JPH05502591A

JPH05502591A - 炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物

Info

Publication number: JPH05502591A
Application number: JP3517456A
Authority: JP
Inventors: ファン　デン　エルゼン　ペーテル　イェー　エム; ヤンペン; アンドレアスフッケマ; セイモンス　ペーテル　クリスチャーン; オーイェンアルベルトイェーイェーファン; リートヴェルト　クレイン; クアックス　ウィルヘルムス　ヨハネス
Original assignee: ギスト　ブロカデス　ナムローゼ　フェンノートシャップ; シンヘンタ　モーヘン　ベースローテン　フェンノートシャップ
Priority date: 1990-09-13
Filing date: 1991-09-13
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2022-06-27
Also published as: IL99482A0; AU8651491A; PT98967A; DE69130698T2; EP0479359B1; IE913215A1; US20060195940A1; CA2072656C; NZ239789A; ATE175238T1; IL99482A; JP3938402B2; AU656920B2; DK0479359T3; DE69130698D1; EP0479359A1; WO1992005259A1; PT98967B; CA2072656A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物（関連分野）本発明は炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物の開発に関する。

（関連技術）炭水化物の組成が変化した穀物を開発し、特定の用途により適した植物または植物器官を提供することは古くから農業の目標となっている。このような改良植物は、風味が良くなり、望ましい糖分の含量が高く、および、またはより望ましい構造の植物産物を提供する。これらの穀物は直接消費するか、または、さらに処理してから使用する。

トウモｏコシ（シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）およびガーウノド（Ｇａｒｗｏ。

ｄ）、１９８４）、エントウ（バタカリャ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ）等、１９９０＞、ジャガイモ（ホーベンカンブーハーメリンク　（Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅ　ｒｍｅ　ｌ　ｉ　ｎ　ｋ）等、１９８７）、アラビドプシス（キャスバー（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８５；リン化ｉｎ）等、１９８８ａ；リン化ｉｎ）等、１９８８ｂ）およびタバコ（ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）等、１９８８）等のいくつかの植物種ては、炭水化物組成が変化した変異体が発見されている。この現象は主に澱粉の合成の調節に関連する酵素における突然変異に起因する。これらの変異体のうちのいくつかは、直接消費しつるスィートコーン（シャノン（Ｓ　ｈ　ａ　ｎｎｏｎ）およびガーウッド（Ｇａ　ｒｗｏｏｄ）　、上述）など食品工業で既に使用されている。

澱粉代謝が変化した変異体は、ランダムスクリーニング操作や育種など古典的手法を用いて得ることが出来る。しかし、これらの方法は煩雑で長時間を必要とする。さらに、育種は、スクリーニングする表現型を与えることが可能であるが、他の望ましい特性の損失や、望ましくない特性（高アルカロイド含量のジャガイモ等）の誘導を起こす可能性がある。遺伝子工学による植物の特性の変化は、精密で予測可能な方法であり、ゲノムのスプライスされる遺伝子の性質は分かっていて望ましくない遺伝子が同時に組み込まれることはない。最後に、古典的手法を用いた特定の特性の変化、例えば変異体における特定の産物のレベルまたは性質の変化は困難である場合が多く、出来ないこともある。遺伝子的技術は新しい戦術を提供し、従来の方法で得ることが出来なかった産物を生じることが可能になった。

遺伝子工学に基づき、炭水化物組成を改良した植物を得る巧妙で予測可能な方法を開発することが望ましいことは明白である。

アメリカ特許４．８０１．５４０には、ポリ　（１，４−α−Ｄ−ガラクトウロニド）グリカンをガラクトウロニン酸に加水分解しうる酵素をコードするＤＮＡフラグメントが公開されている。この酵素をコードする構造遺伝子を修正した調節領域に結合し、この酵素の発現を調節した発現構築物が提供されている。この文献に報告されている発明の目的は、ポリガラクトウロニン酸の分解を防ぎ、果実の成熟を調節するためにポリガラクトウロナーゼの発現レベルを減少させることにある。

ＰＣＴ出願Ｗ０　８９／１２３８６では、植物中でスクラーゼやレバンスクラーゼ等の酵素の発現を介して炭水化物含量を変えた植物とその方法が公開されている。この発明の目的は、果実中の高分子量炭水化物ポリマー濃度を高め、固形物の可溶性および粘度を変化させることにある。

ヨーロッパ特許出８４３Ｂ、９０４は、ホスホフラクトキナーゼ活性レベルを増加し、スクロースの有意な減少および塊茎に蓄積する糖の減少を招く植物代謝（特に塊茎における）の修正を報告している。

ＰＣＴ出ＨＷ０　９０／１２８７６は、遺伝子的に修正したジャガイモ植物のおける内在的α−アミラーゼ活性の調節について報告している。この公開は、還元糖がジャガイモを揚げているときにミラード反応を起こし、製品の風味や組織に有害な効果を引き起こすことから、ポテトチップの生産にはジャガイモα−アミラーゼ活性の低下、すなわち澱粉の還元糖への分解の低下が望ましいと報告している。一方、この公開は、もしもこの修正したジャガイモ塊茎を酒の生産を目的とした醗酵に用いるなら、より高いジャガイモα−アミラーゼ活性、すなわちより高い還元糖含量が望ましいことを報告している。

（発明の概要）本発明は、ポリサッカライド組成を変化させたトランスジェニック植物または植物器官、並びに該植物の生産方法を提供する。このことは、植物に植物のポリサッカライドを分解する酵素をコードするＤＮＡ配列を導入することによって行う。

また、本発明は、植物のトランスホーメーションに用いるＤＮＡ発現構築物およびベクターを提供する。この発現構築物は、選択されたポリサッカライド修正酵素の発現を指令しつる調節配列のコントロール下にある。また、これらの調節配列には、植物または植物器官、および、または組織の望ましい分化段階で特異的に選択された酵素の発現を指令しろる配列が含まれる。

さらに、植物における目的産物に依存して、植物に一つ以上の別の発現構築物が導入される事もある。これらの付加的発現構築物には、最初の酵素反応で生ずる分解産物を望ましいオリゴまたはモノサッカライドに転換する第二の酵素をコードするＤＮＡ配列が含まれる。

本発明により提供されるトランスジェニック植物は、味、固体含量および、または組織が改良された新しい産物としての用途がある。

（図面の簡単な説明）第１図　バイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３゜第２図　ベクターｐＰＲＯＭ５４中に存在するバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のゲノム配列。

第３図　種々の構築に使用する合成オリゴヌクレオチド二本鎖。

第４図　メチオニン翻訳開始コドンに続いてバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列を有するバイナリ−プラスミドｐＭＯＧ２３を含ムバイナリーベクターｐＭＯ０２２８゜第５図　メチオニン翻訳開始コドンに続き、ジャガイモ由来のクラス−■パタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌ　１ｕｓ　Ｉ　１ｃｈｅｎｉ　ｆｏｒｍｉｓ＞由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムＤＮＡ配列を有するバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３を含むバイナリ−プラスミドｐＭＯＧ４５０゜第６図　いずれもメチオニン開始コドンに続き、かついずれもジャガイモ由来のクラス−■バタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｒｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーゼおよびアスヘルギラスニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来の成熟グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列を存するバイナリ−ベクターを含むバイナリ−プラスミドｐＭＯＧ４３７゜（発明の詳細な説明）本発明は、植物にポリサッカライドを分解しつる特定の酵素をコードするＤＮＡ配列を安定に導入することにより、従来の植物育種法の問題点を克服してポリサンカライド組成を改良した植物または植物器官を提供する。

予想に反して、バクテリアα−アミラーゼ遺伝子（分泌シグナル配列を欠く）によるタバコのトランスホーメーンヨンは、α−アミラーゼ活性の指標であるマルトースやマルトトリオース等のマルトデキストリンを蓄積することが分かった。

この知見は、ポリサンカライド分解酵素をコードする遺伝子の導入および翻訳により、植物中のポリサッカライド組成を修正しうることを示している。

α−アミラーゼの導入による澱粉の分解は、植物細胞における澱粉合成の全過程が澱粉が貯蔵されている特定のオルガ不う（クロロプラスト、アミロブラストなど）で起こり、一方発現するα−アミラーゼは、これをそのようなオルガ不うに送る配列がないことから細胞質中に存在することが期待されるので非常に驚くべきことである。特定の澱粉分解酵素は、植物の葉細胞の細胞質中に存在する。

しかし、細胞質中でのそれらの機能はまだ解明されておらず、それら二つが仕切りで分断されていることから澱粉の分解との関連は分かっていない（キ寺スパー（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８９　；リン（Ｌ　ｉ　ｎ）等、１．９８８ａ、ｂおよびＣ：オキタ（Ｏｋｉｔａ＞等、１９７９）。

本発明における植物の味、および、または組織の変化の程度は、サツカライド修飾酵素の選択、目的の酵素の発現を目的とするＤＮＡ構築物の調節領域の選択および発現酵素の所定の細胞内部位への輸送を含む種々の手段で調節しつる。

目的酵素の選択が、目的の最終産物を得る上でもっとも重要であることは明白である。一つの植物中で一つ以上の酵素を発現したい場合は、各酵素の比を至適効果（例えば、甘味など）が得られるように選択すればよい。

また、発現レベルおよび発現の空間的（組！／器官特異的）および、または分化的調節に関する目的酵素の発現の調節も至適産物を得る手段である。たとえば、目的酵素の発現の時期および、または位置に関するプロモーターのタイプおよび強さは、そのトランスホーム植物の望ましい部位における目的酵素の至適レベルを提供する。

最後に、発現した酵素が送られる部位（例えば、細胞コンパートメントやオルガネラ）は、基質とより良く接近するなど至適効果が得られるように選択することが出来る。

トランスホームＤＮＡの組み込み部位やコピー数の違いにより発現レベルにしばしば違いが見られる。この自然のばらつきを用いて、甘味、組織等に関する望ましい特性を有するトランスジェニック植物から個々の植物を選択できる。これらの個々の植物は、別の特性を持つ植物種の増殖および、または育種に使用できる。

以上に示した特性を組み合わせて望ましい効果を得ることが出来る。また、以下に示す内容を用いて至適産物を得る方法が決定される。

本発明において、植物中で発現される目的の酵素には、植物のポリサッカライドを分解しつる酵素または酵素群の組み合わせが含まれる。特に、微生物由来のＤＮＡ配列によってコードされる酵素が好ましい。必要ならば、コード配列および、または調節配列を修正して、細胞質、またはオルガネラ発現組織特異性、または植物または植物器官の望ましい成熟段階における発現を誘導することが出来る。さらに、コドンを修正して選択した宿主植物における該遺伝子の発現を改良することが８来る。

本発明に使用しつる酵素には、ａ）１．）α−アミラーゼ（ＥＣ３，２，１，１）；２）アミログルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，３＞　、β−アミラーセ（ＥＣ３，２，１，２＞　、α−グリコンダーゼ（ＥＣ３，２，１，２０＞および他のエフソーアミラーゼ等のエフソー１．４−α−Ｄグルカナーゼ、および３）イソアミラーゼ（ＥＣ３，２゜１６幻、バルラナーゼ（ＥＣ３，２，１，，４１＞等の澱粉枝切り酵素；ｂ）エフソー１．４−β−セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３，２，１，９１）　、エフソー１．３−β−Ｄ−グルカナーセ（ＥＣ３，２，１，，３９）　、β−グルコシダーセ°（ＥＣ３，２，１，２１）等の七ルラ〜セ：ｃ）エンド−１，３−β−グルカナーセ（ＥＣ３，２，１，６＞およびエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３，２，１，、４）等のエンドグルカナーゼ。

ｄ）エンドル１，５−α−Ｌ−アラビノース（ＥＣ３，２，１，９９＞　、α− アラビノンダーゼ（ＥＣ３，２，１，５５＞等のし一アラビナーゼ：ｅ）エンド −１，４−β−Ｄ−ガラクタナーゼ（ＥＣ３，２，１，８９）　、エンド−１，３−β−Ｄ−ガラクタナーゼ（ＥＣ３，２，１，９０）　、α−ガラクトンダーセ（ＥＣ３，２，１，２２＞、β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３，２１、，２３）等のガラクタナーゼ：「）エンド−１，４−β−Ｄ−マンナナーゼ（ＥＣ３，２，１，７８）　、β− マンノシナーセ　（ＥＣ３，２，１，２５）　、α−マンノシダーゼ（ＥＣ３，２゜１．２４．）等のマンナナーセ：ｇ）エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＥＣ３，２，１，８）　、β−Ｄ−キジロンダーゼ（ＥＣ３，２，１，３７＞、１．３−β−Ｄ−キンラナーセ等のキシラナーゼ：ｈ）α−Ｌ−フコ／ダーセ（ＥＣ３，２，１，５１）　、α−Ｌ−ラムノンダーゼ（ＥＣ３，２，１，，４０＞　、ラベナーゼ（ＥＣ３，２，１，、６５）　、イヌラナーゼ（ＥＣ３，２，１，、７）等の他の酵素が含まれる。

さらに、場合によっては、本発明は、さらにポリサッカライド分解産物（第一ポリサンカライド分解酵素の作用で得られたもの）を望ましいサツカライドサブユニットに変化させつる第二の酵素をコードする一つ以上のＤＮＡ構築物の標的植物（宿主）への導入に関する。この第二の酵素は、微生物由来であるＤＮＡ配列にコードされる酵素であることが特に好ましい。

例として、澱粉の第一分解で得られるマルトース、マルｌ−トＩＪオースおよび α〜デキストリンをさらに分解しつる特に好ましい第二酵素には、マルターゼ、 α〜デキトリナーゼ、α−１，６−グルコシダーゼ等が含まれる。これらの酵素の作用でグルコースが生ｉする。

本発明の別の態様では、更にモノサッカライドを修飾しつる一つ以上の第二酵素を同植物中で発現させる。これらの酵素には、グルコースイソメラーゼ、インバーター七等が含まれる。

目的の酵素が発現もしくは指向する環境下で活性ならば、目的の酵素をコードするＤＮＡ配列の由来は問題にならない。第一（植物ポリサッカライド分解性）酵素および必要な場合は第二酵素の選択は、基質特異性および、または目的とするサツカライド最終産物に依存する。

目的の酵素は、トランスジェニック植物の分化のすべての段階で構成的に発現させることもできる。植物または植物器官の使用に依存して、この酵素は、例えば塊茎形成または果実分化の際など、分化段階特異的に発現させつる。さらに、その使用法に依存して、この酵素を例えば果実、塊茎、葉、または種子等の植物器官特異的に発現しうる。

本発明で定義される植物ポリサッカライドとは、本発明の酵素または酵素群の作用前に通常植物中に存在する結合する６個以上のモノサッカライドからなるポリヒドロキンアルデヒドまたはケトンを含むものである。これらのポリサッカライドは一般にＤ−アラビノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロースおよびマンノースのポリマーである。

本発明の望ましい最終産物であるサツカライドサブユニットとは、植物ポリサッカライドへの一つ以上の目的酵素の作用で得られるモノサッカライドを含む元のポリサッカライドよりも長さが短いサツカライドと定義される。

本発明で定義されるトランスジェニック植物には、組み換えＤＮＡ技術で遺伝子工学的に修正され目的の植物または植物器官中で少なくとも一つの目的酵素の生産を起こすかまたは増加した植物（該植物の一部および細胞も含む）およびそれらの子孫が含まれる。

本発明に使用しつる植物には、カリフラワー（ブラシカ　オレラ七（Ｂ　ｒ　ａ　５ｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ））、朝鮮アザミ　（ンナラ　スコリマス（Ｃｙ　ｎ　ａｒａ　ｓｃｏｌｙｍｕｓ））などの食用孔生産作物、リンゴ（マルス（ＭａｌｕＳ）、例えばドメスチカス（ｄｏｍｅｓ　ｔ　ｉ　ｃｕｓ））、バナナ（ムサ（Ｍｕｓａ）、例えばアクミナタ　（ａｃｕｍｉｎａｔａ）＞、ベリー（スグリ等、ライベス（Ｒｉｂｅｓ）、例えばラブラム（ｒｕｂｒｕｍ））、チェジー（スイートチェリー等、ブラナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、例えばアビウム（ａｖｉｕｍ））、キュウリ　（ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、例えばサチバス（ｓａ　ｔ　ｉ　ｖｕｓ）　）　、ブドウ（バイチス（Ｖｉｔｉｓ）、例えばビニフェラ（ｖｉｎｉｆｅｒａ））、レモン（シトラス　レモン（ｃｉｔｒｕｓ　ｌｉｍｏｎ））、メロン（ククミスメｏ（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ））、ナツツ（クルミ等、ノユグランス（Ｊｕｇｌａｎｓ）、例えばレジア（ｒｅｇｉａ）：ピーナッツ、アラキス　ヒボゲ（Ａｒａｃｈ　ｉ　ｓ　ｈｙｐｏｇｅａｅ））　、オレンジ（シトラス（Ｃｙｔｒｕｓ）、例えばマキンマ（ｍａｘ　ｉｍａ））　、モモ（ブラナス（Ｐｕｒｕｎｕｓ）、例えばバーシカ（ｐｅｒｓ　ｉ　ｃａ））　、ナン（バイラ（Ｐｙｒａ）、例えばコムニス（ｃ　ｏｍｍｕ　ｎ　ｉ　ｓ）　）　、コシヨウ（ソラナム（Ｓｏ　ｌ　ａｎｕｍ）　、例えばカブラカム（ｃａｐｓ　ｉ　ｃｕｍ））　、プラム（ブラナス（Ｐｒｕｎｕｓ）、例えばドメスチ力　（ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）Ｌストロベリル（フラガリア（Ｆｒａｇａｒｌａ）、例えばモスカタ　（ｍｏｓｃｈａｔａ＞）、トマト　（リコパーンコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、例えばエスクレンタム（ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））などの果実、アルファルファ　（メジカゴ（Ｍｃｄ　ｉ　ｃａｇｏ）　、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））、キャベツ（ブランカ　オリラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｏｌｅｒａｃｅａ＞等）、キクヂンヤ（シコレウム（Ｃｉ　ｃｈｏｒｅｕｍ）　、例えばエンジビア（ｅｎｄｉｖｉａ））、ニラ（アリウム（Ａｌｌｉｕｍ＞、例えばプラム（ｐｏ　ｒ　ｒｕｍ））　、レタス（ブランカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））、ホウレンソウ（スピナノア（Ｓｐｉｎａｃｉａ）、例えばオレラセ（ｏｌｅｒａｃｅａｅ））、タバコにコチアナ＜Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ）、例えばツバカム（ｔａｂａｃｕｍ））等の葉、アロールート（マラノタ（Ｍａｒａｎｔａ）、例えばアランジナセ（ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ））、砂糖大根（ベタ（Ｂｅｔａ）、例えばバルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ））、＝ンンン（ビーカス（Ｄａｕｃｕｓ）、例えばカロタ（ｃａｒｏｔａ））、カンサバ（マニポノト（Ｍａｎｉｈｏｔ＞、例えばエスクレノタ＜ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、カブラ（ブラシカ　（Ｂｒａｓｓ　ｉ　ｃａ）　、例えばラバ（ｒａｐａ））、ラテ゛イノンユ（ラファナス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、例えばサチバス（ｓａ　ｔ　ｉ　ｖｕｓ））　、ヤム（ジオスコリア（Ｄｉ　ｏｓｃｏｒｅａ）　、例えばエスクレンタ（ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、スィートポテト（イボモエアバタタス（ｒｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ））等の根、およびソラマメ　（ファセオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、例えばブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ））、エントウ（ビサム（Ｐｉｓｕｍ）、例えばサチバム（ｓａ　ｔ　ｉ　ｖｕｍ）　）　、ダイズ（グリシン（Ｇｌｙｃｉｎ）、例えばマックス（ｍａｘ））、小麦（トリチカム（Ｔｒ　ｉ　ｔ　ｉ　ｃｕｍ）　、例えばアスチバム（ａｅｓｔｉｖｕｍ＞）、大麦（ホーデン（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、例えばパルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ））、コーン（ジー（Ｚｅａ）、例えばマイス（ｍａｙＳ））、米（オリザ（○ｒｙｚａ）、例えばサチバ（ｓａｔｉｖａ））等の種子、カブキャベツ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、例えばオレラセア（ｏｌｅｒａｃｅａｅ））、ジャガイモ（ソラナム（Ｓｏ　ｌ　ａｎｕｍ）　、例えばツベロサム（ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））などの塊茎などが含まれる。

植物種の選択は、その植物または植物の一部の用途およびその植物種のトランスホーメーションの難易度によって決定する。

植物における組み換え遺伝子の発現は、植物のポリメラーゼによる遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳などが詳細に関係する。この事は組み換えＤＮＡ技術の分野ではよく知られている。本発明の正しい理解に関係する事のみを詳細に説明する。

本発明では、植物における目的酵素をコードする遺伝子の発現を起こすことが知られている調節配列を使用する。使用する調節配列の選択は、標的となる作物および、または器官に依存する。このような調節配列は、植物または植物ウィルスから得ることが出来るし、また化学的に合成することもできる。これらの調節配列は、使用する植物またはその一部に依存して構成的、又は分化段階および、または組織特異的に植物中での転写を指令するプロモーターである。これらのプロモーターには、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）　（ガリー（ＧｕｉＩＩｅｙ）等、１９８２）の３５３プロモーターなどの構成的発現を示すプロモーター、ルビローズ　ビスホスフェート　カルボキシラーセのスモールサブユニット遺伝子のプロモーターなどの葉特異的発現を行うもの（コルジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）等、１９８４）、クルタミンシンテース遺伝子のプロモーターなどの板枠異的発現を行うもの（チンギー（Ｔｉｎｇｅｙ）等、１９８７）、ブランカ　ナバス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）由来のクルジフェリンＡプロモーターなどの種子特異的発現を行うもの（ライアン（Ｒ，ｙａｎ）等、１９８９）、ンヤがイモ由来のクラス−■バタチンプロモーターなどの塊茎特異的発現を行うもの（ｏン＋’ソサ（Ｒｏｃｈａ−５ｏｓａ）等、１９８９；ウェンズラー（Ｗｅｙｚｌｅｒ）等、１９８９）またはトマト由来のポリガラクトウロナーゼ（ＰＧ）プロモーターなどの果実特異的発現を行うもの（バード（Ｂｉｒｄ）等、１９８８）等が含まれる。

ターミネータ−配列やボリアデニシーションングナル等、その他の調節配列には植物において機能するものが含まれるが、その選択は当業者のレベルの範囲内にある。このような配列の例には、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリンシンテース（ｎｏｓ）遺伝子の３°隣接領域がある（ビーパン（Ｂｅｖａｎ）　、１９８４）。

また、調節配列には、ＣａＭＶの３５３プロモーター中に見られるエンハンサ− 配列、およびアルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ）ＲＮＡ４のリーダー配列などのｍＲＮＡ安定化配列（ブリブロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）等、１９８０）、または同様の機能を示す他の配列が含まれる。

本発明の態様において、植物細胞の細胞質における目的酵素の単純な発現が望ましい場合には、発現される酵素に分泌シグナルペプチドやその他のターゲツティング配列を含めるべきではない。

本発明の別の態様では、本発明の選択された酵素をコードするＤＮＡ構築物に所定の部位に発現された酵素を指向させ、その基質に酵素がより接近しやすくさせうるリーダー配列を提供している。目的の酵素に機能的に結合し、この機能を行わせるターゲツティング配列は文献に報告されている（スミ−ケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、１９９０；パン　デン　ブルーフ（ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ）等、１９８５；ンユレーヤー（Ｓｃハｒｅｉｅｒ）等、ｌ９８５ン。例えば、クロロプラストおよびミトコンドリアで発現させるために発現酵素は、これらのオルガネラへの輸送を目的とした特異的な所謂トランジットペプチドを含んでいる（スミケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）等、１９９０）。もしもこの酵素の活性が液胞内で必要なら、分泌シグナル配列と酵素を液胞に送る特異的なターゲツティング配列が存在しなければならなシ）（タグエ（Ｔａｇｕｅ）等、１９８８）。

また、この事は酵素を種子に指向させることもできる。

もしも必要な場合は、本発明の関連ＤＮＡ構築物のすべての部分（プロモーター、調節−１安定化−、ターゲツティング−またはターミネーンヨン配列）を従来法を用いて修正し、それらの調節特性を変化させることが出来る。

目的酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現構築物を標的植物に導入する方法は幾つかある。これらの方法には、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロボレーンヨンおよびマイクロインジェクションを用いたプロトプラストのトランスホーメーンヨン、または（コート化）粒子衝突法が含まれる（ボトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、１９９０）。

これらの所謂直接的ＤＮＡ）ランスホーメーンヨン法に加えて、ウィルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶＬフレーリー（Ｆｒａｌｅｙ）等、１９８６＞およびバクテリアウィルス（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ＞由来、ボトリカス（Ｐｏ　ｔ　ｒ　ｙｋｕ　ｓ）、１９９０）等のベクターを含むトランスホーメーションシステムが広く使用されている。トランスホームしたプロトプラスト、細胞、または植物の一部の選択、および、またはスクリーニング後、これらは従来法を用いて完全な植物に再生する（ホー／ユ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９８５）。トランスホーメーションおよび、または再生の方法は本発明にとって本質的なものではない。

双子葉植物の場合の本発明の態様は、毒性遺伝子を有するプラスミドおよび転移する遺伝子構築物を有する適合プラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用するバイナリ−ベクターシステムの方法を取る（ホーケア　（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３；シルバルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）等、１９８４）。このベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれにおいても複製可能で、ＩＨ部にわたって本発明には関係しないように修正したバイナリ−ベクターＢ１ｎ１９　（ビーパン（Ｂｅｖａｎ）−１９８４＞から誘導される。この実施例で使用するバイナリ −ベクターには、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界領域のあいだにカナマイシン耐性をコ −ドするＮＰＴＩＩ−遺伝子々必要とされる遺伝子構築物をクローン化するた約の多重クローニング部位を含んでいる。

単子葉作物のトランスホーメーンヨンおよび再生には標準的方法はｆｌい。しかし、最近の科学の進歩は、原則的に単子葉植物はトランスホームが容易であり、トランスホームした細胞から稔性トランスンエニノク植物が再生しうるこさを示している。これらの作物に対する再生産可能！よ組織培養システムの発達は、植物細胞への遺伝子物質の導入に関する強力な方法とともに、トランスホーメーノヨンを可能にしている。現在、単子葉植物のトランスホーメーノヨンの方法には、植物片または細胞サスベンジコノへの微粒子衝突、およびプロトプラストの直接的ＤＮＡ取り込みまたはエレクトロボレー／コンがある。例えば、選択マーカーとしてハイクロフインン耐性をコードするバクテリアｈｐｈｉｌ母子を用いて、トランスジェニック米植物がうまく得られている。この遺伝子はエレクトロボレーンヨノで導入した（ツマモト　（Ｓｈ　ｉｍａｍｏ　ｔ　ｏ）等、１．９８９＋。また、微粒子衝突により、トウモロコノ懸濁培養物の胚芽細胞にホスフィノスリンノ　アセチルトランスフェラーゼ（除草剤ボスフィノスυツノを不活性化する酵素）をコードするストレプトミセス　バイグロスコピカス＜Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉ　ｃｕｓ）由来のｂａｒ遺伝子を導入することにより、トランスジェニンクトウモロコノ植物が得られている（コードン− カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）等、１．９９０　）。小麦や大麦などの他の単子葉作物の糊粉プロトプラストへの遺伝子物質の導入が報告されている（す〜（Ｌｅｅ）等、１９８９）。最近、微粒子衝突による小麦細胞！！！濁培養物の安定なトランスホーメー／ヨノが示された（ハ／ル（Ｖａｓｉｌ）等、１９９　］、　）。胚芽懸濁培養を行った島に古く小さくて節のある胚芽カルス組織だけを選択し、その培養物から小麦植物を再生した（バフル＜Ｖａｓｉｌ）等、＋９９０）。これらの作物に対するトランスホーメーノヨノンステムと再生技術を組み合わせることにより、本発明の単子葉植物−・の応用が可能となる。また、これらの方法は、双子葉植物のトランスホーメーンヨンや再生にも応用しうる。

必要ならば、目的の一つ以上の酵素を発現するトランスホーム／り植物を得るために多くの方法を使用する。これらには、ａ　目的の異なる酵素を各々発現するトランスジェニック植物の交配。

ｂ、各自必要な調節配列を含む目的の酵素をコードする複数の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる植物のトランスホーメーション。

Ｃ０必要な調節配列を有する目的の酵素をコードする遺伝子を各々が含んでいる異なるＤＮＡフラグメントまたはプラスミドによる同時の植物へのトランスホーメーンヨン。

ｄ、必要な調節配列のコノトロール下にある目的の異なる酵素をコードするＤＮＡフラグメントまたはプラスミドを用いた連続的な植物のトランスホーメー／ヨン。

ｅ　上述の方法の組み合わせ。

以上ａ−ｅの方法があるが、これらの方法に限定されるわけてはない。

上記の方法の選択は本発明にとって本質的なものではない。

本発明の一暫様において、タバコおよびトマト植物の細胞中でα−アミラーセが構成的に発現され、同植物中の澱粉を低分子量の糖に分解している。ハチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟 α〜アミラーゼをコードする、すなわち、シグナルベブチド配列を含まｔよいα −アミラーセをコードするゲノムＤＮＡフラグメントが、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターおよびエンハンサ−配列のコントロール下に置かれた。ＡＩＭＶ由来のＲＮ　Ａ　４のｍＲＮＡ安定化リーダー配列が、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノバリンンンテース（ｎｏｓ）遺伝子のターミネータ−およびポリアゾニレ−ジョンシグナル配列とともに含まれている。その後、この構築物をｐＭＯＧ２３　（１９９０年１月２９日、オランダ、パーン、セントラル・）゛リュー・ボア・ンメルカルチャーズに受理番号ＣＢ５１０２．９０で登録されている）等のバイナリ−ベクターにサブクローニングする。このベクターをノスアームドＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム　ツメ）７’／Ｘ７ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｌｉｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞を標的植物由来の組！ａｌｒｃ！−共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地中で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には、安定に組み込まれた遺伝子が含まれ、細胞中てα−アミラーセが発現される。

このトランスジェニック植物のα−アミラーゼ酵素活性は、比色による直接的酵素検定法またはゲル検定法により検定できる。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。この蛋白質は、バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌ　１ｃｈｅｎｉ　ｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーセに対する抗体を用いたウェスタンプロットで検出しつる。

この植物を沃素で染色することにより澱粉含量を定量する。また、ＮＭＲおよびＨＰ　Ｌ　Ｃなどの方法を用いて澱粉分解産物の存在を定量的に検定する。これには別の方法も使用できる。この方法は本発明にとって本質的なものではない。

別の好ましい態様では、ノヤガイモてα−アミラーセおよびタルコアミラーセの両方が発現されている。この酵素はその植物の塊茎のみて発現している。この結果、両酵素により塊茎中の澱粉が低分子の糖に分解される。バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の成熟α−アミラーセをコードするゲノムＤＮＡフラグメントおよびアスペルギラス　ニガ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来の成熟クルコアミラーセをコードするｃＤＮＡＤＮＡフラグメント々ジャガイモ由来のクラス−■バタチン遺伝子の塊茎特異的プロモーターのコントロール下に置かれている。また、両構築物にはアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ　ｒａｃ　ｉ　ｅｎｓ）のノバリンンンテース（ｎｏｓ＞遺伝子のターミネータ−およびボリアデニシーンヨンングナル配列が含まれる。その後、両構築物を一緒にバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３にサブクローン化する。このベクターを、ジスアームドブラスミドＴ１を含むアグロバクテリウム　ソメファ／エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をジャガイモ植物由来の組織止具培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には安定に組み込まれた遺伝子が含まれている。α −アミラーセふよびグルコアミラーセの両方が、トランスホームしたジャガイモの塊茎でのみ発現している。両酵素は細胞内で発現している。

トランスジェニック塊茎におけるα−アミラーセおよびタバコアミラーゼ酵素活性は、種々の検定法で検定しつる。例えば、グルコアミラーセ活性は、グルコアミラーセによるｐ−ニトロフェノール−α−Ｄ−グルコピラノシドから放出されるｐ−ニトロフェノールを測定することにより決定する。α−アミラーセ活性は、先に示し、また以下の実施例で述べるように測定しつる。両酵素の存在は、例えば、イムノブロッティングにより示される。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。

トランスジェニックジャガイモ塊茎の炭水化物組成を、ＨＰＬＣおよびＮＭＲ等の糖の検出技術を用いて検定する。別の方法を使用することもできる。どの方法を用いるかは本発明にとって本質的ではない。

高含量のポリサッカライド分解産物を有し、結果的に風味が変わり、および、または組織が改良されたトランスジェニック植物または植物器官（花、果物、葉、根、塊茎など）は、そのまま、または植物の糖の変化による品質を維持する非醗酵的処理後に使用される。このような使用の例には、ベビーフード、ジュース、ソース、ペースト、濃縮物、甘味料、ンヤム、ゼリー、ンロノブおよび動物飼料の生産が挙げられる。炭水化物組成が変わった穀物は、例えば、味の良いベーキング産物の生産に使用される。炭水化物組成の変わったタバコは、味や香りの変化を示す。

また、それらの植物または植物からポリサッカライド分解産物が抽出され、甘味料としてや種々の過程で使用される。

以下の実施例は、当業者を対象として本発明の生成法および使用法を完全に公開および説明するこさを意図するもので、本発明の範囲を制限するものではない。

使用する数字（例えば、量、温度、ｐＩ（等）は、正確を期するよう努力したが、いくらかの実験誤差やばらつきがあることを考慮しなければならない。特筆しないかぎり温度は℃て示し、圧力は大気圧付近である。

（実施例１）・バイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３の構築バイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３　（１９９０年１月２９日、オランダ、バーン、セントラル・プリュー・ボア・ンメルカルチャーズに受理番号ＣＢ５１０２．９０で登録されている。

第４図）は、ベクターＢ１ｎ１９　（ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）の誘導体である。まず、Ｚ、オマイシン　ホスホトランスフェラーセ遺母子ｎ　（ＮＰＴＩＩ）に関して左境界（ＬＢ）と右境界（ＲＢ）を交換した。次に、ＬＢの方向に転写してＮＰＴＩＩ遺伝子の方向を逆にした。最後に、Ｂ１ｎ１９のポリリンカーを以下の制限酵素認識部位：ＥｃｏＲＩ、Ｋｐｎｌ、Ｓｍａｌ、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、５ａｃｌ、ＸｈｏｌおよびＨｉｎｄｎｌを有するポリリンカーで置換した。

（実施例２）バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング本実施例のすべてのトランスホーメーションは、大腸菌ＤＨ５α株で行った。

ａ、バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子の調製バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉＳ）由来のα−アミラーゼ遺伝子（第２図）は、ヨーロッパ特許出願２２４．　２９４　（参考として引用する）に公開されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）ベクターｐＰＲＯＭ５４中に存在する。このプラスミドｐＰＲＯＭ５４は、１９８５年１１月５日、オランダ、バーン、セントラル・プリュー・ボア・ンメルカルチャーズに受理番号ＣＢ５６９６．８５で登録されている。

このプラスミドｐＰＲＯＭ５４をＸｂａＬおよびＢｃｌｒで消化した。このＸｂａＩ／Ｂｃｌｌフラグメントを、予めＸｂａ　Ｉおよび１３ａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８にクローン化しプラスミドｐＭＯ０３１８を調製した。テンプレートとしてｐＭＯＧ３１８を使用し、ミスマツチプライマーを使用してＢａｍＨ１部位を生成するＰＣＲを行ってＳａ　ｌ　Ｉ／ＢａｍＨｒフラグメントを合成した（生成したＢａｍＨＴ部位の位置は第２図に示した）。この５ａｌＩ／ＢａｍＦ（Ｉ　ＰＣＲフラグメントを、予め５ａｌｒおよび１３ａｍＨＩで消化したプラスミド１）ＩＣ−１９Ｒ１７−シーｚ（Ｍａｒｓｈ＞等、１９８４）にクローニングし、プラスミドｐＭＯＧ３１９を調製した。α−アミラーゼ遺伝子の５゛末端を含むｐＭＯＧ３１８の５ａｌｒフラグメント（第二の５ａｌｌは、ｐ［Ｊｃ１８中に存在する）を、５ａｌＩて消化したｐＭＯＧ３１９にクローン化した。これで、全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＭＯＧ３２０が生成した。

ｂ、ベクターｐＭＯＧ１８の構築ｐＲＯＫＩ　（ボールコーム（Ｂａｕｌ　ｃｏｍｂｅ）等、１９８６）の発現カセットをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄｌＩＩフラグメントとしてｐＵｃ１８にクローン化した。

このカセットには、ＥｃｏＲｒ／ＢａｍＨＩフラグメント上に８００塩基長のカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターフラグメントおよびＢａｍＨｒ／ＨｉｎｄＩＩ［フラグメント上にアグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリンシンテース（ｎｏｓ）転写ターミネータ−が含まれる。このプロモーターフラグメントには、ＣａＭＶプロモーターの−８００から＋１　（両部位を含む）の配列が含まれる。部位＋１は転写開始部位である（ギ！Ｊ　（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、１８９２）。部位−５１２のＮｃｏｌＲ位の上流の配列が欠失しており、またこの部位はＥ　ＣＯＲＩ　８位に変わっている。この事は、ＮｃｏＩでｐＵＣ１８中にある発現力セントを切断し、クレノーポリメラーゼで一重鎖を平滑化してＥｃｏＲＩリンカ−をライゲーションすることにより行った。

このプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、元のＮｃｏ１部位の上流にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの配列を有するＥｃｏＲＩフラグメントを欠失させた。ｎＯｓターミネータ−を含むＢａｍＨＩ／Ｈｉ　ｎｄＩＩＩフラグメントをフルフアルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ）のＲＮＡ４のリーダー配列（プレブロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ＞等、１９８０）を含む合成りＮＡフラグメント（オリゴヌクレオチド二本鎖ＡＳ第３図）で置換した。この事は、ＢａｍＨＩによる切断、Ｈｉ　ｎｄＩＩｉによる切断および合Ｆ＆ＤＮＡフラグメントのライゲーションで行った。

このＢａｍ８１部位および三個の上流ヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発で欠失させた。

そのプラスミドにｎＯｓターミネータ−を含むＢａｒｒ＋Ｈ４／Ｈｉｎｄｆｌｌフラグメントを再導入した。β−グルクロニダーゼを含む遺伝子（プラスミドｐＲＡＪ２７５由来、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、１９８７）をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてライゲーションし、プラスミドｐＭＯＧ１４を調製した。

一３４３七−９０の間の配列の重複はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性を増加することが知られている（カイ　（Ｋａｙ）等、１９８７）。二重の所謂エンハンサ−配列を含むプロモーターフラグメントを得るために、プラスミド９閘Ｏ６１４由来のエンハンサ−フラグメントをＡｃｃｌ／ＥｃｏＲＩフラグメント々して単離し、クレノーポリメラーゼで末端平滑化した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩで切断し末端平滑化したｐＭＯＧｌ　４に導入した。この結果、平滑化したＥｃｏＲＩとＡｃｃｒの境界で新しいＥｃｏＲＩが生成した。このプラスミドｐＭＯＧ１８２には、二重エンハンサ−配列を有するＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＡＩＭＶのＲＮ　Ａ　４リーダー配列およびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ７ラグメントとして存在する発現カセット中のｎｏｓが含まれている。

Ｃ，バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼ遺伝子のバイナリ−ベクターへのクローン化プラスミドｐＭＯＧ３２０をＨｇａＴおよびＥ３．ｑｍＨＩで消化した。−このＨｇａｒ／ＢａｍＨＩフラグメントを合成オリゴヌクレオチド二本ｔＪＩＢ　（第３図）と共に、ＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＯＧ３２２にクローン化した。

β−グルクロニダーゼ遺伝子をメチオニン翻訳開始コドンをコードするＡＴＧトリブレットに続くバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　ｌｕｓ　ｌ　ｉ　ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の成熟α−アミラーゼをコードする配列で置換した。プラスミドｐＭＯ０１８は、カリホルニアモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５３プロモーターオヨヒエンハンサー、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリンシンテース（ｎ。

Ｓ）ターミネータ−およびアルファルファモザイクウィルス（ＡＩＭＶ）のＲＮＡ４リーダー配列を含んでいる。この構築物にはシグナルペプチドをコードする情報は含まれていない。この全構築物をＥｃｏＲｒおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＥｃｏＲ’ｌおよびＨｉｎｄＩＩｒで消化したバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３にライゲーションした。生成したプラスミドをｐＭＯＧ２２８と命名した。

このバイナリ−ベクターｐＭＯ０２２８上のキメラα−アミラーゼ遺伝子を、プラスミドｐＲＫ２０１３を有する大腸菌Ｈ８１０１株を用いたトリベアレンタルメーティングにより（ジッタ（Ｄｉｔｔａ）等、１９８０）、植物へのＴ−ＤＮＡの移行に必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株に導入した（ホーケマ（Ｈ。

ｅｋｅｍａ）　、１９８３）。

（実施例３　）　タバコのトランスホーメーンヨンタバコにコチアナ　ツバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖベチノト　ハバナ（Ｐｅ　ｔ　ｉ　ｔ　Ｈａｖａｎｎａ）ＳＲＩ）を、α−アミラーゼ遺伝子を有するバイナリ− ベクターｐＭＯＧ２２８を含むアグロバクテリウムソメフ７’／エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）と植物葉ディスクとの共培養（ホーンユ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９８５）でトランスホーメーシヨンした。このトランスジェニック植物をカナマイシン耐性で選択し、目的の酵素活性に関して検定した。α−アミラーゼ遺伝子を発現する植物は、さらに詳細に分析し以後の実験に使用した。

無菌的に生育させたタバコにコチアナ　ツバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ　ベチノト　ハバナ（Ｐｅｔｉｔ　Ｈａｖａｎｎａ）ＳＲＩ）の葉から約５ｘ５ｍｍのディスクを切りだし、１％（Ｖ／Ｖ）となるようにアグロバクテリウム　ソメファンエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４　（ｐＭＯＧ２２８）　（１０’細胞／ｍｌ）を混合した３０ｇ／ｌのスクロースを含むＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）、１９６２）に、２０分間浮かした。このディスクを濾紙上で簡単に乾燥し、３０ｇ／ｌ　スクロース、７ｇ／ｌ　寒天、１ｍｇ／ｌ　ケラチンおよび０．０３ｍｇ／ｌ　ナフチル酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ固体培地を含むプレートに移した。三日後、このディスクを、５００ｍｇ／ｌ　カルベニシリンを含む同培地のプレートに移した。−週間後、このディスクを約５０ｍｇ／Ｉ　カナマイシンを含む同培地のプレートに移しトランスジェニックな新芽を選択した。このディスクを二連間ごとに新しいプレートに移した。成長してくる新芽を切りだし、根を成長させるために３０ｇ／ｌ　スクロース、１００ｍｇ／ｌ　カナマイシンおよび１００ｍｇ／ｌ　七フォタキシムを含むＭＳ固体培地を含むポットに移した。根が成長してきたら、これを土壌に移す。この植物を目的の遺伝子発現について検定した。

（実施例４）　トランスジェニックタバコ植物におけるα−アミラーゼの発現５６℃にあけるα−アミラーゼ活性をサイトウ（Ｓａｉｔｏ）　（１９７３）の方法で検定した。この場合のユニットは、１０分間で６９０ｎｍの吸収を１０％減少させる酵素量と定義する。バチルス　リチェニホルミス（ＢａｃｉｌｌｕｓＩ　１ｃｈｅｎｉ　ｆｏｒｍｉｓ）ａ−アミラーゼの比活性は、８．７Ｘ１．０５Ｕ／ｍｇ蛋白質である。先端の葉（約１００ｍｇ）を切りだし、１００μｍのα −アミラーゼ検定バッファ中でホモジナイズした（サイトウ（Ｓａｉｔｏ）、１９７３）。このホモジネートをエノペンドルフ遠心機で１０分間遠心した。上清を回収し、蛋白質およびα−アミラーゼ含量を検定した。コントロール植物の活性レベルは検出限界以下であった。

得られた６２個のトランスジェニック植物の発現レベルは、０から３．２９ｔＪ／μｇ（蛋白質）の間でばらついていた。その酵素の比活性から、これらのレベルは全可溶性蛋白質の０−０．３８％に相当している。平均は、全可溶性蛋白質の０１１％であった。バッファによる葉の減圧濾過および遠心による溶液の回収で単離した細胞外液にはα−アミラーゼ活性が検出されなかったことから、この蛋白質が細胞内に存在していることは明白である（ンモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）等、１９９０）。これらの結果は、この蛋白質が目的のα−アミラーゼであることを示すウエスタッフブロノトによるバチルス　リチェニホルミス（ＢａｃｉｌＩｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの免疫学的検出からも確認される。さらに、この確証は、抽出物および細胞外液のポリアクリルアミドゲル電気泳動でも得られる。電気泳動後、ゲルを０．０４Ｍ１−ＵスーＨＣＩ　（ｐＨ７，４）のバッファを６回取り替えながら３時間インキュベーションして酵素を再生した。このゲルに１ｍＭＣａＣｌ２を含む０．０５Ｍ１−リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）中０．２５％ポテトリンドナースターチおよび０，７５％寒天を含む溶液を重層し、３７℃で一番インキュベーションしたのち、１ｍＭ　１２１０．５Ｍ　Ｋｌ水溶液で染色した。重層中の透明なゾーンとしてα−アミラーゼ活性が検出される（ラックス（Ｌａｃｋｓ＞およびスプリングホーン（Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ）　、１９８０）。トランスジェニック植物で、バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ゛と同じ分子量約５５．０００ｋＤａのα−アミラーゼが検出された。

α−アミラーゼを発現する植物は、薄い淡緑色（クロロチック）でコントロール植物と比較すると増殖がいくぶん遅い。

（実施例５）　トランスジェニックタバコ植物の炭水化物分析光周期の約半分のときに回収したトランスジェニックタバコ植物の葉の澱粉含量を、９６％エタノール中で葉を一晩振盪して脱染色し、０．２Ｎ　ＨＣＩ中５．７ｍＭＩｚおよび４３．３ｍＭ　Ｋｌを含む溶液で染色することにより定性的に測定した。澱粉を含む葉は紺に染色され、澱粉を含まない葉は黄褐色に染色される（キャスバ−（Ｃａｓｐａｒ）等、１９８５＞。

コントロールおよびトランスホームした（α−アミラーゼ発現良好）植物由来の集約２．５ｇを、ウルトラタラノクスを用い１０ｍ１の水中４℃でホモジナイズした。顕微鏡観察で生の細胞が残存していないことを確認した。遠心による細胞フラグメントの除去後、緑色上清のグルコースオリゴマー含量を測定した。濾過したサンプルは、溶出液として水を用いたアミネソクスＨＰＸ−４２Ａカラム（３００ｍｍｘ７．８ｍｍ、８５℃〉のＨＰ　Ｌ　Ｃで分析した。トランスホーム植物のサンプルにはマルトースおよびマルトトリオースの存在が確認されたが、コントロール（非トランスホーム）植物には＋ｉｌＢされなかった。この結果を表１に示す。

表１　タバコの葉から抽出した糖とアミネノクスＨＰＸｉ２Ａ−ＨＰＬＣカラムによる分析調製物　糖　ｍｇ−糖／ｇ−湿物質コントロール　マルトトリオース　検出されずマルトース　検出されずトランスホームｙり　マルトトリオース　０−３４マルトース　１７３（実施例６）　塊茎特異的発現構築物におけるバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｒｏｒｍｉｓ）のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング本実施例の大腸菌のトラノスホーメーノヨンは全てＤＨ５α株を用いた。

塊茎特異的発現用の発現力セントを構築するために、ジャガイモのクラス−ｒバタチン遺伝子のプロモーター（ソラナム　ッベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ　ピンチ（Ｂ、ｉ　ｎ　ｔ　ｊ　ｅ）　）を、テンプレートとして単離したゲノムＤＮＡを用いたポリメシースチェーンリアクションリアクションで合成した（メトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）、１９８７）。ジャガイモ中でクラス−■バタチン遺伝子は塊茎特異的発現を示した。いくつかのバクチンマルチジーン群のコードおよび隣接側配列が決定されている（ロカーソサ（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａ）等、１９８９；ビーパン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８６；ミグネリ −（Ｍ　ｉ　ｇｎ　ｅ　ｒ　ｙ）等、１９８８）。β−グルクロニダーゼに融合したクラス−■バタチン遺伝子の５”隣接領域を含みβ−グルクロニダーゼの塊茎特異的発現を起こすキメラ遺伝子が報告されている（ウエンズラ−（Ｗｅｎ　ｚ　Ｉ　ｅ　ｒ）　等、１９８９）。

ｐＡＴ２１１およびＢ３３の配列に対応する二つのオリゴヌクレオチド（ミグネリ−（Ｍｉｇｎｅｒｙ）等、１９８９；ビーパン（Ｂｅｖａｎ）等、１９８６）を合成し、Ｈｉ　ｎ　ｄＩＩｌ／Ｎｃ　ｏ　Ｉフラグメントとしてクラス−Ｉバクテン５°隣接領域を増幅した。

５１　人ＴＴＭＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＡＴＡＧＡ（、ＴＡＧＴ　３’ ５’　ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＴＧＣＡＡＡＴにＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴ　３ ’このオリゴヌクレオチドは、その末端に適当な制限部位（ＨｉｎｄＩ［［およびＮｃａｌ）を含むよう設計し、その制限酵素でフラグメントを消化後発現カセットへの組込みを可能としている。機能的クラス−１バタチンプロモーターフラグメントを含む約１．．３ｋｂのフラグメントを合成した。ライゲーションによるＥｃｏＲ，Ｉ合成リンカ−の付加後、このフラグメントをＥｃｏＲＩで線状化したｐｕＣｌｇにクローン化しｐＭＯＧ５４６を調製した。三者ライゲーションではプラスミドｐＭＯＧ５４６のＨｉ　ｎ　ｄｌＩ［／Ｎｃ　ｏ　ｒフラグメントを、プラスミドｐＭ○Ｇ３２２のＮｃｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント　（実施例２参照、ＡＴＧ翻訳開始コドンにつづき、アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｎｏｓターミネータ−を従えるノ＼チルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の成熟αをコードする）と共に、ＨｉｎｄｌＴＩ”切断したバイナリ−ベクターｐＭ○Ｇ２３にライゲーションしてバイナリ−プラスミドｐＭＯＧ４５０を調製した（第５図参照）。

（実施例７）　トマトのトラノスホーメーンヨントマト　（リコペルシコン　イスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕ　Ｉ　ｅｎ　ｔｕｍ）ｃｖ、　マネーメーカー（Ｍａｎｅｙｍａｋｅｒ））をアグロバクテリ’）ム（Ａｇｒｏｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４　（ｐＭＯＧ２２８）てトランスホームした。基礎培養培地は、３０ｇ／Ｉ　スクロース、Ｂ５ビタミン（ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）　、１９７０）　、２ｍｇ／ｌ　ジ−チンリボシドおよびＯ，１ｍｇ／ｌ　酢酸インドール（ＩＡＡ）を補ったＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコーグ（Ｓｋｏｏｇ）　、１９６２）を含んでいる。必要な場合はこの培地を０．７ｇ／］のダイチン寒天で固形化した。

日令６オの無菌的に生育させたンードリングの子葉の両端を切り、日令１０才のベチュ＝Ｔ　（Ｐｅ　ｔｕｎ　ｉ　ａ）細胞サスペンションのフィーダーを含む固体培地上で２４時間プレインキュベーションした。この子葉をＭＳ培地で洗浄したてグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４　（ｐＭＯＧ２２８）株の対数期培養物と２４時時間項養した。この子葉を滅菌した濾紙で簡単に乾燥し、日令１０才のペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）細胞サスペンションのフィーダ一層を含む固体培地上に置いた。４８時間後、この子葉をフィーダ一層を含まず、２００ｍｇ／ｌ　セフオタキシムおよび１００ｍｇ／Ｉ　バンコマイシンを含む同培地を含むプレートに移した。共培養５日後、この子葉を１００ｍｇ／ｌ　カナマイシンを含む同培地に移した。この子葉を二連間毎に新鮮なプレートに移し変えた。

新芽を切りだし、根づけ培地（１０ｇ／Ｉ　スクロース、１００ｍｇ／ｌ　セファロタキシムおよび５０ｍｇ／ｌ　バンコマイシンを補ったＭＳ培地）上に置いた。根付き後、その植物を土壌に移し、α−アミラーゼの発現を検定した。

（実施例８）　トマトにおけるバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼの発現およびトランスジェニックフルーソの炭水化物分析構成的発現構築物ｐＭｏｃ２２８によるトランスホーメーションから得たトランスジェニックトマトの発現型は変わらなかった。土壌で３週間生育させたトランスジェニックトマトの葉のα−アミラーゼ活性を実施例４の方法で検定した。

分析した植物中のα−アミラーゼ発現レベルは、０から１．２Ｕ／μｇ（可溶性蛋白質）の範囲にあった。この酵素の存在は、バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認された。

土壌に３週間生育させ、光周期の中点で回収した植物から得た葉中の澱粉含量を、実施例５で述べた方法で測定した。α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の葉に含まれる澱粉量は、コントロール植物のものより少なかった。

（実施例９）　アスペルギラス　ニガ＝（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　Ｉｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来の成熟グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡのクローニング本実施例の大腸菌のトランスホーメーンヨンで使用する株は全てＤＨ５α株である。

ａ　アスベルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのポリＡ”ＲＮＡの単離アスペルギラスニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）ＤＳ　２９７５株（１９８８年８月１０日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュ〜・ボア・ンメルカルチャーズに受理番号ＣＢ５５１．３．８８で登録されている）の約ｉＸ］０’個の胞子を、１リンドル当たりＩｇ　ＫＨｉＰＯｈ：３０ｇフルドース：５ｇイーストイクストラクト：１０ｇ　カゼイン加水分解物；０．５ｇＭｇ５ ○、−７Ｈ２０および３ｇ　Ｔｗｅｅｎ８０を含む１．００ｍ１の前培養培地中でイノキユベーンコノした。このｐＨを、５．５に調整する。

ロータリーシェーカー中、３４℃で一晩増殖させたのち、培養物１ｍｌを、１リツトル当たり２ｇ　ＫＨ２Ｐ○ａ：’？Ｏｇ　マルトテ′キストリン（マルチ′ ソクス　ＭＤＯ３、アミラム）；１２．５ｇ　イーストイクストラクト：２５ｇ　カゼイン加水分解物；２ｇ　Ｋ２ＳＯ４；０．５ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ；００３ｇ　ＺｎＣ１，；０．０２ｇ　ＣａＣｌ、＋０．０５ｇ　Ｍｎ５Ｏ，・４）（２０およびＦｅ５０＜を含む１．００ｒｎｌの本培養培地中でインキ、ベーンヨンした。このｐｈを５．６に調整する。１４０時間で菌糸体が生育してくるので、これを回収する。乾燥した菌糸体０．５ｇを液体窒素で凍結し、粉末とする。つづいて、オーフレー（Ａｕｆｆｒａｙｆおよびロージャン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）　（１９８０）の方法に従い、菌糸体を、０℃で３Ｍ　ＬｉＣ１，６Ｍ尿素溶液１０ｍ１中、ウルトラ　ソラックスを用いてホモジナイズし、４℃に一晩維持する。１６、ＯＯＯＸｇの遠心で全細胞ＲＮＡが得られるので、これを３ｍｌの１０ｍＭトリス〜ＨＣＩ　（ｐＨ７，４＞　、０．５％ＳＤＳ溶液に溶かし、フェノール、クロロホルム゛イソアミルフルコール＜５０：４８：２）で二重抽出する。　ポリＡ°を選択するため、全ＲＮＡサンプルを６５℃で５分間加熱し、０．　５Ｍ　ＮａｃＩとした後、オリコ（ｄＴ）−セルロースカラムにかける。１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　＜ｐＨ７、Ｏ）、０．５％ＳＤＳおよび０．１ｍＭＮａＣ１を含む溶液で数回洗浄後、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）および０．　５％ＳＤＳを含む溶液でポＩＪＡ″ＲＮＡを回収する。

ｂ　グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡの調製およびクローニングｃＤＮＡの第−鎮を合成するために、実施例Ｌｌａで単離したポＩＪＡ’ＲＮＡ５μｇを１６．５μｌの水に溶かす。つづいて、以下の成分を添加する＝２，５ｔｔｌＲＮａｓ　ｉｎ　（３０ＴＪ／μｌ）　、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２および４ＯｍＭ　ＫＣＩを含むバッフｙｌＯμｌ、ＬＭ　ＫＣＩ　２μｌ。

０、１Ｍ　ＤＴＴ　５μｌ、オリゴ（ｄＴ）　Ｉ２−＋ｓ　（２，５ｍｇ／ｍｌ）　０゜５μｍ、８ｍＭ　ｄＮＴＰミンクス　５μｌ、ＢＳＡ（１ｒｒ＋ｇ／ｍｌ＞　５μｍおよびモロニーＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）２．５μＩＯこの混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後ｌＯμＩの０．２Ｍ　ＥＤＴＡおよび５０μｍのＨ，Ｏを添加して反応を停止する。１１０μｍのクロロホルムで抽出した後、５分間遠心し、その水層を回収して１１０μｌの５　Ｍ　Ｎ　Ｈ４Ａ　ｃおよび４４０μｌのエタノール（温度−２０℃）を添加する。

ドライアイス／エタノール溶液中３０分間沈澱化を行う。０℃、１０分間の遠心後、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡペレットを７０％水冷エタノールで洗浄する。このペレットを乾燥し、２０μｍの水に溶かす。グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡＯ単離はポリメシースチェーンリアクンヨンリアクションで行う。ボール（Ｂｏｅｌ）等、（１９８４）に報告されているグルコアミラーゼＧ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づき、二つのオリゴヌクレオチドを合成する。

オリゴ１５ＩＣＴＴＣＣＡＣＣ杢ＧＣＧＡＣＣ訂ＧＧＡＴＴＣ３’オリゴ２　、　５’　ＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣ：ｌ’これら二つのオリゴヌクレオチドを用い、ＡＴＧ翻訳開始コドン（下線）につづき、適当なりローニング部位に隣接する成熟型、即ち、分泌シグナルペプチドおよびプロペプチドを含まない酵素をコードする領域を増幅する。得られたＤＮＡをＮｃｏｌおよび３ｓｔｌで消化する。ＣａＭＶ３５Ｓのターミネータ−転写フラグメントを含むｐ３５ｓＧＵｓＩＮＴ　（バンカ不イト　（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ）等、ｌ　９９０）の５ｓｔｌ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと共に、Ｎｃｏｌ／５ｓｔｌフラグメントを三者ライゲーションにより予めＮｃｏＬおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＭＯ０１８（実施例２参照）にクローン化して、ｐＭＯＧ５６７を調製する。

ｐＭＯＧ５６７のＰｓｔｒ／５ｓｔＩフラグメントをＰｓｔＴおよび５ｓｌｌで消化したｐｌｃ２０Ｈ（７−ンユ（Ｍａｒｃｈ）等、１９８４）にクローン化する。このプラスミドてはＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントが相当するアミログルコンダーゼｃＤＮＡフラグメントと置き変わっており、これをｐＭＯＧ５６８と命名する。ＨｉｎｄＩＩＩ／５ｓｔｌフラグメントの配列をボール（Ｂｏｅｒ）等、（１９８４）の配列と比較する。ｐＭＯＧ５６８のＰｓ　ｔ　ｒ／Ｓｓｔ　１７ラグメントをアミログルコンダーゼｃＤＮＡのＰｓｔｌ／５ｔｙＩフラグメントにライゲーションし、生成したフラグメントを合成アダプター。

５’　ＣＡＴＧＧＣにＡＣ３＋３１　ＣＧＣＴＧＧＡＡＣ５鵞・と共に、三者ライゲーションで予めＮｃｏＩおよび５ｓｔＩで消化したｐＭｏｃ５６７にクローニングし、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびターミネータ− のフントロール下にある成熟型アミログルコンダーゼをコードするプラスミドｐＭＯＧ５６９を調製する。

（実施例１０）バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼおよびアスペルギラス　ニカ゛−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼ両方のクローニング本実施例のトランスホーメーンヨンは、全て大腸菌ＤＨ５α株で行う。

プラスミドｐＭＯＧ５４６由来の１−１ｉｎｄＩ［Ｉ／Ｎｃｏｌクラス−１，バタチンプロモーターフラグメント（実施例６参照）を、アスペルギラス　ニガ＝（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ＞　由来の成熟型アミログルコンダーゼおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネ〜ターフラグメント　（実施例１１参照）をコードするプラスミドｐＭＯＧ５６７のＮｃｏｌ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと共にＨｉｎｄＩＩＩで線状化したｐｌｃ１９Ｒ（マージｓ　（Ｍａ　ｒ　ｓ　ｈ）等、１９８４）にクローン化し、プラスミドｐＭＯＧ４４０を調製する。

プラスミドｐＭＯＧ４５０　（実施例６）をＨｉ　ｎｄＩＩ［で消化する。クラス−ｒバタチンプロモーター、バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｉｃｈｅｎ　ｉ　ｆ　ｏｒｍｉ　ｓ）由来の成熟型α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列オヨヒアクロバクテリウム　ソメファンエンス＜Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ　ｆａｃ　ｉ　ｅｎｓ）由来のｎｏｓターミネータ−を含むＨｉｎｄＩＩ［フラグメントをＨｉｎｄＩ［Ｉて線状化したバイナリ−ベクターｐＭＯＧ２３にクローン化する。これをバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４３６とする。

プラスミドｐＭＯＧ４４０をＥｃｏＲＩで消化する。クラス−Ｉパタチンプロモーター、アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来の成熟型グルコアミラーゼをコードするｃＤＮＡフラグメントおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネータ−を含むＥｃｏＲｒフラグメントを、ＥｃｏＲＩで線状化したバイナリ−プラスミドｐＭＯＧ４３６にクローン化する。制限酵素分析を用い、タンデムに二つの発現カセットを含むトランスホーマントをスクリーニングする。

この配置の発現カセットを含むバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４３７　（第６図）を、トランスホーメーション実験に使用する。

バイナリ−プラスミドｐＭｏ（，４３７同様に、塊茎特異的クラス＝■バタチンプロモーターのコントロール下のバチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のキメラα−アミラーゼ遺伝子およびアスベルギラス　ニガー（ＡｓｐｅｒｇＩＩ　Ｉｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のキメラグルコアミラーゼ遺伝子を、トリペアレンタルメーティングでプラスミドｉ：＋ＲＫ２０１３を含む大腸菌８８１０１株（ジッタ（ｒ）ｉｔｔａ）等、１．９８０）と共に、植物にＴ−ＤＮＡを移行させるのに必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４株に取り込ませる（ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、１９８３）。

（実施例１１）ジャガイモのトランスホーメーションホーケ７　（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、（１，９８９＞の方法で、ジャガイモ（ソラナム　ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ、デジゴー（Ｄｅｓｉｒｅｅ＞）をアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４　（ｐＭＯＧ４３７）株でトランスホームする。

基礎培養培地には、３０　ｇ／　Ｉ　スクロースおよびＲ３−ビタミン（オームス（Ｏｏｍｓ）等、１．９８７＞、場合によっては５μＭ　ジ−チンリボシド（ＺＲ）および０．　３μＭ　酢酸インドール（ｒＡＡ）を補ったＭＳ培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）およびスコープ（Ｓｋｏｏｇ）　、１９６２）であるＭＳ３０Ｒ培地を用いる。必要ならば、この培地を０．７ｇ／ｌ　ダイチン寒天で固化する。

ソラナム　ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｃｖ、デジリ（Ｄｅｓｉｒｅｅ）の塊茎の皮を剥き、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０゜６％次亜塩素酸塩溶液中で２０分間表面を滅菌する。このジャガイモを少なくとも２時間かけて大量の滅菌水て完全に洗浄する。コルクボアで作成した円筒の塊茎組織を約２ｍｍの厚さのディスクにスライスする。このディスクを１０６−１０７個／ｍｌのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４　（ｐＭＯＧ４３７）を含む、ＺＲａび１．：ｒＡＡ無ＬノＭ　Ｓ　３０　Ｒ３培地中で２０分間インキュベートした。つづいて、このディスクを滅菌した濾紙で乾燥し、ＺＲおよびＩＡＡを含む固体ＭＳ３０Ｒ３培地に移した。２日後、このディスクを１．ｏＯｍｇ／Ｉ　セフォタキンムおよび５０ｍｇ／Ｉ　バンコマインンを含む新鮮な培地に移した。１週間後、このディスクを１００ｍｇ／］　カナマイシンを含む同培地に移し、トランスジェニックな新芽を選択した。４− ８週間後、このディスクから、ディスク１００個当たり５−１０個の頻度で新芽が出てきた。

この新芽を切りだし、根付は培地（ＺＲおよびＩＡＡを含まず、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび１００ｍｇ／　Ｉ　カナマイシンを含むＭＳ３０Ｒ３培地）上に置いて、分裂組織切断により無菌的に増殖させてから土壌に移した。この植物に塊茎を作らせ、目的の遺伝子発現を検定した。

（実施例１２）ジャガイモにおけるα−アミラーゼ（バチルス　リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））およびグルコアミラーゼ（アスヘルギラスニガ−（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ））の塊茎特異的な同時発現およびトランスジェニック塊茎の炭水化物分析実施例７に述べたようにジャガイモ植物をバイナリ−ベクターｐＭＯＧ４３７でトランスホームする。この植物をα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性に関して検定する。α−アミラーゼ活性は実施例４に示した礪うに測定する。グルコアミラーゼの存在はアスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕｓ　ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングで示す。植物物質（約５０ｍｇ）を１００μｍの検定バッファ中でホモジナイズする。このホモジネートをエンベンドルフ遠心機で１０分間遠心する。この上清をα−アミラーゼ活性、グルコアミラーゼの存在および蛋白質含量について検定する。これらの酵素の存在は、トランスジェニックジャガイモの塊茎にのみ検出される。

両酵素を発現するトランスジェニックジャガイモの塊茎をＨＰＬＣにより可溶性糖の存在について分析する。コントロール植物に比べて、トランスジェニック塊茎にはより高含量の可溶性糖が検出される。

（参考文献）オーフレー（Ａｕｆ　ｆ　ｒａｙ＞、Ｃ６およびロージャン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）、Ｆ（１９８０）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０７，３０３゜ボールコーム（Ｂａｕ　ｌ　ｃｏｍｂｅ）、Ｄ、Ｃ，、サンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）　、Ｇ、Ｒ，、、ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、Ｍ、Ｗ、、７ヨ（Ｍａｙｏ）。

Ｍ、Ａ、およびハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）、Ｂ、Ｄ、（１９８６）ＮａＬｕｒｅ　３２１，４４６゜ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、Ｍ、（１９８４）ＮｕＣｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２．８７１１゜ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、Ｍ、　パーカー（Ｂａ　ｒ　ｋ　ｅ　ｒ）　、Ｒ，、：１−−Ｊｌ／ズブロ（Ｇｏ　ｌｄｓｂｒｏｕｇｈ）、Ａ、、ジャービス（Ｊａｒｖｉｓ）、Ｍ。

カバナ（Ｋａｖａｎａｇｈ）、Ｔ、およびイツリアガ（Ｉｔｕｒｒｉａｇａ）（１９８６）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４，４６２５゜バタチャヤ（Ｂｈａｔ　ｔａｃｈａｒｙｙａ）、Ｍ、、スミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）　、　Ａ、Ｍ、、エリス（Ｅｌ　１ｉｓ）、　Ｔ、　Ｈ，Ｎ、　、　ヘドジー（Ｈｅｄｌｅｙ）、Ｃ１およびマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、Ｃ，（１９９０）Ｃｅｌｌ　６０．１１５゜バード（Ｂｉ　ｒｄ）　、　Ｃ，Ｒ，、スミス（Ｓｍｉ　ｔｈ）　、　Ｃ，Ｊ、Ｓ、　、レイ（Ｒａｙ）、Ｊ、Ａ、、モーリｘ−（Ｍｏｕｒｅａｕ）、Ｐ、、ヒ゛−／＜：／　（Ｂｅｖａｎ）、Ｍ、Ｗ、、バード（Ｂｉ　ｒｄ）　、　Ａ、Ｓ、　、　ツーゲス（Ｈｕｇｈｅｓ）、Ｓ、、モリス（Ｍｏｒｒ　ｉ　ｓ＞　、　Ｐ、　Ｃ，、グリーソン（Ｇ「］ｅｒｓｏｎ）、Ｄ、およびシュッチ（Ｓｃｈｕｃｈ）、Ｗ、（１９８８）ＰＩａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１１．　６５１゜ボール（Ｂｏｅ　Ｉ）、Ｅ、、ホード（Ｈｊｏｒｔ）、１．、スベンソン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ）、Ｂ、、ノリス（Ｎｏｒｒ　ｉ　ｓ）　、　Ｆ、　、ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）　、　Ｋ、Ｅ、およびフィル（Ｆｉｌｔｈ、Ｎ、Ｐ、（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、、３．１０９’ｌ−１１０２゜プレブロード（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ）、Ｆ、Ｔ、、：］／＜−−ズワーソフ（Ｋｏｐｅｒ−Ｚｗａｒｔｈｏｆ　ｆ）、Ｅ、Ｃ，およびポル（Ｂｏｌ）、Ｊ、　Ｆ、（１９８０）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８．２２１３゜キャスパ−（Ｃａｓｐａ　ｒ）、Ｔ、、７−バー（Ｈｕｂｅｒｌ　、Ｓ、　Ｃ，およびツマ−ビル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）、Ｃ，（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、７９，１１゜キャスバ−（Ｃａｓｐａｒ）、Ｔ、、リフ　（Ｌｉｎ）　、　Ｔ、　−Ｐ、　、　−ｖ：ンａ　−（Ｍｏｎｒｏｅ＞、Ｊ、、バーンハード（Ｂｅｒｎｈａｒｄ）、Ｗ、、スビラトｏ（Ｓｐｉｌａｔｒｏ）、Ｓ、、ブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）、Ｊ　およびツマ−ビル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）、Ｃ，（１９８９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．５８３０゜コルク（Ｃｏｒｕｚｚｉ）、Ｇ、、プログリ−（Ｂｒｏｇｌ　ｉｅ）、Ｒ，、ｘドワーズ（Ｅｄｗａ　ｒ　ｄ　ｓ）　、　Ｃ，、チュア（Ｃｈｕａ）　、　Ｎ、　−Ｈ，（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、３．１６７１−１６７９゜ジッダ（Ｄｉ　ｔｔａ）、Ｇ、、ｘタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ）、Ｓ。

、コービン（Ｃｏｒｂｉｎ）、Ｄ、およびヘリンスキー（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）、Ｄ、Ｒ，（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７．７３４７゜フレーゴー（Ｆｒａｌｅｙ）、Ｒ，Ｔ、、Ｏジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）、Ｓ、Ｇｏ、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）、Ｒ，Ｂ、（９８６）　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　４．　１−ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）、Ｏ，Ｌ、（１９７０）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、４５，３７２゜ゴートン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）、Ｗ、Ｊ、、スペンサー（Ｓ　ｐ　ｅ　ｎｃｅｒ）　、　Ｔ、　Ｍ、　、　７ンガノ　（Ｍａｎｇａｎｏ＞、Ｍ、Ｌ、、アダムス（Ａｄａｍｓ）、Ｔ、Ｒ，、ディング（Ｄａ　１ｎｅｓ＞、Ｒ，Ｊ、、スタート（Ｓｔａｒｔ）、Ｗ、Ｇ、、オフライエン（０’　Ｂｒ　ｉ　ｅｎ）　、Ｊ、　Ｖ、　。

チャンパース（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）、Ｓ、Ａ、、アダムス（Ａｄａｍｓ）Ｊｒ、　、　Ｗ、Ｒ，、ウィレッツ（Ｗｉ　ｌ１ｅｔｓ）、Ｍ、Ｇ、、ライス（Ｒｉｃｅ）、Ｔ、Ｂ、、７７キー（Ｍａｃｋｅｙ）、Ｃ，Ｊ、、　クルーガー（Ｋｒｕｅｇｅｒ）、Ｒ，Ｗ、、コールｘ　（Ｋａｕｓｃｈ）、Ａ、Ｐ、およびレモークｘ　（Ｌｅｍａｕｘ）、Ｐ、Ｇ、（１９９０）Ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　２．６０３゜ギジー（Ｇｕｉ　Ｉ　１ａｙ）、Ｈ，、ダドジー（Ｄｕｄ　］　ｅｙ）、Ｒ，に、、ジョナード（Ｊｏｎａｒｄ）、Ｊ、、バラス（Ｂａ　１ａｚｓ）、Ｅ、およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、に、Ｅ、（１９８２）　Ｃｅ１ｌ　３０．７６３゜ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）、Ｈ，Ｒ，およびマツコール（ＭｃＨａ　ｌ　ｅ）、Ｎ。

Ａ、（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８８．８３８゜ホーケア　（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ａ、、　バーシュ（Ｈｊ　ｒｓｃｈ）　、Ｐ、　Ｒ，、ポイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）、Ｐ、Ｊ、Ｊ、およびンルバルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）、Ｒ，Ａ、（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ　３０３．１７９゜ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ａ、、ワイスマン（Ｈｕ　ｉ　ｓｍａ　ｎ）　、　Ｍ、Ｊ。

、モレンジク（Ｍｏｌｅｎｄｉ　ｊｋ＞、Ｌ、、パンデンエルゼン（Ｖａｎｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ）、Ｐ、Ｊ、Ｍ、およびコー不すセン（Ｂｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ）、Ｂ、Ｊ、Ｃ，（１９８９）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７．２７３゜ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）、Ｒ，Ｂ、、　フライ（Ｆｒｙ）、Ｊ、Ｅ、、ホフマン（Ｈｏ　ｆ　ｒｍａｎｎ）、Ｎ、Ｌ、、ｘイクホルソ（Ｅｅｃｈｈｏ　ｌ　ｔ　ｚ）。

１）、、ｏジャース（Ｒ，ｏｇｅ　ｒ　ｓ）　、Ｓ、Ｇ、およびフレーブー（Ｆ　ｒ　ａ　１ｅｙ）、Ｒ，Ｔ、（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２７，１２２９゜ホーベンカンブーハーメリンク　（Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌ　１ｎｋ）。

Ｊ、Ｈ，Ｍ、　、ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）、Ｅ、、ポンスタイ７（Ｐｏｎｓｔｅｉｎ）、Ａ、Ｓ、、ピサ−（Ｖｉｓｓｅｒ）、Ｒ，Ｇ、Ｆ、、ボスーシエバーカータ−（Ｖｏｓ−３ｃｈｅｐｅｒｋｅｕｔｅｒ）、Ｇ、Ｈ。

、ビモルト　（Ｂｉ　ｊｍｏｌ　ｔ）、Ｅ、Ｗ、、デブリス（Ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ）、Ｊ、Ｎ、　、ウィソルト　（Ｗｅ　ｔ　ｈｏ　Ｉ　ｔ）　、Ｂ、　およびフェンスト５　（Ｆｅｅｎｓｔｒａ）、Ｗ、Ｊ、（１９８７）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、、７５．２１７゜ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、Ｒ，Ａ、（１９８７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｆ、Ｂｉｏｌ、５．３８７カイ　（Ｋａｙ）、Ｒ，、チャン（Ｃｈａｎ）、Ａ、、ディリー（Ｄａｙｌｙ）。

Ｍ、およびマツクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ｊ、（１９８７）ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６．　１２９９゜ラックス化ａｃｋｓ）、Ｓ、Ａ、およびスプリングホーン（Ｓｐｒｉｎｇｈ。

ｒｎ）、Ｓ、Ｓ、（１９８０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．７４６７゜ブー（Ｌｅｅ）、１３．、−ｙ−ドック　（Ｍｕｒｄｏｃｈ）、に、、トｙピング（Ｔｏｐｐｉｎｇ）、Ｊ、、ブレイス（Ｋｒ　ｅ　ｉ　ｓ）　、　Ｍ、およびジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｍ、Ｇ、に、（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１３．２１．。

「ノン（Ｌ　ｉ　ｎ）　、　Ｔ−Ｐ、　、スビラトｒｙ　（Ｓｐｉ　１ａｔｏｒｏ）、Ｓ、Ｒ，ｉ６よびブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）、Ｊ、（１９８８ａ）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８６，２５１゜リン（Ｌ　ｉ　ｎ）　、　Ｔ−Ｐ、　、　キャスバー（Ｃａ　ｓ　ｐａ　ｒ）　 ’、　Ｔ、　、ツマ−ビル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）、Ｃ，およびブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）、Ｊ、（１９８８ｂ）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８６，１１３１゜リン（Ｌ　ｉ　ｎ）　、Ｔ−Ｐ、　、　キャスバー（Ｃａｓｐａｒ）、Ｔ、、７フービル（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、）、Ｃ，およびブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）、Ｊ。

（１９８８ｃ）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８８，１１７５゜マーシュ（Ｍａｒｓｈ＞、Ｊ、Ｌ、、アーフル（Ｅｒ　ｆ　］　ｅ）　、　Ｍ、およびワイケｘ　（Ｗｙｋｅｓ）、Ｅ、Ｊ、（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３２，４８１゜メトラ −（Ｍｅｔｔｌｅｒ＞、１．Ｊ、（１９８７）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｌ、Ｒｅｐ、５．　３４６゜ミグネリ−（Ｍｉｇｎｅｒｙ）、Ｇ、Ａ、、ビヵード（Ｐｉｋａａｒｄ）、Ｃ。

Ｓ　、およびパーク（Ｐａｒｋ）、Ｗ、Ｄ、（１９８８）　Ｇｅｎｅ　６２．２７゜ムランゲ（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅ）、Ｔ　およびスコープ（Ｓｋｏｏｇ）、Ｆ、（１９６２）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、１４，４７３゜オキタ（Ｏｋ　ｉ　ｔａ）　、　Ｔ、　Ｗ、　、グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）、Ｒ２，カン（Ｋｕｈｎ）、Ｄ、Ｎ　およびブレイス（Ｐｒｅｉｓｓ）、Ｊ、（１９７９）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、６４．　１８７゜オームス（Ｏｏｍｓ）、Ｇ、、　ブレル（Ｂｕｒｒｅｌ　Ｉ）、Ｍ、Ｍ、、カーブ（Ｋａｒｐ）、Ａ、、ビーパン（Ｂｅｖａｎ）、Ｍ、およびヒル（Ｈｉｌｌｅ）、Ｊ、（１９８７）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、７３，７４４ポトリカス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、１．　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１８．５３５゜ロカーソサ（Ｒｏ　ｃ　ｈ　ａ−５ｏ　ｓ　ａ）　、Ｍ、　、ンネワルド（Ｓ６ｎｎｅｗａｌｄ＞、ｕ、、７０？−（Ｆｒｏｍｍｅｒ）、Ｗ、Ｂ、、ストラドマン（Ｓｔｒａｔｍａｎ）、Ｍ、、シェル（Ｓｃｈｅ　ｌ　ｉ＞、Ｊ、およびライルミツアー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）、Ｌ、（１９８９）　ＥＭＢＯＪ、８．２３゜ライア７　（Ｒｙａｎ）、Ａ、、Ｊ、、Ｔｌ−ヤル（Ｒｏｙａ　ｌ）、Ｃ，Ｌ、、　ハッチンソ７　（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、Ｊ、およびシヨ　（Ｓｈａｗ）、Ｃ，Ｈ、（１９８９）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７，３５８４゜サイトウ　（Ｓａｉｔｏ）、Ｎ、（１９７３）　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１．５５，２９０゜ ’／　ユＬ／イヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅ、ｒ）、Ｐ、Ｈ，、セフタ−（Ｓｅｆｔｏｒ）、Ｅ、Ａ、　、ンエル（Ｓｃｈｅｌ　ｌ＞、Ｊ、およびボナート　（Ｂｏｈｎｅｒｔ）、Ｈ，Ｊ、　（１９８５ン　ＥＭＢＯＪ、４．　２５−３２゜シルパルート　（Ｓｃｈｌｐｅｒｏｏｒｔ＞、Ｒ，Ａ、、ホーケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ａ、およびホイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）、Ｐ、Ｊ、Ｊ、（１９８４）　ヨーロッパ特許出願　Ｎｏ、ＥＰ−Ａ　Ｏ１２０５１，６゜シマモト（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ）、に、、テラダ（Ｔｅｒａｄａ）、Ｒ６，イザワ（ｒ　ｚａｗａ）、Ｔ、　ｉ６よびフジモト　（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）、Ｈ，（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３３８．２７４゜シモンズ（Ｓ　ｉ　ｊｍｏｎｓ）　、　Ｐ、　Ｃ，、デツカ−（Ｄｅｋｋｅ　ｒ）　、　Ｂ、　Ｍ。

Ｍ、　、ンユラメイアー（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉ　ｊｅｒ）、Ｂ、、バーワード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）、Ｔ、Ｃ，、パンデンルゼン（Ｖａｎ　Ｄｅｎ　Ｅｌｚｅｎ）　、Ｐ、Ｊ、　Ｍ、およびホーケ？　（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ａ、（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８，２１７゜シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）、Ｊ、Ｃ，によびガーウッド（Ｃａ　ｒｗｏｏｄ＞。

Ｄ、Ｌ、（１９８４）″澱粉　化学と技術”ｐ、２５（ウィスラ−（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ）、Ｒ，Ｌ、等、編）、アカデミツクプレス、オーランド。

スミーケンズ（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）、Ｓ、、ワイスベーク（Ｗｅｉｓｂｅｅｋ）、ｐ、　、ｏビン７：／（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）、ｃ、（１９９０）　Ｔ、１．Ｂ、Ｓ、１５．　ｐ、７３゜タグ（Ｔａｇｕｅ＞、Ｂ、Ｗ、およびクリスビールス（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、Ｍ、Ｊ、（１９８８）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｔ＋ｙｓｉｏ１．８６，５０６゜チンギー（Ｔｉｎｇｅｙ）、Ｓ、Ｖ、、ウォルカ−（Ｗａｌｋｅｒ）、Ｅ、Ｌ。

およびＤＪＩ／ジ（Ｃｏｒｕｚｚｉ）、Ｇ、Ｍ、（１９８７）　ＥＭＢＯＪ。

６．３５６５−３６６９゜パンカネイト（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ＞　、Ｇ、、シュミット　（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、Ｒ１，オコーナーーサンチェス（０’　Ｃｏｎｎｏｒ−３ａｎｃｈｅｚ）。

Ａ１．ウィルミツｙ−（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）、Ｌ、およびロカーソサ（Ｒｏｃｈａ−３ｏｓａ）、Ｍ、（１９９０）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２２０，２４５．　、パンデンブルーク（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ）、Ｇ、、チムコ（Ｔｉｍｋｏ）、　Ｍ、Ｐ、　、：ｌ−シュ（Ｋａｕｓｃｈ）、Ａ、Ｐ、、キ＋’７シユモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、Ａ、Ｒ，、パンモンターギュ　（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ）　、　Ｍ、　、　ヘレラーエストレラ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌ　ｌａ）。

Ｌ、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１３，３５ｇ−３６３゜バシル（Ｖａｓ　ｉ　ｌ）、Ｖ、　、レッドウェイ　（Ｒｅｄｗａｙ）、Ｆ、およびバシル（Ｖａｓｉｌ＞、　１．　Ｋ、　（１９９０）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．８゜４２９゜バシル（Ｖａｓ　ｉ　Ｉ）　、　Ｖ、　、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、Ｓ、Ｍ、リ（Ｒｅ）。

Ｄ、、フロム（Ｆ　ｒ　ｏｍｍ）　、　Ｍ、Ｅ、およびバンル（Ｖａｓｉｌ）、Ｉ。

Ｋ、（１９９１）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．９，７４３゜ウエンズラ−（Ｗｅｎ　ｚ　Ｉ　ｅ　ｒ）　、Ｈ，−Ｃ，、ミグジー（Ｍｅｇｕｅｒｙ＞。

Ｇ、Ａ、　、ツイツタ−？　−（Ｆ　ｉ　ｓｈｅ　ｒ）　、Ｌ、　Ｈ，およびパーク（Ｐａｒｋ）、Ｗ、Ｄ、（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１２，４１゜ＴＦ工ＧＵＲＥ　４Ｆ工ＧＵＲＥ　５Ｆ工ＧＵＲＥ　６要　約　書本発明は、味、固体含量および、または組織を変化させた植物を提供する。また、本発明は、植物のポリサッカライドを分解しつる酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ構築物、場合によってはさらに第１分解ステップで生じた分解産物を５　変化しつる酵素をコードする付加的遺伝子を含むＤＮＡ構築物を用いたトランスホーメーションによりそのような植物を得る方法を提供する。

、、、、、、、、Ａ、、、、、、、Ｎ、　ＰＣＴ／ＮＬ　９１１００１７１

Claims

【特許請求の範囲】

１．植物または植物器官の炭水化物組成を変える方法であって、植物の糖を分解しうる（第１）目的酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを有するトランスジェニック植物を、該植物または植物器官がジャガイモである場合には、該（第１）目的酵素をコードするＤＮＡ配列が微生物由来であるという条件付きで、該酸素コードＤＮＡ配列が発現し該植物または植物器官の炭水化物組成が変化する誘導条件下で生育させることを特徴とする方法。
２．前記発現カセットが前記トランスジェニック植物または植物器官の発生の所定の成熟段階で前記目的酵素の発現を指令しうる調節配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記発現構築物が、前記目的酵素の組織特異的発現を指令しうることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記（第１）目的酸素をコードするＤＮＡ配列に該発現酵素を所定の細胞組織またはオルネガネラに指向させうるリーダー配列が備えられていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記目的酵素の作用の結果として前記トランスジェニック植物または植物器官において６個までのそノサッカライドユニットを含む可溶性サッカライド含量が増加することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記（第１）目的酵素が、アミラーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、フコシダーゼ、ラムノシダーゼ、レバナーゼおよびイヌリナーゼからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記（第１）目的酵素をコードするＤＮＡ配列が微生物由来である請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記（第１）目的酵素をコードするＤＮＡ配列が、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のα−アミラーゼおよびアスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼからなる群から選択される請求の範囲第７項記載の方法。
９．前記トランスジェニック植物が前記（第１）目的酵素以外に加えて該第１目的酵素の作用から生じる澱粉分解産物を基質として使用しうる第２目的酵素をコードするＤＮＡ構築物を含む一つ以上の発現構築物を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
１０．前記付加的目的酵素が、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、シクロマルトデキストリン−Ｄ−グルコスランスフェラーゼ、α−（１−４）−グルカナーゼ、α−（１−４）−グルコシダーゼ、α−（１−６）−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、Ｄ−グルコースイソメラーゼおよびイヌリナーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
１１．前記トランスジェニック植物がトマト、ジャガイモ、コーン、カッサバ、ニンジン、レタス、イチゴおよびタバコからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれか１項記載の方法。
１２．植物のポリサッカライドを分解しうる目的酵素をコードするＤＮＡ配列がトランスジェニック植物または植物器官の発生の所定の成熟段階における該目的酵素の発現を指令しうる調節配列に機能的に結合していることを特徴とする発現構築物。
１３．植物のポリサッカライドを分解しうる目的酵素をコードするＤＮＡ配列が３５ＳＣａＭＶプロモーターと機能的に結合していることを特徴とする発現構築物。
１４．植物のポリサッカライドを分解しうる目的酵素をコードするＤＮＡ配列が該目的酵素の組織特異的発現を指令しうる調節配列に機能的に結合していることを特徴とする発現構築物。
１５．請求の範囲第１２項乃至第１４項のいずれか１項記載の発現構築物を含むベクター。
１６．請求の範囲第１２項乃至第１４項のいずれか１項記載の発現カセットを含むことを特徴とするトランスジェニック植物。
１７．請求の範囲第１５項記載のベクターを含むことを特徴とするバクテリア。
１８．請求の範囲第１項または第９項のうちのいずれか１項記載の方法により炭水化物組成が変化していることを特徴とするトランスジェニック植物または植物器官。