CN108949612B - 一株大肠埃希氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株TMS301及其应用，该菌株于2018年5月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏编号为CGMCC No.15750，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，所分离得到的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TMS301处理淀粉糊液时具有良好的降低直链含量、提高支链含量的特性。

Description

一株大肠埃希氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种大肠埃希氏菌在处理淀粉糊液降低直链含量提高支链含量的应用。
背景技术
淀粉是一种多糖，分子式(C6H10O5)n，广泛存在于各种植物的组织中。我国的淀粉资源丰富、来源广泛、价廉易得、无毒且易降解。随着种植技术不断进步，我国淀粉年产量也逐年递增，据不完全统计，我国淀粉年产量已达2000多万吨。但由于淀粉的许多固有性质的限制，使其很难在工业领域发挥重大作用。因此，研究变性淀粉对我国淀粉资源的配置应用意义深远。
变性淀粉是指在原淀粉的基础上,利用物理、化学或生物法处理来改变天然淀粉的原有性质(如：水溶性、糊化温度、粘度、冻融稳定性、热塑性、成膜性、物理强度、透明度等)，通过在天然淀粉分子中引入取代基或者将原淀粉分子破碎、重新排列、氧化而制得性质有所改变、发生强化或者具有原淀粉不具有的新特性的淀粉衍生物。变性淀粉是淀粉深加工系列产品中最大的一个分支，目前世界变性淀粉产品约有2000余种，在建筑、食品、医药、环境等诸多领域已得到广泛应用。而随着科学技术的不断发展以及人们对变性淀粉功能认识的不断深入，其应用领域也在不断拓宽。我国对变性淀粉的研究、生产起步较晚，目前只有300余种产品，且存在着附加值低、同质化严重、产品种类重复单一、科技含量较低等问题，与欧美国家尚有较大差距。但是我国淀粉资源非常丰富，近十年来变性淀粉生产发展比较迅猛，已初具规模。据不完全统计，全国变性淀粉生产厂家已超过300多家，年生产能力可达120万～150万吨，呈现出良好的发展态势，如能进一步利用自身优势，积极开发和推广新的变性淀粉生产工艺，会具有更强的市场竞争力和更广阔的应用前景。
通过改变淀粉的直链含量或支链含量，可以使淀粉的性质发生改变，从而使其具有新的或改变的特性，例如减少淀粉的直链含量，可以延缓淀粉的老化，而提高淀粉的支链含量，可以改善淀粉的冻融稳定性，扩大淀粉的应用范围。然而使用传统的物理或化学手段很难改变淀粉的直链或支链含量，目前主要是通过生物育种和酶法变性来达到改变淀粉直链及支链含量的目的。
通过生物育种来改变淀粉的直链或支链含量已有报道，如高直链玉米或糯米玉米的育种及推广等。然后生物育种耗时长，产量低，不适宜大面积种植及推广，因此生物育种法整体进展比较缓慢。
酶法变性因其工艺简单、成本低廉、功能丰富、环境友好且完全无毒无害而受到越来越多的关注，有着自身无可比拟的优势。但是由于目前国内已知的工业微生物或淀粉酶种类较少，功能不明晰，工艺手段单一且不易控制，再加上国内对生物法变性的研发力度远远不够，极大地限制了生物法改性淀粉方向的发展，目前只有欧美和日本等少数几个国家掌握生物法改性先进技术，能够生产高性能高附加值生物法变性淀粉及产品。因此大力投入对重要工业微生物及淀粉酶的开发及其性能的研究，大力推进生物法相关生产工艺的研究和应用，将是打破国外对重要工业微生物及淀粉酶的工艺封锁和对国内生物法变性淀粉市场垄断的关键。
发明内容
本发明的第一目的提供了一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株TMS301，本发明利用的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株TMS301已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，地址：中国北京市北辰西路1号院3号，保藏日为2018年5月10日，保藏号为：CGMCC No.15750。
本发明的第二目的提供了一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株TMS301在制备低直链含量、高支链含量的淀粉中应用。
本发明所用菌株TMS301是从山东某淀粉厂用地的土壤中分离得到，该菌株TMS301可在pH为7.2±0.2的LB培养基中良好生长。将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，通过菌体破碎得到粗酶液，应用于处理淀粉糊液降低直链含量、提高直链含量。
所述大肠杆菌菌株TMS301，在pH＝7.0±2.0，温度30-80℃条件下，处理淀粉糊液可降低直链含量提高支链含量。
所述处理淀粉糊液包括所有的淀粉种类。
具体步骤如下：
1、菌种复苏：所述大肠埃希氏菌菌株TMS301种子菌接种到LB固体培养基上，37℃培养24h，备用。
2、菌种发酵：将液体发酵种子培养液按1％的接种量接入摇瓶，装液量为100mL，37℃培养至OD600达到0.6-0.8，加入诱导剂IPTG(工作浓度为0.4mM)，30℃培养16h，得到大肠埃希氏菌菌株TMS301发酵液。
3、粗酶液制备：100mL大肠埃希氏菌菌株TMS301发酵液6000g，10min离心得到菌体，弃上清，用10mL 50mM,pH7.0±2.0的PBS缓冲液重悬，超声破碎(30％功率，30min)，10000g，10min离心得到粗酶液，4℃保存，备用。
4、处理淀粉糊液：配制一定浓度的淀粉糊液，均匀取出等量2份。第一份加入一定量的粗酶液，第二份加入等量的水，30-80℃匀速搅拌3h。取1mL待测糊液加入1mL 1M乙酸和2mL碘液(I2 0.2％+KI 2％),静止10min后,测定OD620和OD460,查标准曲线,即可求得试样中直链淀粉的含量；测定OD540和OD700,查标准曲线即可求得试样中支链淀粉的含量。
本发明的特点与优势在于：该菌株TMS301处理淀粉糊液时可降低直链含量、提高支链含量。本发明中淀粉糊液的直链含量和支链含量由双波长分光光度法测定。
附图说明
图1.直链淀粉的标准曲线。
图2.支链淀粉的标准曲线。
图3.酶处理前后淀粉直链淀粉含量变化。
图4.酶处理前后淀粉支链淀粉含量变化。
具体实施方式
实施例1：
大肠埃希氏菌的获得
从山东某淀粉厂工厂附近土地取土样。称取10g土壤溶解于100mL无菌水中，混匀制得样品溶液。通过无菌操作，称取0.1mL于LB固体培养基中，用高压灭菌后的玻璃棒涂布平板，置于37℃培养，待菌落生长完成后，挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃培养24h后得到菌悬液，用灭菌的接种环蘸取菌悬液于LB固体培养基上划线，待菌落生长完成。重复上述步骤，直至得到纯的单菌落，挑取该板单菌落培养，并在30％甘油条件下-80℃保存。
该分离菌株经实验室鉴定，形态为两端钝圆的短小杆菌，有鞭毛，能运动，无芽孢，在培养基培养时无需添加生长因子，加入伊红美蓝时菌落呈深紫色，并有金属光泽，革兰氏染色呈阴性，经确认为大肠埃希氏菌。
实施例2：
大肠埃希氏菌TMS301粗酶液制备
将活化的大肠埃希氏菌接入LB液体培养基中，37℃培养24h。将液体发酵种子培养液按1％的接种量接入摇瓶，装液量为100mL，37℃培养至OD600达到0.6-0.8，加入诱导剂IPTG(工作浓度为0.4mM)，30℃培养16h，得到大肠埃希氏菌发酵液。100mL大肠埃希氏菌发酵液6000g，10min离心得到菌体，弃上清，用10mL 50mM,pH7.0±2.0的PBS缓冲液重悬，超声破碎(30％功率，30min)，10000g，10min离心得到粗酶液，4℃保存，备用。
实施例3：
标准曲线
用直链淀粉标品配制0mg/mL,0.04mg/mL,0.08mg/mL,0.16mg/mL,0.32mg/mL和0.64mg/mL的淀粉溶液，搅拌煮沸30min。冷却后各取1mL加入1mL 1M乙酸和2mL碘液(I20.2％+KI 2％),静止10min后,测定测定OD620和OD460,绘制直链淀粉标准曲线。
表1.直链淀粉标准曲线数据
Figure BDA0001692223390000041
Figure BDA0001692223390000051
用支链淀粉标品配制0mg/mL,0.32mg/mL,0.64mg/mL,1.28mg/mL,2.56mg/mL,5.12mg/mL的淀粉溶液，搅拌煮沸30min。冷却后各取1mL加入1mL 1M乙酸和2mL碘液(I20.2％+KI 2％),静止10min后,测定测定OD540和OD700,绘制支链淀粉标准曲线。
表2.支链淀粉标准曲线数据
浓度(mg/mL) A<sub>540</sub>-A<sub>700</sub>
0 0
0.08 0.2784
0.16 0.5092
0.32 0.9708
0.64 1.894
1.28 3.7404
实施例4
大肠埃希氏菌处理淀粉糊液降低直链含量提高支链含量。
按照下表配置淀粉糊液：
Figure BDA0001692223390000052
上表中每份糊液各取出等量2份。第一份加入一定量的粗酶液，第二份加入等量的水，30-80℃匀速搅拌3h。
取1mL待测糊液加入1mL 1M乙酸和2mL碘液(I2 0.2％+KI 2％),静止10min后,测定OD620,OD460,查标准曲线,即可求得试样中直链淀粉的含量；测定OD540,OD700,查标准曲线即可求得试样中支链淀粉的含量。
表3.酶处理前后淀粉直链淀粉含量变化数值
Figure BDA0001692223390000061
表4.酶处理前后淀粉支链淀粉含量变化数值
Figure BDA0001692223390000062
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TMS301，其保藏编号为CGMCC No.15750。
2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TMS301在降低淀粉中低直链含量、提高淀粉中高支链含量中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的淀粉包括天然淀粉和变性淀粉。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的天然淀粉包括玉米淀粉、木薯淀粉、大米淀粉。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的变性淀粉包括羟丙基玉米淀粉、羟丙基木薯淀粉、乙酰化大米淀粉。
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