MX2014007346A - Ingredientes para composiciones de pienso para animales. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a ingredientes para composiciones de pienso para animales destinadas a mejorar el crecimiento y/o la salud de los animales. La invención también se refiere a métodos para producir dichos ingredientes y composiciones de pienso. Los métodos de la invención permiten mejorar además la palatabilidad y/o la digestibilidad de las composiciones de pienso. Más concretamente, la invención describe el uso de una mezcla de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas y biomasa como suministro de componentes orgánicos en composiciones de pienso.

Description

INGREDIENTES PARA COMPOSICIONES DE PIENSO PARA ANIMALES Campo de la Invención La presente invención se refiere a ingredientes para composiciones de pienso para animales destinadas a mejorar el crecimiento y/o la salud de los animales. La invención también se refiere a métodos para producir dichos ingredientes y composiciones de pienso para animales. Los métodos de la invención permiten mejorar además la palatabilidad y/o la digestibilidad de las composiciones de pienso. Más concretamente, la invención describe el uso de una mezcla de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas y biomasa como suministro de componentes orgánicos en composiciones de pienso.

Antecedentes de la Invención La alimentación de los animales de cria tales como animales domésticos, ganado vacuno, ovino y porcino, aves de corral, peces, incluyendo peces comerciales y ornamentales, camarones y otros crustáceos, es un problema constante en el ámbito de la cria de animales y la industria agroalimentaria . Debido a las instalaciones de producción limitada y a la falta de mejoras en la tecnología de producción, la cría de animales además de resultar costosa, requiere mucho tiempo. Para mejorar la producción y la rentabilidad de la cría de animales, la solución más común es proporcionar composiciones de pienso industriales, al menos para completar la dieta de los animales.

Aunque los piensos no tienen una composición constante, se requieren varios componentes para cumplir con el objetivo nutricional. De hecho, incluso si la respuesta biológica a la alimentación depende de la capacidad del animal para obtener nutrientes útiles de dicha alimentación, los piensos usados en la alimentación comprenden generalmente proteínas digeribles, lípidos, carbohidratos y fibra.

Las composiciones de pienso para animales normalmente se formulan con formulaciones de bajo coste. Es de particular importancia el suministro limitado de energía digerible y el coste asociado. Los nutrientes más costosos son las proteínas y los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos esenciales. Sin embargo, sería necesaria la producción de animales que contuvieran una tasa significativa de proteínas en proporción con el aumento de la población mundial.

Debido a su bajo coste, se ha desarrollado el uso de la harina de pescado o harina de carne y huesos como materia prima proteica. De hecho, la harina de carne y huesos es un producto de la industria de extracción de grasas que comprende aproximadamente el 50 % de proteínas y 8-12 % de grasa. Se usa principalmente en la formulación de piensos para animales con el fin de mejorar el perfil de aminoácidos de los mismos. Sin embargo, se cree que el aporte de proteínas en forma de harina de huesos para el ganado ha sido responsable de la propagación de la enfermedad de las vacas locas. Por consiguiente, en casi todo el mundo, está prohibido el uso de la harina de huesos como aporte proteico en la alimentación de los rumiantes.

Otra materia prima usada para la preparación de composiciones de pienso para animales rumiantes es la materia celulósica, que es una materia barata que carece de valor directo. Sin embargo, aunque las enzimas de los rumiantes permiten la degradación de la celulosa, se realizan varios tratamientos previos para hidrolizar parcialmente la celulosa y la hemicelulosa con el fin de ayudar a la posterior degradación por parte de los animales rumiantes y mejorar la digestibilidad de esta materia prima. Por ejemplo, la adición de diversas enzimas exógenas, tales como celulasas y hemicelulasas , al pienso que comprende materia celulósica es útil para reducir la cristalinidad del polímero y aumentar el acceso a la cadena principal del mismo. De igual manera, también es posible el pretratamiento termoquímico de la materia celulósica para hidrolizar parcialmente las porciones de hemicelulosa y celulosa.

Aunque estos tratamientos mejoran la digestibilidad de los hidratos de carbono y, más generalmente, la biodisponibilidad de los nutrientes de la materia celulósica, pueden resultar caros y prohibitivos desde el punto de vista económico. Además, incluso con un tratamiento previo, la materia celulósica sigue siendo indigerible y, por lo tanto, incapaz de alimentar a los animales no rumiantes, tales como cerdos y aves de corral. Es más, estos tratamientos no proporcionan proteínas, que son el componente más caro de las composiciones de pienso para animales.

Por consiguiente, existe la necesidad de alimentos más baratos, más seguros y más nutritivos para los animales de granjas comerciales y de cría intensiva, incluyendo animales tanto rumiantes como no rumiantes, acuicultura de peces comerciales y camarón, y mascotas.

Sumario de la Invención La presente invención se refiere a mezclas de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas y biomasa tal como biomasa animal y/o vegetal y/o de algas, y al uso de las mismas en la alimentación animal, por ejemplo, como parte de composiciones de pienso para animales. La invención también se refiere a un método de preparación de piensos usando biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas como materias primas. La invención también se refiere a métodos para aumentar el valor nutritivo, la palatabilidad o la digestibilidad de la biomasa. Las composiciones y los métodos de la invención son adecuados para la alimentación de cualquier animal, incluyendo preferentemente el ganado (incluyendo rumiantes y no rumiantes), los animales de cria, aves, peces o animales de compañía.

Los inventores han descubierto que las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas en combinación con materias primas no usables, tales como la biomasa lignocelulósica, se pueden usar como un nutriente seguro y de bajo coste para los animales. Ambos ingredientes cooperan en la producción de piensos de alto valor. Tanto la biomasa como las bacterias Deinococcus se transforman, mediante la invención, de productos de bajo valor nutritivo a útiles ingredientes para piensos. La invención demuestra que es posible usar bacterias Deinococcus en piensos, que son seguras y que contienen valiosos agentes nutritivos. La invención también demuestra que la biomasa sirve como medio de crecimiento para las bacterias Deinococcus, permitiendo de este modo su expansión y enriquecimiento, mientras que las bacterias Deinococcus son capaces de digerir la biomasa, convirtiendo así la biomasa en productos de alto valor nutritivo con una mejor digestibilidad. Por lo tanto, los ingredientes de los piensos de acuerdo con la invención incluyen compuestos orgánicos (por ejemplo, proteínas, aminoácidos, azúcares) e inorgánicos (por ejemplo, minerales) que se utilizan en el metabolismo normal de los animales y los peces, y proporcionan nutrientes esenciales que no se sintetizan en una cantidad suficiente o no se sintetizan en absoluto, tales como los aminoácidos esenciales .

Por lo tanto, un objeto de la invención se refiere a un ingrediente para pienso que comprende una mezcla de biomasa y una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada, siendo dicha biomasa al menos parcialmente digerida por dicha bacteria Deinococcus o bacteria emparentada.

La invención también se refiere al uso de una mezcla de biomasa y una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada para preparar un pienso.

La invención también se refiere a una composición de pienso que comprende un ingrediente como se ha definido anteriormente. Por lo general, la composición de pienso comprende al menos el 10 % en peso de dicho ingrediente. La composición de pienso puede comprender además ingredientes adicionales tales como, sin limitación, alfalfa, cebada, harina de sangre/harina de carne, grasa animal, aves de corral, residuos de patata o residuos de tomate.

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende una biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas para la alimentación de animales .

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere al uso de una mezcla de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, siendo dicha biomasa digerida al menos parcialmente por dichas bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, como un ingrediente para pienso.

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere al uso de una mezcla de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, siendo dicha biomasa digerida al menos parcialmente por dichas bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, como aporte proteico para piensos. Como se ilustra más detalladamente en los ejemplos, las bacterias Deinococcus son por si mismas una alta fuente de proteínas y, además, hidrolizan las proteínas de la biomasa, proporcionando así valiosos aminoácidos.

La invención también se refiere al uso de bacterias Deinococcus como una fuente de aminoácidos para la alimentación de animales.

La invención también se refiere a un método para la preparación de un pienso que comprende: someter una biomasa a la digestión al menos parcial por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas; y formular una mezcla de biomasa al menos parcialmente digerida y bacterias como ingrediente para pienso.

En una realización particular, el método comprende una etapa adicional de adición a la mezcla de otros ingredientes comúnmente usados para piensos.

En una realización alternativa, el método comprende: (a) combinar una biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas para obtener una mezcla; (b) mantener la mezcla en condiciones que permitan la digestión de la biomasa por dichas bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas; (c) recoger la mezcla de (a) o (b) ; y (d) mezclar opcionalmente la mezcla de (c) con uno o varios ingredientes adicionales.

El pienso se puede envasar en cualquier forma o recipiente adecuado .

La biomasa para su uso en la invención puede comprender biomasa vegetal, biomasa animal y/o biomasa de algas. En una realización particular, la biomasa es una biomasa lignocelulósica . En otra realización, la biomasa es una biomasa que contiene proteínas. La digestión de la biomasa se puede realizar en condiciones aerobias o anaerobias, preferentemente en un reactor, para manejar fácilmente los parámetros de reacción (por ejemplo, el tiempo de reacción, la temperatura o las cantidades de las materias primas) .

La invención también se refiere a un método para mejorar el valor nutritivo de una biomasa, que comprende someter dicha biomasa a la digestión al menos parcial por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas. Dicho método puede comprender además una etapa en la que se analiza o controla el valor nutritivo de dicha biomasa al menos parcialmente digerida/hidrolizada .

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere a un método para mejorar la palatabilidad y/o la digestibilidad de una biomasa, que comprende someter dicha biomasa a la digestión al menos parcial por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, con el fin de degradar al menos parcialmente los azúcares complejos de dicha biomasa. Dicho método puede comprender además una etapa en la que se controla la degradación de los azúcares complejos.

Las composiciones y los métodos de la invención se pueden usar como nutriente o aditivo de nutrientes para cualquier animal, especialmente mamíferos no humanos tales como ganado (incluyendo rumiantes y no rumiantes), animales de cría o - - animales de compañía; aves o peces.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Crecimiento de la cepa DG01 (D. geothermalis 01) en paja de colza al 1 % previamente tratada con o sin la adición de celulasa y ß-glucosidasa .

Figura 2: Análisis de TLC que muestra el consumo de xilosa y glucosa retirado de la paja de colza al 1 % previamente tratada inoculada con DG01. El control consiste en la paja de colza previamente tratada sin bacterias. Las enzimas se añaden al cultivo en T0 (0,11 g de celulasa/g de celulosa y 0,05 g de ß-glucosidasa/g de celulosa). La hidrólisis enzimática total se realizó usando 1,1 g de celulasa/g de celulosa, 0,5 g de ß-glucosidasa/g de celulosa y 5,5 g de xilanasa/g de hemicelulosas .

Figura 3: Crecimiento de la cepa DG01 en trigo integral (1 %, con o sin Termamyl, y 6 %) y los residuos de fermentación (6 %) que muestra el consumo del gluten (%) contenido en el medio. La cepa DG01 es capaz de hidrolizar el gluten del trigo integral o los residuos de la fermentación.

Descripción Detallada de la Invención La invención se refiere, en general, al uso de cepas de bacterias Deinococcus o cepas bacterianas emparentadas para producir pienso animal o aditivos con biomasa. Más concretamente, la invención proporciona un aporte de proteínas y aminoácidos de bajo coste y alto nivel, basado en el crecimiento de bacterias Deinococcus y la degradación/transformación de la biomasa. La mezcla de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas y una biomasa de acuerdo con la invención se puede usar para proporcionar a - - los animales una fuente de bajo coste y/o alto nivel de valiosos mono- y di-ácidos o cualquier metabolito derivado de estos mono- o di-ácidos, derivado de azúcares tales como xilano o hidrolizado de hemicelulosa contenido en la biomasa. De acuerdo con la invención, la materia sin procesar de origen biológico, incluyendo la biomasa vegetal, de algas o animal, o la biomasa secundaria, que contiene esencialmente productos de biomasa pretratados hidrolizados, se puede usar en combinación con las bacterias Deinococcus como materias primas alimenticias/nutritivas, pienso para animales o aditivo .

Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un ingrediente para pienso que comprenda una mezcla de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, estando dicha biomasa al menos parcialmente digerida por bacterias Deinococcus .

Un objetivo adicional de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende una biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, para la alimentación de los animales.

Definiciones El término "biomasa" de acuerdo con la invención designa cualquier materia biológica en general. En particular, el término biomasa incluye materia orgánica de origen biológico, incluyendo el origen vegetal, de algas o animal, que puede estar sin procesar o pretratada. Los ejemplos de biomasa incluyen, sin limitación, productos forestales, incluyendo los árboles maduros no aptos para la producción de madera o de papel, pulpa, papel reciclado, residuos orgánicos, productos agrícolas tales como hierba, paja, cultivos y estiércol animal, y productos acuáticos tales como algas y algas marinas. Los ejemplos de biomasa incluyen madera o materia vegetal derivada de numerosos tipos de plantas, incluyendo miscanto, cáñamo, pasto varilla, remolacha azucarera, trigo, cebada, maíz, arroz, soja, colza (incluyendo cañóla) , sorgo, caña de azúcar, cacahuete, algodón, altramuz, y varias especies de árboles que varían desde el eucalipto hasta la palmera de aceite, al álamo y el sauce. Las fuentes específicas de biomasa incluyen, sin limitación, residuos vegetales, troncos de madera dura o tallos de madera blanda, mazorcas, paja, hierba, hojas, semillas, papel, etc. (véase, por ejemplo, Sun et al., "Bioresource Technology" 83 (2002) 1-11). El término biomasa también abarca la biomasa transformada o biomasa secundaria, que contiene esencialmente productos de biomasa pretratados hidrolizados . En una realización preferida, la biomasa de acuerdo con la invención comprende cualquier materia lignocelulósica, por ejemplo, celulosa, hemicelulosas y/o xilano .

La biomasa de acuerdo con la invención puede comprender biomasa en bruto y/o biomasa secundaria. La "biomasa en bruto" es materia sin procesar de la materia biológica. Los ejemplos incluyen, sin limitación, productos forestales tales como los árboles maduros no aptos para la producción de madera o de papel, productos agrícolas tales como pastos, cultivos y estiércol animal, y productos acuáticos tales como algas y algas marinas. La "biomasa secundaria" es cualquier material que procede inicialmente de la biomasa en bruto, que ha sufrido importantes cambios físicos y químicos. Los ejemplos incluyen, sin limitación, papel, cuero, algodón, cáñamo, productos de caucho natural, subproductos del procesamiento de alimentos, harinas de pescado y animales, y aceites de cocina usados.

La expresión "biomasa lignocelulósica" de acuerdo con la invención designa una materia biológica orgánica que contiene lignina, celulosa, hemicelulosa y/o xilano. La expresión biomasa lignocelulósica designa, en general, materia sin procesar de origen biológico, por ejemplo, biomasa en bruto. Los ejemplos de biomasa lignocelulósica incluyen, sin limitación, madera o materia vegetal derivada de numerosos tipos de plantas, incluyendo miscanto, colza, pasto varilla, cáñamo, remolacha azucarera, trigo, paja de trigo, maíz, álamo, sauce, sorgo, caña de azúcar, y varias especies arbóreas que varían desde el eucalipto hasta la palmera de aceite.

Como se usa en el presente documento, la expresión "derivados de biomasa" designa todas las moléculas derivadas de la biomasa en bruto y/o de la biomasa secundaria, como se ha definido anteriormente.

En el contexto de la presente solicitud, la expresión "bacteria Deinococcus" incluye bacterias de tipo silvestre o cepas de variantes naturales de bacterias Deinococcus, por ejemplo, cepas obtenidas a través de la evolución acelerada, mediante tecnologías de barajado de ADN, así como cepas recombinantes obtenidas mediante la inserción de ácido/s nucleico/s eucariota/s, procariota/s y/o sintético/s.

Una bacteria "emparentada" con la bacteria Deinococcus designa una bacteria que (i) contiene un ADNr 16S que, tras su amplificación usando cebadores GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA (SEC ID N°: 1) y GGTATCTACGCATTCCACCGCTA (SEC ID N°: 2), genera un fragmento de aproximadamente 158 pares de bases y/o (ii) resiste un tratamiento de radiación UV de 4 mJ/cm2. En una realización particular, las bacterias emparentadas con Deinococcus son bacterias que tienen una molécula de ADNr 16S que es al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 % idéntica en la secuencia a una secuencia de ADNr 16S de Deinococcus .

En el contexto de la invención, "proteínas" significa todos los compuestos bioquímicos que comprenden una o más cadenas poliméricas de restos de aminoácidos unidos entre si. El suministro de proteínas de la invención incluye proteínas, péptidos, polipéptidos , aminoácidos y derivados relacionados. En el contexto de la invención, un "componente exógeno" tal como una "proteína exógena" se refiere a un componente que procede de la biomasa o de un medio de cultivo y, a la inversa, un "componente endógeno" se refiere a un componente que procede de la bacteria.

En el contexto de la invención, "almidón" se refiere a un hidrato de carbono que consiste en un gran número de unidades de glucosa unidas entre sí por 1-4 y 1-6 enlaces glicosídicos . El almidón es una molécula de almacenamiento de energía acumulada por muchas plantas y bacterias, y las moléculas de almidón se disponen en la planta en gránulos semicristalinos .

Digestión de la biomasa por las bacterias para producir piensos de alto valor La presente invención se basa, entre otras cosas, en la combinación de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas que cooperan para generar productos de alto valor nutritivo y de alta digestibilidad adecuados para los - - piensos. La invención demuestra que la biomasa permite el crecimiento y la expansión de las bacterias, aumentando el valor nutritivo de la mezcla, mientras que las bacterias son capaces de digerir la biomasa, aumentando aún más el valor nutritivo, la digestibilidad y palatabilidad de la mezcla.

De acuerdo con la invención, la biomasa puede ser al menos parcialmente digerida por las bacterias Deinococcus y/o bacterias emparentadas.

El término "digerido" o "digestión" incluye toda modificación o transformación biológica de la biomasa, tal como la degradación o la hidrólisis de los componentes de la biomasa tales como materias primas, paredes celulares, polímeros (por ejemplo, azúcares, proteínas), etc. La digestión puede ser parcial, lo que significa que solo se digiere una parte de algunos de los componentes de la biomasa, por lo general, el 5 %, 10 % o más. La digestión parcial indica que al menos parte de la biomasa se ha modificado o transformado, lo que normalmente da lugar a un valor nutritivo, una digestibilidad o una palatabilidad mayores.

Las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas pueden catalizar venta osamente (o contribuir a la catálisis de) la degradación de los diversos componentes de una biomasa, tales como polímeros de azúcar como el almidón, el xilano o la celulosa en oligosacáridos de menor grado de polimerización y monosacáridos . De hecho, el solicitante ha desvelado bacterias Deinococcus que expresan determinadas enzimas y/o que tienen la capacidad de transformar la biomasa en bruto. En este sentido, las bacterias Deinococcus preferidas para su uso en la invención sintetizan xilanasas y/o celulasas y/o amilasas. Las xilanasas son enzimas que catalizan la - - hidrólisis del xilano, un componente principal de las hemicelulosas de la madera dura y la madera blanda. Las amilasas participan en la hidrólisis de polímeros de almidón. Las celulasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de la celulosa o hemicelulosa, un componente principal de la madera dura y la madera blanda.

En una realización particular, la digestión de la biomasa designa una reducción del nivel de celulosa o hemicelulosa de la biomasa, preferentemente una reducción del al menos 5 %. Dicha disminución facilita la digestibilidad de la biomasa por todo tipo de animales, incluyendo los animales no rumiantes .

En una realización preferida, la digestión de la biomasa designa la conversión de la hemicelulosa de dicha biomasa en oligosacáridos inferiores y/o xilosa, mañosa, arabinosa o galactosa, y/o la conversión de la celulosa y/o el almidón de dicha biomasa en glucosa. Preferentemente, la digestión abarca la conversión del al menos 5 % de la hemicelulosa, celulosa o almidón de dicha biomasa.

Dicha digestión al menos parcial de los azúcares mejora la digestibilidad y/o palatabilidad de la biomasa, ya que los azúcares de 5 C como la xilosa, que hacen que el sustrato no sea apetecible, son digeridos por las bacterias Deinococcus {Br J nutr., Mayo de 2010; 103 (10): 1507-13).

En otra realización, la digestión comprende la oxidación del azúcar celular, incluyendo particularmente azúcares DP3-DP7 (DP: grado de polimerización) como, por ejemplo, triosa, tetrosa, pentosa, hexosa y heptosa, seleccionados, por ejemplo, de entre restos de xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa o fucosa como monómeros.

- - Simultáneamente a la degradación/digestión de la biomasa, el crecimiento de las bacterias aumenta. Por consiguiente, debido al aumento del nivel de bacterias dentro de la mezcla, el nivel de proteínas y lípidos también aumenta. Así pues, de acuerdo con la invención, la digestión de la biomasa por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, incluso de biomasa indigerible tal como tortas forrajeras de granos de trigo o semilla de cañóla, proporciona un alto nivel de componentes directamente nutritivos para los animales. La invención permite aprovechar al máximo las diversas biomasas vegetales que no se usaban para la alimentación animal debido a su indigestibilidad y/o bajos niveles de nutrientes. Este es el caso, por ejemplo, de las tortas forrajeras de colza, que contienen un bajo nivel de proteínas en comparación con las tortas forrajeras de soja. Dicha biomasa comprende de 1 a 6 g/1 de proteínas vegetales y una cantidad insignificante de lípidos. Tras una digestión parcial de dicha biomasa por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas de acuerdo con la invención, se puede esperar una cantidad de aproximadamente 12 a 25 g/1 de proteínas y de aproximadamente 1 a 2,5 g/1 de lípidos. De igual manera, varias biomasas de origen animal sin interés industrial, tales como las plumas de aves de corral, se pueden usar ventajosamente como biomasa para su mezcla con bacterias Deinococcus con el fin de proporcionar un ingrediente para los piensos animales.

Además, como la especie Deinococcus produce de forma natural carotenoides , la mezcla de biomasa/bacterias Deinococcus de la invención puede contener carotenoides que tengan un efecto positivo tanto en la calidad visual como gustativa y en la salud de los animales alimentados con dicha mezcla. Por ejemplo, basándose en una biomasa vegetal sin ningún tipo de carotenoide, cabe esperar aproximadamente 15 mg/kg de carotenoides en la mezcla tras la digestión parcial de la biomasa vegetal y el crecimiento de las bacterias.

La cantidad final de proteínas, aminoácidos, lípidos, vitaminas, carotenoides, etc. producida o sintetizada por bacterias Deinococcus y recuperada en la mezcla dependerá de varios parámetros industriales tales como la naturaleza y las condiciones de la reacción, el tiempo de reacción, la cantidad inicial de bacterias y el tipo de biomasa usada. Será evidente para un experto en la materia que se pueden hacer diversas adaptaciones para adaptar el método de la invención a las necesidades.

Por ejemplo, el nivel de digestión de la biomasa puede variar dependiendo de los requerimientos industriales/económicos y/o nutritivos. Si se prefiere un alto nivel de componentes nutritivos a una producción de bajo coste, se puede aumentar el tiempo de reacción para permitir una digestión completa de la biomasa. En la mezcla final, cabe esperar la ausencia de fracción vegetal, habiendo digerido las bacterias casi toda la biomasa. Por el contrario, se puede desear un ingrediente de bajo coste, con un nivel mínimo de proteínas. El equilibrio entre el tiempo de reacción y el nivel de componentes nutritivos se puede adaptar fácilmente.

La mezcla de la invención, o mezcla final, comprende la biomasa restante (la parte de la biomasa que no ha sido hidrolizada/digerida por las bacterias) y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, cuyo número ha aumentado .

En una realización de la invención, la bacteria Deinococcus o - - bacteria emparentada usada presenta una actividad proteolítica, particularmente útil para hidrolizar, al menos parcialmente, las proteínas contenidas en la biomasa.

Las proteasas, también conocidas como proteinasas o enzimas proteolíticas , son enzimas que comienzan el catabolismo de las proteínas por hidrólisis de los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos entre sí en la cadena polipeptídica .

Los inventores han descubierto que las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas pueden presentar una alta actividad proteolítica. De acuerdo con la invención, las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas que tienen actividad proteolítica se pueden usar ventajosamente en combinación con varias biomasas vegetales, de algas o animales que contienen proteínas para proporcionar aminoácidos altamente digeribles. Las bacterias hidrolizan las proteínas, proporcionando aminoácidos y péptidos que son fácilmente absorbidos por los animales. La mezcla resultante se puede usar como ingrediente para la composición de pienso que proporciona tanto aminoácidos (y/o péptidos) exógenos como nutrientes endógenos (de las propias bacterias) incluyendo proteínas y aminoácidos .

Por ejemplo, las bacterias Deinococcus pueden ponerse en contacto con algas tales como Micratinium pusilum y/o Chlorella sp. para poderse usar la mezcla resultante en lugar de harina de pescado como ingrediente para piensos que contienen aminoácidos útiles.

Otros ejemplos de biomasas que contienen proteínas incluyen pulpa de remolacha, soja, alfalfa y plumas de pollo.

El uso de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas también puede reducir la viscosidad de la biomasa (vegetal, - - animal o de algas), lo que representa una ventaja adicional. De hecho, la actividad proteolitica de las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas reduce la viscosidad de la biomasa que contiene gelatina. Además, la actividad pectinolitica de las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas reduce la viscosidad de la biomasa que contiene pectina .

Los inventores han descubierto que las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas pueden presentar una alta actividad pectinolitica . De acuerdo con la invención, las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas que sintetizan pectinasas se pueden usar venta osamente en combinación con una biomasa que contenga peptina para reducir su viscosidad y asi aumentar su palatabilidad . Las bacterias hidrolizan la pectina, eliminando las propiedades viscosas de la biomasa. Dicha biomasa viscosa se puede usar como medio de cultivo para las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, y la mezcla resultante se puede usar como ingrediente para piensos .

En una realización particular de la invención, la bacteria Deinococcus o bacteria emparentada usada en la mezcla para piensos presenta, por lo tanto, una actividad pectinolitica, particularmente útil para hidrolizar al menos parcialmente la pectina contenida en alguna biomasa viscosa.

Este es el caso, por ejemplo, de la pulpa de remolacha, que contiene un alto nivel de pectina (del 15 al 20 % en peso) . La pulpa de remolacha es una materia prima difícil de aprovechar debido a la pectina, que hace que esta biomasa sea viscosa. No es posible alimentar a los animales directamente con dicha biomasa viscosa y su transformación en un alimento - - agradable requiere costosos tratamientos.

En una realización, la biomasa viscosa es solo una parte de la biomasa de la mezcla. Por ejemplo, la biomasa usada comprende el 60 % de biomasa lignocelulósica, tal como una torta forrajera de semillas de cañóla, y el 40 % de biomasa viscosa, tal como pulpa de remolacha.

Proceso para la preparación de la mezcla La digestión de la biomasa por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas se puede llevar a cabo ventajosamente en un reactor para controlar fácilmente los parámetros de la reacción. En función de la/s cepa/s de bacterias y/o de la biomasa usada, la reacción se puede llevar a cabo en un reactor aeróbico o anaeróbico.

En una realización, la biomasa se introduce de una vez, junto con las bacterias. En otra realización, el reactor se puede recargar con biomasa o bacterias durante el proceso. En ese caso, la naturaleza y cantidad de la biomasa pueden variar para mejorar el contenido final de nutrientes de la mezcla final. La mezcla final comprende la biomasa restante, que todavía no se ha hidrolizado/digerido, los productos resultantes de la digestión/hidrólisis (a menos que sean consumidos por las bacterias) y las bacterias que se han expandido. La cantidad de líquido añadida en el interior del reactor puede depender del estado de la composición final, es decir, estado líquido o sólido, y del contenido de humedad de la biomasa.

En otra realización, la preparación de la mezcla de la invención se lleva a cabo en campo abierto. Por ejemplo, primero se mezclan la biomasa y las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas entre sí antes de extenderlas sobre el suelo. Esta mezcla inicial se puede cubrir con una lámina de lona o, por el contrario, la mezcla se puede poner al aire libre .

De acuerdo con la invención, la mezcla se puede usar directamente como parte de una composición de pienso para animales. Por el contrario, la mezcla se puede procesar (por ejemplo, deshidratar, filtrar, secar, triturar, etc.) antes de usarla. En otra realización, la mezcla se puede tratar para matar o inactivar las bacterias, o para eliminar la biomasa en bruto restante. El producto resultante comprende esencialmente las bacterias y los componentes de la biomasa digeridos, y se puede usar directamente como materia prima de proteínas y lípidos.

La mezcla de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas de acuerdo con la invención se puede usar como ingrediente en una composición de pienso para animales. Una composición de pienso para animales, como se usa en el presente documento, es una composición para la alimentación de animales que se encuentra en estado sólido o líquido. El pienso se puede definir como una sustancia con suficiente valor nutritivo para permitir el crecimiento y el mantenimiento de las condiciones corporales adecuadas de un animal. Por ejemplo, una composición de pienso para animales puede estar en forma de microgránulos , harina, granos, cereales extrudidos o expandidos, polvo en comprimidos, en bolo o una mezcla de los mismos.

Preferentemente, la composición de pienso para animales de la invención, que incluye la mezcla de bacterias y biomasa, se encuentra en una forma y/o una composición autorizada por un organismo gubernamental tal como la Administración Nacional - - de Alimentos (por ejemplo, la AFSSA francesa, la ACIA canadiense o FAD estadounidense) .

En una realización preferida, la composición de pienso para animales de la invención comprende al menos el 10 % en peso de la mezcla de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas y biomasa al menos parcialmente digerida/hidrolizada . Dependiendo del resto de ingredientes usados para formar la composición de pienso para animales y de su efecto tanto en la calidad física de los piensos tras su formación (por ejemplo, aglomeración) como en la calidad nutricional requerida, se puede aumentar o disminuir el nivel de la mezcla de la invención. Por ejemplo, para obtener microgránulos con una buena calidad en términos de dureza y durabilidad, se puede añadir una cantidad del aproximadamente 40 % de almidón pregelatinizado . Si se usa almidón natural, la cantidad requerida puede ser superior. Del mismo modo, la cantidad de proteína dispersable también puede afectar positivamente a las propiedades de dureza y la durabilidad de los piensos de microgránulos.

En este sentido, la invención también se refiere a un método para la preparación de un pienso que comprende: someter una biomasa a la digestión al menos parcial por bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas; y formular una mezcla de biomasa al menos parcialmente digerida y bacterias como ingrediente para pienso.

En una realización particular, el método comprende una etapa adicional de añadir a la mezcla otros ingredientes comúnmente usados para piensos.

En una realización alternativa, el método comprende: a) combinar una biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias - - emparentadas para obtener una mezcla; (b) mantener la mezcla en condiciones que permitan la digestión de la biomasa por dichas bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas; (c) recoger la mezcla de (a) o (b) ; y (d) mezclar opcionalmente la mezcla de (c) con uno o varios ingredientes adicionales.

El pienso se puede envasar en cualquier forma o recipiente adecuado .

En la mezcla, es posible usar una especie o cepa de una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada, o combinar varias cepas, o las mismas o distintas especies de bacterias Deinococcus . También, además de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, la mezcla o producto de pienso puede comprender otras bacterias o células de levadura, si es apropiado. Es más, se pueden añadir a la biomasa agentes adicionales tales como enzimas.

Como se ha indicado anteriormente, la invención se puede usar para producir piensos o aditivos para piensos adecuados para su uso en todos los animales no humanos. Es especialmente adecuado para el ganado (incluyendo los rumiantes y no rumiantes), animales de cria, aves, peces o animales de compañía. Los ejemplos específicos incluyen ganado vacuno, ovino y porcino, aves de corral, peces, camarones y crustáceos.

En el siguiente apartado experimental, se desvelan otros aspectos y ventajas de la invención, debiéndose considerar como ilustrativo de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Identificación de cepas de Deinococcus mesófilas y - - termófilas con actividades de degradación de la biomasa Este ejemplo desvela ensayos adecuados para determinar si un género, una especie y/o una cepa bacteriana es capaz de funcionar en un método para la preparación de piensos de acuerdo con la invención. A continuación, se describen ejemplos no limitantes de los ensayos que se pueden realizar para identificar las bacterias que presentan determinadas actividades enzimáticas.

Materiales y métodos Composición de medio complejo de glucosa al 1 % (CMG) Peptona: 2 g/1 Extracto de levadura: 5 g/1 Tratamiento en autoclave a 121 °C, 15 min.

Glucosa: 10 g/1 - Filtro esterilizado (0,22 µt?) A continuación, se añaden MOPS, micronutrientes , vitaminas, FeCl3, K2HP04 (véase más abajo) .

Composición de los medios (MM) Se añaden 14 g/1 de agar a 704 mi de agua ultrapura. A continuación, se realiza un tratamiento en autoclave. Seguidamente, tras el enfriamiento del medio, se añaden 80 mi de MOPS x 10, 8 mi de FeCl3 x 100, 8 mi de K2HP04 x 100, 80 µ? de micronutrientes x 10.000 y 80 µ? de vitaminas x 10.000. Composición de los medios para la detección en medio sólido de la actividad celulolitica (AZO-Celulosa al 5 ¾) Se añaden 14 g/1 de agar a 704 mi de agua ultrapura. A continuación, se realiza un tratamiento en autoclave. Seguidamente, tras el enfriamiento del medio, se añaden 80 mi de MOPS x 10, 8 mi de FeCl3 x 100, 8 mi de K2HP04 x 100, 80 µ? de micronutrientes x 10.000 y 80 µ? de vitaminas x 10.000. - - Finalmente, se añade solución de AZO-celulosa al 5 %.

Composición de los medios para la detección en medio sólido de la actividad proteolitica (leche al 1 %) Se añaden 10 g/l de leche en polvo y 14 g/l de agar a 704 mi de agua ultrapura. A continuación, se realiza un tratamiento en autoclave. Seguidamente, tras el enfriamiento del medio, se añaden 80 mi de MOPS x 10, 8 mi de FeCl3 x 100, 8 mi de K2HP04 x 100, 80 µ? de micronutrientes x 10.000 y 80 µ? de vitaminas x 10.000.

Composición de los medios para la detección en medio sólido de la actividad amilolitica (almidón al 0,5 %) Se añaden 5 g/l de almidón y 14 g/l de agar a 704 mi de agua ultrapura. A continuación, se realiza un tratamiento en autoclave. Seguidamente, tras el enfriamiento del medio, se añaden 80 mi de MOPS x 10, 8 mi de FeCl3 x 100, 8 mi de K2HP04 x 100, 80 µ? de micronutrientes x 10.000 y 80 µ? de vitaminas x 10.000.

Composición de los medios para la detección en medio sólido de la actividad xilanolitica (AZQ-xilano al 5 %) Se añaden 14 g/l de agar a 704 mi de agua ultrapura. A continuación, se realiza un tratamiento en autoclave.

Seguidamente, tras el enfriamiento del medio, se añaden 80 mi de MOPS x 10, 8 mi de FeCl3 x 100, 8 mi de K2HP04 x 100, 80 µ? de micronutrientes x 10.000 y 80 µ? de vitaminas x 10.000. Finalmente, se añade solución de AZO-xilano al 5 % .

Mezcla de MOPS-tampón x 10, pH 7,0 Ácido MOPS 400 mM NH4CI 200 mM NaOH 100 mM - - KOH 100 mM CaCl2 5 µ? Na2S04 2, 76 mM MgCl2 5,28 mM Esterilizada por filtración (0,22 µ?) .

Micronutrientes ? 10.000 (??4) 6(??7) 024 30 µ? ?3?03 4 mM CoCl2 300 µ? CuS04 100 µ? MnCl2 2,5 mM ZnS04 100 µ? Ajustados a ?? 5 con HC1.

Esterilizados por filtración (0,22 µ?) .

Vitaminas x 10.000 10 mg/1 de cada uno: D-biotina, niacina (ácido nicotinico) , piridoxina (clorhidrato de piroxidal) B6, tiamina (clorhidrato de vitamina Bl) - patrón a pH 4 - esterilizadas por filtración (0,22 µ?) .

FeCl3 x 100 FeCl3 2 mM en citrato de sodio 2 mM, esterilizado por filtración (0,22 µ?) K2HPQ4 x 100 100 g/1, tratado en autoclave.

Detección de las actividades enzimáticas Detección de la actividad celulolitica Detección en medio sólido (ensayo en placa de agar) Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se salpicaron 5 µ? de precultivo en placas de agar que contenían MM y AZO-celulosa al 5 %.

Se siguió la actividad enzimática celulolítica midiendo el diámetro del halo de la hidrólisis tras 1, 2 y 5 días (se necesitó 1 placa/día) .

Detección en medio líquido Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se añadieron 5 µ? de precultivo a 200 µ? de MM + CMC al 1 % o CMC4M al 1 % o celobiosa al 1 % en microplacas.

Se estimó la actividad enzimática celulolítica siguiendo el crecimiento a DOeoonm (lectura dos veces al día durante 5 días ) .

Detección de la actividad proteolítica Detección en medio sólido (ensayo en placa de agar) Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se salpicaron 5 µ? de precultivo en placas de agar que contenían MM y leche al 1 % . Se siguió la actividad enzimática proteolítica midiendo el diámetro del halo de la hidrólisis tras 1, 2 y 5 días (se necesitó 1 placa/día) .

Detección en medio liquido - - Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se añadieron 5 µ? de precultivo a 200 µ? de MM + peptona al 1 % o caseína al 1 % en microplacas .

Se estimó la actividad enzimática proteolítica siguiendo el crecimiento a DOeoonm (lectura dos veces al día durante 5 días) .

Detección de la actividad amilolítica Detección en medio sólido (ensayo en placa de agar) Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se salpicaron 5 µ? de precultivo en placas de agar que contenían MM y almidón al 0,5 %.

Se siguió la actividad enzimática amilolítica midiendo el diámetro del halo de la hidrólisis tras 1, 2 y 5 días (se necesitó 1 placa/día).

En placas de agar que contenían almidón, se realizó el revelado del halo de hidrólisis mediante la adición de reactivo de yodo de Gram (también se necesitó 1 placa/día) . Detección en medio líquido Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se añadieron 5 µ? de precultivo a 200 µ? de MM + almidón al 0,5 % en microplacas. - - Se estimó la actividad enzimática proteolitica siguiendo el crecimiento a DOgoonm (lectura dos veces al día durante 5 días) .

Detección de la actividad xilanolitica Detección en medio sólido (ensayo en placa de agar) Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se salpicaron 5 µ? de precultivo en placas de agar que contenían MM y AZO-xilano al 5 %. Se siguió la actividad enzimática xilanolitica midiendo el diámetro del halo de la hidrólisis tras 1, 2 y 5 días (se necesitó 1 placa/día) .

Detección en medio líquido Se llevó a cabo un precultivo en medio CMG al 1 % en microplaca usando clones aislados (5 colonias en 200 µ? de medio CMG al 1 %) .

A partir de una fase estacionaria, se añadieron 5 µ? de precultivo a 200 µ? de MM + xilano al 0,5 % en microplacas. Se estimó la actividad enzimática xilanolitica siguiendo el crecimiento a D060onm (lectura dos veces al día durante 5 días ) .

Resultados La Tabla 1 (que figura a continuación) muestra ejemplos de bacterias identificadas con los ensayos de detección en medio sólido y que tienen actividad de digestión de la biomasa adecuada para su uso en la producción de piensos. El diámetro del halo de hidrólisis se ha medido tras 2 días para las actividades proteolíticas y amilolíticas , y tras 5 días para - - las actividades xilanoliticas y celuloliticas . Más concretamente, para la actividad proteolitica, una actividad alta corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis superior a 2,4 cm, una actividad media corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis de entre 2 cm y 2,35 cm, y una actividad baja corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis inferior a 1,95 cm.

Para la actividad amilolitica, una actividad alta corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis superior a 2,4 cm, una actividad media corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis de entre 2,1 cm y 2,35 cm, y una actividad baja corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis inferior a 1,9 cm .

Para la actividad xilanolitica, una actividad alta corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis superior a 2,8 cm, una actividad media corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis de entre 2,1 cm y 2,7 cm, y una actividad baja corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis inferior a 2,05 cm.

Para la actividad celulolitica, una actividad alta corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis superior a 1,6 cm, una actividad media corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis de entre 1,1 cm y 1,35 cm, y una actividad baja corresponde a un diámetro del halo de hidrólisis inferior a 0,9 cm.

Tabla 1: Lista de cepas de Deinococcus que tienen actividad celulolitica, proteolitica, amilolitica y/o xilanolitica (detección en medio sólido) - - - - (+++) : Actividad alta (++) : Actividad media (+) : Actividad baja (-) : Actividad nula La Tabla 2 (que figura a continuación) muestra ejemplos de bacterias identificadas con ensayos de detección en medio liquido y que tienen actividades enzimáticas variables para la producción de piensos. El crecimiento de las bacterias se sigue mediante la medición de la DO a 600 nm.

Tabla 2: Lista de cepas de Deinococcus que tienen actividad celulolitica, proteolitica, amilolitica y/o xilanolitica - - (detección en medio líquido) - - (+ ) : Buen crecimiento (D06oonm = 0,5) (-) : Bajo o ningún crecimiento (D06oonm < 0,5).

Este ejemplo muestra que las bacterias Deinoccocus que tienen actividad biológica adecuada se pueden seleccionar de colecciones públicas y usar en la invención para producir piensos .

Ejemplo 2 : Producción de una mezcla de paja de colza y bacterias Deinococcus Se prepara una mezcla de paja de colza y bacterias Deinococcus . Más concretamente, se pone en contacto paja de colza pretratada al 1 % con una bacteria Deinococcus (por ejemplo, cepa DG01) . Se determina la capacidad de la mezcla para producir una mezcla valiosa para preparar pienso mediante la verificación de la capacidad de Deinococcus para expandir y digerir la paja de colza, bien sola o tras la suplementación enzimática, y para producir un alto contenido nutritivo .

Materiales y métodos Paja de colza La paja de colza se obtuvo de Sofiproteol, y se trituró en un mezclador y luego se pasó a través de un tamiz, obteniéndose secciones finas, inferiores a 1 mm de longitud.

Celulasa y ß-glucosidasa Las enzimas comerciales usadas fueron una celulasa de Trichoderma reesei (SIGMA ref. C8546-5KU) y una ß-glucosidasa - - de almendras (SIGMA ref . 49290-1G) .

Pretratamiento hidrotérmico con H2SO4 El pretratamiento se realizó en un matraz Erlenmeyer con paja de colza al 20 % (p/v) y H2S04 al 0,5 % (p/p) en agua corriente. Se trató esta mezcla en autoclave durante 10 min a 120 °C (duración del ciclo: 1,5 h) y luego se diluyó con agua corriente estéril, obteniéndose la concentración final de paja de colza. Se ajustó el pH a 7 con solución de NaOH 20 M (verificado con papel de pH) . Antes de la inoculación, se añadieron soluciones minerales: NH4C1 20 mM y 2HP04 5, 7 mM antes de la inoculación.

Protocolo de recuento - Se toma 1 mi de cultivo homogéneo (CMG, sustrato técnico) en 2 mi de Ependorff.

- Se somete a movimientos vorticiales durante 10 s y luego se aplica Ultrason en un baño ultrasónico durante 10 minutos y se vuelve a someter a movimientos vorticiales durante 10 s. En microplaca de 96 pocilios: - Se dispensan 180 µ? de agua MilliQ estéril en 9 pocilios por triplicado.

- Por triplicado: se realizan diluciones en serie de 1/10 a partir del pocilio N° 1 (correspondiente a la muestra pura) hasta el pocilio N° 10 (correspondiente a la dilución 10~9) : se toman 20 µ? y se disponen en 180 µ? de agua milliQ estéril a partir del siguiente pocilio, se mezcla y se pipetea a la inversa tres veces. Se cambia el cono entre cada pocilio.

- Con la pipeta multicanal, se aplican puntualmente en la placa de APG-agar 5 µ? de cada dilución por duplicado.

Se incuba durante 2 días a 45 °C (para bacterias - - Deinococcus termófilas ) ; - Se cuenta el número de colonias en la primera dilución contable: se hace la media de los seis puntos corregidos por el factor de dilución y se multiplica por 200, obteniéndose el número de UFC/m.

Protocolo de la TLC - Se aplican puntualmente 5 µ? de la muestra en gel de sílice para TLC.

Se secan las muestras aplicadas con pistola de aire caliente.

Se realiza la migración de la TLC en disolvente de butanol/acetona/H20 (4/5/1) .

- Al final de la migración, se seca la TLC con pistola de aire caliente.

- Se revela la TLC usando una solución que contiene 12 g de molibdato de amonio + 0,5 g de nitrato de cerio y amonio en 80 mi de H2S04 al 10 %.

Hidrólisis enzimática y cultivo Para DG01, se añadieron enzimas al medio de cultivo para hidrolizar los polímeros en monómeros de azúcar.

La paja de colza contiene celulosa al 40 %. La carga de enzima es de 0,11 g de celulasa/g de celulosa y 0,05 g de ß-glucosidasa/g de celulosa. Se filtraron las soluciones de enzima a través de 0,22 micrómetros antes de la introducción en el cultivo.

Se realizó un precultivo durante 3 días en CMG al 1 % . Se lavó el sedimento celular tres veces en agua estéril y luego se usó para inocular medio de cultivo a DOi de 0,2, es decir, ~107 UFC/ml.

El cultivo se llevó a cabo durante 9 días a 30 °C para DRH46 y a 45 °C para DG01. El crecimiento se controla contando las bacterias de acuerdo con el siguiente protocolo.

Resultados Se siguió el crecimiento de DG01 mediante el recuento (UFC/ml) (Figura 1), y se estimó el consumo de azúcares se estimó usando el análisis de TLC (Figura 2).

Tras 9 días, toda la glucosa y xilosa libre fue consumida por DG01 de tipo silvestre. Al presentar este consumo con respecto a los azúcares totales, parecía que se había consumido una parte importante de la glucosa y la xilosa. Por tanto, estos resultados muestran que la mezcla comprende biomasa parcialmente digerida, con un reducido contenido de xilosa .

Se obtienen resultados similares con otras bacterias Deinococcus como las enumeradas en la Tabla 1, tales como DRH01, DRH02 , DRH03 o DRH46.

Se liofilizaron los cultivos, y se llevó a cabo la determinación de la composición de aminoácidos, nitrógeno soluble y fibras NDF/ADF/ADL en masa seca.

En la siguiente Tabla 3, se compara la composición de aminoácidos de la paja de colza (g/kg de masa seca) con la composición de aminoácidos de la mezcla de la invención (g/kg de masa seca) .

Los resultados muestran que la mezcla de la invención comprende al menos 20 veces más aminoácidos que la paja de colza inicial.

Tabla 3: Composición de aminoácidos de la mezcla y la paja de colza - - Mezcla de la invención Paja de colza (g/kg de masa seca) (g/kg de masa seca) Ácido aspártico 51, 3 2,6 Treonina 31, 9 1,4 Serina 18, 9 1,4 Ácido glutámico 65, 1 3,1 Prolina 26 1,3 Glicina 37, 1 1,8 Alanina 46, 8 1,8 Valina 36,2 1,8 Cisteina 1,6 0, 6 Metionina 10, 4 0,4 Isoleucina 20, 6 1,2 Leucina 42, 5 2,1 Tirosina 16, 1 0,7 Fenilalanina 19, 5 1,4 Lisina 29, 4 1,2 Histidina 9,7 0,4 Arginina 40 1,2 La mezcla de la invención, por tanto, transforma un material biológico deficiente en una mezcla rica y de fácil digestión para los piensos.

Ejemplo 3: Producción de una mezcla de trigo-bacterias Delnococcus Se preparó una mezcla de biomasa de Deinoccocus y trigo por inoculación de la cepa de Deinoccocus DG01 en un medio hecho de trigo integral (1 % con o sin adición de Termamyl, y 6 %) y los residuos de fermentación (1 % o 6 %) suplementado con NH4C1 20 mM y K2HP04 5, 7 mM.

Se determinó la capacidad de la mezcla para producir una mezcla valiosa para piensos mediante la verificación de la capacidad de Deinoccocus para expandirse en el trigo y reducir el contenido de gluten del mismo.

El consumo de gluten se evaluó usando un inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de la gliadina (fracción soluble del gluten) /gluten . Este ensayo se basa en el principio del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Protocolo Se mide el consumo de proteínas usando un kit comercial de Libios (Ref . GLI-E02) .

Preparación de las muestras: se vuelven a suspender 100 mg de sustrato técnico liofilizado finamente molido en 1 mi de EtOH al 40 %, se mezcla durante 5 minutos y, finalmente, se centrifuga durante 10 min a 3.800 rpm. Se diluye el sobrenadante (1/500.000) en la muestra de tampón de dilución x 1.

Ensayo ELISA Las muestras y los patrones se ensayan por duplicado.

- Se añaden 100 µ? de patrones y muestras a una microplaca de 96 pocilios recubierta con anticuerpo antigliadina.

- Se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.

- Se lavan los pocilios tres veces con 300 µ? de solución de lavado x 1.

Se añaden 100 µ? de anticuerpo conjugado secundario (antigliadina peroxidasa) a los pocilios vacíos.

- Se lavan los pocilios tres veces con 300 µ? de solución de lavado x 1.

- Se añaden 100 µ? de solución de TMB (sustrato) .

- Se incuba durante 20 min a temperatura ambiente a oscuras.

- Se añaden 100 µ? de solución de detención (cambio de color azul a amarillo) .

- Se homogeniza y realiza la lectura con un espectrofotómetro a una DO450nm.

Resultado La concentración de gliadina es directamente proporcional a la intensidad del color de la muestra de ensayo. Debido a que la cantidad de gliadina y gluten del trigo es igual, la concentración de gluten de la muestra se calcula multiplicando por 2.

Como se muestra en la Figura 3, la bacteria Deinococcus es capaz de hidrolizar el gluten del trigo integral o los residuos de la fermentación del mismo, y consumirlo tras 2 días de crecimiento a 45 °C. Tras 48 horas, todas las proteínas contenidas en las biomasas vegetales son consumidas por la cepa de Deinococcus .

- - Se obtienen resultados similares con otras bacterias Deinococcus enumeradas en la Tabla 1, tales como DRH01, DRH03 o DRH46.

Por tanto, estos resultados demuestran claramente que las cepas de Deinococcus pueden presentar una fuerte actividad proteolitica que produce una mezcla más digerible de trigo apta para su uso en el consumo animal.

Ejemplo 4: Análisis de la composición de aminoácidos de Deinococcus geothermalls La composición de aminoácidos de Deinococcus geothermalis (cepa M36-7D_21) se determinó tras cultivar las células en un medio que contenia peptona y glucosa como únicas fuentes de carbono. Luego, se comparó la composición con la composición de aminoácidos de las levaduras que se usan comúnmente como fuente complementaria de proteínas en la dieta de los peces y/o como suplemento en la alimentación de animales para compensar las deficiencias de aminoácidos y/o vitaminas de los cereales.

Materiales y métodos Composición de medio complejo de glucosa al 1 % (C G) Peptona: 2 g/1; Extracto de levadura: 5 g/1; Glucosa 55 mM (10 g/1) ; Ácido MOPS 40 mM; NH4C1 20 mM; NaOH 10 mM; KOH 10 mM; CaCl2-2H20 0, 5 µ?; Na2SO4-10H2O 0,276 mM; - - MgCl2-6H20 0, 528 mm; (NH4) 6 (Mo7) 024·4 H20 3 n ; H3BO3 0,4 µ?; CoCl2 6H20 30 nM; CuS02 5H20 10 nM; ZnS04-7H20 10 nM; D-biotina 1 µg/l; Niacina (ácido nicotínico) 1 µg/l; Piridoxina (HC1 de piridoxal o vitamina B6) 1 µg/l; HC1 de Tiamina (vitamina Bl) ; FeCl3 20 µ?; Citrato de sodio.2H20 20 µ?; K2HP04 5,7 mM.

La concentración final de MnCl2 fue de 5,25 µ?.

Se cultivaron las células en medio CMG al 1 % que contenia 6 µg/ml de bleomicina en un termentador de 3,5 1 a 45 °C y bajo agitación de 400 rpm.

Se cosecharon de aproximadamente 100 a 200 mi de medio de cultivo por centrifugación (4000 rpm, 20 min a 4 °C) en la fase de crecimiento exponencial y estacionaria, y se lavaron antes de la liofilización .

A continuación, se liofilizaron los cultivos y se llevó a cabo la determinación de la composición de aminoácidos en masa seca.

La composición de aminoácidos y la cuantificación se determinaron por HPLC.

Los valores de la composición de aminoácidos del extracto de levadura se obtienen de S. Cortassa et al., 2002 (S. Cortassa - - et al., 2002, "An introduction to metabolic and cellular engineering" World scientific Publishing) .

Resultados En la siguiente Tabla 4, se compara la composición de aminoácidos de Deinococcus geothermalis con la composición de aminoácidos del extracto de levadura. Eas cantidades se dan en g/100 g de materia seca.

Tabla 4 : Composiciones de aminoácidos de bacterias Deinococcus en comparación con el extracto de levadura Extracto D. D. de greothermalis geothermalis levadura Fase de Fase de crecimiento crecimiento exponencial estacionaria Aminoácidos : Ácido aspártico 5, 10 4, 65 5,46 Ácido glutámico 6, 50 5, 98 6, 90 Alanina nd 4, 67 4, 99 Arginina§ 0,78 3,92 4,57 Cisteina nd 0, 31 0,08 Glicina 2,40 3, 05 3,47 Histidina*§ 0, 94 0, 93 1, 08 Isoleucina*§ 2, 90 1, 94 2,23 Leucina*§ 3,60 4,38 5,23 Lisina*§ 4, 00 2, 34 2,70 Metionina*§ 0,79 1,51 0,44 Fenilalanina*§ 2,20 1,88 2,09 Prolina nd 2,22 2, 55 Serina nd 1,75 2,15 - - Treonina*§ nd 2, 82 3,39 Triptófano*§ 0,88 0,76 0,79 Tirosina 0,60 1,55 1,91 Valina*§ 3, 40 3, 31 3, 82 Aminoácidos 34,00 48,00 54,00 totales : Proteínas : 29,45 41,05 46,19 "§": aminoácidos cuyas estructuras de carbono no son sintetizadas por las células animales y que son esenciales para el crecimiento de los peces (H. George Ketola 1982, Comp biochem physiol 73B, N° 1, pág. 17-24); aminoácidos cuyas estructuras de carbono no son sintetizadas por las células animales y que son esenciales para los mamíferos monogástricos; "nd" : no determinado Estos datos muestran que el contenido total de aminoácidos de las células de Deinococcus alcanza el 48 % y 54 % (g/100 g de materia seca) en la fase de crecimiento exponencial y estacionaria, respectivamente. Estos valores son superiores a los obtenidos con el extracto de levadura (34 %) independientemente la fase de crecimiento. El contenido total de proteínas de Deinococcus también es más alto que el del extracto de levadura. Además, en comparación con el extracto de levadura, las bacterias Deinococcus proporcionan una cantidad significativa de arginina, que es un aminoácido esencial para los peces (H. George Ketola 1982, Comp biochem physiol 73B, N° 1, pág. 17-24) . La biomasa de Deinococcus también proporciona más tirosina y leucina en comparación con el extracto de levadura, siendo la leucina un aminoácido esencial tanto para mamíferos monogástricos como para peces. - - Por lo tanto, las bacterias Deinococcus se pueden usar como una fuente de proteínas y aminoácidos altamente valiosa para piensos, pudiendo incluso reemplazar los extractos de levadura en las composiciones de piensos.

Ejemplo 5: Análisis de determinadas condiciones de cultivo Condiciones de cultivo que permiten la producción de carotenoides Se cultivó la cepa de Deinococcus geothermalis MX6-1E en 1 1 de medio que contenía 20 g/1 de peptona y 10 g/1 de extracto de levadura en un fermentador de 1 1 a 45 °C bajo aire a 0,35 1/min. Se reguló la DO al 20 % mediante el control en cascada en aireación y la velocidad de agitación.

Tras 20 horas, el medio de cultivo presentó un color rojo intenso, lo que indicaba la presencia de carotenoides en dicho medio de cultivo.

Esta experimentación confirma que las bacterias Deinococcus pueden producir una cantidad significativa de carotenoides. Además, la biomasa de Deinococcus proporciona más metionina que el extracto de levadura cuando las células están en fase de crecimiento exponencial, y la metionina es un aminoácido esencial para las células animales, siendo también necesaria para el crecimiento de los peces.

Condiciones de cultivo que permiten una expansión sustancial Se cultivó la cepa de Deinococcus geothermalis MX6-1E-14 en 1 1 de medio de CMG al 10 % (según lo descrito en el Ejemplo 4) que contenía 20 g/1 de glucosa en un fermentador de 1 1 a 45 °C. En esas condiciones de cultivo, la densidad óptica a 600 nm (D06oonm) alcanza el valor de 20 en 40 horas (siendo la tasa de crecimiento específico de 0,5 h"1) , indicando una fuerte expansión de las células.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un ingrediente para piensos que comprende una mezcla de biomasa y una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada con Deinococcus, estando dicha biomasa al menos parcialmente digerida por dicha bacteria Deinococcus o bacteria emparentada .

2. El ingrediente para piensos de la reivindicación 1, en el que la biomasa comprende biomasa lignocelulosica.

3. El ingrediente para piensos de la reivindicación 2, en el que la biomasa lignocelulosica está seleccionada del grupo que comprende granos de cereal tales como grano de trigo, torta forrajera vegetal, tal como tortas forrajeras de colza y soja, caña de azúcar y derivados de la misma, maiz, remolacha azucarera, miscanto, pasto varilla, cáñamo, álamo, sauce, sorgo, y especies arbóreas que varían desde el eucalipto hasta la palmera de aceite.

4. El ingrediente para piensos de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la biomasa comprende proteínas que están al menos parcialmente hidrolizadas por dicha bacteria Deinococcus o bacteria emparentada.

5. El ingrediente para piensos de la reivindicación 4, en el que la biomasa que comprende proteínas está seleccionada de entre pulpa de remolacha, soja, alfalfa y plumas de pollo.

6. Una composición de pienso que comprende el ingrediente de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Uso de una mezcla de biomasa y bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, estando dicha biomasa digerida al menos parcialmente por dichas bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, como aporte de proteínas para el pienso .

8. Uso de la reivindicación 7, en el que la biomasa comprende biomasa lignocelulósica .

9. Uso de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la biomasa comprende proteínas.

10. Un método para la preparación de un pienso que comprende someter una biomasa a la digestión al menos parcial realizada por las bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas, para obtener una mezcla, y formular dicha mezcla como ingrediente para el pienso.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la biomasa comprende biomasa lignocelulósica seleccionada del grupo que comprende granos de cereal tales como grano de trigo, torta forrajera vegetal, tal como torta forrajera de colza y torta forrajera de soja, caña de azúcar y derivados de la misma, maíz, remolacha azucarera, miscanto, pasto varilla, cáñamo, álamo, sauce, sorgo, y especies arbóreas que varían desde el eucalipto hasta la palmera de aceite.

12. El método de las reivindicaciones 10 u 11, en el que la biomasa comprende proteínas y está seleccionada preferentemente de entre pulpa de remolacha, soja, alfalfa y plumas de pollo.

13. Un método para mejorar 1 valor nutritivo de una biomasa, que comprende someter icha biomasa a la digestión al menos parcial realizada pe una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende además permitir el crecimiento de bacterias Deinococcus o bacterias emparentadas en dicha biomasa.

15. Un método para mejorar la palatabilidad y/o la digestibilidad de una biomasa, que comprende someter dicha biomasa a la digestión al menos parcial por una bacteria Deinococcus o bacteria emparentada para degradar al menos parcialmente el azúcar complejo de dicha biomasa.

16. El uso de una bacteria Deinococcus para la alimentación animal .

17. El uso de una bacteria Deinococcus como fuente de aminoácidos para la alimentación animal.

18. El uso de una mezcla de bacterias Deinococcus y una biomasa para la alimentación animal.