JP3938402B2 - 炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
本発明は炭水化物含量を変化させたトランスジェニック植物の開発に関する。
(関連技術)
炭水化物の組成が変化した穀物を開発し、特定の用途により適した植物または植物器官を提供することは古くから農業の目標となっている。このような改良植物は、風味が良くなり、望ましい糖分の含量が高く、および、またはより望ましい構造の植物産物を提供する。これらの穀物は直接消費するか、または、さらに処理してから使用する。
トウモロコシ(シャノン(Shannon)およびガーウッド(Garwood),1984)、エンドウ(バタカリヤ(Bhattacharyya)等、1990)、ジャガイモ(ホーベンカンプーハーメリンク(Hovenkamp−Hermelink)等、1987)、アラビドプシス(キャスパー(Caspar)等、1985;リン(Lin)等、1988a;リン(Lin)等、1988b)およびタバコ(ハンソン(Hanson)等、1988)等のいくつかの植物種では、炭水化物組成が変化した変異体が発見されている。この現象は主に澱粉の合成の調節に関連する酵素における突然変異に起因する。これらの変異体のうちのいくつかは、直接消費しうるスイートコーン(シャノン(Shannon)およびガーウッド(Garwood)、上述)など食品工業で既に使用されている。
澱粉代謝が変化した変異体は、ランダムスクリーニング操作や育種など古典的手法を用いて得ることが出来る。しかし、これらの方法は煩雑で長時間を必要とする。さらに、育種は、スクリーニングする表現型を与えることが可能であるが、他の望ましい特性の損失や、望ましくない特性(高アルカロイド含量のジャガイモ等)の誘導を起こす可能性がある。遺伝子工学による植物の特性の変化は、精密で予測可能な方法であり、ゲノムのスプライスされる遺伝子の性質は分かっていて望ましくない遺伝子が同時に組み込まれることはない。最後に、古典的手法を用いた特定の特性の変化、例えば変異体における特定の産物のレベルまたは性質の変化は困難である場合が多く、出来ないこともある。遺伝子的技術は新しい戦術を提供し、従来の方法で得ることが出来なかった産物を生じることが可能になった。
遺伝子工学に基づき、炭水化物組成を改良した植物を得る巧妙で予測可能な方法を開発することが望ましいことは明白である。
アメリカ特許4,801,540には、ポリ(1,4−α−D−ガラクトウロニド)グリカンをガラクトウロニン酸に加水分解しうる酵素をコードするDNAフラグメントが公開されている。この酵素をコードする構造遺伝子を修正した調節領域に結合し、この酵素の発現を調節した発現構築物が提供されている。この文献に報告されている発明の目的は、ポリガラクトウロニン酸の分解を防ぎ、果実の成熟を調節するためにポリガラクトウロナーゼの発現レベルを減少させることにある。
PCT出願WO 89/12386では、植物中でスクラーゼやレバンスクラーゼ等の酵素の発現を介して炭水化物含量を変えた植物とその方法が公開されている。この発明の目的は、果実中の高分子量炭水化物ポリマー濃度を高め、固形物の可溶性および粘度を変化させることにある。
ヨーロッパ特許出願438,904は、ホスホフラクトキナーゼ活性レベルを増加し、スクロースの有意な減少および塊茎に蓄積する糖の減少を招く植物代謝(特に塊茎における)の修正を報告している。
PCT出願WO 90/12876は、遺伝子的に修正したジャガイモ植物のおける内在的α−アミラーゼ活性の調節について報告している。この公開は、還元糖がジャガイモを揚げているときにミラード反応を起こし、製品の風味や組織に有害な効果を引き起こすことから、ポテトチップの生産にはジャガイモα−アミラーゼ活性の低下、すなわち澱粉の還元糖への分解の低下が望ましいと報告している。一方、この公開は、もしもこの修正したジャガイモ塊茎を酒の生産を目的とした醗酵に用いるなら、より高いジャガイモα−アミラーゼ活性、すなわちより高い還元糖含量が望ましいことを報告している。
(発明の概要)
本発明は、ポリサッカライド組成を変化させたトランスジェニック植物または植物器官、並びに該植物の生産方法を提供する。このことは、植物に植物のポリサッカライドを分解する酵素をコードするDNA配列を導入することによって行う。
また、本発明は、植物のトランスホーメーションに用いるDNA発現構築物およびベクターを提供する。この発現構築物は、選択されたポリサッカライド修正酵素の発現を指令しうる調節配列のコントロール下にある。また、これらの調節配列には、植物または植物器官、および、または組織の望ましい分化段階で特異的に選択された酵素の発現を指令しうる配列が含まれる。
さらに、植物における目的産物に依存して、植物に一つ以上の別の発現構築物が導入される事もある。これらの付加的発現構築物には、最初の酵素反応で生ずる分解産物を望ましいオリゴまたはモノサッカライドに転換する第二の酵素をコードするDNA配列が含まれる。
本発明により提供されるトランスジェニック植物は、味、固体含量および、または組織が改良された新しい産物としての用途がある。
(図式の簡単な説明)
第1図 バイナリーベクターpMOG23。
第2図 ベクターpPROM54中に存在するバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ遺伝子のゲノム配列。
第3図 種々の構築に使用する合成オリゴヌクレオチド二本鎖。
第4図 メチオニン翻訳開始コドンに続いてバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムDNA配列を有するバイナリープラスミドpMOG23を含むバイナリーベクターpMOG228。
第5図 メチオニン翻訳開始コドンに続き、ジャガイモ由来のクラス−Iパタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムDNA配列を有するバイナリーベクターpMOG23を含むバイナリープラスミドpMOG450。
第6図 いずれもメチオニン開始コドンに続き、かついずれもジャガイモ由来のクラス−Iパタチンプロモーターのコントロール下にあるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟α−アミラーゼおよびアスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来の成熟グルコアミラーゼをコードするDNA配列を有するバイナリーベクターを含むバイナリープラスミドpMOG437。
(発明の詳細な説明)
本発明は、植物にポリサッカライドを分解しうる特定の酵素をコードするDNA配列を安定に導入することにより、従来の植物育種法の問題点を克服してポリサッカライド組成を改良した植物または植物器官を提供する。
予想に反して、バクテリアα−アミラーゼ遺伝子(分泌シグナル配列を欠く)によるタバコのトランスホーメーションは、α−アミラーゼ活性の指標であるマルトースやマルトトリオース等のマルトデキストリンを蓄積することが分かった。この知見は、ポリサッカライド分解酵素をコードする遺伝子の導入および翻訳により、植物中のポリサッカライド組成を修正しうることを示している。
α−アミラーゼの導入による澱粉の分解は、植物細胞における澱粉合成の全過程が澱粉が貯蔵されている特定のオルガネラ(クロロプラスト、アミロプラストなど)で起こり、一方発現するα−アミラーゼは、これをそのようなオルガネラに送る配列がないことから細胞質中に存在することが期待されるので非常に驚くべきことである。特定の澱粉分解酵素は、植物の葉細胞の細胞質中に存在する。しかし、細胞質中でのそれらの機能はまだ解明されておらず、それら二つが仕切りで分断されていることから澱粉の分解との関連は分かっていない(キャスパー(Caspar)等、1989;リン(Lin)等、1988a,bおよびc;オキタ(Okita)等、1979)。
本発明における植物の味、および、または組織の変化の程度は、サッカライド修飾酵素の選択、目的の酵素の発現を目的とするDNA構築物の調節領域の選択および発現酵素の所定の細胞内部位への輸送を含む種々の手段で調節しうる。
目的酵素の選択が、目的の最終産物を得る上でもっとも重要であることは明白である。一つの植物中で一つ以上の酵素を発現したい場合は、各酵素の比を至適効果(例えば、甘味など)が得られるように選択すればよい。
また、発現レベルおよび発現の空間的(組織/器官特異的)および、または分化的調節に関する目的酵素の発現の調節も至適産物を得る手段である。たとえば、目的酵素の発現の時期および、または位置に関するプロモーターのタイプおよび強さは、そのトランスホーム植物の望ましい部位における目的酵素の至適レベルを提供する。
最後に、発現した酵素が送られる部位(例えば、細胞コンパートメントやオルガネラ)は、基質とより良く接近するなど至適効果が得られるように選択することが出来る。
トランスホームDNAの組み込み部位やコピー数の違いにより発現レベルにしばしば違いが見られる。この自然のばらつきを用いて、甘味、組織等に関する望ましい特性を有するトランスジェニック植物から個々の植物を選択できる。これらの個々の植物は、別の特性を持つ植物種の増殖および、または育種に使用できる。
以上に示した特性を組み合わせて望ましい効果を得ることが出来る。また、以下に示す内容を用いて至適産物を得る方法が決定される。
本発明において、植物中で発現される目的の酵素には、植物のポリサッカライドを分解しうる酵素または酵素群の組み合わせが含まれる。特に、微生物由来のDNA配列によってコードされる酵素が好ましい。必要ならば、コード配列および、または調節配列を修正して、細胞質、またはオルガネラ発現組織特異性、または植物または植物器官の望ましい成熟段階における発現を誘導することが出来る。さらに、コドンを修正して選択した宿主植物における該遺伝子の発現を改良することが出来る。
本発明に使用しうる酵素には、
a)1)α−アミラーゼ(EC3.2.1.1);2)アミログルコシダーゼ(EC3.2.1.3)、β−アミラーゼ(EC3.2.1.2)、α−グリコシダーゼ(EC3.2.1.20)および他のエクソ−アミラーゼ等のエクソ−1,4−α−Dグルカナーゼ、および3)イソアミラーゼ(EC3.2.1.68)、パルラナーゼ(EC3.2.1.41)等の澱粉枝切り酵素;
b)エクソ−1,4−β−セロビオヒドロラーゼ(EC3.2.1.91)、エクソ−1,3−β−D−グルカナーゼ(EC3.2.1.39)、β−グルコシダーゼ(EC3.2.1.21)等のセルラーゼ;
c)エンド−1,3−β−グルカナーゼ(EC3.2.1.6)およびエンド−1,4−β−グルカナーゼ(EC3.2.1.4)等のエンドグルカナーゼ;d)エンド−1,5−α−L−アラビノース(EC3.2.1.99)、α−アラビノシダーゼ(EC3.2.1.55)等のL−アラビナーゼ;
e)エンド−1,4−β−D−ガラクタナーゼ(EC3.2.1.89)、エンド−1,3−β−D−ガラクタナーゼ(EC3.2.1.90)、α−ガラクトシダーゼ(EC3.2.1.22)、β−ガラクトシダーゼ(EC3.2.1.23)等のガラクタナーゼ;
f)エンド−1,4−β−D−マンナナーゼ(EC3.2.1.78)、β−マンノシナーゼ(EC3.2.1.25)、α−マンノシダーゼ(EC3.2.1.24)等のマンナナーゼ;
g)エンド−1,4−β−キシラナーゼ(EC3.2.1.8)、β−D−キシロシダーゼ(EC3.2.1.37)、1,3−β−D−キシラナーゼ等のキシラナーゼ;
h)α−L−フコシダーゼ(EC3.2.1.51)、α−L−ラムノシダーゼ(EC3.2.1.40)、ラベナーゼ(EC3.2.1.65)、イヌラナーゼ(Ec3.2.1.7)
等の他の酵素が含まれる。
さらに、場合によっては、本発明は、さらにポリサッカライド分解産物(第一ポリサッカライド分解酵素の作用で得られたもの)を望ましいサッカライドサブユニットに変化させうる第二の酵素をコードする一つ以上のDNA構築物の標的植物(宿主)への導入に関する。この第二の酵素は、微生物由来であるDNA配列にコードされる酵素であることが特に好ましい。
例として、澱粉の第一分解で得られるマルトース、マルトトリオースおよびα−デキストリンをさらに分解しうる特に好ましい第二酵素には、マルターゼ、α−デキトリナーゼ、α−1,6−グルコシダーゼ等が含まれる。これらの酵素の作用でグルコースが生成する。
本発明の別の態様では、更にモノサッカライドを修飾しうる一つ以上の第二酵素を同植物中で発現させる。これらの酵素には、グルコースイソメラーゼ、インバーターゼ等が含まれる。
目的の酵素が発現もしくは指向する環境下で活性ならば、目的の酵素をコードするDNA配列の由来は問題にならない。第一(植物ポリサッカライド分解性)酵素および必要な場合は第二酵素の選択は、基質特異性および、または目的とするサッカライド最終産物に依存する。
目的の酵素は、トランスジェニック植物の分化のすべての段階で構成的に発現させることもできる。植物または植物器官の使用に依存して、この酵素は、例えば塊茎形成または果実分化の際など、分化段階特異的に発現させうる。さらに、その使用法に依存して、この酵素を例えば果実、塊茎、葉、または種子等の植物器官特異的に発現しうる。
本発明で定義される植物ポリサッカライドとは、本発明の酵素または酵素群の作用前に通常植物中に存在する結合する6個以上のモノサッカライドからなるポリヒドロキシアルデヒドまたはケトンを含むものである。これらのポリサッカライドは一般にD−アラビノース、D−フラクトース、D−およびL−ガラクトース、D−グルコース、D−キシロースおよびマンノースのポリマーである。
本発明の望ましい最終産物であるサッカライドサブユニットとは、植物ポリサッカライドへの一つ以上の目的酵素の作用で得られるモノサッカライドを含む元のポリサッカライドよりも長さが短いサッカライドと定義される。
本発明で定義されるトランスジェニック植物には、組み換えDNA技術で遺伝子工学的に修正され目的の植物または植物器官中で少なくとも一つの目的酵素の生産を起こすかまたは増加した植物(該植物の一部および細胞も含む)およびそれらの子孫が含まれる。
本発明に使用しうる植物には、カリフラワー(ブラシカ オレラセ(Brassica oleracea))、朝鮮アザミ(シナラ スコリマス(Cynara scolymus))などの食用花生産作物、リンゴ(マルス(Malus)、例えばドメスチカス(domesticus))、バナナ(ムサ(Musa)、例えばアクミナタ(acuminata))、ベリー(スグリ等、ライベス(Ribes)、例えばラブラム(rubrum))、チェリー(スイートチェリー等、プラナス(Prunus)、例えばアビウム(avium))、キュウリ(ククミス(Cucumis)、例えばサチバス(sativus))、ブドウ(バイチス(Vitis)、例えばビニフェラ(vinifera))、レモン(シトラス リモン(citrus limon))、メロン(ククミス メロ(Cucumis melo))、ナッツ(クルミ等、ジユグランス(Juglans)、例えばレジア(regia);ピーナッツ,アラキス ヒポゲ(Arachis hypogeae))、オレンジ(シトラス(Cytrus)、例えばマキシマ(maxima))、モモ(プラナス(Purunus)、例えばパーシカ(persica))、ナシ(パイラ(Pyra)、例えばコムニス(communis))、コショウ(ソラナム(Solanum)、例えばカプシカム(capsicum))、プラム(プラナス(Prunus)、例えばドメスチカ(domestica))、ストロベリー(フラガリア(Fragaria)、例えばモスカタ(moschata))、トマト(リコパーシコン(Lycopersicon)、例えばエスクレンタム(esculentum))などの果実、アルファルファ(メジカゴ(Medicago)、例えばサチバ(sativa))、キャベツ(ブラシカ オリラセ(Brassica oleracea)等)、キクヂシャ(シコレウム(Cichoreum)、例えばエンジビア(endivia))、ニラ(アリウム(Allium)、例えばポラム(porrum))、レタス(ラクツカ(Lactuca)、例えばサチバ(sativa))、ホウレンソウ(スピナシア(Spinacia)、例えばオレラセ(oleraceae))、タバコ(ニコチアナ(Nicotiana)、例えばタバカム(tabacum))等の葉、アロールート(マランタ(Maranta)、例えばアランジナセ(arundinacea))、砂糖大根(ベタ(Beta)、例えばバルガリス(vulgaris))、ニンジン(ドーカス(Daucus)、例えばカロタ(carota))、カッサバ(マニホット(Manihot)、例えばエスクレンタ(esculenta))、カブラ(ブラシカ(Brassica)、例えばラパ(rapa))、ラディッシユ(ラファナス(Raphanus)、例えばサチバス(sativus))、ヤム(ジオスコリア(Dioscorea)、例えばエスクレンタ(esculenta))、スイートポテト(イポモエアバタタス(Ipomoea batatas))等の根、およびソラマメ(ファセオラス(Phaseolus)、例えばブルガリス(vulgaris))、エンドウ(ピサム(Pisum)、例えばサチバム(sativum))、ダイズ(グリシン(Glycin)、例えばマックス(max))、小麦(トリチカム(Triticum)、例えばアスチバム(aestivum))、大麦(ホーデン(Hordeum)、例えばバルガレ(vulgare))、コーン(ジー(Zea)、例えばマイス(mays))、米(オリザ(Oryza)、例えばサチバ(sativa))等の種子、カブキャベツ(ブラシカ(Brassica)、例えばオレラセア(oleraceae))、ジャガイモ(ソラナム(Solanum)、例えばツベロサム(tuberosum))などの塊茎などが含まれる。
植物種の選択は、その植物または植物の一部の用途およびその植物種のトランスホーメーションの難易度によって決定する。
植物における組み換え遺伝子の発現は、植物のポリメラーゼによる遺伝子の転写、mRNAの翻訳などが詳細に関係する。この事は組み換えDNA技術の分野ではよく知られている。本発明の正しい理解に関係する事のみを詳細に説明する。
本発明では、植物における目的酵素をコードする遺伝子の発現を起こすことが知られている調節配列を使用する。使用する調節配列の選択は、標的となる作物および、または器官に依存する。このような調節配列は、植物または植物ウイルスから得ることが出来るし、また化学的に合成することもできる。これらの調節配列は、使用する植物またはその一部に依存して構成的、又は分化段階および、または組織特異的に植物中での転写を指令するプロモーターである。これらのプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)(ガリー(Guilley)等、1982)の35Sプロモーターなどの構成的発現を示すプロモーター、ルビローズ ビスホスフェート カルボキシラーゼのスモールサブユニット遺伝子のプロモーターなどの葉特異的発現を行うもの(コルジ(Coruzzi)等、1984)、グルタミンシンテース遺伝子のプロモーターなどの根特異的発現を行うもの(チンギー(Tingey)等、1987)、ブラシカ ナパス(Brassica napus)由来のクルシフェリンAプロモーターなどの種子特異的発現を行うもの(ライアン(Ryan)等、1989)、ジャガイモ由来のクラス−Iパタチンプロモーターなどの塊茎特異的発現を行うもの(ロシャ・ソサ(Rocha−Sosa)等、1989;ウェンズラー(Weyzler)等、1989)またはトマト由来のポリガラクトウロナーゼ(PG)プロモーターなどの果実特異的発現を行うもの(バード(Bird)等、1988)等が含まれる。
ターミネーター配列やポリアデニレーションシグナル等、その他の調節配列には植物において機能するものが含まれるが、その選択は当業者のレベルの範囲内にある。このような配列の例には、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンテース(nos)遺伝子の3’隣接領域がある(ビーバン(Bevan)、1984)。
また、調節配列には、CaMVの35Sプロモーター中に見られるエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルス(A1MV)RNA4のリーダー配列などのmRNA安定化配列(ブリデロード(Brederode)等、1980)、または同様の機能を示す他の配列が含まれる。
本発明の態様において、植物細胞の細胞質における目的酵素の単純な発現が望ましい場合には、発現される酵素に分泌シグナルペプチドやその他のターゲッティング配列を含めるべきではない。
本発明の別の態様では、本発明の選択された酵素をコードするDNA構築物に所定の部位に発現された酵素を指向させ、その基質に酵素がより接近しやすくさせうるリーダー配列を提供している。目的の酵素に機能的に結合し、この機能を行わせるターゲッティング配列は文献に報告されている(スミーケンス(Smeekens)等、1990;バン デン ブルーク(van den Broeck)等、1985;シュレーヤー(Schreier)等、1985)。例えば、クロロプラストおよびミトコンドリアで発現させるために発現酵素は、これらのオルガネラへの輸送を目的とした特異的な所謂トランジットペプチドを含んでいる(スミケンス(Smeekens)等、1990)。もしもこの酵素の活性が液胞内で必要なら、分泌シグナル配列と酵素を液胞に送る特異的なターゲッティング配列が存在しなければならない(タグエ(Tague)等、1988)。また、この事は酵素を種子に指向させることもできる。
もしも必要な場合は、本発明の関連DNA構築物のすべての部分(プロモーター、調節−、安定化−、ターゲッティング−またはターミネーション配列)を従来法を用いて修正し、それらの調節特性を変化させることが出来る。
目的酵素をコードするDNA配列を含む発現構築物を標的植物に導入する方法は幾つかある。これらの方法には、カルシウム/ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを用いたプロトプラストのトランスホーメーション、または(コート化)粒子衝突法が含まれる(ポトリカス(Potrykus),1990)。
これらの所謂直接的DNAトランスホーメーション法に加えて、「ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、フレーリー(Fraley)等、1986)およびバクテリアウイルス(例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)由来、ポトリカス(Potrykus)、1990)等のベクターを含むトランスホーメーションシステムが広く使用されている。トランスホームしたプロトプラスト、細胞、または植物の一部の選択、および、またはスクリーニング後、これらは従来法を用いて完全な植物に再生する(ホーシュ(Horsch)等、1985)。トランスホーメーションおよび、または再生の方法は本発明にとって本質的なものではない。
双子葉植物の場合の本発明の態様は、毒性遺伝子を有するプラスミドおよび転移する遺伝子構築物を有する適合プラスミドを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)を使用するバイナリーベクターシステムの方法を取る(ホーケマ(Hoekema)等、1983;シルパルート(Schilperoort)等、1984)。このベクターは大腸菌およびアグロバクテリウム(Agrobacterium)のいずれにおいても複製可能で、細部にわたって本発明には関係しないように修正したバイナリーベクターBin19(ビーバン(Bevan)、1984)から誘導される。この実施例で使用するバイナリーベクターには、T−DNAの左右の境界領域のあいだにカナマイシン耐性をコードするNPTII−遺伝子と必要とされる遺伝子構築物をクローン化するための多重クローニング部位を含んでいる。
単子葉作物のトランスホーメーションおよび再生には標準的方法はない。しかし、最近の科学の進歩は、原則的に単子葉植物はトランスホームが容易であり、トランスホームした細胞から稔性トランスジェニック植物が再生しうることを示している。これらの作物に対する再生産可能な組織培養システムの発達は、植物細胞への遺伝子物質の導入に関する強力な方法とともに、トランスホーメーションを可能にしている。現在、単子葉植物のトランスホーメーションの方法には、植物片または細胞サスペンジョンへの微粒子衝突、およびプロトプラストの直接的DNA取り込みまたはエレクトロポレーションがある。例えば、選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性をコードするバクテリアhph遺伝子を用いて、トランスジェニック米植物がうまく得られている。この遺伝子はエレクトロポレーションで導入した(シマモト(Shimamoto)等、1989)。また、微粒子衝突により、トウモロコシ懸濁培養物の胚芽細胞にホスフィノスリシン アセチルトランスフェラーゼ(除草剤ホスフィノスリシンを不活性化する酵素)をコードするストレプトミセス ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)由来のbar遺伝子を導入することにより、トランスジェニックトウモロコシ植物が得られている(ゴードン−カム(Gordon−Kamm)等、1990)。小麦や大麦などの他の単子葉作物の糊粉プロトプラストへの遺伝子物質の導入が報告されている(リー(Lee)等、1989)。最近、微粒子衝突による小麦細胞懸濁培養物の安定なトランスホーメーションが示された(バシル(Vasil)等、1991)。胚芽懸濁培養を行うために古く小さくて節のある胚芽カルス組織だけを選択し、その培養物から小麦植物を再生した(バシル(Vasil)等、1990)。これらの作物に対するトランスホーメーションシステムと再生技術を組み合わせることにより、本発明の単子葉植物への応用が可能となる。また、これらの方法は、双子葉植物のトランスホーメーションや再生にも応用しうる。
必要ならば、目的の一つ以上の酵素を発現するトランスジェニック植物を得るために多くの方法を使用する。これらには、
a.目的の異なる酵素を各々発現するトランスジェニック植物の交配。
b.各自必要な調節配列を含む目的の酵素をコードする複数の遺伝子を含むDNAフラグメントまたはプラスミドによる植物のトランスホーメーション。
c.必要な調節配列を有する目的の酵素をコードする遺伝子を各々が含んでいる異なるDNAフラグメントまたはプラスミドによる同時の植物へのトランスホーメーション。
d.必要な調節配列のコントロール下にある目的の異なる酵素をコードするDNAフラグメントまたはプラスミドを用いた連続的な植物のトランスホーメーション。
e.上述の方法の組み合わせ。
以上a−eの方法があるが、これらの方法に限定されるわけではない。
上記の方法の選択は本発明にとって本質的なものではない。
本発明の一態様において、タバコおよびトマト植物の細胞中でα−アミラーゼが構成的に発現され、同植物中の澱粉を低分子量の糖に分解している。バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟α−アミラーゼをコードする、すなわち、シグナルペプチド配列を含まないα−アミラーゼをコードするゲノムDNAフラグメントが、CaMV 35Sプロモーターおよびエンハンサー配列のコントロール下に置かれた。A1MV由来のRNA4のmRNA安定化リーダー配列が、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンテース(nos)遺伝子のターミネーターおよびポリアデニレーションシグナル配列とともに含まれている。その後、この構築物をpMOG23(1990年1月29日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号CBS102.90で登録されている)等のバイナリーベクターにサブクローニングする。このベクターをジスアームドTi−プラスミドを含むアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞を標的植物由来の組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地中で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には、安定に組み込まれた遺伝子が含まれ、細胞中でα−アミラーゼが発現される。
このトランスジェニック植物のα−アミラーゼ酵素活性は、比色による直接的酵素検定法またはゲル検定法により検定できる。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。この蛋白質は、バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロットで検出しうる。
この植物を沃素で染色することにより澱粉含量を定量する。また、NMRおよびHPLCなどの方法を用いて澱粉分解産物の存在を定量的に検定する。これには別の方法も使用できる。この方法は本発明にとって本質的なものではない。
別の好ましい態様では、ジャガイモでα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方が発現されている。この酵素はその植物の塊茎のみで発現している。この結果、両酵素により塊茎中の澱粉が低分子の糖に分解される。バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟α−アミラーゼをコードするゲノムDNAフラグメントおよびアスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来の成熟グルコアミラーゼをコードするcDNAフラグメントが、各々ジャガイモ由来のクラスーIパタチン遺伝子の塊茎特異的プロモーターのコントロール下に置かれている。また、両構築物にはアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンテース(nos)遺伝子のターミネーターおよびポリアデニレーションシグナル配列が含まれる。その後、両構築物を一緒にバイナリーベクターpMOG23にサブクローン化する。このベクターを、ジスアームドプラスミドTiを含むアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)に導入する。この構築物を含むバクテリア細胞をジャガイモ植物由来の組織と共培養し、トランスホームした植物細胞を抗生物質を含む栄養培地で選択後、同培地で分化した植物の再生を誘導する。生成した植物には安定に組み込まれた遺伝子が含まれている。α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方が、トランスホームしたジャガイモの塊茎でのみ発現している。両酵素は細胞内で発現している。
トランスジェニック塊茎におけるα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ酵素活性は、種々の検定法で検定しうる。例えば、グルコアミラーゼ活性は、グルコアミラーゼによるp−ニトロフェノール−α−D−グルコピラノシドから放出されるp−ニトロフェノールを測定することにより決定する。α−アミラーゼ活性は、先に示し、また以下の実施例で述べるように測定しうる。両酵素の存在は、例えば、イムノブロッティングにより示される。この検定法は本発明にとって本質的なものではない。
トランスジェニックジャガイモ塊茎の炭水化物組成を、HPLCおよびNMR等の糖の検出技術を用いて検定する。別の方法を使用することもできる。どの方法を用いるかは本発明にとって本質的ではない。
高含量のポリサッカライド分解産物を有し、結果的に風味が変わり、および、または組織が改良されたトランスジェニック植物または植物器官(花、果物、葉、根、塊茎など)は、そのまま、または植物の糖の変化による品質を維持する非醗酵的処理後に使用される。このような使用の例には、ベビーフード、ジュース、ソース、ペースト、濃縮物、甘味料、ジャム、ゼリー、シロップおよび動物飼料の生産が挙げられる。炭水化物組成が変わった穀物は、例えば、味の良いべーキング産物の生産に使用される。炭水化物組成の変わったタバコは、味や香りの変化を示す。
また、それらの植物または植物からポリサッカライド分解産物が抽出され、甘味料としてや種々の過程で使用される。
以下の実施例は、当業者を対象として本発明の生成法および使用法を完全に公開および説明することを意図するもので、本発明の範囲を制限するものではない。使用する数字(例えば、量、温度、pH等)は、正確を期するよう努力したが、いくらかの実験誤差やばらつきがあることを考慮しなければならない。特筆しないかぎり温度は℃で示し、圧力は大気圧付近である。
(実施例1)バイナリーベクターpMOG23の構築
バイナリーベクターpMOG23(1990年1月29日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号CBS102.90で登録されている;第1図)は、ベクターBin19(ビーバン(Bevan)、1984)の誘導体である。まず、ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子II(NPTII)に関して左境界(LB)と右境界(RB)を交換した。次に、LBの方向に転写してNPTII遺伝子の方向を逆にした。最後に、Bin19のポリリンカーを以下の制限酵素認識部位:EcoRI,KpnI,SmaI,BamHI,XbaI,SacI,XhoIおよびHindIIIを有するポリリンカーで置換した。
(実施例2)バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング
本実施例のすべてのトランスホーメーションは、大腸菌DH5α株で行った。a.バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ遺伝子の調製
バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼ遺伝子(第2図)は、ヨーロッパ特許出願224,294(参考として引用する)に公開されているバチルス(Bacilli)ベクターpPROM54中に存在する。このプラスミドpPROM54は、1985年11月5日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号CBS696.85で登録されている。
このプラスミドpPROM54をXbaIおよびBclIで消化した。このXbaI/BclIフラグメントを、予めXbaIおよびBamHIで消化したプラスミドpUC18にクローン化しプラスミドpMOG318を調製した。テンプレートとしてpMOG318を使用し、ミスマッチプライマーを使用してBamHI部位を生成するPCRを行ってSalI/BamHIフラグメントを合成した(生成したBamHI部位の位置は第2図に示した)。このSalI/BamHI PCRフラグメントを、予めSalIおよびBamHIで消化したプラスミドpIC−19R(マーシュ(Marsh)等、1984)にクローニングし、プラスミドpMOG319を調製した。α−アミラーゼ遺伝子の5’末端を含むpMOG318のSalIフラグメント(第二のSalIは、pUC18中に存在する)を、SalIで消化したpMOG319にクローン化した。これで、全α−アミラーゼ遺伝子を含むプラスミドpMOG320が生成した。
b.ベクターpMOG18の構築
pROKI(ボールコーム(Baulcombe)等、1986)の発現カセットをEcoRI/HindIIIフラグメントとしてpUC18にクローン化した。このカセットには、EcoRI/BamHIフラグメント上に800塩基長のカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35SプロモーターフラグメントおよびBamHI/HindIIIフラグメント上にアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンテース(nos)転写ターミネーターが含まれる。このプロモーターフラグメントには、CaMVプロモーターの−800から+1(両部位を含む)の配列が含まれる。部位+1は転写開始部位である(ギリー(Guilley)等、1892)。部位−512のNcoI部位の上流の配列が欠失しており、またこの部位はEcoRI部位に変わっている。この事は、NcoIでpUC18中にある発現カセットを切断し、クレノーポリメラーゼで一本鎖を平滑化してEcoRIリンカーをライゲーションすることにより行った。
このプラスミドをEcoRIで切断し、元のNcoI部位の上流にあるCaMV35Sプロモーターの配列を有するEcoRIフラグメントを欠失させた。nosターミネーターを含むBamHI/HindIIIフラグメントをフルファルファモザイクウイルス(A1MV)のRNA4のリーダー配列(ブレデロード(Brederode)等、1980)を含む合成DNAフラグメント(オリゴヌクレオチド二本鎖A、第3図)で置換した。この事は、BamHIによる切断、HindIIIによる切断および合成DNAフラグメントのライゲーションで行った。このBamHI部位および三個の上流ヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発で欠失させた。
そのプラスミドにnosターミネーターを含むBamHI/HindIIIフラグメントを再導入した。β−グルクロニダーゼを含む遺伝子(プラスミドpRAJ275由来、ジェファーソン(Jefferson)、1987)をNcoI/BamHIフラグメントとしてライゲーションし、プラスミドpMOG14を調製した。
−343と−90の間の配列の重複はCaMV35Sプロモーターの活性を増加することが知られている(カイ(Kay)等、1987)。二重の所謂エンハンサー配列を含むプロモーターフラグメントを得るために、プラスミドpMOG14由来のエンハンサーフラグメントをAccI/EcoRIフラグメントとして単離し、クレノーポリメラーゼで末端平滑化した。このフラグメントを、EcoRIで切断し末端平滑化したpMOG14に導入した。この結果、平滑化したEcoRIとAccIの境界で新しいEcoRIが生成した。このプラスミドpMOG182には、二重エンハンサー配列を有するCaMV35Sプロモーター、A1MVのRNA4リーダー配列およびEcoRI/HindIIIフラグメントとして存在する発現カセット中のnosが含まれている。
c.バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼ遺伝子のバイナリーベクターへのクローン化
プラスミドpMOG320をHgaIおよびBamHIで消化した。このHgaI/BamHIフラグメントを合成オリゴヌクレオチド二本鎖B(第3図)と共に、NcoIおよびBamHIで消化したpMOG322にクローン化した。β−グルクロニダーゼ遺伝子をメチオニン翻訳開始コドンをコードするATGトリプレットに続くバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)の成熟α−アミラーゼをコードする配列で置換した。プラスミドpMOG18は、カリホルニアモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーターおよびエンハンサー、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンテース(nos)ターミネーターおよびアルファルファモザイクウイルス(A1MV)のRNA4リーダー配列を含んでいる。この構築物にはシグナルペプチドをコードする情報は含まれていない。この全構築物をEcoRIおよびHindIIIで切断し、EcoRIおよびHindIIIで消化したバイナリーベクターpMOG23にライゲーションした。生成したプラスミドをpMOG228と命名した。
このバイナリーベクターpMOG228上のキメラα−アミラーゼ遺伝子を、プラスミドpRK2013を有する大腸菌HB101株を用いたトリペアレンタルメーティングにより(ジッタ(Ditta)等、1980)、植物へのT−DNAの移行に必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404株に導入した(ホーケマ(Hoekema)、1983)。
(実施例3)タバコのトランスホーメーション
タバコ(ニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum)cv.ペチット ハバナ(Petit Havanna)SR1)を、α−アミラーゼ遺伝子を有するバイナリーベクターpMOG228を含むアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)と植物葉ディスクとの共培養(ホーシュ(Horsch)等、1985)でトランスホーメーションした。このトランスジェニック植物をカナマイシン耐性で選択し、目的の酵素活性に関して検定した。α−アミラーゼ遺伝子を発現する植物は、さらに詳細に分析し以後の実験に使用した。
無菌的に生育させたタバコ(ニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum)cv.ペチット ハバナ(Petit Havanna)SR1)の葉から約5×5mmのディスクを切りだし、1%(v/v)となるようにアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pMOG228)(109細胞/ml)を混合した30g/lのスクロースを含むMS培地(ムラシゲ(Murashige)およびスコーグ(Skoog)、1962)に、20分間浮かした。このディスクを濾紙上で簡単に乾燥し、30g/lスクロース、7g/l寒天、1mg/lケラチンおよび0.03mg/lナフチル酢酸(NAA)を含むMS固体培地を含むプレートに移した。二日後、このディスクを、500mg/lカルベニシリンを含む同培地のプレートに移した。一週間後、このディスクを約50mg/lカナマイシンを含む同培地のプレートに移しトランスジェニックな新芽を選択した。このディスクを三週間ごとに新しいプレートに移した。成長してくる新芽を切りだし、根を成長させるために30g/lスクロース、100mg/lカナマイシンおよび100mg/lセフォタキシムを含むMS固体培地を含むポットに移した。根が成長してきたら、これを土壌に移す。この植物を目的の遺伝子発現について検定した。
(実施例4)トランスジェニックタバコ植物におけるα−アミラーゼの発現
56℃におけるα−アミラーゼ活性をサイトウ(Saito)(1973)の方法で検定した。この場合のユニットは、10分間で690nmの吸収を10%減少させる酵素量と定義する。バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼの比活性は、8.7×105U/mg蛋白質である。先端の葉(約100mg)を切りだし、100μlのα−アミラーゼ検定バッファ中でホモジナイズした(サイトウ(Saito)、1973)。このホモジネートをエッペンドルフ遠心機で10分間遠心した。上清を回収し、蛋白質およびα−アミラーゼ含量を検定した。コントロール植物の活性レベルは検出限界以下であった。
得られた62個のトランスジェニック植物の発現レベルは、0から3.29U/μg(蛋白質)の間でばらついていた。その酵素の比活性から、これらのレベルは全可溶性蛋白質の0−0.38%に相当している。平均は、全可溶性蛋白質の0.11%であった。バッファによる葉の減圧濾過および遠心による溶液の回収で単離した細胞外液にはα−アミラーゼ活性が検出されなかったことから、この蛋白質が細胞内に存在していることは明白である(シモンズ(Sijmons)等、1990)。これらの結果は、この蛋白質が目的のα−アミラーゼであることを示すウエスタンフブロットによるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼの免疫学的検出からも確認される。さらに、この確証は、抽出物および細胞外液のポリアクリルアミドゲル電気泳動でも得られる。電気泳動後、ゲルを0.04Mトリス−HCl(pH7.4)のバッファを6回取り替えながら3時間インキュベーションして酵素を再生した。このゲルに1mMCaCl2を含む0.05Mトリス−HCl(pH7.4)中0.25%ポテトリントナースターチおよび0.75%寒天を含む溶液を重層し、37℃で一番インキュベーションしたのち、1mM I2/0.5M KI水溶液で染色した。重層中の透明なゾーンとしてα−アミラーゼ活性が検出される(ラックス(Lacks)およびスプリングホーン(Springhorn)、1980)。トランスジェニック植物で、バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼと同じ分子量約55,000kDaのα−アミラーゼが検出された。
α−アミラーゼを発現する植物は、薄い淡緑色(クロロチック)でコントロール植物と比較すると増殖がいくぶん遅い。
(実施例5)トランスジェニックタバコ植物の炭水化物分析
光周期の約半分のときに回収したトランスジェニックタバコ植物の葉の澱粉含量を、96%エタノール中で葉を一晩振盪して脱染色し、0.2N HCl中5.7mMI2および43.3mM KIを含む溶液で染色することにより定性的に測定した。澱粉を含む葉は紺に染色され、澱粉を含まない葉は黄褐色に染色される(キャスパー(Caspar)等、1985)。
コントロールおよびトランスホームした(α−アミラーゼ発現良好)植物由来の葉約2.5gを、ウルトラタラックスを用い10mlの水中4℃でホモジナイズした。顕微鏡観察で生の細胞が残存していないことを確認した。遠心による細胞フラグメントの除去後、緑色上清のグルコースオリゴマー含量を測定した。濾過したサンプルは、溶出液として水を用いたアミネックスHPX−42Aカラム(300mm×7.8mm,85℃)のHPLCで分析した。トランスホーム植物のサンプルにはマルトースおよびマルトトリオースの存在が確認されたが、コントロール(非トランスホーム)植物には確認されなかった。この結果を表1に示す。
(実施例6)塊茎特異的発現構築物におけるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)のα−アミラーゼ遺伝子のクローニング
本実施例の大腸菌のトランスホーメーションは全てDH5α株を用いた。
塊茎特異的発現用の発現カセットを構築するために、ジャガイモのクラス−Iパタチン遺伝子のプロモーター(ソラナム ツベロサム(Solanum tuberosum)cv.ビンテ(Bintje))を、テンプレートとして単離したゲノムDNAを用いたポリメレースチェーンリアクションリアクションで合成した(メトラー(Mettler)、1987)。ジャガイモ中でクラス−Iパタチン遺伝子は塊茎特異的発現を示した。いくつかのパタチンマルチジーン群のコードおよび隣接両配列が決定されている(ロカ−ソサ(Rocha−Sosa)等、1989;ビーバン(Bevan)等、1986;ミグネリー(Mignery)等、1988)。β−グルクロニダーゼに融合したクラス−Iパタチン遺伝子の5’隣接領域を含みβ−グルクロニダーゼの塊茎特異的発現を起こすキメラ遺伝子が報告されている(ウェンズラー(Wenzler)等、1989)。pAT21およびB33の配列に対応する二つのオリゴヌクレオチド(ミグネリー(Mignery)等、1989;ビーバン(Bevan)等、1986)を合成し、HindIII/NcoIフラグメントとしてクラス−Iパタチン5’隣接領域を増幅した。
このオリゴヌクレオチドは、その末端に適当な制限部位(HindIIIおよびNcoI)を含むよう設計し、その制限酵素でフラグメントを消化後発現カセットへの組込みを可能としている。機能的クラス−Iパタチンプロモーターフラグメントを含む約1.3kbのフラグメントを合成した。ライゲーションによるEcoRI合成リンカーの付加後、このフラグメントをEcoRIで線状化したpUC18にクローン化しpMOG546を調製した。三者ライゲーションではプラスミドpMOG546のHindIII/NcoIフラグメントを、プラスミドpMOG322のNcoI/HindIIIフラグメント(実施例2参照、ATG翻訳開始コドンにつづき、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のnosターミネーターを従えるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)の成熟αをコードする)と共に、HindIIIで切断したバイナリーベクターpMOG23にライゲーションしてバイナリープラスミドpMOG450を調製した(第5図参照)。
(実施例7)トマトのトランスホーメーション
トマト(リコペルシコン イスクレンタム(Lycopersicon esculentum)cv.マネーメーカー(Maneymaker))をアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404(pMOG228)でトランスホームした。基礎培養培地は、30g/lスクロース、B5ビタミン(ガンボーグ(Gamborg)、1970)、2mg/lジーチンリボシドおよび0.1mg/l酢酸インドール(IAA)を補ったMS培地(ムラシゲ(Murashige)およびスコーグ(Skoog)、1962)を含んでいる。必要な場合はこの培地を0.7g/lのダイチン寒天で固形化した。
日令6才の無菌的に生育させたシードリングの子葉の両端を切り、日令10才のペチュニア(Petunia)細胞サスペンジョンのフィーダーを含む固体培地上で24時間プレインキュベーションした。この子葉をMS培地で洗浄したアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pMOG228)株の対数期培養物と24時間共培養した。この子葉を滅菌した濾紙で簡単に乾燥し、日令10才のペチュニア(Petunia)細胞サスペンジョンのフィーダー層を含む固体培地上に置いた。48時間後、この子葉をフィーダー層を含まず、200mg/lセフォタキシムおよび100mg/lバンコマイシンを含む同培地を含むプレートに移した。共培養5日後、この子葉を100mg/lカナマイシンを含む同培地に移した。この子葉を三週間毎に新鮮なプレートに移し変えた。
新芽を切りだし、根づけ培地(10g/lスクロース、100mg/lセファロタキシムおよび50mg/lバンコマイシンを補ったMS培地)上に置いた。根付き後、その植物を土壌に移し、α−アミラーゼの発現を検定した。
(実施例8)トマトにおけるバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼの発現およびトランスジェニックフルーツの炭水化物分析
構成的発現構築物pMOG228によるトランスホーメーションから得たトランスジェニックトマトの発現型は変わらなかった。土壌で3週間生育させたトランスジェニックトマトの葉のα−アミラーゼ活性を実施例4の方法で検定した。分析した植物中のα−アミラーゼ発現レベルは、0から1.2U/μg(可溶性蛋白質)の範囲にあった。この酵素の存在は、バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認された。
土壌に3週間生育させ、光周期の中点で回収した植物から得た葉中の澱粉含量を、実施例5で述べた方法で測定した。α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の葉に含まれる澱粉量は、コントロール植物のものより少なかった。
(実施例9)アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来の成熟グルコアミラーゼをコードするcDNAのクローニング
本実施例の大腸菌のトランスホーメーションで使用する株は全てDH5α株である。
a.アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)からのポリA+RNAの単離
アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)DS 2975株(1988年8月10日、オランダ、バーン、セントラル・ブリュー・ボア・シメルカルチャーズに受理番号CBS513.88で登録されている)の約1×108個の胞子を、1リットル当たり1g KH2PO4;30gマルトース;5gイーストイクストラクト;10gカゼイン加水分解物;0.5g MgSO4・7H2Oおよび3g Tween80を含む100mlの前培養培地中でインキュベーションした。このpHを、5.5に調整する。
ロータリーシェーカー中、34℃で一晩増殖させたのち、培養物1mlを、1リットル当たり2g KH2PO4;70gマルトデキストリン(マルデックスMDO3,アミラム);12.5gイーストイクストラクト;25gカゼイン加水分解物;2g K2SO4;0.5g MgSO4・7H2O;0.03g ZnCl2;0.02g CaCl2;0.05g MnSO4・4H2OおよびFeSO4を含む100mlの本培養培地中でインキュベーションした。このpHを5.6に調整する。140時間で菌糸体が生育してくるので、これを回収する。乾燥した菌糸体0.5gを液体窒素で凍結し、粉末とする。つづいて、オーフレー(Auffray)およびロージャン(Rougeon)(1980)の方法に従い、菌糸体を、0℃で3M LiCl,6M尿素溶液10ml中、ウルトラ ツラックスを用いてホモジナイズし、4℃に一晩維持する。16,000×gの遠心で全細胞RNAが得られるので、これを3mlの10mMトリス−HCl(pH7.4)、0.5%SDS溶液に溶かし、フェノール:クロロホルム:イソアミルフルコール(50:48:2)で二回抽出する。ポリA+を選択するため、全RNAサンプルを65℃で5分間加熱し、0.5M NaClとした後、オリゴ(dT)−セルロースカラムにかける。10mMトリス−HCl(pH7.0)、0.5%SDSおよび0.1mMNaClを含む溶液で数回洗浄後、10mMトリス−HCl(pH7.0)および0.5%SDSを含む溶液でポリA+RNAを回収する。
b.グルコアミラーゼをコードするcDNAの調製およびクローニング
cDNAの第一鎖を合成するために、実施例11aで単離したポリA+RNA5μgを16.5μlの水に溶かす。つづいて、以下の成分を添加する:2.5μlRNasin(30U/μl)、50mMトリス−HCl、6mM MgCl2および40mM KClを含むバッファ10μl、1M KCl 2μl、0.1M DTT 5μl、オリゴ(dT)12-18(2.5mg/ml)0.5μl、8mM dNTPミックス5μl、BSA(1mg/ml)5μ1およびモロニーMLV逆転写酵素(200U/μl)2.5μl。この混合物を37℃で30分間インキュベートし、その後10μlの0.2M EDTAおよび50μlのH2Oを添加して反応を停止する。110μlのクロロホルムで抽出した後、5分間遠心し、その水層を回収して110μlの5M NH4Acおよび440μlのエタノール(温度−20℃)を添加する。ドライアイス/エタノール溶液中30分間沈澱化を行う。0℃、10分間の遠心後、cDNA/mRNAペレットを70%氷冷エタノールで洗浄する。このペレットを乾燥し、20μlの水に溶かす。グルコアミラーゼをコードするcDNAの単離はポリメレースチェーンリアクションリアクションで行う。ボール(Boel)等、(1984)に報告されているグルコアミラーゼG1cDNAのヌクレオチド配列に基づき、二つのオリゴヌクレオチドを合成する。
これら二つのオリゴヌクレオチドを用い、ATG翻訳開始コドン(下線)につづき、適当なクローニング部位に隣接する成熟型、即ち、分泌シグナルペプチドおよびプロペプチドを含まない酵素をコードする領域を増幅する。得られたDNAをNcoIおよびSstIで消化する。CaMV35Sのターミネーター転写フラグメントを含むp35SGUSINT(バンカネイト(Vancanneyt)等、1990)のSstI/HindIIIフラグメントと共に、NcoI/SstIフラグメントを三者ライゲーションにより予めNcoIおよびHindIIIで消化したpMOG18(実施例2参照)にクローン化して、pMOG567を調製する。
pMOG567のPstI/SstIフラグメントをPstIおよびSstIで消化したpIC20H(マーシュ(March)等、1984)にクローン化する。このプラスミドではPstI/HindIIIフラグメントが相当するアミログルコシダーゼcDNAフラグメントと置き変わっており、これをpMOG568と命名する。HindIII/SstIフラグメントの配列をボール(Boel)等、(1984)の配列と比較する。pMOG568のPstI/SstIフラグメントをアミログルコシダーゼcDNAのPstI/StyIフラグメントにライゲーションし、生成したフラグメントを合成アダプター:
と共に、三者ライゲーションで予めNcoIおよびSstIで消化したpMOG567にクローニングし、CaMV35Sプロモーターおよびターミネーターのコントロール下にある成熟型アミログルコシダーゼをコードするプラスミドpMOG569を調製する。
(実施例10)バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のα−アミラーゼおよびアスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来のグルコアミラーゼ両方のクローニング
本実施例のトランスホーメーションは、全て大腸菌DH5α株で行う。
プラスミドpMOG546由来のHindIII/NcoIクラス−Iパタチンプロモーターフラグメント(実施例6参照)を、アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来の成熟型アミログルコシダーゼおよびCaMV35Sターミネーターフラグメント(実施例11参照)をコードするプラスミドpMOG567のNcoI/HindIIIフラグメントと共にHindIIIで線状化したpIC19R(マーシュ(Marsh)等、1984)にクローン化し、プラスミドpMOG440を調製する。
プラスミドpMOG450(実施例6)をHindIIIで消化する。クラス−Iパタチンプロモーター、バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来の成熟型α−アミラーゼをコードするDNA配列およびアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のnosターミネーターを含むHindIIIフラグメントをHindIIIで線状化したバイナリーベクターpMOG23にクローン化する。これをバイナリーベクターpMOG436とする。
プラスミドpMOG440をEcoRIで消化する。クラス−Iパタチンプロモーター、アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来の成熟型グルコアミラーゼをコードするcDNAフラグメントおよびCaMV35Sターミネーターを含むEcoRIフラグメントを、EcoRIで線状化したバイナリープラスミドpMOG436にクローン化する。制限酵素分析を用い、タンデムに二つの発現カセットを含むトランスホーマントをスクリーニングする。この配置の発現カセットを含むバイナリーベクターpMOG437(第6図)を、トランスホーメーション実験に使用する。
バイナリープラスミドpMOG437同様に、塊茎特異的クラス−Iパタチンプロモーターのコントロール下のバチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)由来のキメラα−アミラーゼ遺伝子およびアスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)由来のキメラグルコアミラーゼ遺伝子を、トリペアレンタルメーティングでプラスミドpRK2013を含む大腸菌HB101株(ジッタ(Ditta)等、1980)と共に、植物にT−DNAを移行させるのに必要な毒性遺伝子を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404株に取り込ませる(ホーケマ(Hoekema)等、1983)。
(実施例11)ジャガイモのトランスホーメーション
ホーケマ(Hoekema)等、(1989)の方法で、ジャガイモ(ソラナム ツベロサム(Solanum tuberosum)cv.デジリー(Desiree))をアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404(pMOG437)株でトランスホームする。
基礎培養培地には、30g/lスクロースおよびR3−ビタミン(オームス(Ooms)等、1987)、場合によっては5μM ジーチンリボシド(ZR)および0.3μM 酢酸インドール(IAA)を補ったMS培地(ムラシゲ(Murashige)およびスコーグ(Skoog)、1962)であるMS30R培地を用いる。必要ならば、この培地を0.7g/lダイチン寒天で固化する。
ソラナム ツベロサム(Solanum tuberosum)cv.デジリー(Desiree)の塊茎の皮を剥き、0.1%Tween−20を含む0.6%次亜塩素酸塩溶液中で20分間表面を滅菌する。このジャガイモを少なくとも2時間かけて大量の滅菌水で完全に洗浄する。コルクボアで作成した円筒の塊茎組織を約2mmの厚さのディスクにスライスする。このディスクを106−107個/mlのアグロバクテリウム(Agrobacterium)LBA4404(pMOG437)を含む、ZR並びにIAA無しのMS30R3培地中で20分間インキュベートした。つづいて、このディスクを滅菌した濾紙で乾燥し、ZRおよびIAAを含む固体MS30R3培地に移した。2日後、このディスクを100mg/lセフォタキシムおよび50mg/lバンコマイシンを含む新鮮な培地に移した。1週間後、このディスクを100mg/lカナマイシンを含む同培地に移し、トランスジェニックな新芽を選択した。4−8週間後、このディスクから、ディスク100個当たり5−10個の頻度で新芽が出てきた。この新芽を切りだし、根付け培地(ZRおよびIAAを含まず、100mg/lセフォタキシムおよび100mg/lカナマイシンを含むMS30R3培地)上に置いて、分裂組織切断により無菌的に増殖させてから土壌に移した。この植物に塊茎を作らせ、目的の遺伝子発現を検定した。
(実施例12)ジャガイモにおけるα−アミラーゼ(バチルス リチェニホルミス(Bacillus licheniformis))およびグルコアミラーゼ(アスペルギラス ニガー(Aspergillus niger))の塊茎特異的な同時発現およびトランスジェニック塊茎の炭水化物分析
実施例7に述べたようにジャガイモ植物をバイナリーベクターpMOG437でトランスホームする。この植物をα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性に関して検定する。α−アミラーゼ活性は実施例4に示したように測定する。グルコアミラーゼの存在はアスペルギラス ニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングで示す。植物物質(約50mg)を100μlの検定バッファ中でホモジナイズする。このホモジネートをエッペンドルフ遠心機で10分間遠心する。この上清をα−アミラーゼ活性、グルコアミラーゼの存在および蛋白質含量について検定する。これらの酵素の存在は、トランスジェニックジャガイモの塊茎にのみ検出される。
両酵素を発現するトランスジェニックジャガイモの塊茎をHPLCにより可溶性糖の存在について分析する。コントロール植物に比べて、トランスジェニック塊茎にはより高含量の可溶性糖が検出される。
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Claims (15)
- 双子葉植物または双子葉植物器官の炭水化物組成を変える方法であって、α−アミラーゼをコードする構築物が発現され上記双子葉植物または双子葉植物器官の炭水化物組成が変化する条件下で、微生物のα−アミラーゼ(分泌シグナル配列を欠く)をコードする組換えDNA発現構築物を含む、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物を生育させることを含む方法。
- 上記DNA発現構築物が、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に結合しているプロモーターを含み、前記プロモーターがトランスジェニック双子葉植物または双子葉植物器官の選択された発生段階及び/又は特定の組織における、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する、請求の範囲第1項記載の方法。
- 上記DNA発現構築物が、上記α−アミラーゼをコードするヌクレオチド配列と結合したリーダー配列を含み、前記リーダー配列がm-RNA安定化配列である、請求の範囲第1項記載の方法。
- 上記トランスジェニック双子葉植物が、マルターゼ、α−デキストリナーゼ、α−1,6−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼからなる群より選択される第二の微生物の酵素(分泌シグナル配列を欠く)をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含有する、請求の範囲第1項記載の方法。
- 上記第二の微生物の酵素がグルコアミラーゼ(分泌シグナル配列を欠く)である、請求の範囲第4項記載の方法。
- 上記α−アミラーゼがバチルス・リチェニホルミス由来である、請求の範囲第1項記載の方法。
- 微生物のα−アミラーゼをコードする第一のヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターと微生物のグルコアミラーゼをコードする第二のヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターを含み、前記α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼが分泌シグナル配列を欠き、前記プロモーターがトランスジェニック双子葉植物又は双子葉植物器官の選択された発生段階及び/又は特定の組織における上記酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を指令する、組換えDNA発現カセット。
- 微生物のα−アミラーゼをコードする第一のヌクレオチド配列に機能的に結合した35S CaMVプロモーターと微生物のグルコアミラーゼをコードする第二のヌクレオチド配列に機能的に結合した35S CaMVプロモーターを含み、前記α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼが分泌シグナル配列を欠く、組換えDNA発現カセット。
- 請求の範囲第7項または第8項記載の発現カセットを含有するベクター。
- 請求の範囲第7項または第8項記載の発現カセットを含む、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物。
- 請求の範囲第9項記載のベクターを含む、菌株。
- 変化した炭水化物組成を含み、請求の範囲第1項又は第4項記載の方法で製造された、安定な形質転換トランスジェニック双子葉植物または双子葉植物器官。
- 上記第二の微生物の酵素が、基質として第一の酵素の作用により得られた分解生成物を利用する、請求の範囲第4項記載の方法。
- 上記グルコアミラーゼがアスペルギルス・ニガー由来である、請求の範囲第5項記載の方法。
- 上記トランスジェニック双子葉植物が、トマト、ジャガイモ、カッサバ、ニンジン、レタス、イチゴ及びタバコからなる群から選択される、請求の範囲第1項〜第6項、第13項及び第14項のいずれか一項記載の方法。
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