagggcaa caagggtacc caagtgcaac ttttccacaa 960 cagccaggac aatggcaaca agggtcctac ccaagtacaa cttctccgca gcagtcagga 1020 caagggcaac aagggtacaa cccaagtgga acttctacgc agcagccggg acaagtgcaa 1080 cagttgggac aagggcaaca agggtactac ccaattgcaa cttctccgca gcagccagga 1140 caagggcaac agctaggaca agggcaacaa ccaggacatg ggcaacagct agtgcaaggg 1200 caacaacaag gacaagggca acaaggacac tacccaagta tgacttctcc gcaccaaaca 1260 ggacaagggc aaaaaggata ctacccaagt gcaatttctc cgcagcagtc aggacaagga 1320 caacaaggat accagcctag tggagcttct tcacaggggt cggtgcaagg ggcgtgccag 1380 cacagcacat cttctccgca gcagcaagca caagggtgcc aagcttcttc accaaagcaa 1440 gggctagggt cgttgtacta cccgagtgga gcttatacac aacagaaacc agggcaaggg 1500 tacaacccag gtggaacttc tccgctgcac cagcaagggg gagggttcgg cggcgggtta 1560 acgacggagc aaccgcaggg aggaaagcag ccattccatt gccagcaaac cactgtctcc 1620 cctcaccagg gtcagcaaac cactgtttcc cctcatcagg gtcagcaaac cactgtctcc 1680 cctcatcagg gtcagcaaac cactgtctcc cctcaccagg gtcagcaaac caccgtctcc 1740 cctcaccagg gtcagcaaac caccgtctcc cctcatcagg gtcagcaaac cactgtctcc 1800 cctcatccgg gtcagcaaac cactgtctcc cctcatcagg gtcagcaaac cactgtctcc 1860 cctcatccgg gtcagcaaac cactgtctcc cctcatcagg gtcagcaaac cactgtctcc 1920 cctcatcagg gtcagcaaac caccgtctcc cctcatcagg gtcagcaaac caccgtctcc 1980 cctcatcagg gtcagcaaac caccgtctcc cctcatcagg gtcagcagcc cggcgagcag 2040 ccttgcggtt tccctggcca gcaaaccacc gtgtctctgc accatggtca gcagtccaac 2100 gagttgtact acggcagccc ataccatgtt agcgtggagc agccgtcggc cagcctaaag 2160 gtagcaaagg cgcagcagct cgcggcgcag ctgccggcaa tgtgtcggct ggagggcggc 2220 ggcggcctgt tggccagcca gtag 2244 <210> 77 <211> 450 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 77 atggctaagc ggctggtcct ctttgtggcg gtaatcgtcg ccctcgtggc tctcaccacc 60 gctgaacctg agatcaatgg gaacaacatt ttccttgata gccgctctgg gcagctacag 120 tgtgagcgcg agctccagga gagctcgctc gaggcgtgcc ggcgggtcgt ggaccaacag 180 ctggttggcc agctgccatg gagcacgggg ctccagatgc agtgctgcca gcagcttcgg 240 gacgtcagcc ccgagtgccg ccccgtcgcc ctcagccagg tcgtgaggca atacgagcag 300 caaaccgagg tgccatccaa gggaggatcc ttctacccgg gcgggaccgc accgccgctg 360 cagcaaggag gatggtgggg aacctctgta aaatggtact acccagacca aacttcttcg 420 caacagtcat ggcaagggca acaagggtag 450 <210> 78 <211> 181 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 78 Leu Ala Cys Glu Val Leu Lys Glu Arg Ser Val Cys Ile Leu Gln Leu 1 5 10 15 His Tyr Val Gln Pro Ser Ile Leu Gln Gln Leu Asn Pro Cys Lys Val 20 25 30 Phe Leu Gln Gln Gln Cys Ser Pro Val Arg Met Pro Gln Leu Ile Ala 35 40 45 Arg Ser Gln Met 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Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Leu Gln Gln Pro Gln Gln Thr Ile Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe 195 200 205 Pro Leu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Leu 210 215 220 Pro Gln Gln Pro Gln Gln Ile Ile Ser Gln Gln Pro Gln Gln Pro Phe 225 230 235 240 Pro Leu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Pro Phe Pro Gln 245 250 255 Glu Gln Pro Gln Gln Ala Phe Pro Leu Gln Pro Gln Gln Pro Phe Pro 260 265 270 Glu Glu Ser Glu Gln Ile Ile Thr Gln Gln Pro Phe Pro Leu Gln Pro 275 280 285 Gln Gln Leu Phe Pro Gln Gln Pro Gln Gln Pro Leu Pro Gln Pro Gln 290 295 300 Gln Pro Phe Arg Gln Leu Pro Lys Tyr Ile Ile Pro Gln Gln Pro Gln 305 310 315 320 Gln Pro Phe Leu Leu Gln Pro His Gln Pro Gln Gln Pro Tyr Ala Gln 325 330 335 Gln Asp Ile Trp Ser Asp Ile Ala Leu Leu Gly 340 345 <210> 81 <211> 305 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 81 Met Lys Ile Leu Ile Ile Leu Thr Ile Leu Ala Met Ala Thr Thr Phe 1 5 10 15 Ala Thr Ser Glu Met Gln Val Asn Pro Ser Val Gln Val Gln Pro Thr 20 25 30 Gln Gln Gln Pro Tyr 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130 135 140 Val Met Leu Gln Gln Cys Cys Leu Gln Leu Ala Gln Ile Pro Glu Gln 145 150 155 160 Tyr Lys Cys Thr Ala Ile Asp Ser Ile Val His Ala Ile Phe Met Gln 165 170 175 Gln Gly Gln Arg Gln Gly Val Gln Ile Val Gln Gln Gln Pro Gln Pro 180 185 190 Gln Gln Val Gly Gln Cys Val Leu Val Gln Gly Gln Gly Val Val Gln 195 200 205 Pro Gln Gln Leu Ala Gln Met Glu Ala Ile Arg Thr Leu Val Leu Gln 210 215 220 Ser Val Pro Ser Met Cys Asn Phe Asn Val Pro Pro Asn Cys Ser Thr 225 230 235 240 Ile Lys Ala Pro Phe Val Gly Val Val Thr Gly Val Gly Gly Gln 245 250 255 <210> 83 <211> 289 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 83 Ile Thr Thr Thr Thr Met Gln Phe Asn Pro Ser Gly Leu Glu Leu Glu 1 5 10 15 Arg Pro Gln Gln Leu Phe Pro Gln Trp Gln Pro Leu Pro Gln Gln Pro 20 25 30 Pro Phe Leu Gln Gln Glu Pro Glu Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Gln Pro 35 40 45 Leu Pro Gln Gln Gln Pro Phe Pro Gln Gln Pro Gln Leu Pro His Gln 50 55 60 His Gln Phe Pro Gln Gln Leu Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met 65 70 75 80 Pro Leu Gln Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met Pro Leu Gln Pro 85 90 95 Gln Gln Gln Pro Gln Phe Pro Gln Gln Lys Pro Phe Gly Gln Tyr Gln 100 105 110 Gln Pro Leu Thr Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Gln Gln Pro Leu Ala Gln 115 120 125 Gln Gln Pro Ser Ile Glu Glu Gln His Gln Leu Asn Leu Cys Lys Glu 130 135 140 Phe Leu Leu Gln Gln Cys Thr Leu Asp Glu Lys Val Pro Leu Leu Gln 145 150 155 160 Ser Val Ile Ser Phe Leu Arg Pro His Ile Ser Gln Gln Asn Ser Cys 165 170 175 Gln Leu Lys Arg Gln Gln Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asn Ile Asn Glu 180 185 190 Gln Ser Arg Cys Pro Ala Ile Gln Thr Ile Val His Ala Ile Val Met 195 200 205 Gln Gln Gln Val Gln Gln Gln Val Gly His Gly Phe Val Gln Ser Gln 210 215 220 Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Met Pro Ile Gln Leu Gln Gln Gln Pro 225 230 235 240 Gly Gln Ala Phe Val Leu Pro Gln Gln Gln Ala Gln Phe Lys Val Val 245 250 255 Gly Ser Leu Val Ile Gln Thr Leu Pro Met Leu Cys Asn Val His Val 260 265 270 Pro Pro Tyr Cys Ser Pro Phe Gly Ser Met Ala Thr Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gln <210> 84 <211> 173 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 84 Met Lys Thr Met Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala Phe Ala Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Leu Asp Thr Thr Cys Ser Gln Gly Tyr Gly Gln Cys 20 25 30 Gln Gln Gln Pro Gln Gln Gln Met Asn Thr Cys Ala Ala Phe Leu Gln 35 40 45 Gln Cys Ser Arg Thr Pro Tyr Val Gln Ser Gln Met Trp Gln Ala Ser 50 55 60 Gly Cys Gln Leu Met Arg Gln Gln Cys Cys Gln Pro Leu Ala Gln Ile 65 70 75 80 Ser Glu Gln Ala Arg Cys Gln Ala Val Cys Ser Met Ala Gln Val Ile 85 90 95 Met Arg Gln Gln Gln Gly Gln Ser Phe Thr Gln Pro Gln Gln Gln Gln 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Gly Gln Pro Gln Gln Gln Val Pro Val Glu Val Met 115 120 125 Arg Met Val Leu Gln Thr Leu Pro Ser Met Cys Ser Val Asn Ile Pro 130 135 140 Gln Tyr Cys Thr Thr Thr Pro Cys Ser Thr Ile Thr Pro Thr Ile Tyr 145 150 155 160 Ser Ile Pro Met Ala Ala Thr Cys Ala Gly Gly Val Cys 165 170 <210> 85 <211> 13 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 85 Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Met Cys Arg 1 5 10

Claims (58)

  1. (i) 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물을 가공 처리하여 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계, 및/또는 (ii) 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 1종 이상의 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하여 식품 또는 맥아 베이스(malt-based) 음료 성분을 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 50 ppm 이하의 호르데인(hordein)을 포함하고,
    a) 보리 곡물이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    b) 보리 곡물이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    c) 보리 곡물이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하는 것인, 식품 또는 맥아 베이스 음료 성분을 제조하는 방법.
  2. (i) 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물을 가공 처리하여 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계, 및/또는 (ii) 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분을 1종 이상의 다른 식품 또는 음료 성분과 혼합하여 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분은 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하고,
    a) 보리 곡물이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    b) 보리 곡물이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    c) 보리 곡물이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하는 것인, 식품 또는 맥아 베이스 음료를 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물이 20 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 0.05 ppm 내지 50 ppm, 또는 0.05 ppm 내지 20 ppm, 0.05 ppm 내지 10 ppm, 0.05 ppm 내지 5 ppm, 또는 0.1 ppm 내지 5 ppm의 호르데인을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물의 평균 중량이 35 mg 이상, 39 mg 이상, 41 mg 이상, 47 mg 이상, 35 mg 내지 60 mg, 40 mg 내지 60 mg, 또는 45 mg 내지 60 mg인, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 80% 내지 98%, 또는 80% 내지 93%의 보리 곡물이 2.8 mm 시브(sieve)를 통과하지 못하는 것인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물이 적어도 40%, 40% 내지 60%, 40% 내지 55%, 또는 40% 내지 50%의 수확 지수(harvest index)를 갖는 식물 유래인, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물의 두께에 대한 길이의 비가 5 미만, 4 미만, 3.8 미만, 2 내지 5, 또는 2.5 내지 3.8인, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물로부터 제조된 곡분 또는 전립분이 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 0.05 ppm 내지 10 ppm, 또는 0.05 ppm 내지 5 ppm의 호르데인을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물로부터 제조된 맥아 또는 맥아즙이 50 ppm 미만, 또는 20 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이
    i) 서열번호: 53으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
    ii) 서열번호: 54로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
    iii) 서열번호: 55로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 C-호르데인, 및
    iv) 서열번호: 56으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 D-호르데인 중 하나, 또는 하나 초과, 또는 그들 모두를 야생형 수준의 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준으로 포함하거나, 또는 그를 포함하지 않으며,
    여기서, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준은 각각 보리 품종 보미(Bomi), 슬루프(Sloop), 보딘(Baudin), 예간(Yagan), 하인드마시(Hindmarsh), 또는 코맨더(Commander)의 야생형 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분에 대해 상대적인 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, B-호르데인이 적어도 B1-호르데인 및 B3-호르데인인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이
    i) 서열번호: 57로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 γ-호르데인, 및/또는
    ii) 서열번호: 52로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 아베닌 유사 A 단백질을 야생형 수준의 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준으로 추가로 포함하거나, 또는 추가로 그를 포함하지 않으며,
    여기서, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 수준은 각각 보리 품종 보미, 슬루프, 보딘, 예간, 하인드마시, 또는 코맨더의 야생형 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분에 대해 상대적인 것인, 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 절두된 D-호르데인이 아미노산 번호 150을 코딩하는 트리플렛(triplet)에 종결 코돈을 가지는, 방법.
  16. 삭제
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물, 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 상응하는 야생형 보리 식물로부터의 보리 곡물, 또는 상응하는 야생형 보리 식물로부터의 보리 곡물로부터 같은 방식으로 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분과 비교하였을 때, 1% 이하, 0.01% 이하, 0.007% 이하, 0.0027% 이하, 0.001% 내지 1%, 또는 0.001% 내지 0.01%인 수준으로 호르데인을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 보리 곡물이 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 또는 80% 내지 100%의 야생형 보리 식물의 보리 곡물 수율을 가지는 식물 유래인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 보리 곡물의 평균 중량이 야생형 보리 식물의 보리 곡물의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 하기
    i) 서열번호: 53으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
    ii) 서열번호: 54로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 B-호르데인,
    iii) 서열번호: 55로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 C-호르데인, 및
    iv) 서열번호: 56으로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 D-호르데인 중 하나, 또는 하나 초과, 또는 그들 모두를 상응하는 야생형 보리 식물과 비교하였을 때 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 0.1% 내지 10%, 또는 0.1% 내지 10%로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, B-호르데인이 적어도 B1 및 B3인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 보리 곡물, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 하기
    i) 서열번호: 57로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 γ-호르데인, 및/또는
    ii) 서열번호: 52로서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 아베닌 유사(avenin-like) A 단백질을 상응하는 야생형 보리 식물과 비교하였을 때 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 내지 10%, 또는 0.1% 내지 10%로 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제17항에 있어서, 야생형 보리 식물이 보미, 슬루프, 보딘, 예간, 하인드마시, 또는 코맨더인, 방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물로부터 제조된 곡분의 복강(coeliac) 독성이 상응하는 야생형 보리 식물의 보리 곡물로부터 제조된 곡분의 5% 미만, 또는 1% 미만인, 방법.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 평균 보리 곡물 중량이
    i) B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 야생형 보리 곡물에 비해 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성,
    ii) C-호르데인을 포함하지 않는 보리 곡물을 생성하는 보리의 Lys3 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성, 및
    iii) 전장의 단백질을 코딩하는 D-호르데인의 야생형 대립유전자에 대하여 동형접합성인
    보리 곡물보다 적어도 1.05배, 적어도 1.1배, 또는 1.05 내지 1.3배 더 높은, 방법.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물이
    i) B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 야생형 보리 곡물에 비해 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성,
    ii) C-호르데인을 포함하지 않는 보리 곡물을 생성하는 보리의 Lys3 유전자좌의 대립유전자에 대하여 동형접합성, 및
    iii) 전장의 단백질을 코딩하는 D-호르데인의 야생형 대립유전자에 대하여 동형접합성인
    식물로부터의 보리 곡물 수율보다 적어도 1.20배, 또는 적어도 1.35배, 또는 1.2 내지 1.5배, 또는 1.2 또는 2.0배 더 높은 보리 곡물 수율을 가지는 식물로부터의 것인 방법.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물의 게놈 중 50% 이상이 보리 재배종 슬루프, 하인드마시, 옥스포드(Oxford) 또는 마라타임(Maratime)의 게놈과 동일한 것인, 방법.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물이 비트랜스제닉(non-transgenic) 식물 유래인, 방법.
  29. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물이 트랜스제닉 식물 유래인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 식물이 보리 곡물 중 적어도 하나의 호르데인의 생산을 하향 조절하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 트랜스진(transgene)을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물로부터 곡분 또는 전립분을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물로부터 맥아를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제2항에 있어서, 맥아 베이스 음료가 맥주이고, 상기 방법이 보리 곡물, 또는 그로부터 유래된 분쇄 보리 곡물을 발아시키는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 건조된 발아된 보리 곡물을 배유 분획물, 내피층 분획물, 겉껍질 분획물, 유아초 분획물, 및 맥아 잔뿌리 분획물 중 둘 이상의 것으로 분획화하는 단계; 및 둘 이상의 분획물을 기결정된 양으로 조합하고 블렌딩시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보리 곡물 중 50% 이상이 침지 후 3일 이내에 발아되는, 방법.
  36. 제1항에 있어서, 식품 성분 또는 맥아 베이스 음료 성분이 곡분, 전분, 맥아, 또는 맥아즙인, 방법.
  37. 제2항에 있어서, 맥아 베이스 음료가 맥주 또는 위스키인, 방법.
  38. 제2항에 있어서, 식품 또는 맥아 베이스 음료가 인간 섭취용인, 방법.
  39. 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 보리 곡물을 생산하는 보리 식물로서,
    a) 보리 곡물이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    b) 보리 곡물이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    c) 보리 곡물이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하는 것인, 보리 식물.
  40. 50 ppm 이하의 호르데인을 포함하는 제39항의 보리 식물의 보리 곡물로서,
    a) 보리 곡물이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 야생형 보리 곡물의 Hor2 유전자좌에 비해 Hor2 유전자좌 내 B-호르데인 코딩 유전자의 대부분 또는 그들 모두가 결실되어 있는 Hor2 유전자좌의 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    b) 보리 곡물이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 D-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Hor3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하고,
    c) 보리 곡물이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형에 대하여 동형접합성이거나, 또는 상기 보리 곡물로부터 제조된 맥아, 맥아즙, 곡분 또는 전립분이 C-호르데인이 결핍된 곡물을 초래하는 보리의 Lys3 유전자좌에서 유전적 변형을 포함하는 DNA를 포함하는 것인, 보리 곡물.
  41. a) 제39항의 보리 식물을 재배하는 단계,
    b) 보리 곡물을 수확하는 단계, 및
    c) 임의적으로 보리 곡물을 가공 처리하는 단계를 포함하는, 보리 곡물을 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 면적이 적어도 1 헥타르인 밭에서 적어도 10,000개의 식물을 재배하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. a) 제40항의 보리 곡물을 수득하는 단계, 및
    b) 보리 곡물을 가공 처리하여 곡분, 전립분, 전분, 맥아, 맥아즙 또는 다른 생성물을 제조하는 단계를 포함하는, 곡분, 전립분, 전분, 맥아, 맥아즙 또는 보리 곡물로부터 수득되는 다른 생성물을 제조하는 방법.
  44. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 50 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제2항에 따른 방법을 사용하여 제조되는 식품.
  45. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 50 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제2항에 따른 방법을 사용하여 제조되는 맥아 베이스 음료.
  46. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 0.9 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제43항에 따른 방법을 사용하여 생산되는 맥주.
  47. 제46항에 있어서, 적어도 2%의 에탄올을 포함하는, 맥주.
  48. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 10 ppm 미만, 또는 5 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제43항에 따른 방법을 사용하여 생산되는 곡분.
  49. 제48항에 있어서, 전립분인, 곡분.
  50. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 50 ppm 미만, 또는 20 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제43항에 따른 방법을 사용하여 생산되는 맥아.
  51. 하나 이상의 보리 곡물 단백질 및 50 ppm 미만, 또는 20 ppm 미만의 호르데인을 포함하는, 제43항에 따른 방법을 사용하여 생산되는 맥아즙.
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