PL197151B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania SST, SST, komórka rośliny transgenicznej, roślina, materiał propagacyjny rośliny, produkty zbierane z rośliny, sposoby wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy - Google Patents

Abstract

1. Cz asteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje zale zn a od sacharozy fruktozylo- transferaz e sacharozy (SST) wybran a z grupy obej- muj acej: (a) cz asteczki kwasu nukleinowego koduj ace bia lko obejmuj ace sekwencj e kwasu nukleinowego przedstawion a na SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4; (b) cz asteczki kwasu nukleinowego obejmu- j ace sekwencj e nukleotydow a przedstawion a na SEQ ID nr 1 lub odpowiadaj aca jej sekwencj e rybo- nukleotydow a; (c) cz asteczki kwasu nukleinowego obejmu- j ace sekwencj e nukleotydow a przedstawion a na SEQ ID nr 3 lub odpowiadaj aca jej sekwencj e rybo- nukleotydow a; i (d) cz asteczki kwasu nukleinowego zawiera- j ace fragment cz asteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w punktach (a) do (c) koduj ace bia lko zdolne do katalizowania wi azania ß-2,1-gliko- zydowego lub ß-2,6-glikozydowego pomi edzy jed- nostkami fruktozy. PL PL PL

Description

(21) Numer zgłoszenia: 335657 ⁽¹³⁾

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 02.03.1998 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

02.03.1998, PCT/EP98/01156 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

11.09.1998, WO98/39460 PCT Gazette nr 36/98 (51) Int.Cl.

C12N 15/82 (2006.01) C12N 9/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12P 19/04 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01)

Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania SST, (54) SST, komórka rośliny transgenicznej, roślina, materiał propagacyjny rośliny, produkty zbierane z rośliny, sposoby wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy

(30) Pierwszeństwo: 04.03.1997,DE,19708774.4	(73) Uprawniony z patentu: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V., Berlin,DE
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.05.2000 BUP 10/00	(72) Twórca(y) wynalazku: Arnd G. Heyer,Berlin,DE Elke Hellwege,Berlin,DE Dominique Gritscher,Berlin,DE
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.03.2008 WUP 03/08	(74) Pełnomocnik: Elżbieta Pietruszyńska Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.

(57) 1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST) wybraną z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko obejmujące sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową; i (d) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające fragment cząsteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w punktach (a) do (c) kodujące białko zdolne do katalizowania wiązania e-2,1-glikozydowego lub e-2,6-glikozydowego pomiędzy jednostkami fruktozy.

PL 197 151 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST), wektor zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy, komórka gospodarza zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy lub wektor zawierający taką cząsteczkę kwasu nukleinowego, sposób wytwarzania SST, enzym SST, komórka rośliny transgenicznej zawierająca wprowadzoną przez transformację cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy, roślina zawierająca komórki rośliny transgenicznej, materiał propagacyjny rośliny zawierającej komórki rośliny transgenicznej, produkty zbierane z rośliny zawierającej komórki rośliny transgenicznej, sposoby wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy.

Rozpuszczalne w wodzie polimery liniowe mają wiele różnych zastosowań, na przykład do podwyższania lepkości w układach wodnych, jako detergenty, czynniki zawiesinowe lub do przyspieszania procesu sedymentacji i kompleksowania, ale także do wiązania wody. Polimery na bazie sacharydów, na przykład polisacharydów fruktozylowych są szczególnie interesującym surowcem, ponieważ są one biodegradowalne.

Oprócz zastosowania ich jako surowców odnawialnych do produkcji przemysłowej i obróbki, polimery fruktozylowe są także interesujące jako dodatki do żywności, na przykład jako sztuczne środki słodzące. Do tego celu szczególnie odpowiednie są polimery posiadające niski poziom polimeryzacji.

Do tej pory opisane zostały tylko procesy wytwarzania długołańcuchowych polisacharydów fruktanowych w roślinach na drodze ekspresji enzymów pochodzących z bakterii, jak też i procesów wytwarzania roślin transgenicznych z ekspresją fruktozylotransferaz z Helianthus tuberosus. Sposoby otrzymywania enzymów do wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów nie są znane. W opisie PCT/USA89/02729 określono możliwość wytwarzania polimerów węglowodanowych, szczególnie dekstranu lub polifruktozy w roślinach transgenicznych, szczególnie w owocach roślin transgenicznych. Do produkcji tak zmodyfikowanych roślin, sugerowano zastosowanie lewanosacharazy z mikroorganizmów, szczególnie z Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius i Bacillus subtilis lub dekstranosacharazy z Leuconostoc mesenteroides. Nie opisano, ani aktywnych enzymów ani lewanu, ani dekstranu ani też roślin transgenicznych. Opis PCT/EP93/02110 ujawnia sposób wytwarzania roślin transgenicznych z ekspresją genu Isc lewanosacharazy z bakterii gram ujemnej Erwinia amylovora. W opisie PCT/NL93/00279 ujawniono transformację roś lin posiadają cych geny chimeryczne, które zawierają gen sacB z Bacillus subtilis lub gen ftf z Streptococcus mutans. W przypadku genu sacB zalecana jest modyfikacja w regionie 5'-ulegającym translacji tego genu w celu podniesienia poziomu ekspresji w roślinach transgenicznych. Opis PCT/NL96/00012 ujawnia sekwencje DNA kodujące enzymy syntetyzujące polimery węglowodanowe oraz wytwarzanie roślin transgenicznych za pomocą tych sekwencji DNA. Ujawnione sekwencje pochodzą z Helianthus tuberosus. Zgodnie z PCT/NL96/00012 ujawnione sekwencje są nie tylko odpowiednie do modyfikowania profilu fruktanowego, na przykład petunii lub ziemniaka, ale także Helianthus tuberosus jako takiego. Dlatego opis PCT/NL96/00012 opisuje pomiędzy innymi transgeniczne rośliny ziemniaka z ekspresją SST z Helianthus tuberosus. Mimo to, osiągniętą aktywność enzymatyczną SST wyrażaną w roślinach transgenicznych można było wykryć jedynie na niskim poziomie konwersji substratu sacharozy do krótkołańcuchowych polimerów fruktozylu. Może to wynikać z różnych czynników, takich jak niskie powinowactwo enzymu i jego substratu lub możliwe hamowanie enzymu przez wytwarzany produkt.

Zgodnie z wynalazkiem dostarczono cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zależną od sacharozy fruktozylotransferazę (SST), za pomocą której możliwe jest wytwarzanie modyfikowanych genetycznie organizmów, które zdolne są do tworzenia krótkołańcuchowych polimerów.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego charakteryzująca się tym, że koduje zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST) wybraną z grupy obejmującej (a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko obejmujące sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową; i

PL 197 151 B1 (d) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające fragment cząsteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w punktach (a) do (c) kodujące białko zdolne do katalizowania wiązania β-2,1-glikozydowego lub e-2,6-glikozydowego pomiędzy jednostkami fruktozy.

Korzystnie cząsteczkę kwasu nukleinowego stanowi cząsteczka DNA.

Korzystniej cząsteczkę DNA stanowi cząsteczka cDNA.

Korzystnie cząsteczkę kwasu nukleinowego stanowi cząsteczkę RNA.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor charakteryzujący się tym, że zawiera określoną powyżej cząsteczkę kwasu nukleinowego.

Korzystnie wektor zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego która jest operacyjnie związana z elementami regulatorowymi pozwalającymi na transkrypcję i syntezę podlegającego translacji RNA w komórkach prokariotycznych i/lub eukariotycznych.

Korzystnie elementy regulatorowe pochodzą z promotora patatyny B33.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza charakteryzująca się tym, że zawiera wprowadzoną przez transformację określoną powyżej cząsteczkę kwasu nukleinowego lub określony powyżej wektor.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania SST, polegający na tym, że określoną powyżej komórkę gospodarza hoduje się w warunkach pozwalających na syntezę SST i izoluje się SST z hodowanych komórek i/lub pożywki hodowlanej.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto SST charakteryzująca się tym, że kodowana jest przez określoną powyżej cząsteczkę kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynalazku jest też komórka rośliny transgenicznej charakteryzująca się tym, że zawiera wprowadzoną przez transformację określoną powyżej cząsteczkę kwasu nukleinowego lub określony powyżej wektor, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca SST z karczocha jest kontrolowana przez elementy regulujące pozwalające na transkrypcję dającego się odczytać w procesie translacji mRNA w komórkach rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest także roślina charakteryzująca się tym, że zawiera określone powyżej komórki rośliny.

Korzystnie roślinę stanowi roślina użytkowa.

Korzystniej roślinę stanowi roślina magazynująca sacharozę lub skrobię.

Jeszcze korzystniej roślinę stanowi roślina ziemniaka.

Przedmiotem wynalazku jest również materiał propagacyjny określonej powyżej, charakteryzujący się tym, że zawiera określone powyżej komórki rośliny.

Przedmiotem wynalazku są też produkty zbierane z określonej powyżej rośliny charakteryzujące się tym, że zawierają określone powyżej komórki rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy polegający na tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza jak określono w zastrz. 8 lub komórki rośliny jak określono w zastrz. 11 w warunkach pozwalających na wytwarzanie SST i konwersję, jeżeli to konieczne, podanej z zewnątrz sacharozy lub równoważnego substratu do 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy; i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę wytwarzane tą drogą z hodowanych komórek lub z pożywki.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, polegający na tym, że:

(a) kontaktuje się sacharozę lub równoważny substrat z SST jak określono w zastrz. 10 w warunkach pozwalających na konwersję do 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę w ten sposób wytwarzane.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, polegający na tym, że:

(a) hoduje się roślinę jak określono w zastrz. 12 do 15; i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę z tej rośliny lub jej materiału propagacyjnego jak określono w zastrz. 16 lub produktów zbiorów jak określono w zastrz. 17.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku kodują zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST). Wektory i komórki gospodarza według wynalazku zawierają takie cząsteczki kwasu nukleinowego. Komórki rośliny transgenicznej i rośliny według wynalazku są transformowane opisanymi cząsteczkami kwasu nukleinowego. Sposoby wytwarzania roślin transgenicznych, które syntetyzują krótkołańcuchowe polimery obejmuje wprowadzanie cząsteczek DNA kodujących

PL 197 151 B1

SST z karczocha. Sposób wytwarzania SST według wynalazku pozwala na otrzymywanie krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych w różnych organizmach gospodarza, jak również do otrzymywania SST służącej do wspomagania różnych sposobów, w których krótkołańcuchowe polimery fruktozylowe mogą być wytwarzane, na przykład w sposobach fermentacyjnych lub innych sposobach biotechnologicznych.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą kodować białka o aktywności biologicznej SST, wybrane z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko obejmujące sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową;

(d) cząsteczki kwasu nukleinowego hybrydyzujące z cząsteczkami kwasu nukleinowego wspomniane w punkcie (a) lub (b) i kodujące SST, aminokwasy, które są co najmniej w 90% identyczne z sekwencją aminokwasową opisaną w SEQ ID nr 2; i (e) cząsteczki kwasu nukleinowego w której odchylenie od sekwencji nukleotydowych, określnych w punktach (a), (b) lub (c) wynikają z degeneracji kodu genetycznego.

W kontekś cie niniejszego wynalazku enzym posiadają cy aktywność polimerazy fruktozylowej rozumiany jest jako białko zdolne do katalizowania wiązania e-2,1-glikozydowego lub wiązania β-2,6-glikozydowego pomiędzy jednostkami fruktozy. Tym samym reszta fruktozylowa, która ma być przeniesiona, może pochodzić z sacharozy lub polimeru fruktanowego.

Krótkołańcuchowy polimer fruktozylowy jest rozumiany jako cząsteczka zawierająca co najmniej dwa ale nie więcej niż 100 reszt fruktozy lowych, które są połączone wiązaniem e-2,1-glikozydowym lub e-2,6-glikozydowym. Polimer fruktozylowy może nieść na swym końcu resztę glukozylową, która jest połączona poprzez grupę C-1 OH glukozy z grupą C-2 OH fruktozylu. W tym przypadku cząsteczka sacharozy jest zawarta w polimerze fruktozylowym.

W zalecanej postaci wynalazku sekwencje kwasu nukleinowego pochodzą z karczocha.

Zgodnie z wynalazkiem nieoczekiwanie stwierdzono, że w wyniku ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku wytwarzana jest duża ilość polimeru fruktozylowego.

W przeciwieństwie do opisywanych w opisie PCT/NL96/00012 ziemniaków, w przypadku gdy stosowano cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku otrzymywano duże ilości oligofruktanu, nawet większe niż zawartość w komórce substratu sacharozy.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być zarówno cząsteczkami DNA jak i RNA. Odpowiednie cząsteczki DNA stanowią na przykład cząsteczki genomowe lub cDNA. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być izolowane ze źródeł naturalnych, dogodnie z karczocha, lub mogą być syntetyzowane zgodnie ze znanymi metodami.

Za pomocą sposobów konwencjonalnej biologii molekularnej możliwe jest wprowadzenie różnych mutacji do cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku (patrz e.g., Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-gie wydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). W wyniku syntetyzowane są zsyntetyzowane białka z ewentualnie zmodyfikowanymi własnościami biologicznymi. Jedną z możliwości jest wytworzenie mutantów delecyjnych, w których cząsteczki kwasu nukleinowego są wytwarzane przez ciągłą delecję od końca 5'- lub 3'- kodującej sekwencji DNA i która prowadzi do syntezy odpowiednio skróconych białek. Dzięki takim delecjom na końcu 5'- sekwencji nukleotydowej możliwe jest na przykład zidentyfikowanie sekwencji aminokwasowej, która jest odpowiedzialna za translokację enzymu w plastydach (peptydy przejściowe). Pozwala to na specyficzną produkcję enzymów, które są odpowiedzialne za usunięcie odpowiednich sekwencji, zlokalizowanych już nie w wakuoli ale w cytozolu, lub które są odpowiedzialne za dodanie innych sekwencji sygnałowych, zlokalizowanych w innych przedziałach.

Inną możliwością jest wprowadzenie mutacji punktowej w określonej pozycji, gdzie modyfikacja sekwencji aminokwasowej wpływa na przykład na aktywność enzymu lub regulację enzymu. Sposobem tym można wytwarzać mutanty, na przykład takie, które posiadają zmodyfikowaną wartość Km lub które nie są już przedmiotem mechanizmów regulacji normalnie istniejących w komórce w odniesieniu do regulacji allosterycznej lub modyfikacji kowalencyjnej.

PL 197 151 B1

Ponadto mogą być wytworzone mutanty o zmodyfikowanej specyficzności substratowej lub zmodyfikowanej specyficzności produktu. Mogą być wytwarzane także mutanty wskazujące zmodyfikowany profil zależności aktywność - temperatura.

W celu manipulowania w komórkach prokariotycznych za pomocą inżynierii genetycznej, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku lub części tych cząsteczek mogą być wprowadzone do plazmidów pozwalając na mutagenezę lub modyfikację sekwencji przez rekombinację sekwencji DNA. Za pomocą konwencjonalnych metod, zasady mogą być wymienione i mogą być wprowadzone naturalne lub syntetyczne sekwencje (cf., np., Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2-gie wydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). W celu powiązania fragmentów DNA ze sobą do jego fragmentów można dodać adaptery lub łączniki. Ponadto można prowadzić manipulacje, takie które dostarczają odpowiednich miejsc rozcięcia lub które usuwają niepotrzebne DNA lub miejsca cięcia. W przypadku gdy możliwe są insercje, delecje lub podstawienia, można przeprowadzić mutagenezę in vitro, reperację starterową, restrykcję lub ligację. Jako analizę stosowane są zwykle metody analizy sekwencji, analiza restrykcji i inne metody biochemiczne, lub metody biologii molekularnej.

Określenie hybrydyzacja w kontekście tego wynalazku oznacza hybrydyzację w konwencjonalnych warunkach hybrydyzacji, dogodnie w warunkach ścisłych jak opisano na przykład w Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-gie wydanie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z cząsteczkami według wynalazku mogą być izolowane, na przykład z bibliotek genomowych lub cDNA, które były wytwarzane z karczocha.

W celu zidentyfikowania i izolowania takich czą steczek kwasu nukleinowego, czą steczki wedł ug wynalazku lub części tych cząsteczek lub odwrotne zasady komplementarne tych cząsteczek mogą być stosowane na przykład za pomocą hybrydyzacji zgodnie z metodami konwencjonalnymi (patrz e.g., Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-gie wydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Jako sondy hybrydyzacyjne mogą być przykładowo zastosowane cząsteczki kwasu nukleinowego mające dokładnie lub zasadniczo sekwencję nukleotydową taką jak opisana w SEQ ID nr 1 lub część tej sekwencji. Fragmenty stosowane jako sondy hybrydyzacyjne mogą być fragmentami syntetycznymi, które były wytwarzane za pomocą konwencjonalnych metod syntezy i których sekwencje zasadniczo odpowiadają sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Cząsteczki hybrydyzujące z cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku obejmują także fragmenty, pochodne i alleliczne warianty opisanych powyżej cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego białko według wynalazku. Jako fragmenty rozumie się części cząsteczek kwasu nukleinowego, które są wystarczająco długie do kodowania opisanych białek. Określenie pochodna w niniejszym kontekście oznacza, że sekwencje tych cząsteczek różnią się od sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego opisanych powyżej w jednej lub wielu pozycjach, ale mają wysoki stopień homologii sekwencji. Homologia oznacza tutaj identyczność sekwencji w co najmniej 40%, zwłaszcza identyczność co najmniej w 60%, dogodnie więcej niż w 80% i szczególnie korzystnie więcej niż w 90%. Białka te kodowane przez cząsteczki kwasu nukleinowego mają identyczność sekwencji w stosunku do sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID nr 2 co najmniej 80%, dogodnie 85% i szczególnie dogodnie więcej niż 90%, 95%, 97% i 99%. Odmiany powyżej opisanych cząsteczek kwasu nukleinowego mogą być wytwarzane przez delecję, podstawienie, insercję lub rekombinację.

Cząsteczki kwasu nukleinowego, które są homologiczne do powyżej opisanych cząsteczek i które reprezentują pochodne tych cząsteczek, są zwykle odmianami tych cząsteczek które reprezentują, i są modyfikacjami mającymi takie same biologiczne funkcje. Mogą one stanowić naturalnie występujące odmiany, na przykład sekwencje z innych organizmów, lub mutacje, które mogą albo zachodzić naturalnie lub które były wprowadzane przez specyficzną mutagenezę. Ponadto odmiany te mogą być syntetycznie wytwarzanymi sekwencjami. Warianty alleliczne mogą być albo naturalnie występującymi wariantami lub syntetycznie produkowanymi wariantami albo też, wariantami wytworzonymi w procesach rekombinacji DNA.

Białka kodowane przez różne warianty cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, wykazują pewną wspólną charakterystykę, taką jak aktywność enzymatyczna, masa cząsteczkowa, reaktywność immunologiczna lub konformacja, lub właściwości fizyczne takie jak ruchliwość elektroforetyczna, zachowanie się w trakcie chromatografii, współczynnik sedymentacji, rozpuszczalność, właściwości spektrofotometryczne, stabilność, optymalne pH, optymalna temperatura.

PL 197 151 B1

Inna korzystna postać według wynalazku dotyczy cząsteczek kwasu nukleinowego specyficznie hybrydyzujących z transkryptami cząsteczek kwasu nukleinowego. Te cząsteczki kwasu nukleinowego są korzystnie oligonukleotydami posiadającymi długość co najmniej 10, dogodnie co najmniej 15 i szczególnie dogodnie co najmniej 50 nukleotydów. Cząsteczki kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku i oligonukleotydy mogą być na przykład stosowane jako startery do reakcji PCR. Mogą one być też składowymi konstruktów antysensownych lub cząsteczkami DNA kodującymi odpowiednie rybozymy.

Wynalazek dotyczy ponadto wektorów zawierających cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Korzystnie, są one plazmidami, kosmidami, wirusami, bakteriofagami i innymi wektorami zazwyczaj stosowanymi w dziedzinie inżynierii genetycznej.

Zalecane sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku są operacyjnie związane z elementami regulatorowymi w wektorze według wynalazku, co gwarantuje transkrypcję i syntezy RNA w komórkach prokariotycznych i/lub eukariotycznych, które mogą być poddane translacji.

Wektory ekspresyjne według wynalazku pozwalają na produkcję enzymów syntetyzujących krótkołańcuchowe polimery fruktozylowe w różnych organizmach gospodarza.

Kodowane enzymy mogą być także stosowane poza organizmem gospodarza w celu wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych. Tym samym, można stosować sposoby fermentacyjne i inne biotechnologiczne metody do wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych. Na przykład, można sobie wyobrazić produkcję polimerów fruktozylowych z zastosowaniem unieruchomionych enzymów.

Zgodnie z wynalazkiem zalecane jest użycie elementów regulatorowych promotora patatyny B33. Innymi zalecanymi promotorami są promotor CaMV 35S i promotor genu dehydrogenazy alkoholowej z Saccharomyces cerevisiae.

Wektory według wynalazku mogą posiadać inne dalsze jednostki czynnościowe zmieniające stabilizację wektora w organizmie gospodarza, takie jak bakteryjne miejsca inicjacji replikacji ori lub

2-μ DNA, w celu stabilizacji w Saccharomyces cerevisiae. Ponadto mogą one zawierać granicę lewą i granicę prawą sekwencji agrobakteryjnego T-DNA, tym samym możliwa jest jego trwała integracja w genomie rośliny.

Ponadto, wektory według wynalazku mogą zawierać funkcjonalne zakończenia, takie jak terminator genu syntazy oktopiny z agrobakterii.

W innej postaci, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może być połączona z wektorem według wynalazku przez cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą funkcjonalną sekwencję sygnałową w celu przetransportowania enzymu do różnych przedziałów komórki. Modyfikacja ta może być, na przykład, dodaniem N-końcowych sekwencji sygnałowych sekrecji do przestrzeni błon komórkowych roślin wyższych, ale także może być inną modyfikacją, która prowadzi do fuzji sekwencji sygnałowej z sekwencji kodujących fruktozylotransferazy.

W szczególnie zalecanej postaci stworzony może być plazmid pB33-cySST, którego budowę opisano w przykładach (Fig. 1).

Interesująca jest ekspresja cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku w komórkach priokariotycznych, na przykład w Escherichia coli, ponieważ na tej drodze możliwe jest bliższe scharakteryzowanie aktywności enzymatycznej enzymów kodujących te cząsteczki.

Komórki gospodarza mogą przejściowo lub trwale zawierać cząsteczki kwasu nukleinowego lub wektory według wynalazku. Jako komórkę gospodarza uważa się organizm, który zdolny jest pobrać in vitro rekombinacyjne DNA i w takim przypadku, może syntetyzować białka kodowane przez te cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Zalecanymi komórkami gospodarza są komórki prokariotyczne lub eukariotyczne. Zwłaszcza, komórki roślin zawierających układy wektorów według wynalazku lub pochodne lub ich części. Zalecane jest aby były one zdolne do syntetyzowania enzymów do wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych, co wynika z faktu, że pobierają one układy wektorów według wynalazku, pochodne lub ich części. Komórki według wynalazku zawierają wprowadzoną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku albo heterologiczną w odniesieniu do transformowanej komórki, to znaczy, że nie występuje ona naturalnie w tych komórkach, albo jest zlokalizowana w innym miejscu genomu niż ten, który odpowiada naturalnie występującej sekwencji.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku pozwalają na wytwarzanie krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych w dowolnym organizmie metodami inżynierii genetycznej, podczas gdy do tej pory nie było możliwe modyfikowanie roślin metodami konwencjonalnymi, na przykład metodami hodowlanymi, w taki sposób, aby były one zdolne do syntezy polimerów fruktozylowych. Dzięki

PL 197 151 B1 podwyższeniu aktywności białek według wynalazku, na przykład przez nadekspresję odpowiednich cząsteczek kwasu nukleinowego lub przez dostarczenie mutantów, które nie są dalej przedmiotem specyficznych komórkowo mechanizmów regulacji i/lub które zmieniły zależność temperatura - aktywność, możliwe jest podniesienie wydajności w roślinach zmodyfikowanych metodami inżynierii genetycznej.

Z tego powodu moż liwa jest ekspresja cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku w komórkach roś lin w celu podniesienia aktywności odpowiadającej SST lub wprowadzenie do komórek normalnie nie posiadających ekspresji tego enzymu. Ponadto możliwe jest modyfikowanie cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, sposobami znanymi fachowcom, w celu otrzymania SST według wynalazku, które nie są dalej poddawane specyficznym komórkowo mechanizmom regulacji, lub które mają zmodyfikowaną zależność temperaturową albo specyficzność substratową lub produktową.

W przypadku gdy czą steczki kwasu nukleinowego są ekspresjonowane w roś linach, syntetyzowane białka mogą być zlokalizowane w jakimkolwiek przedziale komórki roślinnej. W celu osiągnięcia lokalizacji w określonym przedziale, sekwencje zapewniające lokalizację w wakuoli muszą być wycięte i jeś li potrzeba, pozostał y region kodują cy musi być przyłączony do sekwencji DNA, gwarantującej lokalizację w określonym przedziale. Takie sekwencje są znane (patrz na przykład, Braun i wsp., EMBO j. 11 (1992), 3219-3227; Wolter i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald i wsp., Plant J. 1 (1991), 95-106). Komórki roś liny transgenicznej wedł ug wynalazku mogą być transformowane jedną lub wieloma cząsteczkami kwasu nukleotydowego według wynalazku. Takie komórki mogą zawierać jeden lub wiele cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku powiązanych z elementami regulatorowymi DNA, gwarantującymi transkrypcję w komórkach roślin, zwłaszcza z promotorem. Takie rośliny mogą być odróżniane od naturalnie występujących komórek roślinnych przez to, że zawierają one co najmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, który nie występuje naturalnie w tych komórkach lub przez to, że taka cząsteczka jest integrowana w genom tej komórki, gdzie ona naturalnie nie występuje to znaczy w innym regionie genomu.

Transgeniczne komórki rośliny mogą być regenerowane do całych roślin przy użyciu znanych fachowcom metod. Rośliny według wynalazku mogą być otrzymywane przez regenerację komórek roślin transgenicznych według wynalazku. Rośliny według wynalazku mogą zawierać opisane powyżej komórki rośliny transgenicznej. Transgeniczne rośliny mogą zasadniczo być roślinami dowolnego gatunku, to znaczy zarówno roślinami jednoliściennymi i dwuliściennymi. W korzystnej postaci są one roślinami uprawowymi, zwłaszcza roślinami, które syntetyzują i/lub gromadzą skrobię, takimi jak pszenica, jęczmień, ryż, kukurydza, burak cukrowy, trzcina cukrowa lub ziemniak. Szczególnie korzystne rośliny gromadzące sacharozę.

Materiał propagacyjny i plony roślin według wynalazku, mogą przykładowo stanowić owoce, nasiona, bulwy, kłącza, podkładki, sadzonki itp.

Komórki roślin transgenicznych i roślin według wynalazku syntetyzują krótkołańcuchowe polimery fruktozylowe, będące wynikiem ekspresji lub dodatkowej ekspresji co najmniej jednej cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.

Krótkołańcuchowe polimery fruktozylowe mogą być otrzymywane z komórek roślin transgenicznych według wynalazku jak również materiału propagacyjnego i plonów, czyli produktów zbieranych z roś liny.

Komórki rośliny transgenicznej według wynalazku mogą być regenerowane do całych roślin zgodnie ze znanymi fachowcom sposobami. Rośliny te są dogodnie roślinami uprawowymi, zwłaszcza roślinami, które syntetyzują i/lub magazynują sacharozę i/lub skrobię. Szczególnie zalecanymi roślinami są ziemniaki. Zalecany materiał propagacyjny roślin według wynalazku stanowią szczególnie bulwy.

W celu ekspresji cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku - nici sensownej i antysensownej w komórkach roślin, są one przyłączone do regulatorowych elementów DNA gwarantujących transkrypcję w komórkach roślinnych. Są nimi zwłaszcza promotory. Zasadniczo, każdy promotor w komórkach roślinnych jest odpowiedni do ekspresji.

Promotor może być wybrany w taki sposób aby ekspresja zachodziła w całym organizmie lub jedynie w pewnych tkankach, na pewnym etapie rozwoju rośliny, lub w określonym momencie wyznaczonym przez zewnętrzną stymulację. W odniesieniu do roślin, promotor może być homologiczny lub heterologiczny. Odpowiednimi promotorami są na przykład promotor 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora i promotor ubikwityny z kukurydzy do ekspresji konstytutywnej, zwłaszcza zalecany promotor genu patatyny B33 (Rocha-Sosa i wsp., EMBO J. 8 (1989), 23-29) dla specyficznej dla bulw ekspresji

PL 197 151 B1 w ziemniakach lub promotor gwarantujący jedynie ekspresję w fotosyntetycznie aktywnej tkance, na przykład promotor ST-LS1 (Stockhaus i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus i wsp., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) lub dla specyficznej dla bielma ekspresji promotora HMG z pszenicy, promotora USP, promotora fazeoliny lub promotorów genów zein z kukurydzy.

Ponadto mogą występować terminatory sekwencji zapewniające właściwe zakończenie transkrypcji, jak też dodatki końców poly-A do transkryptu, który jest uznawany jako posiadający funkcje stabilizacji transkryptów. Elementy takie opisane są w literaturze (cf Gielen i wsp., EMBO J. 8 (1989), 23-29) i mogą być wymieniane dowolnie.

Do przygotowywania wprowadzania obcych genów do roślin wyższych dostępna jest duża ilość wektorów klonujących, zawierających sygnał replikacji dla E.coli i gen markerowy do selekcji transformowanych komórek bakterii. Przykładami takich wektorów są pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184 i tym podobne. Opisana sekwencja może być wprowadzona do wektora w odpowiednie miejsce rozszczepienia. Otrzymany plazmid jest odpowiedni do transformacji komórek E.coli. Transformowane komórki E.coli są hodowane w odpowiedniej pożywce, następnie zbierane i poddawane lizie. Plazmid jest regenerowany. Zwykle stosuje się analizę restrykcyjną, elektroforezę żelową i inne biochemiczne lub molekularne metody biologiczne, jako metody analityczne do charakteryzacji regenerowanego DNA plazmidu. Po każdej manipulacji, DNA plazmidu może być zcięte i zregenerowane fragmenty DNA dołączane do innych sekwencji DNA. Każda sekwencja DNA plazmidu może być klonowana w tym samym lub innych plazmidach.

Do wprowadzania DNA do komórki gospodarza rośliny dostępnych jest wiele sposobów. Sposoby te obejmują transformację komórek roślinnych przez T-DNA stosując Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes jako środki do transformacji, fuzję protoplastów, iniekcje, elektroporację DNA, wprowadzenie DNA za pomocą sposobów biolistycznych jak też innymi sposobami.

W celu przeprowadzenia iniekcji i elektroporacji DNA w komórkach roślin nie ma szczególnych wymagań co do stosowanych plazmidów. Mogą być stosowane proste plazmidy takie jak pochodne pUC. Jeżeli z tak stransformowanych komórek ma być regenerowana cała roślina, powinien być tam zastosowany dający się oznaczyć marker.

W zależności od sposobu wprowadzania pożądanych genów do komórki roślinnej mogą być konieczne dalsze sekwencje DNA. Jeżeli na przykład plazmid Ti lub Ri jest stosowany do transformacji komórki roślinnej, wprowadzone są co najmniej ograniczniki prawego końca, często jednakże prawego i lewego końca plazmidu Ti i Ri T-DNA jako regiony flankujące wprowadzonych genów.

Jeśli do transformacji są stosowane bakterie glebowe, DNA który ma być wprowadzany musi być klonowany w określonych plazmidach, albo w wektorze pośrednim lub w wektorze binarnym. Wektory pośrednie mogą być włączane do plazmidu Ti lub Ri bakterii glebowej za pomocą sekwencji, które są homologiczne do sekwencji w T-DNA, na drodze rekombinacji homologicznej. Plazmidy Ti lub Ri zawierają ponadto region vir konieczny do przenoszenia T-DNA. Wektory pośrednie nie podlegają replikacji w bakteriach glebowych. Przy pomocy plazmidu pomocniczego wektor pośredni może być przenoszony do Agrobacterium tumefaciens (koniugacja). Wektory binarne mogą być replikowane w E.coli i w bakteriach glebowych. Zawierają one gen markerowy selekcyjny i linker lub polilinker otoczony przez prawy i lewy region graniczny T-DNA. Może on być transformowany wprost do bakterii glebowej (Holsters i wsp., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Bakteria glebowa służąca jako komórka gospodarza powinna zawierać plazmid niosący region vir. Region vir jest konieczny do przenoszenia T-DNA do komórki roślinnej. Może ona też zawierać dodatkowe T-DNA. Bakteria glebowa tak transformowana stosowana jest do transformacji komórek roślinnych. Zastosowanie T-DNA do transformacji komórek roślinnych było badane szeroko i opisane w opisie EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley i wsp., Crit. Rev. Plant. Sci. 4, 1-46 i An i wsp., EMBO J. 4 (1985), 277-287. Do przenoszenia DNA do komórki roślinnej eksplanty roślinne mogą być hodowane razem z Agrobacterium tumefaciens lub Agrobacterium rhizogenes. Z zainfekowanego materiału roślinnego (na przykład kawałka liścia, segmentu łodygi, korzenia ale też z protoplastu lub komórki hodowanej w zawiesinie) mogą być regenerowane całe rośliny w odpowiedniej pożywce, która może zawierać antybiotyki lub biozydy do wyboru transformowanych komórek. Otrzymane w ten sposób rośliny mogą być badane na obecność wprowadzonego DNA. Znane są inne możliwości wprowadzenia obcego DNA stosując metody biolistyczne lub transformację protoplastów (cf., np., Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. W: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pϋhler, P. Stadler, eds.), tom 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

PL 197 151 B1

Inne układy do transformacji roślin jednoliściennych stanowią transformacja przy pomocy podejścia bioliostycznego, elektrycznie lub chemicznie indukowane wprowadzenie DNA do protoplastów, elektroporacja częściowo przepuszczalnych komórek, makroiniekcje DNA do kwiatów, mikroiniekcje DNA do mikrospor i pro-zarodków, wprowadzaniem DNA do kiełkujących pyłków i wprowadzanie DNA do zarodków przez obrzmiewanie (przeglądowy artykuł: Potrykus, Physiol, Plant (1990), 269-273).

O ile transformacja roś lin dwuliś ciennych przez ukł ady wektorowe plazmidu Ti za pomocą Agrobacterium tumefaciens jest dobrze poznana, najnowsze prace badawcze wskazują, że także rośliny jednoliścienne można poddawać do transformacji wektorami opartymi na Agrobacterium (Chan i wsp., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei i wsp., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier i wsp., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould i wsp., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney i wsp., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li i wsp., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Trzy z powyżej wspomnianych układów transformacji można było ustalić dla różnych roślin zbożowych: elektroporacja tkanek, transformacja protoplastów i przenoszenie DNA przez bombardowanie cząstkami do tkanki regeneracyjnej i komórek (artykuł przeglądowy: Jahne i wsp., Euphytica 85 (1995), 35-44).

Często w literaturze opisywano transformację pszenicy (artykuł przeglądowy: Maheshwari i wsp., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

Wynalazek dotyczy także roślin zawierających co najmniej jedną, korzystnie wiele komórek zawierających układy wektorów według wynalazku lub pochodnych lub ich części i zdolne do syntetyzowania enzymów do produkcji polimerów fruktozylowych powstałych w wyniku wprowadzenia układu wektorów, pochodnych lub części tych układów wektorów według wynalazku.

Wynalazek dostarcza także roślin wielu gatunków, rodzajów, rodzin, rzędów, i klas, które zdolne są do syntezy enzymów do wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych będących wynikiem wprowadzenia układów wektora lub jego części. Ze względu na to, że znane rośliny są niezdolne do wytwarzania tylko tych krótkołańcuchowych polimerów, łatwo jest sprawdzić czy sposób był skutecznie przeprowadzony, na przykład metodą analizy chromatograficznej cukrów zawierających fruktozę. Są one dogodne w porównaniu do nielicznych roślin zawierających polimery fruktozylowe, ponieważ mają zdefiniowaną masę cząsteczkową, to znaczy wielkość krótkołańcuchowego polimeru fruktozylowego. Ponadto umiejscowienie w różnych przedziałach komórkowych i w różnych organach, jak również zwiększenie szybkości ekspresji umożliwia uzyskanie plonu.

Sposób wytwarzania krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych może obejmować:

a) kontaktowanie sacharozy lub równoważnego substratu z SST według wynalazku w warunkach pozwalających na konwersję krótkołańcuchowych polimerów i otrzymanie polimerów fruktozylowych wytwarzanych tym sposobem.

b) otrzymywanie polimerów fruktozylowych wytwarzanych tym sposobem.

Właściwości wytwarzanych polimerów fruktozylowych zależą od enzymatycznej specyficzności transferazy fruktozylowej. W przypadku, gdy stosuje się SST według wynalazku, korzystnie produkowane są kestoza, ale także nystoza i fruktozylonystoza.

Polimery fruktozylowe mogą być wytwarzane z komórki roślinnej, lub rośliny według wynalazku, lub z materiału propagacyjnego, lub produktów zbieranych z roślin, lub komórek roślin według wynalazku, lub otrzymanych zgodnie z powyżej opisanym sposobem. Te polimery fruktozylowe mogą być dogodne do wytwarzania żywności takiej jak produkty piekarnicze lub makaron. Dogodne polimery fruktozylowe mogą być stosowane do podwyższania lepkości w układach wodnych, jako detergenty, czynniki zawieszające lub przyspieszające procesy sedymentacji i kompleksowania, ale także do wiązania wody.

Figura 1 przedstawia konstrukcję plazmidu pB33-cySST.

Wektor: pBinB33 (pochodna pBin19; Bevan, 1984 Nucl Acids Res 12: 8711) promotor: promotor B33 (Rocha-Sosa i wsp., 1989, EMBO J 8: 23-29) donor: Solanum tuberosum region kodujący: gen SST z Cynara scolymus orientacja: sensowna terminator: sygnał poliadenylacji genu syntazy oktopiny z plazmidu pTiACH5 A.

Tumefaciens (Gielen i wsp., 1984, EMBO J 3: 835-846) donor: Agrobacterium tumefaciens oporność: kanamycyna

PL 197 151 B1

Figura 2 przedstawia analizę rozpuszczalnych cukrów w bulwach roślin transgenicznych, które były wytwarzane stosując układ wektora pB33-cySST. Krótkołańcuchowe polimery fruktozylowe (zwłaszcza 1-kestoza) otrzymane w następstwie genetycznej modyfikacji były znakowane.

Figura 3 przedstawia analizę cukrów rozpuszczalnych w roślinie transgenicznej, która była wytworzona stosując układ wektora odpowiednio pB33-cySST i p35S-cySST, w porównaniu do dzikiego typu roślin.

P r z y k ł a d 1: Identyfikacja, izolacja i charakterystyka cDNA kodującego zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy z karczocha (Cynara scolymus)

Całkowity RNA był izolowany z tarcz kwiatowych karczocha (Sambrook i wsp., patrz wyżej). Poly(A)⁺ mRNA był izolowany stosując układ izolacji mRNA PolyATtract (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Komplementarny DNA (cDNA) był wytwarzany z 5 μg tego RNA za pomocą zestawu syntetyzującego Zap-cDNA Stratagene według instrukcji producenta. Otrzymano 2x10⁶ niezależnych rekombinowanych fagów. Amplifikowana biblioteka cDNA była przesiewana metodami konwencjonalnymi za pomocą znakowanego ³²P fragmentu DNA i odpowiadającego końcowi 3' 6-SFT cDNA o długości 392 p. z. (Sprenger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 11652). Fragment ten otrzymano z całkowitego RNA przez RT-PCR (RT-PCR Kit, Stratagene, Heidelberg, Germany) jako macierz z indukowanych światłem (72 godziny) liści pierwotnych jęczmienia. Pozytywne klony były następnie badane.

P r z y k ł a d 2: Analiza sekwencji insertu cDNA plazmidu pCy21

Plazmid DNA izolowano z klonu pCy21. Sekwencja insertu cDNA oznaczona była metodami konwencjonalnymi za pomocą metody dideoksynukleotydowej (Sangeri wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74 (1977), 5463-5467).

Insercję klonu pCy21 stanowi DNA o 2055 p. z. Sekwencję nukleotydową opisano na Seq ID nr 1. Odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową przedstawiono na Seq ID nr 2.

Analiza sekwencji i porównanie z już opublikowanymi sekwencjami pokazała, że sekwencja ukazana na Seq ID Nr 1 jest nowa i zawiera region kodujący wykazujący homologię do SST z innych organizmów.

P r z y k ł a d 3: Wytwarzanie plazmidu pB33-cySST i wprowadzanie tego plazmidu do genomu ziemniaka

Plazmid pB33-cySST zawiera trzy fragmenty A, B i C w wektorze binarnym pBin19 (Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711, zmodyfikowanym według Becker, 1990, Nucl Acids Res 18: 203) (cf Fig. 1). Fragment A zawiera promotor B33 genu b33 patatyny ziemniaka. Zawiera on fragment Dral (pozycja 1512 do pozycji +14) genu patatyny B33 (Rocha-Sosa i wsp., 1989, EMBO J 8:23-29), który jest wprowadzony pomiędzy EcoRI i miejsce rozcięcia SacI polilinkera pBin19-Hyg. Fragment B zawiera region kodujący sekwencji wskazanej na SEQ ID nr 1. Fragment B był otrzymany jako fragment Notl z tępymi końcami z wektora pBluescript, w którym jest on wstawiony do miejsca cięcia EcoRI przez sekwencję łącznikową EcoRI/Not I. Fragment C zawiera sygnał poliadenylacji genu 3 z T-DNA plazmidu Ti pTi ACH 5 (Gielen i wsp., (1984); EMBO J. 3, 835-846) nukleotydów 11749-11939, który był izolowany jako fragment Pvu II-Hind III z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella i wsp., (1983) Nature 303, 209-213) i sklonowany pomiędzy miejscem cięcia Sph I i Hind III poliłącznika pBin19-Hyg po dodaniu łączników Sph I do miejsca cięcia Pvu II. Plazmid pB33-cySST ma wielkość około 14 kb. Plazmid ten był wprowadzony do bakterii glebowej (Hofgen i Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877).

Plazmid pB33-cySST był wprowadzony do roślin ziemniaka poprzez przeniesienie genu indukowane przez Agrobacterium według powyżej opisanych metod konwencjonalnych. Z transformowanych komórek regenerowane były całe rośliny. Z regenerowanych roślin otrzymywano ekstrakty enzymu i badano pod kątem obecności polimerów fruktozylowych. Analizę prowadzono jak opisano w Rober (Planta 199, 528-536). Analiza bulw dotycząca ilości transformowanych tym wektorem roślin jasno pokazała obecność krótkołańcuchowych polimerów fruktozylowych, zwłaszcza 1-kestozy, która może być przypisana ekspresji genu SST (patrz Fig. 2).

P r z y k ł a d 4: Analiza rozpuszczalnego cukru w roślinach typu dzikiego i zawierających SST roślinach transgenicznych

Rośliny transgeniczne zawierające wektory pB33-cySST i 35S-cySST (posiadające region kodujący SEQ ID nr 1 pod kontrolą promotora 35S) były wytwarzane jak opisano w przykładzie 3. Ekstrakty otrzymywano z roślin transgenicznych i roślin dzikiego typu i badano pod kątem obecności poliPL 197 151 B1 merów fruktozylowych; patrz przykład 3. Analiza HPAEC pokazana na Figurze 3 przedstawia wytwarzanie oligofruktanów. Wyniki są zebrane w Tabeli 1, poniżej.

T a b e l a 1

Cukier rozpuszczalny (sacharoza i oligofruktan) w roślinach typu dzikiego i w transformowanych roślinach

linie	sacharoza	1-kestoza	nystoza	F-nystoza
WT 1 (Desiree)	2,09	-	-	-
WT 2 (Desiree)	1,67	-	-	-
B33-cySST 6	2,26	3,58	1,60	-
B33-cySST 54	5,13	3,06	2,90	0,23
35S-cySST 18	4,08	4,05	1,51	0,12
35S-cySST 22	4,80	4,14	2,19	<0,1

Wartości w g węglowodanu na kg świeżej masy

Jak jasno wynika z Figury 3 i Tabeli powyżej, zawartość polimerów fruktozylowych, zwłaszcza 1-kestozy, przekracza zawartość sacharozy. Dlatego przeprowadzone doświadczenia wykazują przydatność cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku do wytwarzania w transgenicznych roślinach polimerów fruktozylowych.

PL 197 151 B1

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften e.V.

(B) ULICA: nie ma (C) MIASTO: Berlin (E) KRAJ: Niemcy (F) ZIP: nie ma (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania SST, SST, komórka rośliny transgenicznej, roślina, materiał propagacyjny rośliny, produkty zbierane z rośliny, sposoby wytwarzania 1kestozy, nystozy i fruktozylonystozy.

(iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 4 (iv) POSTAĆ ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn wydanie 1.0; wersja

1,30 (EPA)

PL 197 151 B1 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:l:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2226 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Cynara Scolymus (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS

(B)

MIEJSCE: 8

..1918

(xi)

OPIS SEKWENCJI

SEQ ID

: nr

1 :

CCACCAC

ATG

GCT

TCC

TCT

ACC

ACC

ACC

CCA

CTC

CTC

CCT

CAC

CAC

CAC

49

Met

Ala

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Pro

Leu

Leu

Pro

His

His

His

1

5

10

CTT

CAG

AAC

CCG

CAA

CAA

CTC

GCC

GGA

TCT

CCG

GCA

GCT

CAT

CGT

CTA

97

Leu

Gin

Asn

Pro

Gin

Gin

Leu

Ala

Gly

Ser

Pro

Ala

Ala

His

Arg

Leu

15

20

25

30

TCC

CGA

CCC

ACA

CTC

CTT

TCT

GGG

ATC

CTT

GTT

TCG

GTC

CTA

GTC

ATC

145

Ser

Arg

Pro

Thr

Leu

Leu

Ser

Gly

Ile

Leu

Val

Ser

Val

Leu

Val

Ile

35

40

45

PL 197 151 B1

TGT Cys

GCT Ala

CTC Leu

GTT Val 50

GCT Ala

GTA Val

ATC Ile

CAC His

AAC Asn 55

CAA Gin

TCA Ser

CAG Gin

CAA Gin

CCC Pro 60

TAC Tyr

CAT His

193

GAC

GG C

GGA

GCT

AAA

CCC

TCC

TCC

TCC

GCC

GCT

ACC

ACC

ACC

TTC

CCA

241

Asp

Gly

Gly

Ala

Lys

Pro

Ser

Ser

Ser

Ala

Ala

Thr

Thr

Thr

Phe

Pro

65

70

75

ACA

GCG

TCG

CCA

GAA

GCT

GGT

TTG

AAA

CGG

TTT

CCC

ATT

GAG

TTG

AAA

289

Thr

Ala

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Ile

Glu

Leu

Lys

SO

85

90

ACG

AAT

GCT

GAG

GTT

GAG

TGG

CAA

CGC

TCG

GCT

TAC

CAT

TTT

CAG

CCC

337

Thr

Asn

Ala

Glu

Val

Glu

Trp

Gin

Arg

Ser

Ala

Tyr

His

Phe

Gin

Pro

9 5

100

105

110

GAT

AAG

AAC

TAC

ATT

AGC

GAT

CCT

GAT

GGC

CCA

ATG

TAT

CAC

ATG

GGG

385

Asp

Lys

Asn

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr

His

Met

Gly

115

120

125

TGG

TAT

CAT

CTC

TTC

TAT

CAG

TAC

AAT

CCA

GAG

TCT

GCC

ATC

TGG

GGG

433

Trp

Tyr

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Ala

Ile

Trp

Gly

130

135

140

AAC

ATC

ACA

TGG

GGC

CAC

TCC

GTA

TCC

AAA

GAC

ATG

ATC

AAC

TGG

TTC

431

Asn

lis

Thr

Trp

Gly

His

Ser

Val

Ser

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

145

150

155

CAT

CTC

CCC

TTC

GCC

ATG

GTC

CCT

GAC

CAA

TGG

TAC

GAT

ATC

GAA

GGT

529

his

Leu

Pro

Phe

Ala

Met

Val

Pro

Asp

Gin

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu

Gly

lóG

165

170

U'1’ 0

ATG

ACC

GG C

TCC

GCC

ACC

GTC

CTC

CCT

GAC

GGT

CAG

ATC

ATC

ATG

577

Vai

Mec

Thr

Gly

Ser

Ala

Thr

Val

Leu

Pro

Asp

Gly

Gin

Ile

Ile

Met

17 5

ISO

185

190

CTC

TAC

ACC

GGC

AAC

GCG

TAC

GAT

CTC

TCG

CAA

CTG

CAA

TGC

TTA

GCA

625

Uu

Tyr

Thr

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Cys

Leu

Ala

195

200

205

TAT

GCC

GTC

AAC

TCG

TCT

GAT

CCC

CTC

CTC

CTC

GAT

TGG

AAA

AAG

TAC

673

Tyr

Ala

Val

Asn

Ser

Ser

Asp

Pro

Leu

Leu

Leu

Asp

Trp

Lys

Lya

Tyr

210

215

220

G Ag

GGA

AAT

CCC

ATC

TTG

TTC

CCA

CCT

CCT

GGG

GTG

GGA

TAC

AAG

GAT

721

Glu

Gly

Asn

Pro

Ile

Leu

Phe

Pro

Pro

Pro

Gly

Val

Gly

Tyr

Lys

Asp

225

230

235

TTT

CGG

GAC

CCA

TCT

ACA

CTG

TGG

TTG

GGT

CCC

GAT

GGT

GAA

TAC

AGA

769

Phe

Arg

Asp

Pro

Ser

Thr

Leu

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr

Arg

240

24S

250

ATG

GTA

ATG

CGG

TCC

AAG

CAT

AAC

GAG

ACC

ATC

GGT

TGT

GCC

TTG

ATT

817

Met

Val

Met

Gly

Ser

Lys

His

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Cys

Ala

Leu

Ile

155

260

265

270

TAC

CAT

ACC

ACT

AAT

TTT

ACG

CAT

TTC

GAG

CTC

AAG

GAA

GAG

GTG

CTT

865

Tyr

ΗΪ3

Thr

Thr

Asn

Phe

Thr

His

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

275

280

285

PL 197 151 B1

CAC GCC GTT CCC CAC

ACG Thr

GGT Gly

ATG Met

TGG Trp 295

GAA Glu

TGT Cys

GTG Val

GAT Asp

CTT Leu 300

TAT Tyr

CCG Pro

913

His Ala Vai Pro 290

His

GTA TCC ACC ACG

CAC

ACA

AAC

GGG

TTG

GAC

ATG

GTG

GAT

AAC

GGG

CCG

961

Val Ser Thr Thr

His

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Met

Val

Asp

Asn

Gly

Pro

305

310

315

ΑΛΤ GTG AAG· CAT

GTG

TTG

AAA

CAA

AGT

GGG

GAT

GAA

GAT

CGA

CAT

GAT

1009

Asn Val Lys His

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Gly

Asp

Glu

Asp

Arg

His

Asp

320

325

330

TGG TAT GCG CTC

GGG

ACT

TAT

GAC

GTC

GTG

AAT

GAT

AAG

TGG

TAT

CCA

1057

Trp Tyr Ala Leu

Gly

Thr

Tyr

Asp

Vai

Val

Asn

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro

3 5 5

340

345

350

GAT GAC CCT GAA

AAC

GAT

GTG

GGT

ATC

GGG

TTA

AGA

TAC

GAT

TTC

GGA

1105

aap Asp Pro Glu

Asn

Asp

Val

Gly

Ile

Gly

Leu

Arg

Tyr

Asp

Phe

Gly

355

360

365

AAG TTT TAT GCG

TCA

AAG

ACG

TTC

TAC

GAC

CAA

CAT

AAG

AAG

AGA

CGG

1153

Lys Phe Tyr Ala

Ser

Lys

Thr

Phe

Tyr

Asp

Gin

His

Lys

Lys

Arg

Arg

370

375

380

GTC CTT TGG GGT

TAC

GTT

GGA

GAA

ACC

GAT

CCC

CCT

AAA

TAC

GAC

GTT

1201

Vai Leu Trp Gly

Tyr

Val

Gly

Glu

Thr

Asp

Pro

Pro

Lys

Tyr

Asp

Val

385

390

395

TAC AAG GGA TGG

GCT

AAC

ATT

TTG

AAC

ATT

CCA

AGG

ACC

ATA

GTT

TTG

1249

Tyr Lys Gly Trp

Ala

Asn

Ile

Leu

Asn

Ile

Pro

Arg

Thr

Ile

Val

Leu

400

405

410

GAC ACG AAA ACG

AAT

ACC

AAT

TTG

ATT

CAA

TGG

CCA

ATT

GCG

GAA

GTC

1297

Asp Thr Lys Thr

Asn

Thr

Asn

Leu

Ile

Gin

Trp

Pro

Ile

Ala

Glu

Vał

415

420

425

430

GAA AAC TTG AGA

TCG

AAT

AAA

TAC

AAT

GAA

TTC

AAA

GAC

GTG

GAG

CTG

1345

Glu Asn Leu Arg

Ser

Asn

Lys

Tyr

Asn

Glu

Phe

Lys

Asp

Val

Glu

Lau

435

440

445

AAA CCG GGA TCA

CTG

ATT

CCG

CTC

GAG

ATA

GGC

A CA

GCA

ACA

CAG

TTG

1393

Lys Pro Gly Ser

Leu

Ile

Pro

Leu

Glu

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Gin

Leu

4 50

455

460

GAT ATA ACT GCG

ACA

TTC

GAA

GTT

GAT

CAA

ACG

ATG

TTG

GAA

TCG

ACG

1441

Asp Ile Thr Ala

Thr

Phe

Glu

Val

A3p

Gin

Thr

Mer

Leu

Glu

Ser

Thr

46 5

470

47 5

CTT GAA GCC GAT

GTT

TTG

TTC

AAT

TGT

ACG

ACC

AGT

GAA

GGT

TCA

GCC

1489

Leu Glu Ala Asp

Val

Leu

Phe

Asn

Cys

Thr

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

480

485

490

GGG AGA GGG GTG

TTG

GGG

CCA

TTT

GGA

CTG

GTG

GTT

CTA

GCT

GAT

GCC

1537

Gly Arg Gly Val

Leu

Gly

Pro

Phe

Gly

Leu

Val

Val

Leu

Ala

Asp

Ala

49 5

500

505

510

PL 197 151 B1

G Αί- Ο i u

GGA Arg

TCT Ser

GAG Glu

CAA Gin 515

CTT Leu

CCT Pro

GTG Val

TAT Tyr

TTC Phe 520

TAT Tyr

ATA Ile

GCA Ala

AAA Lys

GAC Asp 525

ACC Thr

1585

GAT

t j GA

TCC

TCA

AAA

ACT

TAC

TTC

TGT

GCC

GAT

GAA

TCA

AGA

TCA

TCG

1633

Asp

Gly

Ser

Ser

Lys

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Ser

530

535

540

AAC

GAT

GTA

GAC

ATA

GGG

ΆΑΑ

TGC

GTG

TAC

GGA

AGC

AGT

GTT

CCT

GTT

1631

Asn

Asp

Val

Asp

Ile

Gly

Lys

Trp

Val

Tyr

Gly

Ser

Ser

Val

Pro

Val

545

550

555

cm

G AA

GGC

GAA

AAA

TTC

AAC

ATG

AGG

TTG

CTG

GTG

GAT

CAT

TCA

ATT

1729

Leu

Glti

Gly

Glu

Lys

Phe

Asn

Met

Arg

Leu

Leu

Val

Asp

His

Ser

Ile

3CU

5 6 5

570

GTC

GAA

GGC

TTC

GCA

CAA

GGA

GGC

AGA

ACG

GTG

GTG

ACA

TCA

AGA

GTG

1777

Val

Glu

Gly

Phe

Ala

Gin

Gly

Gly

Arg

Thr

Val

Val

Thr

Ser

Arg

Val

5 75

580

585

590

TAT

GCG

GCG

AAG

GCG

ATC

TAC

GGC

GCT

GCA

AAG

TTA

TTT

TTG

TTC

AAC

1825

Tyr

?ro

Ala

Lys

Ala

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Leu

Phe

Leu

Phe

Asn

595

600

605

AAC

GCC

ACC

GGA

ATC

AG C

GTG

AAG

GCA

TCT

CTC

AAG

ATC

TGG

AAA

ATG

1873

Asn

Ala

Thr

Gly

Ile

Ser

Val

Lys

Ala

Ser

Leu

Lys

Ile

Trp

Lys

Met

610

615

620

AAG

GAA

GCA

CAA

CTG

GAT

CCA

TTC

CCT

CTT

TCT

GGA

TGG

AGT

TCT

1918

Lys

Glu

Ala

Gin

Leu

Asp

Pro

Phe

Pro

Leu

Ser

Gly

Trp

Ser

Ser

625

630

635

TGATGATGAT GATGATTAAG AACTCATTTC ATGAAGATGA TGATTAAGAA CTCATTTCAT 1978

GATGATGATG ATGATTCCAG TTTATATGCG TACCCTGTTC CCTTTACCTG TATGTGGTGG 2038

TGGTGGTGAA ATATGGTTAG CATGATTCCG GGTTGGCGAG GGCAATATGG TAATTTACTA 2098

TCGCTGTAGT AGTACTCCAC TTGTGAGATT ATATTTCATA AATTCAATTA TTATTCCTGT 2158

TTACAACCTT TTTCATTGTA TCATACCACC CATTGAATCC CATCATGTTC AATTAGTGTT 2218

CCiAAAAA 2226 (2) INFORMACJA C SEKWENCJI ID nr: 2 :

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 637 amino acrds \B) TYP: aminokwas i EU TOPOLOGIA: liniowa

Cii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI ID: nr 2:

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gin 15 10 15

PL 197 151 B1

Asn Pro Gin Gin Leu Ala Gly 20

Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile

Leu Val Ala Val Ile His Asn 50 55

Gly Ala Lyo Pro Ser Ser Ser 6 5 70

Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys 85

Ala Glu Val Glu Trp Gin Arg 100

Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp 115

His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn 130 135

Thr Trp Gly His Ser Val Ser 145 150

Pro Phe Ala Met Val Pro Asp 165

Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu 130

Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu 195

Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu 210 215

Aon Pro Ile Leu Phe Pro Pro 225 230

Asp Pro Ser Thr Lau Trp Leu 245

Met Gly Ser Lys His Asn Glu 260

Thr Thr Asn Phe Thr His Phe 2 7 5

Val Pro His Thr Gly Mec Trp 290 295

Thr Thr His Thr Asn Gly Leu 305 310

Lya His Val Leu Lys Gin Ser 325

Ser Pro Ala Ala His Arg Leu 25 30

Leu Val Ser Val Leu Val Ile 40 45

Gin Ser Gin Gin Pro Tyr His 60

Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro 75

Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys 90

Ser Ala Tyr His Phe Gin Pro 105 110

Gly Pro Mat Tyr His Met Gly 120 125

Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly 140

Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe 155

Gin Trp Tyr Asp Ile Glu Gly 170

Pro Asp Gly Gin Ile Ile Met 185 190

Ser Gin Leu Gin Cys Leu Ala 200 205

Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr 220

Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp 235

Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg 250

Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile 265 270

Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu 280 285

Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro 300

Asp Met Val Asp Asn Gly Pro 315

Gly Asp Glu Asp Arg His Asp 330

Ser

Cys

Asp

Thr

Thr

Asp

Trp

Asn

His

Val

175

Leu

Tyr

Glu

Phe

Met

255

Tyr

His

Val

Asn

Trp

335

Arg

Ala

Gly

Ala

Asn

Lys

Tyr

Ile

Leu

160

Met

Tyr

Ala

Gly

Arg

240

Val

His

Ala

Ser

Val

320

Tyr

PL 197 151 B1

Ala

Leu

Gly

Thr 340

Tyr

Asp

Val

Val

Asn 345

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro 350

Asp

Asp

Pi; o

Glu

Aan

Asp

Val

Gly

Ile

Gly

Leu

Arg

Tyr

Asp

Phe

Gly

Lys

Phe

355

360

365

Tyr

Ala

Ser

Lys

Thr

Phe

Tyr

Asp

Gin

His

Lys

Lys

Arg

Arg

Val

Leu

3 70

375

380

Trp

Gly

Tyr

Val

Gly

Glu

Thr

Asp

Pro

Pro

Lys

Tyr

Asp

Val

Tyr

Lys

38 5

390

395

400

Gly

Trp

Ala

Asn

Ile

Leu

Asn

Ile

Pro

Arg

Thr

Ile

Val

Leu

Asp

Thr

405

410

415

Lys

Thr

Asn

Thr

Asn

Leu

Ile

Gin

Trp

Pro

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

420

425

430

Leu

Arg

Ser

Asn

Lys

Tyr

Asn

Glu

Phe

Lys

Asp

Val

Glu

Leu

Lys

Pro

435

440

445

Gly

Ser

Leu

Ile

Pro

Leu

Glu

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Gin

Leu

Asp

Ile

450

455

4 60

Thr

Ala

Thr

Phe

Glu

Val

Asp

Gin

Thr

Met

Leu

Glu

Ser

Thr

Lau

Glu

4 δ 5

4 70

475

480

Ala

Asp

Val

Leu

Phe

Asn

Cys

Thr

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

Gly

Arg

435

490

495

Gly

Val

Leu

Gly

Pro

Phe

Gly

Leu

Val

Val

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Arg

500

505

510

ler

Glu

Gin

Leu

Pro

Val

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Ala

Lys

Asp

Thr

Asp

Gly

515

520

525

Ser

Ser

Lys

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Ser

Asn

Asp

530

535

540

Val

Asp

Ile

Gly

Lys

Trp

Val

Tyr

Gly

Ser

Ser

Val

Pro

Val

Leu

Glu

5 4 5

550

555

560

Gly

Glu

Lys

Phe

Asn

Met

Arg

Leu

Leu

Val

Asp

His

Ser

Ile

Val

Glu

565

570

575

Gly

Phe

Ala

Gin

Gly

Gly

Arg

Thr

Val

Val

Thr

Ser

Arg

Val

Tyr

Pro

530

585

590

A1 a

Lys

Ala

Ile

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Leu

Phe

Leu

Phe

Asn

Asn

Ala

•595

600

605

Thr

Gly

Ile

Ser

Val

Lys

Ala

Ser

Leu

Lys

Ile

Trp

Lys

Met

Lys

Glu

610

615

620

Ala

Gin

Leu

Asp

Pro

Phe

Pro

Leu

Ser

Gly

Trp

Ser

Ser

o2 5

630

63 5

PL 197 151 B1

IN FORt D- J T^Q ~ SEKWENC JI Ii nr: 3:

UJ hi. Lit Ii 1 iU JI WENCJI:

ar zasad

UH TYP: nukleoryd dna

U-U irt/uron-ua: urnowa

Ui) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: (deso = syntetyczny DNA ux) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) MIEJSCE: 1..1911 'XiO OPIS SEKWENCJI: SEQ ID nr: 3:

ATG Met

GCA Ala

AGC Ser 640

TCT Ser

ACG Thr

ACT Thr

ACA Thr

CCG Pro 645

TTG Leu

TTA Leu

CCG Pro

CAC His

CAC His 650

CAT His

TTG Leu

CAG Gin

48

AAT

CCT

CAG

CAG

TTG

GCT

GGA

AGT

CCA

GCT

GCA

CAC

AGG

TTG

AGT

CGT

96

Asn

Pro

Gin

Gin

Leu

Ala

Gly

Ser

Pro

Ala

Ala

His

Arg

Leu

Ser

Arg

6 5 5

660

665

CCT

ACT

CTT

TTG

AGT

GGT

ATA

TTG

GTA

AGT

GTA

CTG

GTC

ATC

TGC

GCA

144

Pro

Thr

Leu

Leu

Ser

Gly

Ile

Leu

Val

Ser

Val

Leu

Val

Ile

Cys

Ala

670

675

680

685

TTG

GTC

GCA

GTT

ATA

CAT

AAT

CAG

TCT

CAA

CAG

CCA

TAC

CAT

GAT

GGT

192

Ldii

Val

Ala

Val

Ile

His

Asn

Gin

Ser

Gin

Gin

Pro

Tyr

His

Asp

Gly

690

695

700

GGT

GCC

AAG

CCT

AGC

TCT

AGC

GCT

GCC

ACG

ACT

ACT

TTT

CCT

ACA

GCC

240

Gly

Ala

Lys

Pro

Ser

Ser

Ser

Ala

Ala

Thr

Thr

Thr

Phe

Pro

Thr

Ala

705

710

715

AGC

CCT

GAA

GCA

GGA

TTC

AAA

AGA

TTC

CCT

ATC

GAA

CTC

AAG

ACC

AAC

288

Sil

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Ile

Glu

Leu

Lys

Thr

Asn

720

725

730

GCA

GAA

GTC

GAG

TGG

CAG

AGA

AGT

GCA

TAC

CAC

TTC

CAG

CCA

GAT

AAG

336

Ala

Glu

Va Ι-

Glu

Trp

Gin

Arg

Ser

Ala

Tyr

His

Phe

Gin

Pro

Asp

Lys

735

740

745

AAC

TAT

ΑΤΟ

TCA

GAC

CCA

GAC

GGG

CCT

ATG

TAC

CAT

ATG

GGT

TGG

TAC

384

Asn

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr

His

Met

Gly

Trp

Tyr

7 50

755

760

765

GAC

TTA

TTC

TAC

CAA

TAT

AAT

CCA

GAG

AGT

GCA

ATA

TGG

GGA

AAT

ATA

432

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Ala

Ile

Trp

Gly

Asn

Ile

770

775

780

ACT

TGG

GGT

CAT

AGC

GTT

AGC

AAG

GAT

ATG

ATT

AAT

TGG

TTT

CAC

TTG

480

Thr

Trp

Gly

His

Se r

Val

Ser

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

His

Leu

785

790

795

CCA

TTT

GCG

ATG

GTC

CCA

GAT

CAA

TGG

TAT

GAT

ATT

GAG

GGC

GTT

ATG

528

PL 197 151 B1

Pro

Phe

Ala Met Val

Pro

Asp

Gin

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu

Gly

Val

Met

800

805

810

ACT

GGA

AGC GCA ACT

GTT

TTG

CCA

GAC

GGA

CAG

ATC

ATT

ATG

TTG

TAT

576

Thr

Gly

Ser Ala Thr

Val

Leu

Pro

Asp

Gly

Gin

Ile

Ile

Met

Leu

Tyr

815

820

825

ACC

GGT

AAT GCA TAC

GAC

TTG

AGT

CAG

TTG

CAG

TGT

CTC

GCC

TAT

GCC

624

Thr

Gly

Asn Ala Tyr

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ala

830

835

840

845

GTT

AAT

AGC AGC GAC

CCC

TTG

TTG

CTC

GAT

TGG

AAG

AAG

TAC

GAG

GGC

672

Vdl.

Asn

Ser Ser Asp

Pro

Leu

Leu

Leu

Asp

Trp

Lys

Lys

Tyr

Glu

Gly

850

855

860

AAT

CCG

ATT CTC TTT

CCG

CCT

CCT

GGC

GTC

GGA

TAT

AAA

GAT

TTC

AGA

720

Aan

Pro

Ile Leu Phe

Pro

Pro

Pro

Gly

Val

Gly

Tyr

Lys

Asp

Phe

Arg

865

870

875

G AT

CCC

AGT ACT CTC

TGG

CTC

GGT

CCA

GAC

GGA

GAG

TAC

CGT

ATG

GTC

768

Asp

Pro

Ser Thr Leu

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr

Arg

Met

Val

880

885

890

ATG

GGC

AGC AAA CAC

AAT

GAA

ACA

ATC

GGG

TGC

GCA

CTC

ATC

TAT

CAC

816

Mat

Gly

Ser Lys His

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Cys

Ala

Leu

Ile

Tyr

His

895

900

905

ACG

ACA

AAC TTC ACG

CAC

TTC

GAG

CTC

AAG

GAA

GAA

GTC

TTA

CAC

GCT

864

Thr

Thr

Asn Phe Thr

His

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

His

Ala

910

915

920

925

GTT

CCT

CAC ACA GGA

ATG

TGG

GAG

TGC

GTC

CAC

TTA

TAT

CCC

GTC

AGT

912

Vai

Pro

His Thr Gly

Met

Trp

Glu

Cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

930

935

940

ACT

ACT

CAT ACG AAT

GGC

TTG

GAT

ATG

GTC

GAC

AAT

GGT

CCC

AAC

GTC

960

Thr

Thr

His Thr Asn

Gly

Leu

Asp

Met

Val

Asp

Asn

Gly

Pro

Asn

Val

945

950

955

AAA

CAT

GTC CTC AAG

CAG

TCC

GGC

GAC

GAG

GAC

AGG

CAC

GAC

TGG

TAC

1008

Lys

His

Val Leu Lys

Gin

Ser

Gly

Asp

Glu

Asp

Arg

His

Asp

Trp

Tyr

960

965

970

GCT

TTA

GGT ACA TAT

GAC

GTC

GTC

AAC

GAC

AAA

TGG

TAT

CCC

GAC

GAT

1056

Ala

Leu

Gly Thr Tyr

Asp

Val

Val

Asn

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro

Asp

Asp

975

980

985

CCC

GAG

AAC GAC GTC

GGA

ATT

GGC

CTT

CGT

TAC

GAC

TTC

GGC

AAG

TTC

1104

Pro

Glu

Asn Asp Val

Gly

Ile

Gly

Leu

Arg

Tyr

Asp

Phe

Gly

Lys

Phe

9 90

995

1000

1005

TAC

GCC

AGT AAA 'ACA

TTC

TAC

GAT

CAG

CAC

AAA

AAA

CGT

CGT

GTT

TTA

1152

Tyr

Ala

Ser Lys Thr

Phe

Tyr

Asp

Gin

His

Lys

Lys

Arg

Arg

Val

Leu

1010

1015

1020

TGG

GGA

TAC GTC GGC

GAG

ACG

GAC

CCG

CCC

AAA

TAC

GAT

GTC

TAC

AAA

1200

Trp

Gly

Tyr Val Gly

Glu

Thr

Asp

Pro

Pro

Lys

Tyr

Asp

Val

Tyr

Lys

1025

1030

1035

GGT

TGG

GCA AAT ATC

CTC

AAC

ΑΪΑ

CCT

CGC

ACT

ATT

GTC

CTC

GAT

ACG

1248

PL 197 151 B1

G1 y

Trp

Ala Asn 1040

Ile

Leu

Asn

Ile Pro 1045

Arg

Thr

Ile

Val 1050

Leu Asp

Thr

AAC

ACA

AAC ACG

AAC

CTC

ATA

CAG TGG

CCT

ATT

GCC

GAG

GTG GAG

AAT

1296

Ly s

Thr

Asn Thr

Asn

Leu

Ile

Gin Trp

Pro

Ile

Ala

Glu

Val Glu

Asn

los;

5

1060

1065

Ϊ'1'Α

GG 1?

AGC' .‘iAC

AAA

TAC

AAC

GAG TTC

AAG

GAT

GTG

GAA

TTG AAG

CCT

1344

Leu

Arg

Ser Asn

Lys

Tyr

Asn

Glu Phe

Lys

Asp

Val

Glu

Lau Lys

Pro

107 0

107 5

1080

1085

GGA

AGT

TTG ATT

CCG

TTA

GAA

ATC GGT

ACT

GCT

ACT

CAA

CTC GAC

ATC

1392

Gly

Ser

Leu Ile

Pro

Leu

Glu

Ile Gly

Thr

Ala

Thr

Gin

Leu Asp

Ile

1090

1095

1100

ACC

GCT

ACT TTT

GAG

GTC

GAT

CAG ACC

ATG

CTC

GAG

AGT

ACC TTA

GAA

1440

Thr

Ala

Thr Phe

Glu

Val

Asp

Gin Thr

Met

Leu

Glu

Ser

Thr Leu

Glu

1105

1110

1115

GCG

GAC

GTA TTA

TTT

AAC

TGT

ACC ACA

TCC

GAG

GGG

AGC

GCA GGT

CGC

1488

Ala

Asp

Val Leu

Phe

Asn

Cys

Thr Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala Gly

Arg

1120

1125

1130

GGA

GTC

CTT GGT

CCA

TTC

GGA

CTT GTC

GTC

TTA

GCG

GAC

GCA GAA

AGA

1536

Gly

Val

Leu Gly

Pro

Phe

Gly

Leu Val

Val

Leu

Ala

Asp

Ala Glu

Arg

1135

1140

1145

AGC

GAG

CAG TTG

CCC

GTC

TAT

TTT TAC

ATT

GCC

AAG

GAC

ACC GAC

GGT

1584

Ser

Glu

Gin Leu

Pro

Val

Tyr

Phe Tyr

Ile

Ala

Lys

Asp

Thr Asp

Gly

1150

115

5

1160

1165

TCC

ACC

AAG ACA

TAC

TTC

TGC

GCA GAT

GAG

TCC

CGC

AGC

AGC AAC

GAC

1632

Ser

Ser

Lys Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Ser Asn

Asp

1170

1175

1180

GTC

CAT

ATC GGC

AAG

TGG

GTC

TAT GGT

TCG

TCA

GTC

CCA

GTG TTG

GAG

1680

Val

Asp

Ile Gly

Lys

T r ρ

Val

Tyr Gly

Ser

Ser

Val

Pro

Val Leu

Glu

1185 1190 1195

GGA GAG AAA TTT AAC ATG CGC CTG CTT GTC GAC CAC AGC ATC GTC GAA 1728

Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu

1200 1205 1210 ^rl’TC GCT CAG GGT CCC CGT ACT GTC GTA ACC AGT CGT GTC TAC CCT 1776

Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro

1215 1220 1225

GCT AAA GCC ΑΤΑ TAT GGG GCA GCC AAA CTC TTC CTC TTT AAT AAT GCC 1824

Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala

1230 1235 1240 1245

ACA. GGC ATA TCA GTC AAA GCC AGC Thr Gly Ile Ser Val Lys Ala Ser

1250

TTA AAA ATT TGG AAA ATG Leu Lys Ile Trp Lys Met

1255

AAA GAG Lys Glu 1260

1872

PL 197 151 B1

GCT CAG	TTG	GAC CCG	TTT	CCA TTA AGC	GGC	TGG	TCT	AGC	1911
Aid Gin	Leu	Asp Pro	Phe	Pro Leu Ser	Gly	Trp	Ser	Ser
	EDI	YORMACJ.	A 0	SEKWENCJI	ID	nr :	4 :

j CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Aj DŁUGOŚĆ: 637 amino acids (B) T YP: am i no k wa s (Dj TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

	(xi	) OPIS	SEKWENCJI	ID:	nr 2:
v x 11 0 PIS	SEKWENCJI:	SEQ ID nr	: 4
Mer Ala Ser Ser 1	Thr 5	Thr Thr	Pro Leu Leu 10	Pro	His His His Leu Gin 15
Asn Pro Gin Gin 20	Leu	Ala Gly	Ser Pro Ala 25	Ala	His Arg Leu Ser Arg 30
Pro Thr Leu Leu 35	Ser	Gly Ile	Leu Val Ser 40	Val	Leu Val Ile Cys Ala 45
Leu Val Ala Val 50	Ile	His Asn 55	Gin Ser Gin	Gin	Pro Tyr His Asp Gly 60
Gly Ala Lys Pro 5 5	Ser	Sar Ser 70	Ala Ala Thr	Thr 75	Thr Phe Pro Thr Ala 80
Sar Pro Glu Ala	Gly 85	Leu Lys	Arg Phe Pro 90	Ile	Glu Leu Lys Thr Asn 95
Ala Glu Val Glu 100	Trp	Gin Arg	Ser Ala Tyr 105	His	Phe Gin Pro Asp Lys 110
Asn Tyr Ile Ser 115	Asp	Pro Asp	Gly Pro Met 120	Tyr	His Met Gly Trp Tyr 12 5
His Leu Phe Tyr 13 0	Gin	Tyr Asn 135	Pro Glu Ser	Ala	Ile Trp Gly Asn Ile 140
Thr Trp Gly His 145	Ser	Vai Ser 15 0	Lys Asp Met	Ile 155	Asn Trp Phe His Leu 160
Pro Phe Ala Met	Val 165	Pro Asp	Gin Trp Tyr 170	Asp	Ile Glu Gly Val Met 175
Thr Gly Ser Ala 180	Thr	Val Leu	Pro Asp Gly 185	Gin	Ile Ile Met Leu Tyr 190
Thr Gly Asn Ala 195	Tyr	Asp Leu	Ser Gin Leu 200	Gin	Cys Leu Ala Tyr Ala 205
Val. Asn Ser Ser 210	Asp	Pro Leu 215	Leu Leu Asp	Trp	Lys Lys Tyr Glu Gly 220

PL 197 151 B1

Asn 225

Pro

Ile

Leu

Phe

Pro 230

Pro

Pro

Gly

Val

Gly 235

Tyr

Lys

Asp

Phe

Arg 240

Asp

Pro

Ser

Thr

Leu

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr

Arg

Met

Val

245

250

255

Met

Gly

Ser

Lys

His

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Cys

Ala

Leu

I le

Tyr

His

260

265

270

Thr

Thr

Asn

Phe

Thr

His

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Glu

Val

Leu

His

Ala

275

280

285

Val

Pro

His

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

290

295

300

Thr

Thr

His

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Met

Val

Asp

Asn

Gly

Pro

Asn

Val

305

310

315

320

Lys

His

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Gly

Asp

Glu

Asp

Arg

His

Asp

Trp

Tyr

325

330

335

Ala

Leu

Gly

Thr

Tyr

Asp

Val

Val

Asn

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro

Asp

Asp

340

345

350

Pro

Glu

Asn

Asp

Val

Gly

Ile

Gly

Leu

Arg

Tyr

Asp

Phe

Gly

Lys

Phe

355

360

36S

Tyr

Ala

Ser

Lys

Thr

Phe

Tyr

Asp

Gin

His

Lys

Lys

Arg

Arg

Val

Leu

370

375

380

Trp

Gly

Tyr

Val

Gly

Glu

Thr

Asp

Pro

Pro

Lys

Tyr

Asp

Val

Tyr

Lys

385

390

395

400

Gly

Trp

Ala

Asn

Ile

Leu

Asn

Ile

Pro

Arg

Thr

Ile

Val

Leu

Asp

Thr

405

410

415

Lys

Thr

Asn

Thr

Asn

Leu

Ile

Gin

Trp

Pro

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

420

425

430

Leu

Arg

Ser

Asn

Lys

Tyr

Asn

Glu

Phe

Lys

Asp

Val

Glu

Leu

Lys

Pro

435

440

445

Gly

Ser

Leu

Ile

Pro

Leu

Glu

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Gin

Leu

Asp

Ile

450

455

460

Thr

Ala

Thr

Phe

Glu

Val

Asp

Gin

Thr

Met

Leu

Glu

Ser

Thr

Leu

Glu

465

470

475

480

Ala

Asp

Val

Leu

Phe

Asn

Cys

Thr

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser

Ala

Gly

Arg

485

490

495

Gly

Val

Leu

Gly

Pro

Phe

Gly

Leu

Val

Val

Leu

Ala

Asp

Ala

Glu

Arg

500

505

510

Ser

Glu

Gin

Leu

Pro

Val

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Ala

Lys

Asp

Thr

Asp

Gly

515

520

525

Ser

Ser

Lys

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Ser

Asn

Asp

530 535 540

PL 197 151 B1

V'a.l 54 5

Asp

Ile

Gly

Lys

Trp 5 5 0

Val

Tyr

Gly

Ser

Ser 555

Val

Pro

Val

Leu

Glu 5 60

Gly

Glu

Lys

Phe

Asn 5 6 5

Met

Arg

Leu

Leu

Val 570

Asp

His

Ser

Ile

Val 57 5

Glu

Gly

Phe

Ale

Gin 580

Gly

Gly

Arg

Thr

Val 585

Val

Thr

Ser

Arg

Val 590

Tyr

Pro

A1ł

Lys

Alu 59 5

He

Tyr

G ly

Ala

Ala 600

Lys

Leu

Phe

Leu

Phe 605

Asn

Asn

Ala

Thr

G 1 y 610

Ile

Ser

Val

Lys

Ala 615

Ser

Leu

Lys

Ile

Trp 620

Lys

Met

Lys

Glu

-4 .i Gi, 62 6

G In

Lau

Asp

Pro

Phe 6 3 0

Pro

Leu

Ser

dy

Trp 635

Ser

Ser

Zastrzeżenia patentowe

Claims (20)

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ż e koduje zależną od sacharozy fruktozylotransferazę sacharozy (SST) wybraną z grupy obejmującej:

(a) cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko obejmujące sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną na SEQ ID nr 2 i SEQ ID nr 4;

(b) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 1 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową;

(c) cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję nukleotydową przedstawioną na SEQ ID nr 3 lub odpowiadającą jej sekwencję rybonukleotydową; i (d) cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające fragment cząsteczek kwasu nukleinowego wspomnianych w punktach (a) do (c) kodujące białko zdolne do katalizowania wiązania β-2,1-glikozydowego lub e-2,6-glikozydowego pomiędzy jednostkami fruktozy.

2. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę DNA.

3. Cząsteczka według zastrz. 2, znamienna tym, że cząsteczkę DNA stanowi cząsteczka cDNA.

4. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę RNA.

5. Wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 do 4.

6. Wektor według zastrz. 5, znamienny tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z elementami regulatorowymi pozwalającymi na transkrypcję i syntezę podlegającego translacji RNA w komórkach prokariotycznych i/lub eukariotycznych.

7. Wektor według zastrz. 6, znamienny tym, że elementy regulatorowe pochodzą z promotora patatyny B33.

8. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wprowadzoną przez transformację cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 do 4 lub wektor jak określono w zastrz. 6 do 7.

9. Sposób wytwarzania SST, znamienny tym, że komórkę gospodarza jak określono w zastrz. 8, hoduje się w warunkach pozwalających na syntezę SST i izoluje się SST z hodowanych komórek i/lub pożywki hodowlanej.

10. SST, znamienna tym, że kodowana jest przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 do 4.

11. Komórka rośliny transgenicznej, znamienna tym, że zawiera wprowadzoną przez transformację cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 1 do 4 lub wektor jak określono w zastrz. 6 do 7, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca SST z karczocha jest kontrolowana

PL 197 151 B1 przez elementy regulujące pozwalające na transkrypcję dającego się odczytać w procesie translacji mRNA w komórkach rośliny.

12. Roślina, znamienna tym, że zawiera komórki rośliny jak określono w zastrz. 11.

13. Roślina według zastrz. 12, znamienna tym, że stanowi roślinę użytkową.

14. Roślina według zastrz. 13, znamienna tym, że stanowi roślinę magazynującą sacharozę lub skrobię.

15. Roślina według zastrz. 14, znamienna tym, że stanowi roślinę ziemniaka.

16. Materiał propagacyjny rośliny jak określono w zastrz. 12 do 15, znamienny tym, że zawiera komórki roślin jak określono w zastrz. 11.

17. Produkty zbierane z rośliny jak określono w zastrz. 12 do 15, znamienne tym, że zawierają komórki rośliny jak określono w zastrz. 11.

18. Sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, znamienny tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza jak określono w zastrz. 8 lub komórki rośliny jak określono w zastrz. 11 w warunkach pozwalają cych na wytwarzanie SST i konwersję , jeż eli to konieczne, podanej z zewnątrz sacharozy lub równoważnego substratu do 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy; i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę wytwarzane tą drogą z hodowanych komórek lub z pożywki.

19. Sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, znamienny tym, że:

(a) kontaktuje się sacharozę lub równoważny substrat z SST jak określono w zastrz. 10 w warunkach pozwalających na konwersję do 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę w ten sposób wytwarzane.

20. Sposób wytwarzania 1-kestozy, nystozy i fruktozylonystozy, znamienny tym, że:

(a) hoduje się roślinę jak określono w zastrz. 12 do 15; i (b) otrzymuje się 1-kestozę, nystozę i fruktozylonystozę z tej rośliny lub jej materiału propagacyjnego jak określono w zastrz. 16 lub produktów zbiorów jak określono w zastrz. 17.