JPH10504453A

JPH10504453A - 新規のイソアミラーゼ遺伝子、この遺伝子を含む組成物、及び、イソアミラーゼの使用方法

Info

Publication number: JPH10504453A
Application number: JP8505908A
Authority: JP
Inventors: バリー，ジエラード・フランシス; キシヨー，ガネシユ・マーシー; クローン，ブラツドリー・マーテイン
Original assignee: モンサント・カンパニー
Priority date: 1994-07-28
Filing date: 1995-07-24
Publication date: 1998-05-06
Also published as: PL318354A1; AU3143795A; CA2195786A1; AU691325B2; WO1996003513A2; WO1996003513A3; EP0772683A1; HUT77745A; US5750876A

Abstract

(57)【要約】より高いアミロース対アミロペクチンの比率、中間材料の増加、又は、分枝の数がより少ない又は変化した分枝パターンを有するアミロペクチンを含む、改変されたデンプン含量を有する植物生産物を生産する方法である。この方法で使用可能なＤＮＡ構築物と形質転換植物細胞も提供する。好ましい方法は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐからのイソアミラーゼを使用し、更に好ましくは、このイソアミラーゼを、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子と組み合わせて使用する。更に、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐからの遺伝子と、この遺伝子の誘導体を含む形質転換した細菌細胞及び植物細胞とを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規のイソアミラーゼ遺伝子、この遺伝子を含む組成物、及び、イソアミラーゼの使用方法発明の背景植物デンプンの多くは、２つの多糖フラクション、即ち、アミロペクチンとアミロースとによって構成される。植物源の種類に応じて、デンプンアミロペクチン含量は典型的には７０−８５％であり、一方、これに対応して、アミロースは１５−３０％である。高度に分枝した枝分れ形態を有するアミロペクチンは、Ｄ −グルコース残基平均して２０−２５個毎に１つのα−１，６−Ｄ−グルコシド性結合によって結合した、頻繁に枝分れしたα−１，４−結合Ｄ−グルコース残基の線状鎖から成る。アミロースフラクションは、線状α−１，４−結合Ｄ−グルコースポリマー及び線状Ｄ−グルコース残基平均して１０００個毎に１つのα −１，６−Ｄ−グルコシド性結合によって構成されている。アミロースがこのように実質的に線状であることは、アミロースが、脂肪酸、低分子量アルコール、及び、ヨウ素と配位化合物をなす螺旋構造を形成することを可能にする。アミロペクチンは約１０⁷の分子量と数１０００以上の重合度を有するが、アミロースは、約１０⁵の分子量と、トウモロコシデンプンの場合の約９００からジャガイモデンプンの場合の約４０００までの範囲内の重合度を有する。これに加えて、幾つかの種類の植物からのデンプンは、中間材料と呼ばれる僅かに枝分れした第３のフラクションを含む。詳細にはキャラクタリゼーションされてはいないが、この中間材料フラクションは、１０００未満の重合度を有し、且つ、５０個以上のグルコース残基の鎖長を有する４つ又は５つの分枝だけから成ることが可能であるという点で、アミロペクチンとアミロースの両方に類似している。アミロース対アミロペクチンの比率が増大した突然変異体が、多くの植物種において知られている。こうした突然変異体のデンプン製品は商品価値を有するが、こうした突然変異体が発見される主要作物（即ち、トウモロコシ、及び、コメ）における全デンプンの収量が低いことを含む様々な問題点のために、その生産は限定されている。３つのトウモロコシ内胚乳突然変異体、ａｍｙｌｏｓｅｅｘｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）、ｄｕｌｌ（ｄｕ−１）、及び、ｓｕｇａｒｙ（ｓｕ− １）が存在し、これらでは顆粒内のアミロース量が増大しているが、そのデンプン収量は著しく低い（Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．，ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｌａｎｔｓ，ｖ．１４．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９８８）。アミロース含量が増大している様々なジャガイモ（ＮＤ８６０−２）が、向上した低温貯蔵特性を有することも知られている。高アミロースデンプンは、アミロース老化のために生じるゲル強度の劇的増大を主たる要因として、薄膜形成とゲル化とに関して特有の特性を有する。このデンプンの利点は、ａ）フライ油でフライした時に「ころも」の油吸収量がより少なくてすむこと、ｂ）ゼラチン化の速度がより早いこと（乾燥時間の短縮）、キャンディー及びソフトジェリーガムにおける構造と生地とが強化されること、及び、ｃ）電子レンジ調理食品が加熱調理後に湿っぽくなることを防止し、調理後のカリッとした状態を向上させることを含むことが可能である。更に、ジャガイモやトウモロコシのような食品のアミロース含量を増大させることは、主としてフライ油の吸収の減少によって、フライ油揚げジャガイモ又はトウモロコシ製品のカロリー値を著しく低減させることを可能にする。最後に、アミロース含量の増大は、デンプンの非食品的用途、例えば、製紙業、包装業、及び、織物業における、紙及びボール紙のサイジング用のデンプン使用、パルプに対するウエットエンド添加剤としてのデンプン使用、及び、段ボール紙の紙積層のためのデンプンの使用に、大きな利点をもたらす。イソアミラーゼ（グリコーゲン６−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．６８）は、デンプン、グリコーゲン、及び、誘導オリゴ糖のα−１，６−グルコシド結合を加水分解すると共に、予め別の酵素による初期ポリマー修飾を必要とする間接脱分枝酵素とは異なって、イソアミラーゼが非改変グルコース及び非改変デンプンに作用するという点で、イソアミラーゼは直接脱分枝酵素と見なされる。イソアミラーゼは、プルランのα−１，６結合ではなくグリコーゲンのα −１，６結合全てを切断する能力を有するという点で、他の主要なデンプン脱分枝酵素であるプルラナーゼとは異なっており、一方、プルラナーゼは、プルランをマルトトリオースに完全に加水分解するが、グリコーゲンに対する脱分枝活性は僅かである。イソアミラーゼを生産することが知られている細菌は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐＳＭＰ１、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｍｙｌｏｄｅｒｏｍｏｓａＳＢ−１５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｓｐ（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒｓｐ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、及び、Ｂａｃｉｌｌｕｓの好アルカリ性菌株を含む。より高等な植物はプルラナーゼタイプの脱分枝酵素だけを有すると考えられているが、ジャガイモ塊茎からの推定イソアミラーゼが、Ｉｓｈｉｚａｋｉ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７：７７１−７７９，１９８３；Ｌｅｅ及びＷｈｅｌａｎ，“Ｇｌｙｃｏｇｅｎａｎｄｓｔａｒｃｈｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ”，ｐ．１９１−２３４，Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ（編），ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ，ｖｏｌ．５，１９７１）で報告されている。同じジャガイモ塊茎抽出物からの２つの異なったプルラナーゼも報告されている。ジャガイモイソアミラーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓイソアミラーゼに類似した基質特異性を有したが、より高い最適ｐＨ（５．５−６．０）を有し、１７８，０００ｋＤの推定分子量を有する二量体から成った。ジャガイモイソアミラーゼは発芽中のデンプンの酵素分解に関与すると考えられているが、その生理学的役割は十分に理解されているとはいえない。ジャガイモ脱分枝酵素活性の１つがプルラナーゼ様であることが報告されている（Ｋｏｓｓｍａｎ，Ｊ．他，ｔｈｅ１ｓｔＩｎｔｌ．Ｃｏｎｆ．ｏｎＰｌａｎｔＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｏｎｄｈｅｉｍ，Ｎｏｒｗａｙ，Ｊｕｎｅ１９９４）。本発明の目的は、高アミロースデンプンを生産する方法を提供することである。本発明の別の目的は、より少ないα−１，６−Ｄ−グルコシド性分枝を有するか又は変更された分枝パターンを有し、従って、食品用及び非食品用に使用するための向上した機能特性を有する、構造的に改変したデンプンを提供することである。本発明の更に別の目的は、本発明の方法で使用するためのＤＮＡ構築物と、この構築物を含む植物細胞とを提供することである。本発明の更に別の目的は、デンプン内容物の構造的改変に基づく、改善された加工処理可能性を有する食品作物を提供することである。本発明の更に別の目的は、改善された最適ｐＨを有するイソアミラーゼを生産することが可能な形質転換細菌を提供することである。本発明の更に別の目的は、本発明のイソアミラーゼを使用してデンプンを脱分枝する方法を提供することである。発明の要約本発明は、配列番号：１として示すＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐからのイソアミラーゼに対する遺伝子を提供する。本発明は更に、作動の順（operat ive order）にａ）植物細胞中で機能してＲＮＡ配列の生産を生じさせるプロモーター、ｂ）イソアミラーゼをコードする構造コーディング配列、及び、ｃ）上記植物細胞内で機能してＲＮＡ配列の３’末端に対するポリアデニラートヌクレオチドの付加を生じさせる３’非翻訳領域を含むＤＮＡ構築物を提供し、上記プロモーターが上記構造コーディング配列に対して異種であり、上記プロモーターが、上記構造コーディング配列に作動的に(operatively)結合しており、一方、上記構造コーディング配列が上記非翻訳領域に作動的に結合している。上記構造コーディング配列が更に、色素体ターゲッティング配列をコードする配列を含むことが好ましい。本発明は更に、上記ＤＮＡ構築物を含むように形質転換された植物細胞も提供する。好ましいイソアミラーゼは、約５から約８の最適ｐＨを有し、最も好ましいイソアミラーゼは配列番号：１１で示す配列を有する。必要に応じて、本発明のＤＮＡ構築物で形質転換した植物が、他の改善をもたらす他の異種のＤＮＡ構築物を含むことも可能である。こうした改善は、デンプン生産に無関係であってもよく、例えば、除草剤に対する耐性、病気に対する耐性、又は、昆虫に対する耐性の改善であることが可能である。或いは、植物の貯蔵組織（ｐｌａｎｔｓｉｎｋｔｉｓｓｕｅ）内でのデンプン生産に関連した遺伝子を使用することも可能である。この例は、顆粒結合デンプンシンターゼ、デンプン分枝酵素、可溶性デンプンシンターゼ、及び、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼを含む。デンプン分子中での他の改変を生じさせるために逆方向配列（アンチセンス）又は他の手段を使用することによって、野生デンプン分枝酵素の発現をダウンレギュレーションすることも可能である。本発明の植物が、異種又は外来のＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼを発現させる遺伝子を更に含むことが好ましく、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼに対するＥ．ＣｏｌｉｇｌｇＣ１６遺伝子を更に含むことがより一層好ましい。植物中でのこの遺伝子の使用と、この遺伝子で形質転換した植物とが、本明細書に引例として組み入れてある１９９３年７月１３日付けで出願された米国出願番号０８／１２０，７０３と同等であるＷＯ９１／１９８０６（Ｋｉｓｈｏｒｅ）に開示されている。本発明は更に、より高いアミロース含量を有するデンプン又は構造的に改変したデンプン含量を有するデンプンを生産する方法を提供し、この方法は、上記ＤＮＡ構築物を含むように植物細胞を形質転換することと、植物全体を再生させることと、上記植物を繁殖させることと、植物から材料を収集することと、この材料からデンプンを抽出することを含む。本発明は更に、上記ＤＮＡ構築物を含むように植物細胞を形質転換することと、植物全体を再生させることと、デンプンを含む作物を収穫することを含む、改変されたデンプン内容物を有する新規の植物作物を提供する。こうした植物作物は、ジャガイモの塊茎、カッサバ又はサツマイモの地下部、及び、トウモロコシ、コムギ、コメ、又は、オオムギの種子を含むことが可能である。本発明は更に、配列番号：１１で示すアミノ酸配列を実質的に有するイソアミラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換生物を提供する。本発明は更に、脱分枝デンプンに使用することが可能な、こうした形質転換細菌によって生産される単離イソアミラーゼを提供する。本明細書で使用する場合の術語「イソアミラーゼ」は、デンプン、グリコーゲン、及び、誘導オリゴ糖のα−１，６−Ｄ−グルコシド結合を加水分解することが可能な酵素を意味する。本明細書で使用する場合の術語「改変デンプン内容物」は、より少ない分枝を有するもしくは変更された分枝パターンを有するアミロペクチン、増加した中間材料、及び／又は、より高い「アミロース」対「アミロペクチン」比率を有するデンプンを含むことを意味する。本明細書で使用する場合の術語「改変デンプン構造」は、より少ない分枝を有するもしくは変更された分枝パターンを有するアミロペクチン、増加した中間材料、及び／又は、より高い「アミロース」対「アミロペクチン」比率を有することを意味する。本明細書で使用する場合の術語「構造改変デンプン」は、より少ない分枝を有するもしくは変更された分枝パターンを有するアミロペクチン、増加した中間材料、及び／又は、より高い「アミロース」対「アミロペクチン」比率を有するデンプンを意味する。全ての場合において、改変デンプンを、導入イソアミラーゼ遺伝子を除いた同一の遺伝子型の植物のよって生産されるデンプンと比較する。発明の詳細な説明本発明は、イソアミラーゼの特性を有するポリペプチドに対する遺伝子でデンプン生産植物を形質転換することによって、構造改変デンプン構造を有する植物デンプン、好ましくは、より高い「アミロース」対「アミロペクチン」比率を有する植物デンプンを生産する新たな方法を含む。この遺伝子を、イソアミラーゼ活性を示す植物と微生物を含む様々なイソアミラーゼ源から得ることが可能である。好ましいイソアミラーゼは、約５から約８の最適ｐＨを有し、このｐＨはアミロプラストの内部のｐＨに近い。こうしたイソアミラーゼを提供する。開示を簡明にするために、本発明の下記の詳細な説明では、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐからのイソアミラーゼにイソアミラーゼを限定する。当業者は、本明細書で説明する方法が他のイソアミラーゼ源からのイソアミラーゼ遺伝子を利用するために使用可能であることを容易に理解するだろう。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼ下記の実験で使用するイソアミラーゼは、Ｓａｔｏ，Ｈ．Ｈ．及びＰａｒｋ，Ｙ．Ｋ．Ｓｔａｒｃｈ３２：１３２−１３６，１９８０に開示されているＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｅｃｉｅｓとして特徴付けられている生物によって自然生産される。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上で又はＬＢブイヨン中で２００ｒｐｍで振とうしながら、２８℃で好気的に増殖させた。イソアミラーゼの精製のために、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐを、２リットルフラスコ中で２２５ｒｐｍで振とうしながら、３０℃で、２０時間、［０．１％トリプトン、０．２％酵母抽出物、０．１％カザアミノ酸、及び、０．８％マルトース］５００ｍＬ中で増殖させた。１５，０００ｘｇで遠心して細胞を取り除き、上清液を０．２μｍフィルターで濾過した。無細胞上清液を、ＹＭ −１０膜付きのＡｍｉｃｏｎ撹拌細胞濃縮器中で２０ｍＬに濃縮し、その後で、ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０遠心濃縮器内で２ｍＬに濃縮した。保持物質を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で予め平衡化したアミロース／アガロースアフィニティーマトリックスカラム（２．５ｃｍ ×５ｃｍ）に適用した。このカラムを、緩衝液Ａ２５０ｍＬを使用して、即ち、検出可能なタンパク質が洗浄中に溶出しなくなるまで、１．５ｍＬ／分で洗浄した。緩衝液Ａ中の２５％マルトースを１．５ｍＬ／分で使用してイソアミラーゼをカラムから溶出させた。活性１ｍＬフラクションをプールし、ＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０遠心濃縮器とＡｍｉｃｏｎＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０遠心濃縮器とを使用して、２５０μＬに濃縮し、緩衝液Ａで再平衡化し、マルトースを取り除いた。グリセロールを加えて最終濃度２０％にし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を評価する時点までイソアミラーゼを４℃で貯蔵した。イソアミラーゼは８０ｋＤから８５ｋＤの範囲内の分子量を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量した場合に７０−７５ｋＤの範囲内の分子量を有する第２の小バンドと共に同時精製される。イソアミラーゼは、標準的なヨウ素アッセイで定量した場合に約５０，０００単位／ｍｇタンパク質の比活性を有する。［混合物を、１％アミロペクチン１ｍＬ、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）０．２ｍＬ、酵素調製物０−０．２ｍＬ、及び、水で、最終体積１．４ｍＬに調製する。酵素の添加時に、反応混合物を４０℃でインキュベートする。様々な時間間隔で、反応混合物０．２ｍＬを、「０．２％Ｉ₂、２．０％ＫＩ、０．２％Ｈ₂ＳＯ₄」０．２ｍＬに加え、水で１０ｍＬに希釈する。室温で１５分後に、６１０ｎｍの吸光度を測定する。１単位のイソアミラーゼ活性を、１時間以内に６１０ｎｍの吸光度を０．０１増加させる酵素の量と定義する。］これらの結果は、Ｓａｔｏ及びＰａｒｋによって報告された結果（サイズ排除クロマトグラフィーによって定量した場合に１２１，０００の分子量と、１１，１１０単位／ｍｇタンパク質の最終比活性）とは異なっている。分子量の相違は、より正確なＳＤＳ−ＰＡＧＥ定量に起因すると考えられる。更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確定される通りの均一性にイソアミラーゼを精製することが上記の報告に示されていなかったので、比活性の差異は、タンパク質純度の相違を原因とする可能性がある。Ｎ末端の配列決定精製したＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ酵素（７５μｇ）を、２００μ Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）溶液７５μＬ（３×２５μＬ充填）から直接的に配列決定した。標準シークエンサーサイクル０３ＲＰＴＨを使用したアミノ末端自動化エドマン分解法（Ｅｄｍａｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を行うために、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ４７０Ａ気相シークエンサーを使用した。Ｂｒｏｗｎｌｅｅ２．１ｍｍＩ．Ｄ．ＰＴＨ−Ｃ１８カラムを装着したＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ１２０ＡＰＴＨＡｎａｌｙｚｅｒを使用してオンラインで、個々のＰＴＨ−ａａ誘導体をＲＰ −ＨＰＬＣ分析によって同定した。次のＮ末端配列を決定した。ＡＩＤＡＱＱＬＧＡＲＹＤＡＡＱＡＮＬＡＦＲＶＹＳＳＲＡＴＸＶＥＸＦＬＹＫＮＰ（配列番号：３）。この配列は、プロセシングした成熟Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐイソアミラーゼ（Ｔｏｇｎｏｎｉ他，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：３７−４５，１９８９）のＮ末端配列と５５％同一であり、このことは、分泌中にＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼからのシグナルペプチドに切断が生じた可能性が高いことを示している。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ培養からの均一性に精製されたイソアミラーゼを、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．）上でブロッティングし、主（上位）バンドと小（下位）バンドの両方をカットアウトした。ＰＶＤＦ上にブロッティングした試料を、シークエンサーサイクル０１ＲＰＶＤを使用してＮ末端式に直接的に配列決定した。両方のバンドのＰＶＤＦブロッティングＮ末端配列は同一であり、配列番号：３に一致したが、このことは、インビボで又は精製中に天然酵素のＣ末端切断が生じた可能性が高いことを示している。遺伝子の配列決定Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に述べられている通りの標準的プロトコルによって、ＰＣＲ、アガロース電気泳動、制限消化、連結反応、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換、ブルーホワイトコロニースクリーン、コロニーリフト、サザンブロットといった基本ＤＮＡ操作を行った。２４時間Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ培養１００ｍＬからの細胞ペレットを［１０ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、５％グリセロール］３．５ｍＬ中に再懸濁させ、１０％ＳＤＳ４００μＬを加えた。懸濁液を氷上で１０分間インキュベートし、その後で１０分間ドライアイス上で凍結させた。懸濁液を解凍し、５分間、即ち、細胞が溶解するまで、時々静かに振動させながら７０℃の水浴中で加熱した。ライゼートを、フェノール−クロロホルム（１：１）４ｍＬで穏やかに２回抽出し、その後で、クロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出し、無水エタノール１０ｍＬを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。遠心せずに、上清液をデカントし、ＤＮＡ沈殿物を［１０ｍＭトリスｐＨ８．０、１．０ｍＭＥＤＴＡ］（ＴＥ８緩衝液）２ｍＬ中に溶解した。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２２５μＬとエタノール６．０ｍＬとで遠心せずにＤＮＡを沈殿させた。沈殿物をＴＥ８緩衝液０．５ｍＬ中に再溶解し、無ＤＮＡｓｅＲＮＡｓｅ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）２５μＬ（３００単位）で３７℃で２０分間処理し、その後で、等体積のフェノール−クロロホルムで抽出した。ＤＮＡを沈殿させ、ＴＥ８緩衝液中に再溶解し、ＴＥ８緩衝液（４×１．０Ｌ）に対して１８時間透析した。イソアミラーゼのためのＤＮＡプローブを、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ染色体ＤＮＡからのＰＣＲ増幅によって産生した。縮重ＰＣＲプライマーを、細菌グルカナーゼの中の２つの高度に保存された共通アミノ酸配列から設計した。これらが配列番号：８と配列番号：９である。特に、使用した一連の酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐの場合にはイソアミラーゼであり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合にはプルラナーゼであり、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの場合にはネオプルラナーゼであった。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノムの高ＧＣ含量を反映させるように、高ＧＣ含量のオリゴ糖プライマーも設計した。ＰＣＲサイクリング条件は次の通りだった。［９４℃で３分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間］（５サイクル）、［９４℃で３０秒間、６０℃で２分間、７２℃で３分間］（３０サイクル）。２６０ｂｐＰＣＲ生産物をゲル精製し、ｐＢＳＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位の中に結合させ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他が述べている通りにブルーホワイトスクリーンでクローンを単離した。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ染色体ＤＮＡから産生した２６０ｂｐＰＣＲ産物のヌクレオチド配列が、配列番号：４である。配列分析は、この配列が、Ｔｏｇｎｏｎｉ他によって報告された通りのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐイソアミラーゼ中の同じ領域に対して、アミノ酸レベルで５６％同一であることを示している。この２６０ｂｐフラグメントを、Ｇｅｎｉｕｓ^TM ＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍによってジゴキシゲニンでランダムプライム標識した。ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、及び、ＸｈｏＩによって、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐゲノムＤＮＡを個々に完全に消化した。消化物をＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でサザンブロッティングし、真空中で８０℃で１時間ベーキングし、ジゴキシゲニン標識２６０ｂｐフラグメントで探査して、Ｇｅｎｉｕｓ^TM ＮｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍによってこの装置の製造者の推奨に従って検出した。６８℃で一晩ハイブリッド形成を生じさせ、最終洗浄を０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃で行った。単一のプローブ陽性バンドを、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩによる各消化物毎に得、これらは各々に約１０ｋｂ、９ｋｂ、５ｋｂのバンドを与えた。ゲノムＢｇｌＩＩフラグメント（９−１２ｋｂ）、ＮｏｔＩフラグメント（７−１０ｋｂ）、ＰｓｔＩフラグメント（４−６ｋｂ）を調製的アガロースゲル電気泳動で単離し、ｐＢＳＳＫ＋中のその個々の脱リン酸化部位の中に結合させた。結合物（ｌｉｇａｔｉｏｎ）をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ αの中に形質転換し、形質転換細胞コロニーをＨｙｂｏｎｄ^TM−Ｎ＋ナイロン膜上にリフトした。この膜をコロニー側を上にして新鮮なＬＢ−アンピシリンプレート上に置き、３７℃で４時間インキュベートした。１０％ＳＤＳで飽和させた、その後で０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌで飽和させた、更にその後で１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０、１．５ＭＮａＣｌで飽和させたＷｈａｔｍａｎ３ＭＭ紙上に、連続的に、５分間、膜を置くことによって、コロニーを溶解させた。５×ＳＳＣで洗浄することによって細胞破片を完全に取り除き、膜を真空下で８０℃で１時間ベーキングした。同じ２６０ｂｐプローブ（配列番号：４）のハイブリッド形成と検出は、サザンブロットに関して説明したものと実質的に同一だった。推定プローブ陽性コロニーをプラスミドＤＮＡのために調製し、サザンブロットハイブリッド形成によってプローブ陽性挿入断片に関して確認した。イソアミラーゼ活性に関するスクリーニングのために、ｐＧＰ１−４を含むＥ．ｃｏｌｉＳＲ１９３を、２つのＮｏｔＩプローブ陽性クローンと、３つのＰｓｔＩプローブ陽性クローンと、ｐＢＳＳＫ＋（対照として）とを使用して個々に形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉＳＲ１９３は、温度感受性切除欠陥（ｅｘｃｉｓｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ラムダプロファージを含む。２８℃で増殖させたコロニーを転移させ、３７℃でインキュベートした時に、ラムダ溶菌遺伝子を誘導し、細胞壁の分解のためにコロニーが「多孔性」となった。ｐＧＰ１−４は、温度誘導可能ラムダＰ_Lプロモーターの制御下のバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼと、熱感受性ラムダリプレッサーｃＩ８５７に対する遺伝子とを含む、ＣｏｌＥ１ベースのプラスミドである（Ｔａｂｏｒ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４−１０７８，１９８５）。アミロペクチン（１％）とアンピシリンとカナマイシンとを含むＬＢ寒天上に、形質転換細胞を置き、プレート検出アッセイを使用してイソアミラーゼ発現をアッセイした。［イソアミラーゼプレート検出アッセイ：２８℃で２０時間の初期インキュベーションの後に、即ち、コロニーの直径が１ｍｍになるまでインキュベートした後に、プレートを更に２０時間３７℃にし、細胞壁の漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）（ラムダ溶菌遺伝子）とＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写とを誘導した。プレートを数滴の「２％Ｉ₂ 、１％ＫＩ、２５％エタノール」溶液上に逆さに置き、（アミロペクチンからのアミロースの形成に起因する）コロニーを囲むブルーハロ（ｂｌｕｅｈａｌｏ）でイソアミラーゼ活性を検出した。］ＮｏｔＩクローンはイソアミラーゼ活性を示さなかった。しかし、ＰｓｔＩクローンは、活性イソアミラーゼの放出のためにコロニーを囲む極めて濃いブルーハロを示した。４．９ｋｂＰｓｔＩ挿入断片を有する１つの活性単離物を、後続の分析全てに使用するために選択し、ｐＭＯＮ１７４８１と名付けた。ｐＭＯＮ１７４８１のＰｓｔＩ挿入断片からの制限フラグメントを、ｐＢＳＳＫ＋とｐＢＳＫＳ＋の中に両方向にサブクローニングした。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による重感染の後に、ｐＭＯＮ１７４８１誘導体を有するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１から、一本鎖ＤＮＡを調製した。ｓｓＰｈａｇｅ^TM ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｂｉｏ１０１）を使用して一本鎖ＤＮＡを精製し、その後で、ＴＡＱｕｅｎｃｅ^TM Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用してジデオキシ鎖終結法で配列決定した。７−デアザ−ｄＧＴＰ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼオープンリーディングフレーム、並びに、５’及び３’非翻訳領域を有するカスタム合成プライマーと、これらを含まないカスタム合成プライマーとを、両方向に配列決定するために使用した。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧＣＧＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅを使用して、配列分析を行った。こうして決定したヌクレオチド配列を配列番号：１として示す。配列分析は、７７７アミノ酸前駆酵素をコードする２３３４ｂｐオープンリーディングフレームを明らかにした。この翻訳（配列番号：２）は、予想分子量８４，３４０を有する。Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現ｐＭＯＮ１７４８１をテンプレートとして使用して、ＰＣＲ突然変異誘発を行い、クローニングした遺伝子から微生物シグナル配列を除去した。下記のプライマーを、処理した成熟イソアミラーゼ（アラニン−３３）の開始点にメチオニン残基を付加して翻訳開始を可能にし、且つ、内在性ＴＧＡコドンの付近に追加停止コドン（ＴＡＡ）３’を付加するように、下記のプライマーを設計した。このプライマーは更に、Ｎ末端ＮｃｏＩとＣ末端ＳａｃＩとＥｃｏＲＩ部位とを含んでいた。コーディング配列の高ＧＣ含量のために、ＰＣＲ反応には５％ホルムアミド又は１０％ＤＭＳＯ（最終濃度）が必要だった。ＰＣＲサイクリング条件は、「９６℃で３分間、６５℃で２分間、７２℃で３分間」（５サイクル）、反応毎に追加分のＴａｑポリメラーゼ５単位を加え、その後で、「９４℃で３０秒間、６５℃で２分間、７２℃で３分＋２０秒／サイクル」（３０サイクル）だった。２．３ｋｂＰＣＲ生産物（配列番号：１０）をゲル精製し、ｌａｃＺ α−ペプチド遺伝子内に修飾ポリリンカーが位置し且つｌａｃプロモーターによって発現が促進される、ｐＵＣベースのＥ．ｃｏｌｉのクローニングベクターのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中にクローニングした。ブルーホワイトスクリーンによって、２．３ｋｂ挿入断片（配列番号：１０）を有するクローンをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１中に同定した。発現タンパク質は、配列番号：１１で示す配列を有する。イソアミラーゼをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１形質転換細胞の液体培養から調製した［ＬＢ−アンピシリンブイヨン２５ｍＬ、２００ｒｐｍ、３７℃、及び、０．５ｍＭＩＰＴＧによる誘導発現、０．５の光学密度（６１０ｎｍ）］。細胞を誘導３時間後にペレット化し、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）５００μＬ中に再懸濁させ、２ｘ１０秒間のバーストで、３０％相対最大出力において、氷上で音波処理した（ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓ−ＵＩｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＭｏｄｅｌＷ−３７５）。粗ライゼートを１２，０００ｘｇで５分間遠心し、上記の標準的なヨウ素アッセイによって脱分枝活性を上清液中で測定した。最高レベルのイソアミラーゼ活性を生じさせる単離物であるｐＭＯＮ１７４０８を選択し、２．３ｋｂ挿入断片（配列番号：１０）をＥ．ｃｏｌｉの発現ベクターのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ１７４０９を得た。このベクターは、ｐＡＣＹＣレプリコンと、発現がｔａｃプロモーターによって促進される合成Ｇ１０リーダー配列のリボソーム結合部位とを含む。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１中のｐＭＯＮ１７４０９からの高レベルのイソアミラーゼ発現は、上記の通りのＬＢ−カナマイシン培養５００ｍＬのＩＰＴＧによる誘導によって得られた。誘導後０時間、１時間、２時間、及び、３時間の時点で、アリコート１ｍＬを培養から取り出し、ペレット化し、Ｋｌｅｔｔ単位での光学密度に数値的に対応する容量（μＬ）のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液の中に再懸濁させ、８分間煮沸した。新たな高発現８０−８５ｋＤタンパク質の出現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。残りの細胞を誘導３時間後にペレット化し、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）８ｍＬ中に再懸濁させ、２ｘ２０秒間のバーストで氷上で音波処理し、１５，０００ｘｇで５分間遠心した。培養５００ｍＬからの細胞内粗上清液からのイソアミラーゼを上記のように精製し均一性にした。精製組換えイソアミラーゼを、ウエスタンブロット分析によって抗Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼポリクローナル抗体との交差反応性に関して確認した。興味深いことに、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐから精製した細胞外イソアミラーゼに見られる小７０−７５ｋＤバンドは検出されず、このことは、供与酵素のＣ末端切断がＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍプロテアーゼによる切断に起因することを示唆する。精製組換え酵素（配列番号：１１）は、約５０，６００単位／ｍｇの比活性を有し、この比活性は、精製供与酵素に関して定量された比活性と同じであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで定量した場合と同一の分子量を有した。他の発酵宿主本発明のイソアミラーゼ（配列番号：１１）を、様々な宿主生物中で生産することも、様々な宿主生物から調製することも可能である。この酵素を宿主生物中で生産するための遺伝子は、分泌のためのシグナル配列を有する未成熟配列に対する遺伝子（配列番号：１）、又は、成熟配列に対する遺伝子（配列番号：１０）であることが可能である。或いは、宿主生物の天然の分泌シグナル配列を使用することも可能である。上記の通りに形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、発酵によるイソアミラーゼの調製のために使用することも可能である。或いは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｉｌｌｕｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ他（編），ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０に述べられている通りに使用することも可能である。Ｆ．Ｇ．Ｐｒｉｅｓｔ，ＡｓｐｅｃｔｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＥｎｚｙｍｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８４も参照されたい。酵母種も異種ポリペプチドの生産のために使用することが可能である。当業者は、酵母の形質転換と発酵のメカニズムに精通しているだろう。全般的な説明については、（１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３（１）：１８−１９，１９９２、及び、（２）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：４８６−４９６，１９９２を参照することが可能である。或いは、形質転換バキュロウイルス粒子で細胞培養を感染させることによって所期のペプチド（例えば、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼ）を、昆虫細胞に生産させることが可能である。Ｓｕｍｍｅｒｓ他，ＴｅｘａｓＥｘｐ．ＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌ．１５５５：１−５７を参照されたい。脱分枝デンプンにおける使用組換えＥ．ｃｏｌｉ又は他の生物によって生産されるイソアミラーゼを、植物デンプンからの様々な製品の生産に使用することが可能である。脱分枝は、コーンスターチからの高フルクトースコーンシロップの生産の１つの段階である。この脱分枝酵素の特性は、中性に近いｐＨが有利であり得る用途に対してこの酵素を特に適したものにする。現在は、最適ｐＨが３−４のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓイソアミラーゼが、デンプン構造分析と食品用途のデンプン加工処理のために入手可能な唯一の市販イソアミラーゼである。最近では、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１３７９２が、４．０−５．５の最適ｐＨを有するＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのアミラーゼの発見を報告している。この出願では、ｐＨの調整なしにグルコースを生産するために「液化コーンスターチ」にこのアミラーゼを使用することが、有利であると述べられている。従って、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼの使用は、この酵素が中性により近いｐＨでさえ機能するので、上記加工処理における更なる改善をもたらすだろう。精製ｐＭＯＮ１７４０９生産イソアミラーゼの最適ｐＨを、［５０ｍＭアセタート、５０ｍＭＭＥＳ、１００ｍＭトリス］緩衝液中で、４−９．５のｐＨ範囲にわたり、標準ヨウ素アッセイ条件下で定量した。線状初速度を、相対活量（最大値の％）の計算のために使用した。ｐＨ安定性プロフィルを得るために、Ａｍｉｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０濃縮器によって、精製ｐＭＯＮ１７４０９イソアミラーゼを、８ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、２０％グリセロールに対して再平衡化した。酵素３．５μＬに対して、［１７５ｍＭアセタート、１７５ｍＭＭＥＳ、３５０ｍＭトリス］ストック緩衝液２．０μＬを加え、６４ｍＭアセタート、６４ｍＭＭＥＳ、１２７ｍＭトリスの最終濃度にした。その後で、酵素をｐＨ４．５−９．５の範囲に亙って４０℃で３０分間インキュベートした。その後で混合物５．５μＬの残留イソアミラーゼ活性を、５０ｍＭアセタート、５０ｍＭＭＥＳ、１００ｍＭトリス（ｐＨ６．５）の最終濃度で、標準ヨウ素アッセイで定量した。この結果は６．０−７．０の最適ｐＨを示し、この値は、供与酵素に関して既に報告されている６．３という値（Ｓａｔｏ及びＰａｒｋ）に近似している。最適安定性はｐＨ６．５−７．０で得られる。しかし、２２℃でアッセイをした時には、組換えイソアミラーゼは、より広いｐＨ５．０−８．０の最適活性及び最適安定性を示した。ｐＭＯＮ１７４０９からの精製組換えイソアミラーゼの基質特異性を、カキ（牡蠣）グリコーゲン、ウサギ肝臓グリコーゲン、トウモロコシアミロペクチン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、プルランに関して定量した。ｐＨ６．５での初期加水分解速度から比活性を定量した。精製組換えイソアミラーゼによる様々な分枝多糖の脱分枝の相対速度を表１に示す。酵素はグリコーゲンに対して最大の基質特異性を有したが、プルランは殆ど加水分解せず、このことは、精製酵素がイソアミラーゼであることを証明している。植物の形質転換二本鎖ＤＮＡ形態で存在する植物遺伝子の発現が、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの一本の鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写と、核内でのｍＲＮＡ一次転写物の後続のプロセシングとに関与する。このプロセシングは、ＲＮＡの３’末端にポリアデニラートヌクレオチド（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を付加する３’非翻訳領域に関与する。ｍＲＮＡ中へのＤＮＡの転写は、プロモーターと一般的に呼ばれるＤＮＡ領域によって調節される。このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼにシグナルを送り、そのＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと連携させて、対応する相補的鎖を形成するためのテンプレートとしてＤＮＡ鎖の１本を使用してｍＲＮＡの転写を開始させる塩基配列を含む。本発明で使用可能なプロモーターは、デンプンが生産される組織の中で転写を開始させるプロモーターである。こうしたプロモーターは、形質転換されるべき植物種から得られることも、こうした植物に対して異種であることも可能である。本発明で有用なプロモーターの例は、ジャガイモ塊茎において機能するプロモーターである。これらは、顆粒結合デンプンシンターゼ、可溶性デンプンシンターゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、パタチン（ｐａｔａｔｉｎｓ）（クラス１）、スクロースシンターゼ、分枝酵素、脱分枝酵素、塊茎ポリフェノールオキシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ^TM ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒｓＭ９５１９６及びＭ９５１９７）のためのプロモーターを含む。種子中でのイソアミラーゼの生産を生じさせるプロモーターを本発明で使用することが可能である。任意の植物の種子からデンプン生産に関与する酵素に対する遺伝子を得ることが可能であり、且つ、本明細書で説明するＤＮＡ構築物にこうしたプロモーターを使用することが可能である。トウモロコシ、コムギ、コメ、オオムギに関する自然プロモーターを得て、本発明に使用することが可能である。トウモロコシの種子の中で機能するプロモーターの例は、ゼインプロモーターを含む。ゼインは、トウモロコシ内胚乳中に見られる一群の貯蔵タンパク質である。ゼイン遺伝子に関するゲノムクローンは既に単離されて公表されており、これらのクローンからのプロモーター（１５ｋＤ、１６ｋＤ、１９ｋＤ、２２ｋＤ、２７ｋＤと、ガンマ遺伝子を含む）を、トウモロコシ及び他の植物の種子中においてイソアミラーゼ遺伝子を発現させるために使用することも可能である。トウモロコシ中で機能することが知られている他のプロモーターは、ｗａｘｙ、ｂｒｉｔｔｌｅ２、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、分枝酵素Ｉ及びＩＩ、デンプンシンターゼ、脱分枝酵素、オレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎｓ）、グルテリン、並びに、スクロースシンターゼに対する遺伝子のプロモーターを含む。コムギにおけるイソアミラーゼ遺伝子の発現に適したプロモーターの例は、ＡＤＰＧＰＰサブユニットに関する遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ及び可溶性デンプンシンターゼに関する遺伝子、分枝酵素及び脱分枝酵素に関する遺伝子、富胚発生タンパク質（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ−ａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ）に関する遺伝子、グリアジンに関する遺伝子、並びに、グルテニンに関する遺伝子に対するプロモーターを含む。コメにおけるこうしたプロモーターの例は、ＡＤＰＧＰＰサブユニットに関する遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ及び可溶性デンプンシンターゼに関する遺伝子、分枝酵素及び脱分枝酵素に関する遺伝子、スクロースシンターゼに関する遺伝子、並びに、グルテリンに関する遺伝子に対するプロモーターを含む。オオムギにおけるこうしたプロモーターの例は、ＡＤＰＧＰＰサブユニットに関する遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ及び可溶性デンプンシンターゼに関する遺伝子、分枝酵素及び脱分枝酵素に関する遺伝子、スクロースシンターゼに関する遺伝子、ホルデイン（ｈｏｒｄｅｉｎｓ）に関する遺伝子、胚グロブリンに関する遺伝子、並びに、アレウロン（ａｌｅｕｒｏｎｅ）特異性タンパク質に関する遺伝子に関するプロモーターを含む。形質転換と本発明での使用に適した植物は数多くある。こうした植物の例は、非限定的に、トウモロコシ、ジャガイモ、コメ、オオムギ、サツマイモ、カッサバ、コムギを含む。当業者は、公知の方法を使用して、こうした植物の各々を形質転換することが可能である。イントロン一般に、単子葉植物においては、イントロン配列がプロモーターとコーディング配列との間に位置する時に、最適な発現が得られる。このイントロン配列の例は、Ａｄｈ１及びＨｓｐ７０イントロンである。ＷＯ９３／１９１８９に述べられているＨｓｐ７０イントロンが好ましい。色素体ターゲッティング配列本発明のＤＮＡ構築物は、随意に色素体ターゲッティング配列を含むことが可能である。この構築物が色素体ターゲッティング配列を含まない場合には、構造コーディング配列から翻訳された酵素が一般的に細胞の細胞質中に見い出されるだろう。こうしたサイトゾル性酵素は、未加工処理の植物部分からの生産物の加工処理中にデンプンの脱分枝を生じさせるので、食品製品の生産に有益だろう。例えば、ジャガイモ塊茎の切断は、この塊茎中に含まれるデンプン顆粒を粉砕し、デンプンがサイトゾル性イソアミラーゼによって脱分枝されることを可能にする。その後では、加工処理されたジャガイモ製品は、フライ油の吸収の減少や質感の向上といった上記のような改善された特性を有するだろう。必要に応じて、色素体ターゲッティング配列を有するＤＮＡ構築物を調製することも可能である。こうした色素体ターゲッティング配列は、そのタンパク質が色素体に取り入れられることを引き起こす。取り込み中に色素体ターゲッティング配列が取り除かれる。葉緑体ターゲッティング配列及びアミロプラストターゲッティング配列の各々は、各々のタイプの色素体の中にタンパク質を移入する働きをするだろう。これら両タイプの使用は本発明の範囲内に含まれる。好ましいターゲッティング配列は、ＩｍｐａｃｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＡＭｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ他編，ｐｐ２７９−２９５、１９８８中の“ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＮｕｃｌｅａｒＥｎｃｏｄｅｄＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅＰｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃＡｐｐａｒａｔｕｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ”においてＴｉｍｋｏ他によって報告されている配列から得られる修飾葉緑体ターゲッティング配列（ＣＴＰ）である。この修飾ターゲッティング配列（ＣＴＰ１）は、Ｓｔａｒｋ他，“ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｓｔａｒｃｈｉｎｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｂｙＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：２８７−２９２，１９９２によって報告されており、本明細書では配列番号：７として示している。選択した色素体ターゲッティング配列とイソアミラーゼ遺伝子との融合を標準的な手順で作製し、本発明で使用することが可能である。ポリアデニル化シグナルキメラ植物遺伝子の３’非翻訳領域は、植物中で機能してＲＮＡの３’末端に対するポリアデニラートヌクレオチドの付加を生じさせるポリアデニル化シグナルを含む。適切な３’領域の例は、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のような腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのポリアデニル化シグナルを含む３’転写非翻訳領域と、（２）ダイズ（大豆）貯蔵タンパク質遺伝子や、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小サブユニットのような、植物遺伝子である。イソアミラーゼ遺伝子源本発明の植物形質転換のためのＤＮＡ構築物で使用するイソアミラーゼは、任意のイソアミラーゼ遺伝子であってよい。上記のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ遺伝子が好ましいが、この遺伝子には限定されない。酵素のターゲッティングを上記の通りの色素体にしない場合には、最適ｐＨ要件はそれほど厳密でなくてよい。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓからのイソアミラーゼ遺伝子を使用することも可能である。イソアミラーゼの工業的生産に既に使用されている遺伝子を、植物に適した調節配列を含むプラスミドの中に移入し、本発明で使用することも可能である。別の可能性は、改変デンプンの生産を生じさせるのに十分な量のイソアミラーゼの生産をデンプン代謝中に生じさせるプロモーターの後に造られている、植物イソアミラーゼ、例えば、天然ジャガイモイソアミラーゼに対する遺伝子を使用することである。例えば、ジャガイモイソアミラーゼ酵素活性を発芽からデンプン生産に移すことも可能だろう。本明細書で述べるアッセイを、発現ライブラリーからの植物源から得たイソアミラーゼ遺伝子の相補クローニングのために使用することが可能であり、こうして得た遺伝子を、細菌性イソアミラーゼ遺伝子の代わりに使用することが可能である。或いは、植物源からのイソアミラーゼ遺伝子を、公知の方法を使用するタンパク質の精製とアミノ酸配列決定と遺伝子単離とによって得ることが可能である。こうした遺伝子を単離するためには、配列番号：８及び配列番号：９として下記に示すＤＮＡプライマー、又は、より低いもしくはより高いＧ＋Ｃ含量％を有する遺伝子に対するより多い又はより少ないバイアスを有するその関連のプライマーを、イソアミラーゼ遺伝子をクローニングするためにＰＣＲ法によって使用することが可能である。或いは、上記のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ遺伝子の内部領域である配列番号：４を、他のイソアミラーゼ遺伝子を単離するためのプローブとして使用することも可能である。下記の実施例は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐからのイソアミラーゼ遺伝子（以下では「ｉａｍ」と表す）を使用するが、このことが本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。当業者は、本発明の思想と範囲から逸脱することなしに、様々な他の遺伝子、修飾、切断等を、本明細書で開示する方法と遺伝子に対して行うことが可能であることを理解するだろう。例えば、好ましい５− ８の範囲により近い最適ｐＨを有する上記の他の公知のイソアミラーゼの突然変異誘導体を生産するために、突然変異誘発とスクリーニングを使用することが可能である。ジャガイモにおける発現塊茎特異的発現を得るために、塊茎特異的クラス１パタチンプロモーターの〜１．０ｋｂ部分（以下では、「Ｐｐａｔａｔｉｎ１．０」と呼ぶ。これに関しては、Ｂｅｖａｎ他，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：４６２５：４６３８，１９８６に述べられている）と、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳ポリアデニル化領域（ＮＯＳ３’）と、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける選択のためのスペクチノマイシン耐性とを含むように、ベクター（ｐＭＯＮ１６９５３）を構築した。ｉａｍ遺伝子を、ｐＭＯＮ１７４０９からのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離した。ＢｇｌＩＩ−ＮｃｏＩフラグメントとしての修飾葉緑体シグナルペプチド（ＣＴＰ１）遺伝子（配列番号：７）を、ｐＭＯＮ１６９５３のＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中に三重結合（ｔｒｉｐｌｅｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによってｉａｍ遺伝子の翻訳開始部位に融合させ、ｐＭＯＮ１７４１１を得た。ｐＭＯＮ１７４１１からのＰｐａｔａｔｉｎ１．０／ＣＴＰ１−ｉａｍ／ＮＯＳ３’ＮｏｔＩ発現カセットを、ｐＭＯＮ１７２２７及びｐＭＯＮ１７３２０のユニーク脱リン酸化ＮｏｔＩ部位の中に結合させ、ｐＭＯＮ１７４１８とｐＭＯＮ１７４１９を各々に得た。ｐＭＯＮ１７２２７は本明細書に引例として組み入れているＷＯ９２／０４４４９（１９９１）でＢａｒｒｙ他によって開示され説明されているＴｉプラスミドベクターであり、このベクターは、植物の形質転換と再生におけるグリホサート選択のためのＦＭＶ／ＣＰ４構築物を含む。ｐＭＯＮ１７３２０は、Ｐｐａｔａｔｉｎ１、．０／ＣＴＰ１−ｇｌｇＣ１６カセットも含むｐＭＯＮ１７２２７誘導体である。ＣＴＰ１−ｇｌｇＣ１６融合は、ＫｉｓｈｏｒｅによってＷＯ９１／１９８０６で説明している通りの修飾ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼをコードする。ｐＭＯＮ１７４１８構築物とｐＭＯＮ１７４１９構築物の両方を、Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４内でＦＭＶ／ＣＰ４に対して時計回り方向に方向付けるようにスクリーニングした。ｐＭＯＮ１７４１８とｐＭＯＮ１７４１９の両方を、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａ他，１９８０）を使用した三親結合系（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）によって、無力化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）ＡＢＩＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株の中に動態化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）した。選択可能マーカーとしてグリホサートを使用してＲｕｓｓｅｔＢｕｒｂａｎｋジャガイモを形質転換するために、適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシンと７５μｇカナマイシンと５０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加したＬＢブイヨン２ｍＬ中で一晩増殖させた。一晩増殖させた培養を、ＭＳＯで１：１０に希釈し、即ち、０．２−０．３３の光学密度（６００ｎｍ）が得られるまで希釈した。２５ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加したＰＭ培地上で、３週間、無菌条件で成長させたジャガイモ植物の茎から葉を取り除た。茎を３−５ｍｍのセグメントに切断し、正方形ペトリ皿の中で１５分間希釈細菌で接種した。外植体を、湿潤させた濾紙を被せたＴｘＤ（タバコ支持細胞（ｔｏｂａｃｃｏｆｅｅｄｅｒ））細胞１．５ｍＬと共に、１／１０ＭＳＯを含んだ共培養プレート上に置いた。プレート１つ当たり約５０個の外植体を置いた。２日の共培養の後に、５．０ｍｇ／ＬＺｅａｔｉｎＲｉｂｏｓｉｄｅと１０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ₃と０．１ｍｇ／Ｌナフタリン酢酸（ｎａｐｔｈａｌｉｎｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）とを含むカルス誘導培地上に、外植体を２日間置いた。その後で、選択のために、外植体を、０．０２５ｍＭグリホサートを含むカルス誘導培地の上に移した。４週間後に、外植体を、５．０ｍｇ／ＬＺｅａｔｉｎＲｉｂｏｓｉｄｅと１０ｍｇ／ＬＡｇＮＯ₃と０．３ｍｇ／Ｌジベレリン酸と０．０２５ｍＭグリホサートとを含む苗条誘導培地（ｓｈｏｏｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉａ）上に置いた。８週間で苗条が出現し始めた。１２週間に亙って４週間毎に外植体を新鮮な苗条誘導培地に移した。苗条を摘出し、約２週間に亙って、即ち、苗条が土壌中に植えるのに十分な大きさになるまで、ＰＭ培地上に置いた。成長チャンバー条件は、最初の２ヶ月間は、光の強さ６００ μＥで１４時間の明期（ｐｈｏｔｏｐｅｒｉｏｄ）、相対湿度６０％、養分有、２５℃日中／１９℃夜間インキュベーションだった。３ヶ月目は、１２時間の明期、養分なし、２５℃日中／１９℃夜間インキュベーションであり、この後に塊茎を収穫した。形質転換ジャガイモからの塊茎の分析ｐＭＯＮ１７４１９で形質転換した２４種の系統の中で、幾つかの系統が、ｇｌｇＣ１６遺伝子を含むジャガイモに関して既に報告されている塊茎比重の増加と同様の塊茎比重の増加を示した。成熟した温室栽培塊茎（対照塊茎と形質転換塊茎の両方）を、抽出緩衝液なしで、Ｂｒａｕｎ高速ジューサーで加工処理し、その直後に２０００ｘｇで５分間遠心し、デンプン顆粒をペレット化した。上清液をドライアイス上で凍結させ、 −８０℃で貯蔵した。塊茎抽出物ジュースの上清液のウエスタン分析は、恐らくはタンパク質加水分解に起因する、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼよりも分子量が小さい新たなバンドの存在を示した。これは、プロテアーゼ阻害剤の存在下でさえ生じた。ペレット化デンプン顆粒を洗浄し、数体積の低温（４℃）水と共に６回遠心し、その後で低温（−２０℃）アセトンで２回洗浄した。顆粒を空気乾燥し、４℃ で貯蔵した。ウエスタンブロット分析のために、この顆粒１．０ｇを、［１．０％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．５］１０ｍＬ中で３分間ボルテックスし、顆粒表面タンパク質を剥がし、２０００ｘｇで５分間遠心した。この手順を繰り返し、顆粒を水１０ｍＬ中で５回洗浄し、その後でアセトン５ｍＬで２回洗浄した。顆粒の内部に埋め込まれたタンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液１．０ｍＬ中で顆粒１００ｍＬを６分間煮沸することによってＳＤＳ洗浄顆粒から抽出した。Ｌａｅｍｍｌｉデンプンゲルを、２００μＬピペット尖端を備えた微量遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中に浸漬して、１２，０００ｘｇで１０分間遠心した。上清液（レーン１つ当たりタンパク質約０．４μｇの充填）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後でウエスタンブロットによって、顆粒中のイソアミラーゼタンパク質レベルを定量した。Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で抽出したこれらのＳＤＳ洗浄顆粒のウエスタン分析は、ｐＭＯＮ１７４１９で形質転換した２３系統の中の１８系統が、顆粒中に、Ｅ．ｃｏｌｉ発現イソアミラーゼと同一の分子量でＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐイソアミラーゼを含むことを示した。ウエスタンブロットで得られたイソアミラーゼ含量は、顆粒抽出タンパク質全体の０．５−３．０％の範囲内であった。イソアミラーゼが塊茎抽出中にタンパク質加水分解によって分解されるように見えたが、ＳＤＳ洗浄顆粒から抽出したタンパク質のウエスタン分析は、イソアミラーゼがタンパク質加水分解から保護されることを示した。この結果は、イソアミラーゼがアミロプラスト内に取り入れられるばかりでなく、顆粒マトリックス内部に埋め込まれるということを明らかにした。デンプン生合成中のイソアミラーゼの存在が、成長デンプン分子が結晶化するにつれて酵素がデンプンネットワーク中に取り込まれていくことを可能にしたと推定された。４℃で貯蔵したデンプン顆粒を、ＮｉｋｏｎＤｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ倒立顕微鏡を使用して光学顕微鏡分析によって分析した。顆粒（５０ｍｇ）を水２ｍＬ中に懸濁させ、懸濁液１００μＬを、カバースリップ下で１００倍、２００倍、４００倍に拡大して可視化した。イソアミラーゼを含むｐＭＯＮ１７４１９顆粒は、全般的な形態変化を示した。幾つかのｐＭＯＮ１７４１９系統は、細長い、円筒形の、紡錘形の、角張った、長球形性が劣った、対称性が劣った、及び、極めて形状が不規則的なイソアミラーゼを含む顆粒を生産した。しかし、イソアミラーゼの発現レベルは、ウエスタンブロットで定量した場合に、顆粒形状の不規則性の度合いに常に完全に相関しているわけではなかった。これに比較して、野生型の系統、又は、ｇｌｇＣ１６のみで形質転換した系統は、楕円形の、長球形の、及び、対称形の顆粒を生産した。ＭｉｃｒｏＶｏｌｕｍｅＭｏｄｕｌｅ付きのＣｏｕｌｔｅｒＬＳ１３０ＳｅｒｉｅｓＰａｒｔｉｃｌｅＳｉｚｅＡｎａｌｙｚｅｒを使用してデンプン顆粒の粒度分布を測定した。顆粒懸濁液（４０ｍｇ／水１０ｍＬ）を１分間音波処理し、その後で、マグネティックスターラーバー（設定３．５）で１分間急速に混合した。予備分析によって、１分間の音波処理時間は粒径に影響を与えなかったことが明らかになった。音波処理した懸濁液からの８００μＬアリコートで、同じ粒径測定値が得られた。表２は、ｐＭＯＮ１７４１９系統全てに関する、ウエスタンブロットによって評価した発現レベルと、顆粒形状の不規則性の主観的度合いと、選択した系統に関する粒径分析とを、まとめて示している。顆粒形状の不規則性を示すために、０から１０のスケールを使用し、このスケールでは、０は正常な形状を表し、１０は極度に変形した形状を表す。トランスジェニック（ｔｒａｓｇｅｎｉｃ）顆粒の異なった形状に関しては粒径分析を調整することはしなかった。データは、系統３、系統１、系統２５では顆粒がより小さいことを示している。Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒｍｏｄｅｌＤＳＣ−７装置を使用して、デンプンの熱ゼラチン化特性に対するｉａｍによって引き起こされる改変作用を、示差走査熱量測定で調べた。デンプン試料（３．０＋／−０．１ｍｇ）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒアルミニウム揮発性試料皿の中に秤量し、蒸留脱イオン水１０μ Ｌを加えた。試料皿を気密封止し、再び重量測定した。直ちに試料を毎分１０℃ で２０℃から９０℃まで走査した。その後で試料の重量を再び測定し、重量損失がないことを確認した。手作業で決定しなければならなかった外挿最終温度（Ｔ_m ）値を除いて、温度とエンタルピー値を、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＳｙｓｔｅｍ７ソフトウェアを使用して決定した。結果を表３に示す。表３に示す値は平均＋標準偏差である。野生型１の場合にはｎ＝４であり、野性型２と野性型３の場合ｎ＝２であり、系統６と系統２１と系統３０の場合にはｎ＝３である。ＤＳＣで定量した場合のトランスジェニック顆粒のゲル化特性は、顆粒形態の変化を実証する。ｉａｍ−ｇｌｇＣ１６顆粒に関する「ゼラチン化」温度がより低いことは、「伸長」対「分枝」の比率の変化のために生じる中間材料の量がより多いことを示唆する。更に、より高いゼラチン化温度を有するデンプン顆粒は、典型的には、より高い結晶化度を有し、これは顆粒に構造的安定性と熱安定性とを与える。ＤＳＣの結果は、更に、トランスジェニック顆粒が（１）全体的として結晶構造の高次性がより低く、及び／又は、（２）熱的及び構造的安定性がより高い結晶領域がより少なく、及び／又は、（３）より安定性の低い非晶質領域を有しているということをも示している。従って、イソアミラーゼ活性によるデンプン生合成機構の動揺が、高度の結晶性を形成する能力がより低い中間材料を生じさせた可能性がある。ＧＰ４０勾配ポンプとヘリウム加圧溶離液オーガナイザーとＤＥ４０パルスアンペロメトリー検出器（ｐｕｌｓｅｄａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＰＡＤ−ＩＩ）とポストカラム空気コントローラーとＡＳ３５００オートサンプラー（ＴｈｅｒｍｏＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＰｒｏｄｕｃｔｓ）とから成るＤｉｏｎｅｘシステムを使用して、高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を行った。ＰＡＤ−IIは、金作用（ｗｏｒｋｉｎｇ）電極と銀−塩化銀基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）電極とを使用した。データの統合と解析は、ＲａｉｎｉｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．からのＤｙｎａｍａｘ^TM ＭａｃＩｎｔｅｇｒａｔｏｒ^TM、ＣｈｒｏｍＰｉｃ^TM、及び、Ｄｙｎａｍａｘ^TM ＣｏｍｐａｒｅＭｏｄｕｌｅｓソフトウェアパッケージを使用して行った。精製デンプン顆粒７５ｍｇを０．１Ｎ水酸化ナトリウム５ｍＬ中に溶解し、水７．５ｍＬを加え、１５分間煮沸することによって、系統６、系統２１、系統３０（最も高い顆粒形状不規則性を有する系統）からのデンプン試料をＨＰＡＥＣのために調製した。この溶液を、１．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）２．５ｍＬで約ｐＨ４．０に調整した。１ｍＬを取り出し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐイソアミラーゼ（Ａｍｉｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で脱塩）２００単位（１０−３０μＬ）を加えた。３７℃ で４時間、即ち、還元基の増加がＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（Ｈｏｄｇｅ及びＨｏｆｒｅｉｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９６２）で測定できなくなるまで、反応物をインキュベートした。デンプン溶液アリコート５００μＬを、水で予め平衡化したＱｕｉｃｋＳｐｉｎ^TM Ｇ−２５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通して脱塩した。５０％水酸化ナトリウム３μＬで溶出液をｐＨ１２に調整し、０．４５μｍ膜を通して濾過した。試料注入体積は２５μＬだった。インラインフィルター（５μｍ、３５μｍ）を備えたＣａｒｂｏＰａｃＰＡ−１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ、４ｘ２５０ｍｍ）を使用して鎖長分布を定量した。溶離液Ａは１５０ｍＭ水酸化ナトリウムであり、溶離液Ｂは、５００ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１５０ｍＭ水酸化ナトリウムだった。酢酸ナトリウム溶離勾配は次の通りである。０分に溶離液Ｂ３０％、２．０分に４０％、２０分に６０％、５０．０分に８０％、５５．０分に８０％。ＰＡＤ−ＩＩパルス電位（ボルト）と持続時間（秒）は次の通りである。Ｅ₁ ０．０５（ｔ₁ ０）、Ｅ₂ ０．０５（ｔ₂ ０．２）、Ｅ₃ ０．０５（ｔ₃ ０．５）、Ｅ₄ ０．６（ｔ₄０．５１）、Ｅ₅ ０．６（ｔ₅ ０．５９）、Ｅ₆０．６（ｔ₆ ０．６）、Ｅ₇−０．６（ｔ₇ ０．６５）。標準応答曲線を構築するために高純度マルト−オリゴ糖（Ｇ２−Ｇ７）（ＨａｙａｓｈｉｂａｒａＣｏ．）を使用した。ＨＰＡＥＣで定量した鎖長分布は、野生型系統から抽出したデンプンとトランスジェニック系統から抽出したデンプンとの間に明確な相違があることを示した。ｐＭＯＮ１７４１９系統６、２１、３０からのデンプンのクロマトグラムは、野生型系統に比較して、３０以上の重合度を有する長い枝分れ鎖の割合が著しく高いことを示した。この結果は、トランスジェニックデンプンでは、分枝点間の距離がより長く、及び／又は、中間材料の量が増加したことを示している。これは、伸長／分枝比率の変化に起因した中間材料の増加を示唆する、ＤＳＣによって得られたより低いゼラチン化値と一致している。ｐＭＯＮ１７４１９で形質転換した系統の塊茎から単離したデンプンに対し、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（１９７０）ＣｅｒｅａｌＣｈｅｍｉｓｔｙ，４７（７）：４１１−４２０の方法を使用して、この方法に次に示す僅かな変更を加えて、アミロース含量に関する分析を行った。正確に１００ｍｇのデンプンを０．５ＮＫＯＨ５０ｍＬ中に分散させた。ゼラチン化中の凝集を防止するためにマグネティックスターラーバーで迅速に撹拌しながらデンプンを加えた。正確に１０ｍＬのデンプン−ＫＯＨ溶液を二重に１００ｍＬメスフラスコに移し、水で１００ｍＬに希釈した。正確に２０ｍＬの希釈デンプン溶液を新たな１００ｍＬメスフラスコに移し、０．１ＮＨＣｌ１０ｍＬを加え、その後でヨウ素試薬Ｂ１．０ｍＬを加えた。体積を１００ｍＬに希釈し、５分後に吸光度を６２５ｎｍで測定した。様々な体積のジャガイモアミロースストック溶液（１００ｍｇ／５０ｍＬＫＯＨ）とジャガイモアミロペクチンストック溶液（１００ｍｇ／５０ｍＬＫＯＨ）とを組み合わせ（合計１０ｍＬ）、水で１００ｍＬに希釈することによって、標準曲線を構築した。重複分析によれば、対照（非形質転換）塊茎からのデンプンは、約２３．６％のアミロースを含んでいたが、ｐＭＯＮ１７４１９系統６、１２、１４、２１，３０からのデンプンは、各々に３１．０％、２５．５％、３１．３％、２８．１％、２７．６％のアミロースを含んでいた。アミロースはヨウ素に対して高いアフィニティーを有するが、一方、中間材料、及び、長い枝分れ鎖を有する異常アミロペクチンは、各々に高度のヨウ素結合能力を有する。従って、アミロースの増加％の一部は、特定のアミロペクチン分枝点の間の距離がより大きいこと、及び／又は、中間材料の増加を原因とする可能性がある。アミロース含量に関する結果は、ｐＭＯＮ１７４１９系統６、２１、３０からのデンプンがより長い分枝点間距離を有することを示すＨＰＡＥＣとＤＳＣとの結果に一致する。これに加えて、アミロース含量の増加は、ｐＭＯＮ１７４１９系統からのデンプンの顆粒形態の変化と相関する。ｐＭＯＮ１７４１９系統からのデンプンの不規則的な、角張った、円筒形形状は、同様にアミロースと中間材料との含量が高いトウモロコシからのアミロース増量剤デンプン（ａｍｙｌｏｓｅｅｘｔｅｎｄｅｒｓｔａｒｃｈ）の顆粒形態に類似している４６：１２１−１２９；Ｋａｔｚ、Ｆ．他，１９９３，Ｃａｒｂ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ２１：１３３−１３６）。単子葉植物における発現当業で公知の方法を使用して、イソアミラーゼに対する遺伝子を、単子葉植物細胞に安定的に形質転換して、植物を再生させることができる。例えば、トウモロコシを形質転換及び再生する方法に関しては、ＥＰ５８６３５５Ａに相当する米国特許出願番号０８／２７５，９２９（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ他）を参照されたい。トウモロコシ及び他の単子葉植物においてｉａｍ遺伝子が発現させられる能力を試験するために、次の実験を行った。ＣＴＰＩ−ｉａｍ融合を、ｐＭＯＮ１７４１１からのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離し、ｐＵＣベースのベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローニングし、ｐＭ０Ｎ１７４３１を得た。ｐＭＯＮ１７４３１中のＣＴＰ−ｉａｍフラグメントは、３’が構成的（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）ＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＨＳＰ７０イントロンであり、５ ’がＮＯＳ３’転写ターミネーターであった（即ち、Ｅ３５Ｓ／ＨＳＰ７０／ＣＴＰ１−ｉａｍ／ＮＯＳ３’）。第２のベクターであるｐＭＯＮ１７４８２を同様に調製したが、この場合には、再生可能トウモロコシ組織の安定した形質転換の後でトウモロコシ穀粒の内胚乳中での発現を得るために、グルテリン１プロモーターの後にＣＴＰ−ｉａｍフラグメントを置いた。ｐＭＯＮ１７４３１とエンプティー（ｅｍｐｔｙ）対照ベクターをＥ．ｃｏｌｉから精製し、トウモロコシ葉から調製したプロトプラストの中に２重に（各々にＤＮＡ１００μｇ）エレクトロポレーションした。約２４時間後に、エレクトロポレーションした細胞からのフラクションを、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中で音波処理することによって粉砕し、ウエスタンブロットで分析した。トウモロコシ葉プロトプラスト中での過渡的イソアミラーゼ発現を抽出タンパク質全体の０．１％と評価した。粒子ガン衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅｇｕｎｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって、ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ（ＢＭＳ）トウモロコシカルス組織の中に、プラスミドＥＣ９（Ｆｒｏｍｍ他，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：８３３−８３９，１９９０に説明）と共にｐＭＯＮ１７４３１も同時形質転換した。ｐＥＣ９は、クロルスルフロン耐性を与え且つＥ３５Ｓプロモーターによって促進されるトウモロコシ突然変異ＡＬＳｃＤＮＡを含む。２％ＳＤＳ、１５％グリセロール、７５ｍＭトリスｐＨ７．４の中で組織を粉砕することによって、タンパク質をクロルスルフロン耐性カルス組織から単離し、ウエスタンブロットによって分析した。ＢＭＳカルス組織中でのイソアミラーゼ発現を、抽出タンパク質全体の０．０２５−０．０５％と評価した。ＣＴＰ１−ｉａｍ／ＮＯＳ３’カセットをｐＭＯＮ１７４１１からのＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして単離し、別のｐＵＣベースのベクターのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位の中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ１７４８２を得た。ｐＭＯＮ１７４８２中のＣＴＰ−ｉａｍ／ＮＯＳ３’フラグメントは、３’が内胚乳特異的コメグルテリンプロモーター（Ｐ−ｏｓｇｔ１）とＨＳＰ７０イントロンであった（即ち、ｐ−ｏｓｇｔ１／ＨＳＰ７０／ＣＴＰ１−ｉａｍ／ＮＯＳ３ ’）。塩化セシウム密度勾配遠心分離を使用して２リットルのＥ．ｃｏｌｉから約１ｍｇのｐＭＯＮ１７４８２を精製した。粒子ガン衝撃によってトウモロコシ細胞を形質転換するために、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを使用した（例えば、ＥＰ５８６３５５Ａ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ他を参照されたい）。Ｒ₀植物からの個々のトウモロコシ種子を液体窒素上で粉砕して微粉末にした。［１００ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、３５ｍＭＫＣｌ、２０％グリセロール、ｐＨ７．５］０．１ｍＬ中でボルテックスすることによって粉末からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットによって分析した。成熟穀粒の内胚乳中でのイソアミラーゼ発現を１８種の形質転換系統の中の５種の系統から検出した。この酵素の発現が最大だった系統は、抽出可能タンパク質全体の０．２％よりも僅かに高い割合でイソアミラーゼを含んでいた。デンプンの構造的改変を、この範囲内の酵素の発現から推定することが可能だろう。同様に、本明細書に引例として組み入れている米国特許第５．４０５，７６５号（Ｖａｓｉｌ他）のような公知の方法を使用して、イソアミラーゼ遺伝子をコムギの中に形質転換することが可能である。イソアミラーゼの発現に有効であり得るプロモーター（例えば、ｉａｍ）を上記で説明している。ＨＳＰ７０イントロンも、コムギ形質転換のためのベクター中で使用可能である。上記説明から、本発明が、明瞭であり且つ本発明に固有である利点と共に、上記の目的と目標の全てを達成することに十分に適合した発明であることが理解されるだろう。幾つかの特徴とその組み合わせが有益であり、他の特徴とその組み合わせに言及せずに使用可能であるということが理解されるだろう。これは、本発明によって意図され、本発明の請求の範囲内に含まれる。本発明の範囲からの逸脱なしに様々な実施様態を作成することが可能なので、本明細書で説明した全ての事柄は本発明を例示するものにすぎず、従って本発明を何ら限定するものではないということを理解しなければならない。本明細書に示す全ての公開又は特許は、その個々に関して本明細書に引例として組み入れられていることが明示されているように、引例として本明細書に組み入れられている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/28 9/28 Ｃ１２Ｐ 19/04 ＺＣ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クローン，ブラツドリー・マーテインアメリカ合衆国、ミズーリ・63146、セント・ルイス、クレーモント・クロツシング・ドライブ・2016、アパートメント・エフ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２のタンパク質をコードする単離ＤＮＡ分子。２．配列番号：１０の単離ＤＮＡ分子。３．配列番号：１１の配列を実質的に有するポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列を含み、且つ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、酵母から選択される形質転換細胞。４．５’から３’の方向に作動的に結合したａ）ＲＮＡ配列の生産を生じさせるように機能するプロモーター、及び、ｂ）配列番号：１０の構造コーディング配列を含み、前記プロモーターが前記構造コーディング配列に対して異種であるＤＮＡ構築物。５．請求項４に記載の前記ＤＮＡ構築物を含む生物の培養を発酵させる段階と、それからイソアミラーゼを抽出する段階を含む、イソアミラーゼを生産する方法。６．５’から３’の方向に作動的に結合したａ）選択されたデンプン生産植物細胞中で機能してＲＮＡ配列の生産を生じさせるプロモーター、ｂ）イソアミラーゼをコードする構造コーディング配列、及び、ｃ）前記植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端に対するポリアデニラートヌクレオチドの付加を生じさせる３’非翻訳領域を含み、前記プロモーターが前記構造コーディング配列に対して異種であるＤＮＡ構築物。７．前記構造コーディング配列が更に色素体ターゲッティング配列を含む請求項６に記載のＤＮＡ構築物。８．前記色素体ターゲッティング配列がＣＴＰ−１色素体ターゲッティング配列配列番号：７である請求項７に記載のＤＮＡ構築物。９．前記イソアミラーゼが配列番号：１１である請求項６に記載のＤＮＡ構築物。１０．５’から３’の方向に作動的に結合したａ）選択されたデンプン生産植物細胞中で機能してＲＮＡ配列の生産を生じさせるプロモーター、ｂ）イソアミラーゼをコードする構造コーディング配列、及び、ｃ）前記植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端に対するポリアデニラートヌクレオチドの付加を生じさせる３’非翻訳領域を有し、且つ、前記プロモーターが前記構造コーディング配列に対して異種であるＤＮＡ構築物を含む形質転換植物細胞。１１．前記構造コーディング配列が更に色素体ターゲッティング配列を含み、且つ、前記イソアミラーゼが５−８の最適ｐＨを有する請求項１０に記載の形質転換植物細胞。１２．前記色素体ターゲッティング配列がＣＴＰ−１色素体ターゲッティング配列配列番号：７である請求項１１に記載の形質転換植物細胞。１３．前記イソアミラーゼが配列番号：１１である請求項１２に記載の形質転換植物細胞。１４．前記イソアミラーゼが配列番号：１０でコードされる請求項１３に記載の形質転換植物細胞。１５．前記植物細胞が、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サツマイモ、カッサバ、又は、コメからの細胞である請求項１０に記載の形質転換植物細胞。１６．更に外来のＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子で安定的に形質転換された請求項１０に記載の形質転換植物細胞。１７．改変された構造を有するデンプンを生産する方法であって、ａ）５’から３’の方向に作動的に結合したｉ）選択したデンプン生産植物細胞中で機能してＲＮＡ配列の生産を生じさせるプロモーター、 ii）イソアミラーゼをコードする構造コーディング配列、及び、 iii）前記植物細胞中で機能して前記ＲＮＡ配列の３’末端に対するポリアデニラートヌクレオチドの付加を生じさせる３’非翻訳領域を有し、且つ、前記プロモーターが前記構造コーディング配列に対して異種であるＤＮＡ構築物を含むように、植物細胞を形質転換する段階、ｂ）植物全体を再生させる段階、ｃ）前記植物を繁殖させる段階、ｄ）植物材料を収穫する段階、及び、ｅ）前記植物材料からデンプンを抽出する段階を含む前記方法。１８．前記構造コーディング配列が更に色素体ターゲッティング配列を含み、且つ、前記イソアミラーゼが５−８の最適ｐＨを有する請求項１７に記載の方法。１９．前記構造コーディング配列がＣＴＰ−１色素体ターゲッティング配列配列番号：７を含む請求項１８に記載の方法。２０．前記イソアミラーゼが配列番号：１１である請求項１９に記載の方法。２１．前記イソアミラーゼが配列番号：１０でコードされる請求項２０に記載の方法。２２．前記植物細胞が、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サツマイモ、カッサバ、又は、コメからの細胞である請求項２１に記載の方法。２３．前記植物細胞が更に安定的に形質転換された外来のＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子を含有する請求項１７に記載の方法。２４．請求項１７に記載の方法で生産されるデンプン。２５．請求項１０に記載の形質転換植物細胞を含み、且つ、構造改変デンプンを含む植物。２６．前記植物が、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、サツマイモ、カッサバ、又は、コメである請求項２５に記載の植物。２７．前記構造改変デンプンが、より高い「アミロース」対「アミロペクチン」比率を有する請求項２５に記載の植物。