CN113046278A - 一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌、微杆菌和纤维单胞菌，再经过优化与复配，获得了降解效率较高的组合，该复合菌剂可实现秸秆中纤维素的快速降解，有利于纤维素类生物质废弃物的资源化利用。

Description

一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂
技术领域
本发明属于纤维素类生物质废弃物微生物降解技术领域，具体是一种发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂及降解方法。
背景技术
随着我国农业生产规模的持续提高，农业固体废物产量逐年上升，玉米、水稻和小麦等大宗秸秆年产量约达11亿吨，这类废弃物如果不加以利用，会造成严重的大气污染和水土污染，不仅浪费资源，还严重影响了生态环境与人类健康。
纤维素类废弃物是一类资源化利用潜力巨大的可再生能源，其具有绿色、洁净，可收集-可储存-可运输等特点，并可通过酶催化转化或微生物发酵手段转化为能源产品和化学制品。因此对纤维素类生物质废弃物的资源化利用有利于发展循环经济、实现可持续发展，具有一定的社会效益、经济效益和环境效益。
纤维素结构复杂，性质稳定，它可以被纤维素酶水解成纤维二糖和葡萄糖的复合酶系，是微生物发挥代谢作用的催化剂。而单一菌株分泌的酶相对较少，酶活降低，对纤维素的降解程度有限，处理效果欠佳。因此需要利用多种纤维素降解菌株间的协同作用，构建可生产多种纤维素酶的高效稳定符合菌剂，通过破坏秸秆表面的蜡质硅化层使秸秆出现裂隙，增加内部组分与纤维素酶的接触面积，加速纤维素降解，增强处理效果，提高生物利用率。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂及降解方法，该方法可实现秸秆中纤维素的快速降解，有利于纤维素类生物质废弃物的资源化利用。
为实现上述目的，本发明包括如下技术方案：
一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂，其包括：枯草芽孢杆菌、微杆菌和纤维单胞菌。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述三种菌种中枯草芽孢杆菌占总菌剂的体积含量为10-70％，微杆菌占总菌剂的体积含量为10-70％，纤维单胞菌占总菌剂的体积含量为10-70％。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的保藏号为CGMCC 1.339，微杆菌Microbacterium的保藏号为CGMCC 1.8072，纤维单胞菌Cellulomonas uda的保藏号为CGMCC 1.1002。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述复合微生物菌剂还包括曲霉菌、链霉菌和/或米根霉，曲霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，链霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，米根霉占总菌剂的体积含量小于50％。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述曲霉菌Aspergillus oryzae的保藏号为CGMCC 3.13904，链霉菌streptomyces thermoalcalitolerans的保藏号为CGMCC4.6961，米根霉Rhizopus oryzae的保藏号为CGMCC 3.5052。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述复合微生物菌剂还包括曲霉菌和/或米根霉，曲霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，米根霉占总菌剂的体积含量小于50％。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述复合微生物菌剂还包括链霉菌，链霉菌占总菌剂的体积含量小于50％。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述复合微生物菌剂是将所述菌株在培养基中培养达到对数生长期，按照所述比例将各菌株的培养液混合。
如上所述的复合微生物菌剂，优选地，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
优选地，培养基成分如下：
牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH7.2-7.4。
高氏一号培养基(g/L)：淀粉20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，MgSO40.5，NaCl0.5，FeSO40.01，琼脂20.0，pH 7.2-7.4。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(g/L)：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂20.0，pH6.0-7.0。培养基配置后需经过121℃灭菌20min。
使用本发明的复合微生物菌剂进行发酵降解麦秆，可采用以下方法对秸秆进行预处理：秸秆在0.5-2％NaOH碱液中浸泡24-48小时，用水冲洗，用清水浸泡12-48小时，用盐酸调整pH为7.0左右，105℃烘干。
本发明的有益效果在于：本发明选择多种纤维素降解菌株，可生产多种纤维素酶，通过相互间的协同作用构建的高纤维素酶活力的复合菌剂，可通过破坏秸秆表面的蜡质硅化层使秸秆出现裂隙，增加内部组分与纤维素酶的接触面积，加速纤维素降解，复合菌剂的纤维素降解率远高于单一菌种，具有极佳的处理效果和生物利用率。
附图说明
图1为实施例1复合菌剂降解滤纸的照片。
图2为实施例2的实验组-1和对照组处理20d时秸秆的降解率。
图3为实施例3的实验组-1与实验组-2处理30d时秸秆的降解率。
图4为实施例4的实验组-1与实验组-2处理12d时秸秆的降解率。
具体实施方式
以下实施例中使用的部分样品来源及预处理：
1.菌株：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 1.339。
微杆菌Microbacterium，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 1.8072。
纤维单胞菌Cellulomonas uda，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 1.1002。
曲霉菌Aspergillus oryzae，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 3.13904。
链霉菌streptomyces thermoalcalitolerans，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 4.6961。
米根霉Rhizopus oryzae，保藏单位，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC 3.5052。
2.玉米秸秆：
玉米秸秆用0.5％NaOH碱液浸泡48小时，用自来水冲洗数次，用清水浸泡24小时，用盐酸调整pH为7.0左右，105℃烘干后，粉碎过40目筛。
实施例1纤维素酶活力测定及滤纸崩解实验
1.实验材料
(1)复合微生物菌剂
将枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌分别在牛肉膏蛋白胨培养基中培养至对数生长期，曲霉菌、米根霉分别在PDA培养基中培养至对数生长期，取各菌株的培养液按照以下比例配制成复合微生物菌剂。
实验组-1，枯草芽孢杆菌、曲霉菌、微杆菌、纤维单胞菌、米根霉的体积比为2∶2∶1∶1∶1；
实验组-2，枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌的体积比为2∶1∶1。
(2)滤纸降解实验
将上述2组复合微生物菌剂分别加入以滤纸为唯一碳源的培养基中，培养48小时后进行纤维素酶活力测定，培养3天、4天后进行滤纸崩解观察。
(3)实验结果
如图1-a所示，培养至第3天，与空白组(右侧试管)相比，实验组-1(左侧试管)对滤纸有明显降解作用，滤纸弯曲程度很大；第4天如图1-b所示，实验组-1(左侧试管)滤纸裂解成呈糊状。
(4)纤维素酶活力测定
上述二组复合微生物菌剂(实验组-1与实验组-2)培养48小时后，分别取3mL发酵液于离心管中，4℃，6000rpm离心10min，取上清液。在装有三张1*6cm滤纸的试管中按照表1所述操作步骤加样操作。
表1比色法测定纤维素酶活力反应体系
Figure BDA0003060269900000041
注：DNS为3’，5’-二硝基水杨酸；
a.50℃水浴5min b.先50℃水浴60min，后沸水5min终止反应c.煮沸5min
反应结束后于520nm处测定的OD值，通过葡萄糖标准曲线可得到葡萄糖生成量，最后根据公式计算纤维素活力。计算公式：
Figure BDA0003060269900000042
式中：C为纤维素酶活(U/mL)
n为葡萄糖生成量(mg)
D为离心后上清液稀释倍数
1000为mg与μg换算系数
V为加入的离心后上清液体积(mL)
T为酶反应时间(min)
纤维素活力单位(U)定义为：1mL酶液每分钟催化底物释放出1μg的葡萄糖，定义为一个纤维素活力单位(U)。
结果如表1所示，C为空白对照，实验组-1(T-1)的纤维素酶活为138.05U/mL，实验组-2(T-2)的纤维素酶活为94.43U/mL。
表2对照组与实验组的纤维素酶活
Figure BDA0003060269900000051
实施例2
(1)复合微生物菌剂发酵降解玉米秸秆
称取预处理的玉米秸秆25g放入三角瓶中，调节初始含水量为70％，加入总水量2％的实施例1所述的复合微生物菌剂(实验组-2)，其包含的对数生长期枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌培养液的体积比分别为2∶1∶1，处理20d。实验设不添加菌剂的空白组及对照组-1(只添加2％的枯草芽孢杆菌)、对照组-2(只添加2％的微杆菌)及对照组-3(只添加2％的纤维单胞菌)，每个处理做3个平行。
(2)差重法测定纤维素及半纤维素的含量
称取秸秆1.5g，60℃烘至恒重W1。加入150mL 2mol/L的HCl，105℃保温50min。过滤，依次用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤2次。转入已恒重的坩埚(重W2)中，60℃烘至恒重W3。加入15mL制冷的75％硫酸，室温水解3h后，再加入135mL水，室温过夜，次日过滤，用蒸馏水洗残渣至滤液pH为6.5～7.0。滤渣转入已恒重的坩埚中(W4)，在60℃烘箱中烘至恒重(W5)。
半纤维素含量＝W1-(W3-W2)；纤维素含量＝(W3-W2)-(W5-W4)。
结果如图2所示，处理20天后，空白组、对照组-1、对照组-2和对照组-3的秸秆降解率为5.8％、10.6％、8.5％和11.6％；实验组-2的秸秆降解率为40.9％，其中纤维素与半纤维素的降解率分别为45.06％、52.52％，与只添加2％单一菌种的对照组-1、对照组-2和对照组-3比较，复合菌种的降解率明显大于各单一菌种处理时降解率的简单加和，协同效果显著(p＜0.01)。
实施例3
(1)复合微生物菌剂发酵降解玉米秸秆
称取预处理的玉米秸秆25g放入三角瓶中，调节初始含水量为60％，分别加入2％的复合微生物菌剂(实验组-3)和2％的复合微生物菌剂(实验组-4)，实验组-3的构成为对数生长期枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌培养液的体积比分别为1∶1∶1，实验组-4的构成为对数生长期枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌、链霉菌培养液的体积比分别为2∶2∶2∶1，处理30d。实验设不添加菌剂的空白组，每个处理做3个平行。
(2)差重法测定纤维素及半纤维素的含量
采用与实施例2相同的方法测定发酵前后秸秆中纤维素、半纤维素含量的变化。结果如图3所示，处理30天后，空白组和实验组-3的秸秆降解率分别为5.8％和48.3％；实验组-4的秸秆降解率为56.5％，其中纤维素与半纤维素降解率分别为67.23％与78.07％。
实施例4
(1)复合微生物菌剂发酵降解玉米秸秆
称取预处理的玉米秸秆25g放入三角瓶中，调节初始含水量为60％，分别加入2％的复合微生物菌剂(实验组-5)和2％的复合微生物菌剂(实验组-6)，实验组-5的构成为对数生长期枯草芽孢杆菌、微杆菌、纤维单胞菌培养液的体积比分别为2∶1∶2，实验组-6构成的为对数生长期枯草芽孢杆菌、曲霉菌、微杆菌、纤维单胞菌、米根霉培养液的体积比分别为2∶2∶1∶2∶1，处理12d。实验设不添加菌剂的空白，每组做3个平行。
(2)差重法测定纤维素及半纤维素的含量
采用与实施例2相同的方法测定发酵前后秸秆中纤维素、半纤维素含量的变化。结果如图4所示，处理12天后，空白组和实验组-5的秸秆降解率分别为5.8％和25.5％；实验组-6的秸秆降解率为41.5％，其中纤维素与半纤维素的降解率分别为52.86％、60.56％。

Claims (9)

1.一种用于发酵降解秸秆中纤维素的复合微生物菌剂，其特征在于，其包括：枯草芽孢杆菌、微杆菌和纤维单胞菌。
2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述三种菌种中枯草芽孢杆菌占总菌剂的体积含量为10-70％，微杆菌占总菌剂的体积含量为10-70％，纤维单胞菌占总菌剂的体积含量为10-70％。
3.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC 1.339，微杆菌的保藏号为CGMCC 1.8072，纤维单胞菌的保藏号为CGMCC 1.1002。
4.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂还包括曲霉菌、链霉菌和/或米根霉，曲霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，链霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，米根霉占总菌剂的体积含量小于50％。
5.如权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述曲霉菌的保藏号为CGMCC3.13904，链霉菌的保藏号为CGMCC 4.6961，米根霉的保藏号为CGMCC 3.5052。
6.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂还包括曲霉菌和/或米根霉，曲霉菌占总菌剂的体积含量小于50％，米根霉占总菌剂的体积含量小于50％。
7.如权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂还包括链霉菌，链霉菌占总菌剂的体积含量小于50％。
8.如权利要求2-7中任一项所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂是将所述菌株在培养基中培养达到对数生长期，按照所述比例将各菌株的培养液混合。
9.如权利要求8所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
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