KR101457958B1

KR101457958B1 - 다종 바이러스 저항성을 갖는 형질전환 감자 식물체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 감자 식물체

Info

Publication number: KR101457958B1
Application number: KR1020127015778A
Authority: KR
Inventors: 정봉남; 최국선; 피터 팔루카이티스
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2010-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2014-11-04
Also published as: WO2012008768A2; KR20120115498A; WO2012008768A3

Abstract

본 발명은 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA), Tobacco rattle virus(TRV) 및 Potato mop-top virus(PMTV)의 5종의 식물 바이러스 각각으로부터의 유전자 단편을 융합시켜 제작한 융합유전자(YLRATRPM) 또는 융합유전자(YLRA)를 포함하는 재조합 발현 벡터로 감자 세포를 형질전환 시킴으로써 상기 융합유전자 제작에 이용된 상기 바이러스 5종 또는 3종 모두 에 대하여 저항성을 나타내는 형질전환 감자식물체의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 감자식물체에 관한 것이다.

Description

다종 바이러스 저항성을 갖는 형질전환 감자 식물체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 감자 식물체{METHOD FOR PREPARING TRANSFORMED POTATO PLANTS HAVING MULTISPECIES VIRUS RESISTANCE, AND POTATO PLANTS PREPARED BY SAME}

본 발명은 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA), Tobacco rattle virus(TRV) 및 Potato mop-top virus(PMTV)의 5종의 식물 바이러스 중 일부 또는 모두에 대하여 저항성을 나타내는 형질전환 감자의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자에 관한 것이다.

농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 바이로이드(viroid) 감염에 의해 수확량이 감소됨은 물론 품질이 저하되어 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 식물 바이러스병은 곰팡이병 또는 세균병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하여, 바이러스에 대한 저항성을 갖는 품종을 만들고자 하는 노력이 있어왔다. 예를 들면 식물 바이러스 유전자를 식물체 형질전환 기술을 이용하여 식물체에서 발현시킴으로써 바이러스 저항성을 부여하는 방법이 이용되어왔다. 이때, 주로 이용된 바이러스 유전자는 외피단백질이었으며, 복제효소 유전자와 HCPro 유전자가 이용되었다. 그러나 바이러스 특정 유전자 전체를 식물체에서 발현시킴으로써 식물체에 바이러스 저항성을 부여하는 방법은 단일 종류 바이러스 또는 밀접한 연관이 있는 바이러스에 대해서만 저항성을 부여할 수 있다는 문제가 있었다.

또한, 여러 종류의 바이러스에 대한 억제효과를 나타내기 위한 방법이 개발되어 있는데 이는 리보솜 불활성화 단백질(ribosomal inactivating protein: RIP)을 식물체에서 발현시키는 것이다. 그러나 이러한 유전자를 발현하는 형질전환 식물체들은 잎에 반점이 생기거나, 발육이 저해되고, 생식능력을 상실하는 등 비정상적인 형질을 나타내는 문제점이 있다.

또한, 동물로부터 유래한 이중가닥 RNA에 의하여 활성화되는 단백질 인산화효소(double strand dependent protein kinase)로 식물체를 형질전환하여 복합저항성을 유도하는 방법도 있으나, 바이러스 감염에 대한 면역반응이 아니라 증상 발현이 늦어지는 정도의 약한 저항성만 보이는 문제점이 있다. 이중가닥 RNA 유전자를 형질전환을 통하여 식물체 게놈에 도입하면 도입유전자가 파괴되면서 20∼25 뉴클레오타이드 크기의 siRNA(small interference RNA)가 생성되는데, 이러한 siRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 도입된 바이러스 유전자와 염기서열이 동일한 바이러스가 외부에서 침입 시 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 저항성 반응을 PTGS(post-transcriptional gene silencing)라고 한다.

또한, 바이러스 일부유전자를 여러개 연결하여 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성을 갖게 하고자 하는 연구가 이루어진 바 있는데, 토스포바이러스(Tospovirus) 그룹에 대한 저항성을 갖는 담배를 만들기 위하여 토스포바이러스 그룹에 속하는 WSMoV(Watermelon silver mottle tospovirus), TCSV(tomato chlorotic spot virus), GRSV(Groundnut ringspot virus), TSWV(Tomato spotted wilt tospovirus) 등의 4종 바이러스 각각으로부터 N 유전자 부위 150bp 부분을 선정하여 만들어진 새로운 바이러스 유전자를 이용하여 담배를 형질전환시킴으로써 바이러스 저항성 담배를 제조한 바 있다. 그러나 이들 4개 바이러스는 모두 동일그룹에 속하며 또한 동일한 바이러스 유전자인 N 유전자를 도입한 것이며, 현실적으로 한 식물체가 4종의 토스포바이러스에 감염되지는 않는다.

대한민국 공개특허 제 10-2008-0058751 호에는 두 가지의 비선택성 제초제에 복합 저항성을 가지는 감자 식물체 및 그 제조방법에 대하여 기재하고 있으나, 본 발명에서는 특정 감자 바이러스병에 대하여 동시에 저항성을 나타내는 감자 식물체 및 그 제조 방법에 관한 것에 차이가 있다.

국내의 중요한 채소작물 중 하나인 감자 바이러스병(바이러스에 의해 일어나는 감자의 병해를 총칭함)은 감자재배 지역에서는 쉽게 발생되며, 소독 및 살균제 살포 등을 이용한 화학적 방제가 불가능하기 때문에 특별한 방제 방법이 필요하다. 바이러스에 감염된 감자를 연속적으로 재배할 경우, 수확량의 20∼50％까지 감소할 수 있기 때문에 생산에 막대한 차질이 생긴다.

이들 바이러스에 의한 병징은 단일종의 바이러스에 의해 유발되기보다는, 상이한 그룹에 속하는 다종 바이러스에 의해 유발되는 경우가 많으며, 이들 바이러스 중 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 등에 대해 동시에 저항성을 갖는 품종 육성이 절실히 요청되고 있는 실정이다.

이러한 바이러스에 의한 피해를 감소시키기 위한 다양한 전략들이 시도되고 있으며, 본 발명에서는 유전자 변형에 의한 저항성을 이용하는 방안을 제시한다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 다종 바이러스, 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV의 5종류 바이러스 또는 PVY, PLRV 및 PVA의 3종류 바이러스에 대하여 동시에 저항성을 갖는 형질전환 감자식물체의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 감자식물체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자 또는 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 가지는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM 또는 도 2(b)의 개열지도를 가지는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킬 수 있다.

상기 서열번호 7의 YLRA 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자 및 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법에 의해 제조되는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공한다.

본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법으로 제조된 감자식물체는, 감자를 감염시키는 5종의 주요 바이러스인 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV에 대하여 다종의 저항성을 나타내므로 감자 생산성을 증가시키고, 바이러스 저항성 교배 모본으로 이용이 가능하다.

도 1은 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현벡터에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT의 구조를 나타낸 사진이다.
도 2은 YLRATRPM 유전자 또는 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현벡터에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN의 구조를 나타낸 사진이다.
도 3는 pK7GWIWG2(I)에 도입된 융합유전자 YLRA와 YLRATRPM 클론에 대한 HindIII 제한효소 처리에 의하여 확인한 결과 사진이다. 1: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN(867, 976, 1597 bp) ; 2-3: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT(667, 776, 1797 bp); 4-5: pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN(467, 576, 1597 bp); 6-7: pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT(667, 776, 1397 bp).
도 4는 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자로 형질전환된 감자의 서던블럿 분석 결과를 나타낸 사진이다. M은 DNA 사이즈 마커 레인(lane)이며, NC는 음성대조로서 형질전환하지 않은 감자(Vales Sovereign 품종)의 DNA 레인이다. 레인 1 내지 7은 형질전환 감자 계통이다(1: 1000-101-OUT16 계통; 2: 1000-101-OUT28 계통; 3: 1000-101-OUT54 계통, 4: 1000-4-11-OUT19계통, 5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통).
도 5은 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자로 형질전환된 감자의 노던블럿 분석 결과를 나타낸 사진이다. 프로브(Probe)는 각 블럿별 하이브리다이제이션(hybridization)에 이용된 도입 바이러스 유전자 특이 프로브를 나타내며, PC는 양성대조로서 각 바이러스에 감염된 식물체로부터 추출한 RNA 레인을 나타내고, NC는 음성대조로서 형질전환하지 않은 감자(품종: Vales Sovereign)로부터 추출한 RNA 레인을 나타낸다.
도 6는 실시예 4에 의한 감자 식물체(품종:Vales Sovereign)의 PVY, PLRV, PVA 다종바이러스 저항성 조사에 대한 결과 사진이다.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]

이하에서는 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 다종 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체로서, 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자로부터 선택된 3종이상의 바이러스 유전자를 융합한 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 발현벡터로 형질전환 된, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공한다.

상기 발현벡터는 pK7GWIWG2(I)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 다종 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA), Tobacco rattle virus(TRV) 및 Potato mop-top virus(PMTV)의 5가지 종류의 식물 바이러스 모두 또는 이로부터 선택된 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA)의 3가지 종류에 식물 바이러스 모두에 대하여 저항성을 나타내는 형질전환 감자의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자에 관한 것이다.

본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법은, PVY 유전자, PLRV 유전자, PVA 유전자, TRV 유전자 및 PMTV 유전자를 융합시킨 바이러스 융합유전자(이후, 'YLRATRPM 유전자'로도 칭함) 를 보유한 식물체 형질전환용 재조합 발현벡터로 감자를 형질전환 시키는 것을 포함하는 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 PVY 유전자, 서열번호 2의 PLRV 유전자, 서열번호 3의 PVA 유전자, 서열번호 4의 TRV 유전자 및 서열번호 5의 PMTV 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킨 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM으로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 상기 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 이용할 수 있다.

또는, 본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법은, PVY 유전자, PLRV 유전자 및 PVA 유전자를 융합시킨 바이러스 융합유전자(이후, 'YLRA 유전자'로도 칭함)를 보유한 식물체 형질전환용 재조합 발현벡터로 감자를 형질전환 시키는 것을 포함하는 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 PVY 유전자, 서열번호 2의 PLRV 유전자 및 서열번호 3의 PVA 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킨 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 상기 아그로박테리움 투메파시엔스는 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 이용할 수 있다.

상기 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA는 보다 상세하게는 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하고, 도 2(b)에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA를 말한다.

여기서, 상기 형질전환된 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 외래 유전자가 도입된 아그로박테리움, 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LB와 감자의 세포 조직을 공존 배양하여 재분화 감자를 유도할 수 있다.

이때, 상기 감자 세포 조직은 줄기 또는 잎의 조직을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 공존 배양시간은 15 내지 30℃에서 10 내지 40분인 것이 바람직하다.

또한, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스(callus)를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 용어 "다종 바이러스 저항성"이란, 동일하거나 상이한 그룹에 포함되는 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성, 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 바이러스에 대한 저항성을 의미한다.

용어 "재조합"이란, 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "발현 벡터"란, 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

여기서, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens FA et al., Nature296,72-74,1982;NegrutiuIetal.,PlantMol.Biol.8,363-373,1987),원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al., Bio / Technol.3,1099-1102,1985),식물 요소로의 현미주사법(Crossway A et al., Mol . Gen . Genet.202,179-185,1986),각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al., Nature327,70,1987),식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0,301,316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터(binary vector) 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 바이러스 저항성 감자 품종은 Vales Sovereign 인 것이 바람직하며, 형질전환 감자 계통명은 예를 들어 1000-101-OUT16(YLRATRPM-101-OUT16), 1000-101-OUT28(YLRATRPM-101-OUT28), 1000-101-OUT54(YLRATRPM-101-OUT54), 1000-4-11-IN19(1000-4-11-IN19), 600-102-6-IN34(YLRA-102-6-IN34), 600-102-6-IN38(YLRA-102-6-IN38) 및 600-102-6-IN39(YLRA-102-6-IN39)이다.

또한, 형질전환 감자의 게놈에 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여 서던브롯(Southern blot) 분석을 이용하였다.

상기 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 도입된 감자의 바이러스 감염에 대한 저항성은 각각의 형질전환 식물체로부터 도입 바이러스 특이 siRNA 생산 여부를 분석하는 노던블롯(Northern blot) 분석과, PVY-O, PVY-N, PLRV, PVA를 형질전환 감자에 인공접종과 진딧물 전염 방법을 통하여 전염시킨 후 형질전환 감자 식물체가 저항성을 발현하는 것을 확인하였다.

보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환 감자로부터 DNA를 추출하여 서던블롯(Southern blot)으로 목적유전자의 삽입 여부를 확인하였으며, RNA를 추출하여 노던 블롯 분석으로 PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV 각각의 바이러스 유전자의 특이 프로브(probe)를 이용하여 siRNA를 검출함으로써, 형질전환 감자에 도입된 바이러스 유전자 발현에 의한 전사후유전자침묵현상(Post transcriptional gene silencing)으로 도입 바이러스 5종 또는 3종에 대하여 저항성을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법에 의해 제조된 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공할 수 있다.

상기 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체는 감자를 감염시키는 주요 5종의 바이러스인 PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV 또는 이 중 선택되는 3종 바이러스인 PVY, PLRV, PVA에 대하여 저항성을 나타내며, 그에 따라 감자의 생산성 향상 효과를 가진다.

또한, 본 발명은 YLRATRPM 유전자를 선정한 각각의 바이러스 유전자 부위 및 염기서열을 제공한다.

PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus), PVA(Potato virus A), TRV(Tobacco rattle virus) 및 PMTV(Potato mop-top virus) 각각으로부터 일부 유전자를 선정하여 융합하였으며, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5에 나타내었다.

또한, 본 발명은 YLRA 유전자는 서열번호 7에 나타냈으며, YLRA 유전자를 선정한 각각의 바이러스 유전자 부위 및 염기서열을 제공한다.

PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus) 및 PVA(Potato virus A) 각각으로부터 일부 유전자를 선정하여 융합하였으며, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3에 나타내었다.

이하에서, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하지만, 이러한 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.

[발명의 실시를 위한 형태]

실시예 1: 융합유전자 YLRATRPM 및 YLRA 의 클로닝

실시예 1-1 : 융합유전자 YLRATRPM 의 클로닝

PVY 전장, PLRV 전장, PVA 전장, TRV RNA1및 PMTV RNA1 유전자가 각각 클로닝 된 클로닝 벡터의 플라스미드 DNA를 융합유전자 제작을 위한 주형으로 이용하였다 (참조: PVY (strain O, SCRI-O isolate; Barker et al., 2009), PLRV (Canadian isolate; Nurkiyanova et al., 2000), PVA (strain U; Paalme et al., 2004), PMTV (Swedish isolate; Savenkov et al., 2003) 및 TRV (isolate PpK20; Liu et al., 2002.)). 이로부터 PVY 외피단백질 200bp(8894-9093, GenBank accession no. NC_001616;서열번호 1), PLRV 외피단백질 200bp(3831-4030, GenBank accession no. AF453394;서열번호 2), PVA 원통형봉입체 200bp(4472-4671, GenBank accession no. Z21670;서열번호 3), TRV 복제효소 200bp(3427-3626, GenBank accession no. NC_003805; 서열번호 4), PMTV 복제효소 200bp(3411-3610, GenBank accession no. NC_003723; 서열번호 5)를 오버랩(overlap) PCR에 의해 융합하여 하나의 새로운 바이러스 유전자 YLRATRPM(1000bp)를 만들었다. 이때, 상기 오버랩 PCR에 이용한 프라이머(primer)를 표 1에 나타내었다. 상기 오버랩 PCR은 클로닝 벡터에 도입된 각 바이러스 플라스미드 DNA를 100ng을 주형으로 이용하였고, 5㎕의 10×PCR 완충액, 2㎕의 50 mM MgSO₄,4㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕의 Taq DNA polymerase(Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity), 서열번호 8 내지 18의 프라이머를 각각 10uM로 이용하여,총 50㎕의 반응액에서 이루어졌다.

보다 구체적으로, 오버랩 PCR 방법은 PVY와 PLRV 주형을 넣은 후 서열번호 8과 서열번호 11 프라이머를 넣어 PCR 을 한 후 PVY와 PLRV이 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY와 PLRV이 합성된 정제된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 13을 넣어 PCR을 하여 PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 PCR 산물을 얻는다. 한편 TRV와 PMTV 주형을 넣은 후 서열번호 15와 서열번호 18의 프라이머를 넣어 PCR 한 후 TRV와 PMTV가 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 PCR 산물과 TRV와 PMTV이 합성된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PVY, PLRV, PVA, TRV와 PMTV 가 합성된 융합유전자 YLRATRPM을 얻는다.

PCR 반응 조건은 92℃에서 2분 변성(denaturation) 반응후, 92℃에서 30초 변성(denaturation), 55℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 2분 연장(extention) 반응을 25회 반응시킨 후, 72℃에서 10분 반응시켰다.

상기 YLRATRPM 유전자의 DNA 서열은 본 출원과 동시에 제출하는 서열목록의 서열번호 6과 같다.

상기 YLRATRPM 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터(Plant systems biology, 벨기에)에 삽입하였다. 상기 벡터 pK7GWIWG2(I)는 T-DNA의 오른쪽 경계(RB: right border)와 왼쪽 경계(LB: left border) 사이에 위치한 CaMV 35S 프로모터(promoter)와 CaMV 35S 터미네이터 사이에 인트론(intron)을 포함하고 있으며, 선발표지 유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있다. 또한 상기 벡터는 게이트웨이 클로닝(Gateway recombination cloning)이 가능하도록 인트론의 전과 후에 attR1과 attR2 카세트를 갖고 있다. 따라서 게이트웨이 시스템(Invitrogen사)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 본 발명의 YLRATRPM 유전자를 상기 벡터에 삽입하였으며(pK7GWIWG2(I))/YLRATRPM), 이때 벡터에 클로닝 가능 부위(CmR-ccdB)가 두 군데 존재하므로 YLRATRPM 유전자가 반대방향으로 반복 삽입됨으로써 RNA 전사 후 헤어핀구조(이중가닥 RNA 형태)가 되도록 하였다. 이때, 상기 벡터에 YLRATRPM 유전자 클로닝시 인트론을 중심으로 YLRATRPM 유전자를 antisense-intron-sense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 OUT으로 명명하였으며, sense-intron-antisense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 IN으로 명명하였다. 도 2의 (a)는 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현백터에 삽입하여 제작한 재조합 백터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN의 구조를 나타낸 사진이다.

실시예 1-2 : 융합유전자 YLRA 의 클로닝

PVY 전장, PLRV 전장 및 PVA 전장 유전자가 각각 클로닝 된 클로닝 벡터의 플라스미드 DNA를 융합유전자 제작을 위한 주형으로 이용하였다. 이로부터 PVY 외피단백질200bp(8894-9093, GenBank accession no. NC_001616;서열번호 1), PLRV 외피단백질 200bp(3831-4030, GenBank accession no. AF453394;서열번호 2) 및 PVA 원통형봉입체 200bp(4472-4671, GenBank accession no. Z21670;서열번호 3)를 증폭하도록 제작한 프라이머를 이용하여 오버랩(overlap) PCR에 의해 융합하여 하나의 새로운 바이러스 유전자 YLRA(600bp)를 만들었다. 이때, 상기 오버랩 PCR에 이용한 프라이머(primer)를 표 1에 서열목록 8 내지 14로 나타내었다. 보다 구체적으로, 상기오버랩 PCR 방법은 PVY와 PLRV 주형을 넣은 후 서열번호 8과 서열번호 11 프라이머를 넣어 PCR을 한 후 PVY와 PLRV이 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY와 PLRV이 합성된 정제된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 13을 넣어 PCR을 하여 PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 융합유전자 YLRA을 얻는다.

상기 YLRA 유전자의 DNA 서열은 본 출원과 동시에 제출하는 서열목록의 서열번호 7과 같다.

상기 YLRA 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터(Plant systems biology, 벨기에)에 삽입하였다. 상기 벡터 pK7GWIWG2(I)는 T-DNA의 오른쪽 경계(RB: right border)와 왼쪽 경계(LB: left border) 사이에 위치한 CaMV 35S 프로모터(promoter)와 CaMV 35S 터미네이터 사이에 인트론(intron)을 포함하고 있으며, 선발표지 유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있다. 또한 상기 벡터는 게이트웨이 클로닝(Gateway recombination cloning)이 가능하도록 인트론의 전과 후에 attR1과 attR2 카세트를 갖고 있다. 따라서 게이트웨이 시스템(Invitrogen사)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 본 발명의 YLRA 유전자를 상기 벡터에 삽입하였으며(pK7GWIWG2(I))/YLRA), 이때 벡터에 클로닝 가능 부위(CmR-ccdB)가 두 군데 존재하므로 YLRA 유전자가 반대방향으로 반복 삽입됨으로써 RNA 전사 후 헤어핀구조(이중가닥 RNA 형태)가 되도록 하였다. 이때, 상기 벡터에 YLRATRPM 유전자 클로닝시 인트론을 중심으로 YLRA 유전자를 antisense-intron-sense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 OUT으로 명명하였으며, sense-intron-antisense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 IN으로 명명하였다.

도 2의 (b)는 YLRA 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현백터에 삽입하여 제작한 재조합 백터 pK7GWIWG2(I)/YLRAM-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN의 구조를 나타낸 사진이다.

상기 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터에 삽입한 것을 확인하기 위하여 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN과 pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT 클론을 HindIII 제한효소로 처리한 후, 전기영동하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. (레인1: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN(867, 976, 1597 bp의 절단 패턴); 레인2-3: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT(667, 776, 1797 bp의 절단 패턴); 레인 4-5: pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN(467, 576, 1597 bp의 절단 패턴); 레인 6-7: pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT(667, 776, 1397 bp의 절단 패턴)).

실시예 2: YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 삽입된 아그로박테리움( Agrobacterium )과 감자 조직의 공존배양 및 형질전환체의 유기

상기 실시예 1에서 제작된 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM벡터 또는 pK7GWIWG2(I)/YLRA벡터를 각각 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404에 도입한 다음 줄기 절편 형질전환법을 이용하여 감자(품종: Vales Sovereign)를 형질전환시켰다(Joung et al., 1996). 상기 아그로박테리움을 접종하기 전, 감자 줄기는 NAA(naphthalene acetic acid) 10mg/L, BA 10mg/L CaCl₂1 47mg/L, NH₄NO₃ 80mg/L를 포함한 MS 배지(Murasighe ＆ Skoong medium)에 24시간 동안 전처리 한 다음 아그로박테리움균 현탁액에 20분간 침지하였다. 아그로박테리움균이 접종된 줄기는 2.4-D(2.4-dichloro phenoxy acetic acid)가 2 mg/L 첨가된 MS 배지에서 48시간 동안 암상태에서 배양하였다. 암배양이 끝난 후 캘러스 유도를 위하여 선발 항생제(카나마이신)가 포함되지 않은 MS배지(NAA 0.1mg/L, Zeatin 2.0mg/L, GA 0.01 mg/L, 세포탁심 250 mg/L)에서 2주 동안 배양하여 캘러스가 유도되면 카나마이신 40 ㎍/ml을 포함한 MS 배지에 옮겨서 감자를 재분화시켰다. 재분화 식물체가 1.5cm 정도 자라면 분리하여 생육시켰다. 형질전환 감자를 배양하는 조직배양실 광조건은 16시간이었으며 온도는 25℃를 유지하였다. 형질전환 감자는 온실에서 성장시킨 다음, 형질전환된 유전자의 삽입여부와 바이러스 저항성 유무를 분석하였다.

실시예 3: 형질전환체의 확인

3-1. 서던블롯 분석( Southern blotting )

먼저 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 감자식물체의 게놈에 삽입되었는지 확인하기 위하여 DNeasy kit(Qiagen사)를 이용하여 실시예 2의 형질전환 감자로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 25 ㎍를 제한효소 EcoRI으로 처리하여 절단한 후, 1％ 아가로즈 겔에서 25V로 17시간 동안 전기영동하였다 (0.5X TBE 버퍼 사용). 상기 겔 상의 게놈 DNA를 나일론 멤브레인(nylon Hybond™-N+membrane, AmershamLifescience사)에 모세관 전이 방법으로 블롯팅한 후, 상기 멤브레인 상에 블롯팅된 DNA 단편에, PVY, PLRV 및 PVA 유전자가 각각 200bp 씩 연결된 600bp 유전자(YLRA)를 RedyprimeII™RandomPrimedlabelingSystem (AmershamLifescience사)을 사용하여 표지(labeling)한 유전자 단편을 프로브로 이용하여 혼성화(hybridization)를 수행하였다. 상기 혼성화 및 멤브레인 세척은 공지된 표준 방법에 따라 수행하였으며, BAS-1800II Bio-Imaging analyzer(Fujifilm)을 사용하여 프로브 인식을 수행하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 형질전환 감자식물체 1 내지 7(각각 1 : 1000-101-OUT16 계통, 2 : 1000-101-OUT28 계통, 3: 1000-101-OUT54 계통, 4 : 1000-4-11-OUT19계통, 5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통)은 모두 상기 600 bp 프로브로 인식되었으므로, 상기 형질전환 감자식물체 1 내지 7의 게놈에는 본 발명의 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 삽입되었음을 알 수 있다.

3-2. 노던블롯 분석( Northern blotting )

pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT 벡터 또는 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN 벡터로 형질전환시킨 형질전환 감자식물체에서 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자의 전사도(transcription level)를 알아보고자 하였다.

실시예 2의 조건으로 배양한 감자식물체의 잎 0.5g을 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 Trizol(Invitrogen사)을 이용하여 전체 RNA를 추출분리하고, 42％ urea를 포함한 12％ PAGE 겔(arylamide:bis=19:1)에서 0.5× TBE 완충액을 이용하여 100 V로 2시간 동안 전기영동을 수행하였으며, 상기 겔 상의 RNA를 Hybond N+ 멤브레인에 전이시켰다 (250 mA, 1시간 가량).

혼성화를 위한 프로브의 제조에 있어, PVY및 TRV 각각에 대한 프로브의 제조에서는 pGEMT-easy 벡터(Promega사)에 클로닝된 PVY 200bp및 TRV 200bp 유전자를 SalI 제한효소로 선형화시킨 DNA를 주형으로 SP6 RNA polymerase를 첨가하고; 또한 PLRV, PVA및 PMTV각각에 대한 프로브의 제조에서는 pGEMT-easy 벡터에 클로닝된 PLRV 200bp, PVA 200bp및 PMTV 200bp 유전자를 NcoI 제한효소로 선형화시킨 DNA를 주형으로 T7 RNA polymerase를 첨가하였으며; 이들 모두 DIG-표지된 dNPT mixture(digozigenin-labeled dNTP mixture, Roche)와 반응시켜 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다.

혼성화는, 상기 멤브레인을 43℃에서 2시간 동안 ULTRAhyb 용액(Ambion사)을 이용하여 전혼성화(prehybridization) 후 특이 프로브를 첨가한 후 하룻밤동안 수행하였다. 상기 멤브레인의 세척은, 45℃에서 2％ SDS를 포함한 2 ×SSC 버퍼로 15분간 2회 세척 후, 0.1X SSC 버퍼에서 15분간 2회 세척하였으며, 상온에서 0.3％의 Tween20과 0.15M NaCl을 포함한 0.1M 말레산(Maleic acid, pH7.5) 버퍼를 이용하여 15분간 2회 세척하였다. 프로브 인식을 위하여 1X 블로킹(blocking) 버퍼(Roche)를 이용하여 1시간 동안 처리 후 동일 용액에 4 ㎕의 Anti-Digoxigenin-AP Fab fragment(Roche)를 첨가하여 2시간 처리하고, 그 후 0.3％의 Tween20과 0.15M NaCl이 첨가된 0.1M 말레산(pH 7.5) 버퍼를 이용하여 20분간 2회 세척한 뒤 필름(Fujifilm사)에 노출시켰다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 형질전환 감자식물체 1, 2, 3 및 4(각각 1 : 1000-101-OUT16 계통, 2 : 1000-101-OUT28 계통, 3: 1000-101-OUT54 계통 및 4 : 1000-4-11-OUT19계통)은 모두 상기 프로브들로 인식되었으므로, 상기 형질전환 감자식물체 1, 2, 3 및 4 모두에서 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 유전자가 모두 전사되었음을 알 수 있며, 본 발명의 형질전환 감자식물체 5, 6 및 7(5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통)는 PVY, PLRV, PVA 프로브들로 인식되었으므로, 형질전환 감자식물체 5, 6 및 7에서 PVY, PLRV 및 PVA 유전자가 전사되었음을 알 수 있었다.

3-3. 웨스턴블롯 분석( Western blotting )

상기 실시예 2의 조건으로 형질전환된 감자 식물체의 바이러스 저항성 검정을 위하여, 웨스턴블롯 분석을 이용하였다. 분리젤(separating gel)은 0.1％ SDS를 포함하는 0.375M Tris-HCl, pH 8.8를 넣어 12.5％ 아크릴아마이드(arylamide:bis=29:1) 농도로 만들었으며, 스태킹 젤(stacking 젤)은 0.1％ SDS을 포함하는 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8을 이용하여 5％ acrylamide(arylamide:bis=29.1) 농도로 SDS-PAGE 겔을 제조하였다.

실시예 2로부터 제조된 형질전환된 감자 식물체의 잎 0.3g을 300㎕의 1× PBS 완충액을 이용하여 마쇄한 후, 상층액을 5× sample 완충액(60 mM Tris-HCl pH 6.8, 25％ glycerol, 2％ SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanl and 0.1％ bromophenol blue)과 혼합하여 5분 동안 끊인 후, 상기 준비한 SDS-PAGE 젤에 로딩하여, running 완충액(25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1％ SDS)으로 100 볼트에서 1시간 30분 동안 전개하였다. 전개된 단백질은 250 mM에서 1 시간 동안 SDS가 포함되지 않은 running 완충액을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전이하였다.

PVY, PLRV, PVA와 TRV 특이항체는 각각 PVGB(SWU, Korea), ATCC PVAS-649, PVAS-266T와 ATCC PVAS-820로부터 구입하여 이용하였다, 2차 항체는 다클론 특이 항체를 이용한 경우에는 Anti-rabbit IgG(H＆L) AP conjugate, 단클론 특이 항체를 이용한 경우에는 anti-Mouse IgG (H＆L) AP conjugate(Promega, USA)를 이용하였다. 발색을 위해서는 NBT/BCIP(Sigma)를 이용하였다.

실시예 4: 형질전환된 감자식물체의 바이러스 저항성 조사

바이러스 저항성 정도를 확인하기 위하여, 상기 식물체의 7계통(각각 1000-101-OUT16 계통, 1000-101-OUT28 계통, 1000-101-OUT54 계통, 1004-4-11-OUT19계통, 600-102-6-IN34 계통, 600-102-6-IN38 계통 및 600-102-6-IN39 계통) 및 음성대조군으로 형질전환시키지 않은 감자 Vales Sovereign 품종에 진딧물을 이용한 바이러스 전염을 시켰다. 진딧물 전염 방법은 PVY-O, PVY-N와 PVA의 경우 복숭아혹진딧물 2령충을 3시간 동안 굶긴 후 각각의 바이러스를 증식시킨 감자 잎에 올려 놓아서 5분 동안 바이러스를 취득하게 하고, 바이러스를 취득한 진딧물을 검정하고자 하는 감자 한그루 당 10마리씩 옮겨서 바이러스를 전염시켰다. PVY-O+PVA 접종은 PVY-O와 PVA에 중복감염된 감자에 진딧물을 옮겨 놓아서 바이러스를 취득하도록 하였다. PLRV 진딧물 전염 방법은 PLRV에 감염된 땅꽈리에 복숭아혹진딧물을 3일동안 올려놓아서 바이러스를 취득하게 한 후, 바이러스를 취득한 진딧물을 감자 한 그루당 10마리씩 옮겨 놓는 방법으로 바이러스를 전염시켰다. 다음 1달 경과 후의 감염 정도(RT-PCR 이용) 및 저항성을 조사하여 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.

이때, 바이러스 접종 후 감염 여부를 확인하기 위한 수단으로 PVY의 경우 웨스턴 블롯분석을 이용하였으며, PLRV와 PVA의 경우 RT-PCR을 이용하였다. 상기 RT-PCR에 이용한 프라이머를 표 2에 나타내었다. 역전사반응은 1㎕의 10 uM 리버스 primer와 1 ㎕의 RNA를 넣고 멸균수를 넣어 총 부피 10㎕의 반응액을 70℃에서 10 분간 반응시킨 후 2㎕의 10× PCR 버퍼, 2㎕ 의 25 mM MgCl₂,2㎕ 의 2.5 mM dNTPs and 1㎕ of ImProm-II reverse transcriptase(Promega, USA)를 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PCR 반응은 20㎕의 RT 반응액, 5㎕의 10× PCR 완충액, 2㎕의 50 mM MgSO₄,4㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕의 Taq DNA polymerase(Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity), 프라이머로는 각각 서열번호 21의 포워드 프라이머 및 서열번호 22의 리버스 프라이머를 이용하거나, 서열번호 23의 포워드 프라이머 및 서열번호 24의 리버스 프라이머를 이용하며, 각각 10uM 프라이머 1㎕, 0.5 ㎕의 Taq DNA polymerase(Roche, USA)를 총 50㎕의 반응액에서 이루어졌다. PCR 반응은 92℃ 변성(denaturation)단계 2분 후, 92℃ 30초, 52℃ 어닐링(annealing)단계 30초, 72℃ 연장(elongation)단계 1분 반응을 30회 시킨 후 마지막으로 72℃ 10분 반응시켰다.

표 3에서 PVY-O, PVY-N는 각각 바이러스 분리주를 나타낸다.

표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 모든 접종 바이러스에서, 형질전환된 식물체의 저항성(저항성={(검정된 식물의 수-감염된 식물의 수)/검정된 식물의 수})이 형질전환되지 않은 식물체(대조군)에 비해 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

따라서, 저항성을 나타내는 형질전환된 감자식물체는 음성 대조군에 비해 상기 바이러스들에 대해 큰 저항성을 나타내었다. 또한 PLRV를 접종한 형질전환 감자식물체의 경우, 계통에 따라 감염 정도 및 저항성에서 차이를 나타내었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD FOR GENERATING TRANSGENIC POTATO PLANT HAVING MULTI-VIRUS RESISTANCE AND TRANSGENIC POTATO PLANT DEVELOPED BY USING THE METHOD <130> FC11046PCK <150> KR10-2010-0067991 <151> 2010-07-14 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus Y <400> 1 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg 200 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Potato leaf roll virus <400> 2 tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa ggatggaata ctcaaggcct 60 accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt cagcgaggcc tcttccacct 120 cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa agtatcatcc ctccagtcct 180 acgtcaacaa gttccaaatt 200 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus A <400> 3 gaagcttgga caagttgaga tcatcaccaa gggcagtgct 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Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP+PVY CP Reverse Primer <400> 9 actcggcccg aaggtgacgc atttctatat acgctt 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY CP+PLRV CP Forward Primer <400> 10 aagcgtatat agaaatgcgt caccttcggg ccgagt 36 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI+PLRV CP Reverse Primer <400> 11 tctcaacttg tccaagcttc aatttggaac ttgttgacgt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP+PVA CI Forward Primer <400> 12 acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 40 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI Reverse Primer <400> 13 ttctctcgaa atagctaata ct 22 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP+PVA CI Reverse Primer <400> 14 agcaccaggc ttcaaagaaa ccttctctcg ccatagctaa 40 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI+TRV REP Forward Primer <400> 15 agctatggcg agagaaggtt tctttgaagc ctggtgct 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP+TRV REP Reverse Primer <400> 16 tcttgcagac aaatcatcct taagtactcc cgacctct 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP+PMTV REP Forward Primer <400> 17 agaggtcggg agtacttaag gatgatttgt ctgcaaga 38 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP Reverse Primer <400> 18 tcaccacgga tgtaccata 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616 9382-9373 nt-Sense-Forward Primer <400> 19 catgaacttg actccaagta ga 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616_8573-8592 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 20 gcaaatgaca caattgatgc 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_3844-3867 nt-Sense-Forward Primer <400> 21 gagtctatca gactgtccgg catt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_4401-4424 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 22 attgagagta atactgagag ctaa 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_8532-8555 nt-Sense-Forward Primer <400> 23 ccgaaactct tgatgcaagc gaa 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_9315-9338 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 24 cacccccttc acgcctaaaa ggtg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV-NC_003805 3191-3214 nt-Sense-Forward Primer <400> 25 cgatgtatct gtcaaggaga tcag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV_NC_003805_3603-3626 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 26 ttaagtactc ccgacctcta gcga 24 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723 3067-3088 nt-Sense-Forward Primer <400> 27 atgaatgaaa ttccgatttt ga 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723_3643-3662 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 28 accatctctg ggtccaacgg t 21

Claims

서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자로부터 선택된 3종이상의 바이러스 유전자를 융합한 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)로 형질전환된, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체.
서열번호 6의 YLRATRPM 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시켜 제조한 것을 특징으로 하는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 서열번호 7의 YLRA 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자 및 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시켜 제조한 것을 특징으로 하는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 2 또는 청구항 4에 있어서, 상기 형질전환된 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시키는 것을 추가로 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 다종바이러스 저항성 감자식물체가 PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus), PVA(Potato virus A), TRV(Tobacco rattle virus) 및 PMTV(Potato mop-top virus) 모두에 대해 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 다종바이러스 저항성 감자식물체가 PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus) 및 PVA(Potato virus A) 모두에 대해 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 2 또는 청구항 4에 있어서, 상기 감자가 Vales Sovereign 품종의 감자인 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.
청구항 2 내지 청구항 5, 및 청구항 8 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체.