JP6511268B2 - 動物用飼料組成物の材料 - Google Patents
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Description
(a)混合物を得るためにバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌を組み合わせることと、
(b)前記デイノコッカス細菌又はその関連細菌によってバイオマスが消化され得る条件下で混合物を保持することと、
(c)(a)又は(b)の混合物を回収することと、
(d)任意に(c)の混合物と1つ又は複数の更なる材料とを混合することとを含む。
本発明に係る「バイオマス」の用語は、通常、生物材料を意味する。特に、バイオマスの用語は、植物、藻類又は動物由来を含む生物由来の有機材料を含み、それらは未処理又は前処理され得る。バイオマスの例は、以下のものに限られないが、用材又は紙製品に適さない成木、パルプ、再生紙、有機廃棄物含む林産物、草、わら、作物及び動物糞尿等の農業製品、並びに藻類及び海藻等の水産製品を含む。バイオマスの例は、ススキ、麻、スイッチグラス、テンサイ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、米、大豆、ナタネ(カノーラを含む)、モロコシ、サトウキビ、ラッカセイ、綿、ハウチワマメ、並びにユーカリからアブラヤシ、ポプラ、ヤナギに至る種々の樹木種の多くのタイプの植物由来の木材又は植物性材料を含む。具体的なバイオマス原料は、以下のものに限られないが、植物残渣、広葉樹又は針葉樹の幹、穂軸、わら、草、葉、種、紙等を含む(例えば、Sun et al.,Bioresource Technology 83 (2002) 1-11を参照)。バイオマスの用語は、変換されたバイオマス又は二次バイオマスを含み、それらは本質的に加水分解された前処理済みバイオマス製品を含む。好ましい実施形態において、本発明に係るバイオマスは、例えばセルロース、ヘミセルロース及び/又はキシランといったリグノセルロース系材料を含む。
本発明は、特に、飼料に適する高栄養価で高消化率製品を生成するために協力するバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌との組み合わせに基づく。本発明は、バイオマスが細菌の増殖及び拡大、混合物の栄養価の増大を支持する一方で、細菌がバイオマスを消化でき、混合物の栄養価、消化率及び嗜好性をさらに増大することを示す。
デイノコッカス細菌又はその関連細菌によるバイオマスの消化は、容易に反応パラメータを管理するために、反応器内で有利に行われ得る。反応は用いられる細菌の菌株及び/又はバイオマスに依存し、反応は好気性又は嫌気性反応器内で行われ得る。
(a)混合物を得るためにバイオマスとデイノコッカス細菌又はその関連細菌を組み合わせることと、
(b)前記デイノコッカス細菌又はその関連細菌によってバイオマスが消化され得る条件下で混合物を保持することと、
(c)(a)又は(b)の混合物を回収することと、
(d)任意に(c)の混合物と1つ又は複数の更なる材料とを混合することとを含む。
本実施例は、属、種及び/又は細菌株が本発明に係る飼料の調製方法において機能できるか否かを決定するのに適する試験を開示する。特定の酵素活性を示す細菌を同定するために行われ得る試験の非限定的な例は、以下に示される。
複合培地グルコース(CMG)1%の組成
ペプトン:2g/L
酵母エキス:5g/L
121℃で15分のオートクレーブ
グルコース:10g/L−濾過滅菌(0.22μm)
さらに、MOPS、微量栄養素、ビタミン、FeCl3、K2HPO4を加える(以下を参照)。
14g/Lのアガーに704mlの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
14g/Lのアガーに704mlの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。さらに、含量が5%となるようにAZO−セルロース溶液を加える。
10g/Lのミルクパウダー及び14g/Lのアガーに704mlの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
5g/Lのデンプン及び14g/Lのアガーに704mlの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000×を加える。
14g/Lのアガーに704mlの超純水を加える。それをオートクレーブにかける。その後、培地を冷却し、80 mlのMOPS 10×、 8 mlのFeCl3 100×、8 mlのK2HPO4100×、80μL の微量栄養素10000×及び80μLのビタミン 10000Xを加える。さらに、含量が5%となるようにAZO−キシラン溶液を加える。
酸性MOPS 400mM
NH4Cl 200mM
NaOH 100mM
KOH 100mM
CaCl2 5μM
Na2SO4 2.76mM
MgCl2 5.28mM
濾過滅菌(0.22μm)。
(NH4)6(Mo7)O24 30μM
H3BO3 4mM
CoCl2 300μM
CuSO4 100μM
MnCl2 2.5mM
ZnSO4 100μM
HClによりpHを5に調整
濾過滅菌(0.22μm)。
D−ビオチン、ナイアシン(ニコチン酸)、ピリドキシン(ピリドキサル塩酸塩)B6,チアミン(ビタミンB1塩酸塩)をそれぞれ10mg/L−pH4で保管−濾過滅菌(0.22μm)。
2mMクエン酸ナトリウムに含有された2mM FeCl3、濾過滅菌(0.22μm)。
100g/Lであり、オートクレーブされる。
セルロース分解活性の検出
固相スクリーニング(アガープレートによる試験)
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液をMM及び5%AZO−セルロースを含むアガープレート上に滴下した。セルロース分解活性は、1日後、2日後及び5日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した(1日毎に1つのプレートを用いた)。
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液を、200μlのMM+1%のCMC又は1%のCMC4M又は1%のセロビオースを含むマイクロプレートに加えた。セルロース分解酵素活性を、OD600nmでの増殖の判定により評価した(1日に2回の測定を5日間行った)。
固相スクリーニング(アガープレートによる試験)
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液をMM及び1%ミルクを含むアガープレート上に滴下した。タンパク質分解活性は、1日後、2日後及び5日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した(1日毎に1つのプレートを用いた)。
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液を、200μlのMM+1%のペプトン又は1%のカゼインを含むマイクロプレートに加えた。タンパク質分解酵素活性を、OD600nmでの増殖の判定により評価した(1日に2回の測定を5日間行った)。
固相スクリーニング(アガープレートによる試験)
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液をMM及び0.5%デンプンを含むアガープレート上に滴下した。アミロース分解活性は、1日後、2日後及び5日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した(1日毎に1つのプレートを用いた)。デンプン含有アガープレート上で、加水分解ハローの顕色をグラムヨウ素試薬により行った(1日毎に1つのプレートを用いた)。
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液を、200μlのMM+0.5%のデンプンを含むマイクロプレートに加えた。アミロース分解酵素活性を、OD600nmでの増殖の判定により評価した(1日に2回の測定を5日間行った)。
固相スクリーニング(アガープレートによる試験)
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液をMM及び5%AZO−キシランを含むアガープレート上に滴下した。キシラン分解活性は、1日後、2日後及び5日後に加水分解ハローの径を測定することで判定した(1日毎に1つのプレートを用いた)。
単離されたクローンを、CMG1%培地を含むマイクロプレート内で前培養した(200μLのCMG1%培地に5つのコロニー)。定常期から、5μLの前培養液を、200μlのMM+0.5%のキシランを含むマイクロプレートに加えた。キシラン分解酵素活性を、OD600nmでの増殖の判定により評価した(1日に2回の測定を5日間行った)。
下記表1は、固相スクリーニング試験で同定され、飼料の製造に用いるためのバイオマス消化活性を有する細菌の例を示す。加水分解ハローの径は、タンパク質分解活性及びアミロース分解活性については2日後、また、キシラン分解活性及びセルロース分解活性については5日後に測定されたもので評価した。より正確には、タンパク質分解活性について、加水分解ハローの径が2.4cmを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が2cm〜2.35cmのものを中活性、加水分解ハローの径が1.95cm未満のものを低活性とした。アミロース分解活性について、加水分解ハローの径が2.4cmを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が2.1cm〜2.35cmのものを中活性、加水分解ハローの径が1.9cm未満のものを低活性とした。キシラン分解活性について、加水分解ハローの径が2.8cmを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が2.1cm〜2.7cmのものを中活性、加水分解ハローの径が2.05cm未満のものを低活性とした。セルロース分解活性について、加水分解ハローの径が1.6cmを超えるものを高活性、加水分解ハローの径が1.1cm〜1.35cmのものを中活性、加水分解ハローの径が0.9cm未満のものを低活性とした。
ナタネわらとデイノコッカス細菌との混合物を調製した。特に、1%の前処理ナタネわらをデイノコッカス細菌(例えばDG01菌株)に接触させた。飼料に利用できる混合物を生成するための混合物の能力は、増殖して、単独で又は後の酵素添加でナタネわらを消化し、多量の栄養物を生成するデイノコッカス細菌の能力を検査することにより決定した。
ナタネわら
ナタネわらはSofiproteolから得て、それをブレンダーで挽いて、その後、1mm未満の長さの微細な断片を得るためにふるいに通した。
用いた市販の酵素は、トリコデルマリーゼイ(Trichodermareesei)からのセルラーゼ(SIGMA ref.C8546-5KU)、及びアーモンドからのβ−グルコシダーゼ(SIGMAref.49290-1G)である。
前処理を、20%w/vのナタネわら及び0.5%w/wのH2SO4を含む水道水を用いてエルレンフラスコ内で行った。この混合液に対して120℃で10分間のオートクレーブ(サイクル時間:1.5時間)をし、最終ナタネわら濃縮物を得るために滅菌水道水で希釈した。20MNaOH溶液を用いてpHを7に調整した(pH試験紙を用いて確認した)。播種前に、20mM NH4Cl及び5.7mMK2HPO4のミネラル溶液を加えた。
−2mlエッペンドルフチューブに1mLの均質な培養液(CMG、技術的基質(technicalsubstrate))をとる。
−10秒間のボルテックスの後、超音波処理器で10分間の超音波処理をし、再度10秒間のボルテックスを行う。
−96ウェルマイクロプレートにおいて、180μLのミリQ水をトリプリケートで9ウェルに分注する。
−トリプリケートで、ウェルNo.1(純粋なサンプル)からウェルNo.10(10−9希釈)まで1/10段階希釈を行う。それは、20μLをとり、180μLの滅菌ミリQ水が入った次のウェルに入れ、混合し、3度ピペッティングを行う。各ウェルの間でチップを変える。
−マルチチャンネルピペットを用いて、5μLの各希釈液をデュプリケートでPGY−アガープレートに滴下する。
−45℃で2日間インキュベートする(好熱性デイノコッカスの場合)。
−カウントできる最初の希釈液においてコロニーの数をカウントする。希釈係数により構成された6つのスポットを平均し、CFU/mLの数値を得るために200を掛ける。
−TLCシリカゲルに5μlのサンプルを滴下する。
−ホットエアガンを用いて滴下したサンプルを乾燥する。
−ブタノール/アセトン/H2O=4/5/1である溶媒でTLCの移動を行う。
−移動の終了時に、ホットエアガンを用いてTLCを乾燥する。
−12gのモリブデン酸アンモニウム+0.5gの硝酸アンモニウムセリウムを含む80mLの10%H2SO4溶液を用いてTLCを検出する。
DG01において、酵素を、ポリマーを単糖に加水分解するために培養培地に加えた。ナタネわらは40%セルロースを含む。酵素の添加は、1gのセルロースに対して0.11gのセルラーゼ、1gのセルロースに対して0.05gのβ−グルコシダーゼを用いた。酵素溶液は、培養液に導入する前に0.22μmのフィルタで濾過した。前培養は、CMG1%で3日間行った。細胞ペレットを滅菌水で3度洗浄し、0.2のDOi、すなわち≒107CFU/mLで培養培地への播種に用いた。培養は9日間行い、DRH46では30℃で、DG01では45℃で行った。
DG01の増殖はカウントすることにより判定し(UFC/ml)(図1)、糖の消費はTLC分析を用いて評価した(図2)。9日後、全ての遊離グルコース及びキシロースは、野生型DG01により消費された。この消費が全糖において報告された、グルコース及びキシロースの大部分が消費されることが明らかとなった。これらの結果は、混合物が、低減されたキシロース量を含む部分的に消化されたバイオマスを含むことを示す。
デイノコッカス細菌とコムギバイオマスとの混合物を、全粒粉(1%でさらにTermamylを含む又は含まない、6%)、又はNH4Cl20 mM及びK2HPO45.7 mMが添加された発酵残渣(1%又は6%)からなる培地にDG01デイノコッカス菌株を播種することにより調製した。飼料に利用できる混合物を生成するための混合物の能力は、コムギにおいて増殖して、コムギのグルテン含量を低減するデイノコッカス細菌の能力を検査することにより決定した。
タンパク質消費は、Libiosからの市販のキット(Ref GLI-E02)を用いて測定される。
サンプル及び標準試薬をデュプリケートで試験する。
−100μlの標準試薬及びサンプルを抗グリアジン抗体でコーティングされた96ウェルマイクロプレートに加える。
−室温で20分間インキュベートする。
−ウェルを300μlの洗浄溶液1×で3度洗浄する。
−空のウェルに100μlの標識二次抗体(抗グリアジンペルオキシダーゼ)を加える。
−ウェルを300μlの洗浄溶液1×で3度洗浄する。
−100μlのTMB溶液(基質)を加える。
−暗所において室温で20分間インキュベートする。
−100μlの停止溶液を加える(色が青から黄色になる)。
−均質化し、分光光度計を用いてOD450nmを測定する。
グリアジンの濃度は、試験サンプルの色彩強度に直接に比例する。コムギにおけるグリアジンとグルテンとが等量であるため、サンプルのグルテン濃度は係数2を掛けることにより算出される。図3に示すように、デイノコッカス細菌は全粒粉又はその発酵残渣由来のグルテンを加水分解でき、45℃での2日間の増殖後にそれを消費できる。48時間後、植物性バイオマスに含まれる全てのタンパク質は、デイノコッカス菌株により消費される。
デイノコッカスジオサーマリス(M36−7D_21菌株)のアミノ酸成分は、単一の炭素源としてペプトン及びグルコースを含む培地で細胞を増殖した後に測定した。その成分を、一般に穀類のアミノ酸及び/又はビタミンの不足を補うために魚の飼料で補助タンパク質源として、及び/又は動物飼料で栄養補助剤として用いられる酵母のアミノ酸成分と比較した。
・複合培地グルコース(CMG)1%の組成
ペプトン 2g/L
酵母エキス 5g/L
グルコース 55mM(10g/L)
酸性MOPS 40mM
NH4Cl 20mM
NaOH 10mM
KOH 10mM
CaCl2・2H2O 0.5μM
Na2SO4・10H2O 0.276mM
MgCl2・6H2O 0.528mM
(NH4)6(Mo7)O24・4H2O 3nM
H3BO3 0.4μM
CoCl2・6H2O 30nM
CuSO4・5H2O 10nM
ZnSO4・7H2O 10nM
D−ビオチン 1μg/L
ナイアシン(ニコチン酸) 1μg/L
ピリドキシン(ピリドキサルHCl、ビタミンB6) 1μg/L
チアミンHCl(ビタミンB1)
FeCl3 20μM
クエン酸ナトリウム・2H2O 20μM
K2HPO4 5.7mM
MnCl2の最終濃度は5.25μMである。
下記表4は、デイノコッカスジオサーマリスのアミノ酸成分を酵母エキスのアミノ酸成分と比較する。量は、100gの乾物に対するgで示す。
カロテノイド生成可能な培養条件
デイノコッカスジオサーマリス菌株MX6−1Eを、1Lの培養装置において45℃、0.35L/minの空気導入の条件下で、20g/Lペプトン及び10g/L酵母エキスを含む1Lの培地で培養した。DOを空気導入及び攪拌速度に基づくカスケード制御により20%に制御した。20時間後、培養培地は濃い赤色を示し、その培養培地中におけるカロテノイドの存在を示す。この試験は、デイノコッカス細菌が多量のカロテノイドを産生し得ることを確認する。さらに、デイノコッカス細菌は、それが対数期の増殖期にあるときに、酵母エキスよりも多くのメチオニンを生成し、メチオニンは、動物の必須アミノ酸であり、魚の成長にも必要である。
デイノコッカスジオサーマリス菌株MX6−1E−14を、1Lの培養装置において45℃で、20g/Lグルコースを含む(実施例4で示すような)1LのCMG10%培地で培養した。
Claims (9)
- 飼料へのタンパク質補給剤としての、バイオマスと、デイノコッカス細菌との混合物の使用であって、
前記バイオマスは、前記デイノコッカスにより少なくとも部分的に消化されており、
前記飼料には、前記バイオマスとデイノコッカス細菌との混合物が含まれている使用。 - 前記バイオマスは、リグノセルロース系バイオマスを含む請求項1に記載の使用。
- 前記バイオマスは、タンパク質を含む請求項1又は2に記載の使用。
- バイオマスとデイノコッカス細菌との混合物を含む飼料組成物を調製する方法であって、
前記混合物を得るために、前記バイオマスを前記デイノコッカス細菌により少なくとも部分的に消化することと、
前記混合物を飼料の材料として調製することとを含む、飼料組成物を調製する方法。 - 前記バイオマスは、コムギの実等の穀類の実、ナタネ及び大豆のキャトルケーキ等の植物性キャトルケーキ、サトウキビ及びその誘導体、トウモロコシ、テンサイ、ススキ、スイッチグラス、麻、ポプラ、ヤナギ、モロコシ、並びにユーカリからアブラヤシの範囲の樹木種を含む群から選択されるリグノセルロース系バイオマスを含む請求項4に記載の方法。
- 前記バイオマスは、タンパク質を含み、ビートパルプ、大豆、アルファルファ及び家禽の羽から選択される請求項4に記載の方法。
- 動物飼料の成分として動物飼料に含有させるためのデイノコッカス細菌の使用。
- 動物飼料のためのアミノ酸源として動物飼料に含有させるためのデイノコッカス細菌の使用。
- 動物飼料のためのデイノコッカス細菌とバイオマスとの混合物の使用であって、
前記動物飼料にはデイノコッカス細菌とバイオマスとの混合物が含まれている使用。
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