ES2247590T3 - Modificacion del contenido en almidon de plantas. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE BASA EN EL SORPRENDENTE EFECTO DEL AUMENTO DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMA CUANDO SE INCORPORA A UN VEGETAL UNO DE LOS GENES DE UNA DE LAS PROTEINAS DE SUBUNIDAD DE UNA ENZIMA CATALIZADORA DE ALMIDON. EL METODO TAMBIEN INCLUYE LA INTRODUCCION DE UNO DE LOS GENES DE UNA DE LAS PROTEINAS DE SUBUNIDAD DE UNA PLURALIDAD DE OTRAS ENZIMAS CATALIZADORAS DE LA SINTESIS DEL ALMIDON. EL GEN ES ADECUADAMENTE UN GEN BRITTLE-2. SE MUESTRA EL AUMENTO DE LA ACTIVIDAD DE PPASA ADPG Y TAMBIEN UN AUMENTO EN LA SINTESIS DE ALMIDON.

Description

Modificación del contenido en almidón de plantas.

Esta invención se refiere a la modificación del contenido en almidón de plantas y, en particular, al incremento del contenido en almidón en plantas.

El almidón en un polímero complejo de residuos glucosilo. Es la forma principal en la que se almacena el carbohidrato en los tejidos de la mayoría de las especies de vegetales superiores. Se acumula en las hojas de las plantas durante el día como resultado de la fotosíntesis y se emplea para abastecer las necesidades de la planta en energía y en la biosíntesis por la noche. El almidón también se acumula en tejidos no fotosintéticos, especialmente los implicados en la reproducción, tales como semillas, frutos y tubérculos. Por ello, el almidón tiene gran importancia en la productividad de la planta y en su supervivencia.

El almidón también es muy importante para el hombre. En primer lugar, forma un componente principal de la dieta de animales, suministrando al hombre y a sus animales domésticos una gran parte de su toma de carbohidratos. En segundo lugar, El tipo de almidón en una planta afecta a la calidad del producto procesado por la planta. En tercer lugar, el almidón se emplea industrialmente en la producción de papel, tejidos, plásticos y adhesivos, así como para proporcionar el material en bruto para algunos biorreactores. El almidón de diferentes especies tiene usos preferidos. A escala mundial, los cultivos que producen almidón son, con gran diferencia, los más importantes en tanto a la agricultura y a la economía, y estos cultivos incluyen trigo, maíz, arroz y patatas. La cantidad de almidón presente en el órgano recolectado de una planta, afectará al rendimiento bruto y a la eficacia del procesamiento del cultivo. Además, el tipo de almidón afectará a la calidad de un producto procesado y a la rentabilidad del proceso.

El almidón se sintetiza en los amiloplastos en los vegetales, a partir de la glucosa-1-fosfato (Glc-1-P), tal y como se muestra a continuación.

1

La adenosinadifosfoglucosa pirofosforilasa [EC. 2.7.7.27] (ADPG PPasa) cataliza la primera etapa realizada de la ruta de la biosíntesis del almidón en vegetales. Una enzima similar que cataliza la misma reacción se encuentra en bacterias y en cianobacterias.

La estructura cuaternaria de la enzima es similar en todos los organismos investigados en los que la enzima funcional está compuesta por un tetrámero de subunidades proteicas. En las bacterias, las subunidades proteicas son idénticas y son el producto de un solo gen, p. ej., en E. coli el gen GlgC. En los vegetales, sin embargo, la enzima está compuesta por dos subunidades cada una de dos proteínas diferentes. Aunque estas subunidades con proteínas diferentes muestran similitudes en la secuencia, son el producto de dos genes distintos.

Existen muchos mutantes de vegetales que tienen un contenido menor en almidón en tejidos particulares, comparado con el de los vegetales de tipo silvestre. Estas plantas mutantes son deficientes en la expresión de uno de los genes que codifica las subunidades de la ADPG PPasa. Dos mutaciones particulares observadas en el endospermo de maíz son los mutantes shrunken-2 y brittle-2. Se argumenta que los genes de tipo silvestre para éstos, codifican las dos proteínas de las subunidades de la enzima. Ambas mutaciones causan una disminución de la actividad enzimática de la ADPG PPasa en el endospermo. Partiendo de esta información, se sostiene que ambas subunidades de la enzima son necesarias para la actividad total y que la falta de un tipo particular de subunidad no se puede compensar con la otra subunidad.

Esta invención se basa en el hecho de que sólo uno de los genes para una de las proteínas de las subunidades de una enzima que cataliza la producción de almidón, es necesario para incrementar la actividad enzimática.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para incrementar la actividad de una enzima que cataliza la síntesis de almidón.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una planta que tenga un contenido en almidón más elevado cuando se compara con una planta testigo no tratada de acuerdo con el método de la invención.

También es un objeto de la invención incrementar la tasa de síntesis de almidón bajo condiciones que no conduzcan a un incremento que compense la tasa de descomposición del almidón.

Un aspecto de la presente invención es un método para incrementar la actividad enzimática de la adenosinadifosfoglucosa pirofosforilasa (ADPG PPasa) en una planta que comprende introducir en dicha planta un gen que codifica sólo una de las proteínas de las subunidades de una ADPG PPasa (EC 2.7.7.27) heterotetrámera que cataliza la etapa que produce ADPG en la ruta de la síntesis de almidón, caracterizado porque un gen heterólogo aislado que no sea del endospermo de la cebada, se introduce en dicha planta provocando de este modo la expresión del gen de la subunidad en la planta para producir la proteína de la subunidad y un incremento en la actividad enzimática en las células vegetales.

La presente invención proporciona adicionalmente una planta transformada en la que se ha introducido un gen heterólogo aislado que no sea de endospermo de cebada, que codifica sólo una de las proteínas de las subunidades de una enzima ADPG PPasa heterotetrámera (E.C. 2.7.7.27) que cataliza la ruta de síntesis del almidón, en donde dicha planta transformada expresa el gen para producir la proteína de la subunidad y tiene una actividad ADPG PPasa incrementada en las células vegetales, comparada con una planta no transformada.

El método puede incluir también la introducción de sólo uno de los genes de una de las proteínas de las subunidades de una pluralidad de otras enzimas que catalizan la síntesis de almidón.

La presente invención también proporciona un plásmido que sólo incorpora uno de los genes de una de las proteínas de las subunidades de una enzima que cataliza la síntesis de almidón, en plantas en uso en el método de esta memoria.

Un plásmido o una planta de acuerdo con la invención también puede contener sólo uno de los genes de una de las proteínas de la subunidades de una o de otras enzimas diversas que catalizan la síntesis de almidón en las plantas.

La presente invención también proporciona una célula vegetal en la que se cosecha un plásmido descrito anteriormente y que tiene una actividad enzimática incrementada.

Preferentemente, el gen es el gen brittle-2 o un homólogo del mismo. Por homólogo se entiende un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica o está relacionada muy estrechamente con otra secuencia de nucleótidos. De forma ventajosa el gen es el gen brittle-2 del trigo.

Preferentemente, la planta crece de forma comercial y es cualquiera entre los cultivos de maíz, trigo, arroz, patata, mandioca, cacahuete, judías, zanahorias, tomate o tabaco, por ejemplo.

Preferentemente, la actividad ADPG PPasa se incrementa por el método de la invención.

Un incremento en el contenido de almidón, especialmente en patatas, se puede medir como un incremento en la gravedad específica (S.G., del inglés "specific gravity") de la planta o del tubérculo, por ejemplo.

Preferentemente, el plásmido incorpora un homólogo del gen brittle-2 de una enzima que cataliza la síntesis de almidón. Alternativamente, el plásmido puede incorporar un homólogo del gen shrunken-2 de una enzima que cataliza la síntesis de almidón.

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención y una mayor facilidad de producción, se hace ahora referencia al siguiente Ejemplo y a los dibujos en los que:

la Figura 1a muestra un vector de transformación o un plásmido que contiene el brittle-2,

la Figura 1b muestra un vector de transformación o un plásmido que contiene el gen shrunken-2,

la Figura 2a muestra una transferencia de tipo Southern de ADN extraído de plantas tratadas y de plantas no tratadas,

la Figura 2b muestra una transferencia de tipo Northern de productos de RT-PCR procedentes de plantas tratadas y de plantas no tratadas,

la Figura 3a es un gráfico de la actividad ADPG PPasa frente a líneas que contienen los genes brittle-2 y
shrunken-2,

la Figura 3b es un gráfico de la actividad ADPG PPasa frente a líneas que contienen el gen brittle-2,

la Figura 4 muestra en forma de gráfico la gravedad específica de tubérculos como la frecuencia acumulativa de tubérculos en cuatro clases de actividad ADPG PPasa, para líneas transformadas con los genes brittle-2 y shrunken-2, y

la Figura 5 muestra la síntesis de almidón frente a cuatro líneas con actividad ADPG PPasa diferente.

Las plantas transgénicas de patata se produjeron conteniendo un gen procedente del trigo que es homólogo al gen brittle-2 de maíz. Este gen se conoce, por tanto, como el gen brittle-2 de trigo. Sorprendentemente encontramos que la expresión del gen brittle-2 en plantas de patata transgénicas causaba un incremento de la actividad ADPG PPasa. Parece que es posible incrementar la actividad de esta enzima en la célula expresando sólo una de las dos proteínas de las subunidades requeridas para producir una enzima activa. Cuando la actividad ADPG PPasa es un factor principal para limitar la cantidad de almidón preparado o almacenado en una planta, entonces la expresión sólo de la proteína brittle-2 proporciona un mecanismo para incrementar la cantidad de almidón en el tubérculo y la gravedad específica en el tubérculo, y posiblemente incrementar la cantidad de almidón en cualquier planta que almacena almidón. Esto mejoraría el rendimiento en almidón de la planta y tendría un alto valor comercial.

Las plantas de patata trangénicas transformadas con el gen de la subunidad brittle-2 de la ADPG PPasa de trigo se analizaron para identificar la presencia de la proteína de la subunidad en las plantas transgénicas de patata y el grado de actividad enzimática (ADPG PPasa) en las plantas. La cantidad de almidón en las plantas también se puede determinar. Los métodos convencionales empleados en estos análisis se describen a continuación:

Producción de Plantas de Patatas Transgénicas

Para los fines de la presente invención, se selecciona una secuencia codificadora que cuando se expresa en plantas transgénicas provoca un incremento de la actividad ADPG PPasa. La secuencia codificadora puede proceder de cualquier planta. A modo de ejemplo, se escoge el homólogo de trigo del locus brittle-2 (Ainsworth, C; Tarvis, M; Clark, J. Pl. Mol. Biol. 23 23-33:1993 Aislamiento y análisis de un ADNc que codifica la subunidad pequeña de la ADP-glucosa pirofosforilasa de trigo). Esta se puede insertar en un vector de transformación, tal y como se muestra en la Figura 1a. Este plásmido pFW 4091 se depositó bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes, en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas, el 13 de junio de 1994, con el número de entrada NCIMB40649. El plásmido similar pFW 4151 que contiene la secuencia codificadora de shrunken-2 de la Figura 1b, se depositó el 13 de junio de 1994, con el número de entrada NCIMB40650. El vector puede comprender por tanto uno o varios genes operativos, un gen de un marcador seleccionable y éstos se pueden introducir entre los bordes del T-ADN. Los genes operativos consisten en una secuencia promotora para provocar la expresión del gen en tubérculos o en otros órganos de almacenamiento de almidón, en tejidos o en células, en la secuencia codificadora y en la secuencia de terminación.

Por ello, el vector tiene típicamente secuencias reguladoras de la transcripción y/o, si no está presente en el extremo 3' de la secuencia codificadora del gen, un codón de detención. De este modo, en un fragmento de ADN se puede incorporar también una secuencia terminadora y otras secuencias que sean capaces de permitir que el gen se exprese en células vegetales. Un potenciador u otro elemento capaz de incrementar o de disminuir los niveles de expresión obtenidos en partes particulares de una planta o bajo ciertas condiciones, se puede suministrar en el fragmento de ADN y/o vector. El vector tiene también típicamente un gen de resistencia a antibióticos que confiere resistencia a células vegetales transformadas, permitiendo que las células, los tejidos y las plantas transformadas se seleccionen por el crecimiento sobre medios adecuados que contienen el antibiótico.

Las células vegetales transformadas se pueden seleccionar por el crecimiento en un medio adecuado. Por consiguiente, el tejido vegetal se puede obtener de modo que contenga una célula vegetal en la que se recoge un gen que codifica una enzima bajo el control de un promotor, por ejemplo, en el genoma de la célula vegetal. El gen se puede expresar de este modo en la célula vegetal. De este modo, se pueden regenerar plantas que incluyen el gen y el promotor en sus células, por ejemplo, integrado en el genoma de la célula vegetal de modo que el gen se pueda expresar. Las plantas regeneradas se pueden reproducir y, por ejemplo, se pueden obtener semillas.

Una forma preferida de transformar una célula vegetal es utilizar Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector que comprende un gen quimérico como el anterior. Por consiguiente, se puede emplear un vector plasmídico híbrido, que comprende:

(a)

un gen quimérico que contiene elementos reguladores capaces de permitir la expresión del gen cuando se integra en el genoma de una célula vegetal;

(b)

al menos una secuencia de ADN que define el ADN que se va a integrar en el genoma vegetal; y

(c)

una secuencia de ADN que permite que este ADN se transfiera al genoma de la planta.

Típicamente, el ADN que se va a integrar en el genoma de la célula vegetal está definido por las secuencias bordes del T-ADN de un plásmido Ti. Si sólo está presente una secuencia borde, es preferentemente la secuencia del borde derecho. La secuencia de ADN que permite que el ADN se transfiera al genoma de la célula vegetal es generalmente la región de virulencia (vir) de un plásmido Ti.

Por ello, se puede proporcionar el gen que codifica el polipéptido y sus elementos de control de la transcripción y la traducción, entre los bordes del T-ADN de un plásmido Ti. El plásmido puede ser un plásmido Ti desarmado, al que se han delecionado los genes oncogénicos. El gen y sus elementos de control transcripcional se pueden proporcionar, sin embargo, entre los bordes del T-ADN en un vector binario en trans, con una región vir. Por consiguiente, un vector binario de este tipo comprende:

(a)

el gen quimérico bajo el control de elementos reguladores capaces de permitir que el gen se exprese cuando se integra en el genoma de una célula vegetal; y

(b)

al menos una secuencia de ADN que define el ADN que se va a integrar en el genoma de la planta.

Por consiguiente, se puede utilizar Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector plasmídico híbrido o un vector binario en trans, con un plásmido Ti que posee una región vir, para transformar células vegetales. Se pueden inocular explantes de tejidos, tales como tallos o discos de hojas, con la bacteria. Por otra parte, la bacteria se puede cocultivar con protoplastos de plantas en regeneración. Los protoplastos o los tejidos vegetales también se pueden transformar mediante introducción directa de fragmentos de ADN que codifican la enzima y en los cuales están presentes los elementos de control adecuados de la transcripción y la traducción, o mediante un vector que incorpora un fragmento de este tipo. La introducción directa se puede realizar utilizando electroporación, polietilenglicol, microinyección o bombardeo de partículas.

Se pueden transformar células vegetales de plantas angiospermas, gimnospermas, monocotiledóneas o dicotiledóneas, de acuerdo con la presente invención. Las especies monocotiledóneas incluyen cebada, trigo, maíz y arroz. Las especies dicotiledóneas incluyen algodón, mandioca, lechuga, melón, guisante, petunia, patata, colza, soja, remolacha, girasol, tabaco y tomate. Los cultivares de patata a los que es aplicable la invención incluyen Desirée, Maris Bard, Record, Russet Burbank, Atlantic y Pentland Dell.

Los cultivos de tejidos de células vegetales transformadas se multiplican para regenerar plantas completas transformadas y diferenciadas. Las células vegetales transformadas se pueden cultivar en un medio adecuado, preferiblemente un medio de crecimiento seleccionable. Las plantas se pueden regenerar a partir del callo resultante. De esta forma se obtienen plantas transgénicas cuyas células incorporan el gen quimérico en el genoma, siendo expresable el gen quimérico en las células de las plantas. Se pueden recoger semillas u otros propágulos de las plantas regeneradas para una futura utilización.

Un procedimiento preferido respecto a la variedad de patatas Record y Desirée es el siguiente.

Material vegetal

Cultivos de vástagos de patata se mantienen in vitro en medio Murashige y Skoog (MS) en recipientes Magenta GA-7 a 22ºC (16 h/8 h luz/oscuridad). Estos se subcultivan nodalmente cada 3 semanas.

Se ponen los vástagos in vitro de 5-7,5 cm de altura en tiestos de 6,4 cm de abono Levingtons F1. Se desacostumbrar de una fuente de alimentación en un propagador durante una semana, en una cámara de crecimiento a 18ºC (16 h/8 h luz/oscuridad). El propagador se retira y las plantas se vuelven a poner en macetas de 12,7 cm a las tres semanas. A las 5-7 semanas, las plantas se utilizan para transformación.

Agrobacterium tumefaciens

Se deja crecer durante una noche los cultivos líquidos de cepas adecuadas; p. ej., LBA4404, C58#3, a 28ºC, hasta obtener una DO_{600} de 0,8 en medio L (véase apéndice).

Cocultivo

Se toman las cuatro hojas más jóvenes y expandidas y se esterilizan en superficie en Domestos al 10% (lejía comercial) durante 15 minutos. Las hojas se aclaran abundantemente con agua estéril y a continuación se cortan en discos con un perforacorchos de 7 mm. Los discos se mezclan con el Agrobacterium durante 1-5 minutos, se secan sobre papel de filtro (Whatman nº 1) y a continuación se ponen en un medio de formación de callos (véase apéndice) en placas Petri con ventilación triple de 90 mm, con la epidermis inferior hacia abajo. Las placas Petri con ventilación triple de 90 mm se sellan con cinta adhesiva, se cortan para permitir el intercambio gaseoso y a continuación se incuban a 22ºC (16 h/8 h luz/oscuridad). Los discos se transfieren a un medio de formación de callos más 500 \mug/ml de clarofan y 30 \mug/ml de kanamicina, después de 48 horas. Con esto se eliminan las bacterias y se selecciona las células transformadas.

Regeneración de los vástagos transformados

Después de 1 semana, los discos se transfieren a un medio de formación de vástagos (véase apéndice) que contiene los mismos antibióticos. Se realizan más transferencias en el mismo medio, hasta que se pueden separar los vástagos (normalmente alrededor de 4 semanas). Los vástagos con callos se transfieren a un medio MS con cefotaxima (500 \mug/ml) en recipientes bien ventilados, p. ej., Magenta. Los transformantes se mantienen después de varios pases con cefotaxima para eliminar bacterias, en medio MS. Se pueden separar de las condiciones in vitro, desacostumbrar y dejar crecer hasta la madurez, tal y como se ha descrito para las plantas de reserva. El procedimiento produce plantas de patata transformadas con una frecuencia de hasta 30% de los discos cocultivados.

Apéndice

Medio L	10 g/l de bactotriptona
	5 g/l de extracto de levadura
	5 g/l de cloruro sódico
Medio de formación de callos	MS con sacarosa al 3%
	0,5 mg/l de 2,4-D
	2,5 mg/l de BAP
Medio de formación de vástagos	MS con sacarosa al 3%
	2,5 mg/l de BAP
	1,0 mg/l de GA_{3}

Identificación del gen brittle-2 de trigo y expresión en plantas transgénicas

Se preparó una transferencia de tipo Southern con ADN de patata extraído de líneas transformadas con NCIMB 40649 y líneas transformadas con NCIMB 40649 y NCIMB 40650 juntas. El ADN vegetal extraído se restringió con HindIII y se emplearon 10 \mug de ADN para cada pista del gel de agarosa al 1%. La transferencia se sondó con la secuencia que codifica brittle-2 obtenida a partir del ADN plasmídico restringido con BamHI de NCIMB 40649. La transferencia se hibridó durante una noche a 55ºC en 5xSSC. Después de lavar con un rigor de 0,2xSSC a 55ºC, la transferencia se autorradiografió. El resultado mostrado en la Figura 2a indica que se han introducido entre una y cuatro copias del gen brittle-2 en las plantas.

En la Figura 2a, las pistas 1-4 son del ADN extraído de plantas transformadas con ambos genes brittle-2 y shrunken-2. Las pistas 5-13 muestran el ADN extraído de las líneas transformadas de modo independiente sólo con el gen brittle-2. La pista 14 muestra el ADN de una planta de patata sin transformar.

Para mostrar que el ADN se expresaba como un ARN mensajero, se prepararon cebadores de oligonucleótidos para el procedimiento conocido como RT-PCR, que se realizó sobre un ARNm extraído de tubérculos de plantas de patata transformadas. La RT-PCR se realizó sobre ARNm extraído de material de tubérculos según el método descrito por Shirzadegan y col. (Nucleic Acid Research 19 6055; 1991 Un método eficaz para aislar ARN a partir de células vegetales cultivadas en tejido). El ARNm se trató con ADNasa para eliminar el ADN contaminante. Para la síntesis de la primera cadena, se empleó el cebador ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA a 42ºC durante 100 minutos. Después de separar el ARN con ARNasa, se sintetizó la segunda cadena para obtener un fragmento en el extremo 5' y un fragmento en el extremo 3' del ADNc de brittle-2. Para amplificar el extremo 5', se emplearon los cebadores CCT CGT CAG GGG ATA CAA TCT AGT CCC y CAC CAA CAA AAT TTC GCG GAT CC y para amplificar el extremo 3' se emplearon los cebadores CAG ACC ATG CTA TTT GTT G y ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA. Las condiciones de la amplificación eran 24 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 30 segundos a 50ºC y 3 minutos a 72ºC. Después de separar los productos sobre un gel de agarosa al 1% y una transferencia de tipo Southern, la transferencia se sondó tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados en la Figura 2b muestran que el gen introducido se expresaba como ARNm.

En la Figura 2b, las pistas 1-4, 5-8, 9-12 muestran los productos de la RT-PCR procedentes de tres líneas transformadas con la secuencia de brittle-2. Las pistas con número par muestran reacciones que carecen de transcriptasa inversa para indicar una contaminación con ADN del ARN. Las pistas 1, 2, 5, 6, 9 y 10 muestran la amplificación del extremo 3' y las pistas 3, 4, 7, 8, 11, 12 muestran la amplificación del extremo 5'. Cuando no se utilizó ARN o se usó una planta no transgénica como testigo, no se obtuvo señal.

Producción de antisueros para identificar ADPG PPASA en plantas 1. Preparación de proteínas a partir de vectores de expresión de E. coli

Las células E. coli transformadas con estructuras artificiales para la expresión GEX2T (Pharmacia Ltd), se dejaron crecer del siguiente modo: un matraz 11 que contenía 100 ml de medio LB (10 g/l de triptona; 5 g/l de extracto de levadura; 10 g/l de cloruro sódico (NaCl)) con 100 \mug/ml de ampicilina añadida, se inoculó con 20 \mul de células E. coli y se dejó crecer durante una noche a 37ºC. El cultivo de una noche se transfirió a un matraz 51 que contenía 900 ml de medio LB y se dejó crecer durante 1 hora. Las células fueron inducidas para expresar la proteína de fusión añadiendo isopropil beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta tener una concentración final de 1 mM. Después de crecer durante 4 horas adicionales, las células se recogieron por centrifugación a 7000 rpm durante 10 minutos. Las células sedimentadas se almacenaron a -80ºC antes de la extracción.

Las células sedimentadas se resuspendieron en 90 ml de N-tris(hidroximetil)aminoetano (Tris) 50 mM , NaCl 150 mM, pH 8,0, se colocaron en un vaso de precipitados de vidrio y se sometieron a ultrasonidos durante 45 segundos. Se añadió Triton X-100 hasta tener una concentración final de 1% y el extracto se clarificó por centrifugación durante 20 minutos a 10.000 rpm y 4ºC. Después de centrifugar, se decantó el material sobrenadante en una botella de plástico de 250 ml y se añadieron 2-3 ml de una suspensión al 50% de resina de afinidad de glutatión-sepharosa (Pharmacia Ltd), se equilibró previamente con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0 y la botella se sacudió suavemente durante 1-2 horas a temperatura ambiente. A continuación, se cargó la resina en una columna de 5 ml y se lavó secuencialmente con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 1%, pH 8,0 y a continuación con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0 hasta que no se detectó más proteína en los lavados. La proteína de fusión unida se eluyó entonces de la resina con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, glutatión reducido 5 mM, pH 8,0. Se recogieron fracciones (1 ml) y se analizó el contenido en proteína empleando el ensayo de fijación de colorante de Biorad para proteínas (Bradford, (1976) Analytical Biochemistry, 72, págs. 248-254). Las fracciones que mostraban el pico de proteína se dejaron aumentar antes de análisis adicionales.

2. Producción de antisuero

Una proteína de fusión que consistía en la secuencia de la proteína brittle-2 de trigo, ligada a la glutatión-s-transferasa, se preparó a partir de células E. coli tal y como se ha descrito anteriormente. Esta preparación de proteína se dializó frente a tres cambios de Tris 50 mM, pH 8,0, y se preparó en tres partes alícuotas, una de 100 \mug de proteína y dos de 50 \mug de proteína, en 500 \mul de Tris 50 mM, pH 8,0. La parte alícuota de 100 \mug se mezcló con un volumen igual de coadyuvante completo de Freund y se inyectó por vía subcutánea en el flanco de un conejo blanco de Nueva Zelanda. Cada una de las partes alícuotas de 50 \mug de proteína se mezclaron con un volumen igual de coadyuvante incompleto de Freund y se inyectaron en el mismo conejo 4 y 8 semanas después de la inyección inicial. Se recogió sangre 12 semanas después de la primera inyección y las células se separaron del suero por coagulación y centrifugación. El suero se retuvo y se almacenó a -20ºC.

Identificación de la proteína brittle-2 de trigo en plantas transgénicas

El siguiente procedimiento se empleó para identificar la proteína brittle-2 de trigo, acumulada en tubérculos plantas de patata transformadas.

1. Electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida

La electroforesis de las muestras de proteína se realizó de forma rutinaria, empleando el sistema de Schagger y von Jagow (Analytical Biochemistry (1987), 166, págs. 368-379). Los extractos de proteína se prepararon homogeneizando tejido de tubérculo (50-100 mg) en un tampón de extracción que consistía en ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (Hepes) 50 mM, pH 8,0; ácido etilén diamino tetraacético (EDTA) 10 mM; ditiotreitol 10 mM (DTT). Las muestras de proteínas que contenían hasta 100 \mug de proteína se prepararon por precipitación con acetona, seguido de resuspensión en agua (50 \mul) y 2X tampón de carga de la muestra (50 \mul). Las muestras se hirvieron durante 60 segundos antes de cargarlas sobre el gel y se sometieron a electroforesis a 50-60 V (constante) durante aproximadamente 20 horas. 2X el tampón de carga de la muestra consistía en Tris 100 mM, pH 6,8; 8% (p/v) de dodecilsulfato sódico (SDS); 24% (p/v) del gicerol; 4% (v/v) de betamercaptoetanol; 0,020 (p/v) de azul de Coomassie.

2. Electrotransferencia de las proteínas

Las proteínas separadas por electroforesis en gel de SDS y poliacrilamida se transfirieron a una membrana de PVDF Immobilon-P (Millipore) mediante electrotransferencia. La membrana, el papel Whatman de 3 mm y las esponjas se equilibraron previamente en tampón de transferencia (Tris 25 mM; glicina 192 mM; 20% de metanol; pH 8,3) antes del uso. Los geles se situaron en estrecho contacto con la membrana y se ensamblaron en casetes de transferencia en la disposición específica especificada en las instrucciones del fabricante. Las casetes se situaron sobre un tanque de electrotransferencia que contenía tampón de transferencia y se facilitó la transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana, aplicando 50 V a 4ºC durante 3-4 horas. La transferencia se vigiló empleando marcadores del peso molecular con proteínas teñidas previamente (Sigma Chemical Co.).

3. Inmunodetección de las proteínas inmovilizadas

Las proteínas específicas se detectaron sobre membranas Immobilon-P empleando anticuerpos producidos contra las proteínas expresadas en E. coli. Las membranas se tomaron directamente desde el tanque de electrotransferencia y se situaron sobre una placa de vidrio. Las membranas se lavaron brevemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS, dihidrógeno fosfato sódico (NaH_{2}PO_{4}) 10 mM; NaCl 150 mM; pH 7,2) y los sitios restantes de unión a proteínas se bloquearon tratando con seroalbúmina bovina (BSA) al 4% (p/v) en PBS, durante 30 minutos. A continuación, se estimularon las membranas con anticuerpo primario con una dilución adecuada (típicamente, 1/1000-1/10000 (v/v)) en PBS que contenía 4% de BSA, durante 16 horas a temperatura ambiente y con sacudidas suaves. El exceso de anticuerpo primario se retiró lavando las membranas con diversas cargas de PBS. Las membranas se trataron a continuación con 20-40 \mul de IgG anti-conejo (inmunoglobulina G) conjugada con fosfatasa alcalina en hasta 200 ml de PBS que contenía 2% (p/v) de BSA durante 2-3 horas. El conjugado no ligado se retiró después de la incubación, lavando con diversas cargas de 1% (v/v) de Triton X-100 en PBS. Las membranas se lavaron a continuación brevemente con tampón de dietanolamina 100 mM, pH 9,8 y se revelaron incubando con una mezcla de reacción de fosfatasa alcalina (nitroazul de tetrazolio 120 \muM, 5-bromo-4-cloroindolil fosfato 135 \muM; cloruro de magnesio 4 mM (MgCl_{2}); dietanolamina 100 mM; pH 9,8). Se permitió que tuviera lugar la reacción y se visualizaron bandas púrpura-azules, generalmente después de 15-30 minutos. La reacción se detuvo lavando las membranas con agua de ósmosis inversa (RO). Las membranas se dejaron secar boca abajo sobre papel de filtro y se almacenaron en la oscuridad.

Ensayo de ADPG PPASA en patatas transgénicas 1. Preparación de los extractos

El tejido de tubérculo de patata, 2-3 g, se homogeneizó con 3 ml de tampón de extracción (Hepes 50 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM; DTT 10 mM; 10% (p/v) de BSA) empleando un mortero. El extracto se clarificó por centrifugación. Para desalar el extracto, se cargaron 2,5 ml del extracto clarificado sobre una columna de filtración en gel PD10 (Pharmacia Ltd), equilibrada previamente con tampón de extracción y se eluyó con 3,5 ml de tampón de extracción. Esta preparación se tomó para el ensayo de la enzima.

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NADH se detectó espectrofotométricamente a 25ºC y 340 nm.

En una cubeta de plástico, con un volumen final de 1 ml, se tomaron:

Hepes 40 mM, pH 8,0

Cloruro de magnesio 10 mM (MgCl_{2})

Pirofosfato tetrasódico 1 mM (Na_{4}P_{2}O_{7})

Dinucleótido de nicotinamida y adenina 0,4 mM (NAD)

4 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

2 unidades de fosfoglucomutasa

glucosa-1,6-difosfato 24 \muM (Glc-1,6-P_{2})

hasta 300 \mul de extracto.

La reacción se inició añadiendo adenosinadifosfoglucosa hasta una concentración final de 0,8 mM.

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Análisis de la gravedad específica de patatas transgénicas

Se pesaron tubérculos completos al aire y en agua. La gravedad específica se calculó como:

\frac{\text{peso al aire}}{\text{peso al aire - peso en agua}}

Análisis del contenido en almidón de patatas transgénicas

Se extrajo tejido del tubérculo (40-70 mg) en 500 \mul de HClO_{4} al 45%. Una parte alícuota de este extracto (50 \mul) se preparó en 1 ml con Hepes 400 mM, pH 8,0 y a continuación se dividió en dos partes de 500 \mul que se prepararon ambas hasta 1 ml, añadiendo Hepes 400 mM, pH 8,0. A continuación, se añadió a una parte 100 unidades de alfa-amilasa y 7 unidades de amiloglucosidasa, a la otra parte no se añadieron enzimas y ambas se dejaron reposar durante una noche, antes del ensayo de la glucosa.

El ensayo de la glucosa se realizó espectrofotométricamente a 25ºC y 340 nm. En una cubeta de plástico se tomó hasta tener un volumen final de 1 ml:

Hepes 100 mM, pH 8,0

MgCl_{2} 4 mM

NAD 4 mM

Adenosina trifosfato (ATP) 3 mM

3 unidades de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc (Boehringer Mannheim)

500-300 microlitros de digestión de almidón.

La reacción se inició con 0,3 unidades de hexoquinasa de levadura (Boehringer Mannheim).

La cantidad de almidón presente en el tejido de patata se puede calcular a partir de la cantidad de glucosa medida en el ensayo.

Los siguientes resultados se obtuvieron empleando los métodos anteriores.

1. Reconocimiento de proteínas con antisuero anti-Brittle-2 en extractos de patata y de trigo

Los extractos de tubérculo de patata y de tejido del endospermo de trigo se prepararon según los métodos. Se tomaron partes alícuotas que contenían 100 \mug de proteína y se analizaron sobre geles de SDS-PAGE, tal y como se ha descrito, se transfirieron y se estimularon con el antisuero anti-brittle-2. Con una dilución de 1/10000, sólo se detectó una banda de proteína en las calles correspondientes a los extractos de trigo y de patata. Además, la banda de la patata se distinguía de la banda del trigo debido a que tenían diferentes tamaños. En un tercer extracto, preparado a partir de tejido de trigo y de patata, se distinguían dos bandas, correspondientes a los tamaños de las bandas observadas en los extractos individuales de trigo y de patata.

2. Detección de proteínas en tubérculos de plantas de patata transformados con la secuencia génica del gen brittle-2 de trigo

Las plantas de patata se transformaron según el método de cocultivo de discos de hojas con Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pFW 4091, que contenía el ADN que codifica el gen de trigo de la proteína brittle-2 del trigo. Además, las plantas se transformaron empleando el mismo método y una combinación de Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pFW 4151 que contenía el ADN que codifica el gen de trigo para la proteína shrunken-2 de trigo y Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pFW 4091 que contenía el ADN que codifica el gen de trigo para la proteína brittle-2 de trigo. El plásmido pFW 4091 se depositó con el número de entrada NCIMB 40649 y el plásmido pFW 4151 se depositó con el número de entrada NCIMB 40650, tal y como se ha descrito anteriormente. Los tubérculos de patata procedentes de plantas que se habían transformado con el ADN que codifica el gen de trigo para la proteína brittle-2 de trigo, se analizaron en busca de expresión del gen mediante transferencia de tipo Western, tal y como se ha descrito en los métodos, empleando el anticuerpo preparado contra la proteína de fusión brittle-2/glutatión-s-transferasa. De forma similar, se analizaron tubérculos de líneas que se habían transformado con brittle-2 y shrunken-2 de trigo. Tal y como se ha descrito en la sección 1 anterior, este antisuero reconoce una sola proteína en el trigo y una sola proteína en la patata que se distinguen entre sí basándose en su tamaño. De este modo se seleccionaron líneas que sólo expresaban la proteína brittle-2 de trigo. En los tubérculos de estas líneas se sometió a ensayo la actividad de la ADPG PPasa y el contenido en almidón, tal y como se ha descrito en los métodos, y se comparó con las actividades y los contenidos en almidón de los tubérculos testigos.

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Se analizaron cincuenta líneas de tubérculos tratados de acuerdo con el método inventivo y se compararon con cincuenta líneas de tubérculos testigos (no tratados). Las Figuras 3a y 3b muestran una selección de los límites extremos de la actividad de la ADPG PPasa (nanomoles por minuto por gramo de peso fresco) observados en líneas que contenían el gen quimérico de brittle-2 y shrunken-2 (Figura 3a) y en líneas que contenían el gen quimérico de brittle-2 (Figura 3b). Creemos que estas líneas muestran una actividad ADPG PPasa significativamente superior a la de los tubérculos testigos.

La Figura 4 muestra en forma gráfica la gravedad específica de los tubérculos como la frecuencia acumulativa de los tubérculos en cuatro clases de actividad ADPG PPasa, para líneas transformadas con brittle-2 y shrunken-2. Un análisis similar para las líneas transformadas sólo con brittle-2, proporciona el siguiente cambio en el valor medio de la población:

		Gravedad específica Media
transgénica con brittle-2	línea 153	1,09
transgénica con brittle-2	línea 32	1,095
Testigo	línea 16	1,087
Testigo	línea 28	1,087
Testigo	línea 38	1,089

Creemos que esta producción incrementada de ADPG PPasa también conducirá a un incremento en el contenido de almidón en las plantas, tal y como se ha medido con el método descrito anteriormente, cuando se dejan crecer bajo condiciones adecuadas o cuando se introducen otros genes adecuados (véase a continuación).

Medición de la síntesis y del recambio del almidón

Para determinar el efecto del cambio de la actividad sobre la síntesis de almidón, se proporcionó sacarosa radiomarcada a tubérculos en desarrollo de plantas transgénicas con una actividad ADPG PPasa incrementada. El almidón se extrajo tal y como se ha descrito anteriormente y se determinó la radiactividad mediante recuento del centelleo. Una línea transformada con el gen brittle-2con una actividad ADPG PPasa elevada, se comparó con una línea testigo y proporcionó los siguientes resultados:

	% del total de cuentas incorporadas en el almidón
	media	sem
línea brittle-2	0,52	0,37
línea testigo	0,30	0,18
sem = error típico de la media

Para confirmar esta observación, se empleó un experimento adicional con cuatro líneas que mostraban actividades diferentes de ADPG PPasa (véase la Figura 5). Los resultados en la Figura 5, muestran que el almidón se sintetiza más rápidamente pero muestra que, bajo ciertas condiciones, el almidón se destruye más rápidamente. Por ello, sugerimos que esto muestra que para que la invención sea aplicable de forma universal, es necesario introducir genes funcionales para incrementar la actividad ADPG PPasa y genes funciones para disminuir la actividad amilasa (EC 3.2.1.1 y EC 3.2.1.2) y fosforilasa del almidón (EC 2.4.1.1).

Claims (19)

1. Un método para incrementar la actividad enzimática de la adenosina-difosfoglucosa pirofosforilasa (ADPG PPasa) en una planta que comprende introducir en dicha planta un gen que codifica sólo una de las proteínas de las subunidades de una ADPG PPasa heterotetrámera (EC. 2.7.7.27) que cataliza la etapa de producción de ADPG en la ruta de la síntesis de almidón, caracterizado porque un solo gen heterólogo que codifica sólo una de las proteínas de las subunidades de la ADPG PPasa (EC. 2.7.7.27) heterotetrámera que no proviene del endospermo de la cebada, se introduce en dicha planta causando de este modo la expresión del gen de la subunidad en la planta para producir la proteína de la subunidad y un incremento de la actividad enzimática en las células vegetales.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde el gen es el gen que codifica la proteína de la subunidad brittle-2 o es un gen equivalente en el locus que codifica la proteína de la subunidad brittle-2.

3. Un método según la reivindicación 1, en donde el gen es el gen equivalente de trigo en el locus que codifica la proteína de la subunidad brittle-2.

4. Un método según las reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde también se introducen en la planta genes funcionales para disminuir la actividad de las enzimas que degradan el almidón.

5. Un método según la reivindicación 4, en donde los genes funcionales para disminuir la actividad de las enzimas que degradan el almidón, disminuyen la actividad de la amilasa (E.C. 3.2.1.1 y E.C. 3.2.1.2) o de la fosforilasa del almidón (E.C. 2.4.1.1).

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se incrementa el contenido en almidón de la planta.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la planta es una monocotiledónea seleccionada entre el grupo que comprende trigo, cebada, centeno, maíz o arroz.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la planta es una dicotiledónea seleccionada entre el grupo que comprende la patata, el tomate, la mandioca, el cacahuete, la judía o el guisante.

9. Un método según la reivindicación 8, en donde el contenido en almidón de un tubérculo de patata está incrementado.

10. Una planta transformada en la que se ha introducido un solo gen heterólogo que no proviene del endospermo de la cebada, que codifica sólo una de las proteínas de las subunidades de una enzima ADPG PPasa heterotetrámera (E.C. 2.7.7.27), que cataliza la ruta de la síntesis del almidón, en donde dicha planta transformada expresa el gen para producir la proteína de la subunidad y tiene una actividad ADPG PPasa incrementada en las células vegetales, comparada con una planta no transformada.

11. Una planta según la reivindicación 10, en donde dicho gen es el gen que codifica la proteína de la subunidad brittle-2 o es un gen equivalente en el locus que codifica la proteína de la subunidad brittle-2.

12. Una planta según la reivindicación 11, en donde dicho gen es el gen equivalente del trigo en el locus que codifica la proteína de la subunidad brittle-2.

13. Una planta según la reivindicación 10, 11 o 12 y que comprende adicionalmente uno de los genes de una de las proteínas de las subunidades de una pluralidad de otras enzimas que catalizan la síntesis del almidón.

14. Una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha planta tiene un contenido en almidón incrementado.

15. Una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 y que es monocotiledónea, seleccionada entre el grupo que comprende el trigo, la cebada, el centeno, el maíz o el arroz.

16. Una planta según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 y que es una dicotiledónea seleccionada entre el grupo que comprende la patata, el tomate, la mandioca, el cacahuete, la judía o el guisante.

17. Una planta según la reivindicación 16, en donde un tubérculo de patata tiene un contenido en almidón incrementado.

18. Un plásmido que tiene el nº de NCIMB 40649, en donde el gen es el gen equivalente del trigo en el locus que codifica la subunidad brittle-2 para la enzima ADPG PPasa.

19. Un plásmido que tiene el nº de NCIMB 40650, en donde el gen es el gen equivalente del trigo en el locus que codifica la subunidad shrunken-2 para la enzima ADPG PPasa.