CN105316425B - 一种小麦b-型avenin-like分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦b‑型avenin‑like分子标记及其应用。本发明提供了一种检测或辅助检测小麦品质的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基因组中TaALP‑7A基因的序列，TaALP‑7A基因序列为序列3的待测小麦的品质好于或候选好于TaALP‑7A基因序列为序列4的待测小麦。本发明的实验证明，本发明首次报道了b‑型avenin‑like蛋白的等位基因，定位于7A染色体上，命名为TaALP‑7A。并针对7A的特异变异序列，结合面团揉混特性，开发出其功能标记，为优质小麦分子标记辅助选择提供可靠、简便的标记类型。

Description

一种小麦b-型avenin-like分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦b-型avenin-like分子标记及其应用。

背景技术

小麦作为我国三大粮食作物之一，约占全国粮食作物的1/4，不仅为人类提供了大量的热量，也是食物蛋白质的主要来源之一。据统计，全世界小麦蛋白质的总量约等于肉、蛋、奶蛋白质的总和。随着人们生活水平的不断提高，食品工业对小麦品质尤其对强筋小麦类型需求逐年增高。因此，明确优质强筋小麦的生理生化及代谢途径，培育优质强筋小麦品种则显的尤为重要。

小麦籽粒成分主要有淀粉65～70％，蛋白质10～15％，水分13～15％，粗纤维矿物质2～3％和1～2％等。蛋白质含量是商品小麦分级的首要指标。蛋白质的组成及其含量是决定面团流变学特性的主要因素。经典小麦品质研究中，将小麦主要蛋白(贮藏蛋白)分为麦醇溶蛋白和麦谷蛋白。麦醇溶蛋白为单体蛋白，不含双硫键，为面团的延展性提供物质基础。麦谷蛋白为一种含双硫键的非均质大分子聚合体，很大程度上决定了面团的弹性，对面粉的经济价值有重要影响。有研究表明，麦谷蛋白的含量与沉降值和湿面筋含量呈现显著正相关，麦醇溶蛋白以及非储藏蛋白的清蛋白和球蛋白均与沉降值相关不显著。但也有研究发现，总蛋白质及各蛋白组分含量均与湿面筋含量及沉降值呈显著或极显著正相关，而总蛋白质、清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量分别与面团形成时间、稳定时间的相关性不显著。

近年来，在小麦胚乳中发现了一类新型的蛋白质，这类蛋白质与燕麦储藏蛋白(avenin)有一定的同源性，故称为类燕麦储藏蛋白(avenin-like)。Kan等经序列比对，揭示了a-型avenin-like蛋白与先前Salcedo等、Anderson等、Clarke等、Payne等和Harsch等所鉴定的低分子量麦谷蛋白相对应；对普通小麦近缘种属的b-型avenin-like蛋白展开了克隆及表达分析，并发现了包含19个半胱氨酸残基的罕见类型，并且如此多的半胱氨酸残基会形成更为丰富的分子内或分子间的二硫键，对面粉的加工品质具有一定的影响。因此，深入研究b-型avenin-like蛋白的功能，将对改良小麦品质开辟新的途径和认识。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测小麦品质的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因序列，TaALP-7A基因序列为序列1的待测小麦的品质好于或候选好于TaALP-7A基因序列为序列3的待测小麦。

上述方法中，所述品质体现为小麦强筋度，所述强筋度具体体现在揉混参数中的和面时间和/或8分钟带宽。

上述方法中，检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因的序列的方法为如下1)或2)：

1)直接测序；

2)以扩增TaALP-7A基因的引物对对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的序列。

上述方法中，所述扩增TaALP-7A基因的引物对由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列序列5所示的单链DNA分子组成。

上述的方法在培育高强筋或高品质小麦中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育高强筋或高品质小麦的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因的序列；

2)选取TaALP-7A基因序列为序列1的待测小麦进行培育，实现高强筋或高品质小麦。

本发明第三个目的是提供用于检测或辅助检测小麦品质的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括扩增TaALP-7A基因的引物对；

所述引物对具有由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列序列5所示的单链DNA分子组成；

所述TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列1或序列3。

本发明第四个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围，其是如下1)-4)中任一种：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述的试剂盒、上述的蛋白质、上述的DNA分子在检测或辅助检测小麦品质或筋度中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的试剂盒、上述的蛋白质、上述的DNA分子在筛选、鉴定或培育高品质或高强筋度小麦中的应用也是本发明保护的范围。

上述品质体现为小麦强筋度，所述强筋度具体体现在揉混参数中的和面时间和/或8分钟带宽。

上述待测小麦为表1中任一种。

本发明的实验证明，本发明首次报道了b-型avenin-like蛋白的等位基因，定位于7A染色体上，命名为TaALP-7A。并针对7A的特异变异序列，结合面团揉混特性，开发出其功能标记，为优质小麦分子标记辅助选择提供可靠、简便的标记类型。

附图说明

图1为TaALP基因扩增电泳图。

图2为中国春缺体定位结果。

图3为TaALP-7A标记检测部分材料电泳结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

供试小麦品种102份中国小麦品种(系)均可由山东省农业科学院作物研究所获得；大肠杆菌DH5α、DNA凝胶回收纯化试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T克隆载体、Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购于TaKaRa公司(大连)。

表1.用于检测的102份小麦材料清单

下述实施例所需要的引物序列如表2所示：

表2为本发明所设计的特异性引物

实施例1、蛋白TaALP-7A的获得

1、蛋白TaALP-7A

以济麦44基因组DNA为模板，用全长引物TaALP-F和TaALP-R进行扩增，得到PCR扩增产物。

PCR产物进行电泳，结果如图1所示，泳道1和2为PCR扩增产物、泳道3为marker，可以得到能扩增出800bp左右条带。

测序PCR扩增产物，切胶回收，连接转化后获得阳性克隆进行测序，结果在EnsemblPlants和IWGSC比对后发现，PCR扩增产物具有如下核苷酸：

序列表中序列1所示的核苷酸，命名为TaALP-7A，编码的蛋白命名为TaALP-7A，其氨基酸序列为序列2。

2、染色体定位分析

以中国春7A缺体基因组DNA为模板，用TaALP-7A-F和TaALP-7A-R进行扩增。

电泳结果如图2所示，M:DNA ladder 100bp；1：中国春7A缺体；2：中国春7B缺体；3:中国春7D缺体，缺失条带表明其定位于该染色体上。

实施例2、TaALP-7A分子标记的获得及其应用

1、TaALP-7A分子标记的获得

以TaALP-7A-F和TaALP-7A-R分别对济麦44、济麦0860229、济麦13P406、济麦13P414、济麦13J409、济麦13J394、济麦13J492、济麦13J494、济麦23和济麦24基因组DNA进行扩增，得到PCR产物，即为各个品种的TaALP-7A编码基因。

测序比对序列，发现TaALP-7A编码基因具有如下两种类型TaALP-7A1和TaALP-7A2：

TaALP-7A1的核苷酸序列为序列表中序列1；

TaALP-7A2的核苷酸序列为序列表中序列3。

因此，可以针对TaALP-7A1/TaALP-7A2的差异设计引物作为TaALP-7A标记，TaALP-7A标记如下：

F:5'-TGCAGCAGCTTAGCAGCTGCCAT-3'(序列4)；

R:5'-GCTGGT AGGCTGATCCACCGGA-3'(序列5)。

2、TaALP-7A分子标记的应用

提取表1中的102份小麦品种叶片的基因组DNA，用TaALP-7A标记F:5'-TGCAGCAGCTTAGCAGCTGCCAT-3'；R:5'-GCTGGT AGGCTGATCCACCGGA-3'进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系包括2.5×Real Master Mix 4μl，上下游引物各0.5μl，ddH₂O 4.5μl，模板1μl。PCR反应的条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

若得到400bp的PCR扩增产物，则该品种中TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列1，记作1；

若无400bp PCR扩增产物，则该品种中TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列3，记作0。

结果如图3所示，M为marker,泳道1为济麦13p415，泳道2为济麦13p414，泳道3为济麦13J494，泳道4为济麦23，泳道5为济麦13J394，泳道6为济麦24，泳道7为济麦13p307，泳道8为济麦13J492，泳道9为济麦9088，泳道10为济麦13J495，泳道11为济麦13J490，泳道12为济麦0860229，泳道13为水对照；可以看出，5、8、9、11、12、13泳道的品种无400bp PCR扩增产物，则这些品种中TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列3。

统计：50份小麦品种的TaALP-7A的核苷酸序列为序列1；52份小麦品种的TaALP-7A的核苷酸序列为序列3。

将含有序列1所示TaALP-7A的50份小麦品种和含有序列3所示TaALP-7A的52份小麦品种进行揉混仪参数线峰值宽度、中线峰值时间、中线峰值积分面积、8min带宽的测定，具体如下:

采用美国National公司的505SS-揉混仪进行测定；10g参试小麦面粉加入到揉面钵中，依据AACC方法54-4A标准加水(AACC,1995)，吸水量(g)＝(蛋白质含量×1.5)+43.6；样品重量(g)＝8.6/(1-样品湿度)；加水量(g)＝10-样品重量+0.1×吸水量；由Mixsmart软件控制，并获得揉混特性曲线，自动计算出主要揉混参数，即中线峰值宽度、中线峰值时间、中线峰值积分面积、8min带宽。

结果如表3所示。

表3为主要揉混参数

上表中，分子标记结果为0，则TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列3；

分子标记结果为1，则TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列1。

表4为TaALP-7A等位基因的揉混仪参数统计结果

利用SAS统计分析表明，含有序列3所示TaALP-7A的52份小麦品种的和面时间及8分钟带宽与含有序列1所示的TaALP-7A的50份小麦品种的值差异达极显著水平，

因此，可以通过TaALP-7A分子标记检测待测小麦品种中的TaALP-7A基因序列判断待测小麦的品质状态，含有序列1所示TaALP-7A的50份小麦品种的品质好于含有序列3所示TaALP-7A的52份小麦品种；

品质体现强筋度，具体体现在提高了和面时间及8分钟带宽，面粉对搅拌的耐受力强,面团的弹性大。

也可以通过TaALP-7A分子标记检测待测小麦品种是否为高品质小麦。

Claims (10)

1.一种检测或辅助检测小麦品质的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因序列，TaALP-7A基因序列为序列1的待测小麦的品质好于或候选好于TaALP-7A基因序列为序列3的待测小麦；所述品质为强筋度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述强筋度具体体现在揉混参数中的和面时间和/或8分钟带宽。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因序列的方法为如下1）或2）：

1）直接测序；

2）以扩增TaALP-7A基因的引物对对待测小麦的基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物的序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述扩增TaALP-7A基因的引物对由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列序列5所示的单链DNA分子组成。

5.权利要求1-4中任一所述的方法在培育高强筋小麦中的应用。

6.一种培育高强筋小麦的方法，包括如下步骤：

1）检测待测小麦基因组中TaALP-7A基因的序列；

2）选取TaALP-7A基因序列为序列1的待测小麦进行培育，实现高强筋小麦。

7.用于检测或辅助检测小麦品质的试剂盒，包括扩增TaALP-7A基因的引物对；

所述引物对具有由序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列序列5所示的单链DNA分子组成；

所述TaALP-7A基因的核苷酸序列为序列1；所述品质为强筋度。

8.一种蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

9.编码权利要求8所述蛋白质的DNA分子，其是如下1）或2）种：

1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）编码区为序列表中序列3所示的DNA分子。

10.权利要求7所述的试剂盒、权利要求8所述的蛋白质、权利要求9所述的DNA分子在检测或辅助检测小麦筋度中的应用；

或权利要求7所述的试剂盒、权利要求8所述的蛋白质、权利要求9所述的DNA分子在筛选、鉴定或培育高强筋度小麦中的应用。