RO115650B1

RO115650B1 - Acid nucleic, secventa de acid nucleic si vector care determina producerea de trehaloza si procedeu de producere a plantelor cu un continut crescut de trehaloza

Info

Publication number: RO115650B1
Application number: RO95-02295A
Authority: RO
Inventors: Andreas Hoekema; Jan Pen; Maria Petronella Does; Den Elzen Petrus Josephus Van
Original assignee: Mogen Int
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 2000-04-28
Also published as: ATE284446T1; DE69434173D1; FI956317A; CA2166063A1; NZ269548A; UA39958C2; DE69434173T2; CZ290830B6; PL312303A1; SK166095A3; AU697997B2; HU221124B1; CN1131315C; EP0711353B1; CN1129015A; CA2166063C; WO1995001446A1; ES2229222T3; PL179629B1; NO955354D0

Description

Prezenta invenție se referă la un acid nucleic, care determină producerea trehalozei, la o secvență a acidului nucleic, la un vector cu acesta și la un procedeu de obținere a unei plante cu capacitate sporită de producere a trehalozei. Prin introducerea acidului nucleic, în plante, folosind tehnici de DNA recombinant, se modifică metabolismul carbohidratului, în plantă sau, alternativ, plantele se pot prelucra ca produs alimentar, hrană sau ingrediente ale acestora, care au proprietăți îmbunătățite, datorită prezenței numiților carbohidrați.

Este cunoscut din publicația internațională WO 93/17093 Al, din 2 septembrie 1993, în care se descrie producerea trehalozei, în drojdii transgenice, pentru gene de drojdie care codifică trehaloză, ce poate fi produsă la fel în plantele superioare, folosind aceste gene de drojdie, dar până în prezent, nu există descrierea producerii trehalozei într-o plantă. Este de remarcat că W0/17093 Al a fost publicată anterior datei de depozit, dar ulterior datei de prioritate a prezentei cereri.

Este, de asemenea, cunoscut faptul că trehaloza este un nume general dat la Dglucozil D-glucozide, care cuprind dizaharide bazate pe două molecule de glucoză a-, a, β-, β, β- legate. Trehaloza și, în special, α-trehaloza 1-(0-a-D-glucopiranozil)-1'-0-a-dglucopiranoza) este o dizaharidă care este foarte răspândită în natură.

Sinteza chimică a trehalozei este dificilă (necesită grupări protectoare] și ineficientă. Surse naturale curente de trehaloză sunt ciupercile comestibile și drojdia Saccharomyces cerevisiae, care pot acumula, ca trehaloză, peste 1D% din greutatea uscată. Totuși, producerea este limitată de activitatea trehalozică ridicată, care produce metabolizarea rapidă a trehalozei. Elbein A. D. (1974, Adv. Carbohydrate Chem. And Biochem. 30, 227-256] face o trecere în revistă a apariției și metabolismului dizaharidei trehaloză, în special, trehaloză, în organismele vii. La plante, prezența trehalozei s-a raportat în unele specii de plante inferioare, precum și la un număr de specii de palnte superioare, aparținând spermatophytelor, Echinops persicus, carex brunescens, Fagus silvaticus. Totuși, aceste rezultate nu au fost stabilite de către alți autori (de exemplu, Kendall et al., 1990, Phytochemistry 29, nr.8, 2525-2528].în publicația de mai sus, de exemplu, Kendall etal., referindu-se la apariția trehalozei în spermatofite, au stabilit că prezența acesteia a fost documentată ferm numai pentru semințe de chimen [Carum carvi). O lucrare despre prezența trehalozei în floarea soarelui, aparținând lui Cega et al., (1977, J. Am. Oii Chem. Soc. 54, 15D et seq.) a fost pusă sub semnul îndoielii de către Kandler et al., (în Structure and Function; Preiss, J., p. 228, Academia Press) conform publicației de mai sus, a lui Kendall et al., 1990. Raportări ale trehalozei în fag [Fagus Sylvaticus) și varză nu au putut fi verificate de către alți autori. Publicația de mai sus a lui Kendall et al., (1990) este prezentată aici ca referință.

în ciuda aparentei rarități a trehalozei, în plantele superioare s-au raportat activități de degradare a trehalozei pentru un număr semnificativ de familii de plante investigate. Activitatea trehalozică stabilă, ridicată, s-a găsit în trei linii de grâu, pin și Selaginella lepidophylla. Activitatea trehalozică stabilă, redusă, s-a găsit la lucernă, porumb negru dulce mexican și molid alb. Activități moderate, labile, s-au găsit în două suspensii diferite de canola, dar acestea probabil nu se pot atribui activității trehalozice specifice. Orzul, iarba Bromus și molidul negru s-au raportat a nu conține nici un fel de activitate trehalozică (Kendall, 1990).

în organismele capabile de producerea sa, trehaloza este considerată a fi biosintetizată ca 6-fosfat, în timp ce forma de depozitare este zahărul liber. Prin urmare,

RO 115650 Bl se consideră că organismele care produc și/sau depozitează trehaloza conține o fosfatază capabilă să cliveze trehaloza 6-fosfat (Elbein, 1974). Se cunoaște puțin despre prezența fosfatazelor fosfat la plantele superioare.

Prezenta invenție se referă la un acid nucleic, care determină producerea de 50 trehaloză în plantele superioare, la o secvență a acidului nucleic de mai sus, la un vector de donare, la un procedeu de obținere a unei plante cu capacitate sporită de producere a trehalozei.

Acidul nucleic, care determină producerea de trehaloză în plantele superioare, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că el conține: 55

a) o regiune de inițiere transcripțională, pentru regiunea ce codifică enzima trehaloză fosfat sintetază;

b) o secvență care codifică o activitate trehaloză fosfat sintetaza reprezentată prin secvența de aminoacizi SECV Nr. 2, de preferință, o secvență DNA, care codifică o activitate trehaloză fosfat sintetaza, care cuprinde cadrul de citire al genei otsA a E. coli 6o așa cum este descrisă în SECV NR. 2 sau un acid așa cum este prezentat în pM0G799, depozitat la Central Bureau voon Schimmelcultures, număr de acces 430.93;

c) o regiune de terminare trenscripțională, pentru regiunea ce codifică enzima trehaloză fosfat sintetaza.

Secvență de acid nucleic, care determină producerea de trehaloză în plantele 65 superioare, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că ea conține:

(A) acidul nucleic ce determină producerea de trehaloză, în plantele superioare, așa cum este revendicat în revendicarea 1; și (B) o genă care inhibă enzima sacroză fosfat sintetaza (SPS), care cuprinde:

a) o regiune de inițiere transcripțională operabil legată la aceasta; 70

b) o secvență DNA, care codifică o secvență de RNA, cel puțin parțial complementară, la o secvență de RNA, care codifică o enzimă sucroză fosfat sintetaza (SPS), produsă în mod natural în plantă; și

c) o secvență de terminare transcripțională și/sau 75 (C) o genă care inhibă ADP-glucoza pirofosforilaza, care cuprinde:

a) o regiune de inițiere transcripțională, operabil legată la aceasta;

b) o secvență DNA, care codifică o secvență RNA cel puțin parțial complementară la o secvență RNA, care codifică o enzimă ADP-glucoza pirofosforilaza, produsă în mod natural în plantă; 80

c) o secvență transcripțională terminală;

sau ambele B) și C).

Vectorul de donare, conform invenției, este un vector binar pM0G799, care este depozitat la Central Bureau voor Schimmel cultures, sub numărul de depozit CBS 430.93, și vectorul binar menționat conține E. co//trehaloza fosfat sintetaza, așa cum 85 este descrisă în revendicarea 1.

Procedeul de obținere a unei plante cu capacitate sporită de producere a trehalozei, cuprinde următoarele etape:

1) introducerea, într-o celulă receptoare, a unei plante, a unui acid nucleic, conform revendicărilor 1 la 3, acid nucleic care atunci când este exprimat într-o plantă 90 sau într-o celulă a unei plante crește conținutul de trehaloză a plantei sau a celulei menționate,

RO 115650 Bl și o genă exprimabilă a unei plante cuprinsă în secvența:

(a) o regiune transcripțională de inițiere, care este funcțională în planta menționată, (b) o secvență DNA care codifică o genă marker selectabilă care este funcțională la planta gazdă selectată, și opțional, (c) o secvență transcripțională terminală care este funcțională în planta gazdă menționată (2) generarea unei plante dintr-o celulă transformată în condiții care permit selectarea pentru prezența genei marker selectabilă.

Un mod de realizare preferat este o metodă de păstrare a unei plante sau a unei părți dintr-o plantă, în prezența trehalozei și cuprinde următoarele etape:

(1) creșterea unei plante având genomul recombinant cu oricare din secvențele definite în revendicările 4 la 6;

(2) recoltarea plantei sau a părți din plantă care conține trehaloza, și (3) uscarea în aer a plantei sau a părții din plantă, sau alternativ, (4) uscarea prin congelare a plantei sau a părții din plantă.

Un mod de realizare preferat este o metodă de producere a trehalozei, cuprinde următoarele etape:

(1) creșterea plantei, având genomul recombinant al oricăreia dintre revendicările

4...6, în condiții care permit producerea trehalozei, (2) recoltarea plantei menționate sau a unei părți din aceasta, (3) izolarea trehalozei din planta menționată sau din partea menționată din aceasta.

Un mod de realizare preferat este o metodă de obținere a unei plante cu rezistență crescută la lipsa de apă, care cuprinde următoarele etape:

(1) introducerea în celula receptoare a unei plante, a unui acid nucleic conform revendicăriil, (2) regenerarea unei plante din celula receptoare menționată, în care planta menționată prezintă o rezistență crescută la lipsa de apă.

Un alt mod preferat, de realizare al invenției, este o plantă de cartof, capabilă să producă trehaloza în tuberculi, datorită prezenței, în numita plantă de cartof, a unei gene exprimabile, care cuprinde în secvența sa:

(A) o regiune de inițiere transcripțională, derivată de la RNA-ul 355 al CaMv flacat în amonte, printr-un intensificator dublu, (b) o secvență DNA care codifică trehaloza fosfat sintetaza care este regiunea de codificare a genei oCsA localizată în operonul BA de E.coli.

(c) o secvență de terminare transcripțională, derivată de la gena nopalin sintataza ( nos] a Agrobacterium. Tuberculi ai plantelor transgenice, care conțin gena TPS exprimabilă în plantă, au produs trehaloză, în timp ce la plantele la care lipsește această genă, nu s-a produs. Aparent, trehaloza fosfatul care este produs de către tuberculii transgenici este convertit în trehaloză. Aparent, nu este necesar să se asigure o activitate trehaloză fosfat fosfataza, deoarece pare a fi prezentă la cartof.

De asemenea, ilustrată în fig. 1, este o încercare de a îmbunătăți accesibilitatea substratului pentru TPS. în acest scop, două gene care influențează accesibilitatea glucozei-6-fosfatului (G6F) și UDPG-ului, cu o genă SPS antisens și APG-ază antisens s-au donat, sub controlul promotorului CaMV35S, pentru expresie în plante gazdă. Dacă s-a

RO 115650 Bl introdus într-o plantă gazdă, care conține o genă TPS exprimabilă în plantă, conform invenției, aceasta va crește accesibilitatea substratului pentru TPS și, ca urmare, sinteza trehalozei. Este evident pentru oricine cu pregătire în domeniu, de asemenea, că alte gene antisens pot fi folosite pentru blocarea sintezei sucrozei sau amidonului, în vederea îmbunătățirii accesibilității substratului.

Cu toate că invenția este descrisă în detaliu, pentru plante de cartof, în care se exprimă gena trehaloză fosfat sintază, de la E. coh sub controlul promotorului CaMV355 ca regiune de inițiere a transcripției, va fi clar pentru cei cu pregătire în domeniu că sunt în mod egal corespunzătoare pentru producerea trehalozei în alte plante gazdă spermatofite. Plante gazdă, dintre spermatofite, sunt Angispermae și anume Dicotiledoneae, cuprinzând, între altele, Solanaceae ca o familie reprezentativă și Monocotiledoneae, cuprinzând, între altele, Gramineae ca o familie reprezentativă. Plante gazdă adecvate, așa cum s-au definit în contextul prezentei invenții, includ plante (precum și părți și celule ale numitor plante] și urmașilor care au fost modificați gentic, folosind tehnicide DNA recombinant, pentru a produce sau spori producerea trehalozei de interes în plantă sau organul de plantă; aceste plante pot fi folosite direct (de exemplu, speciile de plante care produc părți comestibile) sau după ce trehaloza este purificată de numita gazdă (care poate fi plantă gazdă atât comestibilă, cât și necomestibilă). Plante de cultură cu părți comestibile, conform invenției, includ pe cele care au flori: conopida (Brassica oleracea), anghinare [Cynara scolymus), fructe precum măr [Malus ex. domesticus], banană [Musa ex. acuminata], boabe (precum coacăze (Ribes de ex. rubrum), sâmburoase (precum cireașa dulce, Prunus ex. avium], castravete [Cucumis ex. sativus), strugure [Vitis, ex. vinifera], lămâia [Citrus Umori], pepene galben (Cucumis melo), nuci (precum nuca, Juglans ex. regia, arahida, Arachis hypogeae), portocala [Citrusex. maxima), piersica [Prunus ex. persica), para [Pyra ex. domestica), ardei iute (Solanum, ex. capsicum), pruna [Prunus, ex. domestica], fraga [Fragaria ex. Moscata), pătlăgeaua roșie [Lycopersicon ex. Esculentum), frunze precum lucerna [Medicago sativa) varza [Brassica oleracea), andiva [Cichoreum, ex. Endiva), praz [Allium porrum), lăptuca [Lactuca sativa), spanac [Spinacia oleraceae) tutun [Nicotină tabacum), rădăcini precum (Maranta arundinacea), sfecla [Beta vulgaris], morcov [Daucus Carota), maniocul [Manihot esculenta), rapița sălbatică [Brassica rapa), ridichea [Raphanus sativus), ignema [Dioscorea esculenta), cartof dulce sau batată [Ipomoea batatas) și semințe, ca fasolea [Phaseolus vulgaris), mazărea [Pisum sativus), soia [Glicin max.), grâu (Triticum aestivum), orz [Hordeum vulgare), porumb [Zea mays), orez [Oryza sativa), tuberculi precum gulia [Brassica oleraceae), cartof [Solanum tuberosum) și altele. Părțile comestibile pot fi conservate, prin uscare în prezența nivelurilor sporite de trehaloză, produse aici, datorită prezenței unei gene exprimabile de plantă, trehaloză fosfat sintetaza. Poate fi avantajos să se producă niveluri crescute ale trehalozei, punând DNAul, care codifică activitatea TPS, sub controlul unui promotor specific organului sau țesutului de plantă; alegerea căruia se poate determina cu ușurință de către specialiștii din domeniu.

Se poate folosi orice genă trehaloză fosfat sintetaza, sub controlul elementelor reglatoare, necesare pentru expresia DNA-ului în celule de plantă fie specifică, fie constructivă, atâta timp cât ea este capabilă să producă o activitate trehaloza fosfat sintetază opțională. Secvența de acid nucleic reprezentată în SECV. NR: 2, de fapt orice cadru de citire deschis care codifică o activitate trehaloză fosfat sintetază, conform

140

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 115650 Bl invenției, se poate modifica fără a modifica neapărat secvența de aminoacizi a proteinei codificate prin aceasta. Acest fapt este produs prin degenerarea codului genetic. Astfel, cadrul de citire deschis care codifică activitatea trehaloză fosfat sintetaza poate fi adaptat la codonul folosit în planta gazdă aleasă.

De asemenea, secvența de acid nucleic, izolată, reprezentată prin SECV. NR: 2, poate fi folosită pentru identificarea activităților trehalozei fosfat sintetaza în alte organisme și izolarea ulterioară a acestora, prin hibridizarea DNA-ului din alte surse cu un fragment de DNA sau RNA care se poate obține din gena E.coli. De preferință, astfel de secvențe DNA sunt căutate prin hibridizare în condiții stringente ( ca temperatura și tăria ionică a amestecului de hibridizare). Dacă aceste condiții sunt sau nu stringente depinde, de asemenea, de natura hibridizării, cu alte cuvinte, DNA:DNA, DNA:RNA, RNA: RNA, precum și de cât este de lung sau scurt fragmentul hibridizat. Specialiștii în domeniu sunt capabili să stabilească, cu ușurință, un regim de hibridizare stringentă.

Surse pentru izolarea activităților trehaloză fosfat sintetaza includ microorganisme (de exemplu, bacterii, drojdii, fungi), plante, animale și altele. Secvența DNA care codifică activitatea trehalozei fosfat sintaza izolată din alte surse, poate fi folosită în același fel, într-o metodă pentru producerea trehalozei, conform invenției.

Invenția cuprinde, de asemenea, secvențe de acid nucleic care au fost obținute prin modificarea secvenței de acid nucleic reprezentate în SECV. NR:2, prin mutația unuia sau mai multor codoni astfel, încât acestea au ca urmare schimbări de aminoacizi din proteina codificată, atăta timp cât mutația secvenței aminoacide nu anulează integral activitate trehaloză fosfat sintazei.

în principiu, orice plantă gazdă este adecvată în combinație cu orice genă exprimabilă de plantă trehaloză fosfat sintaza. Gene trehaloză din alte surse devin accesibile, ca și cele descrise aici, pentru a fi folosite într-un mod similar, pentru obținerea unei combinații plantă, genă exprimabilă trehaloză fosfat sintaza.

Inhibarea genelor endogene, în vederea sporirii accesibilității substratului pentru trehaloză fosfat sintaza, așa cum s-a exemplificat aici, cu inhibarea genei endogene sucroza fosfat sintază și genei ADP-glicoză pirofosforilază, se poate dirija în numeroase moduri, alegerea acestora nefiind critică pentru invenție. De preferință, inhibarea genei se obține prin așa numita “abordare antisens”. Aici se exprimă o secvență DNA care produce RNA ce este cel puțin parțial complementar la RNA-ul care codifică activitatea enzimatică, ce trebuie să fie blocată (de exemlu, AGP-ază sau SPS, din exemple). Este de preferat să se utilizeze gene antisens omoloage, acestea fiind mai eficiente decât gene heteroloage. Izolarea unei gene SPS antisens, din cartofi, folosind ca sondă o secvență de genă SPS de la porumb, servește pentru indicarea fezabilității acestei strategii. Aceasta nu înseamnă însă a indica faptul că, pentru practicarea invenției, este necesară utilizarea fragmentelor antisens omoloage. O metodă alternativă pentru blocarea sintezei activităților enzimatice nedorite este introducerea în genomul plantei gazdă, a unei copii suplimentare a unei gene endogene, prezente în plata gazdă. Se observă că o astfel de copie suplimentară a unei gene suprimă gena endogenă: acest efect este cunoscut, în literatură, ca efectul co-supresiv sau co-supresie. în principiu, atât plantele monocotiledonate, cât și cele dicotiledonate sunt predispuse pentru transformare, putând fi modificate prin introducerea unei gene exprimabile de plantă, conform invenției, într-o celulă receptoare și creșterea unei plante noi, care adăpostește și exprimă gena exprimabilă de plantă. Plante preferate, conform invenției, sunt acelea

RO 115650 Bl

235 care sunt capabile să convertească fosfat-trehaloză în trehaloză și care nu conțin deloc sau conțin puțină activitate care degradează trehaloza. Se va înțelege că plantele cărora le lipsește abilitatea de a converti fosfat trehaloză în trehaloză sunt, de asemenea, incluse în prezenta invenție. Aceste plante pot fi modificate ulterior, prin introducerea de gene suplimentare, care codifică fosfataze care sunt capabile să convertească fosfat trehaloza în trehaloză. De asemenea, în principiu, sunt avute în vedere plante care conțin trehaloze, deoarece aceste plante pot fi făcute corespunzător,pentru producerea trehalozei prin inhibarea activității unor astfel de enzime, de exemplu, prin inhibarea expresiei genelor care codifică asemenea enzime, folosind o abordare antisens.

Metoda de introducere a genei exprimabile trehaloză fosfat sintaza de plantă într-o celulă de plantă receptoare nu este crucială, atâta timp cât gena este încorporată stabil în genomul celulei numitei plante. în plus, la utilizarea tulpinilor de Agrobacterium sunt accesibile diverse alte tehnici pentru introducerea DNA-ului. în celulele de plantă, cum ar fi transformarea protoplaștilor folosind metoda calciu/polietilenglicol, electroporarea și microinjectarea sau bombardamentul cu particule (acoperite) (Potrykus, 1990, Bio/Tehnol. 8, 535-542).

Suplimentar față de aceste așa numitele metode de transformare DNA directă, sunt accesibile în mare măsură sisteme de transformare care implică vectori, cum ar fi vectori virali (de exemplu, de la virusul mozaicului conopidei (CaMV) și vectori bacterieni (de exemplu, de la genul Agrobacterium], (Potrykus, 199D, Bio/Tehnol. 8:535-542). După selectare și/sau sortarea protoplaștilor, celulele sau părți ale plantei care au fost transformate pot fi regenerate la plante întregi, folosind metode cunoscute în domeniu (Horsch etal., 1985, Science 225, 1229-1231).

S-a dovedit că plantele monocotiledonate sunt apte pentru transformare și că plantele transgenice fertile se pot regenera de la celule transformate. Dezvoltarea sistemelor reproductibile de cultură de țesut pentru aceste plante de cultură, alături de metode eficace pentru introducerea de material genetic în celule de plante, au facilitat transformarea. în prezent, metode preferate pentru transformarea monocotiledonatelor sunt bombardamentul cu microproiectile al extractelor sau suspensiilor de celule și absorbția direactă de DNA sau electroporarea (Shimamoto et al., 1989, Nature, 338, 274-276). Plante de porumb trangenice s-au obținut prin introducerea genei bar de Streptomyces hygroscopicus, care codifică fosfinocitin acetiltransferaza (o enzimă care inactivează erbicidul fosfinotricină), în celule embriogenice ale unei culturi în suspensie de porumb prin bombardament cu microproiectile (Gordon.Kamm, 1990, Plant Cell, 2. 603-618). A fost raportată introducerea de mterial genetic la protoplastele aleuronice ale altor monocotiledonate cum ar fi grâu și orz (Lee, 1989, Plant Mol, Biol. 13, 21-30). Plante de grâu s-au regenerat din suspensii de culturi embriogene, prin alegerea numai a celulelor de vârstă omogenă și a țesuturilor embriogene modulare calusate, pentru stabilirea suspensiilor de culturi embriogene (Vasil, 1990, Bio/Technol 8, 429-434). Combinarea cu sisteme de transformare, pentru aceste plante cultivate, face posibilă aplicarea invenției la monocotiledonate. Aceste metode pot fi aplicate, de asemenea, pentru transformarea și regenerarea dicotiledonatelor.

Plantele monocotiledonate, inclusiv plante cultivate de importanță comercială, cum este porumbul, sunt convenabile pentru transferul de DNA prin tulpini de Agrobacterium (EP 159 418 B1; Gould J, Michael D, Hasegawa □, Ulian EC, Peterson G, Smith RH, (1991) Plant. Physiol95, 426-434).

240

245

250

255

260

265

270

275

RO 115650 Bl

Considerând alegerea plantei gazdă, este de preferat să se selecteze specii de plante cu activitate mică de degradare a trehalozei sau absentă. Cu toate acestea, plantele care prezintă activitate trehalozică nu sunt excluse ca nefiind corespunzătoarte pentru producerea trehalozei și este necesar să se asigure inhibarea activității trehalozice, dacă aceasta previne cu desăvârșire acumularea trehalozei. Astfel de inhibarte poate fi obținută folosind abordarea antisens binecunoscută în domeniu și ilustrată pentru alte scopuri, în această descriere.

De asemenea, ar fi de înțeles că invenția nu este limitată la folosirea promotorului CaMV35S ca regiune de inițiere transcripțională. Secvențe DNA corespunzătoare pentru controlul expresiei genelor exprimabile în plantă, incluzând gene marker, ca regiuni de inițiere transcripțională, intensificatori, lideri netranscriși și altele, pot fi derivate de la orice genă care este exprimată într-o celulă de plantă, ca genele endogene de plantă, gene exprimate natural în celulele de plantă așa cum sunt cele localizaze pe T-DNA-ul de tip sălbatic al Agrobacterium, gene ale virusurilor de plante, precum și alte gene eucariote care includ o regiune de inițiere transcripțională care se conformează secvenței consens pentru inițierea transcripției eucariote. De asemenea, se au în vedere promotori hibrizi care combină porțiuni funcționale ale diverșilor promotori sau echivalenți sintetici ai acestora. Pentru controlul expresiei genelor exprimabile de plantă, conform invenției, se pot folosi în afară de promotori constitutivi, promotorii nduși sau promotori reglați în alt mod în imaginea expresiei lor, de exemplu, de dezvoltare sau specifici tipului de celulă, atâta timp cât ei sunt exprimați în părți de plantă care conțin substrat pentru TPS.

Pentru alegerea sau căutarea celulelor transformate, este de preferat să se includă o genă marker legată la gena exprimabilă de plantă conform invenției pentru a fi transferată la o celulă de plantă. Alegerea unei gene marker adecvate în transformarea plantei face parte din pregătirea obișnuită a specialistului din domeniu; câteva gene marker folosite de exemplu, în mod uzual sunt genele neomicin fosfotransferaza care conferă rezistență la kanamicină (EP-B 131 623), gena glutation-transferaza din ficat de șobolan care conferă rezistanță la erbicide derivate de la glutation (EP-A 256 223), glutamin sintetaza care conferă la supraexpresie rezistență la inhibitorii glutamin sintetază ca fosfinotricină (WO 87/053327), gena acetil transferaza din Streptomyces viridochromogenes care conferă rezistență la agentul selectiv fosfinotricină (EP-A 275 957), gena care codifică o 5-enolshikimat-3-fosfat sintazâ (EPSPS) care conferă toleranță pentru N-fosfonomitilglicină, gena bar care conferă rezistență împotriva Bialophosului (de exemplu, WO 91/02071) și altele. Acum alegerea markerului nu este decisivă atâta timp căt este funcțional ( cu alte cuvinte selectiv] în combinație cu celulele plantei alese.

Gene marker și gena de interes nu trebuie să fie legate deoarece cotransformarea genelor nelegate (US 4 399 216) este, de asemenea, un proces eficient în transformarea plantei.

Ca material de plantă preferat pentru transformare, în special pentru plante dicotiledonate de cultură, sunt discurile din frunză care pot fi transformate cu ușurință și au o capacitate de regenerare bună (Horsch R. B. Et al., (1985), Science 227, 12291231).

Cu toate că producerea trehalozei poate fi obținută cu gena exprimabilă în plantă trehaloză fosfat sintetaza ca genă unică de carbohidrat modificată, invenția este ilustrată suplimentar cu exemple de gene antisens suplimentare exprimabile la plantă care sunt capabile să efectueze o creștere a accesibilității substratului pentru trehaloză fosfat

RO 115650 Bl

325 sintază. Exemple specifice, de asemenea, gene sunt genele antisens exprimabile în plantă pentru SPS de la porumb și cartof și AGP-ază de la cartof. Reglarea încetinită a enzimelor carbohidratului modificat care folosește abordarea antisens nu este limitată prin exemple specifice. De exemplu, gene antisens exprimabile în plantă, parțial complementare, pot fi folosite pentru inhibarea expresiei unei gene țintă, atât timp cât gena exprimabilă în plantă produce un transcript care este complementar suficient cu transcriptul genei țintă și suficient de lung pentru a inhiba numita genă țintă.

Este lipsit de importanță pentru invenție cum se efectuează introducerea a două sau a mai multor gene în plantă. Aceasta poate fi obținută, între altele, prin una dintre următoarele metode:

(a) transformarea liniei de plantă cu un construct multigenă care conține mai mult de o genă de introdus, (b) co-transformarea simultană a diferitelor constructe la aceiași linie de plantă, (c) reprize sub secvențe de transformare a aceleiași plante cu genele de introdus, (d) încrucișarea a două plante, fiecare conținând o genă diferită de indus în aceeași plantă.

Domeniul de aplicare al invenției aparține atât agriculturii cât și horticulturii, de exemplu, datorită proprietăților îmbunătățite ale plantelor modificate precum și la fel de bine, în oricare formă de industrie unde trehaloza este sau va fi aplicată. Fosfat trehaloza și trehaloza pot fi folosite ca atare, de exemplu, sub formă purificată sau sub formă de amestecuri sub forma unui produs de stocare în părți ale plantei. Părțile de plantă care adăpostesc (niveluri ridicate de ) fosfat trehaloza sau trehaloza pot fi folosite ca atare, sau prelucrate fără a finevoie să se adauge trehaloză.

De asemenea, trehaloza poate fi purificată din plantele sau din părțile plantei care o produc și poate fi folosită în continuare într-un proces industrial. în industriile de produse alimentare, trehaloza poate fi folosită prin adăugarea ei la alimente înaintea uscării. Uscarea alimentelor este o metodă importantă de conservare în industrie. Trehaloza poate fi utilă în special pentru conservarea produselor alimentare prin uscarea convențională la aer și pentru a permite reconstituirea rapidă după adăugarea de apă a unui produs de calitate superioară (Roser et al., July 1991, Trends in Food Science and Technology, pp 166-169). Beneficiile includ păstrarea aromelor/mirosurilor naturale, gustului produsului proaspăt și valorile nutritive (proteine și vitamine). S-a dovedit că trehaloza are capacitatea de a stabiliza proteine și membrane și de a forma o peliculă stabilă inertă chimic. Activitatea scăzută a apei în asemenea produse alimentare uscate previne reacțiile chimice care pot produce alterarea.

Plantele de cultură în câmp, precum porumbul, maniocul, cartoful, sfecla de zahăr și trestia de zahăr s-au folosit de mult timp deoarece sunt o sursă naturală pentru producerea de carbohidrați (amidonuri și sucroză). Producerea de trehaloză în astfel de plante de cultură facilitează prin ingineria genetică a căii metabolice de biosinteză a trehalozei în aceste specii de plante, ar permite exploatarea de asemenea plante cultivate pentru producerea trehalozei.

Toate referințele citate în această descriere sunt orientate asupra nivelului cunoștințelor în domeniu la care aparține invenția. Toate publicațiile, atât brevete cât și altele asemenea amintite anterior sau ulterior în această descriere sunt încorporate aici ca referință, chiar fiecare dintre ele a fost încorporată aici individual pentru referire.

330

335

340

345

350

355

360

365

RO 115650 Bl în continuare se prezintă nouă exemple de realizare a invenției în legătura cu fig. 1... 11, care reprezintă:

-fig 1, reprezentarea schematică a părților căilor metabolice biosintetizatoare ale sucrozei și amidonului în țesuturile de absorbție ale plantei. Figura arată cum carbohidratul produs prin fotosinteză în frunză este transportat pe calea țesutului floemic sub formă de sucroză. După traversarea țesutuluide absorbție, el este descărcat printr-o membrană care leagă activitatea invertazei pentru a da monozaharurile glucoză și fructoză. Prin acțiunea unui număr de etape enzimatice aceste monozaharuri sunt convertite la amidon și/sau sucroză așa cum s-a schțat aici. Metaboliții glucozei GGP și UDPG sunt considerați folosiți ca substrate pentru enzime TPS prelucrată în plantă prin introducerea genei exprimabile de plantă otsA. Figura arată cum cantitatea UDPG-ului și GGP-ului accesibilă ca substrat este crescută prin reducerea nivelurilor enzimelor SPS și AGPază. Inhibiția lor este marcată cu o cruce.

-fig. 2, harta schematică a EMBL 4 clona 7F11 din Kohara et al., (1987), care conține operonul otsBA de la E. coli. Insertulde 18,8 kb a fost hașurat. Sunt identice siturile de restricție pentru enzimele EcoRV și Hindi! folosite pentru clonarea otsA, precum și distanța lor în kb considerând situl din partea stângă a insertului. Sunt indicate genele otsA și B, săgețile arătând direcția transcripției (vezi fig. 8 harta extinsă).

-fig. 3, secvența cDNA SPS de cartof donată. Subliniat: secvențele cDNA SPS de porumb folosite ca oligonucleotide în reacția de amplificare PCR.

-fig. 4, reprezentarea schematică a vectorului binar pM0G664.

-fig. 5, harta de restricție a părții pTiB6 care arată două fragmente donate în pM0G578.

-fig. 6, reprezentarea schematică a pM0GS79 folosite pentru construirea plasmidului ajutător fără regiunea T în Agrobacterium tulpina M0G1O1.

-fig. 7, reprezentarea schematică a vectoruluide expresie pMOG18O.

-fig. 8, harta extinsă a EMBL 4 clona 7F11 din Kohara et al., (1987) care conține operonul otsBA de la E.coli. este indicată localizarea cadrului de citire deschis (ORP) al luiTPS (*: Siturile Hind II nu sunt prezente în harta lui Kahora et al., infra],

-fig. 9, reprezentarea schematică a vectorului binar pM0G799.

-fig. 1G, reprezentarea schematică a vectorului binar pMOG8O1.

-fig. 11, reprezentarea schematică a vectorului binar pM0G802.

Manipulări DNA.

Toate procedurile DNA (izolare DNA din E. coli, restricțiae, ligare, transformare, etc] s-au realizat conform protocoalelor standard (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual, a 2-a ediție, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, NY).

Tulpini: în toate exemplele, s-a folosit pentru donare E. coli K-12 tulpina DH5a. Tulpina de Agrobacterium tumefaciens folosită în experimentele pentru transformarea plantelor este M0G101 care este o tulpină octopină neocogenă de tip helper derivată de la LBA 1O1D (Koekman et al., (1982) Plasmid 7, 119] prin substituire T-DNA-ului printr-un marker de rezistență la streptomicină.

Construcția tulpinii Agrobacterium MOG1O1: Pentru transferul constructelor genetice în plante de cartof și tutun s-a folosit un sistem vector linear (Hoekema A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J., și Schilperoort, R. A. (1983) Nature, 303, 179).

RO 115650 Bl

Plasmidul ajutător care conferă funcții de virulență la Agrobacterium tumefaciens este derivat de la octopina plasmiduluiT/pT/B6. M0G101 este o tulpină de Agrobacterium tumefaciens purtătoare a unui plasmid și substituită printr-un marker bacterian de rezistență la streptomicină de la transpozonul Tn1831 (Hooykaas et al., 1980, plasmid 4, 64-75).

Plasmidul Ti, pTiB6 conține două regiuni adiacente, TL (T-stânga) și TR (TDreapta).Pentru obținerea unui derivat căruia să-i lipsească regiunile TL și TR, s-a construit vectorul intermediar pM0G579. Plasmidul pM0G579 este un derivat pBR322 care conține două fragmente de plasmid tiomoloage la fragmentele regiunilor T ale lui pTiB6 localizate în stânga și în dreapta (hașurate în figurile 5 și 6). Cele două fragmente sunt separate în pM0G579 printr-un fragment BamHI-Hindll de 2,5 kb din transpozonul Tn831 (Hooykaas et al., 1980, Plasmid 4, 64-75) care conține markerul de rezistență la streptomicină (figura 6). Plasmidul introduce în Agrobacterium tumefaciens tulpina LH4 7O7O(C58-C9(pTiB6] o tulpină C58 tratată în care este introdus pTiB6 din publicația de mai sus (Koekman et al., (1982), prin împerechere triparenterală din E.coli, folosind ca helper HB1O1 8pRK2O13. S-au selectat transconjugați după rezistența la rifamicină (20 mg/l) și streptomicină (25 mg/l). 0 recombinare dublă dintre pM0G579 și pTiB6 a avut ca rezultat pierderea rezistenței la carbenicilină (markerul pBR322] și deleția întregii regiuni T. Dintre 5000 replici ale transconjugaților rezistenți la streptomicină, puși pe carbenicilină (100mg/l) doi s-au găsit sensibili. Analiza Southern (nu s-a prezentat) a arătat că un crossing-over dublu a deletat întreaga regiune T. Tulpina rezultată s-a numit MOG1O1. Această tulpină și construcția sa este analoagă tulpinii GV2260 (Deblaere etal., 1985, Nuci. Acid Res. 13, 4777-4788).

□ tulpină alternativă ajutătoare pentru MOG1O1 este, de exemplu LB44O4; această tulpină poate fi, de asemenea, folosită corespunzător pentru introducerea unui plasmid binar ca pM0G799 și transformarea în continuare a plantei. Sunt accesibile cu ușurință și alte tulpini helper corespunzătoare.

Construcția vectorului de expresie pM0G18D. Vectorul de expresie pM0G180 este un derivat al lui pM0G18 (EP 0479 359 Al, Exemplul 2b) din care s-a îndepărtat gena care codifică GUS și au putut fi inserate alte gene între liderul A1MV ARN4 șiterminatorul 3' nos ca un fragment BamHI.

Pentru acest scop, s-a sintetizat folosind tehnologia PCR fragmentul EcoRI/Ncd din pM0G18, care conține secvențele promotorului 35S și liderul A1MV RNA 4 cu seturile de primeri

5' GTTTCTACAGGACGG AGGATCFCTGGAAGTATTTGAAAGA 3' și

5' CAGCTATGACCATGATTACG 3' mutând astfel situl Ncd într-un sit BamHI. Vectorul pM0G18 este apoi tăiat cu EcoR și BamH după care fragmentul nou sintetizat EcoRI/BamH se poate liga între aceste situri de restricție. Pentru abaterea mutațiilor întâmplătoare induse PCR în secvențele promotor, fragmentul EcoRI/EcoRV din fragmentul EcoRI/BamH sintetizat PCR se înlocuiește prin secvențe de tip sălbatic din pM0G18. S-au verificat mutațiile fragmentului scurt EcoRV/BamFA prin secvențiere. Vectorul de expresie care a rezultat este plasmidul pMOG18O(\\q 7).

împerecheri triparenterale: Vectorii binari s-au mobilizat în împerecheri triparenterale cu E.coli tulpina HB101 care conține plasmidul pRK2013 (Ditta G. Stanfield, S., Corbin, D., și Helinscki, D. R. Etal., (198D) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,

415

420

425

430

435

440

445

450

455

RO 115650 Bl

7347] în Agrobacterium tumefacieris tulpina MOG1O1 și s-au folosit pentru transformare.

Transformarea tutunului [Nicotiana tabacum SR1]:Tutunul s-a transformat prin cultivarea împreună a țesutului de plantă cu Agrobacterium tumefaciens tulpina M0G101 (Hoekema et. al., 1983, Nature 303, 179-180) care conține vectorul binar de interes așa cum s-a descris. Transformarea s-a realizat folosind cultivarea concomitentă a discurilor din frunze de tutun [Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1), așa cum s-a descris de către Horsch et al., 1985, science 227, 1229-1231). Plantele transgenice s-au regenerat de la vlăstari care au crescut pe mediul de selecție conținând kanamicină sau higromicină, în funcție de gena de rezistență prezintă în plasmidul binar, s-au înrădăcinat și s-au transferat în sol.

Transformarea cartofului: Cartoful [Solanum tuberosum cv. Desiree] s-a transformat cu Agrobacterii tumefaciens, tulpina M0G101 care conține vectorul binar de interes așa cum s-a descris (Hoekema A., Huisman, M.J., Molendijk, L., Van den Elzen, P. J. M., și Cornelissen, B. J. C. (1989) Bio/technology 7, 273). Mediul de cultură de bază este mediul MB (Murashige, T., și Skoog, F.(1962) Physiol. Plan. 14,473), suplimentat cu 30 g/l sucroză, vitamine R3 (Ooms et al., G., Burrell, Μ. M., Karp, A., Bevan, M., și Hille, J (1987) Theor. Appl. Genet. 73,744), 5 μΜ zeatin ribozină (ZR) și 0,3 μΜ acid îndoi acetic (IAA). Mediile s-au solidificat când a fost necesar cu 0,7 g/l agar Daichin. Tuberculii de Solanum tuberosum cv. Desiree s-au cojit și s-a sterilizat la suprafață timp de 20 min în soluție 0,6% de hipoclorit care conțin 0,1% Tween-20. Cartofii s-au spălat complet în volume mari de apă sterilă timp de cel puțin 2 h. S-au tăiat discuri în grosime de aproximativ 2 mm din cilindrii de țesut de tuberculi preparate cu un perforator. Discurile s-au incubat 20 min într-o suspensie constând din mediu MS30R3 fără ZR și IAA, conținând 1O^B -1O⁷ bacterii/ml de Agrobacterium MOG1O1 care conține vectorul binar. Discurile sunt în continuare uscate prin tamponare pe hârtie de filtru sterilă și transferate la mediu MS30R3 cu ZR și IAA. Discurile se transferă la mediu proaspăt cu 100 mg/l cefotaxim și 50 mg/l vancomicină după două zile. 0 săptămână mai târziu discurile se transferă din nou în același mediu, dar de această dată cu 100 mg/l kanamicină pentru a selecta vlăstarii transgenici. După 4-8 săptămâni, vlăstarii care au răsărit din discuri se excizează și se plasează pe mediu de înrădăcinare (mediu MS30R3 fără ZRșilAA, dar cu 100 mg/l cefotaximă și100 mg/l kanamicină). Vlăstarii se propagă axenic prin decupări de meristem și se transferă la sol după dezvoltarea rădăcinii. Când este necesar, se folosesc pentru selecție 10 mg/l în loc de 100 mg/l kanamicină.

Transformarea cartofului cv.Kardal se realizează în principal ca pentru cv. Desiree, cu excepția următoarelor modificări: fitohormoni în mediu de cultură de bază: zeatin ribozidă 3,5 mg/l; IAA (acid indol acetic) 0,03 mg/l. Suspensia de Agrobacterium folosită în transformare conține 10⁵ până la 1O⁶ bacterii/mililitru. Concentrația kanamicinei în mediul de înrădăcinare este 50 mg/l.

Analizele trehalozei:Trehaloza se determină în esență așa cum s-a descris de către Hottiger et al., (1987) J. Bact.” 169, 5518). Țesutul din tuberculul de cartof se îngheață în azot lichid, se majorează și în continuare se extrage 60 min la temperatura camerei în aproximativ trei volume de acid tricloracetic 500 mM, după centrifugare, peletul se extrage încă o dată în același mod. Supernatantele combinate din cele două

RO 115650 Bl

505 extracții se analizează pentru material antronă pozitiv (Spiro R.G. (1966) Meth. Enzymol.” 8, 3). Trehaloza se determină calitativ prin TLC. Extractele se deionizează (Merck, Ion exchanger V) și se încarcă pe 60 de plăci SilicaGel (Merck). După cromatografie, plăcile se developează cu n-butanol-piridină-apă (15:3:2, v/v). Spoturile se vizualizează prin pulverizare cu vanilină 5 mg/ml în H₂S0₄ concentrat și încălzire la 13O°C. Ca martor, se folosește o trehaloză accesibilă comercial (Sigma).

Altenativ, trehaloza se determină cantitativ prin cromatografie de schimb anionic cu detectare amperometrică pulsată. Extractele se prepară adăugând 1 ml apă fiartă la 1 g material înghețat care în continuare se încălzește timp de 15 min. la 1OO°C. Probele (25 pl) se analizează pe un cromatograf în lichid Dionex DX-3OO echipat cu o coloană Dionex 35391 carbopac PA-1 și o precoloană Dionex 43096 cerbopac PA-1 4 x 50 ml. Eluția este cu NaOH 100 mM la 1 ml/min. Zaharurile se detectează cu un detector ampermetric (Dionex, PAD-2). Ca martor se folosește o trehaloză accesibilă comercial (Sigma).

Analizele enzimei: în toate determinările se folosește drept martor material netransgenic de tuberculi sau material netransgenic de tutun. Conținutul de proteină în toate probele se determină cum s-a descris de către Bradford (Bradford (1976) “Anal.Biochem.” 72, 248). Pentru analizele pe extracte de tuberculi, se omogenizează bucăți de tubercul de cartof înghețate de aproximativ 100 mg în 100 pl HEPES 20 mM, pH 7,4 și se centrifughează (Eppendorf, 5 min. la viteză maximă). Supernatantul se folosește pentru analizele activității.

Activitatea SPS se determină, în principal, așa cum s-a descris de către Amir, J. și Preiss, J. (1982), “Plant Physiol.”69, 1027-1030). Prin schimbarea compoziției amestecului de reacție se pot determina două forme diferite de activitate a SPS: V_maxșiV_sel. Amestecul de reacție V_max conține 3,2 mM UDP-glucoză, 81 μΜ (¹⁴C)-UDP-glucoză, 3,2 mM fructoză-6-fosfat, 16 mM glucoză-6-fosfat, 100 mM HEPES pH 7,4, 20 mM MgCI₂ și 5 mM EDTA într-un volum total de 50 pl. în amestecul de reacție V_selconcentrația fructozo-6-fosfatului și glucozo-6-foafatului se înjumătățește și se adaugă 5 mM fosfat anorganic. Pentru control, se măsoară activitatea SPS în amestecul de reacție V_max fără glucozo-6-fosfat șifructozo-6-fosfat. Reacția se realizează la temperatura camerei timp de 30 de min. și se oprește prin încălzirea amestecului 5 min. la 95°C. Produsele reacției se tratează cu fosfatază alcalină și sucroză-(¹⁴C) care rezultă se separă de substraturi prin cromatografie de schimb ionic. Cantitatea de sucroză radiomarcată formată în reacție se măsoară într-un numărător de scintilație.

Activitatea TPS se măsoară într-un mod similar precum cel descris pentru SPS. După cromatografia de schimb ionic probele conțin sucroză defosforilată și trehaloză. Pentru a determina ce proporție reprezintă trehaloza din produsele formate, probele se separă prin TLC așa cum s-a descris. Extractele se deionizează (Merck, Ion exchanger V] și se încarcă pe 60 de plăci Silica Gel (Merck). După cromatografie, spoturile care conțin sucroză-(¹⁴C) și trehaloză-(¹⁴C) se raclează și se măsoară într-un numărător de scintilație.

Activitatea AGPază se determină așa cum s-a descris de către Muller-Rober et al., (Muller-Rober) B., Sonnewald, U., și Willmitzer, L. (1992) EMBO J. 11, 1229).

Producția glucoză-fosfat din ADP-glucoză s-a determinat într-un sistem NAD-legat glucoză6-fosfat dehidrogenază. Analiza de reacție a conținut 80 mM HEPES pH 7,4, 10mM

MgCI₂, 1mM ADP-glucoză, o,6 mM Nad, 10 μΜ glucoză-1,6-difosfat, 3mM DTT, 0,02%

510

515

520

525

530

535

540

545

550

RO 115650 Bl albumină serică bovină, 1U fosfoglucomutază din mușchi de iepure (Sigma), 2,5 U NADlegat glucoză-6-fosfat dehidrogenaza din Leuconoctoc mesemteroides și extract de tubercul. Reacția s-a inițiat prin adăugarea de pirofosfat de sodiu până la concentrația finală de 2mM. Reducerea NAD s-a măsurat spectrofotometrie la 340 nm și 3O°C. 0 unitate de activitate AGP-ază se definește ca nmol glucoză-1-fosfat generat pe minut la 3O°C.

Exemplul 1. Clonarea unei gene otsA E. coli de lungime întrega în E.coli, trehaloză fosfat sintaza (TPS) este codificată de către gena otsA localizată la operonul orsBA. Localizarea și direcția transcripției acestui operon de cromozomul E.coli sunt cunoscute (Kaasen, I., Falkenberg, P., Styrvold, O.B., și Strom a. R. (1993) J. Bact. 174, 889). Gena otsA este localizată la 42' și după Kaasen et al., limitată pe un fragment de 18,8 kb prezent în clona genomică EMBL4 desemnată 7F11 a hărții de către Kahora eet al., (Kahora, Y., Akiyama, K., și Isono, K (1987) Cell 50, 495). Se prepară DNA dintr-un lizant al clonei 7F11 lambda și se digeră cu Hindlll. Fragmentul izolat Hindll de 2,9 kb (situl Hindlll“partea-dreaptă” la 14,3 kb din insert este omis pe harta de către Kahona et al., așa cum deja s-a remarcat de către Kaasen et al., ) se donează în pUC18 linearizat cu HINFI. Se secvențializează insertul de 2,9 kb Hindll\d\n plasmidul rezultat, desemnat pMOG674. S-a dovedit că secvența conține în parte gena araH operonului de transport arabinoză (Scripture, J. B., Voelker, c., Miller,

S., O'Donnell, R. T., Polgar, L., Rade, J., Harazdovsky, B. F., și Hogg, R. W. (1987) J. Mol. Biol. 197, 37), gena otsB care codifică TPP așa cum a fost localizată de către Kaasen et al., și în parte gena otsA care codifică TPS. Gena otsA nu s-a găsit a filimitată la fragmentul Hindlllde 2,9 kb așa cum s-a descris de Kaasen et al. Pentru completarea secvenței se izolează un fragment de suprapunere BamHI/EcoRl și se secvențializează perțial. Secvența completă care codifică TPS a genei otsA este prezentată în SECV. NR.

2. Poziția genei otsA pe clona 7F11, cu siturile enzimelor de restricție folosite este arătată în Fig 8. Un alt sit suplimentar Hindll labsent pe harta publicată de către Kahora et al. s-a găsit pe situl “partea-stângă” a fragmentului Hindll de 2,9 KB. Situl Hindlll din pMOG18O se înlocuiește printr-un sit Sstl, prin clonarea duplexului oligonucleotidic:

Sstl

5' AGCTCACGAGCTCTCAGG 3' (SECV ID. NR: 8)

3' GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5' (SECV ID. NR: 9] în pM0G180 tăiat cu HindlH. Vectorul rezultat se desemnează pMOG74B. Duplexul oligonuleotidic:

BamHI Sphl Hindlll Smal BamHI

5' GATCCCCCGGGGCATCGAAGCTTG 3' (SECV ID NR: 10)

3' GGGGCCCCGTAGCTTCGAACCTAG 5' (SECV ID NR: 11) se donează în vectorul pM0G74B se linearizează cu BamHI. Vectorul cu duplexul oligonucleotidic în orientarea dorită (verificată prin digestie enzimatică de restricție) desemnează pM0G747. Fragmentul de 2,9 kb al plasmidului pM0G674 se donează în pMOG747 linerizat cu Hindlll, și a rezultat vectorul pM0G748. Fragmentele EcoRV/Ssti

RO 115650 Bl de aproximativ 2,4 kb și Sstl/Smal de aproximativ 3,5 kb ale lui pMOG748 se izolează, se leagă și se transformă în E.coli, deletând astfel capătul 3' al fragmentului Hindlll de 2,9 kb. Plasmidul care rezultă desemnează pM0G749. Capătul 5'al genei otsA se sintetizează prin PCR folosind oligonucleotidele sintetice TPS1 și TPS2 cu pM0G749 ca 6oo matriță.

TPS1 5' GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3' (SECV ID NR: 12)

TPS2 3' GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 5' (SECV ID NR: 13)

605

Prin secvențializare se confirmă că fragmentul PCR de 0,4 kb are secvența corectă. Fragmentul BamHI/Hindll de 1 kbal lui pM0G749 se donează împreună cu fragmentul PCR Xmal/BamHl de 0,4 kb în pM0G747 linearizat cu Xma\ și Hindll. în plasmidul rezultat, digerat cu Hindlll și Sstl, se donează duplexul oligonucleotidic sintetic TPSB/7 care codifică cei trei aminoaciziC-terminali ai TPS. 6io

LysLeuAlaStop

TPS6/7: 5’ AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT 3' CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC 5'

615 în plasmidul care rezultă, digerat cu Hindll și Sstl, se donează fragmentul Hindlll/Ssti de 0,25 kb al plasmidului pM0G749, cuprinzând terminatorul de la gena nopalin sintază (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, rezultând plasmidul pM0G798. Acest plasmid conține gena otsA de E.coh în orientare corectă sub controlul promotorului 35S al virusului mozaicului conopidei (CaMV) cu intensificator dublu (Guilley et al. (1982) 620 “Cell” 3Q, 763), secvența lider RNA 4 a virusului mozaicului lucernei (AMV) (Brederode et al. (1980) “Nuci. Acids Res.” 8, 2213) și secvența de terminare a transcripției nopalin sintazei de la Agrobacterium tumefaciens. întreaga casetă de expresie se donează ca un fragment EcoRI/Ssti de 2,5 kb în vectorul binar pl\/IOG23 linearizat cu EcoPh și Sstl. Vectorul binar rezultat, pM0G799 (fig. 9), se folosește pentru 625 transformarea cartofului și tutunului (o tulpină E.coli care adăpostește pM0G799 s-a depozitat la Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Phabagen Collections, Padualaan 8, Utrecht, The Netherlands, pe 23 August 1993 sub depozitul numărul CBS 430.93: pM0G23 s-a depozitat la CBS pe 29 iunie 1990, depozitul numărul CBS 102.90).

Exemplul 2. Producerea trehalozeiî n tutun care s-a transformat cu pM0G799 630

Discuri din frunze de tutun se transformă cu vectorul binar pM0G799 folosind Agrobacterium tumefaciens. Se analizează 20 de lăstari transgenici independent pentru activitate trehaloză fosfat sintază (TPS). Unele plante de tutun crescute in vitro se dovedesc a avea rădăcini extrem de abundente comparativ cu plantele netransformate. Analiza rădăcinilor acestor plante transenice de tutun arată niveluri ridicate de trehaloză 635 în comparație cu plante netransgenice martor.

Exemplul 3. Producerea trehalozei în cartofi transformați cu pM0G799

Discuri din tuberculi de cartofi de transformă cu vectorul binar pM0G799 folosind

Agrobacterium tumefaciens. Se selectează vlăstari transgenici pe kanamicină. Se analizează independent un număr de 20 de vlăstari transgenici pentru activitate trehaloză 64 o fosfat sintază (TPS). Vlăstarii găsiți a conține enzima se cresc până la plante mature.

RO 115650 Bl

Analiza tuberculilor maturi ai acestor plante transgenice de cartof arată niveluri ridicate ale trehalozei în comparație cu plantele netransgenice martor. Linia de plante transgenice M0G799.1 se înmulțește pentru lucrările ulterioare.

Exemplul 4. Construcția lui pM0G664

Se sintetizează două oligonucleotide corespunzând la secvența cDNA a subunității mici a ADP-glucoză pirofosforilazei (AGPază B) din tuberculi de cartofi cv.Desiree (MullerRober, B., Kossmann, J., Hannah, L.C., Willmitzer, L. și Sonnewald, U. (199G), “Mol. Gen. Genet.” 224, 136-146):

5' TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3' (SECV ID NR: 4)

5’ GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3' (SECV ID NR: 5)

Oligonucleotidele trebuie să conțină situri de restricție adecvate (BamHI și Ncol, subliniate) la capetele lor pentru a permite asamblarea într-o casetă de expresie într-o orientare antisens după digestie cu aceste enzime. Se amplifică PCR un fragment de circa 1 kb cu aceste oligonucleotide folosind DNA-ul izolat de la o bibliotecă cDNA de la cartof cv.Desiree (Mîiller-Rober, B., Kossmann, J., Hannah, L.C., Willmitzer, L. șiSonnewald, U. (1990), “Mol. Gen. Genet.” 224, 136-146). După digestie cu BamHI și Ncol, fragmentul se donează în pM0G18 linearizat cu BamHI și Ncol. Din plasmidul care rezultă fragmentul EcoRI/BamHIde 1,85 kb (care conține promotorul 35S CaMV, liderul RNA4 AMV și fragmentul AGPază într-o orientare antisens), precum și fragmentul BamHI/Hindll care conține terminatorul de la gena nopalin sintază (NOS) de la Agrobacterium tumefaciens se se donează într-o ligare în treimoduriîn vectorul binar pM0G22 linearizat cu EcoRI și Hindll. Vectorul binar pM0G22 conține o genă exprimabilă de plantă (HPT II pentru selecție higromicină în plante transgenice (pM0G22 s-a depozitat la Centraal Bureau voor Schimmelcultures pe 29 ianuarie 1990, cu număr de acces 101.90). Vectorul binar rezutat, pM0G664 (fig. 4) se folosește pentru transformarea cartofului.

Exemplul 5. Construcția lui pMOG8O1

Se sintetizează un set de oligonucleotide complementare la secvența cDNA sucroză fosfat sintază de porumb (Worrell, A.C., Bruneau, J.-M., Summerfalt, K., Boerrsing, N. și Voelker, T.A. (1991), “Plant Cell” 3, 1121). Secvențele lor sunt precum urmează:

5’ CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG 3’ (SECV ID NR:6]

5’ GACGATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3' (SECV ID NR:7)

Aceste oligonucleotide se folosesc pentru amplificarea PCR a fragmentului and de 370 bp folosind ca matriță DNA-ul izolat dintr-o bibliotecă de cDNA de cartof cv. Desiree preparată din țesut de frunză în vârstă de 2 luni (Clontech). Prin secvențializarea acestui fragment s-a dovedit că el este omolog la secvența SPS a porumbului (vezi Fig. 3 și Worrell et al., (1991). Fragmentul PCR se folosește pentru căutarea în biblioteca lambda gt a bibliotecii cDNA de cartof cv. Desiree preparată din țesut de frunză în vârstă de 2 luni (clotech). Se secvențializează insertul unei clone de hibridizare pozitive. Secvența fragmentului DNA de 654 bp este identică în proporție de 65 % cu partea corespunzătoare a secvenței SPS de porumb (începând de la nucleotida numărul 349 din

RO 115650 Bl fig. 11 în Worrell et al. (1991). Insertul EcoHI a\ acesteiclone se donează în pM0G180 digerat cu BAMHI, într-o ligare în trei moduri cu următorul duplex de oligonucleotide sintetic:

5’ GATCGTCAGATCTAGC 3’ (SECV ID NR: 14]

3’ CAGTCTAGATCGTTAA 5’ (SECV ID NR: 1 5)

Plasmidul care are fragmentul SPS în orientare antisens, față de promotorul 35SCamv, este pMOG787. Fragmentul EcoRI/Hindll al plasmidului pM0G787 se donează printr-o ligare în trei moduri cu un linker sintetic:

5’ AGCTTCCCCCCCG 3’ (SECV ID NR: 1 B]

3’ AGGGGGGGCTTAA 5’ (SECV ID NR: 1 7) în vectorul binar pM0G22 linearizat cu EcoRI. Vectorul binar pMOG22 conține o genă exprimabilă de plantă HPTII pentru selecție de higromocină în plante transgenice (pM0G22 s-a depozitat la Centraal Bureau Voor Schimmelculutures pe 29 ianuaria 1990 cu numărul de acces 101.90). Vectorul binar rezultat pM0G8O1 (Fig. 10) s-a folosit pentru transformarea cartofului.

Exemplul 6. Construcția lui pM0G801

Fragmentul EcoRI al plasmidului pM0G801, care conține caseta de expresie SPS antisens, se donează în vectorul binar pM0G664 (care conține AGP-ază antisens), linearizat cu EcoRI. Vectorul binar realizat se numește pMOG8O2 (Fig. 11).

Exemplul 7. Producerea trehalozei În cartoful transformat cu pM0G799 și pM0G664

Discuri de tuberculi de cartof ale liniei de plante M0G799.1 rezistente la kanamicină, care exprimă TPS (Exemplul IX) s-au transformat cu vectorul binar pM0G664, care conține caseta de expresie AGP-ază antisens. Vlăstarii transgenici, selectați pe 10 mg/l higramicină, se analizează prin tehnică PCR pentru prezența TPS și secvențelor AGP-ază antisens.

Prin analiza tuberculilor trangenici pentru activitate AGP-ază, s-a dovedit că, se întâlnesc reduceri în nivelurile activității în linii transgenice individuale în comparație cu plante de control netransgenice. Prin analize Northern blot s-a dovedit că nivelurile mRNA pentru AGP-ază sunt reduse la plante transgenice comparativ cu cele de plante netransgenice de control. Nivelurile trehalozei în tuberculii plantelor de cartof transgenic, găsite, prezentă activitate TPS și care au aceleași niveluri cu cele găsite în tuberculii liniei de plante transgenice M0G799.1.

Exemplul 8. Producerea trehalozei în cartoful transformat cu pM0G799 și pMOG8O1

Discurile de tuberculi de cartof ale liniei de plante M0G799.1, rezistente la kanamicină, care exprimă TPS (exemplul IX) s-au transformat cu vectorul binar pM0G8O1, care conține caseta de expresie SPS antisens. Vlăstarii transgenici, selectați pe 10 mg/l higromicină, s-au analizat prin PCR pentru prezența secvențelor TPS și SPS antisens. Plantele transgenice care le conțin pe ambele s-au analizat pentru activitatea TPS și SPS. Prin analiza tuberculilor transgenici pentru activitatea SPS s-a dovedit că se întâlnesc reduceri în nivelurile activității în linii transgenice individuale în comparație cu

690

695

700

705

710

715

720

725

730

RO 115650 Bl plante martor netransgenice. Prin analize Northern blot s-a dovedit că nivelurile mRNA pentru SPS sunt reduse în plante transgenice comparate la cele din plante martor netransgenice. Nivelurile trehalozei în tuberculii plantelor transgenice de cartof, găsite a prezenta activitatea TPS, și care au niveluri reduse SPS, arată o creștere în comparație cu nivelurile găsite în tuberculii liniei de plante transgenice pM0G799.1.

Exemplul 9. Producerea trehalozei în cartof transformat cu pM0G799 și pM0G802

Discurile de tuberculi de cartof ale liniei de plante M0G799.1, rezistente la kanamicină, care exprimă TPS (exemplul 9) s-au transformat cu vectorul binar pl\/IOG8D2, care conține caseta de expresie SPS antisens și AGP-ază. Vlăstarii transgenici, selectați pe 10 mg/l higromicină, s-au analizat prin PCR pentru prezența secvențelor TPS, AGP-ază antisens și SPS antisens. Plantele transgenice care conțin toate cele trei constructe s-au analizat pentru activitatea TPS, AGP-ază și SPS. Prin analiza tuberculilor transgenici pentru activitatea AGP-ază și SPS s-a dovedit că se întâlnesc reduceri în nivelurile activității în linii transgenice individuale în comparație cu plante martor netransgenice. Prin analize Northern blot s-a dovedit că nivelurile mRNA pentru AGP-ază și SPS sunt reduse în plante transgenice în comparație cu cele din plantele martor de control netransgenice. Nivelurile trehalozei în tuberculii plantelor transgenice de cartof găsite prezentă activitatea TPS, și au niveluri reduse SPS, arată o creștere în comparație cu nivelurile găsite în tuberculii liniei de plante transgenice pM0G799.1.

Claims

Revendicări

1. Acid nucleic, care determină producerea de trehaloză în plantele superioare, caracterizat prin aceea că acesta conține:

a] o regiune de inițiere transcripțională, pentru regiunea ce codifică enzima trehaloză fosfat sintetaza;

b] o secvență care codifică o trehaloză fosfat sintetaza, reprezentată prin secvența de aminoacizi nr. 2, de preferință, o secvență DNA, care codifică o activitate trehaloză fosfat sintetaza, care cuprinde cadrul de citire a genei otsA din E. coh, definită în secvența nr. 2 sau un acid, așa cum este prezentat în pM0G799, depozitat la Central Bureau voon Schimmelcultures, număr de acces 430.93;

c] o regiune de terminare transcripțională, pentru regiunea ce codifică enzima trehaloză fosfat sintetaza.

2. Acid nucleic, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că regiunea de inițiere transcripțională cuprinde o regiune promotor de DNA, care codifică RNA-ul virusului 35S al mozaicului conopidei și regiunea de terminare transcripțională a geneinopalin sintaza din Agrobacterium tumefaciens.

3. Secvență de acid nucleic, care determină producerea de trehaloză în plantele superioare, caracterizată prin aceea că aceasta conține:

(A) acidul nucleic, ce determină producerea de trehaloză în plantele superioare, așa cum este definit în revendicarea 1;

(B) o genă care inhibă enzima sucroză fosfat sintetaza (SPS), care cuprinde;

a) o regiune de inițiere transcripțională, operabil legată la aceasta;

RO 115650 Bl

780

b) o secvență DNA, care codifică o secvență de RNA cel puțin parțial complementară la o secvență de RNA, care codifică o enzimă sucroză fosfat sintetaza (SPS), produsă în mod natural în plantă; și

c) o secvență de terminare transcripțională și/sau (C) o genă care inhibă ADP-glucoza pirofosforilaza, care cuprinde:

a) o regiune de inițiere transcripțională, operabil legată la aceasta;

b) o secvență DNA, care codifică o secvență RNA cel puțin parțial complementară la o secvență RNA, care codifică o enzimă ADP-glucoza pirofosforilaza, produsă în mod natural în plantă;

c) o secvență transcripțională terminală.

4. Secvență de acid nucleic, conform revendicărilor 1...3, caracterizată prin aceea că este introdusă în genomul unei plante, pentru a obține un genom de plantă DNA recombinant.

5. Secvență de acid nucleic, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că genomul de plantă DNA recombinant conține:

(a) un acid nucleic, care codifică trehaloza fosfat sintetaza E.coh și (b) o genă exprimabilă de plantă, capabilă să inhibe biosinteza unei sucroză fosfat sintetaze, sau/și ADP-glucoză pirofosforilază;

6. Secvență de acid nucleic, conform revendicărilor 4 și 5, caracterizat prin aceea că genomul recombinant al plantei este prezent într-o celulă de plantă, care aparține unei anumite părți a plantei selectată din grupul: bulbi, flori, fructe, rădăcini piloase, frunze, microtuberculi, polen, rădăcini, semințe, tulpini și tuberculi.

7. Secvență de acid nucleic, conform revendicărilor 4 și 5, caracterizat prin aceea că se poate transforma, cu această secvență, o plantă care aparține Angiospermelor, de preferință, din familia Solanaceelor, și optim, Solanum tuberosum, dar nu este Arabidopsis thaliana.

8. Vector de donare, caracterizat prin aceea că este un vector binar pM0G799 care este depozitat la Central Bureau voor Schimmelcultures, sub numărul de depozit CBS 430.93, și vectorul binar menționat conține E.CoU trehaloza fosfat sintetaza, așa cum este definită în revendicarea 1.

9. Procedeu de obținere a unei plante cu capacitate sporită de producere a trehalozei, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape:

1 ] introducerea într-o celulă receptoare a unei plante, a unui acid nucleic, definit în revendicările 1 ...3, care atunci când este exprimatîntr-o plantă sau într-o celulă a unei plante crește conținutul de trehaloză a plantei sau a celulei menționate, și o genă exprimabilă a unei plante cuprinsă în secvența:

(a) o regiune transcripțională de inițiere care este funcțională în planta menționată, (b) o secvență DNA care codifică o genă marker selectabilă care este funcțională la planta gazdă selectată, și opțional, (c) o secvență transcripțională terminală care este funcțională în planta gazdă menționată (2) generarea unei plante dintr-o celulă transformată în condiții care permit selectarea pentru prezența genei marker selectabilă.

785

790

795

800

805

810

815

820

RO 115650 Bl

10. Procedeu conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că el cuprinde următoarele etape:

(1) creșterea unei plante având genomul recombinant cu oricare din secvențele definite în revendicările 4... 6;
(2) recoltarea plantei sau a părții din plantă care conține trehaloza, și (3) uscarea în aer a plantei sau a părții din planta sau alternativ, (4) uscarea prin congelare a plantei sau a părții din plantă, în care procedeul menționet permite păstrarea unei plante sau a unei părți din plante care conține trehaloză.

11. Procedeu conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că el cuprinde următoarele etape:

(1) creșterea plantei având genomul cu oricare din secvențele definite în revendicările 4... 6 în condiții care permit producerea trehalozei, (2) recoltarea plantei menționate sau a unei părți din aceasta, (3) izolarea trehalozei din planta menționată sau din partea menționată din aceasta, în care procedeul menționat permite producerea de trehaloză.

12. Procedeu conform revendicării 9, caracterizat prin aceea că el cuprinde următoarele etape:

(1) introducerea în celula receptoare a unei plante a unui acid nucleic definit în revendicarea 1, (2) regenerarea unei plante din celula receptoare menționată în care planta menționată prezintă o rezistență crescută la lipsa de apă în care procedeul menționat permite producerea unei plante cu rezistență crescută la rezistența de apă.