CN118127030A - 热胁迫抗性相关蛋白OsALKBHL1或调控其表达的物质的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了热胁迫抗性相关蛋白OsALKBHL1或调控其表达的物质的应用。本发明属于生物技术领域，本发明提供的蛋白质为OsALKBHL1蛋白，可为如下：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗胁迫功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的一端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对水稻热胁迫抗性编码基因Osalkbhl1进行特定靶点的定点突变或敲除，为热胁迫抗性的水稻品种选育提供新材料，对加快改良水稻品种具有积极的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种热胁迫抗性相关蛋白OsALKBHL1或调控其表达的物质的应用。
背景技术
在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如高盐、高温、干旱及冷害等。温度胁迫是限制植物的地理分布、影响农作物产量,并威胁粮食安全的主要环境因子。全球气候变化引起的局部温度异常直接导致作物减产。
DNA 6mA能够调控真核生物发育及其对外源环境刺激的响应。研究表明，DNA 6mA调控胚胎发育和肿瘤的发生；还能调控哺乳动物对低氧环境刺激的应答过程。核小体重塑因子编码基因DEFICIENT IN DNA METHYLATION 1(DDM1)基因突变后水稻DNA 6mA修饰丰度降低，并呈现矮化、结实率降低的表型。进一步研究发现，DDM1能够介导6mA修饰调控株高相关基因GRAIN NUMBER,PLANT HEIGHT,AND HEADING DATE7(GHD7)、BR-DEFICIENT DWARF1(BRD1)以及DWARF7(DWF7)的表达，说明DDM1介导的6mA修饰调控水稻营养生长和生殖生长。此外，DNA 6mA还与水稻的耐热性密切相关。上述研究表明，DNA 6mA不仅能够调控哺乳动物的发育和胁迫响应；还能参与水稻的生长发育和高温应答过程。因此，鉴定植物中DNA 6mA的甲基转移酶、去甲基转移酶和识别蛋白并研究期调控植物发育和胁迫响应的功能，对于利用分子育种手段定向改良作物产量和抗逆性具有重要价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高水稻抵抗热胁迫的能力。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的蛋白质或与蛋白质相关的生物材料中，所述蛋白质为OsALKBHL1蛋白，可为如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗胁迫功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的一端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述生物材料为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述蛋白质中，所述蛋白质来源于水稻(Oryza sativa)。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
B1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsALKBHL1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质OsALKBHL1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsALKBHL1且具有蛋白质OsALKBHL1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。
B1)所述核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)的DNA分子：
(a1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
(a3)来源于水稻且与限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
B1)所述核酸分子具体可为编码链的编码序列是序列2所示的DNA分子。
本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pFGC5941和/或pCAMBIA1300和/或载体pEASY-Blunt simple；
上述生物材料中，B2)和C3)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
上述B3)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用OsALKBHL1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
本发明还提供了上述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在调控植物对热胁迫抗性中的应用，所述基因编码上述蛋白质，所述应用可为下述任一种：
P1)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物对热胁迫抗性中的应用，
P2)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育抗热胁迫植物中的应用，
P3)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在改良植物热胁迫抗性种质资源中的应用。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质OsALKBHL1。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
本文中，所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。
本文中，所述调控植物热胁迫抗性可为上调或增强或提高植物热胁迫抗性，也可为下调或抑制或降低植物热胁迫抗性。
本文中，所述调控所述蛋白质的编码基因的表达可为抑制或降低或下调所述编码基因表达。抑制或降低或下调所述编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。
所述基因敲除(geneknockout)是指通过基因编辑技术使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
本发明还提供了上调或增强或提高水稻热胁迫抗性的方法。
本发明提供的上调或增强或提高水稻热胁迫抗性的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低水稻中所述蛋白质的编码基因的表达，使水稻热胁迫抗性提高。
在一个具体的实施例中，上调或增强或提高水稻热胁迫抗性的方法可包括如下步骤：
A)用CRISPR/Cas9系统对受体水稻中的所述Osalkbhl1蛋白的编码基因Osalkbhl1进行基因编辑，且使所述Osalkbhl1基因发生突变导致翻译蛋白提前终止，得到目的水稻；
B)所述目的水稻自交，得到纯合水稻，即为目的水稻，所述目的水稻的热胁迫抗性优于所述受体水稻。
所述Osalkbhl1基因是如下(a1)或(a2)或(a3)的DNA分子：
(a1)Osalkbhl1基因编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质Osalkbhl1的DNA分子；
(a3)来源于水稻且与限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
本发明还提供了培育热胁迫抗性水稻的方法。
本发明提供的培育热胁迫抗性水稻的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低水稻所述蛋白质的编码基因的表达，得到目的水稻，所述目的水稻的热胁迫抗性高于所述水稻。
上述方法中，所述下调或抑制或降低水稻所述蛋白质的编码基因的表达为敲除目的水稻所述蛋白质的编码基因。
上述方法中，所述敲除通过CRISPR/Cas9系统实现。
上述方法中，所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点为序列3第4723-4742位或对应序列2的第919-938位。
上述方法中，所述敲除目的水稻所述蛋白质的编码基因可为将水稻基因组中的序列3所示的所述蛋白质的编码基因进行下述至少一种突变：
1)用5’-GGTGATATCGTAGC-3’替换水稻基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除；
2)用5’-GGTGATATCGTATTGAGGC-3’替换水稻基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’GGTGATATCGTATTGATGGC-3’，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除。
本发明还提供了一种用于改良水稻热胁迫抗性的物质，为用于基因编辑所述编码OsALKBHL1蛋白的基因的CRISPR/Cas9系统；所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点为序列3第4723-4742位或对应序列2的第919-938位。
本发明利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对水稻热胁迫抗性相关蛋白Osalkbhl 1编码基因进行特定靶点的定点突变或敲除，为热胁迫抗性的水稻品种选育提供新材料，对加快改良水稻品种具有积极的作用。
附图说明
图1为重组质粒SG2027-OsALKBHL1的结构示意图。
图2为突变位点及其周边核苷酸的测序结果。
图3为水稻关键农艺形状的表型和统计图。
图4为热胁迫试验中的表型和存活率统计。
图5为UHPLC-MS/MS检测DNA 6mA修饰的丰度的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pSG2027载体已记载于Zhang Q,Liang Z,Cui X,et al.N6-methyladenine DNA methylation in Japonica and Indica rice genomes and itsassociation with gene expression,plant development,and stressresponses.Molecular plant,2018,11(12):1492-1508.公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
利用EXCEL软件进行数据的统计分析，利用SPASS软件进行数据的多重差异性比较。
实施例1、水稻OSALKBHL1基因的获得
提取水稻品种日本晴的叶片DNA，以此DNA为模板，利用引物OSALKBHL1-F：5’-ATGTACGGCGACACCGAG-3’；OSALKBHL1-R：5’-TCAGTAGACTTGTCTGATG-3’采用MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase(货号：P505-d1，Vazyme)进行PCR扩增，得到扩增产物(即OSALKBHL1基因的编码区)。OSALKBHL1基因在水稻品种日本晴的编码序列(CDS)是SEQ IDNo.2，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的OSALKBHL1蛋白。水稻日本晴的基因组DNA中，编码OSALKBHL1蛋白的基因组基因如序列表的SEQ ID No.3所示。SEQ ID No.3的第2055-2170位为第一外显子，第2269-2438位为第二外显子，第3067-3321位为第三外显子，第4263-4401位为第四外显子，第4499-4565位为第五外显子，第4647-4768位为第六外显子，第4872-5011位为第七外显子。
实施例2、构建用于敲除OsALKBHL1基因的重组质粒pSG2027-OsALKBHL1
重组质粒pSG2027-OsALKBHL1的结构示意图如图1。重组质粒pSG2027-OsALKBHL1的核苷酸序列是序列表中的序列4。pSG2027-OsALKBHL1表达靶向于OsALKBHL1基因的sgRNA，靶序列为：5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’(SEQ ID No.5)，该sgRNA的靶点位于OsALKBHL1基因的第6外显子，该sgRNA的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.3的第4723-4742位或对应序列2的第919-938位。pSG2027-OsALKBHL1含有核苷酸序列是序列4的第59-7247位的sgRNA基因表达盒，sgRNA基因如序列表的序列4的第519-577位核苷酸所示，第59-268位核苷酸为启动sgRNA基因转录的启动子，第7052-7247位核苷酸为终止sgRNA基因转录的终止子。
pSG2027-OsALKBHL1含有核苷酸序列是第3801-8072位的Cas9蛋白基因表达盒，序列4中的第3801-8072位核苷酸编码Cas9蛋白，第725-2725位核苷酸为启动Cas9蛋白基因转录的启动子，第7052-7247位核苷酸为终止Cas9蛋白基因转录的终止子。
实施例3、OsALKBHL1基因敲除水稻的获得和鉴定
1.OsALKBHL1基因敲除水稻的获得
将步骤2中获得的重组质粒pSG2027-OsALKBHL1导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。采用农杆菌浸染法，将重组农杆菌对水稻日本晴的胚性愈伤组织进行遗传转化，然后筛选抗性愈伤组织(抗性筛选采用100mg/L潮霉素)，然后进行分化再生培养，然后进行生根培养，得到再生植株。
具体步骤如下：
(1)取出植物的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。
(2)将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。
(3)取实施例2中构建的重组载体pSG2027-OsALKBHL1导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌，命名为EHA105/pSG2027-OsALKBHL1。
(4)取步骤(3)得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到EHA105/pSG2027-OsALKBHL1菌悬液。
(5)将步骤(2)的日本晴愈伤组织浸泡于步骤(4)制备的EHA105/pSG2027-OsALKBHL1菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于加入乙酰丁香酮和葡萄糖的共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。
(6)完成步骤(5)后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至加入头孢霉素的抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。
(7)将上述培养后的愈伤组织移至加入潮霉素和头孢霉素的筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。
(8)完成步骤(7)后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到候选OsALKBHL1基因敲除植株。
将利用重组载体SG2027-OsALKBHL1得到的转基因植株记为OsALKBHL1转基因植株。
诱导培养基和分化培养基配方均为MS培养基。
2.OsALKBHL1基因敲除水稻的鉴定
待测植株：日本晴Nip(对照组)以及实施例3得到的候选OsALKBHL1基因敲除植株。
提取待测植株叶片基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用引物OsALKBHL1-F1和引物OsALKBHL1-R1组成的引物对进行PCR扩增。
OsALKBHL1-F1：5’-TAGGTGACATGCTTGGTGGC-3’，
OsALKBHL1-R1:5’-ATTCGTGGAACACCTGCGATA-3’。
用pSG2027-OsALKBHL1质粒作为阳性对照(V)，用受体品种日本晴作为阴性对照(CK)。然后将得到的产物进行测序。
经测序鉴定，与Nip的基因组DNA相比，osalkbhl1-1植株(用osalkbhl1-1表示)的两条同源染色体中，编码OsALKBHL1蛋白的基因均发生了如下突变：“5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’(对应于SEQ ID No.3的第4723-4742位，SEQ ID No.2的第919-938位)”突变为“5’-GGTGATATCGTAGC-3’”；编码蛋白序列中缺少了两个氨基酸，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2。
经测序鉴定，与Nip的基因组DNA相比，osalkbhl1-2植株(用osalkbhl1-2表示)的两条同源染色体中，编码OsALKBHL1蛋白的基因均发生了如下突变：“5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’”突变为“5’-GGTGATATCGTATTGAGGC-3’”，导致编辑位点后的氨基酸翻译移码，蛋白序列提前终止，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图2。
通过以上鉴定，得到杂合编辑植株，命名为T0代转OSALKBHL1基因敲除水稻。
将得到的T0代转OSALKBHL1基因敲除水稻培养到T2代，每代培养的水稻经过自交后进行PCR和一代测序鉴定，筛选纯合株系。筛选得到2个纯合突变型植株(即两条同源染色体发生的突变一致)，分别命名为osalkbhl1-1和osalkbhl1-2株系。
将上述osalkbhl1基因纯合突变类型的T1代水稻突变体植株继续培育，筛选得到不含转基因元件的T2代osalkbhl1植株，并进行表型鉴定。
osalkbhl1-1植株自交并收获种子，将种子培育为植株，即为T1代植株。T1代植株自交并收获种子，即为T2代种子。osalkbhl1-1植株及其自交后代，称为osalkbhl1-1株系。
osalkbhl1-2植株自交并收获种子，将种子培育为植株，即为T1代植株。T1代植株自交并收获种子，即为T2代种子。osalkbhl1-2植株及其自交后代，称为osalkbhl1-2株系。
实施例4、水稻生产性状比较
待测植株为：水稻Nip、突变株osalkbhl1-1和osalkbhl1-2株系的T3代纯合株系。
将各待测株系的种子在温室萌发并育苗(从露白开始计时，共培养3周)，得到3周幼苗；将3周幼苗移栽至河北廊坊的大田并正常栽培管理，测量供试株系分蘖数、一(二)级枝梗数、穗长、结实率和穗粒数，每个材料至少统计30个单株数据。
待测植株的生长情况见图3，与Nip相比，osalkbhl1-1和osalkbhl1-2的分蘖数(图3中A和B)和二级枝梗数显著减少(图3中C)。
实施例5、水稻热胁迫试验
待测植株为：水稻Nip、突变株osalkbhl1-1和osalkbhl1-2株系的T3代纯合植株。
将各待测株系的种子在温室萌发并培养至三叶期(拍照)，然后转移到45℃培养箱中培养48小时(拍照)，然后转移回到温室并继续培养7天(拍照)，然后统计存活率(每种供试植株至少统计30株)。温室条件为：28℃，10小时光照/14小时黑暗。
热胁迫实验结果如图4所示，图4中A的左图为待测植株在三叶期的生长状况，图4中A的中图为待测植株转移到45℃培养箱中培养48小时的生长状况，图4中A的右图为待测植株45℃热处理后转移回到温室并继续培养7天后的生长状况。
经过45℃热处理后，水稻存活率结果见图4中B，Nip的存活率约为10.4％，osalkbhl1-1突变植株的存活率约为58.3％，osalkbhl1-2突变植株的存活率约为81.3％。与Nip相比，osalkbhl1-1和osalkbhl1-2突变植株的耐热性显著升高。
实施例6、DNA 6mA修饰水平
待测植株为：水稻Nip、osalkbhl 1-1和osalkbhl 1-2株系的T3代纯合植株。将各待测株系的种子在温室萌发并培养至三叶期，提取基因组DNA，采用三重四级杆液相色谱质谱联用(UHPLC-MS/MS)检测DNA 6mA修饰的丰度。使用安捷伦6400三重四级杆液相色谱质谱联用仪器，屈臣氏蒸馏水(0.1％甲酸)和乙腈(0.1％甲酸)作为流动相，GOLDaQ柱子(100mm*2.1mm)孔径1.9μm，设定离子对进样检测。测定DNA 6mA修饰水平。
结果如图5所示，与Nip相比，osalkbhl1-1和osalkbhl1-2突变植株的DNA 6mA修饰水平上升。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质或与所述蛋白质相关的生物材料，其特征在于，所述蛋白质为OsALKBHL1蛋白，为如下A1)或A2)A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗胁迫功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的一端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；
所述生物材料为下述任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
C1)抑制或降低或沉默所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
C2)表达C1)所述核酸分子的编码基因；
C3)含有C2)所述编码基因的表达盒；
C4)含有C2)所述编码基因的重组载体、或含有C3)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C2)所述编码基因的重组微生物、或含有C3)所述表达盒的重组微生物、或含有C4)所述重组载体的重组微生物；
C6)含有C2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有C3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
C7)含有C2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有C3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C4)所述重组载体的转基因植物组织；
C8)含有C2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有C3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C4)所述重组载体的转基因植物器官。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质来源于水稻。
3.权利要求1或2所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白活性或含量的物质在调控植物对热胁迫抗性中的应用，所述基因编码权利要求1或2所述的蛋白质，所述应用为下述任一种：
P1)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物对热胁迫抗性中的应用，
P2)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育抗热胁迫植物中的应用，
P3)所述蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在改良植物热胁迫抗性种质资源中的应用。
4.上调或增强或提高水稻热胁迫抗性的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低受体水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，使水稻热胁迫抗性提高。
5.培育热胁迫抗性水稻的方法，包括如下步骤：下调或抑制或降低水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，得到目的水稻，所述目的水稻的热胁迫抗性高于所述受体水稻。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述下调或抑制或降低水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达为敲除目的水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述敲除通过CRISPR/Cas9系统实现。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点为序列3第4723-4742位或对应序列2的第919-938位。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述敲除目的水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因为将水稻基因组中的序列3所示的所述蛋白质的基因进行下述至少一种突变：
1)用5’-GGTGATATCGTAGC-3’替换水稻基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除；
2)用5’-GGTGATATCGTATTGAGGC-3’替换水稻基因组DNA中的所述蛋白质的编码基因中的“5’-GGTGATATCGTATTGATGGC-3’”，从而将编码OsALKBHL1蛋白的基因敲除。
10.一种用于改良水稻热胁迫抗性的物质，为用于基因编辑权利要求1所述编码OsALKBHL1蛋白的基因的CRISPR/Cas9系统；所述CRISPR/Cas9系统基因编辑的靶点对应序列3的第4723-4742位。
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