JPH08507918A - 修飾されたフラクタン・パターンを示すトランスジェニック植物を得る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ａ）植物内で活性なプロモーター配列および植物内で活性なターミネーター配列に作動可能に連結した１もしくはそれを超えるフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、またはその修飾バージョン；ｂ）該構築物で植物細胞を形質転換し；次いで、ｃ）該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させる工程よりなる、非形質転換植物に比して修飾されたフラクタン・パターンを示すトランスジェニック植物を得る方法に関する。好ましくは、該フラクトシルトランスフェラーゼの５’非翻訳領域は、該フラクトシルトランスフェラーゼの発現に負に影響しないように修飾されている。好ましくは、該ＤＮＡ構築物は、さらに、フラクトシルトランスフェラーゼを特異的な植物組織または植物細胞区分に向けるための、フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子から上流にある標的配列からもなる。該トランスジェニック植物において産生させた該フラクトシルトランスフェラーゼは、植物のフラクタン・パターンを変化させ、かくして、改変されたシンクーソース関係および収率による異なった植物性能、または乾燥抵抗性、冷温抵抗性もしくは他のストレス抵抗性の向上、乾燥物質含量の上昇、良好な味覚または貯蔵性、栄養価の改善に通じる。該植物は、フラクタン製造のための原料としても用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾されたフラクタン・パターンを示すトランスジェニック植物を得る方法 本発明は、非-形質転換植物に比して修飾されたフラクタン・パターンを示す トランスジェニック植物を得る方法、該トランスジェニック植物または植物組織 を作出するためのＤＮＡ構築物、非-形質転換植物に比して修飾されたフラクタ ン・パターンを示すトランスジェニック植物または植物組織、該植物および植物 組織から単離されるフラクタン、種々の適用のための該トランスジェニック植物 、組織およびフラクタンの使用、ならびにトランスジェニック種子に関する。 植物は、食物的および非-食物的な適用に有用な数多くの炭水化物を産生する 。かかる炭水化物の重要な例は、デンプン、セルロースおよびスクロースである 。食物用および産業用の目的のために、これらの化合物は、そのままもしくは修 飾された形態のいずれかで人類により用いられている。これらの炭水化物を産生 する穀物種は、伝統的な植物育種方法によって得られている。上記したよく知ら れている炭水化物に次いで、人類に有用な特性を有する他の植物炭水化物も植物 には存在し得る。 植物炭水化物は、植物体に対するそれらの機能に応じて２つの群に分けること ができる。第一の群は、通常、細胞外マトリックスの一部分である構造炭水化物 よりなる。この群において最も多量に存在するメンバーはセルロースである。第 二の群は、長期または短期の（一時的）炭水化物貯蔵として作用し得る非-構造 貯蔵炭水化物である。かかる炭水化物の例は、デンプン、スクロースおよびフラ クタンである。 フラクタンは、その大部分が繰り返しフラクトース単位からなるポリマーであ る。フラクタンは、その大部分が経済的な農業実践には適用されていない植物種 に見い出されている。フラクタンは、（特に、ポアセア（Poaceae）、リリアセ ア（Liliaceae）のごとき）単子葉植物および（特に、コンポジタ（Compositae ）のごとき）双子葉植物で生成する（ポロック（Pollock）およびカーンズ（Cai rns）、 １９９１年、アニュアル・レビュー・イン・プラント・フィジオロジー・プラント・モ レキュラー・バイオロジー（Ann．Rev．Plant Phisiol．Plant Mol．Biol.）第４ ２巻、７７-１０１頁；ヘンドリー（Hendry）１９８７年、ニュー・ファイトロ ジスト（New Phytol.）第１０６巻、２０１-２１６頁）。 植物炭水化物貯蔵としてのその役割に次いで、フラクタンに関する他の機能も 提案されている。これらの機能には、例えば、乾燥および冷温気候（冷寒誘導性 の乾燥）に対する抵抗性が含まれる（ポンティス（Pontis）１９８９年、ジャー ナル・オブ・プラント・フィジオロジー（J．Plant Physiol.）第１３４巻、１４８ -１５０頁；ゴンザレス（Gonzales）ら、１９９０年、ニュー・ファイトロジス ト（New Phytol.）第１１５巻、３１９-３２３頁）。 しかしながら、植物により産生されるフラクタンは、通常、限定された機能性 しか有しない。これらの理由により、フラクタンは、特に、他の炭水化物に比し て、膨大な商業的潜在性が認められているにも拘わらず、食物および非-食物生 成物における大きな適用が現在のところ未だ発見されていない（フッチ（Fuchs ）１９９１年、バイオケミカル・ソサイエティー・トランザクションズ（Bioche m．Soc．Transact.）第１９巻、５５５-５６０頁、エイ、フッチ（A．Fuchs）編 、「イヌリンおよびイヌリン-含有穀物（Inulin and Inulin-containing Crops ）」、エルセビエ社（Elsevier）、１９９３年）。 植物フラクタンの有用性を限定する主な問題の一つは、実質的なレベルのフラ クタンを蓄積する植物種の範囲が限定されていることである。数多くの現在重要 な穀物植物において、その中のテンサイおよびジャガイモは、フラクタンが存在 しないか、もしくは見い出されても非常に低レベルである。ある程度のフラクタ ンを貯蔵している植物は、しばしば、望ましくない農地制御学的な特性を有する 。かかる植物の一例は、ヘリアンタス・チューベロサス（Helianthus tuberosus ）である。 もう一つの問題は、産生されるフラクタンの機能性が限定されることである。 該機能性は、植物においては、とりわけ、１００のモノサッカライドのいわゆる 「重合度」（ＤＰ）を超えるのは稀であるフラクタン鎖長により決定される。通 常 は非常に小さなフラクタンが見い出されるが、しばしば、収穫前または収穫およ び/または貯蔵後に、これらフラクタンのＤＰが劇的に減少する。低いＤＰは、 続く工程におけるフラクタンの有用性を厳しく限定し、その結果収率が減少する こともある。 今回、適当な宿主植物においてフラクタンを発現させるために、ある種の植物 が形質転換できることが判明した。 かくして、本発明は、 ａ）植物内で活性なプロモーター配列および植物内で活性なターミネーター配 列に作動可能に連結した１またはそれを超えるフラクトシルトランスフェラーゼ 遺伝子またはその修飾バージョンよりなるＤＮＡ構築物を調製し； ｂ）該構築物で植物細胞を形質転換し；次いで、 ｃ）該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させる工程よりな る、非-形質転換植物に比して修飾されたフラクタン・パターンを示すトランス ジェニック植物を得る方法を提供する。 フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、フラクトース-フラクトース結合 の生成を触媒する酵素をコードする遺伝子である。国際特許出願ＷＯ８９/１２ ３８６号においては、植物細胞の可溶性固形物組成を修飾するために、例えば、 種々のスクラーゼのごとき炭水化物を重合できる酵素をコードする外来遺伝子よ りなるトランスジェニック植物を作出することが提案されている。ＷＯ８９/１ ２３８６号は、とりわけデキストラン・スクラーゼの使用を開示している。この 酵素は、グルコース単位の重合に重合源としてスクロースを用いる。しかしなが ら、本発明は、フラクトース単位の重合に関する。 本発明者らは、フレームＡＴＧコドン外の遺伝子がイニシエーターＡＴＧコド ンの前にある、フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ＳａｃＢの５'側の微生 物非翻訳領域の存在によって、許容できる該遺伝子の発現レベルが得られないこ とを発見した。かくして、本発明のもう一つの態様によれば、フラクトシルトラ ンスフェラーゼ遺伝子の５'側非翻訳領域の適当な修飾によって植物細胞におけ るフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現レベルが上昇することが見い出 された。適当な修飾は、それによってフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の 発現レベルが負に影響されないいずれかの修飾よりなる。実際には、このことは 、発現レベルに負に影響するいずれの配列も除去されるべきことを意味する。好 ましくは、ＡＴＧコドンまでの５'側非翻訳領域を該微生物遺伝子から完全に除 去する。 「フラクタン・パターン」なる語は、サイトゾル、液胞、アポプラスト等のご とき異なった植物組織および植物細胞区分でのフラクタンの分布を意味する。幾 つかの植物が天然にフラクタンを産生する一方、その他のものは産生しない。非 -形質転換植物においてフラクタンを産生しない植物種のフラクタン・パターン は、フラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入により変化させ ることができる。植物における該フラクタン分布は、また、植物または植物細胞 区分における代謝フローをある種の植物または植物細胞区分に再方向付けするこ とによっても変化させることができる。 フラクトシルトランスフェラーゼの基質であるスクロースは、幾つかの異なっ た部位で見い出される炭水化物である。それは、細胞質で合成され、サイトゾル 、液胞および細胞外間隙（アポプラスト）において多量に見い出される。 植物細胞における生化学的過程も、しばしば単一もしくは少数の細胞性区分に 限定されるため、特定の区分に新たに導入した遺伝子の生成物の蓄積を促進する のが望ましい。したがって、細胞区分に特異的な標的配列は、トランスジェニッ ク植物で発現されるフラクトシルトランスフェラーゼ上に存在しなければならな い。異なった細胞部位を標的化するための特異的アミノ酸領域が同定され、分析 されている。キメラ遺伝子の発現により蛋白質が産生され、そこにおいて標的情 報が認識され、目的の細胞部位を正確に標的化するための細胞により用いられる 様に、これらの標的化領域をコードするＤＮＡ配列を目的の遺伝子に結合させる ことができる（オークス（Oakes）ら、欧州特許第０４８６６８３号、ＷＯ９１/ １９８０８号、シモンズ（Symons）ら、バイオ/テクノロジー（Bio/Technology ）第８巻、２１７-２２１頁（１９９０年）、ペン，ジェイ（Pen J.）ら、バイ オ/テクノロジー（Bio/Technology）第１０巻、２９２-２９６頁（１９９２年） ）。 したがって、本発明の好ましい具体例において、発現カセットは、フラクトシ ルトランスフェラーゼを１またはそれを超える特定の植物または植物細胞区分に フラクトシルトランスフェラーゼを向けるための標的化配列からもなる。該標的 化領域は、１またはそれを超えるこれら特定の植物または植物細胞区分にフラク トシルトランスフェラーゼを向ける能力を有するいずれのＤＮＡ配列であっても よい。好ましい標的化領域の例としては、カルボキシペプチダーゼＹ（ｃｐｙ） 遺伝子のシグナル配列および液胞標的化配列、または病原菌関連蛋白質（ＰＲ- 蛋白質）Ｓ遺伝子（ｐｒ-ｓ）のシグナル配列およびアポプラスト標的化配列で ある。該標的化配列を該ＤＮＡ構築物に付加することにより、本発明は、フラク トシルトランスフェラーゼを１またはそれを超える特定の細胞区画に向けること ができ、かくして所望のフラクタン・パターンが植物または植物細胞中に誘導さ れるトランスジェニック植物を作出する方法を提供する。 しばしば、導入遺伝子の発現の部位のみならず時期も制御することが植物に有 利である。例えば、新たに導入した酵素活性の発現が、例えば、塊茎、果実また は種子のごとき植物の特定の部位に限定された方が通常は望ましい。さらに、し ばしば、これら器官における発現が特定の生育段階で開始された方が望ましい。 このことは、導入遺伝子の発現がかかる器官の正常な生育を妨げる場合に確実で ある。 本発明のフラクトシルトランスフェラーゼは、基質としてスクロースを用いて 高分子量のフラクタンを合成する。数多くの微生物が、スクロースから（しばし ば、レバン（levan）とも呼ばれる）フラクタンを生成する能力を有するフラク トシルトランスフェラーゼを含有している（エイ、フッチ（A．Fuchs）１９５９ 年、レイデン大学学位論文（Thesis，University of Leiden）、ハン（Han）１ ９８９年、アドバンシーズ・イン・アプライド・マイクロバイオロジー（Adv．Appl ．Micro-biol.）第３５巻、１７１-１９４頁）。これらの酵素は、フラクトース 基をスクロースからフラクタン受容分子に移行させて、高分子量のフラクタンを 生成することができる。これらのフラクタン受容分子は、元来スクロース由来で あるため、それらはなお末端グルコース分子を含有できる。その反応機構は以下 の通りである （ハン（Han）１９８９年、アドバンシーズ・イン・アプライド・マイクロバイ オロジー（Adv．Appl．Microbiol.）第３５巻、１７１-１９４頁参照）： Ｇ-Ｆ＝スクロース、Ｇ＝グルコース、Ｆ＝フラクトース フラクトース単位を相互に結合するグリコシド結合は、個々のフラクトシルト ランスフェラーゼに依存して、(２-１)-または(２-６)-型となり得る。微生物に おいては、両結合型は単一の分子で見い出すことができる。フラクタン分子の機 能性は、骨格の型（(２-１)-または(２-６)-）ならびに分岐度および重合度に依 存する。 細菌、酵母、菌類等のごとき数多くの微生物が、スクロースから高ＤＰのフラ クタンを合成できるフラクトシルトランスフェラーゼを含有する。通常、該フラ クタンは細胞外に沈殿する。 フラクトシルトランスフェラーゼ産生菌の２つの例は、バチルス・ズブチリス （Bacillus subtilis）（スタインメッツ（Steinmetz）ら、１９８５年、モレキ ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol．Gen．Genet.）第２００巻、 ２２０-２２９頁）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mu tans ）である（シローザ（Shiroza）およびクラミツ（Kuramitsu）１９８８年、 ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J．Bacterol.）第１７０巻、８１０-８ １６頁）。ビィ・ズブチリス（B.subtilis）においては、ＳａｃＢ遺伝子がレバ ンスクラーゼ、すなわちフラクトシルトランスフェラーゼについての構造遺伝子 をコードしている。この酵素は、スクロースを、容易に１００００を超え得るＤ Ｐを有するフラクトースポリマーに変換できる。レバンスクラーゼにより生成し たこのフラクタンに見い出される結合型は、主にかなり(２-１)-分岐を有する( ２-６)-型である。 もう一種の微生物であるエス・ミュータンス（S.mutans）においては、非常に 高ＤＰのフラクタンをも生成できるフラクトシルトランスフェラーゼをｆｔｆ遺 伝子がコードしている。このフラクタンにおけるフラクトース単位は、主に(２- ６)-分岐を有する(２-１)-結合型である（ロゼール（Rosell）およびバークヘ ド（Birkhed）１９７４年、アクタ・ケミカ・スカンジナビカ（Acta Chem．Scand. ）Ｂ２８巻、５８９頁）。 細菌のフラクトシルトランスフェラーゼは、スクロースに対して比較的低いＫ ｍ、すなわちおよそ２０ｍＭを有する。大部分の植物中のスクロース濃度はかな り高く、それゆえこれらの酵素は植物中で活性を有するはずである。細菌フラク トシルトランスフェラーゼのもう一つの重要な特性は、０℃までの低温にてレバ ンを合成できるその能力である（タナカ（Tanaka）ら、１９７８年、アグリカル チャー・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agric．Biol．Chem.）第４２巻 、３２３-３２６頁）。植物はしばしばかかる温度に遭遇するが、かかる状況に おいてもこれらの酵素はなお活性であろう。 好ましい構造フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、種々の使用に対して 、ポリマーの重合度および該フラクタンの分岐度の要件に大いに依存する。 本発明は、微生物のフラクトシルトランスフェラーゼに限定するものではなく 、植物または他の原核生物もしくは真核性物源から由来するフラクトシルトラン スフェラーゼを用いることもできる。 植物において、フラクタンの生合成および生分解は、特にヘリアンタス・チュ ーベローサス（Helianthus tuberosus）および幾つかのイネ科植物において研究 されている（ポロック（Pollock）およびカーンズ（Cairns）１９９１年、アニ ュアル・レビュー・イン・プラント・フィジオロジー・プラント・モレキュラー・バイ オロジー（Ann．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol.）第４２巻、７７-１０ １頁；ポロク（Pollock）１９８６年、ニュー・ファイトロジスト（New Phytol. ）第１０４巻、１-２４頁）。異なった植物ファミリーにおいては、異なったフ ラクタン型、すなわちフラクトース分子間の２-１および２-６グリコシド結合を 有する線状または分岐状のものが合成される。植物においては、フラクタンは液 胞にて貯蔵される。フラクタン生合成のための基質はスクロースであるが、細菌 の酵素での場合よりもスクロースに対するこれら酵素のアフィニティーは低い（ 約Ｋｍ１００）。フラクタン代謝に関与する植物酵素は、非常に冷温抵抗性であ り（ポンティス（Pontis）１９８９年、ジャーナル・オブ・プラント・フィジオロ ジー （J．Plant．Physiol.）第１３４巻、１４８-１５０頁；ゴンザレス（Gonzales ）ら、１９９０年、ニュー・ファイトロジスト（New Phytol.）第１１５巻、３ １９-３２３頁）、それゆえ、特定の適用には非常に有用となり得る。 ほぼ全ての植物は、サイトゾルで起こるスクロース合成能を有する。スクロー スは主要な炭水化物転流糖であって、それは、脈管系を介してソース（source） （正味炭水化物輸出組織）からシンク（sink）（正味炭水化物輸入組織）へと運 搬される。この運搬には、しばしば、細胞外間隙、すなわちアポプラストを通し てのスクロースの運搬が含まれる。さらに、スクロースは、また、炭水化物貯蔵 のために植物により用いられることもある。後者の場合においては、それは、例 えば、テンサイ植物の根茎のごとく、通常は植物細胞の液胞中に蓄積する。結論 としては、スクロースが植物において見い出される２つの重要な細胞部位：サイ トゾルおよび液胞がある。加えて、多くの植物の細胞外間隙（アポプラスト）に も実質量のスクロースが存在する。 好ましい標的化領域は、基質が利用可能な区画である各々サイトゾルおよびア ポプラストにフラクトシルトランスフェラーゼを標的化する。例えば、フラクタ ンの高蓄積に関しては、液胞が好ましい区画である。他の目的（例えば、乾燥抵 抗性および冷温抵抗性）に関しては、サイトゾルまたはアポプラストにフラクタ ンが蓄積するのが望ましい。 特に、多くの植物の液胞におけるスクロースの蓄積は、微生物または植物酵素 によるフラクタン生合成の誘導にこの細胞局在を理想的に適合させる。 従って、本発明の好ましい具体例は、トランスジェニック植物において微生物 、植物または他のフラクトシルトランスフェラーゼを液胞発現させるための方法 を提供する。この方法には、植物特異的発現シグナル、液胞局在化シグナルおよ び微生物、植物または他のフラクトシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ 配列の融合物が含まれる。 スクロースが利用可能な２つの他の区画、すなわちサイトゾルおよびアポプラ ストも、フラクタン蓄積の重要な部位となり得る。これは、微生物、植物または 他のフラクトシルトランスフェラーゼをサイトゾルまたはアポプラストへ向ける ことによって達成できる。サイトゾル発現には、細胞経路情報は必要でなく；成 熟酵素の発現で十分である。フラクトシルトランスフェラーゼのアポプラスト発 現には、該酵素をアポプラストに標的化する酵素に標的化領域が付加されなけれ ばならない。 修飾フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の植物における発現には、ＤＮＡ 構築物にプロモーター・シグナルが付加されなければならない。かかる発現プロ モーターは、ある種の細胞型に特異的としたり、または広範囲の細胞型で活性と することができる。加えて、発現の時期は、例えば、生育段階特異性プロモータ ーの使用により決定できる。植物における遺伝子発現に汎用されている１つのプ ロモーターは、植物の生育段階と独立して、植物の多くの細胞型において活性で ある３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス・プロモーターである。 好ましいプロモーターは、標的の植物または対象に依存して強力であったり脆 弱であったりする、組織-特異的もしくは構成的プロモーターである。貯蔵器官 でのフラクタン産生については、好ましいプロモーターは、強力なシンク-特異 的プロモーターであろう。 転写レベルをさらに改善するために、しばしば該プロモーターを修飾して二重 のエンハンサーを含有させる。 ｍＲＮＡの翻訳は、転写された５'側非翻訳領域に存在させなければならない アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４翻訳エンハンサー・シグナルのごとき 、翻訳エンハンサーを付加することによって改善できる。 翻訳の適当な終止には、植物特異的ターミネーター配列を構築物に付加しなけ ればならない。かかる配列の一例は、ノパリンシンターゼ遺伝子の終止配列であ る。 本発明は、天然のフラクトシルトランスフェラーゼに限定するものではなく、 その修飾バージョンを用いても同等に良好に行うことができる。例えば、産生さ れるフラクタンの重合度または構造を改変させるなどして、修飾はフラクトシル トランスフェラーゼの活性に影響を与えることができる。 前記の原理を用いたトランスジェニック植物におけるフラクタンの蓄積誘導に より、フラクタン産生の目的ためにこれらの植物からフラクタンを抽出すること ができるであろう。フラクタンは、これら植物の例えば、根茎、ビート（beet） 、葉、茎、塊茎、果実および種子のごとき収穫可能な器官に蓄積させることがで きる。 前記したフラクトシルトランスフェラーゼをコードする構築物を導入した遺伝 子的に修飾した穀物植物により、人類にとって有用な高品質の炭水化物ポリマー を十分に産生できるであろう。 本発明は、フラクタンを産生し蓄積できるようにする新規な生合成能を有する 植物を得る方法を提供する。かかる植物は、改変されたシンク-ソース関係およ び収率につき性質が改善されているか、または非生物的および生物的ストレス下 での生産力が改善される。かかるストレスには、限定するものではないが、乾燥 、光、温度、病害および害虫が含まれる。正常またはストレス条件下での改善さ れた生産力には、限定するものではないが、高い乾燥物含量、良質な味覚または 貯蔵性、改善された栄養価等が含まれる。かかる植物は、フラクタン産生のため の原料として適当に用いることができる。 本発明によれば、単一のフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子または原核生 物もしくは真核生物起源のフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の組合せを用 いることができる。これらの遺伝子は、広範なフラクタンの生合成のための酵素 をコードし得る。 さらに本発明は、トランスジェニック植物のさらなる世代の連続産生に有用な 該植物の種子、挿木、塊茎、球根または他の部位にも関する。 本発明のトランスジェニック植物を用いて産生させたフラクタンは、種々の食 物および非-食物適用に用いることができる。その例には、限定するものではな いが、そのままの形態または修飾形態のフラクトース・シロップの製造、化学お よびプラスチックの製造におけるヒトおよび動物の、食物製品が含まれる。 添付した図面において本発明を説明するが、図面中、 図１は構築物の概要図であり； 図２はプラスミドｐＰＡ２およびｐＰＢ１の構築物を示す図であり； 図３はバイナリーベクター（ｐＫＰ）中の３５Ｓ-ｃｐｙ-ｓａｃＢ-ＮＯＳの 構 築物を示す図であり； 図４はバイナリーベクター（ｐＴＰ）中の３５Ｓ-ｃｐｙ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構 築物を示す図であり； 図５はバイナリーベクター（ｐＫＰ）中の３５Ｓ-ｐｒ-ｓ-ｓａｃＢ-ＮＯＳの 構築物を示す図であり； 図６はバイナリーベクター（ｐＴＴ）中の３５Ｓ-ｐｒ-ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構 築物を示す図であり； 図７はバイナリーベクター（ｐＫＺ）中の３５Ｓ-ｓａｃＢ-ＮＯＳの構築物を 示す図であり； 図８はバイナリーベクター（ｐＴＺ）中の３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構築物を示 す図であって； 図９はトランスジェニックＫＰタバコ植物から単離したフラクタンの部分酸加 水分解物一例の図である。この部分酸加水分解パターンは、バチルス・ズブチリ ス（Bacillus subtilis）により産生されたフラクタンのものと同一である（図 中、Ｆはフラクトース、Ｓはスクロース（二糖）、Ｉは１-ケストース（三糖） 、ＤＰ４、ＤＰ５およびＤＰ６は、各々、四糖、五糖および六糖であり、Ｈはス タンダードとして用いたヘリアンタス・チューベローサス（Helianthus tuberos us ）の塊茎抽出物である）。 本発明を以下の実施例で説明するが、決して本発明の範囲を限定するものでは ない。 実施例１． 液胞におけるｓａｃＢ遺伝子の発現 １．用いるべき遺伝子の選択 フラクタン-産生トランスジェニック植物を作出するために、フラクタンを生 成できる蛋白質をコードする遺伝子を選択した。これらの遺伝子の１つであり、 バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）のｓａｃＢ遺伝子によりコードさ れている（スタインメッツ，エム（Steinmetz，M.）ら、モレキュラー・アンド ・ジェネラル・ジェネティクス（Mol．Gen．Genet.）第２００巻：２２０-２２ ８頁 （１９８５年））レバンスクラーゼを用いた。この酵素は、スクロース存在下で 主に(２-６)-結合型の分岐したフラクタンを生成する。 植物細胞におけるスクロースは液胞に蓄積し得るため、そこはフラクタン産生 に好ましい部位である。該レバンスクラーゼを該液胞に向けるために、カルボキ シペプチダーゼＹの標的化部位（ボールス，エル・エイ（Valls，L.A.）ら、セ ル（Cell）第４８巻、８８７-８９７頁（１９８７年））を選択した。 ２．バイナリー・ベクター（ｐＫＰ）における３５Ｓ-ｃｐｙ-ｓａｃＢ-ＮＯ Ｓの構築 プラスミドｐＬＳ３０２は、スタインメッツ，エム（Steinmetz，M.）ら、前 掲によって記載されている。該レバンスクラーゼ（ｓａｃＢ）遺伝子を、BamHＩ およびＰstＩ断片として、このプラスミドから、対応するＢamＨＩおよびＰstＩ サイトにおいてｐＥＭＢＬ９のマルチクローニングサイト（デント，エル（Dent e，L.）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）第１１ 巻、１６４５-１６５５頁（１９８３年））にクローン化し、プラスミドｐＫＡ １６を得た。一般的なＤＮＡクローニングの方法学については、記載されている （サムブルック，ジェイ（Sambrook，J.）ら、コールド・スプリング・ハーバー 、ニュー・ヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー研究所（１９８９年）） 。 レバンスクラーゼ遺伝子の成熟プロセシングサイト（スタインメッツ，エム（ Steinmetz，M.）ら、前掲）のヌクレオチド位置５５０番付近にＮcoＩサイトを 作製するために、クレーマー，ダブリュ（Kramer，W.）らにより記載されている 部位特異的突然変異（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res. ）第１２巻、９４４１-９４５６頁（１９８４年））を以下のオリゴヌクレオチ ド： で行い、プラスミドｐＫＤ２２を得た。 それによって、成熟プロセシングサイト（ヌクレオチド位置５４４番）に対し てアミノ酸位置-２番において、フェニルアラニンがメチオニンに変化した。成 熟レバンスクラーゼ蛋白質をコードする配列がその中に存在するＮcoＩ-ＰstＩ 断片をさらなるクローニングに用いた。 カルボキシペプチダーゼＹ（ｃｐｙ）遺伝子を含むプラスミドｐＴＳ３は、ボ ールス，エル・エイ（Valls，L．A.）ら、前掲により記載されている。 該ｃｐｙ遺伝子の最初の部分を、ＣlaＩ（-６９５）およびＢamＨＩ（４６２ ）断片として、このプラスミドから、対応するAccIおよびＢamＨＩサイトにおい て、ｐＥＭＢＬ８のマルチクローニングサイト（デント（Dente，L.）ら、前掲 ）にクローン化し、プラスミドｐＣＡ１を得た。 ｃｐｙ遺伝子の液胞標的化配列の下流の成熟プロセシングサイト付近のヌクレ オチド位置３３０番（ボールズ，エル・エイ（Valls，L.A.）ら、前掲）にＮco Ｉサイトを作製するために、クレーマー，ダブリュ（Kramer，W.）ら（前掲）に より記載されている部位特異的突然変異を以下のヌクレオチド： で行った。得られたプラスミドｐＣＢ５０は、成熟プロセシングサイトにＮcoＩ サイトを有するｃｐｙ遺伝子の最初の部分を含んでいる。ヌクレオチド位置３３ ４番の該成熟プロセシングサイトに対してアミノ酸位置＋２番において、イソロ イシンがスレオニンに置き換わった。ヌクレオチド位置３３７番の成熟プロセシ ングサイトに対してアミノ酸＋３番において、リジンがメチオニンに置き換わっ た。カルボキシペプチダーゼＹ蛋白質の液胞標的化部分をコードする配列がその 中に存在するＨindIII-ＮcoＩ断片をさらなるクローニングに用いた。 ３点連結（サムブルック，ジェイ（Sambrook，J.）ら、前掲）を用いて、該ｃ ｐｙ 遺伝子の液胞標的化配列をレバンスクラーゼ遺伝子の成熟配列に融合させた 。 以下の断片は等モル濃度で用いた： （液胞標的化配列をコードする）ｃｐｙ遺伝子のＨindIII-ＮcoＩ断片、ｓａ ｃ Ｂ遺伝子のＮcoＲＩ-ＰstＩ断片、およびＨindIIIおよびＰstＩで消化したｐ ＥＭＢＬ８のベクターを含む断片。得られたプラスミドｐＫＫ３は、カルボキシ ペプチダーゼＹ-レバンスクラーゼ融合物のイン-フレーム構築物をコードする。 該融合遺伝子の正確な読み枠を、配列分析により確認した。 二重エンハンサーおよびｍＲＮＡ翻訳を高める配列と共に植物-特異的３５Ｓ プロモーターを含むプラスミドｐＭＯＧ１８は、シモンズ（Symons）ら、バイオ / テクノロジー（Bio/Technology）第８巻、２１７-２２１頁（１９９０年）によ り記載されている。それは、３５Ｓ-プロモーター/uidＡ-遺伝子/ＮＯＳ-ターミ ネーター構築物を含む。ＢamＨＩで切断し、粘着末端をクレノー酵素で満たし、 再び連結することにより内部ＢamＨＩサイトを除去したｐBluescriptII ＳＫ（ ストラテジーン社（Stratagene）カリフォルニア州、サン・ジエゴ（San Diege ，CA））をさらなるクローニングに用いた。ｐＭＯＧ１８をＥcoＲＩおよびＨin d IIIで消化することにより３５S-uidＡ-ＮＯＳ断片を得、対応するＥcoＲＩおよ びＨindIIIサイトにおいて、このＢamＨＩ-ｐBluescriptにクローン化して、プ ラスミドｐＰＡ２を得た。このプラスミドをＮcoＩおよびＢamＨＩで消化して、 該uidＡ遺伝子を除去した。得られたベクターをＳ１-ヌクレアーゼで処理し、突 出末端を除去し、次いで脱リン酸化した。ＡccＩおよびＰstＩで消化することに より、プラスミドｐＫＫ３から、該ｃｐｙ-ｓａｃＢ融合物を含む断片を単離し た。これらのサイトをクレノー酵素で平滑化した。これら２つの断片を連結し、 プラスミドｐＫＭ５を得た。ｐＫＭ５は３５Ｓ-プロモーター/ｃｐｙ-ｓａｃＢ- 遺伝子-融合物/ＮＯＳ-ターミネーター構築物を含む。 このプラスミド、すなわちｐＫＭ５を、最初にＸhoＩで消化し、次いでＸbaＩ で部分消化した。該完全構築物（３５Ｓ-ｃｐｙ-ｓａｃＢ-ＮＯＳ）を含有する 断片を、バイナリー植物ベクターｐＢＩＮ１９誘導体（ビーバン，エム（Bevan ，M.）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl．Acids Res.）第１２巻：８７ １１-８７２１頁）であるｐＭＯＧ２３のＸbaＩおよびＸhoＩサイトにクローン 化し（シモンズ（Symons）ら、前掲）、プラスミドｐＫＰを得た。 ３．ｐＫＰのタバコ植物への形質転換。 ヘルパー・プラスミドｐＲＫ２０１３（ラム，エス・ティ（Lam，S．T.）ら、 プラスミド（Plasmid）第１３巻、２００-２０４頁（１９８５年））を用いたト リペアレンタルメイティング（triparent mating）で、該ｐＫＰプラスミドをア グロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＬＢ４ ４０４（ホッケマ，エイ（Hoekema，A.）ら、ネイチャー（Nature）第３０３巻 、１７９-１８０頁（１９８３年））に接合伝達させた。葉ディスク形質転換法 （ホルシュ，アール・ビィ （Horsch，R．B.）ら、サイエンス（Science）第２２７巻、１２２９-１２３２ 頁（１９８５年））を用いて、該構築物をニコチアナ・タバカム・バラエティ・ペ チット・ハバンナ（Nicotiana tabacum var．Petit Havanna）（ＳＲ１）に導入 した。再生させたＫＰと称する植物をカナマイシン抵抗性につき選抜し、スクロ ースの代わりにグルコースを含有するＭＳ培地（ムラシゲ（Murashige）および スクーグ（Skoog）フィジォロジア・プランタム（Physiol．Plant.）第１５巻、 ４７３-４９７頁（１９６２年））上で生育させた。その後に、植物を温室ない 壌上で生育させ、分析した。 ４．ＫＰ植物の分析 植物を温室内で生育させ、葉材料を切り取り、エッペンドルフチューブ内で摩 砕した。遠心（２’１６０００rpm）した後に１μlの上清をＴＬＣ上にスポット した（カーンズ，エイ・ジェイ（Cairns，A．J.）およびポロック，シィ・ジェ イ（Pollock，C．J.）ニュー・ファイトロジスト（New Phytol.）第１０９巻、 ３９９-４０５頁（１９８８年））。８５：１５のアセトン：水中で該ＴＬＣを ３回展開し、次いで、（ワイズ，シィ・エス（Wise，C．S.)ら、アナリティカル ・ケミストリー（Analytical Chemistry）第２７巻、３３-３６頁（１９５５年 ）に）記載されているごとく尿素-スプレーで処理した。この方法では、フラク トースおよびフラクトース含有ポリマーが優先的に染色される。 非-形質転換植物および無関係の構築物で形質転換した植物においては、フラ トースポリマーは全く検出されなかった。この方法を用いて形質転換体をスクリ ーニングすると、これらの植物においてフラクタンの広範な蓄積が示された。フ ラクタンの発現レベルは、植物形質転換実験において通常認められるように、同 一構築物で形質転換した個々の植物の間で変動した。この発現レベルの変動は、 主にゲノム導入サイト（位置効果）に依存する。 これらの植物におけるフラクタン蓄積は、大量の単離によりさらに研究した（ リビングストーン三世，ディ・エイ（Livingstone III，D．A.）、プラント・フ ィジオロジー（Plant Physiol.）第９２巻、７６７-７６９頁（１９９０年）） 。ＦＰＬＣ・スーパーロース（Superose）６ＨＲ １０/３０カラム（ファルマシ ア社 (Pharmacia)）上の分子量測定によりこのフラクタンを分析したところ、フラク タンはボイドボリュームに検出され、このことは、＞２５，０００フラクトース 単位の重合度を示している。バチルス・ズブリス（Bacillus subtilis）のレバ ンスクラーゼにより産生されるフラクタンも、該スーパーロースカラムのボイド ボリュームに同様に溶出される。 酸分解による部分フラクタン分解は、加水分解生成物の特徴的ひじゃパターン を示す（図９参照）。精製した植物および細菌のフラクタンは、ＴＬＣ上に同一 の分解パターンを示す。完全に酸加水分解し、続いて８５℃にて溶出液として水 を用いるアミネックス（Aminex）ＨＰＸ８７Ｃカラム（バイオラド社(Biorad)） 上でＨＰＬＣ分析すると、このフラクタンがフラクトースからなることが示され る。 また、精製したフラクタンは、プロトン-ＮＭＲによっても分析した。バチル ス・ズブチリス（Bacillus subtilis）からのレバンスクラーゼによって合成し たフラクタンと比較した場合に、トランスジェニック植物から単離したフラクタ ンはピーク・パターンにおいて全く異ならないことを示した。 本発明者らは、数種の植物種（タバコ、テンサイ、トマト、ジャガイモ）にお いて、いかなるフラクタン加水分解活性も認められなかった。ｐＨ５.０のリン 酸-クエン酸緩衝液中で、植物蛋白質抽出物をフラクタンと長時間インキュベー トした場合、全くフラクタンは放出されない。 枯死した植物においてもフラクタンが該トランスジェニック植物に残存してい ることにより、蛋白質抽出物で示された安定性が確認された。トランスジェニッ ク植物における非特異性３５Ｓプロモーター活性と一致して、該植物全体にわた りフラクタンは蓄積する。 トランスジェニック植物は正常に種子を付ける。種子の発芽は非形質転換植物 と同一であって、該構築物はフラクタンを同様に産生する次世代によって安定し て受け継がれる。 実施例２．液胞におけるｆｔｆ遺伝子の発現 １．該遺伝子の選択 フラクタン-産生植物を作出するために、フラクタンを生成できる蛋白質をコ ードする遺伝子を選択した。もう一つの遺伝子、すなわち、ストレプトコッカス ・ミュータンス（Streptococcus mutans）のｆｔｆ遺伝子によりコードされてい るフラクトシルトランスフェラーゼ（シローザ，ティ（Shiroza，T.）およびク ラミツ，エイチ・ケイ（Kuramitsu，H．K.）、ジャーナル・オブ・バクテリオロ ジー（J．Bacteriol.）第１７０巻、８１０-８１６頁（１９８８年））を用いた 。スクロースの存在下で、この酵素は主に(２-１)-結合型の分岐フラクタンを生 成する。植物細胞のスクロースは液胞に蓄積できるため、ここはフラクタン蓄積 に好ましい部位する。該液胞にそれ自体を標的化できる蛋白質をコードする遺伝 子を選択した：カルボキシペプチダーゼＹ（ボールス，エル・エイ（Valls，L． A.）ら、前掲）。この遺伝子からシグナル配列および液胞標的化配列を実施例１ に記載したごとにく用いた。 ２．バイナリーベクター（ｐＴＰ）における３５Ｓ-ｃｐｙ-ｆｔｆ-ＮＯＳの 構築 プラスミドｐＴＳ１０２は、シローザ，ティ（Shiroza，T.）およびクラミツ ，エイチ・ケイ（Kuramitsu，H．K.）により記載されている（前掲）。フラクト シルトランスフェラーゼ（ｆｔｆ）遺伝子を、ＥcoＲＶおよびＢglII断片として このプラスミドから、適合するＳmaＩおよびＢamＨＩサイトにおいてＥＭＢＬ９ のマルチクローニングサイト（デント，エル（Dente，L.）ら、前掲）クローン 化し、プラスミドｐＴＡ１２を得た。 ｆｔｆ遺伝子（ヌクレオチド位置７８３番（シローザ，ティ（Shiroza，T.） およびクラミツ，エイチ・ケイ（Kuramitsu，H．K.）、前掲）の成熟プロセシン グサイト付近にＮcoＩサイトを作製するために、クレーマー，ダブリュ（Kramer ，W.）ら、前掲により記載されている部位特異的突然変異を以下のオリゴヌクレ オチド： で行い、プラスミドｐＴＤ２を得た。 それにより、該成熟プロセシングサイトに対してアミノ酸位置＋１番（ヌクレ オチド位置７８３番）において、グルタミンがメチオニンに変化した。成熟フラ クトシルトランスフェラーゼ蛋白質をコードする配列がその中に存在するＮcoＩ - Ｐst Ｉ断片をさらなるクローニングに用いた。 プラスミドｐＣＢ５０からの、カルボキシペプチダーゼＹ蛋白質の液胞標的化 部分をコードする配列がその中に存在する（実施例１に記載した）該ＨindIII-Ｎco Ｉ断片をさらなるクローニングに用いた。 ３点連結（サムブルック，ジェイ（Sambrook J.）ら、前掲）を用いて、該ｃ ｐｙ 遺伝子の液胞標的化配列をフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の成熟配 列に融合させた。以下の断片は、等モル濃度で用いた： （液胞標的配列をコードする）ｃｐｙ遺伝子のＨindIII-ＮcoＩ断片、ｆｔｆ遺 伝子のＮcoＩ-ＰstＩ断片、ならびに、ＨindIIIおよびＰstＩで消化したｐＥＭ ＢＬ８のベクターを含有する断片である。得られたプラスミドｐＴＫ１は、カル ボキシペプチダーゼＹ-フラクトシルトランスフェラーゼ融合物のイン・フレー ム構築物をコードしている。該融合物が正確な読み枠であることを配列分析によ り確認した。 実施例１に記載したプラスミドｐＰＡ２をＮcoＩおよびＢamＨＩで消化してｕ ｉｄ Ａ遺伝子を除去した。得られたベクターをＳ１-ヌクレアーゼで処理して突 出末端を除去し、次いで脱リン酸化した。ＡccＩおよびＰstＩで消化することに より、プラスミドｐＴＫ１から該ｃｐｙ-ｆｔｆ融合物を含有する断片を単離し た。これらのサイトはクレノー酵素で平滑化した。これら２つの断片を連結して プラスミドｐＴＭ４を得た。ｐＴＭ４は、３５Ｓ-プロモーター/ｃｐｙ-ｆｔｆ- 遺伝子融合物/ＮＯＳ-ターミネーター構築物を含む。 このｐＴＭ４をＸhoＩで消化し、次いで、ＸbaＩで部分消化した。完全構築物 （３５Ｓ-ｃｐｙ-ｆｔｆ-ＮＯＳ）を含む断片を、バイナリーベクターｐＢＩＮ １９誘導体（ビーバン，エム（Bevan，M.）前掲）であるｐＭＯＧ２３（シモン ズ（Symons）ら、前掲）のＸbaＩおよびＨindIIIサイトにクローン化し、プラス ミドｐＴＰを得た。 前記した構築物を含むＴＰ植物と命名したトランスジェニック植物が、実施例 １に記載するごとく得られた。 ３．ＴＰ植物の分析 実施例１のＴＬＣ法を用いて形質転換体をスクリーニングすると、位置効果に よる通常の変動を有するフラクタンの蓄積が示された。大量の単離により、これ らの植物に蓄積したフラクタンをさらに研究した（リビングストーン三世，ディ ・エイ（Livingstone III，D．A.）、前掲）。ＦＰＬＣスーパーロース６ＨＲ１ ０/３０カラム（ファルマシア(Pharmacia)社）上のサイズ分画によりこのフラク タンを分析したところ、フラクタンはボイドボリュームに検出され、このことは ＞２５.０００フラクトース単位の重合度であることを示している。ストレプト コッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）のフラクトシルトランスフェ ラーゼにより生成されたフラクタンも、スーパーロース・カラムのボイドボリュ ームに同様に溶出された。酸分解によって同様にフラクタンを加水分解すると、 加水分解生成物の特徴的なパターンが示された。精製した植物および細菌のフラ クタンは、ＴＬＣ上で同一の分解パターンを示す。完全酸加水分解し、続いて、 ８５℃にて溶出液として水を用いるアミネックスＨＰＸ８７Ｃカラム上のＨＰＬ Ｃ分析すると、このフラクタンがフラクトースよりなることが示される。 実施例１のごとく、枯死した植物でも依然フラクタンを含んでいる。同様にし て、種子は繁殖能を有し、フラクタン産出特性は次世代により受け継がれる。 実施例３． アポプラストにおけるｓａｃＢの発現 １．遺伝子の選択 フラクタンを産生する植物を作出するために、フラクタンを生成できる蛋白質 をコードする遺伝子を選択した。これらの遺伝子の１つであって実施例１に記載 されているｓａｃＢ遺伝子によりコードされているレバンスクラーゼ（スタイン メッツ，エム（Steinmetz，Ｍ.）ら、前掲）を用いた。 タバコ植物においてスクロースはアポプラストを通して師部に運搬されるため 、細胞間間隙（アポプラスト）もまたフラクタン蓄積に好ましいサイトである。 それ自体をアポプラストに標的化できる蛋白質をコードする遺伝子を選択した：ｐｒ-ｓ 遺伝子によりコードされるＰＲ蛋白質Ｓ（コルネリッセン，ビィ・ジェ イ・シィ（Cornelissen，B．J．C.）ら、ネイチャー（Nature）第３２１巻、５ ３１- ５３２頁(１９８６年)）である。この遺伝子からは、輸出シグナル配列を用いた 。 ２．バイナリーベクター（ｐＫＴ）における３５Ｓ/ｐｒ-ｓ-ｓａｃＢ/ＮＯＳ の構築 プラスミドｐＭＯＧ２９は、ペン，ジェイ（Pen，J.）らによって記載されて いる（バイオ/テクノロジー（Bio/Technology）第１０巻、２９２-２９６頁(１ ９９２年)）。ＰＲ蛋白質Ｓ（ｐｒ-ｓ）遺伝子（コルネリッセン，ビィ・ジェイ ・シィ（Cornelissen，B．J．C.）ら、前掲；バン・カン，ジェイ・エイ・エル （Van Kan，J．A．L.）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant Mol ．Biol.）第１２巻、１５３-１５５頁(１９８９年)）は、細胞間間隙であるアポ プラストに蛋白質を標的化できるシグナル配列を有する（ペン，ジェイ（Pen，J .）ら、前掲）。プラスミドｐＭＯＧ２９は、３５Ｓ-プロモーター/ｐｒ-ｓ-配 列/ＮＯＳ-ターミネーター構築物を含んでいる。ＢamＨＩで切断し、粘着末端を クレノー酵素で満たし、再び連結させることによって、内部ＢamＨＩサイトがそ れから除去されたｐBluescript IIＳＫ（ストラテジーン社(Stratagene)）をさ らなるクローニングに用いた。ｐＭＯＧ２９をＥcoＲＩおよびＨindIIIで消化す ることによって該３５Ｓ-プロモーター/ｐｒ-ｓ-配列/ＮＯＳ-ターミネーター構 築物を得、これを対応するＥcoＲIおよびＨindIIIサイトにてこのｐＢluescript にクローン化しプラスミドｐＰＢ１を得た。プラスミドｐＰＢ１をＢamＨIで消 化し、突出末端をクレノー酵素で満たした。ＮcoIおよびＰstIで消化することに より、このプラスミドｐＫＫ３（実施例１）からｓａｃＢ遺伝子を単離した。こ れらのサイトは、クレノー酵素で平滑化した。平滑末端の連結を行い、プラスミ ドｐＫＲを得た。該プラスミドｐＫＰは、該ｐｒ-ｓレバンスクラーゼ融合物の イン・フレーム構築物をコードしている。該融合物が正確な読み枠であることを 配列分析により確 成熟レバンスクラーゼ蛋白質のメチオニン、アラニンおよび残部で始まるレバン スクラーゼ蛋白質配列を該構築物はコードしている（スタインメッツ，エム（St einmetz，M.）ら、前掲）。この構築物をＸbaIで消化し、次いで、ＸhoIで部分 消化した。完全構築物（３５Ｓ/ｐｒ-ｓ-ｓａｃＢ/ＮＯＳ）を含有する該断片 を、バイナリーベクターｐＢＩＮ１９誘導体（ビーバン，エム（Bevan，M.）、 前掲）であるｐＭＯＧ２３（シモンズ（Symons）ら、前掲）のＸbaIおよびＸhoI サイトにクローン化し、プラスミドｐＫＴを得た。前記した構築物を含むＫＴ植 物と命名したトランスジェニック植物が、実施例１に記載のごとく得られた。 ３．ＫＴ植物の分析 実施例１のＴＬＣ法を用いて形質転換体をスクリーニングすると、位置効果に よる通常の変動を有するフラクタンの蓄積が示された。大量の単離によりこれら の植物におけるフラクタン蓄積をさらに研究した（リビングストーン三世，ディ ・エイ（LivingstoneIII，D．A.）、前掲）。スーパーロース・クロマトグラフ ィーのデータおよび実施例１のごとき完全な酸加水分解につづくＨＰＬＣ分析は 、このフラクタンが高分子量であってフラクトースよりなることを示している。 実施例１のごとく、枯死した植物でもなおフラクタンを含んでいる。同様にし て、種子は繁殖能力を有し、該フラクタン産生特性は次世代に受け継がれる。 実施例４． アポプラストにおけるｆｔｆ遺伝子の発現 １．遺伝子の選択 フラクタンを産生する植物を作出するために、フラクタン産生能を有する蛋白 質をコードする遺伝子を選択した。もう１つの遺伝子であって実施例２で導入し た、ｆｔｆによりコードされるフラクトシルトランスフェラーゼ（シローザ，テ ィ（Shiroza，T.）およびクラミツ，エイチ・ケイ（Kuramitsu，H．K.）ら、前 掲）を用いた。タバコ植物におけるスクロースは、アポプラストを通して師部に 運搬されるために、細胞間間隙（アポプラスト）もまたフラクタン蓄積に好まし いサイトである。それ自体をアポプラストに標的化する能力を有する蛋白質をコ ードする遺伝子を選択した：ｐｒ-ｓ遺伝子によりコードされているＰＲ-蛋白質 Ｓ（コルネリッセン，ビィ・ジェイ・シィ（Cornelissen，B．J．C.）ら、前掲 ）である。この遺伝子からのシグナル配列を用いた。 ２．バイナリーベクター（ｐＴＴ）における３５Ｓ/pr-s-ｆｔｆ/ＮＯＳの構 築 プラスミドｐＰＢ１（実施例３）をＢamＨIで消化し、突出末端をクレノー酵 素 で満たした。ＮcoＩおよびＰstＩで消化することによりプラスミドｐＴＫ１（実 施例２）からｆｔｆ遺伝子を単離した。これらのサイトをクレノー酵素で平滑化 した。平滑末端の連結を行い、プラスミドｐＴＲを得た。該プラスミドｐＴＲは 、ｐｒ-ｓフラクトシルトランスフェラーゼ融合物のイン・フレーム構築物をコ ードしている。該融合物は正確な読み枠であることが、配列分析により確認され た。 熟フラクトシルトランスフェラーゼのメチオニンで始まるフラクトシルトランス フェラーゼ蛋白質配列をコードしている（シローザ，ティ（Shiroza，T.）、前 掲）。 この構築物をＸbaＩおよびＨindIIIで消化した。完全構築物（３５Ｓ/ｐｒ-s-ｆｔｆ /ＮＯＳ）を含む断片を、バイナリーベクターｐBIN１９誘導体（ビーバン ，エム（Bevan，M.）、前掲）であるｐＭＯＧ２３（シモンズ（Symons）ら、前 掲）のＸbaＩおよびＨindIIIサイトにクローン化しプラスミドｐＴＴを得た。前 記した構築物を含むＴＴ植物と命名したトランスジェニック植物が、実施例１に 記載するごとく得られた。 ３．ＴＴ植物の分析 実施例１のＴＬＣ法を用いて形質転換体をスクリーニングすると、位置効果に よる通常の変動を有するフラクタンの蓄積が示された。 大量の単離によって、これらの植物に蓄積したフラクタンをさらに研究した（ リビングストーン三世，ディイ・エイ（LivingstoneIII，D．A.）、前掲）。ス ーパーロース・クロマトグラフィーのデータおよび実施例１の完全な酸加水分解 に続くＨＰＬＣ分析により、このフラクタンが高分子量であってフラクトースよ りなることが示された。 実施例１のごとく、涸死した植物でもフラクタンを含んでいる。同様に、種子 は繁殖能力を有し、フラクタン産生特性は次世代により受け継がれる。 実施例５． 細胞質におけるｓａｃＢの発現 １．遺伝子の選択 フラクタンを産生する植物を作出するために、フラクタン生成能を有する蛋白 質をコードする遺伝子を選択した。これらの遺伝子の１つであり、ｓａｃＢ遺伝 子（スタインメッツ，エム（Steinmetz，M.）ら、前掲）によりコードされてい て実施例１に記載されているレバンスクラーゼを用いた。 植物細胞中のスクラーゼは細胞質で合成されるため、細胞質はフラクタン蓄積 に好ましい部位である。核にコードされている蛋白質は細胞質で生成されるため 、標的配列は必要でない。 ２．バイナリーベクター（ｐＫＺ）における３５Ｓ-ｓａｃＢ-ＮＯＳの構築 プラスミドｐＰＡ２（実施例１）をＮcoＩおよびＢamＨＩで消化し、ベクター を含有する断片を単離した。プラスミドｐＫＫ３（実施例１）から、ＮcoＩおよ びＢamＨＩ断片を有してｓａｃＢ遺伝子を単離した。両方の断片を連結してプラ スミドｐＫＸを得た。得られたプラスミドｐＰＫは、完全なレバンスクラーゼの 構築物をコードしている。該構築物が正確であることを、配列分析により確認し た。 この構築物をＸbaＩおよびＸhoＩで消化した。完全な構築物（３５Ｓ-ｓａｃ Ｂ-ＮＯＳ）を含む断片を、バイナリー植物ベクターｐＢＩＮ１９誘導体（ビー バン，エム（Bevan，M.）、前掲）であるｐＭＯＧ２３（シモンズ（Symons）ら 、前掲）のＸbaＩおよびＸhoＩサイトにクローン化し、プラスミドｐＫＺを得た 。 前記の構築物を含みＫＴ植物と命名したトランスジェニック植物が、実施例１ 記載のごとく得られた。 ３．ＫＴ植物の分析 実施例１のＴＬＣ法を用いて形質転換体をスクリーニングすると、位置効果に よる通常の変動を有するフラクタンの蓄積が示された。 大量の単離により、これらの植物に蓄積するフラクタンをさらに研究した（リ ビングストーン三世，ディ，エイ（LivingstoneIII,D.A.）、前掲）。スーパー ロース・クロマトグラフィーのデータならびに実施例１の完全酸加水分解に続く ＨＰＬＣ分析により、このフラクタンが高分子量であってフラクトースよりなる ことが示された。 実施例１のごとく、枯死した植物でもフラクタンを含んでいる。同様に、種子 は繁殖能を有し、該フラクタン産生能は次世代により受け継がれる。 実施例６． 細胞質におけるｆｔｆ遺伝子の発現 １．遺伝子の選択 フラクタンを産生する植物を作出するために、フラクタン生成能を有する蛋白 質をコードする遺伝子を選択した。もう１つの遺伝子であってｆｔｆ遺伝子によ りコードされており実施例２で導入したフラクトシルトランスフェラーゼ（シロ ーザ，ティ（Shiroza，T.）およびクラミツ，エイチ・ケイ（Kuramitsu，H．K. ）、前掲）を用いた。植物細胞中のスクロースは細胞質で合成されるため、細胞 質がフラクタン蓄積に好ましいサイトである。核にコードされている蛋白質は細 胞質で生成されるため、標的配列は必要でない。 ２．バイナリーベクター（ｐＴＺ）における３５Ｓ-ｆｔｆ-ＮＯＳの構築 プラスミドｐＰＡ２（実施例１）をＮcoＩおよびＢamＨＩで消化し、ベクター を含む断片を単離した。プラスミドｐＴＫ１（実施例２）から該ｆｔｆ遺伝子をＮco ＩおよびＢamＨＩ断片として単離した。次いで、両方の断片を接合させてプ ラスミドｐＴＸを得た。得られたプラスミドｐＴＸは、完全なフラクトシルトラ ンスフェラーゼの構築物をコードしている。該構築物が正確であることを配列分 析により確認した。 この構築物をＸbaＩおよびＨindIIIで消化した。完全な構築物（３５Ｓ-ｆｔ ｆ -ＮＯＳ）を含む断片を、バイナリー植物ベクターｐＢＩＮ１９誘導体（ビー バン，エム（Bevan，M.）、前掲）であるｐＭＯＧ２３（シモンズ（Symons）ら 、前掲）のＸbaＩおよびＨindIIIサイトにクローン化し、プラスミドｐＴＺを得 た。前記の構築物を含みＴＺと命名したトランスジェニック植物が、実施例１に 記載したごとく得られた。 ３．ＴＺ植物の分析 実施例１のＴＬＣ法を用いて形質転換体をスクリーニングすると、位置効果に よる通常の変動を有するフラクタンの蓄積が示された。 大量の単離により、これらの植物におけるフラクタン蓄積をさらに研究した（ リビングストーンIII，ディ，エイ（LivingstoneIII，D．A.）、前掲）。スーパ ーロース・ クロマトグラフィーのデータならびに実施例１の完全な酸加水分解に続くＨＰＬ Ｃ分析により、このフラクタンが高分子量であってフラクトースよりなることが 示された。 実施例１のごとく、枯死した植物でもフラクタンを含んでいる。同様に、種子 は繁殖能を有し、フラクタン産生特性は次世代により受け継がれる。 実施例７． フラクトシルトランスフェラーゼ構築物を獲得したトランスジェニックタバコ 植物の後天的な特性 １．一般特性 実施例１-６に記載したごとき異なったフラクトシルトランスフェラーゼ構築 物を獲得したトランスジェニックタバコ植物系は、全てフラクタン分子を蓄積す る。フラクタン蓄積のレベルは、恐らくは形質転換遺伝子の組み込みサイトの遺 伝子発現に対する効果（位置効果）により個々の形質転換体の間、および用いた ６種の異なった構築物の間で異なっていた。サザン・ハイブリダイゼーション分 析（サムブルック（Sambrook）ら、前掲）を用いて、個々の植物体ゲノムに組み 込まれたＤＮＡコピーの数を測定した。組み込まれたコピーの数は１-８の間で 変動するが、大部分の植物体は１個または２個の構築物コピーのみを含んでいた 。該フラクタンの重合度は、２５０００またはそれを超えるフラクトース単位に 上る。葉、茎、根茎および種子を包含する試験した全ての器官においてフラクタ ンが蓄積する。該特性は、メンデル様式で子孫に伝達された。フラクタンの同一 性は、前の実施例に記載したごとき分子量測定、加水分解およびプロトン核磁気 共鳴分析により確認した。加えて、フラクトフラノシル結合に対して向けられた 抗体（ホール，ビィ（Hall，B.）ら、１９９０年、モレキュラー・イムノロジー （Mol.Ｉmmunology）第２７巻：３５１-３６１頁；ホール，ビィ（Hall，B.）ら 、１９９２年、ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（The Journal of Immunol ogy）第１４９巻：１６０５-１６１２頁）を、トランスジェニック植物で産生さ れたフラクタンと反応させた。この実験のために、フラクタンをニトロセルロー スのフィルター紙にスポットし、１２０℃にて１５分間処理することにより固定 した。該フィルター を特異的なマウス抗体（ホール（Hall）ら、前掲）とインキュベートし、該マウ ス抗体の非特異的部位に対して向けられたアルカリホスファターゼ結合ヤギ二次 抗体で、該フラクタンへの抗体の結合を検出した。 フラクタンは、該植物のライフサイクルを通して存在する。一旦合成されたら 、フラクタンは安定である。この段階の全てにおいてフラクタンの分解があると しても、非常に低いものであろう。枯死し脱水した葉においても、フラクタンは 成熟した葉に匹敵する量でまだ存在している。該トランスジェニックタバコ植物 におけるフラクタン含量は、成熟葉の乾燥重量の３-８％の範囲である。他の可 溶性炭水化物（グルコース、スクロースおよびフラクトース）のレベルを前記の ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて定量したところ、非形質転換野生型の植物 に匹敵することが判明した。 ２．表現型特性 通常の生育条件下では、非形質転換対照タバコ植物と実施例２、４および６（ ＴＰ、ＴＺおよびＴＴ系）において言及した３種の異なった立体構造のエス・ミ ュータンス（S．mutans）のｆｔｆ遺伝子を獲得したフラクタン蓄積トランスジ ェニック植物との間における生育または形態に相違は認められなかった。このこ とは、該ｃｐｙ標的シグナルに融合させたビィ・ズブチリス（B．subtilis）のｓａｃ Ｂ遺伝子を有する植物（ＫＰ植物、実施例１）に関しても同様である。細 胞質およびアポプラストにおいてビィ・ズブチリス（B．subtilis）のｓａｃＢ 遺伝子を発現する植物（ＫＺ、ＫＴ、実施例３および５）は、成葉および成茎に 壊死斑点を示す。表現型の度合は、蓄積したフラクタンのレベルと関連する。こ れらの植物は繁殖能を有する種子を付ける。 実施例８ フラクトシルトランスフェラーゼ構築物を獲得したトランスジェニックタバコ 植物のストレス条件下における能力の向上 ｃｐｙ-ｓａｃＢ構築物（ＫＰ、実施例１）を獲得した代表的なフラクタン蓄 積タバコ系のストレス条件下における能力を、非形質転換対照植物と比較した。 １．乾燥ストレス 平均分子量１０,０００ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ10,000） のバーミキュライト上で生育させた植物に制御して添加することにより一連の植 物に乾燥ストレスを誘導した。乾燥ストレスレベルの範囲は、ＰＥＧ溶液の適用 で２０％のＰＥＧ１０,０００まで誘導された。新鮮重量および乾燥重量を、生 育速度（ｃｍ/日）と共に測定した。乾燥ストレスをかけたフラクタン蓄積ＫＰ 植物は早く生育し、同様にストレスをかけた非形質転換植物より有意に高い収率 を供した。同様にストレスをかけた非形質転換植物と比較した場合、トランスジ ェニックＫＰ植物は、典型的な場合で新鮮重量が１９％まで、乾燥重量が３２％ まで上昇した。 ２．光ストレス条件 最適下限の光条件下での収率特性を、代表的なトランスジェニックＫＰ植物と 非形質転換植物との間で比較した。低い光（５０００ルクス）下で生育させたＫ Ｐ植物を、対照（非形質転換）植物と直接比較した。フラクタンを蓄積するＫＰ 植物は早く生育し、非形質転換植物よりも有意に高い収率が得られた。該ＫＰ植 物の新鮮重量および乾燥重量は両方とも非形質転換植物より１８％高かった。該 ＫＰは、非形質転換植物より多く葉を付けた。 また、高光強度、特に最下限の生育条件と組み合わせた場合にもほとんどの植 物種において重度のストレスとなる。フラクタンを蓄積する植物は、かかる条件 下でも非形質転換植物より良好な能力を発揮できる。例えば、付加炭水化物シン クおよびこの様式としてのフラクタン機能は、植物に対する光誘導性障害に対し て保護し得る。 ３．冷温ストレス トランスジェニックＫＰ植物および非形質転換植物の生育特性を、冷温ストレ ス条件下で比較した。１２℃の制御条件下で生育させた場合、該ＫＰ植物は、非 形質転換植物よりも新鮮重量および乾燥重量において１９％を超える高い収率を 供した。１）、２）および３）と命名したストレス条件は、非形質転換ＫＰ植物 に比してのトランスジェニックＫＰ植物におけるフラクタンのレベルで４倍を超 える増加を誘導した。フラクタンの蓄積により、生育能が改善され、フラクタン 蓄積の度合が生育向上性の度合と関連するようになる。 ストレス条件下での良好な能力は、１）、２）および３）下に供された特別の 例に限らず、広範な好ましくない環境条件下でも起こり得る。能力の改善は、生 育速度または新鮮重量および乾燥重量の増加に限らず、収穫前および収穫後の特 性の双方に関する他の経済的に重要な生理学的態様をも包含し得る。 前記した一例のごとき非生物的ストレス下での能力の改善に加えて、該フラク タン蓄積植物は病害および害虫のごとき生物学的ストレスに対しても抵抗性が向 上した植物を提供する（ファーラー：「害虫および病原菌：葉の攻撃に対する植 物の反応（Ｐest and pathogens:plant response to foliar attack）」１０７- １２７頁、ピィ・ジィ、アイレス（P．G．Ayres）編、ビオス・パブリッシャー ズ（ＢＩＯＳ Publishers）１９９２年）。フラクタン蓄積により、病害および 害虫に対して感受性が減じる代謝修飾または構造修飾が植物に起こり得る。かか る修飾の例には、それらに限定するものではないが、消化性、テクスチャー、香 りおよび改変されたレベルの他の植物の一次および二次代謝生成物が含まれる。 例えば、フラクタン蓄積をさらに増加させるには、天然または誘導した修飾炭 水化物の分画パターンを有する植物がストレス条件下での改善された能力の標的 に好ましいものとなり得る。かかる植物には、限定するものではないが、デンプ ンおよびスクロース代謝が、例えば、ソンネバルド（Sonnewald）およびウィル- ミッツァ（Will-mitzer）により記載されているごとき（プラント・フィジオロ ジー（Plant Physiol.）第９９巻、１２６７-１２７０頁、１９９０年）、分子 および遺伝子技術により修飾された天然の突然変異体が含まれる。 実施例９ 技術の一般適用性 １．構築 用いた技術の一般適用性を立証するために、実施例１に記載したｃｐｙ-ｓａ ｃ Ｂ構築物を用いた。少なくとも２個の結合したフラクトース単位よりなるフラ クタンを合成できるポリペプチドをコードするいずれの起源の他の遺伝子も良好 に用いることができる。加えて、レベル、時期および部位に関してトランスジェ ニッ ク植物においてフラクタン蓄積を向けるその能力の観点における導入構築物の有 効性も、限定するものではないが、構造プロモーター、器官特異的プロモーター 、生長段階的に調節されたプロモーター、ポリアデニル化シグナル、翻訳エンハ ンサー、転写エンハンサー等を用いることにより修飾できる。加えて、該ポリペ プチドの細胞質局在も、限定するものではないが、いずれかの起源の液胞標的シ グナルまたはアポプラスト標的シグナルを包含する異なった細胞質標的シグナル を用いることによって向けることができる。前記した因子のいずれかの組合せを 植物に導入した後に、葉、根茎および茎、ならびに、限定するものではないが、 塊茎、貯蔵根、果実ならびに種子を包含する由来の器官に大量のフラクタンが蓄 積し得る。 ２．異なった穀物種における適用性 該技術の一般適用を立証するために、実施例１に記載したごとき構築物ｃｐｙ -ｓａｃＢを、ビッサー（Visser）、プラント・ティシュー・カルチャー・マニ ュアル（Plant Tissue Culture Manual）Ｂ５、１-９頁、クルーアー・アカデミ ック・パブリッシャーズ（Kluwer Academic Publishers）、１９９１年に記載の ごとく形質転換できるが、必ずしもそうする必要のないジャガイモ（ソラナム・ チューベローサム・エル（Solanum tuberosum L.））のごとき穀物種に導入した 。得られたトランスジェニック植物は、生長段階を通してあらゆる器官にフラク タンを蓄積した。葉および塊茎におけるレベルは、９％新鮮重量を超え得る。加 えて、同一の構築物を、ダハリン（D'Halluin）ら、バイオテクノロジー（Biote chnology）第１０巻、３０９-３１４頁（１９９２年）に記載のごとく形質転換 できるが、必ずしもそうする必要のないテンサイ（ベータ・ブルガリス（Beta v ulgaris L.））に導入した。得られたトランスジェニックテンサイ植物は、例え ば、それらの葉および貯蔵根に、２５，０００またはそれを超える重合度の大量 のフラクタンを蓄積した。同一のｃｐｙ-ｓａｃＢ構築物を、ド・ブロック（de Block）ら、プラント・フィジオロジー（Plant Physiol.）第９１巻、６９４-７ ０１頁（１９８９年）に記載のごとく形質転換できるが必ずしもそうする必要の ない飼料用アブラナ（ブラシカ・ナプス（Brassica napus L.））に導入した。 得られたトランスジェ ニック飼料用アブラナ植物は、例えば、それらの葉および貯蔵根に、２５,００ ０またはそれを超える重合度の大量のフラクタンを蓄積した。 さらに、フラクタンを蓄積するよう修飾できる植物種には、限定するものでは ないが、トウモロコシ（Zea may L.）、コムギ（Triticum aestiyum L.）、オオ ムギ（Hordeum vulgare L.）、コメ（Oryza sativa L.）、ダイズ（Glycin max L.）、エンドウマメ（Pisum sativum L.）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris L.）、チコリー（Cichorium intybus L.）、スイーコーン（Saccharum officin arum L.）、ヤマイモ（Dioscorea escculenta L.）、キャッサバ（Manihot escul enta L.）およびイネ科植物（例えば、Lolium spp.、Poa spp.、Festucas pp.） が含まれる。 天然または誘導性の修飾炭水化物の分画パターンを有する植物は、特にフラク タン蓄積レベルの増加のようなフラクタン代謝の修飾に好ましい標的となり得る 。かかる植物には、限定するものではないが、デンプンおよびスクロース代謝に おける天然の突然変異体および、例えば、ゾーンバルド（Sonnewald）およびウ ィルミッツァー（Willmitzer）、プラント・フィジオロジー（Plant Physiol.） 第９９巻、１２６７-１２７０頁（１９９２年）に記載のごとき分子および遺伝 子技術によりデンプンおよびスクロース代謝が修飾された植物が含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 エブスカンプ，ミヒャエル・ヨハネス・マ ルクス オランダ、エヌエル―3454イェーデー・ド ゥ・メールン、レエィクスストラートウェ ッヒ55番 (72)発明者 ウェイスビーク，ペトルス・ヤコブス オランダ、エヌエル―3734セーアー・デ ン・ドルデル、バールンセウェッヒ49番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）植物内活性なプロモーター配列および植物内で活性なターミネーター 配列を作動可能に連結した１もしくはそれを超えるフラクトシルトランスフェラ ーゼ遺伝子、またはその修飾バージョンよりなるＤＮＡ構築物を調製し； ｂ）該構築物で植物細胞を形質転換し；次いで、 ｃ）該形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生させる 工程よりなる、非形質転換植物に比して修飾されたフラクタン・パターンを示す トランスジェニック植物を得る方法。 ２．該ＤＮＡ構築物が、さらに該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子から 上流の標的化配列よりなることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の５'側非翻訳領域が、フラク トシルトランスフェラーゼの発現に負に影響しないように修飾されていることを 特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が微生物起源であることを特徴 とする請求項１、２または３記載の方法。 ５．該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が、バチルス・ズブチリス（Ba cillus subtilis）のｓａｃＢ遺伝子およびストレプトコッカス・ミュータンス （Streptococcus mutans）のｆｔｆ遺伝子よりなる群から選択されることを特徴 とする請求項４記載の方法。 ６．該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子が植物起源であることを特徴と する請求項１または２記載の方法。 ７．該標的化配列が、カルボキシペプチダーゼＹ（ｃｐｙ）遺伝子のシグナル 配列および液胞標的化配列ならびにＰＲ-蛋白質Ｓ遺伝子のシグナル配列および アポプラスト標的化配列よりなる群から選択されることを特徴とする請求項２な いし６のいずれか１に記載の方法。 ８．該ターミネーター配列が、ノパリン・シンターゼ遺伝子のターミネーター 配列であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１に記載の方法。 ９．該プロモーター配列が、構成的プロモーター配列または調節可能なプロモ ーター配列であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１に記載の方法 。 １０．該プロモーター配列が、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスのプロモー ター配列ならびにジャガイモ顆粒-結合性のスターチシンターゼ・プロモーター よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１に記 載の方法。 １１．該ＤＮＡ構築物が、さらに、該フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の 上流であって該プロモーター配列から下流にある翻訳エンハンサーよりなること を特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１に記載の方法。 １２．該翻訳エンハンサーが、アルファルファモザイクウイルスのＲＮＡ４の翻 訳エンハンサーであることを特徴とする請求項１１記載の方法。 １３．植物特異的プロモーター配列および植物特異的ターミネーター配列に作動 可能に連結した１またはそれを超えるフラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子ま たはその修飾物よりなる、トランスジェニック植物を作出するためのＤＮＡ構築 物。 １４．その５'非翻訳領域が、フラクトシルトランスフェラーゼの発現が負に影 響しないように修飾されていることを特徴とする請求項１３記載のＤＮＡ構築物 。 １５．さらに、フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の上流にある標的化配列 よりなる請求項１３または１４記載のＤＮＡ構築物。 １６．請求項１３、１４または１５に記載されたＤＮＡ構築物よりなるトランス ジェニック植物細胞。 １７．請求項１ないし１２のいずれか１の方法に従って作出したトランスジェニ ック植物。 １８．非生物的および/または生物的ストレスに対して抵抗性である請求項１な いし１２に記載された方法に従って作出したトランスジェニック植物。 １９．請求項１７または１８に記載されている植物の果実、茎、根、塊茎、種子 のごときトランスジェニック植物組織。 ２０．非生物的および/または生物的ストレスの条件下で栽培させるための、請 求項１８記載のトランスジェニック植物の使用。 ２１．フラクタン産生のための、請求項１７記載のトランスジェニック植物また は請求項１９記載のトランスジェニック植物組織の使用。 ２２．食材としての、請求項１７記載のトランスジェニック植物または請求項１ ９記載のトランスジェニック植物組織の使用。 ２３．動物用飼料のための、請求項１７記載のトランスジェニック植物または請 求項１９記載のトランスジェニック植物組織の使用。 ２４．請求項１７記載のトランスジェニック植物または請求項１９記載のトラン スジェニック植物組織から単離したフラクタン。 ２５．食料および非食料生成物ならびに産業工程における請求項２４記載のフラ クタンの使用。 ２６．低カロリー食物生成物における請求項２５記載のフラクタンの使用。 ２７．請求項１７または１８記載のトランスジェニック植物から収穫可能なトラ ンスジェニック種子。 ２８．請求項１７または１８記載のトランスジェニック植物から収穫可能な再生 可能な構造。