CZ290714B6

CZ290714B6 - Způsob zvyšování účinnosti enzymu v rostlinách

Info

Publication number: CZ290714B6
Application number: CZ19963668A
Authority: CZ
Inventors: Michael Meyrick Burrell; Stephen Andrew Coates; Alfhous Freddie Weir
Original assignee: Advanced Technologies (Cambridge) Limited
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2002-09-11
Also published as: PL317836A1; US6486383B1; CZ366896A3; ES2247590T3; EP0772682B1; US6096945A; AU2625895A; ATE305043T1; JPH10501967A; CA2192195A1; WO1995034660A1; EP0772682B9; PL185155B1; BR9508700B1; DE69534467D1; GB9412018D0; DE69534467T2; BR9508700A; CA2192195C; EP0772682A1

Abstract

Řešení se zakládá na překvapivém zvýšení enzymatické účinnosti, k němuž dochází v případě, že se do rostliny zavede jeden z genů jednoho ze subjednotkových proteinů enzymu katalyzujícího syntézu škrobu. Způsob rovněž zahrnuje zavedení jednoho z genů jednoho ze subjednotkových proteinů množiny dalších enzymů katalyzujících syntézu škrobu. Tímto genem je vhodně gen brittle-2. Obr. znázorňuje zvýšenou aktivitu ADPG PPázy a tedy i zvýšenou syntézu škrobu.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká modifikace obsahu škrobu v rostlinách, a zejména zvýšení tohoto obsahu.

Známv stav techniky

Škrob je komplexní polymer glukosylových zbytků. Představuje nejvýznamnější formu polysacharidu a ukládá se ve tkáních většiny druhů vyšších rostlin. Vzniká v průběhu dne fotosyntézou a ukládá se jako zásobní látka pro noční biosyntézu probíhající v listech rostlin. Škrob se hromadí rovněž ve tkáních, u nichž neprobíhá fotosyntéza, například v semenech, plotech a hlízách. Vzhledem k tomu je škrob velmi důležitý i pro produktivitu rostlin a pro jejich schopnost přežívat.

Škrob je velmi důležitý i pro člověka. Škrob na jedné straně představuje hlavní složku živočišné potravy, která znamená pro člověka a jeho domácí zvířata hlavní přísun cukrů, a na druhé straně ovlivňuje kvalitu zpracovaného rostlinného produktu a nachází široké průmyslové uplatnění při výrobě papíru, textilií, plastů a adheziv. Navíc je surovinou pro některé biologické reaktory. Výhodně se používá škrob z různých druhů rostlin. Ve světovém měřítku jsou zdaleka zemědělsky a ekonomicky nejdůležitějšími plodinami plodiny produkující škrob, přičemž tyto plodiny zahrnují pšenici, kukuřici, rýži a brambory. Množství škrobu, které je přitom ve sklizených částech rostliny, bude ovlivňovat celkový výtěžek a zpracovatelskou účinnost této plodiny. Typ škrobu bude ovlivňovat i kvalitu zpracovaného produktu a ziskovost celého zpracovatelského procesu. Škrob se syntetizuje v amyloplastech rostlin z glukózo-1-fosfátu (Glc-l-P), viz níže.

Glakózo-l-P ψ ADPG PPáza

Adenosindifosfoglukóza (ADPG) _v Syntéza škrobu a větvící enzym

Škrob [Arcylóza a Amylopektin]

Adenosindifosfoglukózopyrofosforyláza [Ec.2.7.7.27] (ADPG PPáza) katalyzuje první krok prováděný v rámci biosyntézy škrobu v rostlinách. Podobný enzym katalyzující stejnou reakci byl nalezen v bakterií a kyanobakterii.

Kvartémí struktura tohoto enzymu je ve všech zkoumaných organizmech podobná. Z toho vyplývá že se funkční enzym skládá z tetrameru proteinových subjednotek. V bakterii jsou tyto proteinové subjekty shodné a jsou produktem jediného genu, například v E. coli genu GlgC. Nicméně u rostlin se enzym skládá vždy ze dvou rozdílných proteinových subjednotek. I když tyto subjednotky vykazují sekvenční podobnosti, jsou produktem dvou rozdílných genů.

Existuje mnoho mutantů rostlin, které mají nižší obsah škrobu v příslušných tkáních ve srovnání s odpovídajícími tkáněmi divoce rostoucích rostlin. Tyto mutantní rostliny mají nedostatečnou expresi jednoho z genů, kódujícího subjednotky ADPG PPázy. Dvěma specifickými mutacemi pozorovanými v kukuřičném endospermu jsou mutanty shrunken-2 a brittle-2. Prokázalo se, že divoké typy genů kódují dvě proteinové subjednotky tohoto enzymu. Obě mutace způsobují

-1 CZ 290714 B6 snížení enzymatické účinnosti ADPG PPázy v endospermu. Z této informace se dá odvodit, že pro úplnou účinnost jsou zapotřebí obě subjednotky enzymu a že nedostatek určitého typu subjednotky nemůže být kompenzován druhou subjednotkou.

Vynález je založen na skutečnosti, že pro zvýšení enzymatické účinnosti je požadován pouze jeden z genů pro jednu z proteinových subjednotek enzymu katalyzujícího produkci škrobu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu pro zvýšení účinnosti enzymu katalyzujícího škrobovou syntézu.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí rostliny mající zvýšený obsah škrobu v porovnání s kontrolní rostlinou, která nebyla ošetřena způsobem podle vynálezu.

Dalším předmětem vynálezu je zvýšení rychlosti škrobové syntézy za podmínek, které nevedou ke kompenzačnímu zvýšení rychlosti rozkladu škrobu.

Vynález poskytuje způsob zvyšující enzymatickou účinnost v rostlině, který zahrnuje zavedení pouze jediného z genů jedné z proteinových subjednotek enzymu katalyzujícího škrobovou syntézu do rostlin, čímž se dosáhne exprese uvedeného subjednotkového genu v rostlině, která zase vede ke vzniku subjednotky proteinu a zvýšení enzymatické účinnosti rostlinných buněk.

Vynález dále poskytuje rostlinu, do které byl zaveden pouze jediný z genů jednoho ze subjednotkových proteinů enzymu katalyzujícího škrobovou syntézu, čímž došlo u této rostliny k expresi genu za vzniku subjednotkového proteinu a ke zvýšení enzymatické aktivity v rostlinných buňkách.

Způsob podle vynálezu může dále zahrnovat zavedení pouze jediného z genů jednoho ze subjednotkových proteinů množiny dalších enzymů katalyzujících škrobovou syntézu.

Výhodně je genem gen brittle-2 nebo jeho homolog. Výraz „homolog“, jak je zde uveden, znamená nukleovou kyselinu, která má nukleotidovou sekvenci shodnou nebo velmi blízce příbuznou s druhou nukleotidovou sekvencí. Výhodně je genem pšeničný gen brittle-2.

Výhodně se rostlina pěstuje komerčním způsobem, přičemž touto rostlinou je libovolná rostlina zvolená například z množiny zahrnující kukuřici, pšenici, rýži, rajské jablko, maniok, hrách, fazole, karotku, brambory a tabák.

Aktivita ADPG PPázy se výhodně zvýší způsobem podle vynálezu.

Zvýšení obsahu škrobu, zvláště u brambor, lze zaznamenat například jako zvýšení měrné hmotnosti rostliny nebo hlízy.

Výhodně se pro zabudování homologu genu brittle-2 enzymu katalyzujícího škrobovou syntézu použije plazmid. Alternativně může uvedený plazmid zabudovat homolog shrunken-2 genu enzymu katalyzujícího škrobovou syntézu.

Pro snadnější pochopení vynálezu bude vynález dále popsán pomocí příkladů provedení vynálezu a tento text bude doplněn doprovodnými výkresy, na kterých:

Obr. la znázorňuje transformační vektor neboli plazmid obsahující gen grittle-2;

obr. lb znázorňuje transformační vektor neboli plazmid obsahující gen shrunken-2',

-2 CZ 290714 B6 obr. 2a znázorňuje Southemův přenos DNA extrahované z ošetřených a neošetřených rostlin;

obr. 2b znázorňuje northernový přenos RT-PCT produktů z ošetřených a neošetřených rostlin;

obr. 3a znázorňuje graf aktivity ADPG PPázy vynesené v závislosti na liniích obsahujících geny brittle-2 a shrunken-2', obr. 3b znázorňuje graf aktivity ADPG PPázy vynesené v závislosti na liniích obsahujících gen brittle-2', obr. 4 znázorňuje grafickou formou měrné hmotnosti hlíz jako kumulativní frekvenci hlíz ve čtyřech třídách ADPG aktivity pro linie transformované brittle-2 a shrunken-2 geny; a obr. 5 znázorňuje průběh škrobové syntézy vynesený proti čtyřem liniím diferenční aktivity ADPG PPázy.

Byly vyprodukovány transgenní bramborové rostliny, které obsahují pšeničný gen, jenž je homologní s genem brittle-2 v kukuřici. Tento gen je tedy znám jako pšeničný gen grittle-2. Překvapivě se zjistilo, že exprese brittle-2 genu v transgenních bramborových rostlinách způsobila zvýšení aktivity ADPG PPázy. Je tedy zřejmě možné zvýšit účinnost tohoto enzymu v uvedené buňce expresí pouze jediného ze dvou subjednotkových proteinů žádaného pro získání aktivního enzymu. Pokud je aktivita ADPG PPázy hlavním faktorem omezujícím množství škrobu vzniklého nebo uloženého v rostlině, potom právě exprese genu grittle-2 proteinu poskytne mechanizmus zvyšující množství škrobu v uvedené hlíze a specifickou hmotnost této hlízy, a případně zvyšující množství škrobu v libovolné rostlině, ve které se ukládá škrob. To by zvýšilo výtěžek škrobu z rostliny a komerční hodnotu této rostliny.

Transgenní bramborové rostliny transformované genem pro subjednotku brittle-2 ADPG PPázy z pšenice se analyzovaly s cílem identifikovat přítomnost subjednotkového proteinu v těchto transgenních bramborových rostlinách a stanovení stupně enzymatické (ADPG PPázové) aktivity v rostlinách. Rovněž lze stanovit množství škrobu v uvedených rostlinách.

Nyní bude následovat podrobný popis standardních metod používaných při provádění výše popsaných analýz.

Produkce transgenních bramborových rostlin

Pro účely vynálezu se zvolila kódující sekvence, jejíž exprese v transgenních rostlinách způsobí zvýšení aktivity ADPG PPázy. Tato kódující sekvence může být z libovolné rostliny. Pro účely vynálezu se zvolil pšeničný homolog genu brittle-2 (Ainsworth, C; Tarvis, M; Clark, J. Pl. Mol. Biol. 23 23-33; 1993 Isolation and analysis of a cDNA encoding the smáli subunit of ADP-glucose pyropohosphorylase from wheat). Ten lze zavést do transformačního vektoru znázorněného na obr. Ia. Získaný plazmid pfW4091 byl uložen podle Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení mikroorganizmů pro účely patentového řízení v mezinárodní sbírce průmyslových a mořských bakterií ke 13. červnu 1994 pod vkladovým číslem NCIMB40649. Podobný plazmid pfW 4151 obsahující sekvenci kódující shrunken-2 znázorněný na obr. Ib byl uložen ke 13. červnu 1994 pod vkladovým číslem NCIMB40650. Tento vektor může proto obsahovat jeden nebo několik operačních genů a selektovaný značkovací gen (markér) a tyto geny lze zavést mezi konce T-DNA. Operační geny jsou tvořeny promotorovou sekvencí, která způsobí expresi genu v hlízách a dalších orgánech, v nichž se ukládá škrob, ve tkáních nebo v buňkách; kódující sekvenci; a terminační sekvencí.

Tento vektor je proto zpravidla vybaven transkripčními regulačními sekvencemi a/nebo, ukončovacím kodónem, pokud není přítomen na 3' konci kódující sekvence uvedeného genu.

-3CZ 290714 B6

Řetězec DNA může proto rovněž zabudovat terminační sekvenci a další sekvence, které jsou schopny umožnit genu expresi v rostlinných buňkách. Řetězec DNA a/nebo vektor mohou být vybaveny promotorem nebo jiným prvkem schopným za určitých podmínek zvyšovat nebo snižovat hladiny exprese dosažené v určitých částech rostliny. Vektor je rovněž zpravidla opatřen genem rezistence k antibiotikům, který transformovaným rostlinným buňkám, tkáním a rostlinám vyselektovaným pěstováním na vhodném médiu obsahujícím antibiotika udílí odolnost.

Buňky transformované rostliny lze selektovat pěstováním na vhodném médiu. Lze tedy získat rostlinnou tkáň obsahující rostlinnou buňku, která přechovává gen kódující enzym pod řízením promotoru, například v genomu rostlinné buňky. Proto je možná exprese tohoto genu v rostlinné buňky. Rostliny, které mají ve svých buňkách obsažen gen a promotor, integrovaný například v genomu rostlinné buňky tak, že je možná exprese uvedeného genu, lze následně regenerovat. Regenerované rostliny lze reprodukovat a získat například jejich semena.

Výhodným způsobem transformace rostlinné buňky je použití bakterie Agrobacterium tumefaciens obsahující vektor, který zahrnuje výše zmíněný chimérický gen. Proto lze použít hybridní plazmidový vektor, který zahrnuje:

(a) chimérický gen obsahující regulační prvky, které tomuto genu, pokud je zabudován do genomu rostlinné buňky, umožňují expresi;

(b) alespoň jednu DNA sekvenci, která stanoví délku DNA, která má být zabudována do rostlinného genomu; a (c) DNA sekvenci, která umožní přesun DNA do rostlinného genomu.

Délka DNA, která má být zabudována do buněčného genomu rostlinné buňky, je zpravidla načrtnuta T-/DNA okrajovými sekvencemi Ti-plazmidu. Pokud je přítomna pouze jediná okrajová sekvence, potom se výhodně jedná o pravou okrajovou sekvenci. Sekvencí DNA, která umožní DNA přenos do genomu rostlinné buňky, je zpravidla virulentní oblast Ti-plazmidu.

Gen kódující polypeptid a jeho transkripční a translační řídicí prvky se tedy může nacházet mezi okraji T-DNA Ti-plazmidu. Tímto plazmidem může být deaktivovaný Ti-plazmid, ze kterého byly odstraněny geny způsobující tvorbu nádorů. Gen a jeho transkripční řídicí prvky se mohou nacházet mezi okraji T-DNA v binárním vektoru v poloze trans k Ti-plazmidu a virulentní oblastí. Takový binární vektor potom obsahuje:

(a) chimérický gen, který je řízen regulačními prvky tak, že genu, který se integruje do genomu rostlinné buňky, umožní expresi; a (b) alespoň jednu sekvenci DNA, která stanoví délku DNA, jež má být zabudována do rostlinného genomu.

Pro transformaci rostlinných buněk lze použít Agrobacterium tumefaciens, které obsahuje hybridní plazmidový vektor nebo binární vektor v trans-poloze k Ti-plazmidu majícímu virovou oblast. Tkáňové explantáty, jakými jsou stonky nebo kotoučkové vzorky listů, mohou být inokulovány bakterií. Alternativně lze bakterii pěstovat společně s regeneračními rostlinnými protoplasty. Rostlinné protoplasty nebo tkáně lze rovněž transformovat přímým zavedením fragmentů DNA, které kódují enzym a ve kterých jsou přítomny příslušné transkripční a translační kontrolní elementy, nebo pomocí vektoru, který tento fragment zabudovává. Přímého zabudování lze dosáhnout pomocí elektroforézy, polyethylenglykolu, mikroinjektáží nebo bombardováním částicemi.

Způsobem podle vynálezu lze transformovat rostlinné buňky z krytosemenných, nahosemenných, jednoděložných nebo dvouděložných rostlin. Jednoděložné druhy zahrnují ječmen, pšenici,

-4CZ 290714 B6 kukuřici a rýži. Dvouděložní druhy zahrnují bavlnu, maniok, salát, meloun, hrášek, petúnii, brambory, brukev, řepku, sojové boby, cukrovou třtinu, slunečnice, tabák a rajské jablko. Bramborové kultiváty, na které lze aplikovat vynález, zahrnují Desiree, Maris Bard, Record, Russet Burbank, Atlantis a Pentland Dell.

Tkáňové kultury transformovaných rostlinných buněk se množí ve snaze regenerovat diferencované transformované celé rostliny. Transformované rostlinné buňky lze pěstovat na vhodném médiu, výhodně na selektivním růstovém médiu. Rostliny lze regenerovat z rezultujícího kalusu. Takto se získají transgenní rostliny, jejichž buňky zabudovávají chimérický gen v uvedeném genomu, přičemž tento chimérický gen je možné exprimovat v buňkách rostlin. Semena z regenerovaných rostlin lze shromáždit pro další použití.

U výhodného postupuje použita bramborová odrůda Record a Desiree.

Rostlinný materiál

Bramborové výhonky se udržují in vitro na Murashigo-Skoogově médiu (MS) v zásobnících Magenta GA-7 při 22 °C (16h/8h světlo/tma). Ty se nodálně subkultivují každé 3 týdny.

Výhonky in vitro, jejichž výška je 5 cm až 7,5 cm, se umístí do kořenáčů (6,4 cm), obsahujících Levingtonsův kompost Fl. Najeden týden se odstaví do propagátoru, který je umístěn v růstové místnosti při 18°C (16h/8h světlo/tma). Propagátor se odstraní a rostliny se opět zasadí na 3 týdny do kořenáčů (12,7 cm). V 5. až Ί. týdnu se rostliny použijí pro transformaci.

Agrobacterium Tumefaciens

Kapalné, jednu noc staré kultury vhodných kmenů, například LBA4404, C58#3 se nechají růst při teplotě 28 °C na OD₆₀o 0,8 v L-bujonu (viz dodatek).

Kokultivace

Použijí se čtyři nejmladší nejrozvinutější listy, které se 15 minut povrchově sterilizují v 10% Domestosu (komerční bělidlo). Listy se opláchnou sterilovanou vodou a následně se žních pomocí korkovače o průměru 7 mm vyříznou kotoučkové vzorky. Na tyto kotoučky se nechá 1 až 5 minut působit mikroorganismus Agrobacterium, načež se přenesou na filtrační papír (Whatman č. 1), kde se vysuší a potom se spodním epidermem směrem dolů přenesou na kalusující médium viz dodatek) do 90mm Petriho misek se třemi průduchy. 90mm tříotvorová Petriho miska se uzavře lepicí páskou, která se nařízne tak, aby umožnila průchod plynu a následně se inkubuje při 22 °C (16h/8h světlo/tma). Připravené listové kotoučky se přemístí do kalusujícího média s 500 μΓ¹ claforanu a po 48 hodinách se přidá 30 pg.mf¹ kanamicinu, který odstraní bakterii a selektuje transformované buňky.

Regenerace transformovaných výhonků

Po uplynutí jednoho týdne se kotoučky přenesou na výsadbové médium (viz dodatek) obsahující stejná antibiotika. Další přenos na stejné médium se provede až v okamžiku, když mohou být odříznuty výhonky (zpravidla přibližně po 4 týdnech). Výhonky s kalusy se přenesou na MS médium s cefotaxinem (500 pg/ml), které se nachází v dobře větraných kontejnerech, například kontejnerech Magenta. Transformanty se ponechají, po několika pasážích s cefotaximem, jejichž cílem se odstranit bakterií, na MS médium. Transformanty lze odstranit z in vitro a nechat růst do zralosti způsobem popsaným pro zásobní rostliny. Tímto postupem se získají transformované bramborové rostliny při frekvenci až 30 % kokultivovaných kotoučků.

Dodatek

L-bujon

Závalové médium

Výsadbové médium g/1 bactotrypton g/1 kvasinkový extrakt g/1 chlorid sodný g/1 glukóza MS s 3 % sacharózy

0,5 mg/12,4-D

2,5 mg/1 BAP

MS plus 3 % sacharózy

2,5 mg/1 BAP

1,0 mg/1 GA₃

Identifikace pšeničného genu Brittle-2 a exprese v transgenních rostlinách

Northemový přenos se připravil za použití bramborové DNA extrahované z linií transformovaných pomocí NCIMB 40649 a linií transformovaných současně pomocí NCIMB 40649 a NCIMB 40650. U extrahované rostlinné DNA se provedla restrikce pomocí HindlII a 10 μΐ DNA se použilo na stopu 1% agarového gelu. Přenos se sondoval brittle-2 kódující sekvencí získanou zBamHi restringované plazmidové DNA NCIMB 40649. Přenos se hybridizoval přes noc při 55 °C v 5xSSC. Po promytí, kdy se dosáhlo 0,2xSSC při 55 °C se přenos autoradiografoval. Výsledek pozorování je znázorněn na obrázku 2a, který naznačuje, že do rostlin byla zavedena jedna až čtyři kopie genu brittle-2.

Na obr. 2a pruhy 1 až 4 znamenají DNA extrahovanou z rostlin transformovaných geny brittle-2 a shrunken-2. Pruhy 5 až 13 ukazují DNA extrahovanou z linií nezávisle transformovaných právě genem brittle-2. Pruh 14 ukazuje DNA z netransformované bramborové rostliny.

Aby se ukázalo, že se DNA exprimuje jako mediátorová DNA, připravily se oligonukleotidové primery, které se použily pro RT-PCR (reakce polymerázová řetězová inverzní), která se prováděla na mRNA extrahované z hlíz transformovaných bramborových rostlin. RT-PCR se prováděla na mRNA extrahované z hlízového materiálu způsoben, který popsal Shrzadegan a kol. (Nucleic acid research 19 6055; 1991 An efficient method of isolation of RNA from tissue cultured plant celíš). Zmíněná mRNA se ošetřila pomocí DNA s cílem odstranit z mRNA kontaminující DNA. Pro první řetězovou syntézu, která se prováděla 100 minut při 42 °C, se použil primer ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA. Po odstranění RNA pomocí RNA se syntetizoval druhý řetězec za účelem získání fragmentu na 5' konci a fragmentu na 3' konci brittle—2 cDNA. Pro růst na 5' konci se použily primery CCT CGT CAG GGG ATA CAA TCT AGT CCC a CAC CAA CAA AAT TTC GCG HAT CC a pro růst na 3' konci se použily primery CAG ACC ATG CTA TTT GTT G a ATA ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA. Pro růst řetězce se zvolily následující podmínky: 24 cyklů, při kterých se teploty střídaly v následujícím sledu: 1 minutu při 94 °C, 30 sekund při 50 °C a 3 minuty při 72 °C. Po separaci produktů na 1% agarovém gelu a southemovém přenosu se přenos sondoval výše popsaným způsobem. Výsledky znázorněné na obr. 2b ukazují, že zavedený gen je exprimován jako mRNA. Na obr. 2b pásy 1—4, 5-8, a 9-12 ukazují produkty RT-PCR ze tří linií transformovaných sekvencí brittle-2. Sudými čísly očíslované pásy ukazují reakce prováděné bez reverzní transkriptázy, které měly indikovat kontaminaci RNA pomocí DNA. Pásy 1, 2, 5, 6, 9 a 10 ukazují růst na konci a pásy 3, 4, 7, 8, 11, 12 ukazují růst na konci 5'. V případě, že se jako kontrola nepoužily žádná DNA nebo transgenní rostlina, se nezískal žádný signál.

-6CZ 290714 B6

Produkce antiséra pro identifikaci ADPG PPázy v rostlinách

1. Příprava proteinů z E. coli expresních vektorů

Buňky E. coli transformované pomocí GEX2T (Pharmacia Ltd) expresních konstrukcí se pěstovaly následujícím způsobem: 11 Baňka obsahující 100 ml LB bujónu (10 g/1 tryptonu; 5 g/1 kvasnicového extraktu; 10 g/1 chloridu sodného (NaCl)) se 100 ug/rnl přidaného ampicillinu se inokulovala 20 μΐ baněk E. coli. které se nechaly růst přes noc při teplotě 37 °C. Jednonoční kultura se přemístila do 51 baňky obsahující 900 ml LB bujónu a nechala jednu hodinu růst. Buňky se indukovaly pro exoresi fúzovaného proteinu přidáním izopropyl Beta-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) ke konečné koncentraci 1 mM. Po dalším čtyřhodinovém růstu se buňky sklidily lOminutovým odstřeďováním při frekvenci otáček 7000 min'¹. Peletované buňky se před extrakcí skladovaly při -80 °C.

Takto získané peletované buňky se resuspendovaly v 90 ml ledově studeného 50mM N-tris(hydroxymethyl)aminoethanu (Tris), 150mM NaCl, pH 8,0, umístily do skleněné kádinky a vystavily účinkům ultrazvuku po dobu 45 s. Triton X-I00 se přidal do konečné koncentrace % a extrakt se čistil odstředěním prováděným 20 minut při 10 000 min'¹ a 4 °C. Po odstředění se supematant dekantoval v 250ml umělohmotné láhvi, do které se přidaly 2-3 ml 50% suspenze glutathionsepharosové afinitní pryskyřice (Pharmacia Ltd) která byla uvedena předem do rovnovážného stavu s 50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8,0, a láhev se lehce protřepávala 1 až hodiny při pokojové teplotě. Pryskyřice se následně přemístily do 5ml válce a postupně proplachovala 50 mM Tris, 150 mM NaCl, lTritonem X-100, pH 8,0 a následně 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0, tak dlouho, dokud bylo možné v promývacím podílu detekovat protein. Vazebný fúzní protein se následně eluoval z pryskyřice pomocí 50mM Tris, 150 mM NaCl, Emm redukovaného glutathionu, pH 8,0. Frakce se shromáždily a za použití vybarvovacího testu Biorad pro proteiny (Bradford, (1976) Analytical Biochemistry. 72, str. 248-254) se zjišťoval obsah v nich obsaženého proteinu. Frakce ukazující proteinový pík se před další analýzou sloučily.

2. Příprava antiséra

Fúzní protein, obsahující pšeničnou brittle-2 proteinovou sekvenci začleněnou do glutathion-stransferázy, se připravily z buněk transformované E. coli výše popsaným způsobem. Tato příprava proteinu se provádí pomocí dialýzy proti třem změnám 50 mM Tris, pH 8,0, přičemž se připraví tři alikvoty, jeden, ve kterém je 100 pg proteinu v 500 μΐ Tris, pH 8,0, a dva, ve kterých je 50 pg proteinu. 100 pg Alikvótní podíl se smísil se stejným objemem Freudova komplexního adjuvansu a subkutánně injektoval do boku novozélandského bílého králíka. Každý ze dvou 50 mikrogramových dílů se smísil se stejným objemem Freudova komplexního adjuvansu a subkutánně injektoval do jednoho a téhož králíka 4 a 8 týdnů po první injekci. Po dvanácti týdnech od první injekce se králíkovi odebrala krev a ze séra se srážením a odstředěním separovaly buňky. Sérum se skladovalo při teplotě -20 °C.

Identifikace pšeničného proteinu brittle-2 v transgenních rostlinách

Následující postup se použil k identifikaci pšeničného brittle-2 proteinu nahromaděného v hlízách transformovaných bramborových rostlin.

1. Elektroforéza na natriumdodecylsulfátpolyakrylamidovém gelu

Elektroforéza proteinových vzorků se běžně provádí za použití Schaggerova a von Jagowova systému (Analytical Biochemistry (1987), 166, str. 368-379). Proteinové extraktry se připravily homogenizací hlízové tkáně (50 mg až 100 mg), v extrakčním pufru obsahujícím 50mM kyselinu N-2-hydroxyethylpiperazin-/V-2-ethansulfonovou (Hepes), pH 8,0; lOmM kyselinu diamino

-7 CZ 290714 B6 ethantetraoctovou (EDTA); a lOmM dithiothreitol (DTT). Proteinové vzorky obsahující až 100 pg proteinu se připravily vysrážením acetonem a následnou resuspendací ve vodě (50 pl) a dvojnásobném zaváděním pufru (50 pl). Vzorky se před naložením na gel vařily 60 sekund, načež se podrobily elektroforéze při 50 V až 60 V (konstantní napětí) po dobu přibližně 20 hodin. Dvojnásobný zaváděcí pufr sestával z lOOmM Tris, pH 6,8; 8 % (hmotn./obj.) natriumdodecylsulfátu (SDS); 24% (hmotn./obj.) glycerolu; 4% (obj./obj.) betamerkaptoethanolu; 0,02 % (hmotn./obj.) modři Coomassie.

2. Elektropřenos proteinů

Proteiny separované elektroforézou na SDS polyakn lamidovém gelu se elektropřenosem přenesly na membránu Immobilon-P PVDF (Millpore). Membrána, Shatmanův 3mm papír, a gelová frakce se před použitím uvedla do rovnováhy s přenosovým pufrem (25mM Tris; 192mM glycinu; 20 % methanolu; pH 8,3). Gely se umístily do blízkého kontaktu s membránou a složily do přenosových kazet ve specifickém uspořádání uvedeném v instrukcích výrobce. Kazety se umístily do elektropřenosového tanku obsahujícího přenosový pufr a přenosu proteinů z gelu na membránu se dosáhlo aplikací 50 V při teplotě 4 °C po dobu 3 až 4 hodin. Přenos se monitoroval za použití předběžně vybarvených proteinových značkovačů (Sigma Chemical Co.).

3. Imunodetekce imobilizovaných proteinů

Specifické proteiny se detekovaly na membránách Imobilon-P použitím protilátek pěstovaných proti proteinům exprimovaným v E. coli. Membrány se odebraly přímo z elektropřenosového tanku a umístily do skleněné nádoby. Membrány se lehce opláchly fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (PBS, lOmM dihydrogenfosforečnan sodný (NaH₂PO4); 150mM NaCl; pH 7,2) a zbývající místa vážící protein se blokovala ošetřením 4% (hmotn./obj.) bovinním sérovým albuminem (BSA) v PBS po dobu 30 minut. Potom se membrány opakovaně imunizovaly primární protilátkou při vhodném naředění (zpravidla 1/1000-1/10 000 (obj./obj.) v PBS obsahujícím 4% BSA po dobu 16 hodin při pokojové teplotě a za lehkého protřepávání. Přebytečná primární protilátka se odstranila propláchnutím membrány několika dávkami PBS. Membrány se následně ošetřily 20 μΐ až 40 μΐ alkalické fosfatázy konjugovaného králičího anti-IgG (immunoglobulinu G) až ve 200 ml PBS obsahujícího 2 % (hmotn./obj.) BSA po dobu 2 až 3 hodin. Nenavázaný konjugát se po inkubaci odstranil propláchnutím několika dávkami 1% (obj./obj,) Tritonu X-100 v PBS. Membrány se následně lehce propláchly lOOmM diethanolaminové pufru, pH 9,8 a vyvíjely inkubací reakční směsi alkalické fosfatázy (120μΜ nitrobluetetrazolium (2/7-tetrazonium, 3,3'-(3,3'-dimethoxyl[l-(bifenyl]^l,4'-diyl)bis[2-(4-nitrofenyl)5-fenyljdichlorid), 135μΜ 5-bromo-4-chloroindolylfosfátu; 4mM chloridu hořečnatého (MgCl₂); lOOmM diethanolamin; 9,8 pH). Reakce se nechala probíhat do okamžiku, kdy se objeví pufrově modré pásy, zpravidla po 15 až 30 minutách. Reakce se zastavila reverzní osmózou (RO) membrán vodou. Membrány se nechaly vysušit lícovou stranou otočenou k filtračnímu papíru a skladovaly ve tmě.

Testování ADPG PPázy v transgenních bramborách

1. Příprava extraktů

Tkáň bramborové hlízy, 2-3 g, se za použití hmoždíře a tlouku homogenizovala se 3 ml extrakčního pufru (50mM Hepes, pH 8,0, lOmM EDTA; lOmM DTT; 10% (hmotn./obj.) BSA). Extrakt se vyčistil odstředěním. Za účelem odsolení extraktu se předem uvedené do rovnováhy s pufrem do PD10 gelové filtrační kolony (Pharmacia Ltd) zavedlo 2,5 ml vyčištěného extraktu. Tento přípravek se použil pro enzymatické testy.

-8CZ 290714 B6

2. Enzymatický test

Princip enzymatického testuje následující:

ADPG + PPi -------------> glukózo-l-fosfát + ATP

ADPG PPáza

Fosfoglukomutáza glukózo-6-fosfát ______— NAD /glukózo-6-fosfátídehydrogenáza ,, > NADH

6-fosfoglukonát + CO2

NADH se detekuje spektrofotometricky při 25 °C a 340 nm.

Do plastikové kyvety se umístil 1 ml vzorku, který obsahoval:

40mM Hepes, pH 8,0, lOmM chlorid hořečnatý (MgCH lmM difosforečnan tetrasodný,

0,4mM nikotinamidadenindinukleotid (NAD), jednotky glukózo-6-fosfátdehydrogenázy, μΜ glukózo-1,6-difosfát (Glc—1,6—P₂), až 300 μΐ extraktu.

Reakce se nastartovala přidáním adenosindifosfoglukózy (ADPG) do konečné koncentrace 0,8 mM.

Analýza specifické hmotnosti transgenních brambor

Celé hlízy se zvážily na vzduchu a pod vodou.

Specifická hmotnost se vypočetla pomocí následujícího vztahu;

hmotnost na vzduchu .

hmotnost na vzduchu - hmotnost ve vodě

Analýza obsahu škrobu transgenních brambor

Hlízová tkáň (40 mg až 70 mg) se extrahovala v 500 μΐ 45% HC1O₄. Podíl tohoto extraktu (50μ1) se doplnil do 1 ml 400mM Hepesu, pH 8,0 a následně rozdělil na dvě 500μ1 části, které se obě doplnily do 1 ml přidáním 400 mM Hepesu, pH 8,0. Do jedné části se následně přidalo

-9CZ 290714 B6

100 jednotek alfa-amylázy a 7 jednotek amyloglukosidázy, přičemž do druhé části se nepřidal žádný enzym. Oba vzorky se nechaly předtím, než se použily pro testování glukózy, přes noc odstát.

Stanovení glukózy se provádělo spektrometricky při 25 °C a 340 nm.

Do plastikové kyvety se zavedl 1 ml vzorku, který obsahoval

100 mM Hepes, pH 8,0, mM MgCl₂, mM NAD, mM adenosintrifosfátu (ATP), jednotky glukózo-6-fosfátdehydrogenázy od společnosti Leuconostoc (Boehringer Mannheim).

Množství škrobu přítomného v bramborové tkáni lze vypočíst z množství glukózy zjištěného v tomto testu. Pomocí výše zmíněné metody se získaly následující výsledky.

1. Stanovení proteinů pomocí antiséra ar\X.\-Brittle~2 v extraktech brambor a pšenice

Extrakty bramborové hlízy a tkáň pšeničného endospermu se připravily těmito metodami. Použily se podíly obsahující 100 pg proteinu a již popsaným způsobem se nanesly na SDS-PAGE gely, přenesly a opakovaně imunizovaly antisérem ant\-brittle-2. Při naředění 1/10 000 se detekoval pouze jediný proteinový pás v záznamových stopách odpovídajících pšeničnému a bramborovému extraktu. Bramborový pás byl vzhledem ke svým odlišným rozměrům odlišitelný od pšeničného pásu. U třetího extraktu se vytvořily oba dva pásy, jak pro pšeničnou, tak pro bramborovou tkáň, které byly díky rozměrům odpovídajícím velikostem pásů u individuálního pšeničného a bramborového extraktu rozlišitelné.

2. Detekování proteinů v hlízách bramborových rostlin transformovaných genovou sekvencí pro pšeničný gen brittle-2

Bramborové rostliny se transformovaly metodou kokultivace listových kotoučů s bakterií Agrobacterium tumefaciens obsahující plazmid pFW 4091 obsahující DNA kódující pšeničný gen pro brittle-2 protein pšenice. Další rostliny se transformovaly za použití stejné metody a kombinace bakterií Agrobackterium tumefaciens obsahující plazmid pFW 4151 obsahující DNA kódující pšeničný gen pro shrunken-2 protein pšenice a Agrobacterium tumefaciens obsahující plazmid pFW 4091 obsahující DNA kódující pšeničný gen pro brittle-2 protein pšenice. Plazmid pFW 4091 byl uložen pod přijímacím číslem NCIMB 40649 a plazmid pFW 4151 byl uložen pod přijímacím číslem NCIMB 40650, jak již bylo uvedeno. U bramborových hlíz z rostlin, které byly transformovány pomocí DNA kódující pšeničný gen pro brittle-2 protein pšenice, se zjišťovala exprese genu westernovým přenosem, způsobem popsaným v rámci metod, za použití protilátky působící proti fúznímu proteinu ůrz7//e-2/glutathion-s-transferázy. Podobně se analyzovaly hlízy z linií, které se transformovaly pomocí Brittle-2 a shrunken-2 z pšenice. Jak již bylo popsáno ve výše zmíněné 1. části, toto antisérum zjišťuje jeden protein v pšenici a jeden protein v bramboře, přičemž tyto proteiny lze od sebe vzájemně odlišit na základě jejich velikosti. Tímto způsobem se vybraly pouze ty linie, které byly transformovány pomocí brittle-2 proteinu obsaženého v pšenici. U hlíz těchto linií se zkoumaly ADPG PPázová aktivita a obsah škrobu, způsobem popsaným v rámci metod, a získané hodnoty se porovnávaly s aktivitami a obsahy škrobu kontrolních hlíz.

Padesát linií z hlíz ošetřených způsobem podle vynálezu se testovalo a porovnalo s padesáti liniemi z kontrolních (neošetřených) hlíz. Obrázky 3a a 3b ukazují selekci maximálních rozmezí ADPG PPázová aktivita (nmol/min/g čerstvé hmotnosti) sledovaný v liniích, které obsahovaly

-10CZ 290714 B6 chimérický gen pro brittle-2 a shrunken-2 (obrázek 3a) a v liniích obsahujících chimérický gen pro brittle-2 (obrázek 3b). Dá se předpokládat, že tyto linie ukáží podstatně vyšší ADPG PPázovou aktivitu než kontrolní hlízy.

Obr. 4 ukazují grafickou formou měrné hmotnosti hlíz jako kumulativní frekvenci hlíz ve čtyřech třídách ADPG PPázové aktivity pro linie transformované pomocí Brittle-2 a Shrunken-2. Podobné analýzy pro linie transformované pouze pomocí Brittle-2 přinesla následující změnu ve střední hodnotě populace:

střední měrná hmotnost

transgenní s brittle-2	linie 153	1,09
transgenní s brittle-2	linie 32	1,095
kontrolní	linie 16	1,087
kontrolní	linie 28	1,087
kontrolní	linie 38	1,089

Dá se předpokládat, že toto zvýšení produkce ADPG PPázy rovněž povede ke zvýšení obsahu škrobu v rostlinách, které bylo naměřeno pomocí výše popsaných metod v případě růstu za vhodných podmínek nebo v případě zavedení dalších vhodných genů (viz níže).

Měření syntézy a přeměny na škrob

K určení účinku změny aktivity na syntézu škrobu se sacharóza značená radioaktivním izotopem zavedla do vyvíjející se hlízy transgenních rostlin s rostoucí aktivitou ADPG PPázy. Škrob se extrahoval výše popsaným způsobem a radioaktivita se určila pomocí kapalinové scintilační sondy. Linie transformovaná genem brittle-2 se zvýšenou ADPG PPázovou aktivitou se porovnala s kontrolní linií a poskytla následující výsledky:

% celkové radioaktivity zabudované do škrobu _____________________________________střední hodnota____________________sem____________ brittle-2 linie 0,52 0,37 kontrolní linie 0,30 0,18 sem = standardní chyba střední hodnoty

K potvrzení tohoto pozorování se použil další experiment se čtyřmi liniemi vykazujícími odlišné aktivity ADPG PPázy (viz obr. 5). Výsledky na obrázku 5 ukazují, že se škrob syntetizuje rychleji, ale rovněž ukazuje, že za určitých podmínek se také mnohem rychleji štěpí. Takže, aby mohl být vynález univerzálně aplikován, je třeba zavést operační geny pro zvýšení aktivity ADPG PPázy a operační geny pro snížení aktivity amylázy (EC 3.2.1.1 a EC 3.2.1.2) a škrobové fosforylázy (EC 2.4.1.1).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zvýšení enzymatické aktivity adenosildifosfoglukózopyrofosforylázy, ADPG PPázy, v rostlině, která obsahuje funkční ADPG PPázy, vyznačený tím, že zahrnuje zavedení genu kódujícího pouze jeden ze subjektových proteinů heterotetramemí ADPG PPázy (EC. 2.7.7.27), která katalyzuje produkci ADPG v dráze syntézy škrobu, transformací do rostliny, ve které způsobí expresi subjektového genu, vznik subjektového proteinu a zvýšení aktivity enzymu v rostlinných buňkách.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že genem je gen kódující brittle-2 subjektu enzymu ADPG PPázy nebo jeho homolog, který je dostatečně podobný genu brittle-2 a kódující protein, který má stejný biologický účinek na rostlinné buňky.
3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že genem je gen kódující ekvivalentní brittle-2 subjednotkový protein pšenice.
4. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3,vyznačený tím, že se do rostliny rovněž zavedou geny, které jsou schopny snižovat aktivitu jednoho nebo více enzymů rozkládajících škrob.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že geny, které jsou schopné snižovat aktivitu enzymů rozkládajících škrob, snižují aktivitu amylázy (E.C. 3.2.1.1 a E.C. 3.2.1.2) nebo škrobové fosforylázy (E.C. 2.4.1.1).
6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačený tím, že rostlinou je jednoděložná rostlina zvolená ze skupiny zahrnující pšenici, ječmen, žito, kukuřici nebo rýži.
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že rostlinou je dvouděložná rostlina zvolená ze skupiny zahrnující bramboru, rajské jablko, kassavu, hrách setý, fazol obecný nebo podzemnici olejnou.