CN104673779A - 降解木质纤维质生物质的组合物和方法 - Google Patents

降解木质纤维质生物质的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及降解木质纤维质生物质的组合物和方法，具体涉及从木质纤维质生物质生产工业上重要的生物能产品和代谢产物的组合物和方法。更具体来说，本发明描述了具有将木质纤维质生物质转变成可发酵糖类、尤其是转变成生物能产品和代谢产物的显著能力的新细菌的鉴定、表征和分离。本发明还公开了分离这样的细菌的方法、包含这样的细菌的组合物以及它们在对木质纤维质生物质进行改性以便生产生物能中的应用。

Description

降解木质纤维质生物质的组合物和方法
本申请为国际申请PCT/EP2010/051885于2011年8月17日进入中国国家阶段、申请号为201080008209.2、发明名称为“降解木质纤维质生物质的组合物和方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及从木质纤维质生物质生产工业上重要的生物能产品和代谢产物的组合物和方法。更具体来说，本发明描述了具有将木质纤维质生物质转变成可发酵糖类、以及更显著地转变成生物能产品和代谢产物的显著能力的新细菌的鉴定、表征和分离。本发明还公开了分离这样的细菌的方法、包含这样的细菌的组合物以及它们在对木质纤维质生物质进行改性以便生产生物能中的应用。
背景技术
自从1970s年代以来，木质纤维质生物质的转化已成为集中研究的主题(Blumer-Schuette等，Extremely thermophilic microorganisms forbiomass conversion:status and prospects(用于生物质转化的极端嗜热微生物：现状与展望),Curr Opinion Biotechnol 19,pp.210-217；Perez等，2002,Int Microbiol 5,pp 53-63)。
就此而言，已知使用微生物对转化的生物质、特别是预处理过的农业原料进行改进，以生产生物能产品例如乙醇。然而，正如在Mosier等(Bioresource Technology 96(2005)673–686)中所报道的，需要对木质纤维质生物质进行预处理以改变纤维素质生物质的结构，使纤维素更容易接近将糖类聚合物转变成可发酵糖类的酶。
然而，据信未来的生物燃料或生物能产品应该源自于原木质纤维质生物质，而不是预处理过的农业原料。这种原生物质的利用需要将木质纤维质生物质降解(例如水解)成可发酵糖类的有效方法，所述可发酵糖类然后可以通过发酵转变成生物能产品(例如醇类和其他具有工业价值的代谢产物)。因此，从原木质纤维质生物质生产可发酵糖类(例如单糖)是一项重要挑战，并且为此已提出多种方法，例如热化学方法、酸水解和酶水解。
然而，由于所考虑的木质纤维质生物质范围广，各自具有纤维素、半纤维素和木质素的特定组成，开发用于水解这种原生物质的酶或酶组合物显得成本效率不高。此外，从木质纤维质生物质的这种处理剩余的木质素副产物，一般保持不变并被浪费。
WO2009/063079描述了使用奇异球菌属(Deinococcus)的细菌通过生物质发酵生产生物能产品和代谢产物。
Taryn等(ABB 45(1994)209)报道了梭状芽胞杆菌属(Clostridium)的细菌降解可发酵糖类的能力。
WO97/10352涉及降解纤维素的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌菌株。类似地，Weon等(Int.J.Systematic and Evolutionary Microbiology(2007),57,pp 1685-1688)报道了水解纤维素的UV抗性奇异球菌属(Deinococcus)菌株。
W.Zimmermann(Journal of Biotechnology,13(1990)119-130)提供了木质素的细菌降解的综述。
还从未报道过能够在适合于工业过程的条件下水解木质纤维质生物质的主要组分包括木质素、木聚糖和纤维素的细菌。具体来说，还从未分离到能够在工业条件下降解木质素的细菌。
因此，对于用于将木质纤维质生物质降解成有价值产品例如可发酵糖类或生物能产品和代谢产物的成本效益高并且可放大的过程，存在着尚未满足的需求。
发明内容
本发明涉及用于从木质纤维质生物质或其衍生物生产有价值产品的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及能够将木质纤维质生物质或其衍生物转化成有价值产品、包括可发酵糖类和生物能产品的新的细菌。本发明还涉及使用这样的细菌生产有价值产品和代谢产物的方法。
本发明尤其源自于鉴定到具有出人意料和引人注目的性质的微生物，所述性质即在工业规模上并且既经济又可靠地转化木质纤维质生物质或其衍生物，以便获得可用于生产生物能的化合物、特别是乙醇。
就此而言，本发明源于设计从任何样品选择或鉴定细菌的改进方法。更具体来说，本发明公开了选择或鉴定或分离细菌的方法，所述方法包含下列步骤：
a)提供包含细菌的样品；
b)对样品进行细胞破坏性的DNA损伤性处理；以及
c)从所述处理过的样品选择或分离在存在木质素、纤维素或木聚糖作为碳源的情况下能够生活或生长，例如利用木质素、纤维素或木聚糖作为碳源的细菌。
本发明的另一个目的是可以通过这样的方法获得的细菌，或所述细菌的提取物。
按照上述方法，本发明人确实从原料分离和鉴定了新的微生物，其具有出人意料的水解木质纤维质生物质的三种主要成分、即纤维素、木聚糖和木质素的能力。
微生物能够转化含木质素原料以生产生物能产品这一新发现，代表了生物技术的突破，其允许通过一步生产过程从原生物质(木质纤维质生物质)生产生物能产品(例如乙醇)，克服了先前的使用预处理过的农业原料代替木质纤维、原生物质的缺点。此外，本发明的相同细菌可用于整个生产过程中，即水解木质纤维质生物质并且通过同时糖化和发酵过程(SSF)经发酵生产生物能产品。
因此，本发明的目的在于分离的细菌，其中所述细菌具有在30℃或更高温度下、在存在木质素或纤维素或木聚糖作为碳源的情况下生长以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。
本发明的具体目的是分离的细菌，其中所述细菌具有在30℃或更高温度下、在存在木质素作为唯一碳源的情况下生长以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。
本发明的另一个目的是分离的细菌，其中所述细菌具有在30℃或更高温度下利用纤维素和木聚糖作为碳源以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。
在优选实施方案中，本发明的细菌具有利用木质素、纤维素和木聚糖作为碳源的显著能力。本发明事实上显示了能够鉴定和培养具有降解木质纤维质生物质的所有主要成分的能力的细菌。这样的细菌可用于以前所未有的效率转化这样的生物质。
在具体和优选实施方案中，本发明的细菌可以在需氧和厌氧两种条件下生长或培养。本发明事实上出人意料地显示出本发明的细菌可以在适合于从各种底物生产大量生物能产品或代谢产物的条件、例如厌氧条件下操作。
在具体实施方案中，本发明的细菌含有外源核酸分子。
在优选实施方案中，本发明的细菌属于选自下列的属：奇异球菌属(Deinococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、热单胞菌属(Caldimonas)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、戈登氏菌属(Gordonia)、红球菌属(Rhodococcus)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、鞘氨醇菌属(Sphingobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)或产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)。
正如在实施例中显示的，可以鉴定并培养的上述属的细菌，能够转化生物质并抵抗4mJ/cm2的细胞破坏性UV处理。这些细菌代表了将生物质、包括木质纤维质生物质转变成高价值产品的有价值的手段。
本发明的另一个目的是包含本发明的细菌和培养基的组合物。
本发明的另一个目的是如上所公开的细菌的提取物。
本发明的另一个目的在于使用本发明的细菌或其提取物来水解木质纤维质生物质，或将木质纤维质生物质转变或转化成可发酵糖类。
本发明的另一个目的是将木质纤维质生物质降解或转变成可发酵糖类的方法，所述方法包含将木质纤维质生物质暴露于本发明的细菌或其提取物的步骤。
本发明的另一个目的是从木质纤维质生物质生产可发酵糖类的方法，所述方法包含将木质纤维质生物质暴露于本发明的细菌或其提取物的步骤。
上述方法可以在需氧和/或厌氧条件下、在高温(例如至少30℃或更高温度)下进行，并允许有效转化木质纤维质生物质的所有主要类型的成分。此外，在具体实施方案中，本发明的方法包含收集可发酵糖类或将可发酵糖类转化成生物能产品或代谢产物的另外步骤。这样的转化(发酵)步骤可以使用本发明的细菌或不同细菌或细菌的组合或其提取物来进行。
在优选实施方案中，水解和发酵两者使用本发明的细菌来进行，更优选情况下使用相同细菌来进行。事实上，在优选实施方案中，本发明通过允许同时进行木质纤维质生物质的水解和糖类的发酵，允许直接从木质纤维质生物质生产生物能产品。
因此，本发明的另一个目的在于使用本发明的细菌生产生物能产品或代谢产物。
本发明的另一个目的是生产生物能产品或代谢产物的方法，所述方法包含将木质纤维质生物质暴露于本发明的细菌或其提取物，以及回收获得的生物能产品或代谢产物。
在优选实施方案中，水解和发酵两者使用本发明的细菌来进行，最优选情况下使用相同细菌来进行。应该指出，在可选实施方案中，可以相继或组合使用两种或更多种不同细菌，以从木质纤维质生物质生产生物能产品。
在具体情况下，本发明涉及包含下列步骤的方法：
-提供(或培养和/或生长)本发明的细菌或其提取物，
-使用所述细菌或其提取物将木质纤维质生物质或其衍生物改性成工业上重要的生物能产品或代谢产物(生物能源如乙醇，化学基础材料(building block)例如琥珀酸)，以及
-收集从所述改造得到的至少一种生物能产品或代谢产物。
本发明还涉及包含如上所定义的细菌和木质纤维质生物质或其衍生物的组合物。
本发明还涉及使用上述方法生产的生物能产品或代谢产物。
本发明的另一个目的是包含木质纤维质生物质和本发明的细菌的反应器或发酵器。
附图说明
图1：UV抗性嗜热细菌在厌氧条件下在MM+CMC1％上的生长结果。
图2：UV抗性嗜热细菌在厌氧条件下在MM+木聚糖1％上的生长结果。
图3：UV抗性粉色分离株在需氧条件下，在30℃下，在MM+木质素0.1％上5天后的生长结果。用线围住的是能够利用木质素作为唯一碳源的分离株M10-1D和M10-1E，以及能够降解木质素的分离株M10-8D。
图4：奇异球菌属(Deinococcus)菌株DRH46能够降解纸质期刊。
发明详述
本发明描述了具有将木质纤维质生物质转化成可发酵糖类以及甚至更显著是转化成生物能产品和代谢产物的卓越能力的新细菌的鉴定、表征和分离。本发明还公开了分离这样的细菌的方法、包含这样的细菌的组合物以及它们在改性木质纤维质生物质以便生产生物能产品和代谢产物中的应用。
定义
本发明的术语木质纤维质生物质是指含有木质素、纤维素和/或木聚糖的原生物质。因此，术语木质纤维质生物质本质上是指未加工的生物来源的材料，例如林产品包括不适合用于木头或造纸的成熟树木、农产品例如草、作物和动物粪尿以及水产品例如藻类和海草。生物质的具体来源包括但不限于硬木或软木树干、玉米芯、麦秸、草、树叶、种子、纸等(参见例如Sun等，Bioresource Technology 83(2002)1–11)。术语木质纤维质生物质应该与被转化的生物质或次生生物质相区分，后者主要包含水解预处理过的生物质产品。
木质纤维质生物质的实例包括源自于大量植物类型的木质或植物材料，所述植物包括芒、麻、甜菜、小麦、玉米、杨树、柳树、高粱、甘蔗以及从桉树到油棕的各种树种。
当在本文中使用时，术语“生物质衍生物”是指包含源自于木质纤维质生物质的分子例如木质素、纤维素、半纤维素的组合物。
在本申请的文本中，术语细菌包括细菌的野生型或天然变体株，例如通过加速进化、通过DNA改组技术获得的菌株，或通过插入真核、原核和/或合成的核酸获得的重组菌株。
“细菌的提取物”是指从细菌获得的任何级份，例如细胞上清液、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制备物、或通过化学、物理和/或酶处理从细菌产生的任何制备物，其基本上不含活细菌。细菌提取物优选保留细菌的酶活性，最优选保留水解木质纤维质生物质的能力。
在本发明的文本中，术语“生物能”是指源自于生物质的可再生能量。更具体来说，术语“生物能产品”包括“生物燃料”和生物质或生物质衍生物改造的能够用作燃料的所有终产品，例如乙醇、丙醇、丁醇、甘油、丁二醇和丙二醇。
术语“代谢产物”是指在生物质或生物质衍生物改造成生物能产品过程中产生的所有可能的中间分子，包括但不限于几种工业上重要的化学产品，例如有机酸和基础材料如乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸、乳酸和/或琥珀酸。
本发明涉及从木质纤维质生物质或木质纤维质生物质衍生物生产生物能的组合物和方法。更具体来说，本发明涉及使用细菌改造木质纤维质生物质以便生产生物能产品和代谢产物。
现在，本发明第一次显示了可以从环境来源分离到能够从木质纤维质生物质生产生物能产品或代谢产物的细菌。
就此而言，本发明的目的在于分离或鉴定细菌的方法，所述方法包含下列步骤：
a)提供包含细菌的样品；
b)对样品进行细胞破坏性DNA损伤性处理；以及
c)从所述处理过的样品分离具有能够在存在木质素、纤维素、半纤维素或木聚糖作为碳源的情况下生活或生长的能力的细菌。
该方法可以使用包含未表征细菌的各种样品、特别是使用是或源自于环境样品的样品来进行。在本发明的情形中，环境样品包括含有(大量)未表征的(微)生物、特别是未培养微生物(例如尚未以分离的形式有意培养和扩增的微生物)的任何样品。样品可以得自或源自于天然环境或人造或特别产生的环境。
正如指出的，样品可以是任何环境样品，例如得自或源自于土壤、水、植物提取物、生物材料、沉积物、泥炭地、工业排放物或排放位点、矿物提取物、沙等的环境样品。样品可以从各种地区或条件收集，例如但不限于热带地区、火山地区、森林、农场、工业区等。样品通常含有各种种类的(未表征、未培养的)微生物，例如陆生微生物、海洋微生物、淡水微生物、共生微生物等。这样的环境微生物的种类包括细菌、藻类、真菌、酵母、霉菌、病毒等。微生物可以包括嗜极生物例如嗜热微生物。样品典型地包含各种不同种类以及各种不同量的这些(未培养)微生物。此外，样品还可以含有已知和/或可培养微生物(例如原核或真核的)。
应该理解，本发明不限于样品或环境微生物的任何具体类型，而是可以使用包含未培养微生物的任何样品来执行。
在优选实施方案中，样品是或源自于土壤、水、温泉、海洋环境、泥、木头、石头、苔藓、植物提取物、地衣、生物材料、沉积物、生物膜、工业废水、气体、沙、油、污水、或动物或人类排泄物。
为了在本发明中使用，样品可以是湿的、可溶的、干燥的，采取悬液、糊状物等形式。此外，在方法的步骤b)之前，可以对样品进行处理以改进过程，例如通过例如过滤、洗涤、浓缩、稀释、操控、干燥等对微生物进行富集。
在具体实施方案中，样品采取过滤过的悬液的形式。更具体来说，在处理步骤b)之前，样品可以被除菌过滤和/或置于无菌水中。
方法的步骤b)包含对样品(即包含在样品中的微生物)进行细胞破坏性DNA损伤性处理。
细胞破坏性DNA损伤性处理是指与仅仅导入DNA修饰的诱变处理相反，引起样品中大部分细胞死亡的处理。具体来说，细胞破坏性DNA损伤性处理是足以在大肠杆菌(E.coli)细菌培养物中引起90％以上细胞死亡的处理。更优选情况下，细胞破坏性DNA损伤性处理是足以在大肠杆菌(E.coli)培养物中使细菌滴度降低至少两个对数级的处理。令人吃惊的是，本发明显示出这种一般来说对大多数细胞群体致死的处理，允许从各种类型的样品有效快速地分离新的微生物，所述微生物具有出人意料的性质。该结果是特别令人吃惊的，因为根据预计，对微生物进行这样的细胞破坏性DNA损伤性处理将阻止活微生物的分离。
DNA损伤性处理可以包含对样品进行辐射和/或一种或几种基因毒物处理。处理在足以在样品中存在的微生物中诱导显著细胞死亡的条件下和/或时间长度内进行。
在具体实施方案中，DNA损伤性处理包含对样品进行一次或几次辐射。优选处理包含对样品(即样品中的微生物)进行重复的连续辐射处理。
辐射可以选自单独或组合的UV、γ和/或X射线辐射，最优选为UV辐射。辐射处理典型地包含对微生物进行一次或几次连续辐射(例如1至5次)，所述辐射可以是相同或不同性质的，优选为相同性质的。
特别优选的处理包含对样品进行细胞破坏性UV辐射。事实上，本发明显示出这种处理允许从环境(例如土壤或水)样品中高效分离具有显著酶活性的未表征的细菌菌种。细胞破坏性UV处理典型在0.5至400mJ/cm2之间，更优选在1至200mJ/cm2之间，典型在1至100mJ/cm2之间。优选的UV处理是4mJ/cm2。重复的辐射处理典型以1至8小时之间、优选3至5小时之间、更优选约4小时的时间间隔进行。
在具体实施方案中，细胞破坏性DNA损伤性处理包含对样品进行至少两次、优选至少三次UV处理，每次处理在0.5至400mJ/cm2之间、优选每次约4mJ/cm2，其以1至8小时之间、优选3至5小时之间、更优选约4小时的时间间隔进行。
在可选方法中，细胞破坏性DNA损伤性处理包含将样品与基因毒物例如溶剂、丝裂霉素或H2O2相接触。应该理解，基因毒物也可与辐射组合使用。
在处理阶段中，优选将样品置于适合的培养基中，例如但不限于PGY(细菌蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖1g/L)或LB(细菌胰蛋白胨10g/L、酵母提取物2.5g/L、氯化钠10g/L)。应该理解，其他适合的培养基对于专业技术人员来说是已知的(Buchanan等，1974,Difco,1995)，或可以由专业技术人员从这样的已知培养基制备。
处理步骤b)典型地在固体或半固体培养基中，例如在凝胶(例如琼脂)存在下执行。最优选的处理培养基包含琼脂培养基，例如软琼脂培养基。在具体实施方案中，使用PGY琼脂培养基来生长细菌。然而，也可以使用含有碳源、氮源和无机盐的不同固体培养基。也可以使用按照Schoenborn等(2004)的连续稀释技术。
在步骤c)中，从处理过的样品鉴定或分离活的或生长的细菌。活的或生长的细菌可以通过本技术领域中本身已知的不同手段来鉴定。在具体实施方案中，鉴定在培养基中形成的菌落。可以分离活的或生长的细菌，并将其置于新鲜培养基中用于进一步培养或扩增。
在优选实施方案中，将步骤b)中的细菌培养在包含木质素(以重量计优选为0.05-3％)、纤维素(以重量计优选为0.5-3％)和/或木聚糖(以重量计优选为0.5-3％)作为唯一碳源的基本培养基中。木质素、纤维素和木聚糖可以从商业来源获得(木质素：Sigma，法国；CMC和木聚糖：Fluka，法国)。基本培养基的来源提供在实施例中。可以使用以前描述的其他基本培养基(Rainey,F.A.等，2005.Appl EnvironMicrobiol.71(9):5225-35；Ferreira,A.C.等，1997.Int J Syst Bacteriol.47(4):939-47；Kongpol A等，2008.FEMS Microbiol Lett.286(2):227-235)。
本发明的方法可以包含一个或几个选择具有特定性质的细菌的其他步骤。更具体来说，在优选实施方案中，方法还包含一个或几个选择在所选的培养条件例如培养基、温度、pH、盐度、营养物、充氧或碳源条件下存活或生长的细菌的步骤。为此目的，可以在步骤b)或c)任一期间或先前或随后步骤期间将样品或细菌置于适合的选择条件下，并在任一这些步骤期间选择得到的性质。
在本发明的具体情况下，将细菌在特定温度条件下培养，以便鉴定或分离在约4至70℃的温度范围内活的或能够生长的细菌。更具体来说，在步骤b)和/或c)期间和/或附加步骤期间，将细菌维持在选定温度下，以便鉴定或分离在所需温度下存活或能够生长的细菌。
在本发明的另一个具体情况下，将细菌在特定盐浓度下培养，以便鉴定或分离在NaCl或相当的盐类可能达到约5％重量体积比的浓度条件下存活或能够生长的细菌。更具体来说，在步骤b)和/或c)期间和/或附加步骤期间，将细菌维持在选定盐度下，以便鉴定或分离在所需盐度下存活或能够生长的细菌。
在本发明的另一个具体和优选实施方案中，将细菌在特定pH条件下培养，以便鉴定或分离在约3至9.5之间、优选在4至8之间的pH范围内存活或能够生长的细菌。更具体来说，在步骤b)和/或c)期间和/或附加步骤期间，将细菌维持在选定pH下，以便鉴定或分离在所需pH下存活或能够生长的细菌。
在本发明的另一个具体实施方案中，将细菌在特定充氧条件下培养，以便鉴定或分离在需氧和/或厌氧条件下存活或能够生长的细菌。更具体来说，在步骤b)和/或c)期间和/或附加步骤期间，将细菌维持在选定的充氧条件下，以便鉴定或分离在所需条件下存活或能够生长的细菌。
在本发明的另一个具体实施方案中，将细菌在特定培养基中培养，以便鉴定或分离在所选碳源存在下存活或能够生长的细菌。更具体来说，在步骤b)，c)和或d)期间和/或附加步骤e)期间，将细菌维持在培养基中，以便鉴定或分离在使用所需碳源下存活或能够生长的细菌。
应该理解，可以单独或以任何组合选择上述特征。例如，方法可用于鉴定在所需温度和盐度下、或所需温度和pH下、或所需温度、pH和充氧条件下存活或能够生长的细菌。
此外，本发明的方法可以包含通过本技术领域中本身已知的任何方法，对鉴定或分离到的细菌或它们的DNA进行例如生物、遗传和/或化学修饰的其他步骤，所述修饰旨在例如改进所述细菌的存活力、生长或功能，例如酶活性。这样的修饰步骤包括但不限于细胞融合、加速进化、DNA改组、诱变、插入来自另一菌株的真核、原核或合成的核酸(例如DNA)，或任何遗传工程技术。修饰也可以包括将标志物基因(例如卡那霉素抗性)导入细菌中的步骤。所述修饰步骤可以在分离到的细菌上或在上述过程的任何较早阶段、例如在步骤a)的样品上进行。
本发明的另一个目的是可以通过上述方法获得的细菌。
更具体来说，本发明的目的在于分离的细菌，其中所述细菌具有在至少30℃的温度下、在存在木质素或纤维素或木聚糖作为唯一碳源的情况下生长以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。这些特点的组合是前所未有的，并为木质纤维质生物质的开发利用提供了新的途径。具体来说，抵抗上述UV处理并在30℃或更高温度下生长的能力，允许在与生物质的性质相容的特定严紧工业条件下使用细菌。在存在木质素、纤维素或木聚糖作为唯一碳源的条件下生长(即利用木质素、纤维素或木聚糖作为碳源)的能力，使细菌适合于转化任何类型的木质纤维质生物质。
在其他优选实施方案中，细菌具有利用木质素、纤维素和木聚糖作为碳源的能力。事实上，本发明人已经鉴定到能够降解木质纤维质生物质的所有主要组分的细菌。
此外，正如在实验部分中所显示的，本发明人已经鉴定到能够在需氧或厌氧条件或两种条件下生长的细菌。在特定和有利的实施方案中，本发明涉及如上所定义的能够在需氧和厌氧两种条件下生长或培养的细菌。事实上，本发明出人意料地显示出细菌可以在适合于从各种底物生产大量生物能产品或代谢产物的条件、例如厌氧条件下操作。因此，本发明提供了用于以非常高效的方式从木质纤维质生物质和/或木质纤维质生物质组分即纤维素、半纤维素和木质素生产生物能产品或代谢产物的新的手段和组合物。
本发明的优选细菌能够水解木质纤维质生物质以生产可发酵糖类，并可以在需氧或厌氧条件下培养。
本发明的细菌优选属于选自下列的属：奇异球菌属(Deinococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微杆菌属(Microbacterium)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、热单胞菌属(Caldimonas)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、戈登氏菌属(Gordonia)、红球菌属(Rhodococcus)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、鞘氨醇菌属(Sphingobium)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)或产卟啉杆菌属(Porphyrobacter)。
本发明的优选细菌表现出下列特征：
-在高温(例如约30-70℃)下存活或有功能，
-在厌氧条件下存活或有功能，
-抵抗4mJ/cm2的UV处理；以及
-能够促进纤维素消化以产生葡萄糖。
本发明的其他优选细菌表现出下列特征：
-在高温(例如约30-70℃)下存活或有功能，
-在厌氧条件下存活或有功能，
-抵抗4mJ/cm2的UV处理；以及
-能够利用木质素作为碳源。
本发明的其他优选细菌表现出下列特征：
-在高温(例如约30-70℃)下存活或有功能，
-在厌氧条件下存活或有功能，
-抵抗4mJ/cm2的UV处理；以及
-能够利用木聚糖作为碳源。
本发明的其他优选细菌表现出下列特征：
-在高温(例如约30-70℃)下存活或有功能，
-在厌氧条件下存活或有功能，
-抵抗4mJ/cm2的UV处理；
-能够利用木质素作为碳源；以及
-能够促进纤维素消化以产生葡萄糖；和/或
-能够促进木聚糖消化以产生木糖；和/或
-能够利用木聚糖作为碳源。
细菌可以维持或培养在适合的培养基中，例如但不限于PGY(细菌蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、葡萄糖1g/L)或LB(细菌胰蛋白胨10g/L、酵母提取物2.5g/L、氯化钠10g/L)。应该理解，其他适合的培养基对于专业技术人员来说是已知的(Buchanan等，1974,Difco,1995)，或者可以由专业技术人员从这样的已知培养基来制备。
本发明细菌的具体说明性实例，与它们的分离技术和性质一起提供在实验部分中。应该理解，按照本发明的教导可以分离或表征其他细菌。
本发明的另一个目的在于使用由本发明人提供的细菌或其提取物，以从木质纤维质生物质生产有价值产品。
就此而言，本发明涉及使用这样的细菌或其提取物水解木质纤维质生物质。
本发明还涉及使用这样的细菌或其提取物将木质纤维质生物质转化成生物能产品或代谢产物。
本发明还涉及将木质纤维质生物质降解成可发酵糖类的方法，所述方法包含将所述木质纤维质生物质暴露于本发明的细菌或其提取物。
方法特别适合于生产选自葡萄糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖或半乳糖的可发酵糖类。
本发明的另一个目的是包含木质纤维质生物质和本发明的细菌或其提取物的反应器或发酵器。
本发明的另一个目的是生产生物能产品或代谢产物、特别是乙醇的方法，所述方法包含将木质纤维质生物质暴露于本发明的细菌或其提取物。方法优选还包含收集所述生物能产品或代谢产物的步骤。
本发明的另一个目的是通过上述方法获得的生物能产品或代谢产物。
培养或暴露可以在允许对木质纤维质生物质进行改性以生产生物能产品或代谢产物的任何适合的条件或环境下进行。就此而言，如果需要，方法可以在存在适合的营养物或添加剂的情况下，在反应器中、发酵器中、在户外执行。方法典型地在pH条件、高于40℃的温度以及适合底物的存在下进行。
在上述方法中，培养和/或生长细菌的步骤和将生物质转化成生物能产品或代谢产物的步骤，可以同时或相继进行；并且收集生物能产品或代谢产物的步骤可以与第一和/或第二个步骤同时或相继进行。就此而言，可以将生物质与细菌在适合条件下接触以允许所述细菌的扩增，从而提高过程的效率。可选地，细菌菌株可以在适合的培养条件下单独扩增，然后添加到生物质中。应该理解，最初使用以便将生物质有效转化成大量生物能产品或代谢产物的细菌的精确量，可以由专业技术人员根据细菌的类型、生物质的类型和培养条件进行调整。
在方法的具体实施方案中，细菌生长与生物质转变分开进行。
在具体实施方案中，本发明的方法在生物质转化反应器中执行。“反应器”是指常规发酵器或特殊设计用来执行本发明的用于生物质转变的任何装置或系统，因此具体来说由生物反应器、生物过滤装置、旋转式生物接触器和用于处理生物质的其他气相和/或液相生物反应器构成。可用于本发明的装置可以连续或以分批载量方式使用。
在反应器中，为了执行本发明的方法，使用了至少一种本发明的细菌或细菌提取物，同时对所述反应器进行安置和供应以便在其中建立并维持物理化学条件，以便可以操作所述细菌用于所考虑的应用，并任选使得在反应器中细菌的生长是可能的并优选得到促进。
在本发明方法的另一个实施方案中，在生物质转变过程中将细菌在反应器中生长，同时建立并维持适合的物理化学条件，以便所述细菌的生长是可能的并优选得到促进。
在本发明的可选实施方案中，生物质的转变在需氧、厌氧或微需氧条件下进行。
本发明的其他特点和优点将在实施例中公开，所述实施例是说明性的，并且不对保护范围构成限制。
具体实施方式
实施例
材料和方法
选择试验和培养基组成
167栖热菌(Thermus)培养基
磷酸盐缓冲液
基础培养基组成
-MOPS缓冲液1X(pH7)含：酸性MOPS缓冲液40mM，NH4Cl20mM，KOH 10mM，NaOH 10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM。
-微量营养物质溶液(pH5)：(NH4)6(MO7)243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM。
-维生素溶液，pH4.0，(每种1μg/l)：D-生物素，烟酸，盐酸吡哆醛-HCl，盐酸硫胺素，维生素B12
-磷源：K2HPO45.7mM
-FeCl320μM(制备在柠檬酸钠溶液中，然后过滤)
细菌纤维素酶活性的检测：
原理：
测试是基于追踪纤维素降解过程中NAD向NADH的转变。然后按照供应商的说明书监测340nm处吸光度的增加。
乙醇生产的检测
乙醇可以使用两种方法来定量。
酶法
该方法是基于在乙醇和醇脱氢酶存在下追踪NAD向NADH的转变。
该反应转换成340nm处吸光度的增加。为了进行该测量，可以按照制造商的说明书使用Sigma N7160试剂盒。
通过反相高效液相色谱测量
条件：
带有自动进样器的HPLC Gilson，通过折射法检测，
柱子：Phenomenex Rezex ROA，300mm x 7.8mm
柱温：65℃
流动相：0.005N硫酸
流速：0.600ml/min
首先通过将含有已知浓度乙醇的培养基注入柱子来制作校正曲线。计算在对应于乙醇的22.26min处洗脱的峰面积。对校正曲线进行作图。
接下来，通过将培养上清液注入柱子来测量由细菌产生的乙醇的量。计算在22.26min处洗脱并对应于乙醇的峰的面积。通过与校正曲线进行比较推导出上清液中存在的乙醇浓度。
可以各种不同比例产生的其他代谢产物的检测和定量，可以按照常规的分析和评估方法来进行。
实施例1-利用纤维素作为碳源并在厌氧条件下生长的嗜热抗 UV细菌的选择(图1)
将从环境样品分离并根据其对UV射线的抗性而选择(用4mJ/cm2处理3次，间隔为4小时)的嗜热细菌，接种在含有1％目标碳源、即羧甲基纤维素(CMC；Fluka，法国)或桦木木聚糖(Fluka，法国)的压热灭菌(120℃15分钟)的固体基础培养基上。基础培养基由pH7的MOPS缓冲液构成并经过过滤：酸性MOPS缓冲液40mM(Sigma，法国)，NH4Cl 20mM，KOH 10mM，NaOH 10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM)，pH5的微量元素溶液((NH4)6(MO7)243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM)，pH4的维生素溶液(1μg/L的D-生物素、烟酸、盐酸吡哆醛、盐酸硫胺素和维生素B12)，5.7mM的K2HPO4溶液以及20μM FeCl3在NaH2(C3H5O(COO)3)中的溶液。
通过添加厌氧产气袋(GENbag anaer)((BioMérieux，法国)确保厌氧条件。在厌氧条件下在45℃温育4至5天后，可以观察到利用培养基中存在的碳源的菌落(参见图1)。
命名为M11-2F的UV抗性细菌能够在厌氧条件和45℃下，利用CMC作为唯一碳源生长。
因此，该细菌能够在工业条件下将木质纤维质生物质转化成有价值产品。
实施例2-在厌氧条件下利用木聚糖的嗜热UV抗性细菌的选择 (图2)
将从环境样品根据其对UV射线的抗性而选择(用4mJ/cm2处理3次，间隔为4小时)的嗜热细菌，接种在含有1％目标碳源、即羧甲基纤维素(CMC；Fluka，法国)或桦木木聚糖(Fluka，法国)的压热灭菌(120℃15分钟)的固体基础培养基上。基础培养基由pH7的MOPS缓冲液构成并经过过滤：酸性MOPS缓冲液40mM(Sigma，法国)，NH4Cl 20mM，KOH 10mM，NaOH 10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM)，pH5的微量营养物质溶液((NH4)6(MO7)243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM)，pH4的维生素溶液(1μg/L的D-生物素、烟酸、盐酸吡哆醛、盐酸硫胺素和维生素B12)，5.7mM的K2HPO4溶液以及20μMFeCl3在NaH2(C3H5O(COO)3)中的溶液。
通过添加厌氧产气袋(GENbag anaer)((BioMérieux，法国)确保厌氧条件。在厌氧条件下在45℃温育4至5天后，可以观察到利用培养基中存在的碳源的菌落(参见图2)。
命名为M11-3C的UV抗性细菌能够在厌氧条件和45℃下，利用来自桦木的木聚糖作为唯一碳源生长。
命名为M11-9D的UV抗性细菌能够在厌氧条件和45℃下，在含有CMC或木聚糖作为碳源的培养基上生长。
因此，这些细菌能够在工业条件下将木质纤维质生物质转化成有价值产品。
实施例3–能够利用木质素作为碳源的UV抗性细菌的选择(图3)
将从环境样品根据其对UV射线的抗性而选择(用4mJ/cm2处理3次，间隔为4小时)的细菌，接种在含有0.1％木质素(Sigma，法国)的固体基础培养基上。基础培养基的组成描述在前面的实施例中。在30℃下温育4至5天后，观察到利用培养基中存在的木质素作为碳源的菌落(降解木质素的细菌使培养基脱色)。
结果描述在图3和下面的表1和2中。
表1
表2
因此，所有这些细菌能够在工业条件下将木质纤维质生物质转化成有价值产品。到目前为止，尚未描述过属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)或纤维微菌属(Cellulosimicrobium)的细菌利用木质素作为碳源。
实施例4–木质纤维质生物质转变
将来自在丰富培养基中进行的液体培养的细菌样品用去离子水洗涤，然后接种(1/10)20ml基础培养基，所述基础培养基含有酸性MOPS缓冲液40mM(Sigma，法国)，NH4Cl 20mM，KOH 10mM，NaOH 10mM，CaCl20.5μM，Na2SO40.276mM，MgCl20.528mM)，pH5的微量营养物质溶液((NH4)6(MO7)243nM，H3BO3400nM，CoCl230nM，CuSO410nM，MnCl2250nM，ZnSO410nM)，pH4的维生素溶液(1μg/L的D-生物素，烟酸，盐酸吡哆醛，盐酸硫胺素和维生素B12)，5.7mM的K2HPO4溶液以及20μM的FeCl3在NaH2(C3H5O(COO)3)中的溶液。
纸质期刊和/或Whatman纸被用作木质纤维质生物质来源和碳源。将约140mg纸质期刊加入到上述培养基中。在几周期间监测纸质期刊和/或Whatman纸的降解，并与对照试管(在培养基中不含任何细菌)进行比较。
结果显示在图4中。奇异球菌属(Deinococcus)菌株DRH46能够降解纸质期刊和/或Whatman纸。降解通过纸纤维释放到培养基中来观察，所述培养基在生长几周后变得浑浊(与对照试管相比)。
实施例5–生产可检测水平乙醇的UV抗性纤维素水解和木聚糖 水解性奇异球菌(Deinococcus)的选择
将从环境样品根据其对UV射线的抗性而选择(用4mJ/cm2处理3次，间隔为4小时)的细菌，在45℃下接种在含有Whatman I滤纸或木聚糖作为木质纤维底物的唯一碳源的液体基础培养基上。基础培养基的组成描述在前面的实施例中。在与细菌在45℃下温育几周后，whatman I滤纸被降解，但是对于以与上述相同的方式处理但是不含细菌的whatman I滤纸(对照)，没有观察到降解。此外，在45℃下温育几天后，含有在作为唯一碳源的木聚糖中生长的细菌的培养基与不含细菌的对照培养基相比，观察到表明细菌在这种条件下生长的混浊度的增加。然后确定菌株的代谢性质以评估它们生产乙醇的能力。在所鉴定的各种菌株中，可以提到的是下列水解纤维素、水解木聚糖并生产乙醇的菌株。
本实施例进一步说明了本发明方法的效能，以当将所宣称的方法应用于各种样品时分离具有所选卓越性质的细菌的能力。

Claims (20)

1.一种将木质纤维质生物质降解成可发酵糖类的方法，所述方法包含将所述木质纤维质生物质暴露于具有以下能力的细菌或其提取物下：(i)利用纤维素和木聚糖作为碳源，和/或(ii)利用木质素作为碳源、在至少30℃的温度下以及抵抗4mJ/cm2的UV处理。
2.权利要求1的方法，其中所述细菌通过包含以下步骤的方法获得：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对样品进行重复的UV射线辐射处理、γ射线辐射处理和/或X射线辐射处理，在大肠杆菌(E.coli)培养物中使细菌滴度降低至少两个对数；和
c)从所述处理过的样品分离在存在木质素、纤维素和/或木聚糖作为唯一碳源的情况下能够生活或生长的细菌。
3.权利要求2的方法，其中样品是环境样品或源自于环境样品。
4.权利要求2或3的方法，其中所述处理包含对样品进行三次UV处理，每次为4mJ/cm2，以4小时的时间间隔进行。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述细菌具有利用纤维素和木聚糖作为碳源的能力。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述细菌具有利用木质素作为碳源的能力。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述细菌具有利用纤维素、木聚糖和木质作为碳源的能力。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述细菌能够在需氧和厌氧条件下培养。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述细菌属于选自下列的属：奇异球菌属(Deinococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，微杆菌属(Microbacterium)，纤维微菌属(Cellulosimicrobium)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，热单胞菌属(Caldimonas)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，戈登氏菌属(Gordonia)，红球菌属(Rhodococcus)，窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述可发酵糖类选自葡萄糖、纤维二糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖或半乳糖。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述方法还包含收集所述可发酵糖类。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述方法还包含将所述可发酵糖类转化成生物能产品或代谢产物。
13.权利要求12的方法，其中所述方法还包含收集所述生物能产品或代谢产物。
14.通过包含以下步骤的方法获得的细菌：
a)提供包含未表征细菌的样品；
b)对样品进行重复的UV射线辐射处理、γ射线辐射处理和/或X射线辐射处理，在大肠杆菌(E.coli)培养物中使细菌滴度降低至少两个对数；和
c)从所述处理过的样品分离在存在木质素、纤维素和/或木聚糖作为唯一碳源的情况下能够生活或生长的细菌。
15.分离的细菌或其提取物，其中所述细菌具有在至少30℃的温度下、在存在木质素作为唯一碳源的情况下生长以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。
16.分离的细菌或其提取物，其中所述细菌具有在至少30℃的温度下利用纤维素和木聚糖作为碳源以及抵抗4mJ/cm2的UV处理的能力。
17.权利要求15或16的细菌，其具有利用木质素、纤维素和木聚糖作为碳源的能力。
18.权利要求15-17任一项的细菌，其能够水解木质纤维质生物质产生可发酵糖类。
19.权利要求15-18任一项的细菌，其中所述细菌能够在需氧和厌氧条件下培养。
20.权利要求14-19任一项的细菌，其属于选自下列的属：奇异球菌属(Deinococcus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，微杆菌属(Microbacterium)，纤维微菌属(Cellulosimicrobium)，甲基杆菌属(Methylobacterium)，鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)，假单胞菌属(Pseudomonas)，热单胞菌属(Caldimonas)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)，戈登氏菌属(Gordonia)，红球菌属(Rhodococcus)，窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)。
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