DE69534467T2

DE69534467T2 - Modifikation des starke-gehalts in pflanzen

Info

Publication number: DE69534467T2
Application number: DE69534467T
Authority: DE
Inventors: Meyrick Michael BURRELL; Andrew Stephen COATES; Freddie Alfhous Milton WEIR
Original assignee: Advanced Technologies Cambridge Ltd
Current assignee: Advanced Technologies Cambridge Ltd
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-06
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2015-06-07
Also published as: US6486383B1; BR9508700B1; EP0772682B9; CZ290714B6; PL185155B1; MX9606422A; PL317836A1; EP0772682A1; AU711602B2; ATE305043T1; DE69534467D1; DK0772682T3; ES2247590T3; AU2625895A; WO1995034660A1; GB9412018D0; CZ366896A3; US6096945A; CA2192195A1; BR9508700A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf die Modifikation des Stärkegehalts von Pflanzen und besonders auf die Steigerung des Stärkegehalts in Pflanzen.
Stärke ist ein komplexes Polymer aus Glucosylresten. Sie ist die Hauptform, in welcher Kohlenhydrate in den Geweben der meisten Arten höherer Pflanzen gelagert werden. Sie wird in den Blättern von Pflanzen während des Tages als ein Ergebnis der Photosynthese akkumuliert und wird verwendet, um die Bedürfnisse der Pflanze nach Energie und Biosynthese während der Nacht zu befriedigen. Stärke wird ebenfalls in nicht photosynthetischen Geweben akkumuliert, insbesondere in jenen, die in die Reproduktion involviert sind, wie Samen, Früchte und Knollen. Deshalb ist Stärke von höchster Bedeutung für die Produktivität der Pflanze und ihr Überleben.
Stärke ist ebenfalls äußerst wichtig für den Menschen. Erstens bildet sie einen Hauptbestandteil tierischer Diäten, wodurch der Mensch und seine Haustiere mit einem großen Teil ihrer Kohlenhydrataufnahme versorgt werden. Zweitens beeinflusst der Stärketyp in einer Pflanze die Qualität des verarbeiteten Pflanzenproduktes. Drittens wird Stärke industriell bei der Produktion von Papier, Textilen, Plastik und Klebstoffen verwendet, ebenso wie sie das Rohmaterial für gewisse Bioreaktoren bereitstellt. Stärke von verschiedenen Arten haben bevorzugte Verwendungen. Auf einer Werteskala sind Stärke produzierende Feldfrüchte landwirtschaftlich und ökonomisch bei weitem die wichtigsten und diese Feldfrüchte schließen Weizen, Mais, Reis und Tomaten ein. Die in dem geernteten Organ einer Pflanze vorhandene Stärkemenge wird den Rohertrag und die Verarbeitungseffizienz der Feldfrucht beeinflussen. Zusätzlich wird der Stärketyp die Qualität eines verarbeiteten Produktes und die Rentabilität des Prozesses beeinflussen.
Stärke wird in Amyloplasten in Pflanzen aus Glucose-1-phosphat (Glc-1-P) synthetisiert, wie unten gezeigt.
Adenosindiphosphoglucose-Pyrophosphorylase [EC.2.7.7.27] (ADPG-PPase) katalysiert den ersten begangenen Schritt auf dem Weg der Stärkebiosynthese in Pflanzen. Ein ähnliches Enzym, das dieselbe Reaktion katalysiert, wird in Bakterien und Cyanobakterien gefunden.
Die Quartärstruktur des Enzyms ist in sämtlichen untersuchten Organismen dahingehend ähnlich, dass das funktionelle Enzym aus einem Tetramer aus Untereinheitenproteinen zusammengesetzt ist. In Bakterien sind die Untereinheitenproteine identisch und das Produkt eines einzelnen Gens, z. B. in E.coli des GlgC-Gens. In Pflanzen ist das Enzym jedoch aus je zwei von je zwei verschiedenen Untereinheitenproteinen zusammengesetzt. Wenn diese unterschiedlichen Untereinheitenproteine auch Sequenzähnlichkeiten zeigen, sind sie doch das Produkt von zwei verschiedenen Genen.
Es gibt viele Pflanzenmutanten, die einen geringeren Stärkegehalt in bestimmten Geweben im Vergleich mit jenen von Wildtyppflanzen haben. Diese mutierten Pflanzen sind bei der Expression eines der Gene, die für die Untereinheiten der ADPG-PPase kodieren, mangelhaft. Zwei bestimmte, in Maisendosperm beobachtete Mutationen, sind die Mutanten shrunken-2 und brittle-2. Es wird argumentiert, dass die Wildtypgene für diese die beiden Untereinheitenproteine des Enzyms kodieren. Beide Mutationen bewirken eine reduzierte Enzymaktivität der ADPG-PPase in dem Endosperm. Es wird aus dieser Information argumentiert, dass beide Untereinheiten des Enzyms für die volle Aktivität erforderlich sind und dass das Fehlen eines bestimmten Untereinheitentyps nicht durch die andere Untereinheit kompensiert werden kann.
Diese Erfindung ist auf der Tatsache basiert, dass nur eines der Gene für eine der Untereinheitenproteine eines die Stärkeproduktion katalysierenden Enzyms erforderlich ist, um die Enzymaktivität zu steigern.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Steigerung der Aktivität eines die Stärkesynthese katalysierenden Enzyms bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Pflanze mit einem erhöhten Stärkegehalt bereitzustellen, wenn sie mit einer Kontrollpflanze verglichen wird, die nicht in Übereinstimmung mit dem erfinderischen Verfahren behandelt worden ist.
Es ist ebenfalls ein Ziel der Erfindung, die Rate der Stärkesynthese unter Bedingungen zu steigern, welche nicht zu einer kompensierenden Zunahme der Rate des Stärkeabbaus führen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Steigern der Enzymaktivität der Adenosindiphosphoglucose-Pyrophosphorylase (ADPG-PPase) in einer Pflanze, umfassend das Einführen eines Gens in diese Pflanze, das nur eines der Untereinheitenproteine einer heterotetramären ADPG-PPase (EC 2.7.7.27) kodiert, die den Schritt katalysiert, bei dem ADPG in dem Stärkesyntheseweg produziert wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein einzelnes heterologes Gen, das nicht aus Gerstenendosperm stammt, in diese Pflanze eingeführt wird, wodurch Expression des Untereinheitengens in der Pflanze verursacht wird, um das Untereinheitenprotein zu produzieren, und wodurch eine Steigerung in der Enzymaktivität in der Pflanzenzelle bewirkt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine transformierte Pflanze bereit, in welche ein einzelnes heterologes Gen eingeführt worden ist, das nicht von Gerstenendosperm stammt, welches nur eines der Untereinheitenproteine eines heterotetramären ADPG-PPase-Enzyms (E.C. 2.7.7.27) kodiert, das den Weg der Stärkesynthese katalysiert, wobei die transformierte Pflanze das Gen exprimiert, um die Untereinheit zu produzieren, und eine erhöhte ADPG-PPase-Aktivität in den Pflanzenzellen im Vergleich mit einer nichttransformierten Pflanze hat.
Das Verfahren kann ebenfalls das Einführen von nur einem der Gene von einem der Untereinheitenproteine in einer Vielzahl von anderen Enzymen, die Stärkesynthese katalysieren, einschließen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Plasmid, das nur eines der Gene von einem der Untereinheitenproteine eines die Stärkesynthese katalysierenden Enzyms in Pflanzen, die bei dem Verfahren hiervon in Verwendung sind, einbaut, bereit.
Ein Plasmid oder eine Pflanze gemäß der Erfindung kann ebenfalls nur eines der Gene von einem der Untereinheitenproteine von einem oder mehreren anderen Enzymen, die Stärkesynthese in den Pflanzen katalysieren, enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Pflanzenzelle, die ein oben beschriebenes Plasmid beherbergt und die eine gesteigerte Enzymaktivität hat, bereit.
Bevorzugt ist das Gen das brittle-2-Gen oder ein Homolog davon. Mit Homolog wird eine Nucleinsäure gemeint, die eine Nucleotidsequenz hat, die identisch ist mit einer anderen Nucleotidsequenz oder sehr eng mit einer solchen verwandt ist. Vorteilhafterweise ist das Gen das Weizen-brittle-2-Gen.
Vorzugsweise wird die Pflanze kommerziell wachsen gelassen und ist irgendeine Feldfrucht unter Mais, Weizen, Reis, Kartoffel, Maniok, Erdnuss, Bohnen, Karotten, Tomate oder Tabak zum Beispiel.
Bevorzugt wird die ADPG-PPase-Aktivität durch das Verfahren der Erfindung gesteigert.
Eine Zunahme im Stärkegehalt, besonders in Kartoffeln, kann als eine Zunahme im spezifischen Gewicht (S.G.) der Pflanze oder Knolle, zum Beispiel, gemessen werden.
Vorzugsweise schließt das Plasmid ein Homolog des brittle-2-Gens eines Enzyms ein, das Stärkesynthese katalysiert. Alternativ kann das Plasmid ein Homolog des shrunken-2-Gens eines die Stärkesynthese katalysierenden Enzyms einschließen.
Um die vorliegende Erfindung leicht zu verstehen und leicht ausführen zu können, wird nun auf die folgenden Beispiele und die Zeichnungen Bezug genommen werden, in welchen:
1a einen Transformationsvektor oder ein Plasmid zeigt, das das brittle-2-Gen enthält,
1b einen Transformationsvektor oder ein Plasmid zeigt, das das shrunken-2-Gen enthält,
2a einen Southern-Blot einer aus behandelten und unbehandelten Pflanzen extrahierten DNS zeigt,
2b einen Northern-Blot von RT-PCT-Produkten aus behandelten und unbehandelten Pflanzen zeigt,
3 eine Grafik der ADPG-PPase-Aktivität im Vergleich von Linien, die die brittle-2- und shrunken-2-Gene enthalten, ist,
3b eine Grafik der ADPG-PPase-Aktivität im Vergleich von Linien, die das brittle-2-Gen enthalten, ist,
4 in grafischer Form das spezifische Gewicht von Knollen als die kumulative Häufigkeit von Knollen in vier Klassen an ADPG-PPase-Aktivität für Linien, die mit brittle-2- und shrunken-2-Genen transformiert worden sind, zeigt und
5 Stärkesynthese im Vergleich von vier Linien mit unterschiedlicher ADPG-PPase-Aktivität zeigt.
Transgene Kartoffelpflanzen wurden produziert, die ein Gen aus Weizen enthalten, welches zu dem brittle-2-Gen in Mais homolog ist. Dieses Gen ist folglich als das Weizen-brittle-2-Gen bekannt. Wir fanden heraus, dass überraschenderweise die Expression des brittle-2-Gens in transgenen Kartoffelpflanzen eine Zunahme in der ADPG-PPase-Aktivität bewirkte. Es scheint deshalb möglich, die Aktivität dieses Enzyms in der Zelle zu steigern, indem nur eines der beiden Untereinheitenproteine, die erforderlich sind, um ein aktives Enzym zu machen, exprimiert wird. Wenn die Aktivität der ADPG-PPase ein Hauptfaktor beim Begrenzen der Menge der in einer Pflanze hergestellten oder eingelagerten Stärke ist, dann stellt die Expression von nur dem brittle-2-Protein einen Mechanismus zur Steigerung der Stärkemenge in der Knolle und dem spezifischen Gewicht in der Knolle und möglicherweise der Menge an Stärke in jeder Pflanze, die Stärke einlagert, bereit. Dies würde die Ausbeute an Stärke aus der Pflanze verbessern und wäre von großem kommerziellem Wert.
Die mit dem Gen für die brittle-2-Untereinheit der ADPG-PPase aus Weizen transformierten transgenen Kartoffelpflanzen wurden analysiert, um die Anwesenheit des Untereinheitenproteins in den transgenen Kartoffelpflanzen zu identifizieren und den Grad an Enzymaktivität (ADPG-PPase) in den Pflanzen. Die Stärkemenge in den Pflanzen kann ebenfalls bewertet werden. Die bei diesen Analysen verwendeten Standardverfahren werden unten beschrieben:
Produktion von transgenen Kartoffelpflanzen
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird eine kodierende Sequenz ausgewählt, welche, wenn sie in transgenen Pflanzen exprimiert wird, eine Zunahme in der ADPG-PPase-Aktivität bewirkt. Die kodierende Sequenz kann aus jeder Pflanze stammen. Für den Zweck des Beispiels wird das Weizenhomolog des brittle-2-Genorts ausgewählt. (C. Ainsworth; M. Tarvis; J. Clark, Pl. Mol. Biol. 23: 23–33; 1993, Isolation and analysis of a cDNA encoding the small subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase from wheat). Dieses kann in einen Transformationsvektor, wie in 1a gezeigt, inseriert werden. Dieses Plasmid pfW4091 wurde unter dem Budapester Vertrag für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria am 13. Juni 1994 unter der Zugangsnummer NCIMB40649 hinterlegt. Das ähnliche Plasmid pfW 4151, enthaltend die shrunken-2-Kodiersequenz, 1b, wurde am 13. Juni 1994 unter der Zugangsnummer NCIMB40650 hinterlegt. Der Vektor kann deshalb eines oder mehrere funktionsfähige Gene, ein selektierbares Markergen enthalten und diese können zwischen die T-DNS-Grenzen eingefügt werden. Die funktionsfähigen Gene bestehen aus einer Promotersequenz, um die Expression des Gens in Knollen oder anderen stärkespeichernden Organen, Geweben oder Zellen zu bewirken, der kodierenden Sequenz und der Terminatorsequenz.
Der Vektor wird deshalb typischerweise mit Transkriptionsregulationssequenzen und/oder, falls nicht an dem 3'-Ende der kodierenden Sequenz des Gens vorhanden, einem Stoppkodon bereitgestellt. Ein DNS-Fragment kann deshalb ebenfalls eine Terminatorsequenz und andere Sequenzen, die in der Lage sind, dem Gen zu ermöglichen, dass es in Pflanzenzellen exprimiert wird, einschließen. Ein Enhancer oder ein anderes Element, das in der Lage ist, die Expressionsspiegel, die in bestimmten Teilen einer Pflanze oder unter bestimmten Bedingungen erhalten werden, zu steigern oder zu reduzieren, kann in dem DNS-Fragment und/oder Vektor bereitgestellt werden. Der Vektor wird ebenfalls typischerweise mit einem Antibiotikaresistenzgen bereitgestellt, welches transformierten Pflanzenzellen Resistenz verleiht, wodurch es transformierten Zellen, Geweben und Pflanzen ermöglicht wird, dass sie durch das Wachstum auf geeigneten, das Antibiotikum enthaltenden Medien selektiert werden können.
Transformierte Pflanzenzellen können durch Wachstum in einem geeigneten Medium selektiert werden. Pflanzengewebe können deshalb gewonnen werden, die eine Pflanzenzelle umfassen, welche ein Gen trägt, das ein Enzym unter der Kontrolle eines Promotors kodiert, zum Beispiel in dem Pflanzenzellgenom. Das Gen ist deshalb in der Pflanzenzelle exprimierbar. Pflanzen können dann regeneriert werden, die das Gen und den Promoter in ihren Zellen einschließen, zum Beispiel in das Pflanzenzellgenom so integriert, dass das Gen exprimiert werden kann. Die regenerierten Pflanzen können fortgepflanzt werden und es kann zum Beispiel Samen gewonnen werden.
Ein bevorzugter Weg, eine Pflanzenzelle zu transformieren, ist, Agrobacterium tumefaciens zu verwenden, das einen Vektor enthält, der ein chimäres Gen, wie oben, umfasst. Ein Hybridplasmidvektor kann deshalb genutzt werden, der Folgendes umfasst:

(a) ein chimäres Gen, das regulatorische Elemente enthält, die in der Lage sind, es dem Gen zu ermöglichen, dass es exprimiert wird, wenn es in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird;
(b) wenigstens eine DNS-Sequenz, die die in das Pflanzengenom zu integrierende DNS darstellt; und
(c) eine DNS-Sequenz, die es dieser DNS ermöglicht, dass sie in das Pflanzengenom übertragen wird.

Typischerweise wird die in das Pflanzenzellgenom zu integrierende DNS durch die T-/DNS-Grenzsequenzen eines Ti-Plasmids dargestellt. Falls nur eine Grenzsequenz vorhanden ist, ist es bevorzugt die rechte Grenzsequenz. Die DNS-Sequenz, die es der DNS ermöglicht, dass sie in das Pflanzenzellgenom übertragen wird, ist allgemein die Virulenzregion (vir-Region) eines Ti-Plasmids.
Das für das Polypeptid und seine Transkriptions- und Translationskontrollelemente kodierende Gen kann deshalb zwischen den T-DNS-Grenzen eines Ti-Plasmids bereitgestellt werden. Das Plasmid kann ein entwaffnetes Ti-Plasmid sein, aus welchem die Gene für die Tumorigenität deletiert worden sind. Das Gen und seine Transkriptionskontrollelemente können jedoch zwischen T-DNS-Grenzen in einem binären Vektor in trans mit einem Ti-Plasmid mit einer vir-Region bereitgestellt werden. Solch ein binärer Vektor umfasst deshalb:

(a) das chimäre Gen unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, die in der Lage sind, es dem Gen zu erlauben, exprimiert zu werden, wenn es in das Genom einer Pflanzenzelle integriert wird; und
(b) wenigstens eine DNS-Sequenz, die die in das Pflanzengenom zu integrierende DNS darstellt.

Agrobacterium tumefaciens, das einen Hybridplasmidvektor oder einen binären Vektor in trans mit einem Ti-Plasmid, das eine vir-Region besitzt, enthält, kann deshalb verwendet werden, um Pflanzenzellen zu transformieren. Gewebeexplantate, wie Stämme oder Blattscheiben können mit dem Bakterium inokuliert werden. Alternativ kann das Bakterium mit regenerierenden Pflanzenprotoplasten cokultiviert werden. Pflanzenprotoplasten oder -gewebe können ebenfalls durch direktes Einführen von DNS-Fragmenten transformiert werden, welche das Enzym kodieren und in welchen die geeigneten Transkriptions- und Translationskontrollelemente vorhanden sind, oder durch einen Vektor, der solch ein Fragment einschließt. Das direkte Einführen kann unter Verwendung von Elektroporation, Polyethylenglykol, Mikroinjektion oder der Partikelkanone erreicht werden.
Pflanzenzellen aus angiospermen, gymnospermen, monocotyledonen oder dicotyledonen Pflanzen können gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden. Monocotyledone Arten schließen Gerste, Weizen, Mais und Reis ein. Dicotyledone Arten schließen Baumwolle, Maniok, Salat, Melone, Erbse, Petunie, Kartoffel, Raps, Sojabohne, Zuckerrübe, Sonnenblume, Tabak und Tomate ein. Kartoffelkulturformen, für welche die Erfindung anwendbar ist, schließen Desiree, Maris Bard, Record, Russet Burbank, Atlantic und Pentland Dell ein.
Gewebekulturen transformierter Pflanzenzellen werden fortgepflanzt, um differenzierte, transformierte Gesamtpflanzen zu regenerieren. Die transformierten Pflanzenzellen können auf einem geeigneten Medium, bevorzugt einem Selektionswachstumsmedium, kultiviert werden. Pflanzen können aus dem resultierenden Kallus regeneriert werden. Es werden dabei transgene Pflanzen gewonnen, deren Zellen das chimäre Gen in dem Genom einbauen, wobei das chimäre Gen in den Zellen der Pflanzen exprimierbar ist. Samen oder andere Fortpflanzungseinheiten aus den regenerierten Pflanzen können für die zukünftige Verwendung gesammelt werden.
Ein bevorzugtes Vorgehen in Hinblick auf die Kartoffelvarietäten Record und Desiree ist wie folgt.
Pflanzenmaterial
Kartoffelschösslingskulturen werden in vitro auf Murashige-und-Skoog- (MS-)Medium in Magenta-Ga-7-Behältern bei 22 °C (16h/8h hell/dunkel) aufrechterhalten. Diese werden alle 3 Wochen nodial subkultiviert.
In-vitro-Schösslinge mit 2–3 inch (5–7,5 cm) Höhe werden in 2,5 inch (6,4 cm) Töpfe aus Levingtons F1-Kompost eingetopft. Sie werden in einem Minigewächshaus für eine Woche in einem Wachstumsraum bei 18 °C (16h/8h hell/dunkel) entwöhnt. Das Minigewächshaus wird entfernt und die Pflanzen werden nach 3 Wochen in 5 inch (12,7 cm) Töpfe umgetopft. Nach 5–7 Wochen werden die Pflanzen für die Transformation verwendet.
Agrobacterium tumefaciens
Flüssige Übernachtkulturen geeigneter Stämme, z. B. LBA4404, C58#3 werden bei 28 °C auf einen OD₆₀₀-Wert von 0,8 in L-Nährlösung wachsen gelassen (siehe Anhang).
Cokultivierung
Die jüngsten vier der am meisten ausgebreiteten Blätter werden genommen und werden für 15 Minuten oberflächensterilisiert in 10 % Domestos (kommerzielle Bleiche). Die Blätter werden gründlich mit sterilem Wasser gespült und werden dann in Scheiben mit einem 7 mm Korkbohrer geschnitten. Die Scheiben werden mit dem Agrobacterium für 1–5 Minuten vermischt, trocken auf Filterpapier (Whatman Nr. 1) geblottet und dann mit der unteren Epidermis nach unten auf Kallusbildungsmedium (siehe Anhang) in dreifach belüftete 90mm-Petrischalen gegeben. Die dreifach belüfteten 90mm-Petrischalen werden mit Klebeband versiegelt, eingeschnitten, um den Gasaustausch zu erlauben, und dann bei 22 °C (16h/8h hell/dunkel) inkubiert. Die Scheiben werden auf Kallusbildungsmedium plus 500 μg ml^–1 Claforan und 30 μg ml^–1 Kanamycin nach 48 Stunden übertragen. Dies entfernt Bakterien und selektiert für transformierte Zellen.
Regeneration transformierter Schösslinge
Nach einer Woche werden die Scheiben auf Schossbildungsmedium (siehe Anhang), enthaltend dieselben Antibiotika, übertragen. Weitere Übertragungen werden auf dasselbe Medium gemacht, bis die Schösslinge ausgeschnitten werden können (gewöhnlich ungefähr 4 Wochen). Schösslinge mit Kalli werden auf MS-Medium mit Cefotaxim (500 μg/ml) in gut belüfteten Behältern, z.B. Magenta, übertragen. Transformanten werden nach etlichen Passagen mit Cefotaxim, um Bakterien zu entfernen, auf MS-Medium aufrechterhalten. Sie können aus der in-vitro-Kultur entnommen werden, entwöhnt und bis zur Reife wachsen gelassen werden, wie für die Stammpflanzen beschrieben. Der Vorgang ergibt transformierte Kartoffelpflanzen mit einer Häufigkeit von bis zu 30 % der cokultivierten Scheiben. Anhang
Identifikation des Weizen-brittle-2-Gens und Expression in transgenen Pflanzen
Es wurde ein Southern-Blot mit Kartoffel-DNS zubereitet, die aus mit NCIMB 40649 transformierten Linien und aus mit NCIMB 40649 und NCIMB 40650 zusammen transformierten Linien extrahiert worden ist. Die extrahierte Pflanzen-DNS wurde mit HindIII geschnitten und 10 μg wurden pro Spur des 1 %igen Agarosegels verwendet. Der Blot wurde mit der brittle-2-Kodiersequenz, die aus mit BamHI geschnittener Plasmid-DNS aus NCIMB 40649 gewonnen worden ist, sondiert. Der Blot wurde über Nacht bei 55 °C in 5 × SSC hybridisiert. Nach Waschen bis zu einer Stringenz von 0,2 × SSC bei 55 °C wurde der Blot der Autoradiographie unterzogen. Das in 2a gezeigte Ergebnis zeigt, dass zwischen eine und vier Kopien des brittle-2-Gens in die Pflanzen eingeführt worden sind.
In 2a stammen die Spuren 1–4 von DNS, die aus Pflanzen extrahiert worden ist, die sowohl mit dem brittle-2- als auch dem shrunken-2-Gen transformiert worden sind. Die Spuren 5–13 zeigen DNS, die aus Linien extrahiert worden ist, die unabhängig mit nur dem brittle-2-Gen transformiert worden sind. Spur 14 zeigt DNS von einer untransformierten Kartoffelpflanze.
Um zu zeigen, dass DNS als Boten-RNS exprimiert worden ist, wurden Oligonucleotidprimer für das Vorgehen zubereitet, das als RT-PCR bekannt ist, welches mit mRNS durchgeführt wurde, die aus Knollen transformierter Kartoffelpflanzen extrahiert worden ist. RT-PCR wurde mit mRNS, die aus Knollenmaterial mit dem von Shirzadegan et al. (Nucleic acid research 19 6055; 1991, An efficient method of isolation of RNA from tissue cultured plant cells) beschriebenen Verfahren extrahiert worden ist, durchgeführt. Die mRNS wurde mit DNAse behandelt, um kontaminierte DNS zu entfernen. Für die Synthese des ersten Stranges wurde der Primer ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA bei 42 °C für 100 Minuten verwendet. Nach Entfernen von RNS mit RNAse wurde der zweite Strang synthetisiert, um ein Fragment an dem 5'-Ende und ein Fragment an dem 3'-Ende der brittle-2-cDNS zu erhalten. Um das 5'-Ende zu amplifizieren, wurden die Primer CCT CGT CAG GGG ATA CAA TCT AGT CCC und CAC CAA CAA AAT TTC GCG GAT CC verwendet, und um das 3'-Ende zu amplifizieren, wurden die Primer CAG ACC ATG CTA TTT GTT G und ATA ATC ATC GCA AGA CCG GCA ACA GGA verwendet. Die Amplifikationsbedingungen waren 24 Zyklen mit 1 Minute bei 94 °C, 30 Sekunden bei 50 °C und 3 Minuten bei 72 °C. Nach Abtrennen der Produkte auf einem 1 % Agarosegel und Southern-Blotting wurde der Blot wie oben beschrieben, sondiert. Die Ergebnisse in 2b zeigen, dass das eingeführte Gen als mRNS exprimiert worden ist.
In 2b zeigen die Spuren 1–4, 5–8, 9–12 RT-PCR-Produkte aus drei mit der brittle-2-Sequenz transformierten Linien. Gerade nummerierte Spuren zeigen Reaktionen, denen reverse Transkriptase fehlt, um die DNS-Kontamination der RNS anzuzeigen. Die Spuren 1, 2, 5, 6, 9 und 10 zeigen Amplifikation des 3'-Endes und die Spuren 3, 4, 7, 8, 11, 12 zeigen Amplifikation des 5'-Endes. Wenn keine RNS oder eine nicht transgene Pflanze als eine Kontrolle verwendet worden sind, wurde kein Signal erhalten.
PRODUKTION VON ANTISEREN, UM ADPG-PPASE IN PFLANZEN ZU IDENTIFIZIEREN
1. Zubereitung von Proteinen aus E.coli-Exuressionsvektoren
Mit GEX2T-Expressionskonstrukten (Pharmacia Ltd) transformierte E.coli-Zellen wurden auf die folgende Weise aufgezogen: Ein 11-Kolben, enthaltend 100 ml LB-Nährlösung (10 g/l Trypton; 5 g/l Hefeextrakt; 10 g/l Natriumchlorid (NaCl)), zu der 100 μg/ml Ampicillin hinzugefügt worden ist, wurde mit 20 μl E.coli-Zellen beimpft und über Nacht bei 37 °C wachsen gelassen. Die Übernachtkultur wurde in einen 51-Kolben übertragen, der 900 ml LB-Nährlösung enthielt, und für 1 Stunde weiter wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch das Hinzufügen von Isopropylbeta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert, um das Fusionsprotein zu exprimieren,. Nach dem Wachsenlassen für weitere 4 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 7000 rpm für 10 Minuten geerntet. Pelletierte Zellen wurden bei –80° C vor der Extraktion gelagert.
Die pelletierten Zellen wurden in 90 ml eiskalter 50 mM N-Tris(hydroxymethyl)aminoethan (Tris), 150 mM NaCl, pH 8,0 resuspendiert, in einen Glasbecher gegeben und für 45 Sekunden beschallt. Triton X-100 wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 % hinzugefügt und der Extrakt wurde durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 10.000 rpm und 4 °C geklärt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand in eine 250ml-Plastikflasche dekantiert und 2–3 ml eines 50 %igen Schlammes aus Glutathionsepharoseaffinitätsharz (Pharmacia Ltd), der mit 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0 voräquilibriert worden war, wurden hinzugefügt und die Flasche wurde 1–2 Stunden bei Raumtemperatur sanft bewegt. Das Harz wurde dann auf eine 5ml-Säule geladen und nacheinander mit 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, pH 8,0, und dann 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0 gewaschen, bis kein weiteres Protein in den Waschlösungen detektiert worden ist. Das gebundene Fusionsprotein wurde dann von dem Harz mit 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM reduziertem Glutathion, pH 8,0 eluiert. Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt und für den Proteingehalt unter Verwendung des Biorad-Farbstoffbindungstest für Protein (Bradford, (1976) Analytical Biochemistry, 72, S. 248–254) analysiert. Fraktionen, die den Proteinpeak zeigen, wurden vor der weiteren Analyse vereinigt.
2. Antiserumproduktion
Ein Fusionsprotein, bestehend aus der Weizen-brittle-2-Proteinsequenz, die an Glutathion-S-Transferase gekoppelt ist, wurde aus transformieren E.coli-Zellen wie oben beschrieben zubereitet. Diese Proteinzubereitung wurde gegen drei Änderungen aus 50 mM Tris, pH 8,0 der Dialyse unterzogen und es wurden bis zu drei Aliquoten, eine aus 100 μg Protein und zwei mit 50 μg Protein, in 500 μm 50 mM Tris, pH 8,0 gemacht. Die 100μg-Aliquote wurde mit einem gleichen Volumen aus Freunds vollständigem Adjuvans vermischt und wurde subkutan in die Flanke eines weißen New-Zealand-Kaninchens injiziert. Jede der beiden 50-μg-Proteinaliquoten wurde mit einem gleichen Volumen aus Freunds unvollständigem Adjuvans vermischt und in dasselbe Kaninchen 4 und 8 Wochen nach der Anfangsinjektion injiziert. Blut wurde 12 Wochen nach der ersten Injektion gesammelt und die Zellen wurden von dem Serum durch Verklumpen und Zentrifugation abgetrennt. Das Serum wurde aufbewahrt und bei –20 °C gelagert.
IDENTIFIKATION VON WEIZEN-BRITTLE-2-PROTEIN IN TRANSGENEN PFLANZEN
Das folgende Vorgehen wurde verwendet, um Weizen-brittle-2-Protein, das in Knollen transformierter Kartoffelpflanzen akkumuliert ist, zu identifizieren.
1. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Elektrophorese von Proteinproben wurde routinemäßig unter Verwendung des Systems von Schagger und von Jagow (Analytical Biochemistry (1987), 166, S. 368–379) durchgeführt. Proteinextrakte wurden durch Homogenisieren des Knollengewebes (50–100 mg) in einem Extraktionspuffer, bestehend aus 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (Hepes), pH 8,0; 10 mM Diaminoethan-Tetraessigsäure (EDTA); 10 mM Dithiothreitol (DTT) zubereitet. Proteinproben, die bis zu 100 μg Protein enthalten, wurden durch Fällen mit Aceton zubereitet, gefolgt von Resuspendieren in Wasser (50 μl) und 2X Probenbeladungspuffer (50 μl). Proben wurden für 50 Sekunden vor dem Laden auf das Gel gekocht und wurden der Elektrophorese bei 50–60 V (konstant) für annähernd 20 Stunden unterzogen. 2X Probenbeladungspuffer, bestehend aus 100 mM Tris, pH 6,8; 8 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS); 24 % (w/v) Glycerol; 4 % (v/v) Betamercaptoethanol; 0,02 % (w/v) Coomassie-Blau.
2. Elektroblotting von Proteinen
Durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennte Proteine wurden auf Immobilon-P-PVDF-Membran (Millipore) durch Elektroblotting übertragen. Membran, 3mm-Papier von Whatman, und Schwämme wurden in Transferpuffer (25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20 % Methanol; pH 8,3) vor der Verwendung voräquilibriert. Gele wurden in engen Kontakt mit der Membran gebracht und in Transferkassetten in der spezifischen Anordnung, die in den Anweisungen des Herstellers angegeben ist, zusammengesetzt. Kassetten wurden in ein Transferpuffer enthaltendes Elektroblottingbad gegeben und der Transfer von Proteinen von dem Gel zu der Membran wurde durch das Anlegen von 50 V bei 4 °C für 3–4 Stunden erleichtert. Das Blotting wurde überwacht unter Verwendung von vorgefärbten Proteinmolekulargewichtsmarkern (Sigma Chemical Co.).
3. Immundetektion immobilisierter Proteine
Spezifische Proteine wurden auf Immobilon-P-Membranen durch die Verwendung von gegen in E.coli exprimierten Proteinen erzeugten Antikörpern detektiert. Membranen wurden direkt aus dem Elektroblottingbad entnommen und in eine Glasschale gegeben. Die Membranen wurden kurz mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10 mM Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄); 150 mM NaCl; pH 7,2) gespült und die verbleibenden Proteinbindungsstellen wurden durch Behandlung mit 4 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 30 Minuten blockiert. Dann wurden die Membranen mit primärem Antikörper bei einer geeigneten Verdünnung (typischerweise 1/1000–1/10000 (v/v)) in PBS, enthaltend 4 % BSA, für 16 Stunden bei Raumtemperatur und unter sanftem Schütteln immungetestet. Überschüssiger primärer Antikörper wurde durch Waschen der Membranen mit etlichen Änderungen an PBS entfernt.
Membranen wurden dann mit 20–40 μl von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG (Immunglobulin G) in bis zu 200 ml PBS, enthaltend 2 % (w/v) BSA, für 2–3 Stunden behandelt. Ungebundenes Konjugat wurde nach der Inkubation durch Waschen mit etlichen Änderungen aus 1 % (v/v) Triton X-100 in PBS entfernt. Membranen wurden dann kurz mit 100 mM Diethanolaminpuffer, pH 9,8, gewaschen und durch Inkubieren mit alkalischer Phosphatasereaktionsmischung (120 μM Nitroblautetrazolium; 135 μM 5-Brom-4-chlorindolylphosphat; 4 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂); 100 mM Diethanolamin; pH 9,8) entwickelt. Der Reaktion wurde so lange erlaubt, zu geschehen, bis sich purpurblaue Banden zeigten, gewöhnlich nach 15–35 Minuten. Die Reaktion wurde durch Spülen der Membranen unter Umkehrosmose- (RO-)Wasser gestoppt. Den Membranen wurde ermöglicht, kopfunter auf Filterpapier zu trocknen und sie wurden im Dunkeln gelagert.
UNTERSUCHTUNG DER ADPG-PPASE IN TRANSGENEN KARTOFFELN
1. Zubereitung von Extrakten
Kartoffelknollengewebe, 2–3 g, wurde mit 3 ml Extraktionspuffer (50 mM Hepes, pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM DTT; 10 % (w/v) BSA) unter Verwendung eines Pistills und Mörsers homogenisiert. Der Extrakt durch Zentrifugation geklärt. Um den Extrakt zu entsalzen, wurden 2,5 ml des geklärten Extraktes auf eine PD10-Gelfiltrationssäule (Pharmacia Ltd), die mit Extraktionspuffer voräquilibriert worden ist, geladen und mit 3,5 ml Extraktionspuffer eluiert. Diese Zubereitung wurde für den Enzymtest genommen.
2. Enzymtest
Das Prinzip des Enzymtests ist wie folgt:
NADH wurde spektrophotometrisch bei 25 °C und 340 nm detektiert.
Zu einer Plastikküvette wurden in einem Endvolumen von 1 ml gegeben:
40 mM Hepes, pH 8,0
10 mM Magnesiumchlorid (MgCl₂)
1 mM Tetranatriumpyrophosphat (Na₄P₂O₇)
0,4 mM Nicotinamidadenindinucleotid (NAD)
4 Einheiten Glucose-6-phosphatdehydrogenase
2 Einheiten Phosphoglucomutase
24 μM Glucose-1,6-diphosphat (Glc-1,6-P₂)
bis zu 300 μl Extrakt
Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von Adenosindiphosphoglucose (ADPG) bis zu einer Endkonzentration von 0,8 mM gestartet.
ANALYSE DES SPEZIFISCHEN GEWICHTES TRANSGENER KARTOFFELN
Ganze Knollen wurden in der Luft und unter Wasser gewogen. Das spezifische Gewicht wurde berechnet als:
ANALYSE DES STÄRKEGEHALTS TRANSGENER KARTOFFELN
Knollengewebe (40–70 mg) wurde in 500 μl 45 % HClO₄ extrahiert. Eine Aliquote dieses Extraktes (15 μl) wurde auf 1 ml mit 400 mM Hepes, pH 8,0, aufgefüllt und wurde dann in zwei 500 μl Portionen aufgeteilt, die beide auf 1 ml durch die Zugabe von 400 mM Hepes, pH 8,0, aufgefüllt wurden. Zu einer Portion wurden dann 100 Einheiten Alpha-Amylase und 7 Einheiten Amyloglucosidase hinzugefügt, zu der anderen Portion wurden keine Enzyme hinzugefügt und beide wurden über Nacht vor dem Untersuchen für Glucose belassen.
Der Glucosetest wurde spektrophotometrisch bei 25 °C und 340 nm durchgeführt.
Zu einer Plastikküvette wurden in einem Endvolumen von 1 ml gegeben:
100 mM Hepes, pH 8,0
4 mM MgCl₂
4 mM NAD
3 mM Adenosintriphosphat (ATP)
3 Einheiten Glucose-6-phosphatdehydrogenase von Leuconostoc (Boehringer Mannheim) 500–300 μl Stärkeverdauung.
Die Reaktion wurde mit 0,3 Einheiten Hefehexokinase (Boehringer Mannheim) gestartet.
Die in dem Kartoffelgewebe vorhandene Stärkemenge kann aus der Menge an Glucose, die in dem Test gemessen wird, berechnet werden.
Die folgenden Ergebnisse wurden unter Verwendung der obigen Verfahren gewonnen.
1. Erkennung von Proteinen durch Anti-Brittle-2-Antiserum in Extrakten aus Kartoffel und Weizen
Extrakte aus Kartoffelknollen und Weizenendospermgewebe wurden gemäß den Verfahren zubereitet. Aliquoten, enthaltend 100 μg Protein, wurden genommen und auf SDS-PAGE-Gelen wie beschrieben laufen gelassen, geblottet und mit dem Anti-brittle-2-Antiserum immungetestet. Bei einer Verdünnung von 1/10000 wurde nur eine Proteinbande in Spuren detektiert, die den Weizen- und Kartoffelextrakten entsprechen. Ferner war die Kartoffelbande von der Weizenbande unterscheidbar, da sie von unterschiedlicher Größe waren. In einem dritten Extrakt, hergestellt sowohl aus Weizen- als auch aus Kartoffelgewebe, waren zwei Banden unterscheidbar, entsprechend den Größen der in den gesonderten Weizen- und Kartoffelextrakten gesehenen Banden.
2. Detektion von Proteinen in Knollen aus Kartoffelpflanzen, die mit der Gensequenz für das Weizen-brittle-2-Gen transformiert worden sind.
Kartoffelpflanzen wurden durch das Blattscheibencokultivierungsverfahren mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend das Plasmid pFW 4091, das die für das Weizengen für das brittle-2-Protein aus Weizen kodierende DNS enthält, transformiert. Weitere Pflanzen wurden unter Verwendung desselben Verfahrens und einer Kombination aus Agrobacterium tumefaciens, das das Plasmid pFW 4151 enthält, das die für das Weizengen für das shrunken-2-Protein von Weizen kodierende DNS enthält, und Agrobacterium tumefaciens, das das Plasmid pFW 4091 enthält, das die für das Weizengen für das brittle-2-Protein von Weizen kodierende DNS enthält, transformiert. Das Plasmid pFW 4091 wurde unter der Zugangsnummer NCIMB 40649 hinterlegt und das Plasmid pFW 4151 wurde unter der Zugangsnummer NCIMB 40650 hinterlegt, wie oben beschrieben. Kartoffelknollen aus Pflanzen, die mit der für das Weizengen für das brittle-2-Protein von Weizen kodierenden DNS transformiert worden sind, wurden für die Expression des Gens durch Western-Blotting analysiert, wie unter Methoden beschrieben, unter Verwendung des gegen das brittle-2/Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein erzeugten Antikörpers. Ähnliche Knollen aus Linien, die mit brittle-2 und shrunken-2 von Weizen transformiert worden sind, wurden analysiert. Wie in Abschnitt 1. oben beschrieben, erkennt dieses Antiserum auf der Basis ihrer Größe ein einzelnes Protein in Weizen und ein einzelnes Protein in der Kartoffel, die voneinander unterscheidbar sind. Auf diesem Wege wurden Linien selektiert, die nur das Weizen-brittle-2-Protein exprimierten. Knollen dieser Linien wurden für die ADPG-PPase-Aktivität und den Stärkegehalt untersucht, wie in den Methoden beschrieben, und wurden mit den Aktivitäten und Stärkegehalten von Kontrollknollen verglichen.
Fünfzig Linien aus mit gemäß dem erfinderischen Verfahren behandelten Knollen wurden analysiert und gegen fünfzig Linien aus Kontrollknollen (unbehandelt) verglichen. Die 3a und 3b zeigen eine Auswahl der Extrembereiche an ADPG-PPase-Aktivität (Nanomol pro Minute pro Gramm Frischgewicht), beobachtet in Linien, die das chimäre Gen für brittle-2 und shrunken-2 enthielten (3a), und in Linien, die das chimäre Gen für brittle-2 enthalten (3b). Wir glauben, das diese Linien eine signifikant größere ADPG-PPase-Aktivität zeigen, als Kontrollknollen.
4 zeigt in grafischer Darstellung das spezifische Gewicht von Knollen als die kumulative Häufigkeit von Knollen in vier Klassen an ADPG-PPase-Aktivität für mit brittle-2 und shrunken-2 transformierte Linien. Eine ähnliche Analyse für nur mit brittle-2 transformierte Linien ergibt die folgende Änderung in dem Medianwert der Population:
Wir glauben, dass diese gesteigerte ADPG-PPase Produktion ebenfalls zu einem erhöhten Stärkegehalt in den Pflanzen führen wird, wie durch das oben beschriebene Verfahren gemessen, wenn sie unter geeigneten Bedingungen wachsen gelassen werden und wenn geeignete andere Gene eingeführt werden (siehe unten).
Messen der Synthese und Umwandlung zu Stärke
Um die Wirkung der Änderung in der Aktivität auf die Stärkesynthese zu bestimmen, wurde radioaktiv markierte Saccharose sich entwickelnden Knollen transgener Pflanzen mit einer gesteigerten Aktivität der ADPG-PPase zugeführt. Stärke wurde wie oben beschrieben extrahiert und die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählen bestimmt. Eine mit brittle-2-Gen transformierte Linie mit erhöhter ADPG-PPase-Aktivität wurde mit einer Kontrolllinie verglichen und ergab die folgenden Ergebnisse:

sem: = Standardabweichung des Mittelwertes

Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurde ein weiteres Experiment mit vier Linien, die unterschiedliche Aktivitäten der ADPG-PPase zeigen, verwendet (siehe 5). Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die Stärke schneller synthetisiert wird, zeigen jedoch, dass unter gewissen Bedingungen die Stärke schneller abgebaut wird. Deshalb schlagen wir vor, dass dies zeigt, dass, damit die Erfindung universell anwendbar ist, es notwendig ist, funktionsfähige Gene einzuführen, um die Aktivität der ADPG-PPase zu erhöhen, und funktionsfähigeGene, um die Aktivität der Amylase (EC 3.2.1.1 und EC 3.2.1.2) und Stärkephosphorylase (EC 2.4.1.1) zu reduzieren.

Claims

Verfahren zum Steigern der Enzymaktivität der Adenosindiphosphoglucose-Pyrophosphorylase (ADPG PPase) in einer Pflanze, umfassend das Einführen eines Gens in die Pflanze, welches nur eines der Untereinheitsproteine einer heterotetrameren ADPG PPase (E.C. 2.7.7.27) kodiert, welches den Schritt der Herstellung von ADPG im Stoffwechselweg der Stärkesynthese katalysiert, dadurch gekennzeichnet, dass ein einzelnes heterologes Gen, das nur eines der Untereinheitsproteine der heterotetrameren ADPG PPase (E.C. 2.7.7.27) kodiert, das nicht aus Gerstenendosperm stammt, in die Pflanze eingeführt wird, wodurch die Expression des Gens der Untereinheit in der Pflanze verursacht wird, um das Untereinheitsprotein zu erzeugen und eine Steigerung der Enzymaktivität in den Pflanzenzellen zu verursachen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gen das Gen ist, welches die brittle-2-Untereinheit als Protein kodiert, oder ein äquivalentes Gen an dem Ort darstellt, der bzw. das die brittle-2-Untereinheit als Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gen das äquivalente Weizengen an dem Locus ist, der bzw. das die brittle-2-Untereinheit als Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin auch Gene, die operativ die Aktivität von Enzymen senken können, welche Stärke abbauen, in die Pflanze eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Gene, die operativ die Aktivität von Enzymen, welche Stärke abbauen, senken können, die Aktivtät der Amylase (E.C. 3.2.1.1 und E.C. 3.2.1.2) oder der Stärkephosphorylase (E.C. 2.4.1.1) senken.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Stärkegehalt der Pflanze erhöht wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Pflanze eine monocotyledone Pflanze ist, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Weizen, Gerste, Roggen, Mais oder Reis.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Pflanze eine Dicotyledone ist, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Kartoffel, Tomate, Manniok (Tapioka), Erdnuss, Bohne oder Erbse.
Verfahren nach Anspruch 8, worin der Stärkegehalt einer Kartoffelknolle gesteigert wird.
Transformierte Pflanze, in die ein einzelnes heterologes Gen eingeführt worden ist, das nicht aus Gerstenendosperm stammt, nur eines der Untereinheitsproteine einer heterotetrameren ADPG PPase als Enzym (E.C. 2.7.7.27) kodiert, welches den Stoffwechselweg der Stärkesynthese katalysiert, wobei die transformierte Pflanze das Gen exprimiert, um das Untereinheitsprotein zu erzeugen und eine im Vergleich zu einer nicht transformierten Pflanze gesteigerte ADPG PPase-Aktivtät in den Pflanzenzellen aufweist.
Pflanze nach Anspruch 10, worin das Gen das Gen ist, welches das brittle-2 Untereinheitsprotein kodiert oder ein äquivalentes Gen an dem Locus darstellt, der bzw. das die brittle-2 Untereinheit als Protein kodiert.
Pflanze nach Anspruch 11, worin das Gen das äquivalente Weizengen an dem Locus darstellt, der bzw. das das brittle-2 Untereinheitsprotein kodiert.
Pflanze nach Anspruch 10, 11 oder 12 und zusätzlich umfassend eines der Gene eines der Untereinheitsproteine einer Vielzahl anderer Enzyme, welche die Stärkesynthese katalysieren.
Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin die Pflanze einen erhöhten Stärkegehalt aufweist.
Pflanze nach einem der Ansprüche 13 bis 14, bei der es sich um eine Monocotyledone handelt, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Weizen, Gerste, Roggen, Mais oder Reis.
Pflanze nach einem der Ansprüche 10 bis 14, bei der es sich um eine Dicotyledone handelt, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Kartoffel, Tomate, Manniok (Tapioka), Erdnuss, Bohne oder Erbse.
Pflanze nach Anspruch 16, worin eine Knolle einer Kartoffel einen erhöhten Stärkegehalt aufweist.
Plasmid mit der NCIMB-Nr. 40649, worin das Gen das äquivalente Weizengen an dem Locus ist, der bzw. das die brittle-2 Untereinheit für das Enzym ADPG PPase kodiert.
Plasmid mit der NCIMB-Nr. 40650, worin das Gen das äquivalente Weizengen an dem Locus ist, der bzw. das die shrunken-2 Untereinheit für das Enzym ADPG PPase kodiert.