CN101245364A

CN101245364A - 一种聚己内酯降解菌株及其选育方法

Info

Publication number: CN101245364A
Application number: CNA2008100504898A
Authority: CN
Inventors: 王战勇; 王岩; 于丹; 陈珊
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2008-08-20

Abstract

本发明属于生物材料及其选育方法，具体涉及可降解PCL(聚己内酯)的菌株以及该株的选育方法本发明将从化工厂污水中采集的活性污泥放入分离液体培养基中，置恒温摇床中振荡培养、采用平板稀释涂布法进行分离、将选择到的具有降解PCL能力的菌株接种到固体斜面培养基上培养、水冲洗、磁力搅拌下用紫外灯照射、悬液涂布于固体平板培养基上培养等步骤，选育到的青霉(Penicillium.sp)YD0401－Ae具有很强的PCL降解能力，其PCL解聚酶的酶活力可达12~13U/ml。可应用于PCL材质的塑料制品的生物降解。

Description

一种聚己内酯降解菌株及其选育方法

技术领域

本发明属于生物材料及其选育方法，具体涉及可降解PCL(聚己内酯)的菌株以及该菌株的选育方法。

背景技术

PCL(聚己内酯)作为一种新型的可生物降解高分子材料具有广泛的应用前景。具有很好的柔韧性和加工性，同时这种材料具有很好的生物相容性。这种特点，一方面使其具有形状记忆性，具有初始形状的制品，经形变固定后，通过加热等外部条件刺激手段的处理，又可使其恢复初始形状的现象。另一方面，该材料与淀粉等物质共混，可制得完全生物降解材料。目前，PCL作为一种新型的可生物降解高分子材料，在医学、药物、工业、农业等领域具有广泛的应用前景。国外均已有工业规模生产，在许多国家都建立了PCL的研发公司，如美国的U.C.C、Solvay公司，日本的タイセイ化学工业，意大利的Novamont公司等。而且近年来已经将许多的研究成果应用于实际中，如意大利Novamont公司研发的PCL生物降解塑料(Mater-Bi)一次性餐饮具，曾成功用于2000年澳大利亚悉尼奥运会上，用后其废弃物连同生物垃圾进行堆肥化处理，较好地解决了一次性餐饮具废弃物再资源化的问题，为实现绿色奥运贡献了力量；又如日本已在北海道、关东、九州等地区进行PCL生物降解地膜的覆盖试验；北美、欧洲、日本均在积极进行研究开发PCL用于渔业材料。基于PCL本身诸多的优点，进入20世纪90年代以来我国加大了对PCL的研发，并将PCL(聚己内酯)研究列入地方“九五”重点科技攻关计划。本项研究的目的是研究PCL降解菌株降解PCL的特性和降解规律，探讨PCL解聚酶的生化特性及其降解过程和酶作用的机理，为PCL的应用奠定理论和实践基础，从自然界中筛选出可降解PCL的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种可降解PCL(聚己内酯)的菌株及其选育方法。

本发明从化工厂污水处理车间采集活性污泥，并以PCL作为唯一碳源筛选到具有PCL降解菌株。对该菌株进行紫外诱变处理，获得具有降解PCL能力的变异菌株YD0401-Ae。PCL可被本发明的菌株产生的PCL解聚酶水解而发生降解，产物为ε-羟基己酸。

将从化工厂污水处理车间采集的活性污泥放入分离液体培养基(组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.194％，pH 6.8)中，置恒温摇床中振荡培养，直至浑浊的培养液变得澄清为止。取一定量的培养液，采用平板稀释涂布法进行分离。选菌落周围有明显透明圈的菌落进一步纯化。

将选择到的具有降解PCL能力的菌株接种到固体斜面培养基(组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.194％，琼脂2％，pH 6.8，)上，培养至出现大量分生孢子。

以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡使分生孢子分散。显微镜检查，使孢子浓度为10⁶~10⁷个/ml。

灭菌平皿中装入适量分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯照射，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释。

取上述悬液涂布于固体平板培养基上，避光培养，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小。初步筛选水解透明圈较大的菌株。

根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入固体斜面培养基，待长满后接入液体培养基中，摇瓶培养，通过检测发酵液中PCL解聚酶的活力进一步筛选获得青霉(Penicillium.sp)菌株。

选育获得的菌株的菌落培养初期颜色为灰白色，渐变灰绿色，最后为墨绿色，且中间夹有橙色(或黄色)。其气生菌丝为絮状，营养菌丝为无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗顶端有不对称帚状分枝，帚状枝结构由简单到复杂，作两次对称二轮或不对称(三次)分枝。分生孢子为椭圆形。具体分生孢子梗的帚状分枝和分生孢子形态见图1。

采用紫外诱变筛选到的青霉(Penicillium.sp)YD0401-Ae具有很强的PCL降解能力。菌株在液体培养基中，28℃摇瓶培养120h，其PCL解聚酶的酶活力可达12~13U/ml。对YD0401-Ae菌株的PCL降解产物进行质谱分析，结果如图2所示。在图中出现的明显的分子量为133的质谱峰，对应的是PCL单体，即ε-羟基己酸。说明青霉(Penicillium.sp)YD0401-Ae对PCL的产物为ε-羟基己酸，菌株可应用于PCL材质的塑料制品的生物降解。

附图说明

图1为菌株的帚状枝及分生孢子

图2应用菌株对PCL降解产物的质谱分析图

本发明的可降解PCL微生物是属于青霉属(Penicillium.)的菌种，青霉(Penicillium.sp)YD0401-Ae，已于2008年1月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京朝阳区大屯路)保藏，保藏号为CGMCC No.2344。

具体实施方式

筛选和培养PCL降解菌株的液体培养基组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.194％，pH 6.8。固体培养基组分还需添加2％的琼脂。

菌株的菌落培养初期颜色为灰白色，渐变灰绿色，最后为墨绿色，且中间夹有橙色(或黄色)。其气生菌丝为絮状，营养菌丝为无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗顶端有不对称帚状分枝，帚状枝结构由简单到复杂，作两次对称二轮或不对称(三次)分枝。分生孢子为椭圆形。具体分生孢子梗的帚状分枝和分生孢子形态见图1。

将从化工厂污水处理车间采集活性污泥放入上述分离液体培养基中，置恒温摇床(28℃，110r/min)中振荡培养，直至浑浊的培养液变得澄清为止。取一定量的培养液，采用平板稀释涂布法进行分离。选菌落周围有明显透明圈的菌落进一步纯化。

将选择到的具有降解PCL能力的菌株接种到固体斜面培养基上，28℃培养6天至出现大量分生孢子。

以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，28℃振荡15min，使分生孢子分散。显微镜检查，使孢子浓度为10⁶~10⁷个/ml。

灭菌平皿中装有5ml分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯(30W，照射距离10cm)照射，照射时间为20~80s，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释。

取上述悬液0.1ml涂布于固体平板培养基上，避光培养3天，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小。初步筛选合适菌株。

根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入固体斜面培养基，待长满后接入液体培养基中，28℃摇瓶培养120h，检测发酵液中PCL解聚酶的活力。

PCL解聚酶酶活的测定(比浊法)

将PCL粉末溶于氯仿中，所得溶液与十二烷基磺酸钠溶液混合，混合液经超声波处理5min，制得PCL乳化液，75℃加热90min除去氯仿，得到PCL乳化液。

以PCL悬浮液为底物用分光光度法测定PCL解聚酶的活力，取3ml PCL乳化液置于40℃的恒温水浴中，待平衡后加入粗酶液1ml，反应30min后，于650nm波长下测其吸光值。1个酶活单位定义为每分钟引起光吸收率降低0.001(A650nm)单位所需的酶量。

Claims

1、一种聚己内酯降解菌株的选育方法，其特征是将采集的活性污泥放入组分为PCL0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O1.194％，pH 6.8分离液体培养基中，置恒温摇床中振荡培养，直至浑浊的培养液变得澄清为止，取一定量的培养液，采用平板稀释涂布法进行分离，选菌落周围有明显透明圈的菌落进一步纯化；

将选择到的具有降解聚己内酯能力的菌株接种到固体斜面培养基上，该固体斜面培养基组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.194％，琼脂2％，pH 6.8，培养至出现大量分生孢子；

以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使分生孢子分散，显微镜检查，使孢子浓度为10⁶~10⁷个/ml；

灭菌平皿中装有分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯照射，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释；

取上述悬液涂布于固体平板培养基上，避光培养，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选水解透明圈较大的菌株；

根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入同上固体斜面培养基，待长满后接入同上液体培养基中，摇瓶培养，通过检测发酵液中PCL解聚酶的活力进一步筛选。

2、按照权利要求1所述的一种聚己内酯降解菌株的选育方法，其特征是将采集的活性污泥放入组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O 1.194％，pH 6.8的分离液体培养基中，置恒温摇床中振荡培养，直至浑浊的培养液变得澄清为止，取一定量的培养液，采用平板稀释涂布法进行分离，选菌落周围有明显透明圈的菌落进一步纯化；

将选择到的具有降解PCL能力的菌株接种到固体斜面培养基上，固体斜面培养基组分为PCL 0.15％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NH₄Cl₂ 0.1％，CaCl₂·2H₂O 0.0005％，KH₂PO₄ 0.554％，Na₂HPO₄·12H₂O1.194％，pH 6.8，另添加2％的琼脂，28℃培养6天至出现大量分生孢子；

以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，28℃振荡15min，使分生孢子分散，显微镜检查，使孢子浓度为10⁶~10⁷个/ml；

灭菌平皿中装有5ml分生孢子悬液，在磁力搅拌下用30W紫外灯，照射距离10cm照射，照射时间为20~80s，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释；

取上述悬液0.1ml涂布于固体平板培养基上，避光培养3天，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选合适菌株；

根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入同上固体斜面培养基，待长满后接入同上液体培养基中，28℃摇瓶培养120h。

3、按权利要求1、2所述的选育方法选育的聚己内酯降解菌株，该菌株为青霉(Penicillium.sp)YD0401-Ae，已于2008年1月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No.2344。