PL185155B1 - Sposób zwiększania aktywności enzymatycznej pirofosforylazy adenozynodifosfoglukozowej w roślinie oraz komórka roślinna - Google Patents

Abstract

1. Sposób zwiekszania aktywnosci enzymatycznej pirofosforylazy adenozynodifos- foglukozowej (ADPG PPaza) w roslinie, która zawiera funkcjonalna ADPG PPaze, znamienny tym, ze do rosliny wprowadza sie przez transformacje gen kodujacy tylko jedna podjednostke bialkowa heterotetramerycznej ADPG PPazy (EC 2.7.7.27), która katalizuje etap wytwa- rzania ADPG w szlaku syntezy skrobi, powodujac ekspresje tego genu podjednostki w roslinie i wytworzenie podjednostki bialkowej oraz zwiekszenie aktywnosci enzymu w komórkach roslinnych. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania aktywności enzymatycznej pirofosforylazy adenozynodifosfoglukozowej w roślinie oraz komórka roślinna.

Wynalazek dotyczy modyfikowania zawartości skrobi w roślinach, a w szczególności zwiększania zawartości skrobi w roślinach.

Skrobia jest złożonym polimerem reszt glukozylowych. W tkankach większości gatunków' roślin wyższych, węglowodany są na ogół przechowywane w tej właśnie postaci. Skrobia, jako produkt fotosyntezy, jest akumulowana w liściach roślin w ciągu dnia, by w ciągu nocy służyć do zaspokajania potrzeb rośliny w zakresie produkcji energii i biosyntezy. Akumulacja skrobi zachodzi także w tkankach nie biorących udziału w procesie fotosyntezy, zwłaszcza w tych, które związane sąz reprodukcją, np. w nasionach, owocach i bulwach. Stąd właśnie bierze się tak duże znaczenie skrobi dla produktywności roślin, oraz dla ich zdolności do przetrwania.

Skrobia ma również wielkie znaczenie dla człowieka. Po pierwsze, jest jednym z głównych składników pożywienia zwierzęcego, stanowiąc olbrzymie źródło węglowodanów dla człowieka i jego zwierząt domowych. Po drugie, typ skrobi obecnej w roślinach wpływa na jakość przetworzonych produktów roślinnych. Po trzecie, skrobia znajduje zastosowanie w przemyśle: w produkcji papieru, materiałów tekstylnych, tworzyw sztucznych i klejów, a także jako surowiec dla niektórych typów bioreaktorów. Skrobia, pochodząca z różnych gatunków ma na ogół zróżnicowane zastosowanie. W skali światowej, zdecydowanie największe rolnicze i ekonomiczne znaczenie mają rośliny uprawne wytwarzające skrobię, a wśród nich pszenica, kukurydza, ryż i ziemniaki. Ilość skrobi obecna w zbieranej części danej rośliny decyduje w znacznym stopniu o wysokości plonów i wydajności uprawy. Ponadto, także typ skrobi wpływa na jakość przetwarzanego produktu i dochodowość całego procesu.

Skrobia produkowana jest w amyloplastach roślinnych z glukozo-1-fosforanu (Glc-1-P), jak przedstawiono poniżej.

Glukozo-1 pirooosfoiylaa ADPG

Adenozynodifosfoglukoza (ADPG)

Φ Synteza skrobiowa i enzym rozgałęziający

Skrobia (Amyloza i Amylopektyna)

Pirofosforylaza adenfzynodiffsffglukfzowa [EC.2.7.7.27) (pirofosforylaza ADPG) katalizuje pierwszą reakcję szlaku biosyntezy skrobi w roślinach. Podobny enzym, katalizujący tę samąrekcję, obecny jest w bakteriach i sinicach.

Struktura czwartorzędowa enzymujest podobna we wszystkich zbadanych pod tym względem organizmach, i charakteryzuje się tym, że aktywna cząstka enzymu składa się z podjednostek białkowych, tworzących strukturę tetrameru. W przypadku bakterii, wszystkie podjednostki białkowe są identyczne i stanowią produkt pojedynczego genu, np. u E. coli genu GlgC. Z kolei u roślin, enzym składa się z dwóch różnych podjednostek białkowych, z których, każda występuje w dwóch kopiach. Choć te dwie różne podjednostki białkowe wykazują podobieństwo sekwencji, są jednak produktami dwóch oddzielnych genów.

Istnieje wiele mutantów roślinnych, które, w porównaniu z roślinami typu dzikiego, zawierają mniej skrobi w poszczególnych tkankach. Owe mutanty roślinne mają obniżoną ekspresję jednego z dwóch genów kodujących podjednostki pirofosfo^lazy ADPG. Dwie szczególne mutacje obserwowane w bielmie kukurydzy związane sąz występowaniem mutantów shrunken-2 i brittle-2. Uważa się, że dzikie postacie tych genów kodujądwiepodjednostki enzymu. Obydwie mutacje powodują obniżenie aktywności enzymatycznej pirofosfo^lazy ADPG w bielmie. Na podstawie tej informacji uważa się, że do pełnej aktywności enzymu wymagana jest obecność obu pfdaednfstek, i że brak jednej z tych podjednostek nie może być zrekompensowany obecnością drugiej.

Wynalazek niniejszy oparty jest na fakcie, iż do zwiększenia aktywności enzymatycznej wystarcza jeden z genów dla jednej z podjednostek białkowych enzymu katalizującego wytwarzanie skrobi.

Celem mniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu zwiększania aktywności enzymu katalizującego syntezę skrobi.

Sposób ten pozwala na uzyskanie rośliny o zwiększonej zawartości skrobi, w porównaniu do rośliny kontrolnej, która nie była traktowana sposobem według wynalazku.

Innym celem wynalazkujest zwiększenie szybkości syntezy skrobi w warunkach, które nie prowadzą do równoważącego zwiększenia szybkości rozkładu skrobi.

Sposób według wynalazku dotyczy zwiększania aktywności enzymatycznej pirofosforylazy adenozynodifosffglukfzowej (ADPG PPaza) w roślinie, która zawiera funkcjonalną ADPG PPazę i polega na tym, że do rośliny wprowadza się przez transformację gen kodujący tylko jedną podjednostkę białkową heterotetramerycznej ADPG PPazy (EC 2.7.7.27), która katalizuje etap

185 155 wytwarzania ADPG w szlaku syntezy skrobi, powodując ekspresję tego genu podjednostki w roślinie i wytworzenie podjednostki białkowej oraz zwiększenie aktywności enzymu w komórkach roślinnych.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku że wprowadza się gen, który koduje podjednostkę brittle-2 enzymu ADPG PPazy lub jego homolog, który wykazuje podobieństwo do genu brittle-2 wystarczająco duże aby kodować białko o identycznym działaniu biologicznym w komórce roślinnej.

Korzystnie, omawianym genem jest gen brittle-2, lub jego homolog. Przez „homolog” należy rozumieć kwas nukleinowy, którego sekwencja nukleotydowa jest identyczna lub bardzo zbliżona do innej sekwencji nukleotydowej. Korzystnie, jest to gen pszenicy dla podjednostki białkowej brittle-2.

Korzystnie, roślina powinna być jedną z roślin o znaczeniu komercyjnym, takich jak na przykład roślinajednoliścienna, wybrana z grupy obejmującej pszenicę, jęczmień, żyto, kukurydzę lub ryż lub roślina dwuliścienna, wybrana z grupy obejmującej ziemniak, pomidor, maniok, orzech ziemny, fasolę lub groch.

Zwiększenie zawartości skrobi, zwłaszcza w ziemniakach, może być oceniane np. na podstawie zwiększenia ciężaru właściwego (c.w.), np. rośliny lub bulwy.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku do rośliny wprowadza się również funkcjonalne geny, które zmniejszają aktywność jednego lub więcej enzymów degradujących skrobię, korzystnie, które zmniejszają aktywność amylazy (EC 3.2.1.1 oraz EC 3.2.1.2) lub fosforylazy skrobiowej (EC 2.4.1.1).

W zakres wynalazku wchodzi też komórka roślinna zawierająca tylko jeden plazmid z wbudowanym genem brittle-2 lub jego homologiem, który koduje tylko jedną podjednostkę białkową heterotetramerycznej ADPG PPazy (E.C. 2.7.7.27), korzystnie komórka zawierająca plazmid z wbudowanym genem zdeponowany pod numerem NCIMB 40649.

Wynalazek obejmuje też komórkę roślinną zawierającą plazmid z wbudowanym genem zdeponowany pod numerem NCIMB 40650.

Aby niniejszy wynalazek mógł być łatwiej zrozumiany i zastosowany w praktyce, przedstawiono następujący przykład oraz załączono rysunki, w których:

Figura la przedstawia wektor (plazmid) transformacyjny, zawierający gen brittle-2.

Figura lb przedstawia wektor (plazmid) transformacyjny, zawierający gen shrunken-2.

Figura 2a przedstawia wynik analizy wykorzystującej technikę Southema, dla DNA wyekstrahowanego z roślin poddawanych i niepoddawanych transformacji.

Figura 2b przedstawia wynik analizy wykorzystującej technikę „Northern blotting”, dla produktów RT-PCR z roślin poddawanych i niepoddawanych transformacji.

Figura 3a jest wykresem przedstawiającym porównanie aktywności pirofosforylazy ADPG w liniach zawierających geny brittle-2 i shrunken-2 oraz w liniach kontrolnych.

Figura 3b jest wykresem przedstawiającym porównanie aktywności pirofosforylazy ADPG w liniach zawierających gen brittle-2 i liniach kontrolnych.

Figura 4 przedstawia, w postaci graficznej, ciężar właściwy bulw jako skumulowaną częstość występowania bulw, dla czterech różnych klas aktywności pirofosforylazy ADPG, w odniesieniu do lini transformowanych genami brittle-2 i shrunken-2.

Figura 5 przedstawia szybkość syntezy skrobi w czterech liniach roślin o różnej aktywności pirofosforylazy ADPG.

Wyprodukowano transgeniczne rośliny ziemniaka, zawierające gen pszenicy, homologiczny do genu brittle-2 kukurydzy. Gen ten znany jest więc jako gen brittle-2 pszenicy. Niespodziewanie stwierdziliśmy, że ekspresja genu brittle-2 w transgenicznych roślinach ziemniaka powodowała wzrost aktywności pirofosforylazy ADPG. Można zatem zwiększyć aktywność tego enzymu w komórce poprzez wywołanie ekspresji tylko jednej z dwóch podjednostek białkowych, wymaganych do powstania aktywnego enzymu. Skoro aktywność pirofosforylazy ADPG jest głównym czynnikiem limitującym ilość powstającej lub magazynowanej skrobi w roślinie, to w takim razie ekspresja białka brittle-2 jest wystarczającym mechanizmem zwiększania ilości

185 155 skrobi w bulwie oraz ciężaru właściwego bulwy i także zwiększania ilości skrobi w jakiejkolwiek roślinie, która magazynuje skrobię. Poprawiłoby to wydajność otrzymywania skrobi z rośliny i miałoby wielką wartość komercyjną.

Transgeniczne rośliny ziemniaka stransformowane genem dla podjednostki brittle-2 pirofosforylazy ADPG pszenicy analizowano pod względem obecności podjednostki białkowej w transgenicznych roślinach ziemniaka oraz poziomu aktywności enzymatycznej (pirofosforylazy ADPG) w roślinach. Oceniano także ilość skrobi w roślinach. Poniżej opisano standardowe sposoby użyte do tych analiz:

Produkcja transgenicznych roślin ziemniaka

Dla celu niniejszego wynalazku wybrano sekwencję kodującą, która, jeśli ulega ekspresji w transgenicznych roślinach, wywołuje wzrost aktywności pirofosforylazy ADPG. Sekwencja kodująca może pochodzić zjakiejkolwiek rośliny. W celach przykładowych wybrano pszeniczną sekwencję homologiczną do locus brittle-2 (Ainsworth, C; Tarvis, M; Clark, J. Pl. Mol. Biol. 23 23-33; 1993 Isolation and analysis of cDNA encoding the smali subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase from wheat). Może być ona wstawiona do wektora transformacyjnego, co przedstawiono na figurze la. Zgodnie z układem budapesztańskim w sprawie Międzynarodowego Uznawania Depozytów Mikroorganizmów dla celów Procedury Patentowej, plazmid pfW4091 został zdeponowany w Narodowej Kolekcji Bakterii Przemysłowych i Morskich (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) dnia 13 czerwca 1994 roku, pod numerem NCIMB 40649. Podobny plazmid pfW 4151, zawierający sekwencję kodującą shrunken-2 (figura Ib), został zdeponowany 13 czerwca 1994 roku pod numerem NCiMb 40650. Wektor może więc zawierać jeden lub więcej genów funkcjonalnych oraz umożliwiający selekcję gen markerowy, które wszystkie mogąbyć umieszczone w obrębie T-DNA. Funkcjonalne geny składają się z sekwencji promotorowej, niezbędnej do ekspresji genu w bulwach lub innych organach, tkankach bądź komórkach magazynujących skrobię, oraz z sekwencji kodującej i sekwencji terminacyjnej.

Wektor jest więc wyposażony w typowe transkrypcyjne sekwencje reglatorowe i/lub kodon terminacyjny, jeśli brakuje go na końcu 3' sekwencji kodującej genu. Fragment DNA może zatem zawierać także sekwencję terminacyjną i inne sekwencje umożliwiające ekspresję genu w komórkach roślinnych. Enhancer (sekwencja wzmacniająca ekspresję genu) lub inny element zdolny do podwyższania lub obniżania poziomu ekspresji w poszczególnych częściach roślin i w określonych warunkach, może być również włączony do fragmentu DNA i/lub wektora. Wektor jest również w sposób typowy wyposażony w gen oporności antybiotykowej, który czyni transformowane komórki roślinne opornymi, co z kolei pozwala selekcjonować transformowane komórki, tkanki i rośliny poprzez wzrost na pożywkach zawierających antybiotyk.

Transformowane komórki roślinne mogą być selekcjonowane poprzez wzrost na odpowiedniej pożywce. Można w ten sposób otrzymać tkankę roślinną, obejmującą komórki zawierające kodujący enzym gen, który znajduje się pod kontrolą promotora, np. w obrębie genomu komórki roślinnej. Gen ten zdolny jest więc do ekspresji w komórce roślinnej. Można wówczas doprowadzić do regeneracji roślin, zawierających w swoich komórkach gen wraz z promotorem, włączony na przykład do genomu komórki roślinnej, tak aby mógł ulegać ekspresji. Można następnie rozmnażać zregenerowane rośliny i na przykład otrzymywać nasiona.

Korzystnym sposobem transformowania komórki roślinnej jest transformacja z udziałem bakterii Agrobacterium tumefaciens, zawierających wektor obejmujący chimerę genową, według powyższego opisu. Można więc zastosować hybrydowy wektor plazmidowy, który zawiera:

(a) chimerę genową obejmującą elementy regulatorowe, umożliwiające ekspresję genu po jego wbudowaniu się do genomu komórki roślinnej;

(b) przynajmniej jedną sekwencję, która określa ten fragment DNA, który ma ulec wbudowaniu do genomu roślinnego; oraz (c) sekwencję DNA, która umożliwia przeniesienie tego fragmentu DNA do genomu roślinnego.

18S 155

Na ogół, fragment DNA, który ulec ma wbudowaniu do genomu roślinnego, określony jest sekwencjami ograniczającymi obszar T-DNA plazmidu Ti. Jeśli obecna jest tylko jedna sekwencja ograniczająca, korzystnie jest, aby była to sekwencja prawa. SekwencjąDNA, która umożliwia danemu fragmentowi DNA przeniesienie do genomu komórki roślinnej jest na ogół region wirulencyjny (vir) plazmidu Ti.

Tak więc gen kodujący polipeptyd oraz elementy kontrolujące transkrypcję i translację mogą być umieszczone pomiędzy sekwencjami granicznymi obszaru T-DNA w plazmidzie Ti. Plazmidem tym może być „rozbrojony” plazmid Ti, z którego usunięto geny odpowiedzialne za wywoływanie nowotworów. Gen i jego elementy kontrolujące transkrypcję, mogą być także umieszczone pomiędzy sekwencjami granicznymi T-DNA w wektorze binarnym, który towarzyszy plazmidowi Ti zawierającemu region vir. Taki wektor binarny zawiera więc:

(a) chimerę genowąpod kontrolą elementów regulatorowych, umożliwiających ekspresję genu po jego wbudowaniu się do genomu komórki roślinnej; oraz (b) przynajmniej j edną sekwencj ę, która określa ten fragment DNA, który ma ulec wbudowaniu do genomu roślinnego.

Do transformacji komórek roślinnych można zatem użyć bakterii Agrobacterium tumefaciens, zawieraj ących hybrydowy wektor plazmidowy lub wektor binarny towarzyszący plazmidowi Ti posiadającemu region vir. Bakteriami inokulować można eksplanty tkankowe, takie jak łodygi lub krążki liściowe. Alternatywnie, bakterie mogą być hodowane wspólnie z regenerującymi protoplastami roślinnymi. Protoplasty i tkanki roślinne mogą być także transformowane poprzez bezpośrednie wprowadzanie fragmentów DNA, które kodują enzym, i w których obecne są odpowiednie elementy kontrolujące transkrypcję i translację, lub też poprzez wektor zawierający taki fragment. Bezpośrednie wprowadzenie można osiągnąć stosując elcktroporację, glikol polietylenowy, mikroiniekcję lub bombardowanie cząstkami.

Według prezentowanego wynalazku transformować można komórki roślin okrytonasiennych, nagonasiennych, jednoliściennych i dwuliściennych. Gatunki jednoliścienne obejmują jęczmień, pszenicę, kukurydzę i ryż. Wśród gatunków dwuliściennych są bawełna, maniok, sałata, melon, groch, petunia, ziemniak, rzepak, soja, burak cukrowy, słonecznik, tytoń i pomidor. Odmiany ziemniaka, wobec których wynalazek znajduje zastosowanie, obejmują Desiree, Maris Bard, Record, Russet Burbank, Atlantic i Pentland Dell.

Hodowle tkankowe stransformowanych komórek roślinnych są poddawane regeneracji do całych zróżnicowanych i stratKfoimowanych roślin. Stransfomowane komórki roślinne mogą być hodowane na odpowiedniej pożywce, korzystnie na pożywce wzrostowej umożliwiającej selekcję. Rośliny mogą być regenerowane z uzyskanego tą drogą kallusa. W ten sposób otrzymuje się transgeniczne rośliny, których komórki zawierają w swym genomie chimerę genową, zdolną do ekspresji w komórkach roślinnych. Ze zregenerowanych roślin otrzymywać można nasiona lub inne organy służące rozmnażaniu, przeznaczone do przyszłego wykorzystania.

Poniżej przedstawiono korzystnąprocedurę odnośnie odmian ziemniaka Record i Desiree.

Materiał roślinny

Hodowle pędów ziemniaka prowadzono in vitro na pożywce MS (Murashige i Skoog) w pojemnikach Magenta GA-7, w temperaturze 22 °C (16 godzin/8 godzin, światło/ciemność). Co 3 tygodnie tworzono z węzłów hodowle pochodne.

Wyhodowane in vitro pędy o wysokości 2-3 cali (5-7,5 cm) sadzono w 2,5-calowych (6,4 cm) doniczkach z kompostem Levingtons F1. Rośliny odstawiane sąw rozsadniku na okres 1 tygodnia, w pomieszczeniu, w którym temperatura wynosi 18 °C (16 godzin/8 godzin, światło/ciemność). W trzecim tygodniu, po usunięciu rozsadnika, rośliny przesadza się do doniczek 5-calowych (12,7 cm). W 5-7 tygodniu rośliny używane były do transformacji.

Agrobacterium tumefaciens

Prowadzono płynne hodowle nocne odpowiednich szczepów, np. LBA4404 lub C58#3, w pożywce LB (patrz dodatek), w temperaturze 28 °C, aż do osiągnięcia wartości OD_6oo= 0,8.

1815155

Wspólna hodowla

Pobierano cztery najmłodsze, najlepiej rozwinięte liście, po czym sterylizowano ich powierzchnię 10% Domestosem (komercyjny środek czyszczący) przez 15 minut. Dokładnie przemywano liście jałowąwodą, a następnie krojono na krążki przy pomocy korkobora o średnicy 7 mm. Krążki mieszano z agrobakteriami przez 1 do 5 minut, odsączano na bibule filtracyjnej (Whatman No. 1) i umieszczano na pożywce indukującej rozwój kallusa (patrz dodatek) w 90 mm-płytkach Petrie’go z potrójnym otworem wentylacyjnym, przy czym krążki przylegały do pożywki spodnim naskórkiem. 90 mm-płytki Petrie’go z potrójnym otworem wentylacyjnym uszczelniano taśmą, ciętą tak aby pozwolić na wymianę gazową, i następnie inkubowano w temperaturze 22°C (16 godzin/8 godzin, światło/ciemność). Po 48 godzinach przenoszono krążki na pożywkę indukującąrozwój kallusa, zawierającą dodatkowo 500 g ml'¹ Claforanu i 300 g ml'¹ kanamycyny. To umożliwiło pozbycie się bakterii i wyselekcjonowanie stransfomowanych komórek.

Regeneracja stransformowanych pędów

Po tygodniu, przenoszono krążki na pożywkę wzrostową dla pędów (patrz dodatek) zawierąjącąte same antybiotyki. Kolejne pasaże przeprowadza się na tę samąpożywkę, aż do momentu, kiedy pędy mogą być wycięte (zwykle około 4 tygodnia). Pędy z kallusami przenoszone są do pożywki MS z cefotaksimem (500 g/ml) w dobrze wentylowanych pojemnikach, np. Magenta. Po kilku pasażach z cefotaksimem, przeprowadzanych w celu usunięcia bakterii, transformanty utrzymuje się na pożywce MS. Mogą być one usunięte z hodowli in vitro, i dalej rosnąć aż do osiągnięcia dojrzałości, jak to zostało opisane dla wyjściowych roślin. W efekcie tego procesu uzyskuje się st^^i^isformowane rośliny ziemniaka z wydajnością sięgającą 30%, obliczaną w stosunku do liczby krążków na etapie wspólnej hodowli.

Dodatek
Pożywka LB	BactoTryptone	10 gr*
	Wyciąg drożdżowy	5g l*
	Chlorek sodowy	5g l'*
	Glukoza	1 g i·1
Pożywka indukująca wzrost kallusa	MS z 3% sacharozą
	2,4-D	0,5 mg l'*
	BAP	2,5 mg l'*
Pożywka wzrostowa dla pędów	MS z 3% sacharozą
	BAP	2,5 mg l'*
	ga3	1,0 mg l'*

Identyfikacja genu brittle-2 pszenicy i jego ekspresji w roślinach transgemcznych DNA ekstrahowany z linii transformowanych plazmidem NCIMB 40649, oraz z linii transformowanychjednocześnie plazmidami NCIMB 40649 i NCIMB 40650, poddawano analizie z wykorzystaniem techniki Southema. Wyekstrahowany DNA roślinny trawiono enzymem restrykcyjnym Hindlll, a na jedną ścieżkę 1 % żelu agarozowego nanoszono 10 g DNA. Filtr uzyskany po transferze hybrydyzowano z sondą, którą była sekwencja kodująca brittle-2, uzyskana w wyniku trawienia plazmidu NCIMB 40649 enzymem BamHl. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc w 5xSSC, w temperaturze 55°C. Po płukaniu w 0,2xSSC, przeprowadzanym w temperaturze 55°C, poddawano filtr autoradiografn. Wynik przedstawiony na figurze 2a wskazuje, że do roślin wprowadzonych zostało od jednej do czterech kopii genu brittle-2.

Na figurze 2a, ścieżki 1 -4 odpowiadają DNA ekstrahowanemu z roślin transformowanych zarówno genem brittle-2, jak i shrunken-2. W ścieżkach 5-13 widoczny jest DNA wyekstraho8

185 155 wany z niezależnych linii, transformowanych jedynie genem brittle-2. Ścieżka 14 odpowiada DNA z metransformowanej rośliny ziemniaka.

W celu wykazania, iż DNA ulega ekspresji do poziomu mRNA, przygotowano startery oligonukleotydowe, wykorzystane następnie w procedurze określanej mianem RT-PCR, którą przeprowadzono na mRNA ekstrahowanym z bulw stransformowanych roślin ziemniaka. RT-PCR przeprowadzono na mRNA ekstrahowanym z materiału bulwowgo według sposobu opisanego przez Shirzadegana i wsp. (Nucleic acids research 19,6055; 1991 An efficient method of isolation ofRNA from tissue cultured plant cells). mRNA traktowano DNAząw celu usunięcia DNA, zanieczyszczającego próbkę. Syntezę pierwszej nici przeprowadzano przez 100 minut, w temperaturze 42°C, używając startera ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA. Po usunięciu RNA przy użyciu RNAzy, syntezowano drugą nić, w celu uzyskania fragmentów z końca 5’ i końca 3’ c DNA brittle-2. Do powielenia końca 5' używano starterów CCT CGT CAG GGG ATA CAA TCT AGT CCC oraz CAC CAA CAA AAT TTC GCG GAT CC, a do powielenia końca 3’ używano starterów CAG ACC ATG CTA TTT GTT G oraz ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA. Warunki amplifikacji były następujące: 24 cykli, z których każdy obejmował 1 minutę w temperaturze 94°C, 30 sekund w temperaturze 50°C, oraz 3 minuty w temperaturze 72°C. Po rozdzieleniu produktów na 1% żelu agarozowym i transferze przeprowadzonym techniką Southerna, hybrydyzowano otrzymany filtr z sondą, jak opisano powyżej. Wyniki przedstawione na figurze 2b wskazują, iż wprowadzony gen ulegał ekspresji do poziomu mRNA.

Na figurze 2b, ścieżki 1-4, 5-8 i 9-12 odpowiadają produktom RT-PCR dla trzech linii transfomowanych sekwencją brittle-2. Parzyste numery ścieżek odpowiadają reakcjom, w których nie użyto odwrotnej transkryptazy, aby wykazać w ten sposób ewentualną obecność DNA zanieczyszczającego próbki zawierające RNA. Ścieżki 12,5,6,9 i 10 odpowiadają produktom amplifikacji z końca 3 a ścieżki 3,4,7,8,11 i 12 odpowiadają produktom amplifikacji z końca 5 . Gdy jako kontrolę stosowano próbki nie zawierające RNA, lub pochodzące z roślin nietransgenicznych, nie otrzymano żadnego sygnału.

Produkowanie surowicy odpornościowej w celu identyfikacji pirofosforylazy ADPG w roślinach.

1. Izolacja białek kodowanych przez wektory ekspresyjne z E. coli..

Komórki E. coli,, transformowane konstruktami ekspresyjnymi GEX2T (Pharmacia Ltd) hodowano w następujący sposób: Kolba o pojemności 11, zawierająca 100 ml pożywki LB (10 g/l tryptonu,; 5 g/l ekstraktu drożdżowego; 10 g/l chlorku sodowego (NaCl)) z dodatkiem ampicyliny (100 g/ml), była inokulowana 20 l komórek E. coli, które hodowano przez noc w temperaturze 37°C. Hodowlę nocną przenoszono do pięciolitrowej kolby, zawierającej 900 ml pożywki LB, i hodowano przez godzinę. Indukowano ekspresję białka fuzyjnego w komórkach poprzez dodanie izopropylo- -D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM. Po dalszych czterech godzinach hodowli, zwirowywano komórki przez 10 minut przy 7000 obr./min. Komórki w postaci żwirowanego osadu przechowywano w temperaturze -80 °C, przed przeprowadzaniem ekstrakcji.

Żwirowane uprzednio komórki zawieszano w 90 ml lodowatego N-tris(hydroksymetylo)aminometanu (Trisu), 150 mM NaCI, pH 8,0, umieszczano w szklanej zlewce i sonikowano przez 45 sekund. Dodawano Tritonu Χ-100 do końcowego stężenia 1%o, po czym klarowano ekstrakt wirując przez 20 minut w temperaturze 4°C, przy 10000 obr./min. Po wirowaniu zlewano sklarowaną ciecz znad osadu do butelki plastikowej o objętości 250 ml, po czym dodawano 2-3 ml 50% zawiesiny żywicy sorpcyjnej glutatifnfwo-sefaroaowej (Pharmacia Ltd) zrównoważonej 50 mM Trisu, 150 mM NaCl, pH 8,0; a następnie delikatnie kołysano butelkę przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Żywicą napełniano kolumnę o pojemności 5 ml, po czym przemywano ją kolejno roztworem 50 mM Trisu, 150mMNaCl, 1% Tritonu Χ-100, pH 8,0; a następnie roztworem 50 mM Trisu, 150 mM NaCl, pH 8,0; aż do momentu, gdy nie wykrywano już więcej białka w wypłukiwanej cieczy. Wówczas eluowano z żywicy związane białko fuzyjne przy użyciu roztworu zawierającego 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM zredukowany glutation, pH 8,0.

185 155

Zbierano kolejne frakcje o objętości 1 ml i analizowano je pod względem zawartości białka, używając testu firmy Biorad do oznaczania białek poprzez wiązanie barwnika (Bradford. (1976) Analytical Biochemistry, 72, str. 248-254). Frakcje, wykazujące dużą zawartość białka, łączono przed poddaniem dalszej analizie.

2. Produkcja surowicy odpornościowej

Białko fuzyjne, składające się z sekwencji białka brittle-2 pszenicy sprzężonej z transferazą glutationową, izolowano z transformowanych komórek E. coli, jak opisano powyżej. Otrzymany w ten sposób preparat białkowy dializowano, wymieniając trzykrotnie roztwór 50 mM Trisu, pH 8,0, po czym przygotowano 3 porcje, z których jedna zawiera 100 g białka, a dwie po 50 g białka, w 500 l roztworu 50 mM Trisu, pH 8,0. Porcję zawierającą 100 g mieszano z taką samą objętością kompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwano podskórnie do boku białego królika nowozelandzkiego. Każdąz porcji zawierających 50 g białka mieszano z równą objętością niekompletnego adiuwanta Freunda i wstrzykiwano temu samemu królikowi w 4 i 8 tygodniu po pierwszej iniekcji. Po 12 tygodniach od pierwszej iniekcji pobierano krew i oddzielano komórki od surowicy poprzez odwirowywanie skrzepu. Zachowywano surowicę, którą przechowywano w temperaturze -20°C.

Identyfikacja białka brittle-2 pszenicy w roślinach trangenicznych.

Do identyfikacji białka brittle-2 pszenicy gromadzonego w bulwach stransformowanych roślin ziemniaka zastosowano następującą procedurę:

1. Eektroforeza w żelu poliakryloamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu.

Elektroforezę próbek białkowych przeprowadzano w rutynowy sposób, stosując system

Schaggera i von Jagowa (Analytical Biochemistry (1987), 166, str. 368-379). Ekstrakty białkowe przygotowywano homogenizując tkankę bulwy (50-100 mg) w buforze ekstrakcyjnym zawierającym 50 mM kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N’-2-etanosulfonowy (Hepes), pH 8,0; 10 mM kwas wersenowy (EDTA); 10 mM ditiotreitol (DTT). Przygotowywano próbki białkowe, zawierające do 100 g białka, poprzez wytrącanie etanolem i ponowne zawieszanie w wodzie (50 l) i dwukrotnie zatężonym buforze do nanoszenia próbek (50 l). Przed naniesieniem na żel gotowano próbki przez 60 sekund, po czym poddawano elektroforezie przy stałym napięciu 50-60 V przez około 20 godzin. Dwukrotnie zatężony bufor do nanoszenia próbek zawierał 100 mM Tris, pH 6,8; 8% (wag./obj.) dodecylosiarczanu sodu (SDS); 24% (wag./obj.) glicerynę; 4% (obj./obj.) -merkaptoetanol; (wag./obj.) błękit Coomassie.

2. Transfer białek w polu elektrycznym („elektroblotting”)

Białka, rozdzielone w procesie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS, przenoszono na membranę PVDF Immobilon-P (Millipore) poprzez transfer w polu elektrycznym. Membrana, bibuła Whatman 3MM, oraz gąbka nasączane były przed użyciem buforem do transferu (25 mM Tris,; 192 mM glicyna; 20% metanol; pH 8,3). Żele przekładano do membrany, po czym umieszczano w kasetach do transferu, zgodnie ze specyficznymi zaleceniami producenta. Kasety umieszczano w zbiorniku transferowym, zawierającym bufor do transferu, a następnie pobudzano transfer białek z żelu na membranę stosując napięcie 50 V, w temperaturze 4°C, przez okres 3-4 godzin. Transfer monitorowano używając wybarwionych białkowych wzorców ciężaru cząsteczkowego (Sigma Chemical Co.).

3. Immunodetekcja immobilizowanych białek.

Specyficzne białka wykrywano na membranach Immobilon-P, stosując przeciwciała skierowane przeciwko białkom ulegającym ekspresji w E. coli. Membrany, wyjęte bezpośrednio z pojemnika tr^i^i^fe^r^^^«ego, umieszczano na szklanej płytce. Przemywano je krótko buforem PBS (10 mM diwodorofosforan sodowy (NaH2PC₄); 150 mM NaCl; pH 7,2), a pozostałe miejsca wiążące białka blokowano traktując membrany 4% (wag./obj.) roztworem albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) w buforze PBS przez 30 minut. Następnie traktowano membrany pierwotnym przeciwciałem w odpowiednim rozcieńczeniu (zazwyczaj 1/1000-1/10000 (obj./obj.) w buforze PBS zawierającym 4% BSA przez 16 godzin w temperaturze pokojowej, stosując łagodne wytrząsanie. Nadmiar pierwotnego przeciwciała usuwano płucząc kilkukrotnie membrany buforem PBS.

185 155

W kolejnym etapie traktowano membrany przez 2-3 godziny buforem PBS (do 200 ml) zawierającym dodatkowo 2%o (wag./obj.) BSA oraz 20-40 ul immunoglobuliny G (IgG) skierowanej przeciwko białkom królika, sprzężonej z alkaliczną fosfatazą. Po inkubacji usuwano niezwiązany koniugat płucząc kilkakrotnie membrany roztworem 1 % (obj ./obj.) Tritonu X-100 w buforze PBS. Następnie krótko płukano membrany w buforze zawierającym 100 mM dietanoloaminę, i wywoływano poprzez inkubowanie w mieszaninie reakcyjnej dla alkalicznej fosfatazy (120 M błękit nitrotetrazolinowy; 135 M 5-bromo-4-chloroindolilofosforan; 4 mM chlorek magnezowy (MgCl₂); 100 mM dietanoloamina; pH 9,8). Reakcję prowadzono do momentu pojawienia się puipurowo-niebieskich prążków, zwykle około 30 minut. Zatrzymywano reakcję przemywając membrany wodą przy pomocy odwróconej osmozy. Następnie pozwalano membranom wyschnąć, układając je na papierze filtracyjnym wierzchem do dołu, i przechowywano w ciemności.

Oznaczanie pirofosforylazy ADPG w transgenicznych ziemniakach

1. Przygotowanie ekstraktów

Tkankę bulwy ziemniaka (2-3 g) homogenizowano w moździerzu z 3 ml buforu ekstrakcyjnego(50mMHepes,pH8,0; 10 mMEDTA; 10 mMDTT; 10% (wag./obj.) BSA). Ekstrakt klarowano poprzez wirowanie. W celu odsolenia ekstraktu, nanoszono 2,5 ml sklarowanego ekstraktu na kolumnę filtracyjnąz żelem PD10 (Pharmacia Ltd) nasączonym buforem ekstrakcyjnym, i eluowano objętością 3,5 ml buforu ekstrakcyjnego. Tak otrzymany preparat używano do oznaczania enzymu.

2. Oznaczanie enzymu

Zasada oznaczania enzymu jest następująca:

ADPG + PPi-► glukozo-1-fosforan + ATP pirofosforylaza ADPG

F osfoglukomutaza

glukozo-6-fosforan

NAD

Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa NADH

6-fosfoglukonian + CO2

NADH wykrywano spektrofotometrycznie, przy długości fali 340 nm, w temperaturze 25°C. Do plastikowej kuwety, uzupełnianej do objętości 1 ml dodawano:

mM Hepes, pH 8,0 mM chlorek magnezowy (MgCl₂) mM pirofosforan tetrasodowy (Na₄P₂O₇)

0,4 mM dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD) jednostki dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jednostki fosfoglukomutazy 24 M glukozo- 1,6-difosforan do 300 l ekstraktu.

Reakcję inicjowano dodając adenozynodifosfoglukozę (ADPG) do końcowego stężenia 0,8 mM.

Analiza ciężaru właściwego t^^i^n^^^^^^znych ziemniaków

Całe bulwy ważono w powietrzu i pod wodą. Ciężar właściwy obliczano następująco jako: ciężar w wodzie ciężar w powietrzu - ciężar w wodzie

185 155

Analiza zawartości skrobi w transgenicznych ziemniakach

Tkankę bulwy (40-70 mg) ekstrahowano w 500 145% HClO₄. Niewielką ilość ekstraktu (50 l) dopełniano do objętości 1 ml dodając 400 mM Hepes, pH 8,0, po czym dzielono na dwie porcje po 500 l, z których każdą dopełniano do objętości 1 ml dodając 400 mM Hepes, pH 8,0. Następnie, do jednej porcji dodawano 100 jednostek -amylazy i 7 jednostek amyloglukozydazy, a do drugiej nie dodawano żadnego enzymu, przy czym obie porcje odstawiano na noc przed rozpoczęciem oznaczania glukozy.

Glukozę oznaczano spektrofotometrycznie, przy dugości fali 340 nm, w temperaturze 25°C. Do plastikowej kuwety, uzupełnianej do objętości 1 ml dodawano:

100 mM Hepes, pH 8,0 4 mM MgCl₂ 4 mM NAD mM trój fosforan adenozyny (ATP) jednostki dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z Leuconostoc (Boehringer Mannheim) 500-600 mikrolitrów produktu trawienia skrobi.

Reakcję inicjowano dodając 0,3 jednostki heksokinazy (Boehringer Mannheim).

Na podstawie ilości glukozy zmierzonej podczas oznaczania można obliczyć ilość skrobi obecnej w tkance ziemniaka.

Stosując powyższe sposoby uzyskano następujące wyniki:

1. Rozpoznawanie białek w ekstraktach z ziemniaka i pszenicy przy użyciu surowicy odpornościowej przeciwko Brittle-2 (anty-Brittle-2)

Ekstrakty z tkanki bulwy ziemniaka i bielma pszenicy przygotowywano według opisanych wcześniej sposobów. Próbki, zawierające 100 g białek rozdzielano na żelach poliakryloamidowych w obecności SDS (SDS-PAGE), przenoszono na membrany i analizowano używając surowicy odpornościowej anty -Brittle-2. Przy rozcieńczeniu 1710000, w ścieżkach odpowiadających ekstraktom z pszenicy i ziemniaka wykrywano tylko jeden prążek. Ponadto, na podstawie różnicy wielkości wykrywanych produktów, można było odróżnić prążek charakterystyczny dla ziemniaka od prążka charalkeiystycznego dla pszenicy. W trzecim ekstrakcie, z obu tkanek, a więc zarówno ziemniaka, jak i pszenicy, można było rozróżnić dwa prążki, odpowiadające rozmiarom charakterystycznym dla prążków, obserwowanych w pojedynczych ekstraktach z pszenicy i ziemniaka.

2. Wykrywanie białek w bulwach roślin ziemniaka transformowanych sekwencją genową dla genu brittle-2 pszenicy.

Rośliny ziemniaka transformowano sposobem wspólnej hodowli krążków liściowych z bakteriami Agrobacterium tumefaciens, zawierającymi plazmid pFW 4091, obejmujący DNA genu pszenicy, kodującego białko brittle-2 pszenicy. Ponadto, tym samym sposobem transformowano też rośliny stosując kombinację bakterii Agrobacterium tumefaciens zawierających plazmid pFW 4151, obejmujący DNA genu pszenicy kodującego białko shrunken-2 pszenicy, oraz bakterii Agrobacterium tumefaciens zawierających plazmid pFW 4091, obejmujący DNA genu pszenicy kodującego białko brittle-2 pszenicy. Jak to już wcześniej opisano, plazmid pFW 4091 został zdeponowany pod numerem akcesyjnym NCIMB 40649, a plazmid pFW 4151 zdeponowano pod numerem akcesyjnym NCIMB 40650. Bulwy ziemniaka z roślin, które transformowane były DNA genu pszenicy kodującego białko brittle-2 pszenicy, analizowano pod kątem ekspresji tego genu, stosując transfer rozdzielonych elektroforetycznie białek na membranę (tzw. „Western blotting”), według wcześniejszego opisu, oraz przeciwciała skierowane przeciwko białku fuzyjnemu britt/e-2/transferaza glutationowa. W podobny sposób analizowano bulwy z linii, które były transformowane brittle-2 i shrunken-2 pszenicy. Jak opisano powyżej w sekcji 1, surowica odpornościowa rozpoznaje pojedyncze białko w pszenicy oraz pojedyncze białko w ziemniaku, które można od siebie rozróżnić na podstawie ich wielkości. Tą drogą wyselekcjonowano linie, które wykazywały ekspresję jedynie białka brittle-2. W bulwach z tych linii oznaczano, według wcześniejszego opisu, aktywność pirofosforylazy ADPG oraz zawartość skrobi, po czym porównywano te wyniki z aktywnościami oraz zawartościami skrobi w bulwach kontrolnych.

185 155

Analizowano 50 linii wywodzących się z bulw traktowanych według sposobu objętego wyznalazkiem, i próbowano z pięćdziesięcioma liniami wywodzącymi się z kontrolnych (nie traktowanych) bulw. Figury 3a i 3b przedstawiają wybór krańcowych zakresów aktywności pirofosforylazy ADPG (nanomole na minutę na gram świeżej masy) obserwowanych w liniach zawierających chimerę genową obejmującą brittle-2 i shrunken-2 (figura 3a) oraz w liniach zawierających chimerę genową obejmującą brittle-2 (figura 3b). Sądzimy, że linie te wykazują znacząco większą aktywność pirofosforylazy ADPG, niż bulwy kontrolne.

Figura 4 przedstawia, w postaci graficznej, ciężar właściwy bulw jako skumulowaną częstość występowania bulw, dla czterech klas aktywności pirofosforylazy ADPG, w odniesieniu do linii transformowanych brittle-2 i shrunken-2. Podobna analiza dla linii transformowanych jedynie brittle-2 daje następujące zmiany wartości mediany dla populacji.

linia transgeniczna z brittle-2 linia transgeniczna z brittle-2	linia 155	ciężar właściwy (mediana) 1,09 1,095
linia	32
kontrola	linia	16	1,087
kontrola	lima	28	1,087
kontrola	linia	38	1,089

Sądzimy, że ta zwiększona produkcja pirofosforylazy ADPG będzie również prowadzić do zwiększenia zawartości skrobi w roślinach, mierzonej opisanym wyżej sposobem, jeśli rośliny rosnąw odpowiednich warunkach, lub gdy wprowadzi się odpowiednie inne geny (patrz poniżej).

Pomiary dotyczące syntezy i przemiany metabolicznej skrobi

W celu określenia wpływu zmiany aktywności na syntezę skrobi, dostarczano radioaktywną sacharozę rozwijającym się bulwom z transgenicznych roślin o zwiększonej aktywności pirofosforylazy ADPG. Skrobię ekstrahowano według powyżej opisanego sposobu, po czym określano stopień radioaktywności, używając cieczowego licznika scyntylacyjnego. Linię stransformowaną genem brittle-2, wykazującą zwiększoną aktywność pirofosforylazy ADPG, porównywano z linią kontrolną, i otrzymano następujące wyniki:

% całkowitych zliczeń wbudowany w skrobie średnia os linia brittle-2 0,52 0,37 linia kontrolna 0,30 0,18 os = odchylenie standardowe

W celu potwierdzenia tej obserwacji przeprowadzono kolejny eksperyment, w którym wykorzystano cztery linie wykazujące różne aktywności pirofosforylazy AdPG. Wyniki przedstawione na figurze 5 wykazują, że skrobia jest szybciej syntezowana, lecz jednocześnie wykazują również, że w pewnych warunkach skrobia jest szybciej rozkładana. Na podstawie tego sugerujemy, że aby mniejszy wynalazek mógł być uniwersalnie stosowany, należy wprowadzić, obok funkcjonujących genów zwiększających aktywność pirofosforylazy ADPG, również geny zmniejszające aktywność amylazy (EC 3.2.1.1 oraz EC 3.2.1.2) i fosforylazy skrobiowej (EC 2.4.1.1).

185 155

Fig/la.

. Sphl,211 A7 ' PstI.849

HindHI,1895

EcoRI.1901

-XbaI,3805

SacI, 4740 Pstl,4853 Pstt.5081 EcoRI.5302

EcoRI.5901 BamHI,6401 Smal, 6406 iKpnI,6410 SacI ,6416 . EcoRl.6422 EcoRI,6<)95

185 155

Fig.2a.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Fig.2b.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

185 155 >>

ω co ε

•n ω

*N <D •H \IQ

E

CO

Cu ω

c •H

E r—i o

ε c

\o \w o

c >,

P <

Fig.3a.

Aktywność nmol/min/gram świeżej masy

ACTMTY nmol/min/gFWt

Transgeniczne linie brittle-2/shrunken-2 25» 5» 4» 31 oraz Fiq.3b. kontrolne linie 43, 23, 11, 28

□ BRITTLE-2 TRANSGENICS □CONTROLS

Linie transgeniczne brittle-2

185 155

nmol/g świeżęj δ 20nmol/gfrwt/ min nmol/g świeżej raasy/min masy/min nmol/g świeżej masy/min

Pirofosforylaza ADPG (nmol/g świeżej masy/min)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób zwiększania aktywności enzymatycznej pirofosforylazy adenozynodifosfoglukozowej (ADPG PPaza) w roślinie, która zawiera funkcjonalną ADPG PPazę, znamienny tym, że do rośliny wprowadza się przez transformację gen kodujący tylko jedną podjednostkę białkową heterotetramerycznej ADPG PPazy (EC 2.7.7.27), która katalizuje etap wytwarzania ADPG w szlaku syntezy skrobi, powodując ekspresję tego genu podjednostki w roślinie i wytworzenie podjednostki białkowej oraz zwiększenie aktywności enzymu w komórkach roślinnych.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wprowadza się gen, który koduje podjednostkę brittle-2 enzymu ADPG PPazy lub jego homolog, który wykazuje podobieństwo do genu brittle-2 wystarczająco duże aby kodować białko o identycznym działaniu biologicznym w komórce roślinnej.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że genem jest gen pszenicy dla podjednostki białkowej brittle-2.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że do rośliny wprowadza się również funkcjonalne geny, które zmniejszają aktywność jednego lub więcej enzymów degradujących skrobię.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że geny, zmniejszające aktywność enzymów degradujących skrobię, zmniejszają aktywność amylazy(EC 3.2.1.1 oraz EC 3.2.1.2) lub fosforylazy skrobiowej (EC 2.4.1.1).
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rośliną jest roślina jednoliścienna, wybrana z grupy obejmującej pszenicę, jęczmień, żyto, kukurydzę lub ryż.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roślinąjest roślina dwuliścienna, wybrana z grupy obejmującej ziemniak, pomidor, maniok, orzech ziemny, fasolę lub groch.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że wzrost zawartości skrobi w ziemniakach mierzony jest wzrostem ciężaru właściwego bulwy.
9. 9. Komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera tylko jeden plazmid z wbudowanym genem brittle-2 lub jego homologiem, który koduje tylko jedną podjednostkę białkową heterotetramerycznej ADPG PPazy (E.C. 2.7.7.27).
10. 10. Komórka roślinna według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera plazmid z wbudowanym genem zdeponowany pod numerem NCIMB 40649.
11. 11. Komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera plazmid z wbudowanym genem zdeponowany pod numerem NCIMB 40650.

    * * *