JP5984195B2 - 菌類を用いた植物バイオマスからのバイオガスの製造装置および方法 - Google Patents
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Description
しかし、比較的利用がまだ緒についていない植物バイオマス資源、たとえば、間伐材、建築廃材、稲藁などのセルロース系やリグノセルロース系バイオマス資源は、燃焼させることによる熱源として利用はされている例があるが、セルロース系やリグノセルロース系植物バイオマス資源からバイオエタノールを生成してバイオ燃料を得ることは比較的困難とされている。
第1の工程として、固相のまま、木質に対して物理的・化学的方法で脱リグニン処理を施し、処理しやすいセルロースを得る。第2の工程として、セルロースに対して強酸を加えて加水分解し、グルコースを得る。強酸を添加した加水分解であるのでこの段階で処理状態は液相となる。第3の工程として、液相のグルコースを基材として酵母菌を播種してアルコール発酵させてアルコール含有発酵液を得る。この状態も液相のままである。
第1の工程として、固相のまま、木質に対して物理的・化学的方法で脱リグニン処理を施し、処理しやすいセルロースを得る。第2の工程として、セルロースに対して物理的・化学的処理を加えてより分解が進んだセルロース(β−1,4−グルカン)とする。例えば、オゾン水を作用させる手法、超臨界水を作用させる手法、爆砕する手法など多様なものがあり得る。この段階で液相になる。第3の工程として、処理済みのセルロース(β−1,4−グルカン)を基材として、酵素の一種であるセルラーゼを用いてグルコースを得る。セルラーゼは、セルロース(β−1,4−グルカン)のグリコシド結合を加水分解する酵素であり、グルコースを得ることができる。この段階も液相のままである。第4の工程として、液相のグルコースを基材として酵母菌を播種してアルコール発酵させてアルコール含有発酵液を得る。この状態も液相のままである。
従来の酸加水分解法は、第1の工程として、木質に対して物理的・化学的方法で脱リグニン処理を施す必要があるが、この脱リグニン処理は容易ではなくコストがかかり、また、物理的・化学的処理にエネルギーを必要とするものである。
また、従来の酸加水分解法は、第2の工程として、セルロースに対して強酸を加えて加水分解する必要があるが、この強酸添加による加水分解は、コストがかかり、また、物理的・化学的処理にエネルギーを必要とするものであり、反応後の強酸を処理するための物理的・化学的コストがかかっていた。また、セルロースの分解速度の制御が難しいという問題がある。また、グルコースが強酸で分解されてしまうおそれもある。
また、従来の酸加水分解法は、第3の工程として、液相のグルコースを基材として酵母菌を播種してアルコール発酵させる必要があるが、第1の工程の脱リグニン処理や第2の工程の強酸による加水分解処理において液相中の酵母菌に対して悪影響を与える物質が混在しているため、そのままではアルコール発酵が阻害されるためにグルコースを洗浄する必要があり、コスト向上、エネルギー消費増加を招いていた。
従来の酵素糖化法は、第1の工程として、木質に対して物理的・化学的方法で脱リグニン処理を施す必要があるが、上記に指摘したように、この脱リグニン処理は容易ではなくコストがかかり、また、物理的・化学的処理にエネルギーを必要とするものである。
従来の酵素糖化法は、第2の工程として、セルロースに対して物理的・化学的処理を加えてより分解が進んだセルロースとする必要があるが、オゾン水を作用させる手法、超臨界水を作用させる手法、爆砕する手法などいずれの手段も物理的・化学的コストがかかるものであり、反応釜や処理装置も特殊なものとなり製造設備にもコストがかかっていた。
また、従来の酵素糖化法は、第4の工程として、液相のグルコースを基材として酵母菌を播種してアルコール発酵させる必要があるが、上記したように、第1の工程の脱リグニン処理や第2の工程の強酸による加水分解処理において生じるアルコール発酵が阻害物質の除去のためコスト向上、エネルギー消費増加を招いていた。
Phlebia属に属する担子菌を用いて木質から直接バイオエタノールを得る方法は、従来の酸加水分解法や酵素糖化法には必須の手順であった物理的・化学的処理を伴わないため、その点は注目すべき技術ではある。
しかし、Phlebia属に属する担子菌を用いて木質から直接バイオエタノールを得る方法は、担子菌がバイオエタノールを生産する相が液相であることである。エタノールは親水性が大きく、一度液相になってしまえば、物理的な蒸留工程を経なければエタノールを単離することができない。その蒸留工程のためコスト増、エネルギー増を招いていた。
この液相のバイオエタノールからエタノールを単離する問題は、上記した酸加水分解法や酵素糖化法にも共通の問題点となっている。
キノコは相性の良い樹木に寄生して発生するが、一般には、竹林、スギ林、ヒノキ林にはごく一部のキノコしか育たないとされている。近年、経済林への竹の侵入が問題となっているが、竹は担子菌との相性は良くないとされている。
このように、Phlebia属に属する担子菌を用いる植物バイオマスを原料とするバイオエタノール生産方法は、利用出来る植物バイオマスの種類が限定されるおそれがある。
また、本発明は、植物バイオマスからバイオガスを発生させて固相から気相にて回収することを目的とし、従来の酸加水分解法や酵素糖化法や担子菌を用いる方法などのように液相での回収とはせず、液相からのエタノールや酢酸エチルの回収コストを不要とする。
また、本発明は、利用出来る植物バイオマスの種類が多様であり、一般樹木、稲藁、さらには竹も原料として利用可能な植物バイオマスとし、バイオガスを生産することを目的とする。
Wickerhamomyces属に属する不完全菌は、糸状菌担子菌様生活環と、酵母様生活環の異なった生活環を遷移するものである。本発明はこのWickerhamomyces属に属する不完全菌の性質に着目した。つまり、バイオガス生成工程は、炭素源がセルロースリッチかつグルコース欠乏で、嫌気的環境下におくことでWickerhamomyces属に属する不完全菌の糸状菌担子菌様生活環を活性化させてグルコースの生成を促す反応と、その後、炭素源がグルコースリッチで、嫌気条件下におくことでWickerhamomyces属に属する不完全菌の酵母様生活環を活性化させてアルコール類とエステル類の生成を促す反応を含むものとした。
Wickerhamomyces属に属する不完全菌を用いた「固相発酵条件」とは、炭素源を粉体または破砕体の固相状態とすること、嫌気条件を保つこと、乳酸菌を除去またはその活性化を阻害することを条件とするものである。
前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌を用いた固相発酵技術を実現できたことにより、様々な技術的効果が得られる。
例えば、エタノールはバイオエタノール燃料として既に注目されており、また、酢酸エチルガスも工業用の各種原料としての需要が大きいものである。
固相発酵であるので、炭素源を粉体または破砕体の固相とし、バイオガス発生工程が固相状態の炭素源から気相状態にてバイオガスを発生させるものであり、液相を介することなく炭素源から直接、バイオガスを発生させることが可能となる。固相発酵であるので、バイオガス生成過程で生じるアルコール成分による発酵サイクルへ与える悪影響を排除でき、また、バイオガスがアルコール成分とエステル成分などが混気状態で生産されても冷却トラップ等の凝集装置の温度設定により簡単に目的とする成分ごとに選択濃縮できる。
なお、以下の実施例は一例であり、本発明の内容は実施例の具体的内容には限定されない。
本発明は、Wickerhamomyces属に属する不完全菌の活性を制御し、糸状菌担子菌様生活環と、酵母様生活環の異なった生活環の遷移を制御し、炭素源を原料として固相発酵を可能とし、アルコール類やエステル類を含むバイオガスを生成させるものである。
本発明に用いるWickerhamomyces属に属する不完全菌は、糸状菌担子菌様生活環と酵母様生活環の異なった生活環を遷移することにより、以下の固相発酵サイクルが可能である。
図1に示すように、炭素源の発酵・分解進度において、糸状菌様、担子菌様生活環はセルロースリッチな状態で発現しやすく、セルロース→グルコース→アルコール類への進度を進め、酵母様生活環はグルコースリッチな状態で発現しやすくグルコース→アルコール類→エステル類への進度を進めてゆく。このように、炭素源の発酵・分解進度が進むとWickerhamomyces属に属する不完全菌は、糸状菌様、担子菌様生活環から酵母様生活環に遷移してゆく。
菌の分析は、微生物同定試験を受託している株式会社テクノスルガ・ラボに実証実験に用いる菌を持ち込んで微生物同定試験を依頼した。具体的な同定方法は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(Denaturing gradient gel electrophoresis:DGGE)法を用いて微生物群集構造解析を行った。DGGE法は、同じ長さの二本鎖DNA断片を塩基配列の違いに基づいて分離する電気泳動法である。切り出したバンドからDNAを抽出し、これを鋳型としてPCR増幅した産物を用いて再度DGGEを行うことによりバンドの純度確認を行いつつDNA型の解析をした。DGGE解析によって得られた7バンドの28SrDNA部分塩基配列および1バンドの16SrDNA部分塩基配列を決定し、それら結果により簡易系統解析を行い、各バンドに由来する細菌群の帰属分類群を決定した。
(Applied Biosystems, CA, USA)
使用プライマー:DGGE band sequencing kit for analysis of the bacterial v3 region
(DS-0001)(TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd, Shizuoka)
Lac1, Lac3, Lac2 (Lactobacillales 目増幅用) Lac1, Lac 3は等量混合使用
シーケンス:ABI 3130xl Genetic Analyzer System (Applied Biosystems, CA, USA)
配列決定 :ChromasPro 1.4 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, AUS)
相同性検索及び簡易分子系統解析:ソフトウェアアポロン3.0(テクノスルガ・ラボ、静岡)
データベース:国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)
アポロンDB−BA10.0(テクノスルガ・ラボ静岡)
アポロンDB−FU(D1/D2)8.0(テクノスルガ・ラボ静岡)
以下、本発明のバイオガス製造方法で用いるWickerhamomyces属に属する不完全菌として、実証実験に用いた菌に関する同定結果を示す。
試験サンプルは、試験区分1と試験区分2の2つを用意してダブルチェックした。
試験1 塩基配列と上位15株との相同率
アポロンDB−FU(D1/D2)8.0検索結果
GenBank/DDBJ/EMBL国際塩基配列データベース検索結果
試験1 塩基配列と上位15株との相同率
アポロンDB−FU(D1/D2)8.0検索結果
GenBank/DDBJ/EMBL国際塩基配列データベース検索結果
また、[表2]及び[表4]のGenBank/DDBJ/EMBL国際塩基配列データベース検索の結果において、Wickerhamomyces anomalusなどの28SrDNAに対して高い相同性が示された。
それらを総合して判断すると、バンド由来の塩基配列はWickerhamomyces属の28SrDNAのクラスターに含まれると結論付けられた。
その結果、実証実験に用いられた菌は、Wickerhamomyces属に属する不完全菌であると結論付けられた。
本発明者は、この同定された当該Wickerhamomyces属に属する不完全菌の株と同じ株の菌を用いて実証実験に使用した。
本発明で利用するWickerhamomyces属に属する不完全菌は、糸状菌担子菌様生活環と、酵母様生活環の異なった生活環を遷移することができるため、特に、炭素源は限定されない。
例えば、植物バイオマス資材は、樹木系バイオマス資材であってもよいし、草系バイオマス資材であってもよい。樹木系バイオマス資材としては針葉樹、広葉樹、裸子植物等の樹木に由来する木材(建築廃材、間伐材等を含む)、またはそれらの樹皮、おがくず、葉、きのこ廃菌床等が挙げられる。草系バイオマス資材としては稲、麦、トウモロコシ、サトウキビ、竹、ススキ等に由来する資材、例えば農産物の収穫や加工処理の際に生じる残渣等が挙げられる。
本発明では固相のまま直接炭素源を材料とし、気相のバイオガスを発生するものであるので、従来のセルロース系の炭素源の利用に必要とされていた物理的処理や化学的処理は不要である。
以下の実証実験では、比較的バイオマス利用が難しいとされている竹粉を用いて行った。
本発明のバイオガス製造装置および製造方法の実証は、以下の固相発酵工程、固相発酵条件で行った。
・固相発酵工程:竹粉を固相のままとし、Wickerhamomyces属に属する不完全菌を播種
・発酵条件:常温、嫌気的条件に維持
なお、本来の固相発酵条件としては、炭素源を粉体または破砕体の固相状態とすることおよび嫌気的条件とすることに加え、炭素源に既に混入している自然界の乳酸菌の活性化を阻害することが条件として入るが、後述するように、十分に嫌気性が保たれていれば、乳酸菌は好気性菌であるので活性化が阻害されるよう配慮して実験を行えば、上記発酵条件にて固相発酵条件が満たされる。
このことを確認する意図も込めて、比較実験として、好気的条件にて培養した結果も示す。ここで、好気的条件とは、具体的には、Wickerhamomyces属に属する不完全菌を播種した培地を、外気と実質的に通気させる状態で培養することを指す。
図2は、バイオガス生成実験で用いた器具構成の概略と、実際の器具の重要部分の様子を写真で示した図である。図2に示すように、器具構成としては、固相発酵用フラスコ、気体排出用のガラス管、クールトラップ器具、窒素回収用のガラス管、窒素ボンベという器具構成を組み上げた。
固相発酵用フラスコは、炭素源となる発酵竹粉を封入し、70℃で1週間窒素乾留し、Wickerhamomyces属に属する不完全菌を播種したものである。
クールトラップ器具は、ガストラップ瓶にガラス玉を入れて配管したものを、予め−20℃で予冷しておく。
窒素ボンベからは毎分2mlにて窒素ガスを供給する。
図3は、本発明にかかるバイオガス製造装置100の構成を簡単に示したものである。バイオガスの製造装置100は、バイオガス生成部110、ガス排出路120、バイオガス回収部130、窒素回収路140、窒素供給部150、窒素供給路160を備えたものとなっている。
バイオガス生成部110が、実験の器具構成では固相発酵用フラスコとなっている。ガス排出路120が、実験の器具構成では気体排出用のガラス管になっている。また、バイオガス回収部130が、実験の器具構成ではクールトラップ器具になっている。窒素回収路140が窒素回収用のガラス管、窒素供給部150が窒素ボンベとなっている。このように図2の実験の器具構成は、図3に示した本発明にかかるバイオガス製造装置100を模擬したものとなっている。
図2に示す実験の器具構成により、所定の60日間連続して発酵実験を行った。
図4に、実証実験におけるバイオガスの回収結果を示す。
図4は、培養を始めて3日目あたりで放出されているバイオガスのGC−MSの測定結果である。
ガスの種類の特定は、GC−MS(Gas Chromatography Mass Spectrometry:ガスクロマトグラフィー質量分析法)により行った。
図4の中で、明瞭に検出されている2.53分のピークはメタノール、2.92分のピークはエタノールである。これらは、バイオガス生成部110を模擬した固相発酵用フラスコ内で発生したバイオガスと考えられる。なお、その他のものはバイオガスではないとみられる。例えば、2分付近の大きなピークと8.5分のピークは、トラップ液の溶媒に使用したアセトン由来ピークと考えられる。18.04分の2つのピークはプラスチックの可塑剤のピークでコンタミネーションした物質由来と推測される。その他の小さなピークの多くは再現性の無いノイズと考えられる。
図6は、培養日数を通じて観察した発生するバイオガスの種類の時系列変化を示す図である。培養日数を横軸にとり、縦軸にバイオガス生成濃度(mg/l)を取ったものである。
図6に示すように、培養日数が浅いうちは、メタノールやエタノールのアルコール類の発生が盛んに見られ、アルコール濃度が高くなっているが、培養日数が経過してゆくにつれ、エステル濃度が上がって来たことが分かる。つまり、培養によって先にアルコール濃度が向上してゆき、遅れるようにエステル濃度が次第に向上していることが読み取れる。つまり最初にエタノール発酵が進み、その後に続いてエステル発酵が起こっていることが分かる。
なお、気中に放出されたバイオガス成分をGC−MSで調べたところ、気中に放出されたアルコール類の主成分はエタノールであり、エステル類は酢酸エチルであることが分かった。
上記の実証実験の結果を考察する。
バイオガス発生工程は、固相状態の炭素源から気相状態にてバイオガスが発生し、液相を介することなく炭素源から直接、バイオガスを発生させる固相発酵であることが確認できたことから、本発明のバイオガス製造方法は、Wickerhamomyces属に属する不完全菌は繁殖する過程における固相発酵サイクルでアルコール類や揮発性有機酸やそれらのエステル類が製造されたものと考えられる。
第1の反応が、固相発酵サイクルの当初に起こる反応であり、炭素源が竹粉などセルロースリッチかつグルコース欠乏の状態であり、嫌気条件下におくことでWickerhamomyces属に属する不完全菌の『糸状菌担子菌様生活環』を活性化させてグルコースの生成が促がされる。
このグルコースの生成にあたり、まず『糸状菌担子菌様生活環』にあるWickerhamomyces属に属する不完全菌は、セルロースからリグニンを分解する脱リグニン反応が起こると考えられる。このことは、実証実験において、リグニンの減少を測定することにより検証できる。
次に、脱リグニン反応に続いて、『糸状菌担子菌様生活環』にあるWickerhamomyces属に属する不完全菌は、セルロースをグルコースに分解するグルコース分解反応を起こすものと考えられる。
次に、固相発酵条件について検証してみた。
固相発酵条件は、前掲したとおり、炭素源を粉体または破砕体の固相状態とすること、嫌気条件を保つこと、乳酸菌を除去またはその活性化を阻害することを条件とするものである。
ここで、嫌気性に関しては、窒素を充満させた嫌気的条件の試験区分と、空気を通気する嫌気的条件の試験区分を用意して両者の発酵結果を比較することにより嫌気的条件を評価できる。次に、乳酸菌の除去または活性阻害に関しては、試験区分に播種する菌をWickerhamomyces属に属する不完全菌のみとした試験区分と、Wickerhamomyces属に属する不完全菌と乳酸菌の両方を播種した試験区分を用意し、両者の発酵結果を比較することにより、乳酸菌の除去または活性阻害という条件を評価できる。
以下の4つの試験区分を用意した。
試験区分1 嫌気条件 播種菌 Wickerhamomyces属に属する不完全菌のみ
試験区分2 好気条件 播種菌 Wickerhamomyces属に属する不完全菌のみ
試験区分3 嫌気条件 播種菌 Wickerhamomyces属に属する不完全菌+乳酸菌
試験区分4 好気条件 播種菌 Wickerhamomyces属に属する不完全菌+乳酸菌
実験器具構成は、図2に示した実験構成と同様の実験器具構成として実験を行った。
なお、嫌気条件は、図2に示した実験器具構成で窒素ガスのみを供給する構成とし、好気条件は、図2に示した実験器具構成で空気ボンベから空気を供給する構成とした。
実験は同じく、公設の試験研究機関である兵庫県立工業技術センターに委託されて行われた。
図7は、固相発酵条件の検証実験の結果を示す図である。縦軸は、クールトラップにて捕捉されたメタノールやエタノールなどのアルコール類の生成量である。クールトラップ装置に流入した5mlあたりの補足量を測定した。つまりアルコール発生が活発であるほどバイオガス中に含有されるアルコール量が多くなるため、5mlあたりの多寡をもって評価した。横軸は培養時間(日数)である。
試験区分1は、上記した本発明のバイオガス製造方法における固相発酵条件を満たすものであるため、この試験区分1のバイオガス生成量がもっとも高いことが確認できた。
そこで、本発明では乳酸菌の繁殖を抑えるため嫌気的状態に保つことにより人為的にWickerhamomyces属に属する不完全菌が優位に立つようコントロールする。この乳酸菌の活性をコントロールすることにより、自然界では乳酸菌よりも劣位のWickerhamomyces属に属する不完全菌を十分に活性化し、糸状菌担子菌様生活環と酵母様生活環との間を遷移させながら、グルコースの生成反応と、アルコール類・エステル類の生成反応を十分に発揮させるものである。
Claims (3)
- Wickerhamomyces属に属する不完全菌を炭素源とともに培養することによりバイオガスを生成するバイオガス生成工程を含むバイオガスの製造方法であって、
前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌が、糸状菌担子菌様生活環と、酵母様生活環の異なった生活環を遷移するものであり、
前記バイオガス生成工程が、
前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌を前記糸状菌担子菌様生活環の状態として常温嫌気条件下で粉体または破砕体である固相の前記炭素源に播種し、前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌の糸状菌担子菌様生活環にてグルコースの生成を促す第1の工程と、
第1の工程によりグルコースリッチとなった前記固相の前記炭素源とともに、常温嫌気条件下で前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌の生活環を酵母様生活環に遷移させてメタノール、エタノールおよびそれらのエステルの生成を促す第2の工程を含む工程であり、
前記第1の工程および前記第2の工程において、前記Wickerhamomyces属に属する不完全菌の前記糸状菌担子菌様生活環と前記酵母様生活環を遷移させつつ、液相を介することなく前記炭素源から直接、気相状態の前記バイオガスを発生させる工程としたものである、バイオガスの製造方法。 - 前記バイオガス生成工程が、前記炭素源とともに嫌気的条件において培養することにより前記炭素源に混入していた乳酸菌の活性化を阻害するよう制御することを含むものである請求項1に記載のバイオガスの製造方法。
- 前記炭素源が、植物バイオマス資材である請求項1または2に記載のバイオガスの製造方法。
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