HU221124B1 - Production of trehalose in plants - Google Patents

Production of trehalose in plants Download PDF

Info

Publication number
HU221124B1
HU221124B1 HU9503723V HUP9503723V HU221124B1 HU 221124 B1 HU221124 B1 HU 221124B1 HU 9503723 V HU9503723 V HU 9503723V HU P9503723 V HUP9503723 V HU P9503723V HU 221124 B1 HU221124 B1 HU 221124B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
trehalose
sequence
gene
plants
Prior art date
Application number
HU9503723V
Other languages
English (en)
Inventor
Mirjam Petronella Does
Den Elzen Petrus Josephus Van
Andreas Hoekema
Jan Pen
Original Assignee
Syngenta Mogen Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP1993/002290 external-priority patent/WO1995006126A1/en
Application filed by Syngenta Mogen Bv filed Critical Syngenta Mogen Bv
Publication of HUP9503723D0 publication Critical patent/HUP9503723D0/hu
Publication of HUT74666A publication Critical patent/HUT74666A/hu
Publication of HU221124B1 publication Critical patent/HU221124B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3562—Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/40—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution
    • A23L3/42—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by drying or kilning; Subsequent reconstitution with addition of chemicals before or during drying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1066—Sucrose phosphate synthase (2.4.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Ceramic Products (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás trehalóz termelésére egy növényigazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződésre képes E. colitrehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-t tartalmazó nukleinsavathordozó növény termesztése és feldolgozása útján. A találmány tárgya anövényben kifejeződésre képes, a növényi sejt trehalóztermelését és -tartalmát növelő nukleinsavszerkezet, az ezt tartalmazó klónozóvektor,ezt hordozó mikroorganizmus, ezt a nukleinsavszerkezetet tar- talmazórekombináns növényi DNS-genom, növényi sejt, sejttenyészet és növényis, valamint egy eljárás trehalóz termelésére fokozottan képes növénylétrehozására. ŕ

Description

KIVONAT
A találmány tárgya eljárás trehalóz termelésére egy növényi gazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződésre képes E. coli trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-t tartalmazó nukleinsavat hordozó növény termesztése és feldolgozása útján.
A találmány tárgya a növényben kifejeződésre képes, a növényi sejt trehalóztermelését és -tartalmát növelő nukleinsavszerkezet, az ezt tartalmazó klónozóvektor, ezt hordozó mikroorganizmus, ezt a nukleinsavszerkezetet tartalmazó rekombináns növényi DNS-genom, növényi sejt, sejttenyészet és növény is, valamint egy eljárás trehalóz termelésére fokozottan képes növény létrehozására.
A leírás terjedelme 30 oldal (ezen belül 11 lap ábra)
HU 221 124 B1
HU 221 124 Β1
A találmány tárgyát növények szénhidrát-anyagcseréjének módosítása rekombináns DNS-technikák alkalmazásával, az ehhez használható rekombináns DNS, valamint a módosított génállományú növények képezik. Az említett növények különleges szénhidrátok forrásaként használhatók fel, vagy olyan élelmiszerré, takarmánnyá, vagy azok alkotórészeivé dolgozhatók fel, amelyek az említett szénhidrátok jelenlétének következtében javított tulajdonságokkal rendelkeznek például a feldolgozás során.
A trehalózok olyan D-glükozil-D-glükozid típusú diszacharidok, amelyeket két, α,α-, α,β- vagy β,β-kötéssel összekapcsolódó glükózmolekula alkot. A trehalózok, és különösen az α-trehalóz [l-(O-a-D-glükopiranozil)-l’-(O-a-D-glükopiranóz)] a természetben széles körben előforduló diszacharid.
A trehalóz kémiai szintézise bonyolult (védőcsoportot igénylő) és nem hatékony eljárás. A trehalóz jelenleg használt természetes forrásai a kalapos gombák és a Saccharomyces cerevisiae élesztőgomba, amely képes a száraz tömegének 10%-át meghaladó mennyiségű trehalóz felhalmozására. A termelést azonban a magas trehalázaktivitás gátolja, ami a trehalóz gyors lebomlását okozza. Elbein [Adv. Carbohydrate Chem. Biochem. 30, 227-256 (1974)] áttekintést ad a trehalóz diszacharidok, különösen az α,α-trehalóz élő szervezetekben való előfordulásáról és anyagcseréjéről. A növények közül a trehalóz jelenlétét számos alacsonyabb rendű növényfajban, valamint néhány magasabb rendű növényfajban, így például egy szamárkenyérben (Echinops persicus), egy sásban (Carex brunescens) vagy a bükkfában (Fagus silvatica) mutatták ki. Ezeket az eredményeket más szerzők nem erősítették meg [például Kendall és munkatársai, Phytochemistry 29, 2525-2528 (1990)]. így például Kendall - a trehalóznak a magasabb rendű növényekben való előfordulásáról szólva - azt állítja, hogy annak jelenléte csak a kömény (Carum carvi) magvában bizonyított. Egy közleményt a trehalóz napraforgóban való jelenlétéről [Cegla és munkatársai, J. Am. Oil Chem. Soc. 54, 150 (1977)] Kandler és munkatársai [The Biochemistry of Plants, Vol. 3.: Carbohydrates: Structure and Function; ed.: Preiss, J., 228 o., Academic Press] kétségbe vonnak Kendall és munkatársai (idézett mű) alapján. A behálóznák bükkfában és káposztában való előfordulását sem sikerült más szerzőknek megerősíteniük (Kendall és munkatársai, idézett mű és hivatkozásai).
A trehalóznak a magasabb rendű növényekben való látszólagos ritkasága ellenére trehalózlebontó aktivitást mutattak ki a vizsgált növénycsaládok jelentős részéből. Stabil, magas trehalázaktivitást találtak három búzavonalban, egy fenyőfajban (jack pine) és egy csipkeharasztban (Selaginella lepidophyla). Stabil, alacsony trehalázaktivitást találtak a lucernában, a fekete mexikói édeskukoricában és a fehér lucfenyőben. Labilis, közepes aktivitást találtak két különböző canolaszuszpenzióban, de ezeket valószínűleg nem lehetett volna specifikus trehalázaktivitásként leírni. Az árpában, a rozsokban, a szójában és a fekete lucfenyőben egyáltalán nem találtak trehalázaktivitást (Kendall és munkatársai, idézett mű).
Azokban a szervezetekben, amelyek képesek a termelésére, a trehalóz a feltételezések szerint 6-foszfátjaként bioszintetizálódik, de szabad cukor alakjában tárolódik. Ennélfogva feltételezik, hogy azok a szervezetek, amelyek termelik és/vagy tárolják a trehalózt, rendelkeznek egy olyan foszfatázzal, amely képes a trehalóz-6-foszfát elbontására (Elbein, idézett mű). Alig tudunk valamit egy specifikus trehalóz-foszfatáz létezéséről a magasabb rendű növényekben.
A WO93/17093 Al számú nemzetközi szabadalmi bejelentés trehalóz termelését írja le egy transzgén élesztőben, amelyet élesztőből származó, trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló génekkel transzformáltak. A bejelentésben utalnak arra, hogy ezeket az élesztőgéneket alkalmazva magasabb rendű növényekben is lehetne trehalózt termelni, de az igénypontok között nem szerepel a trehalóz termeltetése egy növényben. Megjegyezzük, hogy a WO93/17093 Al számú nemzetközi szabadalmi bejelentés közzététele megelőzte találmányunk benyújtásának időpontját, de később történt találmányunk elsőbbségi időpontjánál.
Találmányunk tárgya eljárás trehalóz termelésére egy növényi gazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződni képes génnek az említett növényi gazdaszervezetben való jelenléte következtében, amely gén szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
b) egy DNS-szekvenciát, amely a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódolja, és adott esetben
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben.
Találmányunk egy másik megvalósítása magában foglalja a trehalóz termelését egy növényi gazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződni képes génnek az említett növényi gazdaszervezetben való jelenléte következtében, amely gén szekvenciája tartalmaz:
d) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
e) egy DNS-szekvenciát, amely a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódolja, és adott esetben
f) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben, és egy növényekben kifejeződni képes gént, amelynek szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
b) egy DNS-szekvenciát, amely egy olyan RNS-szekvenciát kódol, amely legalább részben komplementer egy olyan RNS-szekvenciával, amely egy, az említett növényi gazdaszervezetben természetesen előforduló szacharóz-foszfát-szintetáz-enzimet (SPS-t) kódol, és adott esetben
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben.
Találmányunk egy még további megvalósítása magában foglalja a trehalóz termelését egy növényi gazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződni képes génnek az említett növényi gazdaszervezetben való jelenléte következtében, amely gén szekvenciája tartalmaz:
HU 221 124 Β1
d) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
e) egy DNS-szekvenciát, amely a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódolja, és adott esetben
f) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben, és egy növényekben kifejeződni képes gént, amelynek szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
b) egy DNS-szekvenciát, amely egy olyan RNS-szekvenciát kódol, amely legalább részben komplementer egy olyan RNS-szekvenciával, amely egy, az említett növényi gazdaszervezetben természetesen előforduló ADP-glükóz-pirofoszforiláz-enzimet (AGP-ázt) kódol, és adott esetben
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben.
Találmányunk egy még további megvalósítása magában foglalja a trehalóz termelését egy növényi gazdaszervezetben, egy növényekben kifejeződni képes génnek az említett növényi gazdaszervezetben való jelenléte következtében, amely gén szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
b) egy DNS-szekvenciát, amely a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódolja, és adott esetben
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben, és egy növényekben kifejeződni képes gént, amelynek szekvenciája tartalmaz:
d) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
e) egy DNS-szekvenciát, amely egy olyan RNS-szekvenciát kódol, amely legalább részben komplementer egy olyan RNS-szekvenciával, amely egy, az említett növényi gazdaszervezetben természetesen előforduló szacharóz-foszfát-szintetáz-enzimet (SPS-t) kódol, és adott esetben
f) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben, és egy növényekben kifejeződni képes gént, amelynek szekvenciája tartalmaz:
g) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
h) egy DNS-szekvenciát, amely egy olyan RNS-szekvenciát kódol, amely legalább részben komplementer egy olyan RNS-szekvenciával, amely egy, az említett növényi gazdaszervezetben természetesen előforduló ADP-glükóz-pirofoszforiláz-enzimet (AGP-ázt) kódol, és adott esetben
i) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben.
Találmányunk kiterjed azokra a növényekben kifejeződő génekre is, amelyeket a trehalóz-előállító eljárásban használunk, valamint a növényekben kifejeződő gének kombinációira éppúgy, mint a klónozóplazmidokra, transzformációs vektorokra, mikroorganizmusokra és azon egyedi növényi sejtekre, amelyek a találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes géneket tartalmazzák.
A találmány tárgyához tartozik egy olyan növényi rekombináns DNS-genom is, amely egy olyan, növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfát-szintetázgént tartalmaz, amely természetes módon nincs jelen abban. A találmány tárgyához tartozik továbbá egy olyan növényi rekombináns DNS-genom, amely egy olyan, növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfátszintetáz-gént tartalmaz, amely természetes módon nincs jelen abban, és emellett egy olyan, növényekben kifejeződő gént is, amely gátolni képes egy SPS-aktivitás bioszintézisét és/vagy egy növényekben kifejeződő gént, amely gátolni képes egy AGP-áz-aktivitás bioszintézisét.
A találmány tárgyához tartozik továbbá egy módszer egy trehalóz termelésére képes növény létrehozására, amely módszer az alábbi lépéseket foglalja magában:
1. egy növényekben kifejeződni képes gén bejuttatása egy befogadó növényi sejtbe, amely gén szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
b) egy DNS-szekvenciát, amely a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódolja,
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben, és egy növényekben kifejeződni képes gént, amelynek szekvenciája tartalmaz:
d) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
e) egy DNS-szekvenciát, amely egy szelektíven felismerhető, az említett növényi gazdaszervezetben működőképes markergént kódol, és adott esetben
f) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely működőképes az említett növényi gazdaszervezetben,
2. egy növény kinevelése a transzformált sejtből olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a szelektíven felismerhető markergén jelenléte alapján történő kiválasztást.
A találmány tárgyához tartoznak továbbá még azok a növények is, amelyek a genetikai módosítás eredményeként (fokozott mértékben) termelnek trehalózt.
A találmány tárgyához tartoznak továbbá az olyan növények, amelyek rekombináns DNS-genomja egy találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes gént tartalmaz.
A találmány tárgyához tartoznak azok a növények is, amelyek rekombináns DNS-genomja egy találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes gént tartalmaz, és trehalózt termelnek.
A találmány tárgyához tartoznak azok a növények is, amelyek a találmány szerinti rekombináns DNS-genommal rendelkeznek és fokozott szárazságtűrést mutatnak.
A találmány magában foglalja a találmány szerinti növények részeit is, mint amilyenek a sejtek vagy protoplasztok, vagy azok tenyészetei, virágok, gyümölcsök, levelek, virágpor, gyökerek (ideértve a hajszálgyökértenyészeteket), magok, hajtások, gumók (ideértve az úgynevezett minigumókat is) és hasonlók.
HU 221 124 Β1
Találmányunk oltalmi körébe tartozik egy eljárás is növények vagy növényi részek tartósítására trehalóz jelenlétében, amely az alábbi lépésekből áll:
1. egy találmány szerinti, trehalózt termelő növény termesztése,
2. a trehalózt tartalmazó növényi részek betakarítása, és
3. a növények vagy növényi részek légszárítása, vagy
4. a növények vagy növényi részek fagyasztva szárítása.
A találmány tárgyához tartoznak azok a növények is, amelyeket a találmány szerinti eljárással tartósítanak.
Találmányunk magában foglal még egy eljárást trehalóz előállítására, amely a következő lépésekből áll:
1. egy olyan növény termesztése, amely egy rekombináns DNS növényi genom jelenléte következtében képes (fokozott mértékben) trehalózt termelni,
2. az említett növény vagy növényi rész betakarítása,
3. a trehalóz kivonása az említett növényből vagy az említett növényi részből.
A találmány tárgyához tartozik egy további eljárás trehalóz előállítására, amely az alábbi lépésekből áll:
1. növényi sejtek tenyésztése, amelyek egy rekombináns DNS növényi genom jelenléte következtében képesek (fokozott mértékben) trehalózt termelni,
2. a trehalóz kivonása az említett növényi sejttenyészetből.
Találmányunk magában foglal még egy izolált nukleinsavszekvenciát, amely egy trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódol. Egy előnyös izolált nukleinsavszekvencia nyerhető E. coliból, még előnyösebb az az izolált nukleinsavszekvencia, amelyet a 2. számú szekvenciavázlat mutat be. Egy másik előnyös megvalósítás az a nukleinsavszekvencia, amely a 3. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciát kódolja.
Az ábrák leírása
1. ábra. A szacharóz és a keményítő vázlatos bioszintézisútjai a növényi tárolószövetben. Az ábrán látható, hogy a levelekben, fotoszintézissel termelt szénhidrátok szacharóz alakjában szállítódnak a háncsszövetben. A tárolószövetbe lépve a szacharózt egy membránhoz kötött invertáz monoszacharidokra, glükózra és ffuktózra bontja. Ezek a monoszacharidok egy sor enzimatikus lépéssel keményítővé és/vagy szacharózzá alakulnak át, mint az elnagyoltan látható az ábrán. Feltehetően a glükóz metabolitjai, a glükóz-6-foszfát (G-6-P) és az uridin-difoszfát-glükóz (UDP-G) szolgálnak annak a TPS-enzimnek szubsztrátjaiként, amelyet a növénybe manipuláltunk a növényekben kifejeződni képes oí.vA gén bejuttatásával. Az ábrán látható, hogy az SPS- és AGP-áz-enzimek szintjének csökkentése fokozza a szubsztrátként rendelkezésre álló UDP-G és G-6-P mennyiségét. Az enzimek gátlását a keresztek jelölik.
2. ábra. Vázlatos térkép a Kohara és munkatársai (1987) által készített, 7F11 számú EMBL4 kiónról, amely az E. coliból származó oZ.sBA operont tartalmazza. A 18,8 kb hosszúságú inszertumot árnyékolással jelöltük. Az otsfs gén klónozásához használt EcoRV és HindlII enzimek restrikciós helyeit feltüntettük éppúgy, mint távolságukat kilobázispárban (kb) az inszertum bal oldali végétől számítva. Az oteA és -B géneket feltüntettük, a nyilak a transzkripció irányát jelzik (a részletes térkép a 8. ábrán látható).
3. ábra. A klónozott burgonya SPS-cDNS-ének szekvenciája. Az aláhúzott szakasz az a kukoricaSPS-cDNS-szekvencia, amit oligonukleotidként használunk a PCR-bővítő reakcióban.
4. ábra. A pMOG664 bináris vektor vázlatos szerkezete.
5. ábra. A pTiBó egy részének restrikciós térképe, amelyen a pMOG579 vektorba klónozott két fragmentum látható.
6. ábra. A pMOG579 vázlatos szerkezete, amelyet a
T-szakasz nélküli helper plazmid megszerkesztéséhez használunk az MOG101 Agrobacterium törzsben.
7. ábra. A pMOG180 expressziós vektor vázlatos szerkezete.
8. ábra. A 7F11 számú EMBL4 klón részletes térképe
Kohara és munkatársai (1987) nyomán, ami az E. coliból származó o/.vBA operont tartalmazza. Az ábrán feltüntettük a TPS nyílt leolvasó keretének (ORF) elhelyezkedését. (*: a HindlII helyek nem szerepelnek Kohara és munkatársai térképén.)
9. ábra. A pMOG799 bináris vektor vázlatos szerkezete.
10. ábra. A pMOG801 bináris vektor vázlatos szerkezete.
11. ábra. A pMOG802 bináris vektor vázlatos szerkezete.
Találmányunk egy előnyös megvalósítása egy burgonyanövény, amely gumóiban trehalóz termelésére képes egy, növényekben kifejeződni képes gén jelenlétének következtében az említett burgonyanövényben, amely gén szekvenciája tartalmaz:
a) egy transzkripciós iniciátorszakaszt, amely a karfíolmozaikvírus (CaMV) 35S RNS-éből származik, és felülről egy kétszeres fokozó szakasz határolja,
b) egy, a trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-szekvenciát, amely az E. coli oteBA operonjában elhelyezkedő otsh. gén kódolószakasza,
c) egy transzkripciós terminátorszekvenciát, amely az Agrobacterium nopalin-szintetáz (nos)-génjéből származik. A transzgén növények gumói, amelyek tartalmazzák a növényekben kifejeződni képes TPS-gént, trehalózt termelnek, míg a kontrollnövények, amelyekből ez a gén hiányzik, nem. Nyilvánvaló, hogy a transzgén gumókban termelődő trehalóz-foszfát trehalózzá alakul át. Nyilvánvaló, hogy nincs szükség egy trehalóz-foszfát-foszfatáz-aktivitás biztosítására, mivel az - úgy látszik - jelen van a burgonyában.
Az 1. ábrán bemutatunk egy módot a TPS jobb szubsztrátellátottságának biztosítására. E célból a glü4
HU 221 124 Bl kóz-6-foszfát és az uridin-difoszfát-glükóz hozzáférhetőségét befolyásoló két gént, egy antiszensz SPS-gént és egy antiszensz AGP-áz-gént klónozunk a CaMV 35S promoter szabályozó hatása alatt a növényi gazdaszervezetben való kifejeződés céljára. Ha ezeket bejuttatjuk egy olyan növényi gazdaszervezetbe, amely a találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes TPSgént tartalmazza, fokozódni fog a TPS szubsztrátellátottsága és ennek megfelelően a trehalózszintézise is. A szakterületen járatosak könnyen rájöhetnek, hogy más antiszensz gének is használhatók a szacharóz vagy keményítő szintézisének gátlására a szubsztrátellátottság javítása céljából.
Noha találmányunkat részletesen burgonyanövényen írjuk le, amiben az E. coliból származó, növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfát-szintetáz-gén kifejeződik a CaMV 35S promoter mint transzkripciós iniciátorszakasz szabályozó hatása alatt, a szakterületen járatosak előtt nyilvánvaló lehet, hogy más magasabb rendű növényi gazdaszervezetek ugyanúgy alkalmasak lehetnek a trehalóz termelésére. Előnyös növényi gazdaszervezetek lehetnek a zárvatermők (Angiospermae), nevezetesen a kétszikűek (Dicotyledoneae), ahová többek között a burgonyafélék (Solanaceae) tartoznak reprezentatív családként, és az egyszikűek (Monocotyledoneae), ahová többek között a pázsitfűfélék (Gramineae) tartoznak reprezentatív családként. A megfelelő növényi gazdaszervezetek közé tartoznak - találmányunk szempontjából meghatározva - azok a növények (valamint az említett növények részei és sejtjei) és utódaik, amelyeket genetikailag módosítottunk rekombináns DNS-technikával a trehalóz termelésének megindítása vagy fokozása érdekében a kívánt növényben vagy növényi szervben; ezek a növények felhasználhatók közvetlenül (például azok a növényfajok, amelyek ehető részeket teremnek), vagy a trehalóz kinyerésére (ami történhet mind ehető, mind ehetetlen növényi gazdaszervezetekből). A találmány szerinti, ehető részeket termő növények közé tartoznak azok, amelyeknek virágzatát fogyasztják, például a karfiol (Brassica oleracea) vagy az articsóka (Cynara scolymus); amelyeknek gyümölcsét fogyasztják, például az alma (Malus pumila), a banán (Musa acuminata), a bogyós gyümölcsök, mint a ribiszke (Ribes rubrum), a szilvák [például a cseresznye (Prunus avium), az őszibarack (P. persica), a nemes szilva (P. domestica)], az uborka (Cucumis sativus), a szőlő (Vitis vinifera), a citrom (Citrus limon), a sárgadinnye (Cucumis meló), az olajos magvúak [például a dió (Juglans regia), a földimogyoró (Arachis hypogeae)], a narancs (Citrus sinensis), a körte (Pyrus communis), a paprika (Solanum capsicum), a szamóca (Fragaria moschata) vagy a paradicsom (Lycopersicon esculentum); amelyeknek leveleit fogyasztják, például a lucerna (Medicago sativa), a káposzták (Brassica oleracea), az endívia (salátakatáng; Cichorium endivia), a póréhagyma (Allium porrum), a saláta (Lactuca sativa), a paraj (spenót; Spinacia oleracea), a dohány (Nicotiana tabacum); amelyeknek a gyökerét fogyasztják, például a nyílgyökér (Maranta arundinacea), a cukorrépa (Béta vulgáris), a sárgarépa (Daucus carota), a kasszava (manióka, Manihot esculenta), a tarlórépa (Brassica rapa), a retek (Raphanus sativus), a jamszgyökér (Dioscorea esculenta) vagy az édesburgonya (Ipomoea batatas); amelyeknek a magvait fogyasztják, például a bab (Phaseolus vulgáris), a borsó (Pisum sativum), a szója (Glycine max), a búza (Triticum aestivum), az árpa (Hordeum vulgare), a kukorica (Zea mays) vagy a rizs (Oryza sativa); és amelyeknek a gumóit fogyasztják, például a karalábé (Brassica oleracea) vagy a burgonya (Solanum tuberosum), vagy hasonlók. Az ehető részek szárítással tartósíthatok a fokozott trehalózszint jelenlétében, amely bennük termelődött a növényekben kifejeződni képes trehalózfoszfát-szintetáz-gén jelenléte következtében. A fokozott szintű trehalóztermelés érdekében előnyös a TPSaktivitást kódoló DNS-t egy növényi szerv- vagy szövetspecifikus promoter szabályozó hatása alá rendelni; annak megválasztása könnyen eldönthető a szakemberek számára.
Bármely trehalóz-foszfát-szintetáz-gént a DNS növényi sejtekben történő kifejeződéséhez szükséges szabályozóelemek hatása alatt - akár specifikus, akár konstitutív - használhatunk, ha az képes egy aktív trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitás termelésére. A 2. számú szekvenciavázlat nukleinsavszekvenciája a valóságban bármely, a találmány szerinti trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódoló nyílt leolvasókeretben megváltoztatható az általa kódolt fehérje aminosavszekvenciájának szükségszerű megváltozása nélkül. Ez a genetikai kód degeneráltságának következménye. így tehát a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódoló nyílt leolvasókeret a kiválasztott növényi gazdaszervezet kódhasználatához adaptálható.
Ugyancsak a 2. számú szekvenciavázlat izolált nukleinsavszekvenciája használható fel a trehalóz-foszfátszintetáz-aktivitás kimutatására más szervezetekben, majd azt követően izolálására úgy, hogy a más forrásokból származó DNS-t az E. coli-génből nyerhető DNS- vagy RNS-fragmentumokkal hibridizáljuk. Az ilyen DNS-szekvenciákat előnyösen szigorú körülmények között (mint például a hőmérséklet, vagy a hibridizációs elegy ionerőssége), hibridizációval vizsgáljuk. A körülmények szigorúsága függ a hibridizáció jellegétől - azaz DNS: DNS, DNS: RNS vagy RNS: RNS hibridizáció -, valamint a legrövidebb hibridizálóffagmentum hosszától. A szakterületen jártasak számára egyszerű egy szigorú hibridizációs rendszer kialakítása.
A trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitás izolálásának forrásai lehetnek mikroorganizmusok (például baktériumok, élesztők, gombák), növények vagy állatok. A más forrásokból származó, trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást kódoló DNS-szekvenciák a találmány szerintihez hasonló eljárással használhatók fel trehalóz termelésére.
A találmány oltalmi körébe tartoznak olyan nukleinsavszekvenciák is, amelyeket a 2. számú szekvenciavázlat nukleinsavszekvenciájának módosítása útján kapunk meg egy vagy több kodon mutációval történő megváltoztatásával úgy, hogy az változást eredményez a fehérje aminosavszekvenciájában is, addig a határig,
HU 221 124 Β1 amíg az aminosavszekvencia mutációja nem szünteti meg teljesen a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitást.
Elvben bármely növényi gazdaszervezet alkalmas bármely, növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfát-szintetáz-génnel való kombinálásra. Amint más forrásokból származó trehalóz-foszfát-szintetáz-gének elérhetővé válnak, úgy azokat hasonló módon lehet majd használni az itt leírt, növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfát-szintetáz-génkombinációk létrehozásához.
Az endogén gének gátlása a trehalóz-foszfát-szintetáz szubsztrátellátottságának fokozása érdekében amire példaként említettük az endogén szacharóz-foszfát-szintetáz- és az ADP-glükóz-pirofoszforiláz-gén gátlását - számos módon valósítható meg, aminek megválasztása találmányunk szempontjából nem kritikus. Előnyös géngátlás érhető el az úgynevezett „antiszensz megközelítés”-sel. Ekkor egy olyan DNS-szekvencia fejeződik ki, amely egy olyan RNS-t termel, amely legalább részben komplementer azzal az RNS-sel, ami azt az enzimatikus aktivitást kódolja, amelyet gátolni kívánunk (példánkban az AGP-ázt vagy az SPS-t). Előnyös a homológ antiszensz (értelmetlen) gének használata, mert hatásosabbak a heterológ géneknél. E stratégia megvalósíthatóságát egy antiszensz SPS-gén burgonyából, egy kukorica-SPS-génszekvenciával mint szondával végzett izolálása bizonyítja. Ezzel nem arra kívánunk utalni, hogy találmányunk megvalósításához szükség van a homológ antiszensz fragmentumok használatára. A nem kívánt enzimatikus aktivitások szintézise egy alternatív módszerrel is blokkolható, amikor a növényi gazdaszervezetben jelen lévő endogén gén egy további másolatát építjük be a növényi gazdaszervezet genomjába. Gyakran megfigyelték, hogy egy gén egy további másolata elnémítja az endogén gént: ezt a hatást a szakirodalomban koszupresszív hatásnak vagy koszupressziónak nevezik.
Elvben azok a kétszikű és egyszikű növények, amelyek könnyebben transzformálhatok, módosíthatók úgy is, hogy egy találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes gént juttatunk egy befogadó sejtbe és felnevelünk egy új növényt, amely tartalmazza és kifejezi a növényekben kifejeződni képes gént. Találmányunk szempontjából azok a növények az előnyösek, amelyek képesek a trehalóz-foszfát trehalózzá konvertálására és nem vagy csak nagyon csekély trehalózlebontó aktivitást tartalmaznak. Belátható azonban, hogy azok a növények, amelyekből hiányzik a trehalóz-foszfát trehalózzá konvertálásának képessége, szintén találmányunk oltalmi körébe tartoznak. Az ilyen növények tovább módosíthatók járulékos gének bejuttatásával, amelyek olyan foszfatázokat kódolnak, amelyek képesek a trehalóz-foszfát trehalózzá konvertálására. Elvben azokkal a növényekkel is számolhatunk, amelyek trehalázokat tartalmaznak, mivel az ilyen növények alkalmassá tehetők a trehalóz termelésére a trehalázok aktivitásának gátlásával, például úgy, hogy az ilyen enzimeket kódoló gének kifejeződését gátolják az antiszensz megközelítés útján.
A növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfátszintetáz-gén bejuttatásának módja egy befogadó növényi sejtbe nem lényeges mindaddig, amíg a gén stabilan beépül az említett növényi sejt genomjába. Az Agrobacterium törzsek használata mellett számos más technika áll rendelkezésre a DNS bejuttatására növényi sejtekbe, mint például protoplasztok transzformálása a kalcium/polietilénglikol módszerrel, elektroporáció és mikroinjektálás, vagy a (bevont) szemcsék belövése [Potrykus, Bio/Technology 8, 535-542 (1992)].
A fenti, úgynevezett közvetlen transzformálómódszerek mellett vektorokat alkalmazó transzformálórendszerek széles köre is rendelkezésre áll, mint amilyenek a virális vektorok (például a karfiol-mozaikvírus, CaMV) és a bakteriális vektorok (például az Agrobacterium nemzetség fajai; Potrykus, idézett mű). Szelekció és/vagy szűrővizsgálat után a transzformálódott protoplasztok, sejtek vagy növényi részek teljes növényekké regenerálhatok a szakterületen ismert módszerekkel [Horsch és munkatársai, Science 225, 1229-1231 (1985)].
Ismert, hogy egyszikű növények alkalmasak a transzformációra, és fertilis transzgén növények regenerálhatok a transzformált növényekből. A reprodukálható szövettenyészet-rendszerek kifejlesztése, valamint a genetikai anyag növényi sejtekbe juttatására szolgáló erőteljes módszerek együtt elősegítik a transzformációt. Jelenleg az egyszikűek transzformálásának előnyös módszerei a mikroszemcsék belövése a növényi szövetdarabokba vagy a szuszpendált sejtekbe, és a DNS közvetlen felvétele vagy elektroporáció [Shimamoto és munkatársai, Natúré 338, 274-276 (1989)]. Transzgén kukoricanövényeket hoztak létre a Streptomyces hygroscopicus bar génjének bejuttatásával - amely a foszfinotricin-acetil-transzferázt kódolja (ez az enzim a foszfinotricin herbicidet inaktiválja) - a kukorica szuszpenziós tenyészetének embriogén sejtjeibe mikroszemcsék belövésével [Gordon-Kamm, Plánt Cell 2, 603-618 (1990)]. Beszámoltak genetikai anyag bejuttatásáról más egyszikűek, például búza és árpa aleuron protoplasztjaiba is [Lee, Plánt Mól. Bioi. 13, 21-30 (1989)]. Búzanövényeket regeneráltak embriogén szuszpenziós tenyészetből úgy, hogy csak az idősebb, kompakt és csomósodott embriogén kalluszszövetet választották ki az embriogén szuszpenziós tenyészet létrehozásához [Vasil, Bio/Technology 8, 429-443 (1990)]. A transzformáló rendszerek kombinálása ezekhez a növényekhez lehetővé teszi találmányunk egyszikűekre való alkalmazását. Ugyanakkor ezek a módszerek kétszikűek transzformálására és regenerálására is alkalmazhatók.
Egyszikű növények, köztük gazdaságilag fontos kultúrák, mint a kukorica, alkalmasak az Agrobacterium törzsekkel végzett DNS-transzferre [159.418 B1 számú európai szabadalmi leírás; Gould és munkatársai, Plánt Physiol. 95, 426-434 (1991)].
Ami a növényi gazdaszervezet megválasztását illeti, előnyös olyan növényfajt választani, amely nem, vagy csak kisfokú trehalózlebontó aktivitással rendelkezik. Nem zárható ki azonban, hogy egy trehalázaktivitással bíró növény megfelelő gazdaszervezet legyen a trehalóz termeléséhez, ámbár szükségessé válhat a trehalázaktivitás gátlásának biztosítása, ha az teljesen
HU 221 124 Β1 megakadályozza a trehalóz felhalmozódását. Az ilyen gátlás megvalósítható a szakterületen jól ismert antiszensz megközelítéssel, és más célra alkalmazva találmányunkban is bemutatjuk.
Belátható az is, hogy találmányunk nem korlátozódik a CaMV 35S promoter mint transzkripciós iniciátorszakasz használatára. A növényekben kifejeződni képes gének kifejeződését szabályozó, alkalmas DNSszekvenciák - köztük markergének, például transzkripciós iniciátorszakaszok, fokozok, nem átíródó vezérszekvenciák és hasonlók - származhatnak bármely olyan génből, amely egy növényi sejtben kifejeződik, például endogén növényi génből, növényi sejtekben természetes körülmények között kifejeződő génekből, például az Agrobacterium vad típusú T-DNS-én találhatókból, növényi vírusok génjeiből, valamint más eukarióta génekből, amelyek tartalmaznak egy transzkripciós iniciátorszakaszt, ami megfelel a transzkripciós iniciátorszakasz konszenzusszekvenciájának. Ugyancsak használhatók a hibrid promoterek, amelyek különböző promoterek funkcionális darabjaiból vagy azok szintetikus megfelelőiből vannak összekombinálva. A konstitutív promotereken kívül használhatók indukálható, vagy kifejeződésük során bármilyen más módon, például fejlődés- vagy sejttípus-specifikus módon szabályozott promoterek is a találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes gének kifejeződésének szabályozására mindaddig, amíg az olyan növényi részekben kifejeződnek, amelyek a TPS szubsztrátját tartalmazzák.
A transzformált sejtek kiválasztása vagy szűrővizsgálata céljából előnyös egy markergént kapcsolni a találmány szerinti, növényekben kifejeződni képes génhez, amit a növényi sejtbe juttatunk. A növény transzformálásához megfelelő markergén megválasztása jóval belül van az átlagosan képzett dolgozó ismeretkörén; a rutinszerűen használt markergénekre néhány példa a neomicin-foszfotranszferáz-gének, amelyek kanamicinrezisztenciát okoznak (EP-B 131.623 számú európai szabadalmi leírás), a patkánymájból izolált glutation-S-transzferáz-gén, ami rezisztenciát biztosít egyes herbicidekkel szemben (EP-A 256.223 számú európai szabadalmi leírás), a glutamin-szintetáz, amely túltermeléses rezisztenciát biztosít a glutamin-szintetáz gátlószereivel, például a foszfínotricinnel szemben (WO87/057327 számú európai szabadalmi leírás), a Streptomyces viridochromogenes acetil-transzferázgénje, amely szintén a foszfínotricinnel szemben nyújt rezisztenciát (EP-A 275.957 számú európai szabadalmi leírás), az 5-enol-sikimát-3-foszfát-szintetáz-génje, amely az N-(foszfono-metil)-glicinnel szemben okoz rezisztenciát, a bar gén, amely rezisztenciát okoz a bialafosz ellen (például a W091/02071 számú nemzetközi szabadalmi leírás), és a hasonlók. A marker megválasztása nem kritikus, amíg az működőképes (azaz szelektív) a választott növényi sejttel kombinálva.
A markergént és a szóban forgó gént nem szükséges összekapcsolni, mert az összekapcsolatlan gének kotranszformálása (4.399.216 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) szintén hatásos módszere a növények transzformálásának.
A transzformálás számára előnyös növényi anyag különösen kétszikűek esetében - a levélkorong, ami könnyen transzformálható és jó a regenerációs képessége [Horsch és munkatársai, Science 227, 1229-1231 (1985)].
Bár a trehalóz termelése megvalósítható a növényekben kifejeződni képes trehalóz-foszfát-szintetáz-génnel, mint egyetlen szénhidrát-módosító génnel, találmányunkban példákat mutatunk be olyan járulékos, növényekben kifejeződni képes antiszensz génekre, amelyek képesek fokozni a trehalóz-foszfát-szintetáz szubsztrátellátottságát. Az ilyen génekre speciális példák a kukorica és a burgonya SPS-ának és a burgonya AGPázának növényekben kifejeződni képes antiszensz génjei. A szénhidrát-anyagcsere enzimeinek „leszabályozása” az antiszensz megközelítés alkalmazásával nem korlátozódik a fenti példákra. így például részlegesen komplementer, növényekben kifejeződni képes antiszensz gének használhatók egy célgén kifejeződésének gátlására akkor, ha a növényekben kifejeződni képes antiszensz gén egy olyan transzkriptumot termel, amely megfelelő mértékben komplementer a célgén transzkriptumával és kellő hosszúságú ahhoz, hogy az említett célgén kifejeződését gátolja.
Találmányunk szempontjából közömbös, hogy a két vagy több gén jelenlétét ugyanazon növényben hogyan érjük el. Ez többek között az alábbi módszerek egyikével valósítható meg:
a) a növényvonal transzformálása egy multigénszerkezettel, ami egynél több bejuttatandó gént tartalmaz,
b) ugyanazon növényvonal kotranszformálása különböző szerkezetekkel egy időben,
c) ugyanazon növény többszöri, egymást követő transzformálása a bejuttatandó génekkel,
d) két olyan növény keresztezése, amelyek az ugyanabba a növénybe juttatni kívánt, különböző géneket hordozzák.
Találmányunk alkalmazásának területe a mezőgazdaság és a kertészet, például a módosított növények jobb tulajdonságai miatt, valamint az ipar bármely ága, ahol trehalózt használnak vagy használni fognak. A trehalóz-foszfátot és a trehalózt használhatják mint olyanokat például tisztított formában vagy keverékekben, vagy tárolt tennék formájában a növényi részekben. A (fokozott mennyiségű) trehalóz-foszfátot vagy trehalózt tartalmazó növényi részek használhatók önmagukban, vagy feldolgozhatok anélkül, hogy szükség lenne trehalóz hozzáadására.
A trehalóz ki is vonható a termelő növényekből vagy növényi részekből, és azt követően felhasználható ipari eljárásokban. Az élelmiszeriparban a trehalóz arra használható, hogy élelmiszerekhez adják szárítás előtt. Az élelmiszerek szárítása fontos ipari tartósító módszer. A trehalóz különösen jól használhatónak tűnik az élelmiszer-ipari termékek hagyományos, légszárítással történő tartósításában, és lehetővé teszi a magas minőségű termék gyors visszaalakulását a víz hozzáadása után (Roser és munkatársai, Trends in Food Sci. Technoi. 1991. július, 166-169). Az előnyök közé tartozik a természetes aromák és illatanyagok, a friss termék íze és
HU 221 124 Β1 tápértéke (a fehérjék és vitaminok) megőrzése. Kimutatták, hogy a trehalóz képes a fehérjék és membránok stabilizálására, és egy kémiailag inért, stabil üvegmáz kialakítására. Az ilyen, tökéletesen megszárított élelmiszerek alacsony vízaktivitása megelőzi a kémiai reakciókat, amelyek selejtet okozhatnak.
Ipari növények, mint a kukorica, kasszava, burgonya, cukorrépa és cukornád, régóta használatosak a szénhidráttermékek (keményítők és szacharóz) tömeges előállítására. A trehalóz termelése ezekben a növényekben, elősegítve a trehalóz bioszintézisútjának génmanipulációval végzett beépítése által, lehetővé tenné az ilyen manipulált növények felhasználását a trehalóz termelésére.
Találmányi bejelentésünkben a hivatkozások a szakterület azon szintjét jelentik, amelyen találmányunk alapszik. Az összes közleményt és szabadalmi leírást, amelyre eddig hivatkoztunk vagy amelyekre később hivatkozni fogunk, találmányi bejelentésünkben referenciaként tartjuk számon.
Az alább következő példákat a lehetőségek bemutatására szánjuk és azok semmi módon nem korlátozzák találmányunk oltalmi körét.
Kísérleti módszerek DNS-sel végzett műveletek
Az összes, DNS-sel végzett műveletet (a DNS izolálását E. coliból, hasítását, kapcsolását, transzformálását stb.) a standard receptúrák szerint hajtjuk végre (Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, 1989).
Törzsek
Minden példában az E. coli K-12 DH5a törzsét használjuk a klónozáshoz. A növények transzformálásához használt Agrobacterium tumefaciens törzs az MOG101, amely az LÁB 1010 törzsből [Koekman és munkatársai, Plasmid 7, 119 (1982)] a T-DNS-nek egy szpektinomicinrezisztencia-markerrel való helyettesítésével létrehozott, nem onkogén oktopin típusú helpertörzs.
Az MOG101 Agrobacterium törzs létrehozása
Egy bináris vektorrendszert [Hoekema és munkatársai, Natúré, 303, 197 (1983)] használunk a génszerkezetek bejuttatására a burgonya- és dohánynövényekbe. A helperplazmid, amely az Agrobacterium tumefaciens virulenciafunkcióit adja, a pTiBó oktopin Ti-plazmidból származik. Az MOG101 egy olyan Agrobacterium tumefaciens törzs, amely egy nem onkogén Ti-plazmidot hordoz (Koekman és munkatársai, idézett mű), amiből a teljes T-szakasz ki van vágva és egy bakteriális szpektinomicinrezisztencia-markerrel van helyettesítve a Tnl831 transzpozonból [Hooykaas és munkatársai, Plasmid 4, 64-75 (1980)].
A pTiB6 Ti-plazmid két szomszédos T-szakaszt, a TL-t (bal oldali T) és a TR-t (jobb oldali T) tartalmaz. A TL- és TR-hiányos származék létrehozásához megszerkesztjük a pMOG579 átmeneti vektort. A pMOG579 plazmid a pBR322 plazmidnak egy olyan származéka, amely két olyan Ti-plazmid-fragmentumot tartalmaz, amelyek homológok a pTiB6 T-szakaszaitól balra és jobbra kifelé elhelyezkedő fragmentumokkal (az
5. és 6. ábrán árnyékolással jelölve). A két fragmentumot a pMOG579-ben egy 2,5 kb hosszúságú BamHI/HindlII fragmentum választja el, ami Tnl831 transzpozonból származik [Hooykaas és munkatársai, Plasmid 4, 64-75 (1980)], és a szpektinomicinrezisztencia-markert hordozza (6. ábra). A plazmidot bejuttatjuk az LBA1010 jelzésű Agrobacterium tumefaciens törzsbe [C58-C9 (pTiB6) = egy kigyógyított C58 törzs, amelybe a pTiB6 plazmidot triparentális mating útján visszük be E. coliból, a HB101 8pRK2013 helperként való használatával. A transzkonjugánsokat rifampicin- (20 mg/1) és szpektinomicin- (250 mg/1) rezisztenciájuk alapján választjuk ki. Egy kettős rekombináció a pMOG579 és pTiB6 között a karbenicillinrezisztencia (a pBR322 marker) elvesztését és a teljes Tszakasz kiesését okozza, A mintegy 5000 szpektinomicinrezisztens transzkonjugánsból, amit replikamódszerrel vizsgáltunk 100 mg/1 karbenicillinen, mindössze kettőt találtunk érzékenynek. A Southem-analízis azt mutatta, hogy a kettős átkereszteződési esemény kivágta a teljes T-területet. Az így kapott törzs az MOG101. A törzs és megszerkesztése analóg a GV2260 törzsével [Deblaere és munkatársai, Nucl. Acid Rés. 13, 4777-4788 0985)].
Az MOG101 helyett helpertörzsként használhatjuk például az LBA4404-et; ez a törzs ugyancsak megfelelően használható egy bináris plazmid, mint amilyen a pMOG779 bejuttatására és az azt követő növénytranszformálásra. Más megfelelő helpertörzsek is elérhetők.
A pMOG180 expressziós vektor létrehozása
A pMOG180 expressziós vektor a pMOG18 (EP-O 479.359 Al számú európai szabadalmi leírás, 2b. példa) vektor származéka, amiből a GUS-t kódoló gént eltávolítjuk és más géneket inszertálunk az AMV RNS4 vezérszekvencia és a 3’ nos terminátor közé egy BamHI fragmentum alakjában.
Ebből a célból a pMOG18 EcoRI/NcoI fragmentumát, amely a 35S promotert és az AMV RNS4 vezérszekvenciát tartalmazza, PCR-technikát használva szintetikus úton állítjuk elő az alábbi indítószakaszokkal:
5' GTTTCTACAGGACGGAGGATCCT GGAAGTATTTGAAAGA 3 ’ és ’ CAGCTATGACCATGATTACG 3 ’ amivel az Ncol helyet BamHI hasítási hellyé mutáltatjuk. A pMOG18 vektort ezután EcoRI-gyel és BamHI-gyel elvágjuk, ami után az újonnan szintetizált EcoRI/BamHI fragmentumot beragaszthatjuk a restrikciós helyek közé. A PCR-technika okozta véletlen mutációk elkerülésére a promoterszekvenciákban, a szintetikus EcoRI/BamHI fragmentum EcoRI/EcoRV szakaszát kicseréljük egy vad típusú szekvenciára a pMOG18 plazmidból. A rövid EcoRV/BamHI szakaszt szekvenálással ellenőrizzük. Az így kapott plazmidvektor a pMOG180 (7. ábra).
Triparentális mating
A bináris vektorokat a pRK2013 plazmidot [Ditta és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347 (1980)] tartalmazó HB101 E. coli törzsön keresztül jut8
HU 221 124 Β1 tatjuk az Agrobacterium tumefaciens MOG101 törzsbe és használjuk fel transzformálásra.
A dohány (Nicotiana tabacum SRI) transzformálása
A dohányt a leírt bináris vektort hordozó A. tumefaciens MOG101 törzs [Hoekema és munkatársai, Natúré 303, 179-180 (1983)] és a növényi szövetek együttes tenyésztésével transzformáljuk. Ezt úgy vitelezzük ki, hogy a dohány (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI) levélkorongjait használjuk Horsch és munkatársai [Science, 227, 1229-1231 (1985)] leírása szerint. A transzgén növényeket a szelekciós táptalajon amely vagy kanamicint, vagy higromicint tartalmaz a bináris plazmidban jelen levő rezisztenciagénnek megfelelően - kinövő hajtásokból regeneráljuk, gyökereztetjük és ültetjük át talajba.
A burgonya transzformálása
A burgonyát (Solanum tuberosum cv. Désiree) a szóban forgó bináris vektort hordozó A. tumefaciens MOG101 törzzsel transzformáljuk a leírásnak megfelelően [Hoekema és munkatársai, Bio/Technology 7, 273 (1989)]. Az alaptápközeg az MS3OR3, amely MS-tápközegből [Murashige és Skoog, Physiol. Plán. 14, 4Ί3 (1962)] áll, kiegészítve 30 g/1 szacharózzal, R3 vitaminokkal [Ooms és munkatársai, Theor. Appl. Génét. 73, 744 (1987)], 5 pmol zeatin-riboziddal (ZR) és 0,3 pmol indol-ecetsavval (IAA). A tápközeget, ha szükséges, 0,7 g/1 Diachin agarral szilárdítjuk meg.
A Solanum tuberosum cv. Désiree gumóit meghámozzuk és felületüket 0,1% Tween-20-at tartalmazó 0,6%-os nátrium-hipoklorit-oldattal 20 percen át fertőtlenítjük. Ezután a burgonyákat nagy térfogatú steril vízben alaposan mossuk legalább 2 órán át. A gumószövetből dugófúróval készített hengereket körülbelül 2 mm vastagságú korongokra vágjuk. A korongokat 20 percig inkubáljuk egy szuszpenzióban, ami ZR-ot és IAA-at nem tartalmazó MS3OR3 tápközegből és 10ő-107 baktérium/ml mennyiségű, a bináris vektort hordozó Agrobacterium MOGlOl-ből áll. A korongokat ezután szárazra itatjuk steril szűrőpapíron és átrakjuk ZR-ot és IAA-at tartalmazó, szilárd MS3OR3 táptalajra. Két nap múlva a korongokat átrakjuk egy friss táptalajra, amely 100 mg/1 cefotaximot és 50 mg/1 vankomicint tartalmaz. Egy hét után a korongokat újra átrakjuk ugyanarra a táptalajra, ami ekkor 100 mg/1 kanamicint tartalmaz a transzgén hajtások kiválasztásához. A korongokból kiemelkedő hajtásokat 4-8 hét múlva levágjuk és gyökereztető táptalajba tesszük át (MS3OM3 ZR és IAA nélkül, 100 mg/1 cefotaximmal és 100 mg/1 kanamicinnel). A hajtásokat axenikus körülmények között, merisztémaosztással szaporítjuk és a gyökerek megjelenése után talajba ültetjük át. Itt 10 mg/1 higromicint használunk a szelektálásra a 100 mg/1 kanamicin helyett.
A cv. Kardal burgonyát lényegében a cv. Désireevel azonos módon transzformáljuk, kivéve az alábbi módosításokat. A növényi hormonok mennyisége az alaptápközegben: 3,5 mg/1 zeatin-ribozid és 0,03 mg/1 indol-ecetsav. A transzformáláshoz használt Agrobacterium-szuszpenzióban a csíraszám 105—106 baktérium/ml. A kanamicin koncentrációja a gyökereztető táptalajban 50 mg/1.
A trehalóz mérése
A trehalózt lényegében Hottiger és munkatársai [J. Bact. 169, 5518 (1987)] leírása szerint mérjük. A burgonyagumó-szövetet folyékony nitrogénban megfagyasztjuk, mozsárban elporítjuk és ezután 60 percen át extraháljuk szobahőmérsékleten, körülbelül háromszoros térfogatnyi, 500 mmol-os triklór-ecetsav-oldatban. Centrifugálás után az üledéket még egyszer extraháljuk ugyanígy. A két extrakció egyesített felülúszóját antronpozitív anyag jelenlétére vizsgáljuk [Spiro, Meth. Enzymol. 8, 3 (1966)]. A trehalózt vékonyrétegkromatográfiával azonosítjuk. Az extraktumot ionmentesítjük (Merck, Ion exchanger V) és Silica Gél 60 (Merck) lemezekre visszük fel. Miután a lemezeket butanol: piridin: víz = 15:3:2 térfogatarányú oldószerelegyben megfuttattuk, a foltokat tömény kénsavban oldott 5 mg/ml vanillinnal permetezve és 130 °C-ra melegítve tesszük láthatóvá. Standardnak kereskedelmi (Sigma) trehalózt használunk.
A trehalóz kvantitatív mérését ioncserélő kromatográfiával és impulzusüzemű amperometriás detektorai végezzük. Az extraktumot úgy készítjük, hogy 1 ml forró vizet adunk 1 g fagyasztott anyaghoz és 15 percen át forraljuk tovább. A 25 μΐ-es mintákat egy Dionex DX-300 folyadékkromatográfban vizsgáljuk, amely 4x250 mm-es Dionex 35391 Carbopac PA-1 oszloppal és egy 4x50 mm-es Dionex 43096 Carbopac PA-1 előtétoszloppal van felszerelve. Az eluálást 100 mM nátrium-hidroxid-oldattal, 1 ml/perc sebességgel végezzük. A cukrokat egy Dionex PAD-2 impulzusüzemű amperometriás detektor érzékeli. Standardnak kereskedelemben kapható (Sigma) trehalózt használunk.
Az enzimek mérése
Minden méréshez nem transzgén gumóanyagot vagy nem transzgén dohányanyagot használunk kontrollként. A minták fehérjetartalmát Bradford szerint határozzuk meg [Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)]. A gumókivonatokban végzett mérésekhez körülbelül 100 mg-os fagyasztott burgonyagumó-szeleteket homogenizálunk 100 μΐ 20 mmol-os HEPES-pufferben (pH = 7,4), és centrifugáljuk (Eppendorfkészülék, 5 perc maximális sebességen). Az aktivitás méréséhez a felülúszót használjuk.
SPS-aktivitás mérése
Az SPS-aktivitást lényegében Amir és Preiss leírása szerint végezzük [Plánt Physol. 69, 1027-1030 (1982)]. A reakcióelegy összetételének megváltoztatásával az SPS-aktivitás két különböző formája mérhető meg: a Vmax és a Vse,-A Vmax reakcióelegy 3,2 mmol UDP-glükózt, 81 pmol [14C]-UDP-glükózt, 3,2 mmol fruktóz-6-foszfátot, 16 mmol glükóz-6-foszfátot, 100 mmol HEPES-puffert (pH=7,4), 20 mmol magnézium(ll)-kloridot és 5 mmol EDTA-t tartalmaz 50 μΐ végtérfogatban. A Vse| reakcióelegyben a fruktóz-6foszfát és glükóz-6-foszfát koncentrációját megfelezzük és 5 mmol szervetlen foszfátot adunk hozzá. Kontrollként az SPS-aktivitást a VmM reakcióelegyben mérjük ffuktóz-6-foszfát és glükóz-6-foszfát nélkül. A reak9
HU 221 124 Β1 ciót szobahőmérsékleten, 30 percig folytatjuk, és az elegy 5 percen át 95 °C hőmérsékletre melegítésével állítjuk meg. A reakció termékeit alkalikus foszfatázzal kezeljük, a kapott [14C]-szacharózt ioncserélő kromatográfiával választjuk el a szubsztrátoktól. A reakcióban 5 keletkező, radioaktivitással jelölt szacharóz mennyiségét szcintillációs számlálóval mérjük meg.
TPS-aktivitás mérése
A TPS-aktivitást az SPS-aktivitással azonos módon mérjük. Az ioncserélő kromatográfia után a minták 10 defoszforilált szacharózt és trehalózt tartalmaznak. Annak megmérésére, hogy a keletkezett termékeknek mekkora hányada a trehalóz, a mintákat a már leírt módon, vékonyréteg-kromatográfiával elválasztjuk. Az extraktumokat ionmentesítjük (Merck, Ion exchanger V) és Silica Gél 60 (Merck) lemezekre visszük fel. A kromatografálás után a [14C]-szacharózt és a [14C]-trehalózt tartalmazó foltokat lekaparjuk és egy szcintillációs számlálóban mérjük.
AGP-áz-aktivitás mérése
Az AGP-áz-aktivitást Müller-Röber és munkatársai szerint mérjük [EMBO J. 11, 1229 (1992)]. A glükóz-1foszfát keletkezését mérjük ADP-glükózból egy NADfüggő glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz-rendszerben.
A reakcióelegy 80 mM HEPES-puffert (pH = 7,4), 25 10 mM magnézium(II)-kloridot, 1 mM ADP-glükózt,
0,6 mM NADot, 10 μΜ glükóz-1,6-difoszfátot, 3 mM ditiotreitolt (DTT), 0,02% marha-szérumalbumint, 1 U nyúlizom-foszfo-glükomutázt (Sigma), 2,5 U NADfüggő Leuconostoc mesenteroides glükóz-6-foszfát-de- 30 hidrogenázt és burgonyagumó-kivonatot tartalmaz.
A reakciót tetranátrium-difoszfát 2 mM végkoncentrációig való hozzáadásával indítjuk meg. A NAD redukcióját spektrofotometriával mérjük 340 nm-nél, 30 °C hőmérsékleten. Az AGP-áz-aktivitás egysége: 1 nmol glükóz-1-foszfát keletkezik 1 perc alatt, 30 °C hőmérsékleten.
1. példa
Teljes hosszúságú E. coli otsA gén klónozása Az E. coliban a trehalóz-foszfát-szintetázt (TPS) az oteA gén kódolja, ami az otoBA-operonban helyezkedik el. Ennek az operonnak a helyét az E. coli kromoszómájában, és transzkripciójának irányát ismerjük [Kaasen és munkatársai, J. Bact. 174, 889 (1992)]. Az oísA gén a 42’-nél helyezkedik el, és Kaasen és munkatársai szerint egy 18,8 kb hosszúságú fragmentumra korlátozódik az EMBL4 genomiális kiónban, Kohara és munkatársai térképén 7F 11-nek jelölve [Cell 50, 495 (1987)]. DNS-t preparálunk a 7F11 lambda-klón lizátumából és HindlII-mal emésztjük. Az izolált, 2,9 kb hosszúságú HindlII fragmentumot (a Jobb oldali” HindlII hely a 15 14,3 kb-nál az inszertumban nincs feltüntetve Kohara és munkatársai térképén, amint azt már Kaasen és munkatársai megjegyezték) a HindlII-mal kiegyenesített pUC18 plazmidba klónozzuk. Az így kapott, pMOG674 jelzésű plazmid 2,9 kb hosszúságú HindlII 20 inszertum szekvenciáját meghatározzuk. A szekvencia tartalmazza az arabinóz-transzportoperon araü génjének egy részét [Scripture és munkatársai, J. Mól. Bioi. 179, 31 (1987)], a TPP-t kódoló oteB gént, amint azt Kaasen és munkatársai lokalizálták, és a TPS-t kódoló otsA gén egy részét. Eszerint az otsA gén nem korlátozódik a 2,9 kb HindlII fragmentumra, mint ahogy azt Kaasen és munkatársai állították. A szekvencia kiegészítése érdekében egy átlapoló BamHI/EcoRI fragmentumot izolálunk és részben szekvenáljuk. Az otsA gén teljes TPS-kódoló szekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlatban mutatjuk be. Az otsA gén helyzetét a 7F11 kiónban, és a használt restrikciós helyeket a 8. ábrán mutatjuk be. Egy további HindlII restrikciós hely amely nincs feltüntetve Kohara és munkatársai térké35 pén - található a 2,9 kb fragmentum „bal oldalán”.
A HindlII helyet a pMOG180 plazmidban egy SstI hely váltja fel, ha az alábbi oligonukleotidkettőst:
SstI ’ AGCTCACGAGCTCTCAGG 3 ’ 8. számú szekvenciavázlat 3 ’ GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5’ 9. számú szekvenciavázlat klónozzuk a HindlII-mal felvágott pMOG180 plazmidba. Az így kapott vektort pMOG746-nak nevezzük.
A következő oligonukleotidkettőst: 45
BamHI Sphl HindlII
Smal ' GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG 3 ’ GGGGCCCCGTA CGTTCGAA CCTA G
BamHI ’ 10. számú szekvenciavázlat 5’ 11. számú szekvenciavázlat a BamHI-gyel kiegyenesített pMOG746 vektorba klónozzuk. A vektort a kívánt orientációjú oligonukleotidkettőssel (restrikciós enzimes emésztéssel ellenőrizve) pMOG747-nek nevezzük. A pMOG674 vektor 2,9 kb HindlII fragmentumát a HindlII-mal kiegyenesített pMOG747 plazmidba klónozzuk, és így kapjuk a pMOG748 plazmidot. A körülbelül 2,4 kb hosszúságú
EcoRV/SstI és a körülbelül 3,5 kb hosszúságú SstFSmal fragmentumokat izoláljuk a pMOG748 plazmidból, összekapcsoljuk és E. coliba transzformáljuk, amivel kiejtjük a 2,9 kb-os HindlII fragmentum 3’ végét. A kapott plazmid jele pMOG749. Az otsA gén 5’ végét PCR-eljárással szintetizáljuk, templátként használva a TPS1 és TPS2 szintetikus oligonukleotidokat a pMOG749 plazmiddal.
HU 221 124 Β1
TPS1 5 ’ GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3 ’ TPS2 5 ’ GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3 ’
12. számú szekvenciavázlat
13. számú szekvenciavázlat
Szekvenálással sikerült megerősíteni, hogy a 0,4 kb PCR-fragmentum szekvenciája korrekt. A pMOG749 1 kb BamHI/HindlII fragmentumát a 0,4 kb-os Xmal/BamHI PCR-fragmentummal együtt klónozzuk az Xmal-gyel és HindlII-mal kiegyenesített pMOG747 plazmidba. Az így kapott plazmidba - amit HindlII-mal és Sstl-gyel emésztünk - klónozzuk a TPS6/7 szintetikus oligonukleotidkettőst, ami a TPS három C-terminális aminosavát kódolja.
LysLeuAlaStop
TPS6/7 5’ AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT 3’ 3’ CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC 5’
A kapott plazmidba, amit HindlII-mal és Sstl-gyel emésztünk, a pMOG749 plazmid 0,25 kb-os 15 HindlII/Sstl fragmentumát klónozzuk, mert ez tartalmazza az Agrobacterium tumefaciens nopalin-szintetáz (NOS)-génjének terminátorát. A kapott plazmid a pMOG798. Ez a plazmid tartalmazza az E. coli otsA génjét a megfelelő orientációban a CaMV kettős fokozó- 20 val rendelkező 35S promoterének szabályozó hatása alatt [Guilley és munkatársai, Cell 30, 763 (1982)], a lucema-mozaikvírus (AMV) RNS4 vezérszekvenciáját [Brederode és munkatársai, Nucl. Acids Rés. 8, 2213 (1980)] és az Agrobacterium tumefaciens nopalin-szinte- 25 tázának transzkripciós terminátorszekvenciáját. A teljes expressziós kazettát egy 2,5 kb hosszúságú EcoRI/SstI fragmentumként klónozzuk az EcoRI-gyel és Sstl-gyel kiegyenesített pMOG23 bináris vektorba. Az így kapott pMOG799 bináris vektort (9. ábra) használjuk burgonya 30 és dohány transzformálására. (A pMOG799 plazmidot hordozó E. coli törzset letétbe helyeztük a Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS), Phabagen Collections, Padualaan 8, Utrecht, Hollandia gyűjteményében,
CBS 430.93 szám alatt, 1993. augusztus 23-án; a 35 pMOG23 plazmidot CBS 102.90 szám alatt, 1990. június 29-én.)
2. példa
Trehalóztermelés a pMOG799plazmiddal transz- 40 formált dohánynövényben
Dohánylevélkorongokat a pMOG799 bináris vektorral transzformálunk az Agrobacterium tumefaciens segítségével. Húsz, egymástól független transzgén hajtást vizsgáltunk a trehalóz-foszfát-szintetáz-aktivitás jelen- 45 létére. Néhány in vitro nevelt dohánynövény gyökerei rendkívül vastagok voltak a nem transzformált növényekéhez képest. Az ilyen transzgén növények gyökereinek analízise magasabb trehalózszintet mutatott a nem transzgén kontrollnövényekhez képest. 50
Néhány transzformált dohány növény leveleinek analízisénél a következő táblázatban megadott trehalóztartalmakat kaptuk (a frissen begyűjtött levelek tömeg%-ára számítva).
Vonal Trchalóztartalom
799 1 0,004
799-3 0,002
799-5 0,008
799-15 0,006
799-24 0,002
799-26 0,005
799-32 0,006
799-40 0,012
vad típus 0,000
3. példa
Trehalóztermelés a pMOG799plazmiddal transzformáit burgonyanövényekben
Burgonyagumó-korongokat a pMOG799 bináris vektorral transzformálunk az Agrobacterium tumefaciens segítségével. A transzgén hajtásokat kanamicinnel szelektáljuk. Húsz, egymástól független transzgén hajtást vizsgáltunk a trehalóz-foszfát-szintetázaktivitás jelenlétére. Az enzimet tartalmazó hajtásokból teljes növényeket neveltünk. Az ilyen transzgén növények érett gumóinak analízise emelkedett trehalózszintet mutatott a nem transzgén kontrollnövényekéhez képest. Az MOG799.1 transzgén növényvonalat tovább termesztjük a későbbi vizsgálatok számára.
4. példa
A pMOG664 plazmid megszerkesztése
Két oligonukleotidot szintetizálunk, amelyek megfelelnek a cv. Désiree burgonyagumó ADP-glükóz-pirofoszforiláz (AGP-áz B) kisebb alegysége cDNS-szekvenciájának [Müller-Röber és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 224, 136-146(1990)]:
5' rCCCCATGGJJ TCAA A GCA TCC 3 ’ ’ GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3'
4. számú szekvenciavázlat
5. számú szekvenciavázlat
Az oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy alkalmas restrikciós helyeket (BamHl és Ncol, aláhúzva) tartalmazzanak a végeiknél, amelyek lehetővé teszik a be60 építésüket egy expressziós kazettába antiszensz orientá11
HU 221 124 Β1 cióban, az ezekkel az enzimekkel végzett emésztés után. Egy, körülbelül 1 kb hosszúságú fragmentumot kibővítünk ezekkel az oligonukleotidokkal PCR-technikát használva; templátként 2 hónapos cv. Désiree burgonyái evél-szövetből készült cDNS-könyvtárból (Clontech) izolálunk DNS-t. Szekvenciaanalízissel kimutatható, hogy a fragmentum azonos a cv. Désiree burgonya AGP-ázának B szekvenciájával (Müller-Röber és munkatársai, idézett mű). BamHI-gyel és Ncol-gyel végzett emésztés után a fragmentumot az ugyanezen enzimekkel felnyitott pM0G18 vektorba klónozzuk. A kapott plazmidból az 1,85 kb hosszúságú EcoRI/BamHI fragmentumot (ami a CaMV 35S promotert, az AMV RNS4 vezérszekvenciát és az antiszensz irányultságú AGP-áz-fragmentumot tartalmazza), valamint a BamHI/HindlII fragmentumot (amely a nopalin-szintetáz (NOS)-gén terminátorszekvenciáját tartalmazza az
Agrobacterium tumefaciensből) háromirányú ligálással a pMOG22 vektorba klónozzuk, amit EcoRI-gyel és HindlII-mal linearizálunk. A pMOG22 bináris vektor tartalmazza a transzgén növények kiválogatásához szükséges, növényekben kifejeződni képes HPTII higromicinrezisztencia-gént. (A pMOG22 plazmidot 1990. január 29-én helyeztük letétbe a Centraal Bureau voor Schimmelcultures-nél 101.90 letéti szám alatt.) Az így kapott pMOG664 bináris vektort (4. ábra) burgo10 nya transzformálására használjuk.
5. példa
A pMOG801 plazmid megszerkesztése
Egy, a kukorica szacharóz-foszfát-szintetáz (SPS) cDNS-szekvenciájával [Worrell és munkatársai, Plánt Cell 3, 1121 (1991)] komplementer oligonukleotidkészletet szintetizálunk, aminek szekvenciája a következő:
5' CT A GGTCGTGA TTCTGA TA CA GGTGGCCA GGTG 3’ 6. szekvenciavázlat 5 ’ CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3 ’ 7. szekvenciavázlat
Ezeket az oligonukleotidokat arra használjuk, hogy PCR-technikával kibővítsünk velük egy 370 bázispár hosszúságú DNS-fragmentumot, templátként 2 hónapos cv. Désiree burgonyalevél-szövetből készült 25 cDNS-könyvtárból (Clontech) izolált DNS-t használva. Szekvenciaanalízissel kimutatható, hogy ez a fragmentum homológ a kukorica SPS-szekvenciájával (3. ábra és Worrell és munkatársai id. közleménye).
A PCR-fragmentumot a 2 hónapos Désiree burgonyalevél-szövetből készített cDNS-könyvtár (Clontech) lambda-gtlO könyvtárának szűrésére használjuk. Az egy pozitívan hibridizáló klón inszertumát szekvenciaanalízissel megvizsgálva, a 654 bázispár hosszúságú fragmentum 65%-át azonosnak találtuk a kukoricaSPS-szekvencia megfelelő részével (a 349. nukleotidtól kezdve, Worrell és munkatársai idézett közleményének 11. ábráján). E klón EcoRI inszertumát a BamHI-gyel emésztett pMOG180 plazmidba klónoz30 zuk háromirányú ligálással, az alábbi szintetikus oligonukleotidkettőssel:
’ GA TCGTCA GA TCTA GC 3 ’ 3 ’ CAGTCTAGATCGTTAA 5 ’
14. számú szekvenciavázlat
15. számú szekvenciavázlat
A plazmid, amiben az SPS-fragmentum antiszensz irányultságú a CaMV 35S promoterhez képest, a pMOG787 jelzést kapta. A pMOG787 EcoRI/HindlII fragmentumát háromirányú ligálással, az alábbi szintetikus linkerrel:
5' AGCTTCCCCCCCG 3 ’ 3'AGGGGGGGCTTAA 5'
16. számú szekvenciavázlat
17. számú szekvenciavázlat klónozzuk az EcoRI-gyel kiegyenesített pMOG622 bináris vektorba. A pMOG22 bináris vektor tartalmazza a transzgén növények kiválogatásához szükséges, növényekben kifejeződni képes HPTII higromicinrezisztencia-gént. Az így kapott pMOG801 bináris vektort (10. ábra) használjuk a burgonya transzformálásához.
6. példa
A pMOG802 plazmid megszerkesztése A pMOG801 plazmid EcoRI fragmentumát, ami az antiszensz expressziós kazettát tartalmazza, az EcoRIgyel felnyitott pMOG664 bináris vektorba (ami az antiszensz AGP-áz-kazettát tartalmazza) klónozzuk. Az így kapott bináris vektor a pMOG802 (11. ábra).
7. példa
A pMOG799 éspMOG664plazmidokkal transzformált burgonya trehalóztermelése
A kanamicinrezisztens MOG799.1 növényvonalból - amiben a TPS kifejeződik (9. példa) - nyert burgonyagumó-korongokat a pMOG664 bináris vektorral transzformáljuk, ami az antiszensz AGP-áz expressziós kazettát tartalmazza. A 10 mg/1 higromicinnel kiválogatott transzgén hajtásokat a TPS és az antiszensz AGPáz jelenlétére vizsgáljuk PCR-módszerrel. A mindkét enzimet tartalmazó transzgén növényekben megmérjük a TPS és az AGP-áz aktivitását.
A transzgén gumók vizsgálata azt mutatta, hogy az AGP-áz-aktivitás mértéke az egyedi transzgén vonalban csökkent a nem transzgén kontrolihoz képest. Northern-blot-vizsgálattal kimutattuk, hogy az AGPáz mRNS-ének mennyisége csökkent a transzgén növényekben a nem transzgén kontrollnövényekhez képest. A trehalóz szintje azokban a transzgén növényekben, amelyek TPS-aktivitást mutatnak és alacsonyabb az AGP-áz-szintjük, emelkedett az
HU 221 124 Β1
MOG799.1 transzgén növény vonal gumóiban mérhető szinthez képest.
8. példa
A pMOG799 és pMOGSOl plazmidokkal transzformált burgonya trehalóztermelése
A kanamicinrezisztens MOG799.1 növény vonalból
- amiben a TPS kifejeződik (3. példa) - nyert burgonyagumó-korongokat a pMOG801 bináris vektorral transzformáljuk, ami az antiszensz SPS expressziós kazettát tartalmazza. A 10 mg/1 higromicinnel kiválogatott transzgén hajtásokat a TPS és az antiszensz SPS jelenlétére vizsgáljuk PCR-módszerrel. A mindkét enzimet tartalmazó transzgén növényekben megmérjük a TPS és SPS aktivitását.
A transzgén gumók vizsgálata azt mutatta, hogy az SPS-aktivitás mértéke az egyedi transzgén vonalban csökkent a nem transzgén kontrolihoz képest. Northem-blot-vizsgálattal kimutattuk, hogy az SPS mRNSének mennyisége csökkent a transzgén növényekben a nem transzgén kontrollnövényekhez képest. A trehalóz szintje azokban a transzgén növényekben, amelyek TPS-aktivitást mutatnak és csökkent az SPS-szintjük, emelkedett az MOG799.1 transzgén növény vonal gumóiban talált szinthez képest.
9. példa
A pMOG799 és pMOG802plazmidokkal transzformált burgonya trehalóztermelése
A kanamicinrezisztens MOG799.1 növényvonalból 30
- amiben a TPS kifejeződik (3. példa) - nyert burgonyagumó-korongokat a pMOG802 bináris vektorral transzformáljuk, ami az antiszensz SPS és AGP-áz expressziós kazettákat tartalmazza. A 10 mg/1 higromicinnel kiválogatott transzgén hajtásokat a TPS, az anti- 35 szensz AGP-áz és az antiszensz SPS jelenlétére vizsgáljuk PCR-módszerrel. A mindhárom szerkezetet tartalmazó transzgén növényekben megmérjük a TPS, az AGP-áz és az SPS aktivitását.
A transzgén gumók vizsgálata azt mutatta, hogy az AGP-áz- és az SPS-aktivitás mértéke az egyedi transzgén vonalban csökkent a nem transzgén kontrolihoz képest. Northem-blot-vizsgálattal kimutattuk, hogy az AGP-áz és az SPS mRNS-ének mennyisége csökkent a transzgén növényekben a nem transzgén kontrollnövényekhez képest. A trehalóz szintje azokban a transzgén növényekben, amelyek TPS-aktivitást mutatnak és csökkent az AGP-áz- és az SPS-szintjük, emelkedett az MOG799.1 transzgén növényvonal gumóiban mérhető szinthez képest.
Letétbe helyezett törzsek:
pMOG22: CBS 101.90 letéti szám pMOG23: CBS 102.90 letéti szám pMOG799: CBS 430.93 letéti szám
10. példa
Trehalóztermelés a pMOG845 plazmiddal transzformáit burgonyanövényekben
A 3. példában leírtakhoz hasonlóan burgonyát transzformálunk a pMOG845 vektorral, amely a pMOG799 olyan származéka, amelyben a 35S promoter helyett a gumóspecifikus patatin promoter van. A transzformált növények gumóinak analízisét a következő táblázatban összesítettük (a trehalóztartalom a friss gumók tömeg%ában van megadva).
Vonal Trehalóztartalom
845-1-1 0,0050
845-1-2 0,0048
845-1-3 0,0017
845-2-1 0,0012
845-13-1 0,0010
1. vad típus <0,0010
2. vad típus <0,0010
3. vad típus <0,0010
SZEKVENCIALISTA
1. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza:
A szekvencia típusa:
A szekvencia száltípusa: A szekvencia topológiája: A molekula típusa: Hipotetikus:
Antiszensz:
Eredete:
Az 1. számú szekvencia leírása: CTAGGTCGTG ATTCTGATAC CTTGCAAACA TGAAAGGAGT GAGGTTGATT CTAGCTATGG GCTGCTGTGG TGCCTACTAT ATTTACATAC CAGAATTTGT ATAGGGGAGC AAGTCAATGC GCCGATGCTG
370 bázispár nukleinsav kettős szálú lineáris cDNS-ből mRNS nem nem burgonya (Solanum tuberosum) cv. Désiree levélszövet
AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TCACCGAGTT GATCTCTTGA TGAGCCAATT GAGATGCTCT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGATGGAGCA TTAAGCCACA TGGAAAAGCA GTGTGGCCTT
TAGTAGAGCT TGCTCGAGCA CTCGGCAGAT CACATCCCCA CATGCCCATC TGATGCTTTG TGACAAGATA TTCCAAAAGA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT ACGTGATACA TGGGCACTAT
120
180
240
300
360
370
HU 221 124 Β1
2. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza:
A szekvencia típusa:
A szekvencia száltípusa:
A szekvencia topológiája:
A molekula típusa: Hipotetikus:
Antiszensz:
Eredete:
Közvetlen forrása:
Helyzete a genomban: Ismertetőjegyek, kulcs:
gén: termék:
1446 bázispár nukleinsav kettős szálú lineáris genomikus DNS nem nem (Escherichia coli)
7F11 klón
41-42’ térképpozíció CDS (19-1446. helyzet) otsA trehalóz-foszfát-szintetáz
A 2. számú szekvencia leírása:
GAGAAAATAA CAGGAGTG ATG ACT ATG Me t AGT Ser CGT Arg 5 TTA Le u GTC GTA GTA TCT AAC
Me t 1 Thr Va 1 Va 1 Va 1 Ser 10 Asn
CGG ATT GCA CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT GCC
Arg Ile Alá Pro Pro Asp Glu Hi s Al a Al a Ser Al a Gly Gly Leu Al a
1 5 20 25
GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT GGC
Val Gly Ile Leu Gly Alá Leu Ly s Al a Al a Gly Gly Leu Trp Phe Gly
30 35 40
TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG AAA
Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu As p Gin Pro Leu Ly s Ly s Va 1 Ly s
45 50 55
AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC CTT
Lys Gly Asn I1e Thr Trp Al a Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gin As p Leu
60 65 70 75
GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT TTT
Asp Glu Tyr Tyr Asn Gin Phe Ser Asn Al a Va 1 Leu Trp Pro Al a Phe
80 85 90
CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC GGC
His Tyr Arg Leu Asp Leu Va 1 Gin Phe Gin Arg Pro Al a Trp As p Gly
95 100 105
TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG TTG
Tyr Leu Arg Val Asn Alá Leu Leu Al a As p Ly s Leu Leu Pro Leu Leu
110 115 120
CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA TTT
Gin Asp Asp Asp Ile Ile Trp I 1 e Hi s As p Tyr Hi s Leu Le u Pro Phe
125 130 135
GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC TTT
Alá His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Va 1 Asn As n Arg Ile Gly Phe Ph e
140 145 150 155
CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG ACA
Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Ph e Asn Al a Leu Pro Thr
160 165 170
TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT TTC
Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gin Leu Cy s Asp Tyr As p Leu Leu Gly Ph e
175 180 185
CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG TTC CTG GAT TGT CTT TCT AAC CTG
Gin Thr Glu Asn Asp Arg Le u Al a Phe Leu As p Cy s Leu Ser As n Leu
190 195 200
ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC AAA
Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Al a Ly s Ser Hi s Thr Al a Trp Gly Ly s
205 210 215
GCA TTT CGA ACA GAA GTC TAC CCG ATC GGC ATT GAA CCG AAA GAA ATA
Alá Phe Arg Thr Glu Val Tyr Pro Ile Gly I le Glu Pro Ly s Glu Ile
220 225 230 235
147
195
243
291
339
387
435
483
531
579
627
675
723
HU 221 124 Β1
GCC AAA CAG GCT GCC GGG CCA CTG CCG CCA AAA CTG GCG CAA CTT AAA
Al a Ly s Gin Al a Al a Gly Pro Leu Pro Pro Ly s Leu Al a Gin Leu Ly s
240 245 250
GCG GAA CTG AAA AAC GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG GAT
Al a Glu Leu Ly s Asn Va 1 Gin Asn I le Phe Ser Va 1 Glu Arg Leu As p
255 260 265
TAT TCC AAA GGT TTG CCA GAG CGT TTT CTC GCC TAT GAA GCG TTG CTG
Tyr Ser Ly s Gly Leu Pro Glu Arg Phe Leu Al a Tyr Glu Al a Leu Leu
270 275 280
GAA AAA TAT CCG CAG CAT CAT GGT AAA ATT CGT TAT ACC CAG ATT GCA
Glu Ly s Tyr Pro Gin Hi s Hi s Gly Lys I le Arg Tyr Thr Gin I le Al a
285 290 295
CCA ACG TCG CGT GGT GAT GTG CAA GCC TAT CAG GAT ATT CGT CAT CAG
Pro Thr Ser Arg Gly As p Va 1 Gin Al a Tyr Gin As p I le Arg Hi s Gin
300 305 310 315
CTC GAA AAT GAA GCT GGA CGA ATT AAT GGT AAA TAC GGG CAA TTA GGC
Leu Glu Asn Glu Al a Gly Arg I le Asn Gly Ly s Tyr Gly Gin Leu Gly
320 325 330
TGG ACG CCG CTT TAT TAT TTG AAT CAG CAT TTT GAC CGT AAA TTA CTG
Trp Thr Pro Le u Tyr Tyr Leu As n Gin Hi s Phe As p Arg Ly s Leu Leu
335 340 345
ATG AAA ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG ACG CCA CTG CGT
Me t Ly s I le Ph e Arg Tyr Ser As p Val Gly Le u Va 1 Thr Pro Leu Arg
350 355 360
GAC GGG ATG AAC CTG GTA GCA AAA GAG TAT GTT GCT GCT CAG GAC CCA
As p Gly Me t As n Leu Va 1 Al a Ly s Glu Tyr Val Al a Al a Gin As p Pro
365 370 375
GCC AAT CCG GGC GTT CTT GTT CTT TCG CAA TTT GCG GGA GCG GCA AAC
Al a As n Pro Gly Va 1 Leu Va 1 Leu Ser Gin Phe Al a Gly Al a Al a Asn
380 385 390 395
GAG TTA ACG TCG GCG TTA ATT GTT AAC CCC TAC GAT CGT GAC GAA GTT
Glu Leu Thr Ser Al a Leu I le Va 1 As n Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Va 1
400 405 410
GCA GCT GCG CTG GAT CGT GCA TTG ACT ATG TCG CTG GCG GAA CGT ATT
Al a Al a Al a Leu As p Arg Al a Leu Thr Me t Ser Leu Al a G1 u Arg I 1 e
415 420 425
TCC CGT CAT GCA GAA ATG CTG GAC GTT ATC GTG AAA AAC GAT ATT AAC
Ser Arg Hi s Al a Glu Me t Leu As p Va 1 I 1 e Va 1 Ly s Asn As p I 1 e As n
430 435 440
CAC TGG CAG GAG TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG CAG ATA GTT CCG CGA
Hi s Trp Gin Glu Cy s Phe I le Ser As p Leu Ly s G1 n I le Val Pro Arg
445 450 455
AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA GTT GCT ACC TTT CCA AAG CTT
Ser Al a Glu Ser Gin Gin Arg As p Ly s Va 1 Al a Thr Phe Pro Ly s Leu
460 465 470 475
GCG
Al a
3. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza:
A szekvencia típusa:
A szekvencia topológiája:
A molekula típusa:
771
819
867
915
963
1011
1059
1107
1155
1203
1251
1299
347
1395
1443
1446
476 aminosav aminosav lineáris fehérje
A 3. számú szekvencia leírása:
Me t Thr Me t Ser Ar g Le u Va 1 Va 1
1 5
As P Glu Hi s Al a Al a Se Γ Al a Gly
20
Al a Leu Ly s Al a Al a G1 y G1 y Le u
35 40
Va 1 Ser 10 As n Arg I le Al a Pro 15 Pro
Gly 25 Le u Al a Va 1 Gly I 1 e 30 Leu Gly
Trp Phe Gly Trp Ser 45 Gly Glu Thr
HU 221 124 Β1
Gly Asn Glu As p Gin Pro Leu 55 Ly s Ly s Va 1 Ly s Ly s 60 Gly As n lle Thr
50
Trp Al a Ser Ph e As n Leu Ser Glu Gin As p Leu Asp Glu Tyr Tyr As n
65 70 75 80
Gin Phe Ser Asn Al a Va 1 Leu Trp Pro Al a Phe Hi s Tyr Arg Leu As p
85 90 95
Leu Va 1 Gin Phe Gin Arg Pro Al a Trp As p Gly Tyr Leu Arg Val Asn
100 105 110
Al a Leu Leu Al a As p Ly s Leu Le u Pro Leu Leu Gin As p As p As p lle
115 120 125
lle Trp lle Hi s As p Tyr Hi s Leu Leu Pro Phe Al a Hi s Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg lle Gly Phe Phe Leu Hi s lle Pro Phe
145 150 155 160
Pro Thr Pro Glu lle Phe As n Alá Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Le u Leu
165 170 175
Glu Gin Leu Cy s As p Tyr As p Leu Leu Gly Phe Gin Thr G1 u As n As p
180 185 190
Arg Leu Al a Phe Le u As p Cy s Leu Ser As n Leu Thr Arg Va 1 Thr Thr
195 200 205
Arg Ser Al a Ly s Ser Hi s Thr Al a Trp Gly Ly s Al a Phe Arg Thr Glu
210 215 220
Va 1 Tyr Pro lle Gly I le Glu Pro Ly s Glu I 1 e Al a Ly s Gin Al a Al a
225 230 235 240
Gly Pro Leu Pro Pro Ly s Leu Al a Gin Le u Ly s Al a Glu Leu Ly s Asn
245 250 255
Va 1 Gin Asn lle Phe Ser Va 1 Glu Arg Leu As p Tyr Ser Ly s Gly Leu
260 265 270
Pro Glu Arg Phe Le u Al a Tyr Glu Al a Leu Le u Glu Ly s Tyr Pro Gin
275 280 285
Hi s Hi s Gly Ly s lle Arg Tyr Thr Gin I 1 e Al a Pro Thr Ser Arg Gly
290 295 300
As p Va 1 Gin Al a Tyr Gin As p I 1 e Arg Hi s Gin Leu Glu As n Glu Al a
305 310 315 320
Gly Arg lle As n G1 y Ly s Tyr Gly Gin Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr
325 330 335
Tyr Le u Asn Gin Hi s Phe As p Arg Ly s Le u Le u Me t Ly s I 1 e Phe Arg
340 345 350
Tyr Ser As p Va 1 Gly Leu Va 1 Thr Pro Le u Arg Asp Gly Me t As n Leu
355 360 365
Val Al a Ly s Glu Tyr Val Al a Al a Gin As p Pro Al a Asn Pro Gly Val
370 375 380
Leu Va 1 Leu Ser Gin Phe Al a Gly Al a Al a As n Glu Leu Thr Ser Al a
385 390 395 400
Leu lle Val Asn Pro Tyr Asp Arg As p Glu Va 1 Al a Al a Al a Leu As p
405 410 415
Arg Al a Leu Thr Me t Ser Leu Al a Glu Arg lle Ser Arg Hi s Al a Glu
420 425 430
Me t Le u As p Val lle Val Ly s Asn Asp lle Asn Hi s Trp Gin Glu Cys
435 440 445
Phe lle Ser As p Leu Ly s Gin lle Va 1 Pro Arg Ser Alá G1 u Ser Gin
450 455 460
Gin Arg As p Ly s Va 1 Al a Thr Phe Pro Ly s Leu Al a
465 470 475
4. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 22 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
HU 221 124 Β1
Hipotetikus: igen
Az 4. számú szekvencia leírása:
TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC
5. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 22 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
Az 5. számú szekvencia leírása:
GATTGGATCC AGGGCACGGC TG
6. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 33 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 6. számú szekvencia leírása:
CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG
7. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 35 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: genomikus DNS
Hipotetikus: igen
A 7. számú szekvencia leírása:
CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT
8. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 18 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 8. számú szekvencia leírása:
AGCTCACGAG CTCTCAGG
9. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 18 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 9. számú szekvencia leírása:
GTGCTCGAGA GTCCTCGA
10. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 24 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 10. számú szekvencia leírása:
GATCCCCCGG GGCATGCAAG CTTG
11. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 24 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
GTG
AAGGC
HU 221 124 Β1
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
All. számú szekvencia leírása: GGGGCCCCGT ACGTTCGAAC CTAG
12. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 23 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 12. számú szekvencia leírása: GAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC
13. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 25 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDN S
Hipotetikus: igen
A 13. számú szekvencia leírása: GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC
14. számú szekvenciavázlat
A szekvencia hossza: 16 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 14. számú szekvencia leírása: GATCGTCAGA TCTAGC
75. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 16 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 15. számú szekvencia leírása: CAGTCTAGAT CGTTAA
16. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 13 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDN S
Hipotetikus: igen
A 16. számú szekvencia leírása: AGCTTCCCCC CCG
7. számú szekvenciavázlat A szekvencia hossza: 13 bázispár
A szekvencia típusa: nukleinsav
A szekvencia száltípusa: egyszálú
A szekvencia topológiája: lineáris
A molekula típusa: cDNS
Hipotetikus: igen
A 17. számú szekvencia leírása: AGGGGGGGCT TAA

Claims (12)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Nukleinsav, amely egy növényben vagy növényi sejtben kifejeződve növeli az illető növény vagy növényi sejt trehalóztartalmát, azzal jellemezve, hogy a leolvasás irányában haladva tartalmaz:
    a) az illető növényben vagy növényi sejtben működőképes transzkripciós iniciátorrégiót; és
    b) egy E. coli trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-szekvenciát; és adott esetben
    c) egy, az illető növényben vagy növényi sejtben működőképes transzkripciós terminációs régiót.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a 3. számú szekvenciavázlatban megadott aminosavszekvenciával jellemzett E. coli trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy a Centraal Bureau voor Schimmelculturesnél 430.93 számon letétbe helyezett pMOG799 plazmidban jelen lévő E. coli otsA gén nyílt leolvasási keretét tartalmazó, E. coli trehalóz-foszfát-szintetázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav, azzal jellemezve, hogy az említett transzkripciós iniciátorrégió-szakasz tartalmazza a karfiol-mozaikvírus 35S RNS-ét kódoló DNS-ének egy promoterrégióját és az Agrobacterium tumefaciens nopalin-szintetázgénjének transzkripciós terminátorrégióját.
  5. 5. Klónozóvektor, azzal jellemezve, hogy az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat tartalmaz, és a klónozóvektor egy bináris vektor.
  6. 6. Mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti vektort hordoz, és az Agrobacterium nemzetségbe tartozik.
  7. 7. Eljárás trehalóz termelésére fokozottan képes növény létrehozására, azzal jellemezve, hogy:
    i) egy befogadó növényi sejtbe bejuttatunk (a) egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat vagy egy 5. igénypont szerinti klónozóvektort, vagy egy 6. igénypont szerinti mikroorganizmust; és (b) egy olyan szelektálható markergént kódoló DNS-szekvenciát, amely az illető növényben működőképes; és (c) adott esetben egy, az illető növényi gazdaszervezetben működőképes transzkripciós terminátorszekvenciát; és ii) egy transzformált sejtből a szelektíven felismerhető markergén jelenléte alapján történő kiválasztást lehetővé tevő körülmények között kinevelünk egy növényt.
  8. 8. Rekombináns növényi DNS-genom, azzal jellemezve, hogy egy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavat tartalmaz.
  9. 9. Növényi sejt, azzal jellemezve, hogy egy 8. igénypont szerinti rekombináns növényi DNS-genomot hordoz.
  10. 10. Növényi sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz.
  11. 11. Növény, azzal jellemezve, hogy a 9. vagy 10. igénypont szerinti sejt(ek)et tartalmaz.
  12. 12. Eljárás trehalóz termelésére, azzal jellemezve, hogy
    i) egy 11. igénypont szerinti növényt a trehalóztermelést megengedő körülmények között termesztünk;
    ii) az említett növényt vagy annak részét learatjuk; és iii) kinyerjük a trehalózt az említett növényből vagy az említett növényi részből.
    HU 221 124 Β1
HU9503723V 1993-06-30 1994-06-30 Production of trehalose in plants HU221124B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP93201904 1993-06-30
PCT/EP1993/002290 WO1995006126A1 (en) 1993-08-24 1993-08-24 Production of trehalose in plants
PCT/EP1994/002167 WO1995001446A1 (en) 1993-06-30 1994-06-30 Production of trehalose in plants

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9503723D0 HUP9503723D0 (en) 1996-02-28
HUT74666A HUT74666A (en) 1997-01-28
HU221124B1 true HU221124B1 (en) 2002-08-28

Family

ID=26070055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9503723V HU221124B1 (en) 1993-06-30 1994-06-30 Production of trehalose in plants

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0711353B1 (hu)
JP (1) JP3645260B2 (hu)
KR (1) KR960703436A (hu)
CN (1) CN1131315C (hu)
AT (1) ATE284446T1 (hu)
AU (1) AU697997B2 (hu)
CA (1) CA2166063C (hu)
CZ (1) CZ290830B6 (hu)
DE (1) DE69434173T2 (hu)
ES (1) ES2229222T3 (hu)
FI (1) FI956317A0 (hu)
HU (1) HU221124B1 (hu)
NO (1) NO955354L (hu)
NZ (1) NZ269548A (hu)
PL (1) PL179629B1 (hu)
RO (1) RO115650B1 (hu)
SK (1) SK166095A3 (hu)
UA (1) UA39958C2 (hu)
WO (1) WO1995001446A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI943133A0 (fi) * 1994-06-29 1994-06-29 Alko Ab Oy Transgena vaexter
JP3563104B2 (ja) * 1994-03-23 2004-09-08 呉羽化学工業株式会社 トレハロースホスホリラーゼおよびその製造法
DE4444460A1 (de) * 1994-11-29 1996-05-30 Inst Genbiologische Forschung Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
IL116564A0 (en) * 1995-01-04 1996-03-31 Mogen Int Process for producing trehalose in plants
EP0784095A3 (en) 1996-01-12 1997-12-29 Mogen International N.V. Enhanced accummulation of trehalose in plants
IN1997CH00924A (en) 1996-05-03 2005-03-04 Syngenta Mogen Bv Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate
MX205414B (es) * 1996-05-08 2001-12-07 Univ Mexico Nacional Autonoma Metodo para incrementar de trehalosa de los organismos por medio de su transformacion con el adnc de la trehalosa-6-fosfato sintasa/fosfatasa de selaginella lepidophylla.
TW466116B (en) 1997-03-04 2001-12-01 Hayashibara Biochem Lab Reduction inhibitory agent for active-oxygen eliminating activity, method for inhibiting the reduction of said activity, and composition containing said agent
HUP0102598A3 (en) 1998-03-11 2003-03-28 Syngenta Participations Ag Expression of trehalose biosynthetic genes in plants
EP1002867A1 (en) * 1998-10-15 2000-05-24 K.U. Leuven Research & Development Specific genetic modification of the activity of trehalose-6-phosphate synthase and expression in a homologous or heterologous environment
EP2111456A1 (en) * 2007-02-08 2009-10-28 BASF Plant Science GmbH Use of trehalase genes to confer nematode resistance to plants
EP2238231B1 (en) 2008-01-03 2016-03-23 Proterro, Inc. Transgenic photosynthetic microorganisms and photobioreactor
CN103664333B (zh) * 2013-11-12 2015-03-04 宿迁市设施园艺研究院 一种含有5-ala和海藻糖的组合物及其制备的叶面肥

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE133198T1 (de) * 1990-03-28 1996-02-15 Gist Brocades Nv Neue hefestämme mit erhöhtem trehalosegehalt, verfahren zur gewinnung solcher hefen und verwendung dieser hefen
US5422254A (en) * 1992-02-14 1995-06-06 Oy Alko Ab Method to increase the trehalose content of organisms by transforming them with the structural genes for the short and long chains of yeast trehalose synthase
EP0577915A1 (fr) * 1992-07-09 1994-01-12 N.V. Algist-Bruggeman Souches de levures transformées de manière à posséder une résistance au stress et/ou un pouvoir fermentatif amélioré

Also Published As

Publication number Publication date
NO955354L (no) 1996-01-02
WO1995001446A1 (en) 1995-01-12
JPH09501313A (ja) 1997-02-10
FI956317A (fi) 1995-12-29
PL179629B1 (pl) 2000-10-31
EP0711353B1 (en) 2004-12-08
NZ269548A (en) 1997-09-22
RO115650B1 (ro) 2000-04-28
CA2166063A1 (en) 1995-01-12
EP0711353A1 (en) 1996-05-15
CZ290830B6 (cs) 2002-10-16
PL312303A1 (en) 1996-04-15
DE69434173T2 (de) 2005-05-19
JP3645260B2 (ja) 2005-05-11
CZ344995A3 (en) 1997-05-14
DE69434173D1 (de) 2005-01-13
CN1129015A (zh) 1996-08-14
SK166095A3 (en) 1997-01-08
CA2166063C (en) 2008-04-22
CN1131315C (zh) 2003-12-17
NO955354D0 (no) 1995-12-29
HUP9503723D0 (en) 1996-02-28
ATE284446T1 (de) 2004-12-15
FI956317A0 (fi) 1995-12-29
ES2229222T3 (es) 2005-04-16
AU697997B2 (en) 1998-10-22
KR960703436A (ko) 1996-08-17
HUT74666A (en) 1997-01-28
AU7384694A (en) 1995-01-24
UA39958C2 (uk) 2001-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6881877B2 (en) Enhanced accumulation of trehalose in plants
WO1995006126A1 (en) Production of trehalose in plants
EP0977870A1 (en) Regulating metabolism by modifying the level of trehalose-6-phosphate by inhibiting endogenous trehalase levels
HU221124B1 (en) Production of trehalose in plants
JPH08510645A (ja) 貯蔵ジャガイモの品質を改良する方法
US20070169229A1 (en) Method for increasing an abiotic-resistance in monocot plant
WO1996021030A1 (en) Enhanced accumulation of trehalose in plants
HU221515B (en) Transgenic plants with improved biomass production
RU2143496C1 (ru) Продуцирование трегалозы в растениях
CA2235619A1 (en) Modified plants and plant products
AU1487799A (en) Pre- and postharvest inhibition of remobilisation of storage compounds
GB2343183A (en) Transgenic plants and selection of transformed plant cells
AU754482B2 (en) Enhanced accumulation of trehalose in plants
AU2003246315B2 (en) Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile
MXPA97000296A (en) Increased accumulation of trehalosa in plan

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee