JPH09501313A

JPH09501313A - 植物におけるトレハロースの生産

Info

Publication number: JPH09501313A
Application number: JP7503286A
Authority: JP
Inventors: フケマ，アンドレアス; ペン，ヤン; ペトロネーラドゥス，ミリャム; デンエルゼン，ペトルスジョセフスマリアファン
Original assignee: モーゲンインターナショナルナームロゼフェンノートシャップ
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 1997-02-10
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: CZ344995A3; AU697997B2; CZ290830B6; PL312303A1; EP0711353B1; FI956317A; CN1129015A; AU7384694A; FI956317A0; NO955354D0; HUT74666A; PL179629B1; NO955354L; RO115650B1; CN1131315C; KR960703436A; ATE284446T1; NZ269548A; HU221124B1; HUP9503723D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、その植物宿主内での、（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ（trehalose phosphate synthase）活性をコードする DNA配列、及び場合により、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子の存在により、植物宿主内でのトレハロースの生産方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】植物におけるトレハロースの生産発明の分野本発明は、組換え DNA技術を使用する植物炭水化物代謝の修飾、それにおける使用のための組換え DNA、並びに修飾遺伝子構成をもつ植物及び植物部分に関する。これらの植物は、特定の炭水化物化合物を抽出するために使用されることができ、あるいは、それらは、例えば加工の間に、上記炭水化物化合物の存在により改良された特性をもつ、食品、飼料、又はそれらの成分として加工されることができる。技術水準トレハロースは、２つのα−，α，β−、及びβ，β−結合グルコース分子に基づく二糖類を含んで成るＤ−グルコシル−Ｄ−グルコシドに与えられた一般的名称である。トレハロース(trehalose)、特にα−トレハロース１−（Ｏ−α− Ｄ−グルコピラノシル）−１′−（Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノース）は広く天然にある二糖類である。トレハロースの化学合成は、（保護基が必要であり）困難であり、かつ、非効率である。トレハロースの最近の天然源は、キノコと酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であり、これらはトレハロースとして10％を上廻る乾燥重量を蓄積することができる。しかしながら、生産は、トレハロースの速い代謝を引き起こす高いトレハロース活性により妨害される。Elbein A.D .(1974，Adv.Carbohydrate Chem．and Biochem．30，277-256)は、生きた生物における二糖類トレハロース、特にα，α−トレハロースの発生と代謝のレビューを考える。植物においては、トレハロースの存在は、いくつかの下等植物種、並びにスペルマトフィタ（Spermatophyta ）；エチノプス・ペルシカス（Echinops persicus）；カレックス・ブルンセンス（Carex brunescen s ）；ファガス・シルバチカス（Fagus silvaticus）に属する多数の高等植物種において報告されている。しかしながら、これらの結果は、他の著者によってはしっかりと確立されてはいない(例えば、Kendall et al.，1990，Phytochemis try 29，No.8，2525-2528)。例えば、Kendall et al,，前掲は、種子植物におけるトレハロースの発生に関して、その存在がキャラウェー(Caraway seed)(Carum carvi )についてのみしっかりと記載されていると述べてた。Cegla et al.によるヒマワリにおけるトレハロースの存在の報告(1977，J.Am.Oil Chem.Soc．54 ，150 et seq.)は、Kendall et al，1990、前掲に従って(The Biochemistry of Plants Vol.3 Carbohydrates：Structure and Function；Preiss，J.，ed.，p.2 28．Academic Press：中において)Kandlerにより問題とされた。ブナ(beech)(Ea gus sylraticus)とキャベツにおけるトレハロースの報告は、他の著者により証明されることができなかった（Kendall et al.，1990、前掲、及びその中の文献）。高等植物におけるトレハロースの明らかにまれなことにも拘らず、トレハロース分解活性の存在は、その調査された植物の科のかなりの数について報告された。安定した高トレハロース活性が３つの小麦系統、バンクスマツ(jack pine)、及びセラジネラ・レピドフィラ（Selaginella lepidophylla）において見つかった。安定した低トレハロース活性は、アルファルファ、ブラック・メキシカン・スウィート・コーン及び白トウヒ（white spruce）において見つかった。不安定な、中程度の活性がcanolaの２つの異なる懸濁液中に発見されたが、これらは、おそらく特定のトレハロース活性に帰されることはできないであろう。大麦、スズメノチャヒキ(brome grass)、大豆及び黒トウヒ（black spruc e）は、トレハロース活性を全く含まないと報告された（Kendall，1990前掲）。その生産が可能である生物においては、トレハロースは、その６−ホスフェートとして生合成されると信じられている。一方、その保存形態は遊離の糖である。それ故、トレハロースを生産し、そして／又は保存する生物は、トレハロース６−ホスフェートを解裂することができるホスファターゼを含むと信じられる（ Elbein，1974、前掲）。高等植物における特定のトレハロース・ホスフェート・ホスファターゼの存在についてはほとんど知られていない。 1993年９月２日に公開された国際特許出願第 WO 93／17093 A1号は、トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする酵母遺伝子にトランスジェニックな酵母内でのトレハロースの生産について記載している。トレハロースは、これらの酵母遺伝子を使用して、高等植物においても生産されることができると示唆されたが、植物におけるトレハロース生産の実際の開示は全く存在しない。 WO9 3／17093 A1が本出願日前であるが本出願の優先日後に公開されたことに留意すべきである。本発明の要約本発明は、その植物宿主内での、（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ（trehalose phosphate synt hase）活性をコードする DNA配列、及び場合により、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子の存在により、植物内でのトレハロースの生産方法を提供する。本発明の他の態様は、その植物宿主内での、（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により、（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）その植物宿主内で天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素(SPS)をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的である RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。本発明のさらに他の態様は、その植物宿主内での、（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により、（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）その植物宿主内で天然にある ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的である RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。本発明のさらに他の態様は、その植物宿主内での、（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）その植物宿主内に天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする D NA配列、及び場合により、（ｆ）その植物宿主内で機能する転写終止領域、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、並びに（ｇ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｈ）その植物宿主内に天然にある ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする D NA配列、及び場合により、（ｉ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を配列内に含んで成る植物発現性遺伝子、の存在による、植物宿主内でのトレハロースの生産を含んで成る。また、本発明は、トレハロースの生産方法において使用される植物発現性遺伝子、並びに植物発現性遺伝子の組合せ、並びにクローニング・プラスミド、形質転換ベクター、微生物、本発明に係る植物発現性遺伝子を宿す個々の植物細胞、に拡大される。また、本発明は、その中には天然に存在しない植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を含む組換え植物 DNAゲノムをも提供する。本発明は、その中には天然に存在しない植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子及びさらに SPS活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、及び／又はAGPase活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る組換え植物 DNAゲノムをも含んで成る。本発明は、トレハロースを生産することができる植物を得るための方法であって、以下の段階、（１）配列内に：（ａ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、（ｃ）その植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に、（ｄ）その植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）その植物宿主内で機能する選択マーカー遺伝子をコードする DNA配列、及び場合により、（ｆ）その植物内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を受容体植物細胞内に導入し、（２）その選択マーカー遺伝子の存在についての選択を許容する条件下で形質転換された細胞から植物を作出する、を含んで成る方法をも提供する。本発明は、遺伝子修飾の結果としてトレハロースの（増加されたレベル）を作り出す植物をも含んで成る。本発明はさらに、本発明に係る植物発現性遺伝子を含む組換え DNAゲノムをもつ植物をも含んで成る。本発明は、本発明に係る植物発現性遺伝子を含む組換え DNAゲノムをもつ植物であってトレハロースを生産するものをも含んで成る。本発明は、本発明に係る組換え DNAゲノムをもつ植物であって増加された渇水 (drought)耐性を示すものをも含んで成る。また、本発明は、本発明に係る植物の部分、例えば細胞又はそれらのプロトプラスト又はカルチャー、花、果実、葉、花粉、（毛状根カルチャーを含む）根、種、茎、（いわゆる microtubersを含む）塊茎その他に拡大される。本発明は、トレハロースの存在中植物又は植物部分を保存する方法であって、以下の段階：（１）トレハロースを生産する本発明に係る植物を成長させ、（２）トレハロースを含む植物又は植物部分を収穫し、そして（３）その植物又は植物部分を風乾し、あるいは（４）その植物又は植物部分を凍結乾燥する、を含んで成る方法に拡大される。本発明はさらに、本発明に係る方法により保存された植物及び植物部分を含んで成る。本発明は、トレハロースの生産方法であって、以下の段階：（１）組換え植物 DNAゲノムにより、トレハロースの（増加されたレベルを）作り出すことができる植物を成長させ、（２）その植物又は植物部分を収穫し、（３）その植物又はその植物部分からトレハロースを単離する、を含んで成る方法をも含む。本発明はさらに、トレハロースの生産方法であって、以下の段階：（１）組換え植物 DNAゲノムにより、トレハロースの（増加されたレベルの）を作り出すことができる植物細胞を培養において成長させ、（２）その植物細胞カルチャーからトレハロースを単離する、を含んで成る方法を含む。本発明はさらに、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする単離された核酸配列を提供する。好ましい単離された核酸配列は、大腸菌（E.co li ）から得られたものである、そしてより好ましいものは、配列番号：２中に表す単離核酸配列である。他の好ましい態様は、配列番号：３におけるようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んで成る。以下の図はさらに本発明を説明する。図面の説明図１植物sink組織内のスクロースとデンプン生合成経路の一部を図示したものである。この図は、光合成により葉内で生産された炭水化物がスクロースの形態で篩部（phloem）組織を介して輸送されることを示している。このシンクに入る間それは膜結合インベルターゼ活性により処分（unload）され、単糖類グルコースとフルクトースを生じる。多数の酵素段階の働きにより、これらの単糖類は図に概略を示すようにデンプン及び／又はスクロースに変換される。グルコースは G6Pに代謝され、そしてUDPGは、植物発現性 otsA遺伝子の導入により上記植物内に遺伝子操作された TPS−酵素のための基質として使用されると信じられている。この図は、基質として利用されることができるUDPGと G6Pの一定量が酵素 SPSとAGPaseのレベルを減少させることによりどのように増加されるかを示している。それらの阻害を十字によりマークした。図２大腸菌（E.coli）からの otsBAオペロンを含む、Kohara et al．(1987) からの EMBL4クローン7F11の略マップである。 otsA遺伝子をクローン化するために使用された酵素 EcoRＶとHindIIIについての制限部位、並びにその挿入の左側に対してのkbにおけるそれらの距離を示す。 otsAとＢ遺伝子も示され、矢印は転写の方向を示す（図８、拡大マップ参照）。図３クローン化されたポテトSPS cDNAの配列。Ｔ線： PCR増幅反応におけるオリゴヌクレオチドとし使用されたメイズSPS cDNA配列。図４バイナリー・ベクター pMOG664の略図。図５ pMOG579内でクローン化された２つの断片を示す pTiB6の一部の制限マップ。図６アグロバクテリウム（Agrobacterium ）株MOG101内のＴ−領域をもたないヘルパー・プラスミドの構築のために使用された pMOG579の略図。図７発現ベクター pMOG180の略図。図８大腸菌（E.coli）からの otsBAオペロンを含む、Kohara et al．(1987) からのEMBL4クローン7F11の拡大マップ。TPSオープン・リーディング・フレーム (ORF)の位置を示す。（^*：Koharaet al.，以下、のマップ内には存在しないHind III部位）図９バイナリー・ベクター pMOG799の略図。図10 バイナリー・ベクター pMOG801の略図。図11 バイナリー・ベクター pMOG802の略図。発明の詳細な説明本発明の好ましい態様は、配列内に、（ａ）ダブル・エンハンサーにより上流に隣接されたCaMVの 35S RNAから得られた転写開始領域、（ｂ）大腸菌（E.coli）の otsBAオペロン内に位置する otsA遺伝子のコード領域であるトレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする DNA配列、（ｃ）アグロバクテリウム（Agrobacterium ）のノパリン・シンターゼ(nopal ine synthase(nos))遺伝子から得られた転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子のポテト植物内での存在により塊茎（tubers）内でトレハロースを生産することができるポテト植物を含んで成る。植物発現性 T PS遺伝子を含むトランスジェニック植物の塊茎はトレハロースを生産し、一方、この遺伝子を欠く対照植物はそうではなかった。明らかに、トランスジェニック塊茎により生産されるトレハロース・ホスフェートがトレハロースに変換される。明らかに、トレハロース・ホスフェート・ホスファターゼ活性を提供することは必要ではない。なぜなら、それはポテト内に存在するようであるからである。図１中に、 TPSについての基質利用能を改良するためのアプローチをも示す。このために、グルコース−６ホスフェート(G6P)とUDPGの基質利用能に影響を及ぼす２つの遺伝子がある。これに対して、アンチセンス SPS遺伝子とアンチセンスAPGaseが植物宿主内での発現のためのCaMV 35Sプロモーターの制御下でクローン化されている。本発明に従って植物発現性 TPS遺伝子を含む植物宿主内に導入される場合、これは、 TPSについての基質利用能及びそれ故トレハロース合成を増加させるであろう。それは、基質利用能を改良するために、スクロース又はデンプンの合成を遮断するために他のアンチセンス遺伝子をも使用されることができることは当業者に容易に想到するであろう。本発明を、転写開始領域としてCaMV 35Sプロモーターの制御下で大腸菌（E.co li ）からの植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を発現するポテト植物について詳細に記載するけれども、他の種子植物宿主もトレハロースの生産に等しく好適であるということが当業者に明らかであろう。spermatophyta の中で好ましい植物宿主は、Angios permae 、特に代表的な科としてとりわけSolanaceaeを含んで成るDicotyledoneae 、並びに代表的な科としてとりわけGromineae を含んで成るMonocotyledoneaeである。好適な宿主植物は、本発明の文脈中で定義されるように、植物（並びにその植物の部分と細胞）及びそれらの子孫であって組換え DNA技術を使用して遺伝子操作されて、所望の植物又は植物器官内で着目のトレハロースの生産を生じさせ又は強化するようなものを含み；これらの植物は、直接的に（例えば、食用部分を作り出す植物種）、又はそのトレハロースが（食用及び非食用植物宿主由来である）宿主から精製された後に、使用されることができる。本発明に得る食用部分をもつ穀物は、花をもつもの、例えばカリフラワー（Brassica oleracea ）、アーティチョーク（Cynara scolymus）、果物、例えばリンゴ、（Malus 、例えばdomesticus）バナナ（Musa、例えばacuminata ）、イチゴ（例えばスグリ、Ribes 、例えばrubrum）、チェリー（例えばスウィートチェリー、Prunus、例えばavium ）、キュウリ（Cucumis 、例えばsativus ）、グレープ（Vitis 、例えばvinifera）、レモン（Citrus limon ）、メロン（Cucumis melo）、ナッツ（例えばウォルナッツ、Juglans 、例えばregia ；ピーナッツ、Arachis hy pogeae ）、オレンジ（Citrus、例えばmaxima）、もも（Prunus、例えばpersica ）、ナシ（Pyra、例えばcommunis）、コショウ（Solanum 、例えばcapsicum）、プラム（Prunus、例えばdomestica ）、ストロベリー（Fragaria、例えばmoscha ta ）、トマト（Lycopersicon、例えばesculentum）、葉、例えばアルファルファ（Medicago sativa）、キャベツ（例えばBrassica oleracea）、エンダイブ（Cichoreum 、例えばendivia ）、リーキ（Allium porrum）、レタス（Lactuca sativa）、ホウレンソウ（Spinaciaoler aceae 、タバコ（Nicotiana tabacum ）、根、例えばクズウコン（Maranta arundinacea ）、ビート（Beta vulgaris）、ニンジン（Daucus carota）、カッサバ（Manihot esculenta ）、カブ（Brassica rapa）、ハツカダイコン（Raphanus sativus ）、ヤマノイモ（Dioscorea esculenta ）、スウィートポテト（Ipomoea batatas ）並びに種、例えばインゲン豆（Phaseolus vulgar is ）、エンドウ豆（Pisum sativum ）、大豆（Glycin max ）、小麦（Tritic um aestivum）、大麦（Hordeum vulgare ）、トウモロコシ（Zea mays）、米（Oryza sativa）、茎、例えばコールラビ（Brassica oleraceae ）、ポテト（Solanum tuberosum ）、その他を含む。上記食用部分は、植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子の存在により、その中で生産された強化されたトレハロース・レベルの存在中での乾燥により保存されることができる。植物器官又は組織特異的プロモーターの制御下に TPS活性をコードする DNAを配置することにより、トレハロースの強化されたレベルを作り出すことが有利であることができ；その選択は当業者により容易に決定されることができる。植物細胞内での DNAの発現に必要な調節要素の制御下のいずれかのトレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を、特異的にか又は構成的にかのいずれかにおいて、それが活性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を生産することができる限り、使用することができる。配列番号：２中に表された核酸配列、実際には本発明に係るトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするいずれかのオープン・リーディング・フレームが、それによりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更する必要性を伴わずに変更されることができる。この事実は、遺伝子コードの縮重により引き起こされる。従って、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードするオープン・リーディング・フレームは、選ばれた宿主植物におけるコドンの用い方に改作されることができる。配列番号：２により表された単離核酸配列も、大腸菌（E.coli）遺伝子から獲得できる DNA−又は RNA断片と他の源からの DNAとのハイブリダイジングにより、他の生物内でトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を同定し、そしてその後それらを単離するために使用されることができる。好ましくは、このような DNA配列は、ストリンジェント条件（例えば、ハイブリダイゼーション混合物の温度とイオン強度）の下でのハイブリダイジングによりスクリーニングされる。条件がストリンジェントであるかどうかも、ハイブリダイゼーション、すなわち DNA：DNA，DNA：RNA，RNA：RNAの性質並びに最も短いハイブリダイジング断片の長さに依存する。当業者は容易にストリンジェントなハイブリダイゼーション様式を確立することができる。トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を単離するための源は、微生物（例えば、バクテリア、酵母、真菌）、植物、動物その他を含む。他の源からのトレハロース・ホスフェート活性をコードする単離 DNA配列も同様に本発明に係るトレハロースの生産方法において使用されることができる。また、本発明は、そのアミノ酸配列がトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性を完全に廃止しない限り、それが、コードされたタンパク質内でのアミノ酸変化をもたらすように１以上のコドンを突然変異させることにより配列番号：２中に表された核酸配列を修飾することにより得られた核酸配列を包含する。原則として、植物宿主のいずれも、各植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子との組合せにおいて好適である。他の源からのトレハロース遺伝子が利用可能になるとき、これらは本明細書中に記載するような植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子の組合せを得るための類似の方法において使用されることができる。内因性スクロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子と ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子の阻害により本明細書中に例示されるような、トレハロース・ホスフェート・シンターゼについての基質利用能を強化するための、内因性遺伝子の阻害は、その選択が本発明に決定的ではない多くの方法においていわれることができる。好ましくは、遺伝子阻害は、いわゆる“アンチセンス・アプローチ”を通じて達成される。ここでは、遮断されるべき酵素活性(例えば実施例における AGP-ase又はSPS)をコードする RNAに少なくとも部分的に相補的である RNAを作り出す DNA配列が発現される。相同アンチセンス遺伝子を使用することが好ましい。なぜならこれらが異種遺伝子よりも効率的であるからである。プローブとしてメイズ SPS−遺伝子配列を使用したポテトからのアンチセンス SPS の単離は、この戦略の実行可能性を説明するのに役立つ。本発明の実施のために、相同アンチセンス断片の使用が必要であるということを示すことは意味されない。不所望の酵素活性の合成を遮断する他の方法は、植物宿主内に存在する内因性遺伝子の追加のコピーの植物宿主のゲノム内への導入である。このような遺伝子の追加のコピーはその内因性遺伝子を静まらせることがしばしば観察され；この効果は、同時−抑制的効果(co-suppressive effect)、又は同時抑制（co-supp ression）として文献中に言及されている。原則として、双子葉と単子葉植物の両方であって形質転換を受けることができるものが、本発明に係る植物発現性遺伝子を受容体細胞内に導入し、そしてその植物発現性遺伝子を宿し、そして発現する新たな植物を生長させることにより修飾されることができる。好ましい本発明に係る植物は、トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換することができるものであって、かつ、トレハロース分解活性をほとんど又は全く含まないようなものである。トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換する能力を欠く植物も本発明に包含されるということが理解されるであろう。これらの植物は、トレハロース・ホスフェートをトレハロースに変換することができるホスファターゼをコードする追加の遺伝子を導入することによりさらに修飾されることができる。原則として、トレハロースを含む植物も構想される。なぜなら、これらの植物は、このような酵素の活性を阻害することにより、例えば、上記アンチセンス・アプローチを使用してこのような酵素をコードする遺伝子の発現を阻害することにより、トレハロースの生産に好適なものに作られることができるからである。受容体植物細胞内への植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を導入する方法は、その植物細胞のゲノム中に遺伝子が安定して取り込まれる限り、決定的でない。属アグロバクテリウム（Agrobacterium ）の株の使用に加えて、さまざまな他の技術が、植物細胞内への DNAの導入、例えばカルシウム／ポリエチレン・グリコール法、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション又は（コートされた）粒子ボンバードメント(Potrykus，1990，Bio／Te chnol．8，535-542)を使用したプロトプラストの形質転換のために利用されることができる。これらのいわゆる直接 DNA形質転換法に加えて、形質転換系関連ベクター、例えばウイルス・ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）由来）とバクテリア・ウイルス（例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属由来）が、広く入手可能である(Pot rykus，1990，Bio／Technol．8，535-542)。選択及び／又はスクリーニングの後、形質転換されたプロトプラスト、細胞又は植物部分が、本分野において公知の方法(Horsch et al.，1985，Science 225 ，1229-1231)を使用して、植物全体に再生（regenerate）されることができる。単子葉植物は、形質転換を受けることができ、そして稔性トランスジェニック植物が形質転換された細胞から再生されることができる。植物細胞内への遺伝子材料の導入のための強力な方法と共に、これらの穀物のための再生可能な組織培養系の開発は、形質転換を容易にした。現在、単子葉植物の形質転換の好ましい方法は、体外移植物又は懸濁細胞のマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントと直接的 DNA取り込み又はエレクトロポレーション(Shimamoto，et al.，1989，Nature 338 ，274-276)である。トランスジェニック・メイズ植物は、マイクロインジェクタイル・ボンバードメントにより、メイズ懸濁カルチャーの胚形成細胞内に、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ(phosphinothricin acetyltransferase)(除草剤ホスフィノトリシンを失活させる酵素)をコードする、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus ）のbar −遺伝子を導入することにより得られている(Gordon-Kamm，1990，Plant Cell，2，603-618)。他の単子葉穀物、例えば小麦と大麦の糊粉（aleurone）プロトプラスト内への遺伝子材料の導入も報告されている(Lee,1989，Plant Mol.Biol．13，21-30)。小麦植物は、その胚形成懸濁カルチャーの樹立のために加齢のコンパクト、かつ、こぶ状の胚形成カルス組織だけを選択することにより胚形成懸濁液カルチャーから再生された(V asil，1990 Bio／Technol．8，429-434)。これらの穀物のための形質転換系との組合せは、単子葉植物への本発明の適用を可能にする。これらの方法は、双子葉植物の形質転換と再生のために適用されることもできる。商業的に重要な穀物、例えばコーンを含む単子葉植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium ）株による DNA伝達を受け易い(欧州特許第159 418 B1；Gould J，Michael D，Hasegawa O，Ulian EC，Peterson G，Smit h RH，(1991) Plant.Physiol．95，426-434)。宿主植物の選択に関しては、トレハロース分解活性をほとんど又は全くもたない植物種を選択することが好ましい。しかしながら、トレハラーゼ活性を示す植物はトレハロースの生産に好適な宿主植物であることから排除されない。但し、これがトレハロースの蓄積を一緒になって妨ぐ場合にはトレハラーゼ活性の阻害を提供することが必要であることができる。このような阻害は、本分野においてよく知られており、そして本明細書中他の目的のために説明されるアンチセンス・アプローチを使用して達成されることができる。本発明が転写開始領域としてのCaMV 35Sプロモーターの使用に限定されないということも理解されるべきである。マーカー遺伝子、例えば転写開始領域、エンハンサー、非転写リーダーその他を含む植物発現性遺伝子の発現の制御に好適な DNA配列は、植物細胞内で発現されるいずれかの遺伝子、例えば、外因性植物遺伝子、植物細胞内で天然に発現された遺伝子、例えばアグロバクテリウム（Agro bacterium ）の野生型 T-DNA上に位置するもの、植物ウイルスの遺伝子、並びに真核転写開始のためのコンセンサス配列に一致する転写開始領域を含む他の真核細胞遺伝子から得られることができる。各種プロモーターの機能部分を組合せたハイブリッド・プロモーター、又はそれらの合成等価物も意図される。構成的プロモーターとは別に、誘導プロモーター、又は、それらの発現パターン、例えば発達により又は細胞型に特異的に調節された他のプロモーターは、それらが TPSについての基質を含む植物部分内で発現される限り、本発明に係る植物発現性遺伝子の発現を制御するために使用されることができる。形質転換された細胞を選択し又はスクリーニングするために、植物細胞に伝達されるべき本発明に係る植物発現性遺伝子に連絡されたマーカー遺伝子を含むことが好ましい。植物形質転換における好適なマーカー遺伝子の選択は、平均的な熟練者の範囲内に十分にあり；定常的に使用されるマーカー遺伝子のいくつかの例は、カナマイシンに対する耐性を付与するネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（EP-B 131 623）、グルタチオン誘導除草剤に対する耐性を付与するラット肝からのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（EP-A 256 223 ）、グルタミン・シンテターゼ阻害剤、例えばホスフィノトリシン（phosphinot hricin）に対して過剰発現の間に耐性を付与するグルタミン・シンテターゼ(WO 87／05327)、選択剤、ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するストレプトミセス・ビリドクロモジェン（Streptomyces viridochromogenes ）からのアシル・トランスフェラーゼ遺伝子（EP-A 275 957）、Ｎ−フォスホノメチルグリシンに対する耐性を付与する５−エノールシキメート−３−ホスフェート・シンターゼ（5-enolshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)）をコードする遺伝子、Bia laphosに対して耐性を付与するbar 遺伝子(例えば、WO 91／02071)その他である。マーカーの実際の選択は、それが選ばれた植物細胞との組合せにおいて機能的である（すなわち、選択的である）限り、決定的ではない。着目のマーカー遺伝子（単数又は複数）は、連結される必要はない。なぜなら、連絡されていない遺伝子の同時−形質転換も植物の形質転換において効率的なプロセスであるからである。特に双子葉植物についての、形質転換に好ましい植物材料は、容易に形質転換され、そして良好な再生能力をもつことができる葉−皿（leaf-discs）である（ Horsch R.B．et al.，(1985)Science 227 ，1229-1231）。トレハロースの生産は、単独の炭水化物修飾遺伝子として植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子により達成されることができるけれども、本発明は、トレハロース・ホスフェート・シンターゼについての基質の利用能の増加を行うことができる追加の植物発現性アンチセンス遺伝子の例によりさらに説明される。このような遺伝子の特定の例は、メイズとポテトからの SPSのための植物発現性アンチセンス遺伝子及びポテトからのAGPaseである。アンチセンス・アプローチを使用した炭水化物修飾酵素のダウン・レギュレートは、特定の実施例により限定されない。例えば、部分的に相補的な植物発現性アンチセンス遺伝子は、その標的遺伝子の転写物に十分相補的であり、そしてその標的遺伝子の発現を十分に長く阻害する転写物をその植物発現性アンチセンス遺伝子が作り出す限り、標的遺伝子の発現を阻害するために使用されることができる。同一植物内の２以上の遺伝子の存在がどのように行われるかは本発明にとっては重要でない。これはとりわけ以下の方法の中の１により達成される：（ａ）導入されるべき１以上の遺伝子を含む多遺伝子構築物による植物系統の形質転換、（ｂ）同一植物系統に異なる構築物を同時に同時−形質転換すること、（ｃ）導入されるべき遺伝子による同一植物の形質転換のその後のラウンド、（ｄ）各々が、同一植物内に導入されるべき異なる遺伝子を含む、２つの植物の交配。本発明の適用の分野は、例えば、修飾された植物の改良された特性による、農業と園芸、並びにトレハロースが適用される又はされるであろう産業のいずれかの形態の両方にある。トレハロース・ホスフェートとトレハロースは、そのまま、例えば、精製形態又は混合物において、又は植物部分内の保存生成物の形態において使用されることができる。トレハロース・ホスフェート又はトレハロース（の増加レベル）を宿す植物部分は、トレハロースを添加する必要性を伴わずにそのまま使用されることができる。また、トレハロースは、それを生産する植物又は植物部分から精製され、そしてその後工業的過程において使用されることができる。食品産業においては、トレハロースは、乾燥前の食品にトレハロースを添加することにより使用されることができる。食品の乾燥は、その産業における重要な保存方法である。トレハロースは、慣用の風乾を通じて食品製品を保存し、そして高品質製品の水の添加の間の速い再構築を可能にするのに特に有用であるようである(Roser et al，July 1991，Trends in Food Science and Technology，pp.166-169)。これらの利点は、天然フレーバー／芳香剤の保持、新鮮製品の味、及び栄養価（タンパク質とビタミン類）を含む。トレハロースがタンパク質と膜を安定化し、そして化学的に不活性で、安定なガラスを形成する能力をもつことが示されている。上記のように十分に乾燥された食品製品の低い水分活性は、損傷を引き起こすことができるであろう化学反応を妨ぐ。農作物（Field crops）、例えばトウモロコシ（corn）、カッサバ、ポテト、サトウダイコン（sugar beet）とサトウキビ（sugar cane）は、バルク炭水化物製品（デンプンとスクロース）のための天然源として長い間使用されてきている。これらの植物種内のトレハロース−生合成経路の遺伝子操作により容易にされる、上記穀物におけるトレハロースの生産は、トレハロース生産についてこのように遺伝子操作された穀物の市場性開発（ exploitation）を可能にするであろう。本明細書中に引用する文献の全ては、本発明の属する分野における技術水準を示すものである。本明細書中の先又は後に言及された特許その他の刊行物の全てを、あたかもその各々を個々に引用により取り込むように、引用により本明細書中に取り込む。以下に与える実施例は、実行可能性の目的をもって与えるものであり、本発明の範囲をいかなる方法によるかを問わず限定することを意図されていない。実験DNA操作全 DNA手順（大腸菌（E.coli）からの DNA単離、制限酵素処理、ライゲーション、形質転換、等）を標準的なプロトコール(Sambrook et al．(1989)Molecular Cloning：a laboratory manual，2nd ed．Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss，CSH，New York)に従って行った。株全実施例において、大腸菌（E.coli）K-12株 DH5αをクローニングのために使用する。植物形質転換実験のために使用されたアグロバクテリウム・チュームファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）株は、スペクチノマイシン耐性マーカーによる T-DNAの置換によりLBA1010(Koekman et al．(1982)Plasmid 7，11 9)から誘導された非癌遺伝子オクトピン型ヘルパー株であるMOG101である。アグロバクテリウム株MOG101の構築バイナリー・ベクター系(Hoekema A.，Hirsch，P.R.，Hooxkaas,P.J.J.，and Schilperoort，R.A．(1983)Nature303，179)をポテトとタバコ植物内への遺伝子構築物の伝達のために使用する。Agrobacterium tumefaciens 毒性作用を付与するヘルパー・プラスミドはオクトピンTi−プラスミド pTiB6から得られた。MO G101は、Ｔ−領域の全体が欠失され、そしてトランスポゾンTn1831(Hooykaas et al. ，1980 Plasmid 4，64-75)からそのバクテリアのスペクチノマイシン(Spec tinomycin)耐性マーカーにより置換された非癌遺伝子Ti−プラスミド（Koekman et al. 1982、前掲）を担持するAgrobacterium tumefacience株である。このTi−プラスミド pTiB6は、２つの隣接Ｔ−領域、TL（Ｔ−左）とTR（Ｔ− 右）を含む。このTL−とTR−領域を欠く誘導体を得るために、我々は中間体ベクター pMOG579を構築した。プラスミド pMOG579は、（図５と６中で暗くした）pT iB6のＴ領域の外側の左と右に位置する断片に相同な２つのTi−プラスミド断片を含むpBR322である。この２つの断片は、スペクチノマイシン耐性マーカーを担持するトランスポゾンTn1831(Hooykaas et al.，1980 Plasmid 4，64-75)からの2.5kb BamH Ｉ−HindIII断片により pMOG579内で分離される（図６）。このプラスミドを、Agrobacterium tumefacienS 株 LBA1010〔Ｃ58−Ｃ9（pTiB6）ヘルパーとして HB101 8pRK 2013を使用して大腸菌（E.coli）からの３親交配（ triparental mating）により pTiB6が導入されている（Koekman et al.（1982）、前掲）治癒Ｃ58株〕内に導入する。トランス接合体を、リファマイシン（20mg ／ｌ）とスペクチノマイシン（250mg／ｌ）に対する耐性について選択される。 pMOG579と pTiB6との間の２重組換えは、カルベニシリン(carbenicillin)耐性（ pBR322マーカー）の損失とＴ−領域全体の欠失をもたらした。カルベニシリン（ 100mg／ｌ）上にレプリカプレートされた5000のスペクチノマイシン耐性トランス接合体の中で、２つが感受性であることが見つかった。サザン分析（図示せず）は、事件の間の２重交配がＴ領域を完全に欠失させたことを示した。得られた株をMOG101といわれる。この株とその構築物は株GV2260に近似する(Deblaere et al. 1985，Nucl.Ac id Res．13,4777-4788)。 MOG101のための他のヘルパー株は、例えば LBA4404であり；この株も、バイナリー・プラスミド、例えば pMOG799の導入及びその後の植物形質転換のために好適に使用されることができる。他の好適なヘルパー株も容易に入手可能である。発現ベクター pMOG180は、pMOG18(EP 0 479 359 A1、実施例２ｂ)の誘導体であって、 GUSをコードする遺伝子が除去され、そして他の遺伝子が AIMV RNA4リーダーと３′nos ターミネーターの間に BamHＩ断片として挿入されることができるものである。この目的のために、35Ｓプロモーターと AIMV RNA4リーダー配列を含む、pMOG l8からの EcoRＩ／ NcoＩ断片を、プライマー・セット５′GTTTCTACAGGACGGAGGA TCCTGGAAGTATTTGAAAGA３′と５′CAGCTATGACCATGATTACG３′による PCR技術により合成し、このようにその NcoＩ部位を BamHＩ部位に突然変異させた。pMOG18 ベクターを次に EcoRＩと BamHＩにより切断し、その後新たに合成された EcoR Ｉ／ BamHＩ断片をこれらの制限部位間にライゲートすることができる。このプロモーター配列中の PCR−誘導ランダム突然変異を回避するために、 PCR合成 E co RＩ／ BamHＩ断片内の EcoRＩ／ EcoRＶ断片をpMOG18からの野生型配列により置換する。この短い EcoRＶ／ BamHＩを配列決定により突然変異についてチェックする。得られた発現ベクターはプラスミドpMOG180（図７）である。３親交配(Triparental matings) 上記バイナリー・ベクターを、プラスミドpRK2013(Ditta G.，Stanfield，S. ，Corbin，D.，and Helinski，D.R．et al．(1980)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 77 ，7347)を含む大腸菌（E.coli）株 HB101との３親交配によりアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101内に移動性をもたせ(mobilized)、そして形質転換のために使用した。タバコ(Nicotiana tabacum SR1)の形質転換タバコを、記載したような着目のバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101(Hoekema et al. 1983，Nature 303 ，179 -180)との植物組織の同時培養により形質転換する。形質転換を、Horsch et al. 1985，Science 227 ,1229-1231 により記載されたようなタバコ（Nicotiana tabacum品種 Petit Havana SR1)葉皿（leaf disks）の同時培養を使用して行う。トランスジェニック植物を、バイナリー・プラスミド中に存在する耐性遺伝子に依存してカナマイシン又はハイグロマイシンのいずれかを含む選択培地上で生長する菌条（shoots）から再生し、根付けさせ、そして土壌に移す。ポテトの形質転換ポテト(Solanum tuberosum 品種、Desiree)を、記載したように着目のバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウム・チュームファシエンス株MOG101により形質転換する(Hoekema A.，Huisman，M.J.，Molendijk，L.，Vanden Elzen，P .J.M.，and Cornelissen，B.J.C．(1989)Bio／technology 7，723)。塩基性培養基は、30ｇ／Ｌスクロース、Ｒ３ビタミン（Oohs et al．G.，Burrell，M.M.，K arp，A.，Bevan，M.，and Hille，J．(1989)Theor.Appl.Genet．73，744）、５ μＭゼアチン・リボシド（zeatin riboside(ZR)）、及び0.3μＭインドール酢酸 (LAA)を補ったMS培地(Murashige， T.，and Skoog，F．(1962)Physiol.Plan．14，473)から成る MS30R30である。この培地を適宜0.7ｇ／Ｌ Daichin寒天により固化させる。 Solanum tuberosum 品種 Desireeの塊茎を皮剥ぎし、そして0.1％ Tween-20を含む0.6％次亜塩素酸塩溶液中で20分間、表面滅菌する。これらのポテトを少なくとも２時間大容量の滅菌水中で十分に洗浄する。約２mm厚のディスクを、コルク穴（corkbore）により調製した塊茎組織の筒からスライスした。ディスクを、バイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウムMOG101 10⁶-10⁷バクテリア／ml を含むZRと IAAを含まないMS30R3から成る懸濁液中で20分間インキュベートする。これらのディスクをその後滅菌濾紙上に乾燥ブロットし、ZRと IAAを含む固体 MS30R3培地に転移する。ディスクを２日後に 100mg／Ｌセフォタキシム(cefotax im)と50mg／Ｌバンコマイシン（vancomycin）を含む新鮮培地に移す。１週間後、ディスクを再び同一培地に移すが、この時、100mg／Ｌカナマイシンがトランスジェニック菌条について選択するために用いられる。４−８週間後、これらのディスクから生じた菌条を摘出し、そして根付け培地（ZRと IAAを含まないが 1 00mg／Ｌセフォタキシンと 100mg／Ｌのカナマイシンを含むMS30R3培地）上に植える。これらの菌条を、分裂組織（meristem）切断物により純培養により（axen ically）増殖させ、そして根の顕出後に土壌に移す。適宜、10mg／Ｌのハイグロマイシンを、100mg／Ｌカナマイシンの代わりに選択のために使用する。ポテト、品種Kardalの形質転換と本質的に品種 Desireeのためのものと本質的に同様に行った。但し、以下の修飾があった：塩基性培養基中の植物ホルモン：ゼアチン・リボシド 3.5mg／ｌ；IAA（インドール酢酸）0.03mg／ｌ。形質転換において使用されるアグロバクテリウム懸濁液は、１ミリリッター当り10⁵〜10⁶バクテリアを含む。この根付け培地中のカナマイシンの濃度は50mg／ｌであった。トレハロース検定トレハロースをHottiger et al．により本質的に記載されたように測定した（ Hottiger et al．(1987)J.Bact．169，5518）。ポテト塊茎組織を液体窒素中で凍結させ、乳鉢と乳棒により粉末化し、そして約３容量の 500mMのトリクロロ酢酸中で室温において60分間抽出する。遠心分離の後、ペレットを同一の方法でもう一回抽出する。この２つの抽出からの併合上清をアンスロン（anthrone）陽性材料について検定する(Spiro R.G．(1966)Meth.Enzymol．8，3)。トレハロースを TLCにより定性的に測定する。抽出物を脱イオン化し（Merck，Ion exchanger V）、そしてSilica Gel 60プレート(Merck)上にコードする。クロマトグラフィーの後、プレートをｎ−ブタノール−ピリジン−水（15：３：２、ｖ／ｖ）により顕色する。スポットを濃 H₂SO₄中の５mg／mlバニリンによりスプレーし、そして 130℃において加熱することにより可視化する。商業的に入手可能なトレハロース(Sigma)を標準として使用する。あるいは、トレハロースをパルス・アンペア計(amperometric)検出によりアニオン交換クロマトグラフィーにより定量的に測定した。抽出物を、１ｇの凍結材料に１mlの沸騰水を添加することにより調製し、これをその後、 100℃において 15分間加熱した。サンプル（25μｌ）を、４×250mm Dionex 35391 carbopac PA -1カラムと４×50mm Dionex 43096 carbopac PA-1 プレカラムを備えたDionex D X-300液体クロマトグラフ上で分析した。溶出は、１ml／分における100mM NaOH によった。糖をパルスアンペア計検出装置(Dionex，PAD-2)を用いて検出した。商業的に入手可能なトレハロース(Sig ma）を標準として使用した。酵素検定全測定において、非トランスジェニック塊茎材料又は非トランスジェニック・タバコ材料を対照として使用した。全サンプル中のタンパク質含量をBradfordにより記載されたように測定する(Bradford（1976）Anal.Biochem．72，248)。塊茎抽出物についての検出のために、約 100mgの冷凍ポテト塊茎スライスを 100μ ｌ 20mM HEPES pH 7.4中でホモジェナイズし、遠心分離した(Eppendorf,，最大速度で５分間)。この上清を活性検定のために使用する。SPS活性 −SPS活性をAmir，J．and Preiss，J．(1982)，Plant Physiol．69，102 7-1030により本質的に記載されたように測定した。反応混合物の組成を変えることにより、SPSの活性の２つの異なる形態；VmaxとVselを測定することができる。Vmax反応混合物は、50μｌの全容量中、3.2mM UDP−グルコース、81μＭ〔¹⁴ Ｃ〕−UDP−グルコース、3.2mMフルクトース−６−ホスフェート、16mMグルコース−６−ホスフェート、100mM Hepes pH 7.4、20mM MgCl₂と５mM EDTAを含んでいた。Vsel反応混合物中では、フルクトース−６−ホスフェートとグルコース− ６−ホスフェートの濃度は半分であり、そして５mM無機リン酸塩を添加する。対照として、SPS活性を、フルクトース−６−ホスフェートとグルコース−６−ホスフェートを含まないVmax反応混合物中で測定する。反応を30分間室温において行い、そして95℃において５分間加熱することにより終らせる。反応の生成物をアルカリ性ホスファターゼにより処理し、そして得られた〔¹⁴Ｃ〕−スクロースをイオン交換クロマトグラフィーにより基質から分離する。反応において形成される放射標識されたスクロースの量をシンチレーション−カウンター内で計測する。TPS活性 −TPS活性を SPSについて記載したのと同様の方法で測定した。イオン交換クロマトグラフィー後、サンプルは脱リン酸化されたスクロース及びトレハロースを含んでいた。形成された生成物のどれくらいがトレハロースであるかを測定するために、サンプルを上記のように TLCにより分離した。抽出物を脱イオン化し（Merck，Ion exchanger V）、そしてSilica Gel 60プレート（Merck）上にロードした。クロマトグラフィー後、〔¹⁴Ｃ〕−スクロースと〔¹⁴Ｃ〕−トレハロースを含むスポットを剥ぎ落とし、そしてシンチレーション −カウンター内で計測した。 er，L．（1992）EMBO J．11，1229）。ADP−グルコースからのグルコース−１− ホスフェートの生産を NAD−ノンリンクしたグルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ系において測定する。この反応検定は、80mM HEPES pH 7.4、10m M MgCl₂、１mM ADP−グルコース、0.6mM NAD、10μＭグルコース−１，６−ジホスフェート、３mM DTT,，0.02％ウシ血清アルブミン、ウサギ筋からの１Ｕホスホグルコムターゼ(Sigma)、Leuconostoc mesenteroides 及び塊茎抽出物からの 2.5Ｕ NAD−リンク・グルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼを含んでいた。反応を最終濃度２mMまでのピロリン酸ナトリウムの添加により開始した。NAD還元を 340nm及び30℃において分光光度計により計測する。AGPase活性のユニットを30℃において１分間に生成した１ｎモルのグルコース−１−ホスフェートとして定義する。実施例Ｉ完全長大腸菌（E.coli）otsA遺伝子のクローニング大腸菌（E.coli）においては、トレハロース・ホスフェート・シンターゼ(TPS )は、オペロン otsBA内に位置する otsA 遺伝子によりコードされている。大腸菌（E.coli）染色体上のこのオペロンの転写の位置と方向は知られている（Kaasen，Ｉ.，Falkenberg，P., otsA 遺伝子は、42′に位置し、そしてKaasen et al．によれば、Kohara．et a l．（Kohara，Y.，Akiyama，K.，and Isono，K．（1987）Cell 50，495）によるマップの7F11と名付けられた EMBL4ゲノム・クローン内に存在する18.8kb断片上に限定される。DNAをラムダ・クローン7F11の溶解物から調製し、そしてHindIII により消化した。単離された 2.9kbのHindIII断片（挿入物中の14.3kbにおける “右手”のHindIII部位は、Kaasen et al．により既に記されたように、Kohara et al．によるマップ上に省略(omitted)された。）をHindIIIにより線状化された pUC18内でクローン化する。pMOG674と命名された、得られたプラスミドからの2.9kb HindIII挿入物について配列決定する。この配列は、アラビノース輸送オペロンの araH 遺伝子(Scripture，J.B.，Voelker，C.，Miller，S.，O'Donne ll，R.T.，Polgar，L.，Rade，J.，Horazdovsky，B.F.，and Hogg，R.W．（1987 ）J.Mol.Biol． 197，37)の一部、Kaasen et al．により位置決めされるようなT PPをコードする otsB 遺伝子、及び TPSをコードする otsA 遺伝子の一部を含むことが判明した。この otsA は、Kaasen et al．により記載されたような2.9kb HindIII断片に限定されないことが見つかった。その配列を完成させるために、重複するBamHＩ／EcoRＩ断片を単離し、そして部分的に配列決定する。 otsA遺伝子の完全TPS−コード配列を配列番号：２に示す。使用された制限酵素部位と共に、クローン7F11上の otsA 遺伝子の位置を図８に示す。Kohara et al．により公開されたマップ上に存在しない追加のHindIII部位は、2.9kb HindIII断片の “左手”部位上にある。pMOG180内のHindIII部位を以下のオリゴヌクレオチド２本鎖：を、HindIIIにより切断された pMOG180内にクローニングすることにより、SstＩ部位により置換する。得られたベクターを pMOG746と名付ける。以下のオリゴヌクレオチド２本鎖：を、BamHＩにより線状化されたベクター pMOG746内にクローン化する。（制限酵素消化によりチェックされた）所望の方向においてオリゴヌクレオチド２本鎖をもつベクターを pMOG747と名付ける。プラスミド pMOG674の2.9kb HindIII断片を、HindIIIにより線状化された pMOG747内にクローン化して、ベクター pMOG74 8を得る。 pMOG748の約2.4kb EcoRＶ／ SstＩと約 3.5kbの SstＩ／SmaＩ断片を単離し、ライゲートし、そして大腸菌（E.coli）内に形質転換し、このように、 2.9kbのHindIII断片の３′末端を欠失させる。得られたプラスミドを pMOG749と名付ける。 otsA遺伝子の５′末端を鋳型として pMOG749を用いて、合成オリゴヌクレオチドTPS1とTPS2を使用する PCRにより合成する。配列決定により、この 0.4kb PCR断片が正しい配列をもつことが確かめられる。 pMOG749の１kb BamHＩ／HindIII断片を、XmaＩとHindIIIにより線状化された pMOG747内の 0.4kb Xmaｌ／BamHＩ PCR 断片と一緒にクローン化する。HindIIIと SstＩにより消化されて得られたプラスミド内において、合成オリゴヌクレオチド２本鎖 TPS6／7をクローン化し、 T PSの３つのＣ−末端アミノ酸をコードする。 HindIIIと SstＩにより消化されて得られたプラスミドにおいて、プラスミド pMOG749の 0.25kb HindIII／SstＩ断片をクローン化し、これは、アグロバクテリウム・チュームファシエンス・ノパリン・シンターゼ(NOS)遺伝子由来のターミネーターを含んで成り、プラスミド pMOG798をもたらす。このプラスミドは、ダブル・エンハンサーをもつカリフラワー・モザイク・ウイルス(CaMV)35S プロモーターの制御下に正しい方向で大腸菌（E.coli）の otsA 遺伝子（Guilley et al．（1982）Cell30，763）、アルファルファ・モザイク・ウイルス(AMV)RNA4 リーダー配列(Brederode et al．(1980)Nucl.Acids Res．８，2213）とアグロバクテリウム・チュームファシエンス由来のノパリン・シンターゼ転写ターミネーター配列を含む。発現カセット全体が、EcoRＩと SstＩにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG23内に 2.5kbのEcoRＩ／SstＩ断片としてクローン化される。得られたバイナリー・ベクター、 pMOG799(図９)をポテトとタバコを形質転換するために使用する（pMOG799を宿す大腸菌（E.coli）株を、受託番号CBS 430 .93の下、1993年８月23日に、Centraal Bureau voor Shimmelcultures，Phabage n collections，Padualaan ８，Utrecht，The Netherlandsに寄託されている；p MOG23は、受託番号CBS 102.90の下、1990年６月29日に、上記 CBSに寄託されている。）。実施例IIpMOG799により形質転換されたタバコにおけるトレハロース生産タバコの葉のディスクをAgrobacterium tumefaciens を使用してバイナリー・ベクター pMOG799により形質転換する。多数の20の独立したトランスジェニック菌条をトレハロース・ホスフェート・シンターゼ(TPS)活性について分析する。インビトロにおいて生長させたいくつかのタバコ植物が、形質転換された植物に比べてかなり太い根をもつことが見つかった。これらのトランスジェニック・タバコ植物の根の分析は、非トランスジェニック対照植物と比較するときトレハロースの上昇レベルを示す。実施例IIIpMOG799により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産ポテト塊茎ディスクはアグロバクテリウム・チュームファシエンスを使用してバイナリー・ベクター pMOG799により形質転換された。トランスジェニック菌条をカナマイシンに対して選択する。多数の20の独立したトランスジェニック菌条をトレハロース・ホスフェート・シンターゼ(TPS)活性について分析する。この酵素を含むことが判明している菌条を成熟植物に生長させる。これらのトランスジェニック・ポテト植物の成熟塊茎の分析は非形質転換対照植物に比較するときトレハロースの上昇レベルを示す。トランスジェニック植物系統MOG799.1をさらなる研究のために増やした。実施例IV pMOG664の構築ラーゼ(AGPaseB)の小サブユニットのcDNA配列に一致するオリゴヌ llmitzer，L.，and Sonnewald，U．（1990）Mol.Gen.Genet．224，1 36-146）を合成する：これらのオリゴヌクレオチドは、これらの酵素による消化後にアンチセンス方向において発現カセット内でのアセンブリーを可能にするようにそれらの末端において好適な制限酵素部位（BamHＩと NcoＩ、下線）を含むように改作される。約１kbの断片を、鋳型としブラリーから単離された DNAを使用して、これらのオリゴヌクレオチドを用いて PCR増幅する。配列決定により、この断片がポテト品 d Sonnewald，U．（1990）Mol.Gen.Genet．224，136-146）。BamHＩと NcoＩによる消化の後、断片を、BamHＩと NcoＩにより線状化されたpMOG18内でクローン化する。得られたプラスミドから、(アンチセンス方向において、CaMV 35Sプロモーター、AMV RNA4リーダー、及びAGPase断片を含む)1.85kb EcoRＩ／BamHＩ断片、並びにアグロバクテリウム・チュームファシエンスからのノパリン・シンターゼ(NOS)遺伝子からのターミネーターを含むBamHＩ／HindIII断片を、EcoRＩと HindIIIにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG22内で３方向ライゲーションにおいてクローン化する。このバイナリー・ベクターpMOG22は、トランスジェニック植物内のハイグロマイシン選択のための植物発現性 HPTII遺伝子を含む（pMOG22は、受託番号101.90の下、1990年１月29日に、 Centraal Bureau voor Schimmelculturesにおいて寄託されている）。得られたバイナリー・ベクターpM OG664(図４)をポテト形質転換のために使用する。実施例Ｖ pMOG801の構築メイズ・スクロース・ホスフェート・シンターゼ(SPS)cDNAの配列に相補的なオリゴヌクレオチドのセット（Worrell，A.C.，Bruneau，J-M.，Summerfalt，K. ，Boersig，M.，and Voelker，T.A．（1991）Plant Cell 3，1121）を合成する。それらの配列は以下のようなものである：これらのオリゴヌクレオチドを、鋳型として２月齢の葉組織（Cl 離した DNAを使用して370塩基対の DNA断片を PCR増幅するために使用する。この断片の配列決定により、それがメイズの SPS配列に相同であることが示される（図３及びWorrellet al．（1991）参照）。この PCR断片を、２月齢の葉組織（ Clontech）から調製したポクリーニングするために使用する。１の陽性ハイブリダイジング・クローンの挿入物を配列決定する。654塩基対の DNA断片の配列は、メイズ SPS配列の対応部分と65％同一であることが判明している（Worrell et al．（1991）中の図11中のヌクレオチド番号 349から始まる。）。このクローンのEcoRＩ挿入物を、以下の合成オリゴヌクレオチド２本鎖との３方ライゲーションにおいて、BamHＩにより消化された pMOG180内でクローン化する。 CaMV 35Sプロモーターに対してアンチセンス方向において SPS断片をもつプラスミドを pMOG787と命名する。プラスミド pMOG787のEcoRＩ／HindIIIを以下の合成リンカー：との３方ライゲーションにおいて、EcoRＩにより線状化されたバイナリー・ベクターpMOG22内にクローン化する。このバイナリー・ベクターpMOG22はトランスジェニック植物内にハイグロマイシン選択についての植物発現性 HPTII遺伝子を含む（pMOG22は受託番号101.90の下、1990年１月29日に、Centraal Bureau voor S chimmelculturesに寄託されている。）。得られたバイナリー・ベクターpMOG801 (図10)をポテト形質転換のために使用する。実施例VI pMOG802の構築アンチセンス SPS発現カセットを含む、プラスミド pMOG801のEcoRＩ断片を、 EcoRＩにより線状化された、（アンチセンスAGPaseカセットを含む）バイナリー・ベクター pMOG664内でクローン化する。得られたバイナリー・ベクターを pMO G802という（図11）。実施例VIIpMOG799と pMOG664により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産 TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンスAGPase発現カセットを含む、バイナリー・ベクター pMOG664により形質転換する。10mg／Ｌハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRにより TPS及びアンチセンスAGPase配列の存在について分析する。両方を含むトランスジェニック植物を TPSとAGPase活性について分析する。 AGPase活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、AGPaseのためのmRNAレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そしてAGPaseの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。実施例VIIIpMOG799と pMOG801により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産 TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンス SPS発現カセットを含む、バイナリー・ベクター p MOG801により形質転換する。10mg／Ｌハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRにより TPS及びアンチセンス SPS配列の存在について分析する。両方を含むトランスジェニック植物を TPSと SPS活性について分析する。 SPS活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、SPSのためのmRN Aレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そして SPSの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。実施例IXpMOG799と pMOG802により形質転換されたポテトにおけるトレハロース生産 TPSを発現する、カナマイシン耐性植物系統MOG799.1のポテト塊茎ディスク（実施例IX）を、アンチセンス SPS及びAGPase発現カセットを含む、バイナリー・ベクター pMOG802により形質転換する。10mg／Ｌハイグロマイシン上で選択されたトランスジェニック菌条を、PCRにより TPS、アンチセンスAGPase及びアンチセンス SPS配列の存在について分析する。３つの構築物の全てを含むトランスジェニック植物を TPS，AGPaseと SPS活性について分析する。 AGPaseと SPS活性についてのトランスジェニック塊茎の分析により、非トランスジェニック対照と比較して個々のトランスジェニック系統において両酵素についての活性レベルにおける減少が生じていることが示される。ノーザン・ブロットにより、AGPaseと SPSのためのmRNAレベルが非トランスジェニック対照植物におけるものと比較してトランスジェニック植物において減少されていることが示される。TPS活性を示すことが見つかり、そして SPSの減少されたレベルをもつ、トランスジェニック・ポテト植物の塊茎内でのトレハロース・レベルは、トランスジェニック植物系統MOG799.1の塊茎内に見られるレベルと比較して増加を示す。寄託された株 pMOG22；受託番号 CBS 101.90（23頁18−21行；24頁21−23行） pMOG23；受託番号 CBS 102.90（22頁11行） pMOG799；受託番号 CBS 430.93（22頁６行）

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月５日【補正内容】請求の範囲１．植物又は植物細胞内で発現されるときその植物又は植物細胞のトレハロース含量を増加させる核酸であって、大腸菌（E.coli）のトレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする核酸。２．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）大腸菌（E.coli）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る請求項１に記載の核酸であって、その DNA配列が配列番号：２のアミノ酸配列により好ましくは表されるトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードしており、より好ましくは DNA配列が大腸菌の otsA遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んで成るトレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードしており、最も好ましくは、核酸が、受託番号430.93の下、Cent raal Bureau voor Schimmelculturesに寄託された、pMOG799内に存在するようなものである、核酸。３．転写開始部位が、カリフラワー・モザイク・ウイルスの DNAをコードする 35S RNAのプロモーター領域、及びアグロバクテリウム・チュームフアシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のノパリン・シンターゼ遺伝子の転写終止領域を含んで成る、請求項２に記載の核酸。４．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びにＡ．配列内に：（ｄ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素(SPS) をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA 配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、又はＢ．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にある ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、あるいはＡとＢの両方、を含む核酸配列。５．好ましくはバイナリー・ベクターである、請求項１〜４の中のいずれか１項に記載の核酸を含んで成る、クローニング・ベクター。６．好ましくはアグロバクテリウム（Agrobacterium ）属の内にある、請求項５に記載のベクターを含んで成る微生物。７．増加したトレハロースの生産能力をもつ植物を獲得する方法であって、以下の段階、（１）植物の受容体細胞内に、植物又は植物細胞内で発現された時にその植物又は植物細胞のトレハロース含量を増加させる植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）植物宿主内で機能する選択マーカー遺伝子をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を導入し、（２）上記選択マーカー遺伝子の存在についての選択を許容する条件下、形質転換細胞から植物を発生させる、を含んで成る方法。８．大腸菌（E.coli）トレハロース・ホスフェート・シンターゼを含む核酸を含む、組換え植物 DNAゲノム。９．（ａ）大腸菌（E.coli）トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする核酸、及び（ｂ）スクロース・ホスフェート合成活性又は ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性又は両方の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る、組換え植物 DNAゲノム。 10．請求項８又は９の中のいずれか１項に記載の組換え植物 DNAゲノムをもつ植物細胞。 11．請求項10に記載の植物細胞を含んで成る植物細胞カルチャー。 12．請求項11に記載の細胞を含む植物。 13．主に請求項11に記載の細胞から成る植物。 14．遺伝子修飾の結果としてトレハロースの増加レベルを作り出すことができる植物。 15．Arabidopsis thalianaではない、請求項14に記載の植物。 16．好ましくはAngiospermaeに属し、より好ましくは、Solanaceae科に属し、そして最も好ましくは、Solanum tuberosum である、増加レベルのトレハロースを含む、請求項14又は15に記載の植物。 17．好ましくは増加したレベルのトレハロースを含む、請求項14〜16の中のいずれか１項に記載の植物の部分。 18．球根(bulbs)、花、果実、毛状根(hairy roots)、葉、microtubers、花粉、根、種、茎及び塊茎から成る群から選ばれる、請求項17に記載の部分。 19．トレハロースの存在中、植物又は植物部分を保存する方法であって、以下の段階：（１）請求項14〜16の中のいずれか１項に記載の植物を生長させ、又は請求項 17又は18の中のいずれか１項に記載の植物部分を生長させ、（２）トレハロースを含む植物又は植物部分を収穫し、そして（３）その植物又は植物部分を風乾し、あるいは（４）その植物又は植物部分を凍結乾燥させる、を含んで成る方法。 20．請求項19に記載の方法により得られる乾燥植物又は植物部分。 21．トレハロースの製造方法であって、以下の段階：（１）トレハロースの生産を許容する条件下で請求項14に記載の植物を生長させ、（２）その植物又は植物部分を収穫し、（３）その植物又は植物部分からトレハロースを単離する、を含んで成る方法。 22．完全長のトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性、好ましくは配列番号：３のアミノ酸配列又はその機能的誘導体をコードし、より好ましくは配列番号２の DNA配列である、単離 DNA配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 19/12 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/11 Ｃ１２Ｒ 1:025） (Ｃ１２Ｐ 19/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ドゥス，ミリャムペトロネーラオランダ国，エヌエル―1058 ヘーエルアムステルダム，スリナメプレイン９ (72)発明者ファンデンエルゼン，ペトルスジョセフスマリアオランダ国，エヌエル―2215 ベーハーフォールフト，カイェンネホフ 26

Claims

【特許請求の範囲】１．植物又は植物細胞内で発現されるとき、その植物又は植物細胞のトレハロース含量を増加させる植物発現性遺伝子。２．配列内に、（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、並びに場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る、請求項１に記載の植物発現性遺伝子。３．DNA配列が配列番号：２のアミノ酸配列により表されたトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする、請求項２に記載の植物発現性遺伝子。４．トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列が大腸菌（E.coli）の otsA遺伝子のオープン・リーディング・フレームを含んで成る、請求項２に記載の植物発現性遺伝子。５．転写開始部位が、カリフラワー・モザイク・ウイルスの DNAをコードする 35S RNAのプロモーター領域及びアグロバクテリウム・チュームファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のノパリン合成遺伝子の転写終止領域を含んで成る、請求項２〜４のいずれか１項に記載の植物発現性遺伝子。６．受託番号430.93の下、Centraal Bureau voor Schimmelculturesに寄託された、pMOG799内に存在するような、請求項２に記載の植物発現性遺伝子。７．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ｄ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素(SPS) をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA 配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を含む DNA配列。８．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ｄ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にある ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を含んで成る DNA配列。９．配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ｄ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にあるスクロース・ホスフェート・シンターゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｅ）宿主内に天然にある ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードする RNA配列に少なくとも部分的に相補的な RNA配列をコードする DNA配列、及び場合により（ｆ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を含んで成る DNA配列。 10．請求項１〜６の中のいずれか１項に記載の植物発現性遺伝子を含んで成るクローニング・ベクター。 11．請求項７〜９の中のいずれか１項に記載の DNA配列を含んで成るクローニング・ベクター。 12．請求項１〜６の中のいずれか１項に記載の植物発現性遺伝子を含んで成るバイナリー・ベクター。 13．請求項７〜９の中のいずれか１項に記載の DNA配列を含んで成るバイナリー・ベクター。 14．請求項10〜13の中のいずれか１項に記載のベクターを含んで成る微生物。 15．アグロバクテリウム（Agrobacterium ）属の内にある、請求項12又は13に記載の微生物。 16．増加したトレハロースの生産能力をもつ植物を獲得する方法であって、以下の段階、（１）植物の受容体細胞内に、植物又は植物細胞内で発現された時にその植物又は植物細胞のトレハロース含量を増加させる植物発現性遺伝子、並びに配列内に：（ａ）植物宿主内で機能する転写開始領域、（ｂ）植物宿主内で機能する選択マーカー遺伝子をコードする DNA配列、及び場合により（ｃ）植物宿主内で機能する転写終止配列、を含んで成る植物発現性遺伝子、を導入し、（２）上記選択マーカー遺伝子の存在についての選択を許容する条件下、形質転換細胞から植物を発生させる、を含んで成る方法。 17．その内には天然には存在しない植物発現性トレハロース・ホスフェート・シンターゼ遺伝子を含む組換え植物 DNAゲノム。 18．（ａ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする植物発現性遺伝子、及び（ｂ）スクロース・ホスフェート合成の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る、組換え植物 DNAゲノム。 19．（ａ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする植物発現性遺伝子、及び（ｂ）ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る、組換え植物 DNAゲノム。 20．（ａ）トレハロース・ホスフェート・シンターゼをコードする植物発現性遺伝子、（ｂ）ADP−グルコース・ピロホスホリラーゼ活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、及び（ｃ）スクロース・ホスフェート合成活性の生合成を阻害することができる植物発現性遺伝子、を含んで成る、組換え植物 DNAゲノム。 21．請求項17〜20の中のいずれか１項に記載の組換え植物 DNAゲノムをもつ植物細胞。 22．請求項21に記載の植物細胞を含んで成る植物細胞カルチャー。 23．請求項21に記載の細胞を含む植物。 24．主に請求項21に記載の細胞から成る植物。 25．遺伝子修飾の結果としてトレハロースの増加レベルを作り出すことができる植物。 26．増加したレベルのトレハロースを含む請求項25に記載の植物。 27．Angiospermaeに属する請求項25に記載の植物。 28．Solanaceae科に属する、請求項27に記載の植物。 29．Solanum tuberosum である、請求項28に記載の植物。 30．請求項25〜29の中のいずれか１項に記載の植物の部分。 31．部分が増加したレベルのトレハロースを含む、請求項30に記載の植物の部分。 32．球根(bulbs)、花、果実、毛状根(hairy roots)、葉、microtubers、花粉、根、種、茎及び塊茎から成る群から選ばれる、請求項30〜32のいずれか１項に記載の部分。 33．トレハロースの存在中、植物又は植物部分を保存する方法であって、以下の段階：（１）請求項25〜26の中のいずれか１項に記載の植物を生長させ、又は請求項 29〜30の中のいずれか１項に記載の植物部分を生長させ、（２）トレハロースを含む植物又は植物部分を収穫し、そして（３）その植物又は植物部分を風乾し、あるいは（４）その植物又は植物部分を凍結乾燥させる、を含んで成る方法。 34．請求項33に記載の方法により得られる乾燥植物又は植物部分。 35．トレハロースの製造方法であって、以下の段階：（１）トレハロースの生産を許容する条件下で請求項25に記載の植物を生長させ、（２）その植物又は植物部分を収穫し、（３）その植物又は植物部分からトレハロースを単離する、を含んで成る方法。 36．完全長のトレハロース・ホスフェート・シンターゼ活性をコードする単離 DNA配列。 37．大腸菌（E.coli）から得られる、請求項36に記載の単離 DNA配列。 38．配列番号：２により表される請求項35に記載の単離 DNA。 39．配列番号：３のアミノ酸配列をコードする単離核酸配列。