NL9401140A - Produktie van oligosacchariden in transgene planten. - Google Patents

Description

PRODUCTIE VAM OLIGOBACCHARIDEN XM TRANSGENE PLANTEN

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het produceren van oligosacchariden, op de op deze wijze geproduceerde oligosacchariden, op transgene planten en plantecellen, die in staat zijn oligosacchariden te produceren en op de toepassingen van de op deze wijze verkregen oligosacchariden.

In de voedingsmiddelenindustrie is er een toenemende trend naar "light" en calorie-arm waar te nemen. Daarbij wordt het gebruik van teveel vet en/of suiker in produkten vermeden. Om toch een zoete smaak aan voedingsmiddelen te kunnen verschaffen komen er steeds meer suiker-vervangers op de markt. Aspartaam is daarvan een bekend voorbeeld. Aspartaam heeft echter slechte organoleptische eigenschappen.

Een andere type suikervervanger wordt gevormd door oligosacchariden. Oligosacchariden zijn molekulen die bestaan uit twee of meer monosacchariden, zoals fructose en/of glucose. De monosacchariden in bedoelde oligosacchariden zijn ofwel door 6-(2-1)- of door 6-(2-6) -bindingen aan elkaar gekoppeld. Het aantal monosacchariden in een oligo-saccharide wordt aangegeven door middel van de DP-waarde ("Degree of Polymerisation"). Een DP-waarde van 3 betekent dat het oligosaccharide is opgebouwd uit drie monosacchariden. Oligofructosen zijn oligosacchariden, die volledig bestaan uit fructose-eenheden. Wanneer een oligosaccharide tevens één of meer glucose-eenheden omvat zullen deze door middel van een o( 1-2) -binding aan een fructose-eenheid gekoppeld zijn. De samenstelling van oligosacchariden wordt ook wel aangeduid met de formule GJFn, waarbij G staat voor glucose en F voor fructose en waarbij m gelijk is aan 0 of 1, en n een geheel getal is van groter of gelijk aan o. Bijzonder geschikte oligo-sacchariden zijn die waarin m is gelijk aan 1 en n is 2 tot 8, bij voorkeur 2 of 3.

Oligosacchariden kunnen in de menselijke maag en dunne darm niet of nauwelijks gehydrolyseerd worden. Van oligofructose is bekend dat de spijsverteringsenzymen van de mens geen effect hebben op de 6(2-1)- en 6(2-6)-binding in het molekuul. Daardoor passeren zij de maag en de dunne darm zonder afgebroken en in het lichaam opgenomen te worden. De oligo-sacchariden verlaten het lichaam echter niet maar worden gemetaboliseerd door de microbiële flora van de dikke darm. Daarbij komen naast gas eveneens vluchtige vetzuren vrij, die op hun beurt opnieuw als energiebron dienen voor de darmflora. Dit verschijnsel verklaart waarom oligosaccha-riden een lagere energiewaarde hebben voor de mens dan vrije suikers, als glucose, fructose en sucrose, die wel in het lichaam worden opgenomen. Oligosacchariden hebben echter wel voldoende zoetkracht om als suikervervanger te dienen.

Verder is bekend dat oligosacchariden, met name oligofructose, een bifidogeen effect hebben, dat wil zeggen dat zij de groei van Bifidobacteriën in het spijsverterings-stelsel stimuleren. Bifidobacteriën beschermen tegen de ontwikkeling van pathogene bacteriën en hebben daardoor een positieve invloed op de gezondheid. Daarnaast zijn oligosacchariden voedingsvezels.

Momenteel zijn er reeds verschillende oligosacchariden op de markt, die op diverse manieren bereid worden.

Oligosacchariden kunnen gemaakt worden door de partiële enzymatische hydrolyse van langere plantaardige inulineketens. Een werkwijze hiervoor wordt bijvoorbeeld beschreven in de Europese octrooiaanvrage 440.074.

Oligosacchariden kunnen eveneens enzymatisch gesynthetiseerd worden. Voor deze enzymatische produktierou-te wordt gebruik gemaakt van enzymen, fructosyltransferasen, die sucrose omzetten tot een mengsel van oligosacchariden, en die geïsoleerd zijn uit verschillende micro-organismen (JP-80/40193).

Aan de bekende produktieroutes kleeft echter een aantal nadelen. Ten eerste zijn de beide bekende produk-tiewijzen relatief duur. Verder komen naast de gewenste oligosacchariden met een ketenlengte van 2 tot ongeveer 7 in het geproduceerde mengsel ook nog relatief veel vrije suikers en oligosacchariden met een hogere ketenlengte voor.

Het nadeel van veel vrije suikers is dat de energiewaarde van het mengsel daardoor stijgt. Vrije suikers hebben bij voorbeeld een energie-inhoud van 17 kilo joule per gram terwijl zuivere GF2 en GF3 een energie-inhoud van 4 tot 6 kilojoule per gram hebben. Vrije suikers veroorzaken daarnaast tandbederf (cariës).

Oligosacchariden met een te hoge ketenlengte hebben daarentegen te weinig zoetkracht, hetgeen de gemiddelde zoetkracht van het mengsel doet dalen.

Oligosacchariden hebben in tegenstelling tot sommige andere zoetstoffen, zoals bijvoorbeeld Aspartaam, goede organoleptische eigenschappen.

Het is het doel van de onderhavige uitvinding een alternatieve produktieroute voor oligosacchariden te verschaffen, waarmee bovengenoemde nadelen vermeden worden.

Daartoe verschaft de uitvinding een werkwijze voor het produceren van oligosacchariden, omvattende de etappen: a) het selecteren van een gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosac-charide; b) het koppelen van het gen aan geschikte trans-criptie-initiatie- en transcriptie-terminatiesignalen voor het verschaffen van een expressieconstruct; c) het met het expressieconstruct transformeren van een geschikte plantecel; d) het uit de getransformeerde plantecel regenereren van een transgene plant; e) het kweken van de transgene plant onder omstandigheden die de expressie en activiteit van het enzym mogelijk maken; en f) het uit de transgene plant isoleren van de oligosacchariden.

' De uitvinding verschaft derhalve een werkwij ze waarmee door middel van transgene planten of plantecellen een oligosaccharide of een mengsel van oligosacchariden geproduceerd kan worden, die in vergelijking met de langs bekende industriële weg bereide meer gewenste eigenschappen hebben.

Het voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is namelijk dat de ketenlengteverdeling smaller is waardoor er geen of weinig vrije suikers in het eindprodukt voorkomen. Het gevolg hiervan is een lagere cariogeniteit en de gewenste lagere energiewaarde. Ook komen er minder oli-gosacchariden met een ketenlengte van meer dan 5 voor. Het voordeel hiervan is dat de oligosacchariden die geproduceerd worden volgens de uitvinding een hogere specifieke zoet-kracht hebben. De zoetkracht hangt namelijk af van de "gemiddelde ketenlengte”. Hoe hoger de gemiddelde ketenlengte van een mengsel hoe lager de zoetkracht. Het voordeel van een hoge specifieke zoetkracht is dat nauwelijks extra zoetstoffen toegevoegd hoeven te worden bij verwerking van het produkt.

Iets soortgelijks gaat op voor de oplosbaarheid. Ook hier geldt dat bij een toename van de gemiddelde ketenlengte de oplosbaarheid af neemt. De mengsels volgens de uitvinding hebben derhalve een hogere oplosbaarheid dan de mengsels die verkregen worden door middel van enzymatische synthese of enzymatische hydrolyse. Daarnaast worden de produktiekosten aanzienlijk verlaagd.

Er zijn aanwijzingen dat korte ketens beter in het bacterielichaam van Bifidus opgenomen kunnen worden dan lange. De door middel van de werkwijze volgens de uitvinding geproduceerde oligosaccharidemengsels zullen daarom een hoger bifidogeen effect hebben.

Voor de selectie van een gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosac-charide kan gezocht worden in elk mogelijk organisme, dat fructosyltransferase-activiteit bevat, bijvoorbeeld micro-organismen, zoals bacteriën, of planten. Van veel micro-organismen is bekend dat zij fructosyltransferasen bevatten die het vermogen hebben fructanen te produceren uit sucrose. Deze enzymen dragen fructose-eenheden over van sucrose naar een fructaanacceptormolekuul. Gewoonlijk produceren microbi-ele fructosyltransferasen fructanen met een hoge DP. Het gebruik van een aantal fructosyltransferasen voor het vervaardigen van transgene planten voor de produktie van dergelijke polysacchariden is reeds in de literatuur beschreven. Zo is het bekend dat door de inbouw van het SacB-qen van Bacillus subtilis in planten het fructaanpatroori van die planten gemodificeerd kan worden (WO 89/12386). Het betreft hier echter steeds de produktie van hoogmolekulaire polysacchari-den.

Een ander gen waarvan bekend is dat het codeert voor een fructosyltransferase, dat sucrose kan omzetten in hoogmolekulaire fructanen is het ftf-gen van Streptococcus mutans. Volgens de onderhavige uitvinding is nu echter verrassenderwijs gevonden dat dit fructosyltransferase naast hoogmolekulaire fructanen tevens belangrijke hoeveelheden oligosacchariden in de trisaccharideklasse (1-kestose) produceert. Daarnaast zijn er mutanten gevonden, die alleen maar trisacchariden accumuleren en geen polysacchariden.

Verder zijn er mutanten van het SacB-aen van Bacillus subtilis bekend die eveneens voornamelijk trisacchariden produceren.

Een groot aantal andere micro-organismen is eveneens in staat tot fructosyltransferaseproduktie. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot endospore-vormende staafbac-teriën en coccen (bijvoorbeeld Bacillus), gram-positieve coccen (bijvoorbeeld Streptococcus), gram-negatieve aerobe staafbacteriën en coccen (bijvoorbeeld Pseudomonas. Xantho-monas. Azotobacter) gram-negatieve facultatief anaërobe staafbacteriën (bijvoorbeeld Erwinia. Zvmomonas), actinomy-ceten (bijvoorbeeld Actinomvces. Rothia) en cyanobacteriën (bijvoorbeeld Tolvpothrix tenuis).

De genen die coderen voor deze fructosyltransfe-rasen kunnen eventueel door gerichte of random mutagenese-technieken gemodificeerd worden teneinde enzymen te verschaffen die de gewenste oligosaccharide-synthetiserende enzymatische eigenschappen bezitten.

Bacteriële fructosyltransferases hebben een relatief lage KM voor sucrose, ongeveer 20 mM. De sucroseconcen-traties in de meeste planten is aanzienlijk hoger en derhalve zullen deze enzymen ook in planten aktief zijn. Een belangrijke eigenschap van bacteriële fructosyltransferase is hun activiteit bij lage temperaturen tot 0°C. Planten komen vaak in aanraking met deze temperaturen maar zelfs onder die omstandigheden zullen de bacteriële enzymen nog aktief zijn.

Fructosyltranferasen kunnen ook van plantaardige oorsprong zijn. In planten treedt de biosynthese en afbraak van fructaan slechts bij een beperkt aantal soorten op. Voorbeelden zijn de Asteraceae, Liliaceae en Poaceae families. Uitgaande van de bekende plantaardige fructosyltrans-ferasen kunnen hetzij door gerichte of random mutagenese, hetzij door selectie van reeds van nature voorkomende mutanten, de voor de onderhavige uitvinding geschikte genen geïsoleerd of vervaardigd worden.

Een voorbeeld van een zeer geschikt plantaardig fructosyltransferase is het sucrose-sucrose-fructosyltrans-ferase (SST) dat in verschillende planten voorkomt en met name de synthese van trisacchariden katalyseert.

Voor expressie in planten van het geselecteerde fructosyltransferasegen kunnen transcriptie-initiatie-signa-len, zoals promotoren, enhancers en dergelijke, aan het gen toegevoegd worden ter verkrijging van het gewenste expres-sieconstruct. Dergelijke expressiepromotoren kunnen specifiek zijn voor een speciaal celtype of kunnen aktief zijn in een ruime verscheidenheid aan celtypen. Daarnaast kunnen het tijdstip en de plaats van expressie bepaald worden door gebruik van bijvoorbeeld ontwikkelingsspecifieke promotoren. Een algemeen gebruikte promotor voor genexpressie in planten is de 35S Bloemkool Mozaïek Virus Promotor (CaMV promotor) die aktief is in vele celtypen in de plant onafhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de plant. Wanneer het fructosyltransferasegen afkomstig is uit een plant is het ook mogelijk zijn eigen regulatoire sequenties te gebruiken.

De voorkeurspromotor kan een weefselspecifieke of constitutieve promotor zijn, sterk of zwak, afhankelijk van doelplant en doel. Voorbeelden van geschikte promotoren zijn de "sink"-specifieke patatinepromotor en de korreIgebonden zetmeelsynthasepromotor van de aardappel, of de sporamine-promotor van de zoete aardappel.

Voor het verder verhogen van transcriptieniveaus kan de promotor gemodificeerd zijn en een enhancerduplicatie bevatten.

De translatie van de mRNA's kan verbeterd worden door het toevoegen van een translationele enhancer, zoals het Alfalfa Mozaïek Virus RNA4 translatie enhancersignaal, dat aanwezig moet zijn in het getranscribeerde 5' niet-ge-transleerde gebied.

Voor juiste terminatie van transcriptie kan een terminatorsequentie toegevoegd te worden aan de constructen. Een voorbeeld van een dergelijk sequentie is de nopaline synthasegen terminatiesequentie.

Uiteraard ligt de keuze van voor een specifieke situatie geschikte expressiesignalen binnen het bereik van de gemiddelde vakman, zonder dat daarvoor verdere inventieve arbeid verricht dient te worden.

Sucrose, het substraat voor de fructosyltransfe-rasen, is een koolhydraat dat op vele verschillende lokaties aanwezig is. Het wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma en daarnaast kunnen belangrijke hoeveelheden gevonden worden in cytosol, vacuole en de extracellulaire ruimte (de apo-plast) of mogelijk andere plaatsen.

Aangezien biochemische processen in plantecellen eveneens vaak beperkt zijn tot een enkele of een aantal cellulaire compartimenten is het wenselijk de accumulatie van de produkten van de nieuw-geïntroduceerde genen in een specifiek compartiment te doen plaatsvinden. Daartoe kunnen targettingsequenties die specifiek zijn voor cellulaire compartimenten aanwezig zijn in het expressieconstruct nabij het coderende gedeelte van de fructosyltransferase-genen, die tot expressie gebracht worden in de transgene planten.

Er zijn reeds eerder specifieke aminozuurgebieden voor de targetting naar de verschillende cellulaire lokaties geïdentificeerd en geanalyseerd. Deze DNA-sequenties kunnen gekoppeld worden aan de fructosyltransferasegenen zodanig dat de enzymatische activiteit naar een gewenst compartiment van de cel of de plant gestuurd wordt.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding omvat het expressieconstruct derhalve eveneens een targe-ttingsequentie voor het richten van de fructosyltransferase-activiteit naar één of meer specifieke plantecelcomparti-menten. Voorbeelden van voorkeurstargetting zijn de signaal-sequentie en vacuolaire targettingsequentie van het carboxy-peptidase Y fcovï -gen, die van patatine uit de aardappel of die van sporamine uit de zoete aardappel of de signaalse-quentie en apoplastische targettingsequentie van het patho-genese-gerelateerde eiwit S-gen fpr-sl. Dit zijn echter voorbeelden en de vakman zal zelf in staat zijn andere targettingsequenties te selecteren.

In principe kan het expressieconstruct zodanig gemodificeerd worden dat targetting naar elk willekeurig celcompartiment, zoals de vacuole, plastiden, celwand, cytoplasma etc., plaatsvindt.

Vaak is het voordelig voor de plant niet slechts de lokatie maar eveneens het tijdstip van expressie van de geïntroduceerde genen te beheersen. Het is bijvoorbeeld gewoonlijk gewenst de expressie van de nieuw-geIntroduceerde enzymatische aktiviteiten te beperken tot specifieke delen van de plant, bijvoorbeeld oogstbare organen zoals knollen, vruchten of zaden. Bovendien is het vaak gewenst expressie in deze organen in een bepaald ontwikkelingsstadium te initiëren. Dit is zeker het geval wanneer de expressie van de geïntroduceerde genen interfereert met normale ontwikkeling van dergelijke organen.

De oligosacchariden volgens de uitvinding kunnen gebruikt worden als vervanger van suiker, glucosestroop en isoglucose in nlightn-versies van verschillende voedingsmiddelen. Voorbeelden van voedingsmiddelen zijn snoep, koekjes, gebak, zuivelprodukten, babyvoeding, roomijs en andere desserts, chocolade en dergelijke. De stimulatie van Bifidobacteriën is ook belangrijk voor de gezondheid van dieren. De oligosacchariden volgens de uitvinding kunnen derhalve bijvoorbeeld ook toegepast worden in veevoer.

De onderhavige uitvinding zal verder worden verduidelijkt aan de hand van de onderstaande voorbeelden, welke slechts gegeven zijn ter illustratie van de uitvinding en niet de bedoeling hebben deze op enigerlei wijze te beperken. In de voorbeelden wordt verwezen naar de bijgaande figuren die het volgende tonen:

Figuur 1 toont de oligosaccharide-producerende aktiviteit van wildtype en gemodificeerde vormen van het Streptococcus mutans fructosyltransferase fftfl dat geïncu-beerd is met sucrose en geanalyseerd op TLC zoals beschreven door Cairns, A.J. en Pollock, C.J., New Phytol. 109, 399-405 (1988). Monsters van kweken die waren afgeleid van kolonies en gezuiverde eiwitten werden overnacht geïncubeerd met 200 mM sucrose in 50 mM natriumfosfaatbuffer met 1% Triton X-100 bij 37°C. Laan 1 toont de reactieprodukten van een £. mutans-kweek: laan 2 toont de aktiviteit van het gezuiverde enzym uit £. mutans: laan 3 toont de aktiviteit van een £. coli-steun die het plasmide pTS102 in zich draagt; laan 4 toont de aktiviteit van een £. coli-stam die plasmide pTD2 in zich draagt; laan 5 toont de aktiviteit van een £. coli-cel die getransformeerd is met het rijpe £. mutans fructo-syltransferasegen onder de regulatie van een £. coli-promo-tor. De gebruikte oligosaccharidestaandaards zijn in laan A een extract van een Allium cepa bol, en in laan H een extract van een Helianthus tuberosus knol. In de figuur staat F voor fructose, G voor glucose, S voor sucrose (disacchari-de) , N voor neokestose (F2-6G1-2F, trisaccharide), I voor 1-kestose (G1-2F1-2F, trisaccharide), K voor kestose (G1-2F6-2F, trisaccharide). Hogere oligosacchariden (DP « 4-9) zijn eveneens aangegeven.

Figuur 2 toont de TLC-analyse van transgene tabaksplanten (KZ) die het fructosyltransferase gen van £. mutans tot expressie brengen. In deze planten accumuleren oligosacchariden. Laan H toont als controle een extract van een Helianthus tuberosus knol.

Figuur 3 toont de SDS-PAGE-gel van gezuiverd SST uit uienzaad. Op deze door middel van zilverkleuring gekleurde gel was 6én enkele band in het SST-monster zichtbaar. M staat voor molecuulgewichtsmerkers waarbij hun grootte staat aangegeven in kilodaltons (kD).

Figuur 4 toont de reactieprodukten van gezuiverd SST uit uienzaad, dat geïncubeerd is met sucrose (lanen 4 en 5: Q-in vitro). Er worden slechts trisacchariden gevormd. Laan 1 toont het extract van tulpenstengels (T), laan 2 het extract van Helianthus tuberosus knollen (H), laan 3 toont het extract van een Allium cepa bol (O). M staat voor mono-saccharide, S voor sucrose (disaccharide), N voor neokestose (F2-6G1-2F, trisaccharide), I voor 1-kestose (G1-2F1-2F, trisaccharide). Hogere oligosacchariden (DP4-5) staan eveneens aangegeven. De produkten werden geanalyseerd op TLC zoals beschreven door figuur 1.

VOORBEELD 1

Het selecteren van een oen.

1. Van nature voorkomende genen.

Een groot aantal microben werd gescreend op hun vermogen oligosacchariden uit sucrose te produceren.

Daartoe werden overnacht in een vloeibaar voedingsmedium bacteriekweken gegroeid. De oligosaccharide-producerende activiteit werd bepaald door een monster van de kweek te incuberen met 200 mH sucrose in de aanwezigheid van 0,1% Triton X-100. De reactieprodukten werden gescheiden door middel van TLC en zichtbaar gemaakt met behulp van een fructose-specifiek reagens (Cairns, A.J. en Pollock, C.J., New Phytol. 109, 399-405 (1988)). Als resultaat van deze screening werd gevonden dat Streotococcus mutans een effectieve producent van oligosacchariden is (zie figuur 1). De oligasaccharide-producerende enzymatische activiteit werd gezuiverd uit de Streptococcus mutans-kweek door middel van DEAE-ionenwisselaarschromatografie en gelpermeatiechromato-grafie. Hieruit bleek dat de enzymatische activiteit werd veroorzaakt door het produkt van het ftf-aen dat eerder reeds beschreven is door Shiroza en Kuramitsu, (J. Bacterιοί, 170, 810-816 (1988)).

Vervolgens werd het fructosyltransferase fftf) gen uit plasmide pTS102 (Shiroza en Kuramitsu suoraï als een

EcoRV-BglII-fragment in de meervoudige kloneringssite van pEMBL9 (Dente et al., Nucl. Acids Res. 11, 1645-1655 (1983) gekloneerd en tot expressie gebracht vanaf de lacZ promotor die in dit plasmide aanwezig is. Daarna werd hiermee £. coli getransformeerd. Hierdoor wordt de bacterie in staat gesteld oligosacchariden te produceren.

De produktie van oligosacchariden werd aangetoond door middel van de hierboven reeds genoemde screeningsmetho-de. Niet-getransformeerde £. coli produceert geen oligosacchariden uit sucrose.

2. Gemuteerde genen.

Door middel van mutagenese is het mogelijk de oligosaccharide-producerende activiteit van het enzym naar behoefte aan te passen. Mutaties in het gen kunnen bijvoorbeeld op de hierna volgende wijze bewerkstelligd worden.

Voor mutagenese van het ftf-qen van Streptococcus mutans werd het plasmide pTS102 geïntegreerd in het genoom van Svnechococcus sp. PCC 7942 (R2-PIM9) door middel van het genomische integratiesysteem (Van der Plas et al., Gene 95, 39-48 (1990)), hetgeen resulteerde in steun R2-PTS. Deze cyanobacterie R2-PTS-stam brengt het fructosyltransferasegen tot expressie. De R2-PTS-stam is sucrosegevoelig door poly-meeraccumulatie in het periplasma. Een R2-PTS-kweek werd gemuteerd met N-methyl-N' -nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) die puntmutaties (T -* C en G -* A mutaties) induceert. Mutanten met een veranderde fructosyltransferase-activiteit werden geselecteerd. De door middel van MNNG gemuteerde kweek werd uitgeplaat op sucrosebevattend medium en een totaal van 400 sucroseresistente kolonies werd getest op een veranderde fructosyltransferase-activiteit.

Van deze kolonies werden R2-PTS-kweken afgeleid die geconcentreerd werden door middel van centrifugatie. De zo verkregen pellets werden geresuspendeerd in 50 mM natri-umfosfaatbuffer met 1% Triton X-100, 200 mM sucrose en overnacht geïncubeerd bij 37°c. De reactieprodukten werden geanalyseerd door middel van TLC-analyse (Cairns en Pollock supra). De TLC werd driemaal ontwikkeld in 85:15 aceton:wa ter en vervolgens behandeld met ureumnevel zoals beschreven door Wise et al., Analytical Chemistry 27, 33-36 (1955).

Deze methode kleurt bij voorkeur fructose en fructosebevat-tende polymeren.

Van de mutanten die in hoofdzaak trisacchariden produceren werd er één uitgekozen voor het in vitro aantonen van de enzymatische oligosaccharide-vormende activiteit van het gemuteerde ftf-qen op de hierboven beschreven wijze.

Volgens de Uitvinding kunnen eveneens andere mutagenesemethoden (plaatsgericht of random) en genen, die coderen voor fructosyltransferases uit andere organismen, gebruikt worden voor het selecteren van een gen voor een mutant oligosaccharide-producerend eiwit.

▼OORBEELD 2

Expressie yan het ftfraen in planten.

A. Constructie van 35S-ftf-NOS in een plantetransformatie-vector

Het plasmide pM0G18 dat een plantspecifieke 35S-promotor met een enhancerduplicatie en sequenties die de translaties van mRNA stimuleren bevat, is beschreven door Symons et al. (Bio/Technology 8, 217-221 (1990)). Het bevat het 35S-promotor-uidA-gen-N0S-terminatorconstruct. Een pBluescript II SK-plasmide van Stratagene (San Diego, CA, U.S.A.) waaruit de interne BamHI-plaats verwijderd was door knippen met BamHI en het invullen van de overhangende uiteinden met Klenow en opnieuw ligeren, werd gebruikt voor verdere klonering. Het 35S-uidA-N0S-fragment werd verkregen door digestie met EcoRI en HindlII van pMOG18 en werd in dit BamHI-pBluescript gekloneerd in de overeenkomende EcoRI/Hin-dlll-plaats resulterend in plasmide pPA2. Plasmide pPA2 werd gedigesteerd met Ncol en BamHI en het vectorbevattende fragment werd geïsoleerd.

Het fructosyltransferasegen ftf werd uit het plasmide pTSl02 (zie boven) als een EcoRV/BglII-fragment gekloneerd in de meervoudige kloneringssite van pEMBL9. Hiervoor werden de compatibele Smal- en BamHI-plaatsen gebruikt. Dit resulteerde in het plasmide pTA12.

Teneinde een Ncol-plaats nabij de rijpe proces-singssite van het ftf-oen (nucleotidepositie 783) (J. Bacte-riol. 170, 810-816 (1988)) te verkrijgen werd plaatsgerichte mutagenese uitgevoerd zoals beschreven door Kramer et al. (Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)) met het volgende oligonucleotide: 5 · -GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3 ·. Hieruit resulteerde piasmide pTD2. Hierdoor wordt op amino-zuurpositie +1 (nucleotidepositie 783) ten opzichte van de rijpe processingssite een glutamine veranderd in een methio-nine. Het NcoI/Pstï-fragment waarin de sequentie die codeert voor het rijpe fructosyltransferase aanwezig is werd gebruikt voor verdere klonering. Uit dit plasmide werd het ftf-aen geïsoleerd als een NcoI/Pstl-fragment en dit fragment werd geligeerd in het pPA2-vectorbevattende fragment dat boven beschreven is. Dit resulteert in plasmide pTX. pTX bevat het 35S-ftf-NOS-fraament waarin ftf het rijpe fructo-syltransferasegen zonder zijn signaalsequentiegebied weergeeft. pTX werd gedigesteerd met Xbal en HindlII, het fragment dat het volledige construct (35S-ftf-N0S) bevatte werd gekloneerd in de Xbal/HindiII-knipplaats van pMOG23 (Symons et al., suprai een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids. Res. 12, 8711-8721). Dit resulteerde in plasmide pTZ.

B. Vervaardiging en analyse van transgene planten die het rijpe ftf-gen tot expressie brengen

Het pTZ-plasmide werd geconjugeerd in Aorobacteri-um tumefaciens LB4404 (Hoekema et al., Nature 303, 179-180 (1983)) in een driepuntskruising met gebruikmaking van het helperplasmide pRK2013 (Lam, Plasmid 13, 200-204 (1985)).

Het construct werd geïntroduceerd in Nicotiana tabacum var. Petit Havanna (SRI) met behulp van de bladschijftransformatiemethode (Horsch et al., Science 227, 1229-1232 (1985)).

De geregenereerde planten werden KP-planten genoemd en werden geselecteerd op kanamycineresistentie en gekweekt op MS-medium (Murashige en Skoog, Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962)). Daarna werden de planten op aarde gegroeid in de kas en geanalyseerd.

Het bladmateriaal werd afgesneden en gemalen in een eppendorfbuisje. Na centrifugatie (2 minuten bij 16.000 rpm) werd 1 μΐ supernatant geanalyseerd op TLC zoals beschreven in voorbeeld 1.

Er werden nooit oligosacchariden gevonden in wildtype planten of in planten die getransformeerd waren met niet-verwante constructen. De screening van de transformanten toonde met behulp van deze methode oligosaccharide-accu-mulerende planten aan (zie figuur 2). De expressieniveaus varieerden tussen individuele planten die getransformeerd waren met hetzelfde construct. Dit is een normaal verschijnsel bij transformatie-experimenten in planten. De variatie van de express ieniveaus hangt in hoofdzaak af van de inte-gratieplaats in het genoom (positie-effect).

▼OORBEELD 3

Oliqosaccharide-producerend enzvm uit een plant

Naast de hierboven gebruikte fructosyltransferase-genen die afkomstig waren uit micro-organismen worden dergelijke enzymen eveneens door planten geproduceerd. In dit voorbeeld wordt het SST-gen uit uienzaad gebruikt.

Het SST-eiwit uit uienzaad werd gezuiverd door chromatografische procedures met gebruikmaking van het volgende protocol. Het zaad werd bij 22°C geïncubeerd tussen vochtige doeken gedurende 2 tot 3 dagen en gehomogeniseerd in 50 mM fosfaat-citraatbuffer met een pH van 5,7. Het zetmeel en debris werden afgecentrifugeerd bij ongeveer 10.000 g gedurende 10 minuten. Aan het supernatant werd ammonium-sulfaat toegevoegd tot 20% en het precipitaat verzameld door centrifugatie. De concentratie ammoniumsulfaat in het supernatant werd verhoogd tot 80% en het precipitaat verzameld en opgelost in 20 mM NaAc pH 4,6. De oplossing werd overnacht gedialyseerd met drie bufferwisselingen (20 mM NaAc) en de oplossing geklaard door centrifugatie. Het supernatant werd op een FPLC monóS-kolom gebracht en gèëlüeerd in 20 inM NaAc pH 4,6 net een 0-0,5 M NaCl-gradiënt. Na overnacht dialyse tegen 10 nM NaAc pH 5,6 werd de oplossing opgebracht op een raf f inose-epoxysepharosekolom (Pharmacia), die geëquili-breerd was in 10 nM NaAc pH 5,6. Elutie vond plaats net een lineaire gradiënt die bestond uit 10 mM NaAc pH 5,6 (buffer A) en 10 nM fosfaat-citraatbuffer, pH 7,0, plus 0,5 M NaCl-buffer (buffer B). De aktieve fracties werden overnacht gedialyseerd tegen 20 mM fosfaat-citraatbuffer, Ph 7,0, en op een monoQ FPLC-kolom gebracht in 20 mM fosfaat-citraatbuffer, pH 7,0. De kolom werd geëlueerd net een gradiënt van 0-0,5 M NaCl. Voor een uiteindelijke zuivering werd het eiwit opgebracht op een Sepharose 6-kolom en geëlueerd met 50 nM fosfaatbuffer, pH 6,5, 1% Triton X-100. De zilverkleu-ring van een SDS-PAGE-gel van gezuiverd SST uit uienzaad onthulde slechts één band met een nolekuulgewicht van ongeveer 68.000 d (zie figuur 3).

Wanneer dit gezuiverde SST geïncubeerd werd net sucrose werd slechts 1-kestose geproduceerd. Er werd geen significante invertase-aktiviteit waargenomen (zie figuur 4).

Van het gezuiverde eiwit werd de aminozuursequen-tie bepaald aan de hand van door gedeeltelijke afbraak verkregen peptiden. Op basis van deze informatie werden PCR-probes ontworpen waarmee het gen dat codeert voor het SST van uienzaad geïsoleerd werd. Op dezelfde wijze als beschreven in de voorbeelden 1 en 2 werd hiermee zowel in vitro als in vivo aangetoond dat het gen codeert voor een enzym dat in staat is oligosacchariden te produceren.

VOORBEELD 4

Toepasbaarheid bii andere olantesoorten

Teneinde de algemene toepasbaarheid van de technologie te illustreren werd het ftf-construct. dat beschreven is in voorbeeld 2, geïntroduceerd in verschillende gewassen. Zo werd de aardappel getransformeerd volgens de methode beschreven in Visser, Plant Tissue Culture Manual B5, 1-9,

Kluwer Academie Publishers, 1991. De resulterende transgene planten accumuleerden oligosacchariden in elk getest orgaan. Daarnaast werd hetzelfde construct geïntroduceerd in de biet (Bèta vulqaris L.) die getransformeerd werd zoals beschreven door D'Halluin et al., Biotechnology 10, 309-314 (1992). De resulterende transgene bietenplanten accumuleerden belangrijke hoeveelheden oligosacchariden in bijvoorbeeld hun bladeren en wortels. Dezelfde constructen werden geïntroduceerd in Brassica nanus L. welke getransformeerd werd volgens Block et al., Plant Physiol. 91, 694-701 (1989). De resulterende transgene planten accumuleerde belangrijke niveaus aan oligosacchariden in bijvoorbeeld hun bladeren en ops lagorganen. Het is uiteraard niet noodzakelijk dat de planten op de aangegeven wijzen getransformeerd worden. Ook andere binnen het bereik van de vakman gelegen methoden kunnen gebruikt worden.

Voorbeelden van andere plantensoorten die gemodificeerd kunnen worden omvatten maar zijn niet beperkt tot mais (Zea mavs L.), tarwe (Triticum aestivum L.), gerst (Hordeum vulaare L.), rijst (Orvza sativa L.), sojaboon (Glvcin max L.), erwt (Pisum sativum L.), boon (Ehass&lMS vvlqgurig L.), witlof (Cichorium intvbus L.), suikerriet (Saccharum officinarum L.), zoete aardappel (Dioscorea esculenta L.), cassave (Manihot esculenta L.) en grassen (bijvoorbeeld Lollum spp., £s& spp. en Festuca spp.).

Planten met natuurlijke of geïnduceerde gemodificeerde koolhydraatscheidingspatronen kunnen voorkeursdoe1-planten zijn voor de introductie van oligosaccharide-synthe-tiserende genen. Dergelijke planten omvatten maar zijn niet beperkt tot natuurlijke mutanten in zetmeel- en sucrosemeta-bolisme, en planten waarin het zetmeel- en sucrosemetabolisme gemodificeerd zijn door middel van moleculaire en genetische technieken bijvoorbeeld zoals beschreven in Sonnewald en Willmitzer, Plant Physiology 99, 1267-1270, (1992).

VOORBEELD 5

Gebruik van de oliaosacchariden volgens de uitvinding - 'i' '··.·* : -

De oligosacchariden die geproduceerd zijn met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding kunnen worden toegepast als suikervervangers in verschillende produkten. Hieronder wordt hiervan een drietal voorbeelden gegeven.

1. Roomijs

Van de volgende ingrediënten wordt roomijs bereid: 635 delen water 90 delen botervet 100 delen mager melkpoeder 170 delen oligosacchariden volgens de uitvinding 5 delen Cremodan SE30™ (Grindsted) 0,3 delen Aspartaam™ aroma's naar behoeven.

Het melkpoeder wordt opgelost in het water. Het geheel wordt verwarmd tot 40-45 °C. De overige droge ingrediënten worden gemengd en opgelost in de warme melk. Vervolgens wordt de gesmolten boter toegevoegd. Dit geheel wordt dan gedurende 10 minuten bij 72°C gepasteuriseerd. Daarna wordt het mengsel gehomogeniseerd in een twee-traps homogenisator bij 150/35 bar. De zo verkregen ijsmix wordt snel afgekoeld tot 5°C en vervolgens laat men het geheel minimaal 4 uur rijpen bij 5°C. Tenslotte wordt de ijsmix belucht en bevroren tot een overrun van 100%.

Na harden bij -35°C en opslag bij -20eC wordt een ijs verkregen, dat qua smaak en textuur overeenkomt met roomijs dat bereid is met natuurlijke suikers (saccharose, glucosestroop).

2. Mueslireep

Van de volgende ingrediënten werd een mueslireep bereid: 28 delen oligosacchariden volgens de uitvinding 68 delen mueslimix 4 delen cacao

Van de oligosacchariden werd door verwarming een stroop vervaardigd welke met de andere ingrediënten vermengd werden. In een cilindrische pers werden van het zo verkregen mengsel de repen gevormd. De reep is door het ontbreken van natuurlijke suiker veel calorie-armer dan de conventionele repen.

3. Frisdrank

Van de volgende ingrediënten wordt een frisdrank bereid: 90 delen water of vruchtesap 8-10 delen oligosacchariden volgens de uitvinding kunstmatige zoetstof(fen) aroma's en kleurstoffen voedingszuur koolzuur

Alle ingrediënten worden opgelost in een gedeelte van het water. Vervolgens wordt het resterende water als koolzuurhoudend water toegevoegd. De energiewaarde van de frisdrank is, doordat geen extra natuurlijke suikers zijn toegevoegd, veel minder.

Claims (18)

1. Werkwijze voor het produceren van oligosaccha-riden, omvattende de stappen: a) het selecteren van een gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosac-charide; b) het koppelen van het gen aan geschikte trans-criptie-initiatie- en transcriptie-terminatiesignalen voor het verschaffen van een expressieconstruct; c) het met het expressieconstruct transformeren van een geschikte plantecel; d) het uit de getransformeerde plantecel regenereren van een transgene plant; e) het kweken van de transgene plant onder omstandigheden die de expressie en activiteit van het enzym mogelijk maken; en f) het uit de transgene plant isoleren van de oligosacchariden.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide van microbiële oorsprong is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide het ftf-aen van Streptococcus mutans of een gemuteerde versie daarvan is.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide het sacB-aen van Bacillus subtilis of een gemuteerde versie daarvan is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide van plantaardige oorsprong is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide een sucrose-sucrose-fructosyltransferase is.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het sucrose-sucrose-fructosyltransferase afkomstig is van de ui.

8. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het expressieconstruct verder ten minste één targettingsignaalsequentie omvat.

9. Oligosacchariden te verkrijgen door het transformeren van een plaiitecel met een gen dat codeert voor een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide; het uit de getransformeerde plantecel regenereren van een transgene plant; het kweken van de transgene plant onder omstandigheden die de expressie en activiteit van het enzym mogelijk maken; en het uit de transgene plant isoleren van de oligosacchariden.

10. Oligosacchariden volgens conclusie 9, gekenmerkt door de algemene formule GBFn, waarbij G staat voor glucose en F voor fructose en waarbij m is gelijk aan 0 of 1 en n een geheel getal is van groter of gelijk aan 0, bij voorkeur is m gelijk aan 1 en varieert n van 2 tot 8, bij voorkeur is n gelijk aan 2 of 3.

11. DNA-construct voor het tot expressie brengen van een enzym dat in staat is sucrose om te zetten in een oligosaccharide in een plant of plantecel, omvattende een gen dat codeert voor het enzym, in leesraam gekoppeld aan plantspecif ieke transcriptie-initiatie- en terminatiesigna-len.

12. Transgene plantecel, omvattende het DNA-con-struct volgens conclusie 11.

13. Transgene plant, te produceren door regeneratie uit een transgene plantecel volgens conclusie 12.

14. Transgeen planteweefsel, afkomstig van een plant volgens conclusie 13.

15. Gebruik van het oligosaccharide volgens conclusie 9 of 10 als suikervervanger in voedingsmiddelen.

16. Gebruik van het oligosaccharide volgens conclusie 9 of 10 als voedingsvezel in voedingsmiddelen.

17. Gebruik van het oligosaceharide volgens conclusie 9 of 10 als bifidogeen middel in voedingsmiddelen.

18. Gebruik van het oligosaccharide volgens conclusie 9 of 10 als bifidogeen middel in veevoer.