CN104135868B - 用于动物饲料组合物的成分 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增强动物生长和/或动物健康的动物饲料组合物的成分。本发明还涉及用于生产这样的成分和饲料组合物的方法。本发明的方法还允许改善饲料组合物的可口性和/或消化性。更具体地，本发明描述了异常球菌(Deinococcus)或相关细菌和生物质的混合物作为饲料组合物中的有机组分的供应源的用途。

Description

用于动物饲料组合物的成分
发明领域
本发明涉及用于增强动物生长和/或动物健康的动物饲料组合物(animal feedcomposition)的成分(配料，ingredient)。本发明还涉及用于生产这样的成分的方法以及饲料组合物。本发明的方法还允许改善饲料组合物的可口性和/或消化性。更具体地，本发明描述了异常球菌(Deinococcus)或相关细菌和生物质的混合物作为饲料组合物中的有机组分的来源的用途。
发明背景
家畜如宠物、牛、绵羊、猪、家禽、鱼(包括经济鱼类和观赏鱼)、虾(schrimp)和其他甲壳类的饲养在动物育种和农业食物工业领域一直是个问题。因为有限的生产设施和缺乏生产技术方面的改进，动物育种成本高且费时。为了改善生产和动物育种的盈利性，最常见的解决方案是提供工业饲料组合物，至少是完善动物的饮食。
尽管饲料没有恒定组成，但是需要多种组分来满足营养目的。事实上，即使对饲料的生物学反应依赖于动物从所述饲料获得有用营养物的能力，饲养中使用的饲料一般包含可消化蛋白质、脂质、糖类和纤维。
动物饲料组合物通常以低成本配方配制。特别重要的是可消化能量的有限供应和相关成本。最昂贵营养物是蛋白质和氨基酸，包括必需氨基酸。然而，含有大比例蛋白质的动物的生产必需与世界人口增长成比例。
已开发了使用鱼粉或肉骨粉作为蛋白质原料，这是由于其低成本。事实上，肉骨粉是炼油工业(rendering industry)的产品，其包含约50％蛋白质和8-12％脂肪。其最初用于动物饲料的配方中以改善饲料的氨基酸分布。然而，作为用于牛的蛋白质的骨粉的饲养被认为是造成疯牛病传播的原因。因此，在世界的大部分地区，使用骨粉作为蛋白质供应不再允许用于反刍动物的饲料中。
用于制备反刍动物的饲料组合物的另一种原料是纤维质材料，其廉价且不是直接有价值材料。然而，即使反刍动物中的酶允许降解纤维素，但进行多种处理以部分地水解纤维素和半纤维素以便有助于通过反刍动物的进一步降解并且增强这种原料的消化性。例如，将各种外源酶如纤维素酶和半纤维素酶添加至包含纤维质材料的饲料中可用于降低高分子结晶并且增大对高分子主链的接近。以相同方式，纤维质材料的热化学预处理也有可能部分地水解半纤维素和纤维素部分。
尽管这些处理改善糖消化性并且更通常地纤维质材料的营养成分的生物利用度，但是它们可能是昂贵的和经济上禁止的。另外，即使预处理后，纤维质材料仍然是不可消化的并因此不能对反刍动物如猪和家禽提供营养。此外，这些处理不提供蛋白质，其是动物饲料组合物中的最昂贵组分。
因此，需要用于经济农场和观赏动物，包括反刍动物和非反刍动物、经济鱼类和甲壳类水产养殖，以及宠物的较不昂贵的、更安全的且更营养的食物。
发明内容
本发明涉及异常球菌或相关细菌和生物质如动物和/或植物和/或藻类生物质的混合物，及其在动物饲养中的用途，例如，作为动物饲料组合物的一部分。本发明还涉及使用生物质和异常球菌或相关细菌作为给料制备饲料的方法。本发明还涉及用于增加生物质的营养价值、可口性或消化性的方法。本发明的组合物和方法适用于任何动物的营养，包括优选的家畜(包括反刍动物和非反刍动物)、育种动物、鸟类动物、鱼类或伴侣动物。
本发明的发明人已发现，异常球菌或相关细菌联合非可用原料如木质纤维素生物质，可以用作用于动物的安全且低成本营养物。两种成分合作而产生高价值饲料。生物质和异常球菌细菌都通过本发明从低营养价值产品转化为有用的饲料成分。本发明表明，异常球菌细菌可以用于饲料中，是安全的并且含有有价值的营养剂。本发明还表明，生物质用作用于异常球菌细菌的生长介质，由此允许它们的扩增和富集，同时异常球菌细菌能够消化生物质，由此将生物质转化为具有更好消化性的高营养价值产品。因此，根据本发明的饲料成分包括有机(例如，蛋白质，氨基酸和糖类)和无机化合物(例如，矿物质)，其在动物和鱼类的正常代谢中被利用，并且提供不是足量合成或不合成的必需营养物如必需氨基酸。
因此，本发明的目的涉及包含生物质和异常球菌或相关细菌的混合物的用于饲料的成分，所述生物质至少部分地被所述异常球菌或相关细菌消化。
本发明还涉及生物质和异常球菌或相关细菌的混合物用于制备饲料的用途。
本发明还涉及包含如上所述的成分的饲料组合物。通常，饲料组合物包含至少10％重量的所述成分。饲料组合物可以进一步包含另外的成分，如但不限于苜蓿、大麦、血粉/肉粉、肥胖动物粉(fat animal poultry)、马铃薯废物或西红柿废物。
本发明的另一个目的涉及用于动物饲养的包含生物质和异常球菌或相关细菌的组合物的用途。
本发明的另一个目的涉及生物质和异常球菌或相关细菌的混合物作为用于饲料的成分的用途，所述生物质至少部分地被所述异常球菌或相关细菌消化。
本发明的另一个目的涉及生物质和异常球菌或相关细菌的混合物作为用于饲料的蛋白质供应(protein supply)的用途，所述生物质至少部分地被所述异常球菌或相关细菌消化。如实施例中进一步说明的，异常球菌细菌本身是蛋白质的高度来源，另外，它们水解生物质的蛋白质，因此提供可利用的氨基酸。
本发明还涉及异常球菌作为用于动物饲养的氨基酸的来源的用途。
本发明还涉及用于制备饲料的方法，包括：
-使生物质至少部分地经受被异常球菌或相关细菌的消化，和
-配制至少部分被消化的生物质和细菌的混合物作为用于饲料的成分。
在一个特别的实施方式中，所述方法包括向混合物中添加常用于饲料的其他成分的另外步骤。
在一个替代实施方式中，所述方法包括：
(a)组合生物质和异常球菌或相关细菌以获得混合物，
(b)在允许生物质被所述异常球菌或相关细菌消化的条件下保持所述混合物，
(c)收集(a)或(b)的混合物，和
(d)可选地将(c)的混合物混合至一种或多种另外的成分。
所述饲料可以包装在任何合适的形式或容器中。
用于本发明的生物质可以包括植物生物质、动物生物质和/或藻类生物质。在特别的实施方式中，生物质是木质纤维素生物质。在另一个实施方式中，生物质是含蛋白质生物质。生物质的消化可以在好氧或厌氧条件下，优选在反应器中进行，以易于管理反应参数(例如，反应时间，温度，进料量)。
本发明还涉及用于改善生物质的营养价值的方法，包括使所述生物质至少部分地被异常球菌或相关细菌消化。所述方法可以进一步包括这样的步骤，其中分析或控制所述至少部分被消化/水解的生物质的营养价值。
本发明的另一个目的涉及用于改善生物质的可口性和/或消化性的方法，包括使所述生物质经过至少部分被异常球菌或相关细菌消化，以便至少部分地降解所述生物的复合糖。所述方法可以进一步包括这样的步骤，其中控制复合糖的降解。
本发明的组合物和方法可以用作用于任何动物，尤其是非人动物如家畜(包括反刍动物和非反刍动物)、饲养动物或伴侣动物、禽类动物或鱼类的营养物或营养补充剂。
附图说明
图1：在有或没有添加纤维素酶和β-葡糖苷酶下，菌株DG01(中度嗜热菌01(D.Geothermalis 01))在1％预处理的油菜秸秆上的生长。
图2：TLC分析，其显示从用DG01接种的1％预处理的油菜秸秆移出的木糖和葡萄糖的消耗。对照由没有细菌的预处理的油菜秸秆构成。在T0将酶添加到培养物中(0.11g纤维素酶/g纤维素和0.05gβ-葡糖苷酶/g纤维素)。使用1.1g纤维素酶/g纤维素、0.5gβ-葡糖苷酶/g纤维素和5.5g木聚糖酶/g半纤维素进行总的酶水解。
图3：菌株DG01在全麦(1％，有或没有Termamyl(淀粉酶)下，和6％)或发酵残渣(6％)上的生长，其显示培养基中所含谷朊的消耗(％)。菌株DG01能够水解来自全麦或发酵残渣的谷朊。
具体实施方式
本发明总体上涉及异常球菌或相关细菌菌株用于利用生物质生产动物饲料或添加剂的用途。更具体地，基于异常球菌细菌的生长和生物质的降解/转化，本发明提供对于蛋白质和氨基酸的低成本且高水平供应。根据本方面的异常球菌或相关细菌和生物质的混合物可以用于向动物提供生物质中含有的有价值的单和二酸或来源于这些单或二酸、来源于糖类如木聚糖或半纤维素水解物的任何代谢物的低成本和/或高水平来源。根据本发明，未加工的生物学起源的材料，包括植物、藻类或动物生物质，或二次生物质(secondarybiomass)，其基本上含有水解的预处理生物质产品，可以与异常球菌细菌组合用作有营养/营养给料、动物饲料或添加剂。
因此，本发明的目的是提供包含生物质和异常球菌细菌的混合物的用于饲料的成分，所述生物质至少部分被异常球菌消化。
本发明的另一个目的是包含生物质和异常球菌或相关细菌的组合物用于动物饲养的用途。
定义
根据本发明，术语“生物质”通常是指任何生物材料。特别地，术语生物质包括生物起源的有机材料，包括植物、藻类或动物起源，其可以是未加工的或预处理的。生物质的实例包括但不限于林业产品，包括不适用于木材或纸张生产的成熟树木、纸浆、循环纸、有机废物，农业产品，如草、秸秆、农作物和动物粪便，以及水产品，如藻类和海草。生物质的实例包括来源于许多种类植物的木头或植物材料，包括芒草、大麻、柳枝稷、糖用甜菜、小麦、大麦、玉米、水稻、大豆、油菜籽(包括加拿大油菜(canola))、高粱、甘蔗、花生、棉花、羽扇豆，以及各种各样的树物种，范围为桉树至油棕、白杨、柳树。生物质的具体来源包括但不限于植物残渣、硬木或软木茎干、玉米棒、秸秆、草、叶子、种子、纸张等(参见例如Sun等,Bioresource Technology 83(2002)1–11)。术语生物质还涵盖转化的生物质或二次生物质，其基本上含有水解的预处理生物质产品。在一个优选实施方式中，根据本发明，生物质包括任何木质纤维素材料，例如，纤维素、半纤维素和/或木聚糖。
根据本发明，生物质可以包括原料生物质(raw biomass)和/或二次生物质。“原料生物质”是来自生物物质的未加工材料。实例包括但不限于林业产品,如不适用于木材或纸张生产的成熟树木，农业产品，如草类、农作物和动物粪便，以及水产品，如藻类和海草。“二次生物质”是最初来源于原料生物质的任何材料，其经过显著的化学和物理变化。实例包括但不限于纸张、皮革、棉花、大麻、天然橡胶产品、食物加工副产品、鱼类和动物粉，以及用过的烹调油。
根据本发明，术语“木质纤维素生物质”是指含有木质素、纤维素、半纤维素和/或木聚糖的有机生物材料。术语木质纤维素生物质通常是指生物起源的未加工材料，例如原料生物质。木质纤维素生物质的实例包括但不限于来源于许多类型的植物的木头或植物材料，包括芒草、油菜籽、柳枝稷、大麻、糖用甜菜、小麦、小麦秸秆、玉米、白杨、柳树、高粱、甘蔗，以及各种各样的树物种，范围为桉树至油棕。
如本文中使用的，术语“生物质衍生物”是指来源于如上所定义的原料生物质和/或二次生物质的所有分子。
在本申请的上下文中，术语“异常球菌细菌”包括野生型细菌、或异常球菌的天然变异菌株，例如，经过加速进化，通过DNA改组技术获得的菌株，以及通过插入真核、原核和/或合成核酸获得的重组菌株。
与异常球菌“相关”的细菌是指这样的细节，其(i)含有16SrDNA，在利用引物GTTACCCGGAATCACTGGGCGTA(SEQ ID NO:1)和GGTATCTACGCATTCCACCGCTA(SEQ ID NO:2)扩增后，其产生约158个碱基对的片段和/或(ii)抵抗4mJ/cm2的UV处理。在一个特别的实施方式中，异常球菌-相关细菌是具有16S rDNA分子的细菌，其在序列上至少70％,优选至少80％与异常球菌16S rDNA序列相同。
在本发明的上下文中，“蛋白质”是指包含键接在一起的氨基酸的一个或多个聚合物链的所有生物化学化合物。本发明的蛋白质供应包括蛋白质、肽、多肽、氨基酸和相关衍生物。
在本发明的上下文中，“外源组分”，如“外源蛋白质”是指起源于生物质或培养基的组分，并且反过来，“内源组分”是指起源于细菌的组分。
在本发明的上下文中，“淀粉”是指由通过1-4和1-6糖苷键结合在一起的大量葡萄糖单元构成的碳水化合物。淀粉是由许多植物和细菌积累的能量储存分子，并且淀粉分子将它们自身以半结晶颗粒排布在植物中。
生物质被细菌消化以生产高价值饲料
本发明尤其是基于生物质和异常球菌或相关细菌的组合，其合作而产生适用于饲料的高营养价值和高消化性产品。本发明表明生物质支持细菌的生长和扩增，增加混合物的营养价值，同时细菌能够消化生物质，进一步增加所述混合物的营养价值、消化性和美味。
根据本发明，生物质可以至少部分被异常球菌和/或相关细菌消化。
术语消化的或消化包括生物质的所有生物学改性或转化，如生物质的组分如原料、细胞壁、聚合物(例如糖，蛋白质)等的降解或水解。消化可以是部分的，意思是仅生物质的一些组分的一部分被消化，通常为5％、10％或更多。部分消化是指至少生物质的一部分已被改性或转化，其通常导致增加的营养价值、消化性或可口性。
异常球菌或相关细菌可以有利地催化(或有助于催化)生物质的各种组分，例如糖高分子如淀粉、木聚糖或纤维素降解成较小聚合度的寡糖和单糖。事实上，表达特定酶和/或具有转化原料生物质的能力的异常球菌细菌已由声请人在本领域予以公开。在这方面，优选用于本发明的异常球菌细菌合成木聚糖酶和/或纤维素酶和/或淀粉酶。木聚糖酶是这样的酶，其催化作为硬木和软木半纤维的主要组分的木聚糖的水解。淀粉酶参与淀粉高分子的水解。纤维素酶是这样的酶，其催化作为硬木和软木的主要成分的纤维素或半纤维素的水解。
在一个特别的实施方式中，生物质的消化是指生物质的纤维素或半纤维素水平降低，优选降低至少5％。这样的减少促进生物质被所有种类的动物包括非反刍动物的消化性。
在一个优选实施方式中，生物质的消化是指来自所述生物质的半纤维素转化为较小的寡糖和/或木糖、甘露糖、阿拉伯糖或半乳糖，和/或来自所述生物质的纤维素和/或淀粉转化为葡萄糖。优选地，消化涵盖来自所述生物质的至少5％半纤维素、纤维素或淀粉的转化。
这样的糖类的至少部分消化改善生物质的消化性和/或可口性，因为C5糖如木糖(其引起基质没有食欲)被异常球菌消化(Br J nutr.2010May；103(10):1507-13)。
在另一个实施方式中，消化包括细胞的糖氧化，特别包括DP3-DP7糖(DP：聚合度)，例如：三糖，四糖，戊糖，己糖和庚糖，例如选自木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖或果糖残基作为单体。
在生物质降解/消化的同时，细菌的生长增加。因此，由于细菌水平在混合物内部增大，所以蛋白质和脂质的水平也增加。那么，根据本发明，生物质，即使是不可消化的生物质如麦豆或油菜籽牛用饼，被异常球菌或相关细菌的消化，为动物提供高水平的直接滋养组分。本发明允许利用大多数若干由于其消化性和/或低水平营养物而不用于动物饲养的植物生物质。例如对于相比于大豆牛用饼含有一定水平的蛋白质的油菜籽牛用饼的情形。这样的生物质包含1至6g/l植物蛋白质并且没有大量的脂质。根据本发明，在所述生物质被异常球菌或相关细菌部分消化后，可以预期约12至25g/l蛋白质和约1至2.5g/l脂质。以相同方式，没有工业兴趣的若干动物生物质如家禽羽毛可以被有利地用作要与异常球菌混合的生物质以提供动物饲料成分。
另外，由于异常球菌属产生天然类胡萝卜素，所以本发明的混合物生物质/异常球菌可以含有类胡萝卜素，其对视觉和味觉质量以及用所述混合物喂养的动物的健康都具有积极影响。例如，基于没有任何类胡萝卜素的植物生物质，在植物生物质消化和细菌生长后，可以预期混合物中的约15mg/kg类胡萝卜素。
由异常球菌产生或合成并且在混合物中回收的蛋白质、氨基酸、脂质、维生素、类胡萝卜素等的最终量将取决于若干工业参数，如反应的性质和条件，反应时间、细菌的初始量和使用的生物质种类。对于本领域技术人员明显的是，可以进行各种改变以使本发明的方法适应需要。
例如，生物质的消化水平可以根据工业/经济和/或营养要求变化。如果高水平的营养组分优选为低成本生产，则反应时间可以增加以允许生物质的完全消化。在最终混合物中，可以预期缺乏植物部分，细菌几乎全部消化了生物质。相反，低成本成分，在最低水平的蛋白质下，可以是所需的。反应时间和营养组分水平之间的平衡可以容易地改变。
本发明的混合物或最终混合物，包含剩余的生物质(没有被细菌水解/消化的生物质部分)和异常球菌或相关细菌，其数量增加。
在本发明的一个实施方式中，使用的异常球菌或相关细菌呈现蛋白质分解活性，特别可用于指示部分水解生物质中所含的蛋白质。
蛋白质酶，也称为蛋白酶或解蛋白质酶，是这样的酶，其通过水解在多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键而开始蛋白质代谢。
本发明的发明人已发现，异常球菌或相关细菌可以呈现高蛋白质分解活性。根据本发明，具有蛋白质分解活性的异常球菌或相关细菌可以有利地联合若干含有蛋白质的植物、藻类或动物生物质使用以提供高度可消化氨基酸。所述细菌水解蛋白质，提供容易被动物吸收的氨基酸和肽。所得混合物可以用作用于饲料组合物的成分，其提供外源氨基酸(和/或肽)和内源营养物(来自细菌本身)，包括蛋白质和氨基酸。
例如，异常球菌细菌可以与藻类如微芒藻(Micratinium pusilum)和/或小球藻属(Chlorella sp)接触以使所得混合物可以代替鱼粉用作用于含有有用氨基酸的饲料的成分。
含有蛋白质的生物质的其他实例包括甜菜浆、大豆、苜蓿和鸡毛。
使用异常球菌或相关细菌也可以降低生物质(植物，动物或藻类)的粘度，其代表另外的优点。事实上，异常球菌或相关细菌的蛋白质分解活性降低含明胶生物质的粘度。而且，异常球菌或相关细菌的蛋白质分解活性降低降低含果胶生物质的粘度。
本发明的发明人已发现，异常球菌或相关细菌可以呈现高果胶分解活性。根据本发明，合成果胶酶的异常球菌或相关细菌可以有利地联合含有果胶的生物质使用以降低其粘度并由此增加其可口性。所述细菌水解果胶，消除生物质的粘性。这样的粘性生物质可以用作用于异常球菌或相关细菌的生长介质，并且所得混合物可以用作用于饲料的成分。
在本发明的一个特别实施方式中，用于饲料的混合物中使用的异常球菌或相关细菌因此呈现果胶分解活性，特别可用于至少部分地水解一些粘性生物质中含有的果胶。
其是例如含有高水平果胶(15至20％重量)的甜菜浆的情形。甜菜浆是由于果胶使得这种生物质为粘性的而不易于可利用的给料。不可能用这样的粘性生物质直接喂养动物并且其变成愉快的饲料需要高成本处理。
在一个实施方式中，粘性生物质金属混合物的生物质的一部分。例如，所使用的生物质包含60％的木质纤维素生物质,如油菜籽牛用饼，和40％的粘性生物质,如甜菜浆。
用于制备混合物的工艺
生物质由异常球菌或相关细菌的消化可以有利地在反应器中进行，以易于管理反应参数。取决于所使用的细菌的菌株和/或生物质，反应可以在好氧或厌氧反应器中进行。
在一个实施方式中，生物质连同细菌一次引入。在另一个实施方式中，反应器可以在工艺期间再装入生物质或细菌。在这样的情况下，生物质的性质和量可以变化以改善最终混合物中营养物的最终含量。最终混合物包含剩余的生物质(其还没有被水解/消化)、由消化/水解(除非被细菌消耗)产生的产物，以及还没有扩增的细菌。
在反应器内添加的液体量可以取决于最终组合物的形式，即液体或固体形式，以及取决于生物质的水分含量。
在另一个实施方式中，本发明的混合物的制备在空旷地区进行。例如，生物质和异常球菌或相关细菌首先混合在一起，然后铺展到土壤上。这种初始混合物可以用粗帆布覆盖或者相反地所述混合物置于新鲜空气中。
根据本发明，所述混合物可以直接用作动物饲料组合物的一部分。其他方面，所述混合物可以在使用之前加工(例如脱水、过滤、干燥、研磨等)。在另一个实施方式中，所述混合物进行处理以杀灭或使细菌失活，或消除剩余原料生物质。所得产物基本上包含细菌和消化的生物质组分，并且可以用作直接蛋白质和脂质原料。
根据本发明的生物质和异常球菌或相关细菌的混合物可以用作动物饲料组合物中的成分。如本文使用的，动物饲料组合物是用于动物滋养的组合物，为固体或液态形式。所述饲料可以定义为具有足够营养价值的物质以允许动物的足够身体条件的生长和保持。例如，动物饲料组合物可以为团粒、粉、颗粒、挤出或膨化颗粒、片粉末、丸子形式或其混合物。
优先地，本发明的动物饲料组合物，包括细菌和生物质的混合物，为由政府机构如国家食品管理局(例如法国的AFSSA，加拿大的ACIA或美国的FAD)批准的形式和/或组成。
在一个优选实施方式中，本发明的动物饲料组合物包含至少10％重量的异常球菌或相关细菌的混合物和至少部分消化/水解生物质。取决于用来形成动物饲料组合物的其他成分，以及它们对形成(粒化)后的饲料的物流质量和所需的营养质量的影响，本发明的混合物的水平可以增大或降低。例如，为了获得在硬度和持久性方面具有良好质量标准的团粒，可以添加约40％量的预凝胶化淀粉。如果使用天然淀粉，所需的量可以更高。以相同方式，可分散蛋白质的量也可以正面影响粒化饲料的硬度和持久性性能。
在这方面，本发明还涉及一种用于制备饲料的方法，包括：
-使生物质经过至少部分被异常球菌或相关细菌消化，和
-配制至少部分被消化的生物质和细菌的混合物作为用于饲料的成分。
在一个特定实施方式中，所述方法包括向所述混合物中添加通常用于饲料的其他成分的另外步骤。
在一个可替换实施方式中，所述方法包括：
(a)组合生物质和异常球菌或相关细菌以获得混合物，
(b)在允许生物质被所述异常球菌或相关细菌消化的条件下保持混合物，
(c)收集(a)或(b)的混合物，和
(d)任选地将(c)的混合物与一种或多种另外的成分混合。
饲料可以包装在任何合适形式或容器中。
在混合物中，可以使用异常球菌或相关细菌的一个物种或菌株，或组合各种菌株，或异常球菌细菌的相同或不同物种。而且，除了异常球菌或相关细菌，如果合适，混合物或饲料产品可以包含另外的细菌或酵母细胞。此外，另外的试剂如酶可以添加到生物质中。
如所指出的，本发明可以用来生产适合用于任何非人动物的饲料或饲料添加剂。特别适用于家畜(包括反刍动物和非反刍动物)、育种动物、禽类动物、鱼类或伴侣动物。具体事例包括牛、羊、猪、家禽、鱼、虾和甲壳类动物。
本发明的其他方面和优点将在以下实验部分公开，其应被视为本发明的举例说明。
实施例
实施例1：具有生物质降解活性的嗜中温和嗜热异常球菌菌株的鉴别
这个实施例公开了适用于确定一个属、种和/或细菌菌株是否能够在根据本发明的制备饲料的方法中起作用的试验。可以进行以鉴别表现出特定酶活性的细菌的试验的非限制性实例描述如下。
材料和方法
复合介质葡萄糖(CMG)1％组合物
蛋白胨:2g/L
酵母膏:5g/L
高压灭菌121℃,15min.
葡萄糖:10g/L-过滤消毒(0.22μm)
然后加入MOPS、微量营养物、维生素、FeCl3、K2HPO4(参见以下)
介质组合物(MM)
14g/L琼脂加入到704ml超纯水中。然后进行高压灭菌。然后，在介质冷却后，加入80ml的MOPS 10X、8ml的FeCl3100X、8ml的K2HPO4100X、80μL的微量营养物10000X、和80μL的维生素10000X。
用于纤维素分解活性的固体筛选的介质组合物(5％AZO-纤维素)
14g/L琼脂加入到704ml超纯水中。然后进行高压灭菌。然后，在介质冷却后，加入80ml的MOPS 10X、8ml的FeCl3100X、8ml的K2HPO4100X、80μL的微量营养物10000X、和80μL的维生素10000X。
最后，加入5％的AZO-纤维素溶液。
用于蛋白质分解活性的固体筛选的介质组合物(1％乳液)
10g/L奶粉和14g/L琼脂加入到704ml超纯水中。然后进行高压灭菌。然后，在介质冷却后，加入80ml的MOPS 10X、8ml的FeCl3100X、8ml的K2HPO4100X、80μL的微量营养物10000X、和80μL的维生素10000X。
用于淀粉分解活性的固体筛选的介质组合物(0.5％淀粉)
5g/L淀粉和14g/L琼脂加入到704ml超纯水中。然后进行高压灭菌。然后，在介质冷却后，加入80ml的MOPS 10X、8ml的FeCl3100X、8ml的K2HPO4100X、80μL的微量营养物10000X、和80μL的维生素10000X。
用于木聚糖分解活性的固体筛选的介质组合物(5％AZO-木聚糖)
14g/L琼脂加入到704ml超纯水中。然后进行高压灭菌。然后，在介质冷却后，加入80ml的MOPS 10X、8ml的FeCl3100X、8ml的K2HPO4100X、80μL的微量营养物10000X、和80μL的维生素10000X。
最后，加入5％的AZO-木聚糖溶液。
MOPS-缓冲混合物10X，pH7.0
过滤消毒(0.22μm)
微量营养物10000X
用HCl调节至pH 5。
过滤消毒(0.22μm)
维生素10000X
各自10mg/L：D-生物素，Niacin(烟酸)，Pyridoxin(吡哆醛盐酸盐)B6,Thiamin(维生素B1盐酸盐)–原料pH4–过滤消毒(0.22μm)。
FeCl3100X
2mM FeCl3，在2mM柠檬酸钠中，过滤消毒(0.22μm)
K 2 HPO 4 100X
100g/L,高压灭菌。
酶活性的检测
纤维素分解活性的检测
固体筛选(琼脂板上试验)
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物在含有MM和5％AZO-纤维素的琼脂板上形成斑点。
纤维素分解酶活性在1天、2天和5天后通过测量水解晕轮直径跟踪(需要1个板/天)。
液体筛选
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物加入到在微板中的200μl MM+1％CMC或1％CMC4M或1％纤维二糖。
纤维素分解活性通过跟踪在OD600nm的生长进行评估(每天读数两次，持续5天)。
蛋白质分解活性的检测
固体筛选(琼脂板上试验)
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物在含有MM和1％奶的琼脂板上形成斑点。
蛋白质分解酶活性通过在1天、2天和5天后测量水解晕轮直径跟踪(需要1个板/天)。
液体筛选
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物添加到在微板中的200μl MM+1％蛋白胨或1％酪蛋白。
蛋白质分解酶活性通过跟踪在OD600nm的生长进行评估(每天读数两次，持续5天)。
淀粉分解活性的检测
固体筛选(琼脂板上试验)
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物在含有MM和0.5％奶粉的琼脂板上形成斑点。
淀粉分解酶活性通过在1天、2天和5天后测量水解晕轮直径跟踪(需要1个板/天)。
在含淀粉的琼脂板上，通过加入革兰氏碘试剂进行水解晕轮揭示(也需要1个板/天)。
液体筛选
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物添加到在微板中的200μl MM+0.5％淀粉。
淀粉分解酶活性通过根据在OD600nm的生长进行评估(每天读数两次，持续5天)。
木聚糖分解活性的检测
固体筛选(琼脂板上试验)
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物在含有MM和5％AZO-木聚糖的琼脂板上形成斑点。
木聚糖分解酶活性通过在1天、2天和5天后测量水解晕轮直径跟踪(需要1个板/天)。
液体筛选
使用分离的克隆体在微板中在CMG 1％介质中进行预培养(5个克隆体，在200μL的CMG 1％介质中)。
从固定相，将5μL的预培养物添加到在微板中的200μl MM+0.5％木聚糖。
木聚糖分解酶活性通过跟踪在OD600nm的生长进行评估(每天读数两次，持续5天)。
结果
表1(以下)列出了利用固体筛选试验鉴别的并且具有用于饲料生产的适当生物质-消化活性的细菌的实例。
水解晕轮直径对于蛋白质分解和淀粉分解活性在2天后测量，并且对于木聚糖分解和纤维素分解活性在5天后测量。
更准确地，对于蛋白质分解活性，高活性对应于高于2.4cm的水解晕轮直径，中度活性对应于在2cm至2.35cm的水解晕轮直径，并且低活性对应于低于1.95cm的水解晕轮直径。
对于淀粉分解活性，高活性对应于高于2.4cm的水解晕轮直径，中度活性对应于在2.1cm至2.35cm的水解晕轮直径，并且低活性对应于低于1.9cm的水解晕轮直径。
对于木聚糖分解活性，高活性对应于高于2.8cm的水解晕轮直径，中度活性对应于在2.1cm至2.7cm的水解晕轮直径，并且低活性对应于低于2.05cm的水解晕轮直径。
对于纤维素分解活性，高活性对应于高于1.6cm的水解晕轮直径，中度活性对应于在1.1cm至1.35cm的水解晕轮直径，并且低活性对应于低于0.9cm的水解晕轮直径。
表1：具有纤维素分解、蛋白质分解、淀粉分解和/或木聚糖分解活性的异常球菌菌株的列表(固体筛选)
(+++):高活性
(++):中度活性
(+):低活性
(-)无活性
表2(以下)列出了利用液体筛选试验鉴别且对于生产饲料具有可变酶活性的细菌的实例。细菌的生长通过测量在600nm的OD跟踪。
表2：具有纤维素分解、蛋白质分解、淀粉分解和/或木聚糖分解活性的异常球菌菌株的列表(液体筛选)
(+):良好生长(OD600nm≥0.5)
(-):低或无生长(OD600nm<0.5).
这个实施例显示，具有适当生物活性的细菌可以选自公共保藏中心，并且在本发明中使用来生产饲料。
实施例2:油菜秸秆-异常球菌混合物的生产
制备了油菜秸秆和异常球菌细菌的混合物。更具体地，1％预处理的油菜秸秆与异常球菌细菌(例如，菌株DG01)接触。混合物生产用于食物的有价值混合物的能力通过验证异常球菌扩增和消化油菜秸秆(单独或在酶补充后)以及产生高营养含量的能力确定。
材料和方法
油菜秸秆
油菜秸秆获自Sofiproteol并且在混合机中磨碎，然后通过网筛以获得细部分，长度小于1mm。
纤维素酶和β-葡糖苷酶
使用的商业酶是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶(SIGMAref.C8546-5KU)和来自杏树的β-葡糖苷酶(SIGMA ref.49290-1G)。
H 2 SO 4 水热预处理
在具有20％w/v油菜秸秆和在自来水中的0.5％w/w H2SO4的艾伦烧瓶(erlenflask)中进行预处理。这种混合物在120℃高压灭菌10min(周期时间:1.5h)，然后用无菌自来水稀释以获得最终油菜秸秆浓度。用20M NaOH溶液将pH调节至7(用pH纸检查)。在接种前加入无机溶液：20mM NH4Cl和5.7mM K2HPO4。
计数协议
-在Ependorff 2ml中取1mL的均匀培养物(CMG，技术基质)
-涡旋10s，然后在超声浴中施加超声波达10分钟，并再涡旋10s。
在96-孔微板中:
-将180μL的无菌MilliQ水分配在9个孔中，一式三份
-一式三份:进行从第1号孔(对应于纯样品)至第10号孔(对应于稀释10-9)的1/10系列稀释：取20μL并将其置于来自以下孔的180μL无菌milliQ水中，混合并反向移液三次。每个孔之间改变圆锥。
-利用多通道移液管，在PGY-琼脂板上形成斑点(pot)，5μL各个稀释液，一式两份。
-在45℃温育2天(对于嗜热异常球菌)
-在第一可计数稀释液上计数克隆体的数量：
对通过稀释因子校正的六个斑点平均并乘以200而得到CFU/mL的数量。
TLC协议
-将5μl的样品在TLC硅胶中形成斑点。
-用热气喷枪干燥形成斑点的样品。
-TLC在溶剂丁醇/丙酮/H2O-4/5/1溶剂中的迁移
-在迁移结束时，用热气喷枪干燥TLC。
-使用含有12g钼酸铵+0.5g硝酸铈铵在80ml的H2SO410％中的溶液揭示TLC。
酶水解和培养
对于DG01，将酶添加到培养基中以将高分子水解为糖单体。
油菜秸秆含有40％纤维素。酶加载为0.11g纤维素酶/g纤维素和0.05gβ-葡糖苷酶/g纤维素。在引入到培养物之前酶溶液通过0.22微米过滤。
在CMG 1％中进行预培养3天。细胞颗粒在无菌水中洗涤三次，然后用于以0.2的DOi，即≈107CFU/mL接种培养基。
对于DRH46在30℃而对于DG01在45℃进行生长9天。
通过根据以下协议计数细菌来控制生长。
结果
DG01的生长通过计数(UFC/ml)跟踪(图1)并且糖类的消耗使用TLC分析进行评估(图2)。
在9天后，所有游离的葡萄糖和木糖被DG01wt消耗。当这种消耗对总糖报告时，看起来大部分的葡萄糖和木糖被消耗。这些结果因此表明，所述混合物包含部分消化的生物质，具有降低的木糖含量。
利用如表1所列的其他异常球菌如DRH01、DRH02、DRH03或DRH46获得类似的结果。
将培养物冻干并且氨基酸组成、可溶氮和NDF/ADF/ADL纤维确定在干物质上进行。
以下表3比较了油菜秸秆的氨基酸组成(g/kg干物质)与本发明的混合物的氨基酸组成(g/kg干物质)。
结果表明，本发明的混合物包含比初始油菜秸秆多至少20倍的氨基酸。
表3：所述混合物和油菜秸秆的氨基酸组成
因此本发明的混合物将贫生物材料转化为用于饲料的富且可消化混合物。
实施例3：小麦-异常球菌混合物的生产。
异常球菌和小麦生物质的混合物通过在由补加了NH4Cl 20mM和K2HPO45.7mM的全麦(1％，有或没有Termamyl添加，和6％)或发酵残渣(1％或6％)制成的介质上接种异常球菌菌株DG01而制备。
所述混合物产生用于食物的有价值混合物的能力通过验证异常球菌在小麦上扩增和降低小麦的谷朊含量的能力来确定。
谷朊消耗通过使用用于麦胶蛋白(Gliadin)(谷朊的可溶部分)/谷朊的定量确定的酶免疫测定进行评价。这种试验基于酶联免疫吸附测定的原理。
协议
蛋白质消耗使用来自Libios(Ref GLI-E02)的商业试剂盒测量。
样品制备：将100mg的细磨冻干技术基质再悬浮在1ml EtOH40％中，混合5min并且最后以3800rpm离心10min。上清液在样品稀释缓冲液1X中稀释(1/500000)。
Elisa试验:
样品盒标准品一式两份地测试。
-将100μl的标准品和样品添加到用抗麦胶蛋白抗体涂覆的96-孔微板中。
-在室温温育20min。
-用300μl洗涤溶液1X将孔洗涤三次。
-将100μl的二次结合抗体(抗麦胶蛋白过氧化物酶)添加到空的孔中。
-用300μl洗涤溶液1X将孔洗涤三次。
-添加100μl的TMB溶液(底物)。
-在室温在黑暗中温育20min。
-添加100μl的终止溶液(从蓝色至黄色的色移)
-均化并用分光光度计在OD450nm读数。
结果
麦胶蛋白的浓度与测试样品的颜色强度直接成正比。由于小麦中的麦胶蛋白和谷朊等量，所以样品的谷朊浓度通过乘以因子2进行计算。
如图3所示，异常球菌能够水解来自全麦或其发酵残渣的谷朊，并且能够在45℃生长2天后消耗它。在48h后，植物生物质中所含的全部蛋白质被异常球菌菌株消耗。
利用表1中所列的其他异常球菌细菌如DRH01、DRH03或DRH46获得类似结果。
因此这些结果清楚地证实，异常球菌菌株可以表现出强的导致从小麦产生适用于动物消耗的更加可消化的混合物蛋白质分解活性。
实施例4：中度嗜热菌的氨基酸组成的分析
在含有蛋白胨和葡萄糖作为仅有的碳源的基质中生长细胞后确定中度嗜热菌(菌株M36-7D_21)的氨基酸组成。然后将该组成与通常用作鱼类饮食的补偿蛋白质来源和/或作为动物饲料的补充剂以补偿谷类的氨基酸和/或维生素缺乏的酵母的氨基酸组成进行比较。
材料和方法
复合介质葡萄糖(CMG)1％组成
蛋白胨2g/L；
酵母膏5g/L；
葡萄糖55mM(10g/L)；
MOPS酸40mM；
NH4Cl 20mM；
NaOH 10mM；
KOH 10mM；
CaCl2.2H2O 0,5μM；
Na2SO4.10H2O 0,276mM；
MgCl2.6H2O 0,528mM；
(NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3nM；
H3BO30,4μM；
CoCl2.6H2O 30nM；
CuSO4.5H2O 10nM；
ZnSO4.7H2O 10nM；
D-生物素1μg/L；
Niacin(烟酸)1μg/L；
Pyridoxin(吡哆醛HCl或维生素B6)1μg/L；
硫胺HCl(维生素B1)；
FeCl320μM；
柠檬酸钠.2H2O 20μM；
K2HPO45,7mM。
MnCl2的终浓度为5,25μM。
在45℃并且在400rpm搅拌下在3,5L发酵罐中，在含有6μg/ml的博来霉素的CMG1％介质中生长细胞。
在生长的对数期和稳定期通过离心(4000rpm,20min，在4℃)收获约100至200ml的培养基，并在冻干之前洗涤。
然后将培养物冻干并在干物质上进行氨基酸组成。
通过HPLC确定氨基酸组成和定量。
酵母膏的氨基酸组成的值来源于S.Cortassa等人,2002(S.Cortassa et al,2002,“An introduction to metabolic and cellular engineering”世界科学出版)。
结果
以下表4比较了中度嗜热菌的氨基酸组成和酵母膏的氨基酸组成。数量以g/100g干物质给出。
表4：相比于酵母膏的异常球菌的氨基酸组合物
“§”：碳骨架不是由动物细胞合成并且对于鱼生长是必需的氨基酸(H.GeorgeKetola 1982,Comp biochem physiol 73B,N°1,p17-24)；
“*”:碳骨架不是由动物细胞合成并且对于单胃哺乳动物是必需的氨基酸；
“nd”:未确定。
这些数据表明，异常球菌细胞的总氨基酸含量在对数和稳定生长期分别达到48％和54％(g/100g干物质)。无论是哪个生长期，这些值都高于利用酵母膏获得的那些值(34％)。总异常球菌蛋白质含量也高于酵母膏的蛋白质含量。另外，相比于酵母膏，异常球菌提供显著量的精氨酸，其对于鱼类是必需氨基酸(H.George Ketola 1982,Comp biochemphysiol 73B,N°1,p17-24)。相比于酵母膏，异常球菌生物质还提供更多的酪氨酸和亮氨酸，亮氨酸是单胃哺乳动物和鱼类二者必需的氨基酸。
因此，异常球菌细菌可以用作用于饲料的高度有价值蛋白质和氨基酸的来源，并且甚至可以代替饲料组合物中的酵母膏。
实施例5:具体培养条件的分析
允许类胡萝卜素产生的培养条件
在0.35L/min空气下在45℃，在1L发酵罐中，在含有20g/L蛋白胨和10g/L酵母膏的1L介质中生长中度嗜热菌菌株MX6-1E。
通过对通风和搅拌速率的级联控制将DO调节在20％。
在20小时后，培养基显示强的红色，表明在所述培养基中存在类胡萝卜素。
这个实验确认了，异常球菌细菌可以产生大量的类胡萝卜素。另外，当细胞处于生长的对数期时，异常球菌生物质提供提供比酵母膏更多的蛋氨酸，并且蛋氨酸是动物细胞的必需氨基酸并且也是鱼类生长所需的。
允许实质性扩增的培养条件
中度嗜热菌菌株MX6-1E-14在45℃在1L发酵罐中在含有20g/L葡萄糖的1L CMG10％介质(如实施例4中所述)中生长。
在该培养条件中，在600nm的光密度(OD600nm)在40小时内达到数值20(比生长速率为0,5h-1)，表明细胞的强扩增。

Claims (15)

1.一种饲料组合物，其包含一种包含生物质和异常球菌细菌的混合物的成分，所述生物质至少部分地被所述异常球菌细菌消化。
2.根据权利要求1所述的饲料组合物，其中所述生物质包含木质纤维素生物质。
3.根据权利要求2所述的饲料组合物，其中所述木质纤维素生物质选自包含以下各项的组：麦豆，油菜籽和大豆牛用饼，甘蔗，玉米，糖用甜菜，芒草，柳枝稷，大麻，高粱，以及树物种。
4.根据前述权利要求任一项所述的饲料组合物，其中所述生物质包含蛋白质，所述蛋白质至少部分地被所述异常球菌细菌水解。
5.根据权利要求4所述的饲料组合物，其中所述包含蛋白质的生物质选自甜菜浆、大豆、苜蓿和鸡毛。
6.生物质和异常球菌细菌的混合物作为用于饲料的蛋白质供应的用途，所述生物质至少部分地被所述异常球菌细菌消化。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述生物质包含木质纤维素生物质。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其中所述生物质包含蛋白质。
9.一种用于制备饲料的方法，所述方法包括使生物质被异常球菌细菌至少部分地消化以获得混合物，以及配制所述混合物作为用于饲料的成分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物质包含选自包括以下各项的组中的木质纤维素生物质：麦豆，油菜籽和大豆牛用饼，甘蔗，玉米，糖用甜菜，芒草，柳枝稷，大麻，高粱，树物种。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述生物质包含蛋白质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述包含蛋白质的生物质选自甜菜浆、大豆、苜蓿和鸡毛。
13.异常球菌细菌作为用于动物饲养的成分的用途。
14.异常球菌细菌作为用于动物饲养的氨基酸来源的用途。
15.异常球菌细菌和生物质的混合物用于动物饲养的用途。
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