CN110747289B - 一种鉴定木薯薯肉颜色的snap分子标记方法 - Google Patents

一种鉴定木薯薯肉颜色的snap分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，属于分子生物学领域。该标记方法包括以下步骤：S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定。该方法简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。

Description

一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法。
背景技术
木薯(Manihot Esculenta Crantz)是大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物，耐旱抗贫瘠，广泛种植于非洲、美洲和亚洲等100余个国家或地区，是世界三大薯类作物之一，热区第三大粮食作物，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”。木薯用途广泛，可应用于淀粉生产、工业使用和食用，尤其是在一些非洲国家。根据木薯块根中类胡萝卜素的类型，其块根肉质颜色可以从白色到粉色、淡黄色和黄色不等。白肉木薯块根对于淀粉工业很重要，但富含类胡萝卜素的黄肉块根对于直接将其作为主食食用的人来说，是减少维生素A缺乏的关键因素。同时，木薯中类胡萝卜素对延缓采后生理恶化(PPD)也很重要，可降低因PPD导致的经济损失。
到目前为止，木薯育种策略主要集中为资源引进与系统选育，杂交或实生种选育，但育种周期相对较长，效率低下，分子标记辅助育种为木薯品种选育或资源筛选提供了一条高效的途径。
研究表明，木薯块根的肉质颜色是由参与类胡萝卜素生物合成的基因PSY2的SNP位点改变造成的。PSY2中的等位基因特异性单核苷酸多态性(SNP)导致氨基酸序列的变化，导致块根颜色从白色变为黄色。当SNP位点为碱基C时，块根肉质颜色为白色，当SNP位点为碱基A时，块根肉质颜色表现为黄色。基于PSY2基因的单核苷酸多态性，前人已开发出一对酶切扩增多态性序列(CAPS)分子标记，并在“新选048”木薯自交系群体中得到了验证，准确率达到了100％，可用于不同薯肉颜色木薯的分子标记辅助选择(尚小红等，申请号为CN201611199010.8的发明专利，一种鉴定木薯块根肉质颜色的分子标记方法)。然而，该CAPS分子标记的应用需要一些酶切的步骤，相对于简易的分子标记来讲，费时费力。同时，CAPS分子标记酶切所需要的酶，价格昂贵。此外，在已开发出的CAPS分子标记检测的结果中，黄肉与白肉分子标记的条带仅相隔22bp，条带在琼脂糖凝胶电泳图上太近而不易分辨。以上原因导致该CAPS分子标记存在弊端，也限制了其实用性。因此，迫切需要开发出一种简易易行、快捷且价格低廉的分子标记来降低其繁琐度及成本，提高木薯分子标记辅助育种的效率。
发明内容
本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，包括以下步骤：
S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定，判定标准为：
若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为白色；
若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为黄色；
若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为浅黄色。
优选的，在步骤S1中，所述特异引物核苷酸序列为：
引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
优选的，在步骤S1中，反应体系包含基因组DNA(50ng/μL)2μL，2×Taq Master Mix12μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，再加5μLddH2O补齐至20μL。
优选的，在步骤S1中，所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环，72℃延伸5min，4℃下保存。
优选的，在步骤S2中，使用浓度为1.5％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳分离，所述1.5％琼脂糖凝胶是指100mL的TAE缓冲液中含有1.5g琼脂糖粉。
优选的，所述电泳分离方法为：取6μL PCR产物与1μL的6×Loading buffer混匀后，用含有GelRed核酸染色剂的1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，缓冲液为1×TAE，在110V恒电压下电泳约25min。
本发明的原理为：PSY2基因的SNP2位点可决定木薯的薯肉是黄色还是白色，根据该SNP区域的碱基序列设计了两对SNAP引物对。SNAP引物设计时，正向引物在SNP突变位点的前两个碱基处人为错配一个碱基以提高等位基因的特异性，反向引物的设计遵循一般引物设计原则。
引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，扩增出的PCR产物共388bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，扩增出的PCR产物共388bp，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，可以仅仅通过简单的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可实现在苗期通过提取叶片DNA进行分子标记检测，从而快速的鉴别木薯薯肉颜色，准确的选育出适合于育种目标的木薯材料。
2.本发明提供的方法简易、高效、条带易读、价格低廉，可大大提高分子标记辅助选择在木薯育种中的实用性及高效性。
附图说明
图1为本发明实施例的电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一、实验材料：
选取种植于广西农业科学院里建基地，主栽木薯品种“新选048”自交所得的29份木薯叶片。具体29份木薯叶片对应的木薯材料的块根肉质颜色见下表：
表1样本块根肉质颜色
叶片样本 块根肉质颜色 叶片样本 块根肉质颜色 叶片样本 块根肉质颜色
1 浅黄色 11 黄色 21 浅黄色
2 白色 12 白色 22 浅黄色
3 白色 13 浅黄色 23 浅黄色
4 白色 14 浅黄色 24 浅黄色
5 白色 15 黄色 25 浅黄色
6 白色 16 浅黄色 26 浅黄色
7 白色 17 浅黄色 27 浅黄色
8 白色 18 浅黄色 28 浅黄色
9 黄色 19 浅黄色 29 浅黄色
10 黄色 20 浅黄色
二、实验方法：
一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，由以下步骤组成：
S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取基因组DNA。根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，两对引物均可扩增包含SNP2位点的长度为388bp的核苷酸序列，所述特异引物核苷酸序列为：
引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
然后用这两对特异引物分别对木薯基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系为20μL，由下列成分组成：基因组DNA(50ng/μL)2μL，2×Taq Master Mix12μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，5μLddH2O。PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环，72℃延伸5min，4℃下保存，得到PCR扩增产物。
S2.使用浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳对步骤S1的PCR产物进行电泳分离，所述电泳方法为：取6μL PCR产物与1μL的6×Loading buffer混匀后，用含有GelRed核酸染色剂的1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离，缓冲液为1×TAE，在110V恒电压下电泳约25min。电泳结束后，利用紫外凝胶成像系统成像后拍照，根据电泳结果进行木薯块根肉质颜色的判定如图1所示：
若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的块根肉质颜色为白色；
若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的块根肉质颜色为黄色；
若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的块根肉质颜色为浅黄色。
三、实验结果：
由图1可知，仅引物对1能扩增出388bp的条带的木薯材料的块根肉质颜色为白色，即白肉木薯材料有：2、3、4、5、6、7、8、12号。
仅引物对2能扩增出388bp的条带的木薯材料的块根肉质颜色为黄色，黄肉木薯材料有9、10、11和15号。
引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带的木薯材料的块根肉质颜色为浅黄色，浅黄肉木薯材料有1、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28和29号。
将以上结果与表1对应分析发现：采用本实施例的鉴定方法对29份木薯叶片进行鉴定得到的结果与表1结果完全相符，准确率100％，因此本发明的鉴定发明具有很高的准确性，具有实用性。
上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 1
cttcacacat aacgccaacg gc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
gcccatcact ggaacactca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
cttcacacat aacgccaacg ga 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
gcccatcact ggaacactca 20
<210> 5
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
cttcacacat aacgccaaca gctttagata ggtgggaagc aaggttggaa gatatgtttc 60
gaggtcgtcc ctttgatatg cttgatgctg ctttatcaga tacagttact aaatttcctg 120
ttgatattca ggttagccat tattaaatca agtctttaac actacataaa cttttaaaca 180
atcaaaacta cagcttataa tgccatttct gtgtttgttt ctcattttgg ctgattcctt 240
tgaacatctg tttcagccat tcaaagatat gattgaagga atgaggatgg atctgaagaa 300
gtccagatat aagaactttg acgagcttta tctttactgt tattatgttg ctgggacggt 360
tggattaatg agtgttccag tgatgggc 388
<210> 6
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
cttcacacat aacgccaaca gatttagata ggtgggaagc aaggttggaa gatatgtttc 60
gaggtcgtcc ctttgatatg cttgatgctg ctttatcaga tacagttact aaatttcctg 120
ttgatattca ggttagccat tattaaatca agtctttaac actacataaa cttttaaaca 180
atcaaaacta cagcttataa tgccatttct gtgtttgttt ctcattttgg ctgattcctt 240
tgaacatctg tttcagccat tcaaagatat gattgaagga atgaggatgg atctgaagaa 300
gtccagatat aagaactttg acgagcttta tctttactgt tattatgttg ctgggacggt 360
tggattaatg agtgttccag tgatgggc 388

Claims (3)

1.一种鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.采用CTAB法从木薯叶片中提取木薯基因组DNA，根据PSY2基因的DNA序列设计引物对1和引物对2，利用所述引物对1和引物对2分别对所述木薯基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
引物对1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
引物对2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；
S2.对步骤S1的PCR扩增产物进行电泳分离，然后根据电泳结果进行木薯薯肉颜色判定，判定标准为：
若仅引物对1能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为白色；
若仅引物对2能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为黄色；
若引物对1和引物对2均能扩增出388bp的条带，则该木薯材料的薯肉颜色为浅黄色；
在步骤S1中，反应体系包含50ng/μL的基因组DNA 2μL，2×Taq Master Mix 12μL，10μmol/L的正向引物0.5μL，10μmol/L的反向引物0.5μL，再加5μLddH2O补齐至20μL；
在步骤S1中，所述PCR扩增的条件为：先在94℃下预变性3min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，进行32个循环，72℃延伸5 min，4℃下保存。
2.根据权利要求1所述的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，在步骤S2中，使用浓度为1.5%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳分离，所述1.5%琼脂糖凝胶是指100 mL的TAE缓冲液中含有1.5 g琼脂糖粉。
3.根据权利要求1所述的鉴定木薯薯肉颜色的SNAP分子标记方法，其特征在于，所述电泳分离方法为：取6 µL PCR产物与1 µL的6×Loading buffer混匀后，用含有GelRed核酸染色剂的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，缓冲液为1×TAE，在110 V恒电压下电泳25 min。
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Application publication date: 20200204

Assignee: Guangxi Hongge Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

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Denomination of invention: A SNAP Molecular Marker Method for Identification of Cassava Meat Color

Granted publication date: 20201113

License type: Common License

Record date: 20221230

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Application publication date: 20200204

Assignee: Guangxi Nongken Mingyang starch Development Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980044710

Denomination of invention: A SNAP Molecular Marker Method for Identifying the Color of Cassava Meat

Granted publication date: 20201113

License type: Common License

Record date: 20231030

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