JP5900931B2 - 微生物を利用したフェニルプロパン系化合物の製造方法 - Google Patents

微生物を利用したフェニルプロパン系化合物の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、微生物を利用してリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的に生産する方法及びそのための微生物に関する。
リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に１８〜３６％、草本中には１５〜２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みが種々なされている。
一方、フェニルプロパン系化合物としては、例えば、クマル酸、ケイ皮酸、コーヒー酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）、オイゲノール、アネトール、コニフェリルアルコール、シナピルアルコール、フェルラ酸などが知られている。フェニルプロパン系化合物は、工業分野においては、香水、香料、精油、殺菌剤、麻酔薬、抗酸化剤などの医薬品や機能性食品及びそれらの合成中間体となる有用な化合物群である。
例えば、木材、イナワラなどのリグノセルロース物質に含まれるリグニンを、高温高圧処理によりガス化する方法（特許文献１及び２を参照）、加圧熱水法（特許文献３を参照）などの物理化学的な方法によって、非特異的に低分子化する方法が知られている。しかしながら、これらの手法では、リグニンから特定の化合物を製造することは非常に困難である。これらの方法を採用すると、リグニンの持つ単位構造であり、ベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が３個であるフェニルプロパン系化合物はさらに低分子化される。すなわち、グアイヤコール、シリンゴールなどのベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が０個のフェノール類や、バニリン、シリンガアルデヒドなどのベンゼン環骨格に直接結合する炭素側鎖の炭素数が１個のフェニルメタン化合物などに非特異的に変換される。また、分解生成物は多種多様な成分が混在しており、フェニルプロパン系化合物のみを取得することは非常に困難であり、特異的に製造することができない。また、これらの物理化学的な方法を採用する場合、これらの方法を実施するためには多くのエネルギーや特別な装置が必要である。
そこで、リグニンを生物学的に処理してリグニン分解物を得ようとする試みがなされている。例えば、リグノセルロース物質に白色腐朽菌を接種及び培養することによってリグニンを分解する方法が知られている（特許文献４を参照）。
ところで、天然リグニン中にはβ−アリールエーテル型結合が約５０％存在していることから、β−アリールエーテル型結合を分解し得るか否かは、天然リグニンの分解において重要な意義をもつ。このβ−アリールエーテル型結合の特異的な分解酵素を生産する微生物としては、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌（特許文献５及び非特許文献１を参照；ただし、非特許文献１には「シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌」として記載されている）、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌（特許文献６を参照）及びシュードモナス属細菌（非特許文献２を参照）が知られている。
特許文献４〜６及び非特許文献１〜２には、スフィンゴビウム属細菌、ブレバンディモナス属細菌及びシュードモナス属細菌並びにこれらの微生物によって生産されるβ−アリールエーテル切断酵素によって、リグニンのモデル化合物であるグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル又は３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）−１−（３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンのβ−アリールエーテル切断によってフェニルプロパン系化合物を生産する方法が記載されている。
特開２０１２−１４０３４６号公報 特開２０１２−５０９２４号公報 特開２０１０−２３９９１３号公報 特開昭５０−４６９０３号公報 特開平５−３３６９７６号公報 特開２００２−３４５５７号公報
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４９（２），１９８９，ｐｐ．３４８−３５２ Ｍｏｋｕｚａｉ Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，Ｖｏｌ．３１（１１），１９８５，ｐｐ．９５６−９５８
特許文献４に記載の方法によれば、微生物の作用によってリグニンを分解し得る可能性がある。しかし、特許文献４に記載の白色腐朽菌や白色腐朽菌が産生するリグニン分解酵素をリグノセルロース物質に作用させた場合、これらのリグニン分解反応の特異性が非常に低いことから、構造に統一性がない生成物ができるばかりか、主として生成物による重合反応が進行する。したがって、特許文献４に記載の方法は、反応生成物が工業原料としての利用性に欠けるという問題を有する。
特許文献５〜６及び非特許文献１〜２に記載の方法は、リグニンのモデル化合物から、微生物やその生産酵素を利用して、フェニルプロパン系化合物を製造する方法である。しかし、これらの文献には、天然のバイオマスから、微生物や酵素を作用させることによって、フェニルプロパン系化合物を得たとする記載はない。特に、特許文献５に記載の酵素だけでは、フェニルプロパン系化合物を生産することはできない。また、非特許文献１に記載の微生物はグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルを完全に分解して資化、すなわちＣＯ２にまで分解するため、フェニルプロパン系化合物を生産することはできない。グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルのように、β−アリールエーテル型結合のうちα位の炭素にＯＨ基が結合した構造は天然のバイオマスに多く見られることから、特許文献６に記載の微生物やその生産酵素を用いて天然のバイオマスを分解することは非常に困難なことである。
また、非特許文献２に記載の微生物は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルを代謝することが可能であるとしても、生成されるフェニルプロパン系化合物がさらに代謝され、別の化合物へと変換されるため、生成物の収率は非常に低くなる。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、特許文献５〜６及び非特許文献１〜２に記載の方法と比較して、微生物を作用させることにより、リグニンを含む天然バイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的かつ効率的に生産する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ね、深海沈木から、リグニン関連化合物を分解する微生物のスクリーニングを行った。その結果、１，０００以上の菌株の中から、リグニン関連化合物を分解する新規な菌株を単離することに成功した。しかも、本菌株は、リグニンのモデル化合物からだけではなく、天然のリグニンを含有するバイオマスを基質として、特異的にフェニルプロパン系化合物を生産することができるものであった。さらに本発明者らは、本菌株がリグニンのモデル化合物を効率的に分解して、高収率でフェニルプロパン系化合物を生産することができるものであることを見出した。本発明はこのような成功例や知見に基づいて完成するに至った発明である。
したがって、本発明によれば、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法が提供される。
好ましくは、本発明の製造方法において、前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン及び３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンからなる群から選ばれる少なくとも一種である。
好ましくは、本発明の製造方法において、前記ノボスフィンゴビウム属微生物が、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７）である。
本発明の別の側面によれば、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７）が提供される。
本発明の製造方法及び微生物によれば、農業廃棄物や木材などの天然物に由来するリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスからフェニルプロパン構造を有する化合物を特異的かつ効率的に生産することができる。
図１は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルをＭＢＥＳ０４株に作用させて得られた基質量及び生成物量の経時変化を示した図である。図中のＧＧＧＥはグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルを、ＧＰＧＥは１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１−オンを、ＧＨＰは３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンを表わす。 図２は、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルをＭＢＥＳ０４株に作用させて得られた培養上清のクロマトグラムを示した図である。
以下、本発明の詳細について説明する。
本発明の製造方法は、リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属微生物を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法である。
本発明の製造方法では、バイオマス中のリグニン及びリグニン関連物質が、ノボスフィンゴビウム属微生物の代謝作用を受けることにより、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンなどのフェニルプロパン系化合物が生成される。
本発明の製造方法で得られるフェニルプロパン系化合物は、フェニルプロパン構造を有する化合物であれば特に限定されず、例えば、下記一般式（Ａ）
（Ａ）
（式中、Ｒは１個又は２個以上の炭素数が１〜５であるアルキル基、アルコキシ基又は水素原子を示す。）
で表わされる、１位の位置にカルボニル基を有し、かつ、３位及びフェニル基の４位にヒドロキシ基を有する化合物であり、より具体的には３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン又は３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンである。
これらのうち、例えば、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、下記式（Ｉ）の構造からなる。
（Ｉ）
３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、例えば、逆相ＨＰＬＣにより、定性及び定量的に分析できる。逆相ＨＰＬＣの条件は、例えば、オクタデシルシリル基修飾シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を用いて、溶離液Ａ（２ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ ギ酸）及び溶離液Ｂ（１００％Ｖ／Ｖ メタノール）を用いて、カラム温度を４０℃、流速を１．２ｍｌ／ｍｉｎと設定して、溶離液Ａ ９０％Ｖ／Ｖ、溶離液Ｂ １０％Ｖ／Ｖの混合液を１分間送液した後、溶離液Ｂを１０％Ｖ／Ｖ〜９５％Ｖ／Ｖのグラジェントで７分間送液する。この条件により、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、ＵＶ検出器（２７０ｎｍ）を用いることにより、保持時間４．４分付近のピークとして検出できる。３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの標準品を用いれば、検量線法や内標準法などにより、定量することが可能である。
本発明の製造方法では、リグニン、リグニン関連物質又はこの両方を含むバイオマスを原料として用いる。リグニンは、当業界において通常知られるものであれば特に限定されないが、例えば、植物の維管束に存在し、主として下記式（Ｂ）〜（Ｄ）として示す３種のフェニルプロパノイドを構成単位として複雑に重合した樹枝状構造を有するものとして知られているものである。
（Ｂ）
（Ｃ）
（Ｄ）
リグニン関連物質は、リグニンから誘導される物質であれば特に限定されず、例えば、リグニンの分解物やリグニンを処理して得られる物質に加えて、リグニンのモデル化合物とされている物質、例えば、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルなどを含む。バイオマスは、リグニン、リグニン関連物質又はこの両方を含むものであれば特に限定されず、例えば、草や木などの天然物、これら天然物に処理を加えて得られるもの、農業廃棄物などが挙げられる。
リグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマス（以下、リグニン含有バイオマスともよぶ。）は、前処理の有無などによって、例えば、固体状、懸濁状、液体状などであり得る。例えば、リグニン含有バイオマスを粉砕したものを液体に加えて得られる懸濁液とすることもできる。
また、リグニン含有バイオマスは、リグニン抽出物であってもよい。リグニン抽出物としては、例えば、リグニン含有バイオマスの粉末化したものを、０．１％Ｗ／Ｖ〜５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは１％Ｗ／Ｖ〜２０％Ｗ／Ｖとなるように、リグニンの抽出に適した溶媒中に懸濁して懸濁液とし、この懸濁液を１０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜１３０℃、より好ましくは２０℃〜８０℃で、数時間〜数日間、好ましくは１時間〜６日間の抽出処理に供し、次いで抽出処理液から固形分を除いた液体状のリグニン抽出物、又は液体状のリグニン抽出物から溶媒を留去し、乾固することにより得られる固体状のリグニン抽出物などが挙げられる。
リグニンの抽出に適した溶媒は特に限定されず、例えば、水、ジオキサン、メタノール、イソプロパノールなどの低分子アルコール類、ジメチルホルムアミドなどが挙げられ、好ましくは水及びジオキサンである。
本発明の製造方法では、リグニン含有バイオマスからフェニルプロパン系化合物を得るために、ノボスフィンゴビウム属微生物を用いる。ノボスフィンゴビウム属微生物は、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属、別名としてスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属に属する、０．３〜０．８×２〜３μｍのグラム陰性桿菌であれば特に限定されないが、例えば、各種芳香族化合物を分解することが知られているノボスフィンゴビウム属微生物である。本発明の製造方法において用いられるノボスフィンゴビウム属微生物の好ましい具体例は、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（以下、ＭＢＥＳ０４株ともよぶ。）である。
ＭＢＥＳ０４株の菌学的性質、生理学的性質及び基質資化性は後述する実施例３及び４に記載があるとおりである。また、ＭＢＥＳ０４株の１６Ｓ リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号３（アクセッション番号：ＡＢ７３３５７６）に記載されているとおりである。そこで、ノボスフィンゴビウム属であって、このようなＭＢＥＳ０４株の菌学的性質、生理学的性質、基質資化性又は塩基配列を有するものは、ＭＢＥＳ０４株に相当するもの又は同等のものとみなすことができる。特に、後述する表１に記載の酵素活性との一致性が９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％；後述する表２に記載の基質資化性との一致性が９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％；及び／又は配列表の配列番号３に記載の塩基配列との同一性が９８％、好ましくは９９％、より好ましくは９９．５％であるノボスフィンゴビウム属微生物は、実質的にＭＢＥＳ０４株であるとみなすことができる。
同様に、本発明の製造方法で用いられるノボスフィンゴビウム属微生物は、ＭＢＥＳ０４株の菌学的性質、生理学的性質、基質資化性及び／又は塩基配列に基づいて、自然界、例えば、腐食や腐敗が見られる木材から単離することが可能である。ＭＢＥＳ０４株を単離する方法は特に限定されないが、例えば、画線法と限界希釈法により純粋培養株とすることができる。
リグニン含有バイオマスにノボスフィンゴビウム属微生物を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物が得られる。ここで、「ノボスフィンゴビウム属微生物を作用させる」とは、ノボスフィンゴビウム属微生物が有する、リグニンやリグニン関連物質をフェニルプロパン系化合物へ転換する能力を発揮させることを意味する。
リグニン含有バイオマスをノボスフィンゴビウム属微生物に作用させる系（作用系）の条件は、ノボスフィンゴビウム属微生物が生存可能な条件であれば特に限定されず、例えば、ノボスフィンゴビウム属微生物が培養可能な条件である。ノボスフィンゴビウム属微生物がＭＢＥＳ０４株である場合、例えば、ＭＢＥＳ０４株の培養可能な条件である温度１０〜４５℃、好ましくは１５〜３７℃、ｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６〜８、ＮａＣｌ濃度０〜６％Ｗ／Ｖ、好ましくは０〜３％Ｗ／Ｖである。
また、作用系において、培地成分を存在させてもよい。培地成分は、通常知られている微生物用培地成分であれば特に限定されず、例えば、炭素源、窒素源、無機物及び必要に応じて使用菌株の必要とする微量栄養素などが挙げられ、これらの成分は天然物、合成物のいずれであってもよい。
炭素源としてはノボスフィンゴビウム属微生物が資化し得るものであれば特に限定されず、例えば、グルコース、ラクトース、マルトース、セロビオース、キシロース、デキストリンなどの糖質；グルコン酸、ピルビン酸、コハク酸などの有機酸；アラニン、セリンなどのアミノ酸；バニリン、フェルラ酸、安息香酸などの芳香族炭化水素などが挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
窒素源としてはノボスフィンゴビウム属微生物が資化し得るものであれば特に限定されず、例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクトペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆粕、酵母エキスなどの有機窒素源；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウムなどの無機窒素源などが挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
無機物としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが挙げられる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどが挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。さらに、微量栄養素としては、例えば、アミノ酸；ビオチン、チアミンなどの微量栄養素ビタミンなどが挙げられる。
作用系において、リグニン、リグニン関連物質及び培地成分などの濃度、ノボスフィンゴビウム属微生物の菌数などの各種成分の存在量は特に限定されず、適宜設定できる。また、リグニンやリグニン関連物質とノボスフィンゴビウム属微生物との接触頻度を高めるために、作用系を撹拌や振とうなどすることが好ましい。作用時間はフェニルプロパン系化合物の生成が認められる時間であれば特に限定されず、例えば、数時間〜数日間であり、作用系に採用する培養法によって適宜設定することができる。回分培養法を採用した場合は、１２時間〜３６時間程度又はそれ以降の時間経過していることが好ましい。
作用系において生成されたフェニルプロパン系化合物は、特別な処理を加えることなくそのままの状態で使用することができるが、作用後にノボスフィンゴビウム属微生物と分離することにより粗精製状態のフェニルプロパン系化合物とすることが好ましい。さらに、フェニルプロパン系化合物は、固相抽出法やクロマトグラム法などの通常知られる芳香族化合物を精製する手段を採用して精製したものとすることができ、さらに溶媒を留去し乾燥させれば固体状のものとして得られる。
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
本発明の製造方法の具体的態様は、例えば、以下のとおりである。
リグニン含有バイオマスを水又はジオキサン中に懸濁し、２０℃〜８０℃にて１〜１０時間水浴中で保温する。保温後の懸濁液から固形分を除去して、リグニン抽出液を得る。リグニン抽出液に少量のアルカリを滴下し、ｐＨを弱酸性に調整し、次いで栄養培地成分及びマグネシウム塩を添加する。得られた液体を滅菌したものに、ノボスフィンゴビウム属微生物を植菌する。１５〜４０℃で１０〜１２０時間培養した後に得られる培養液を遠心操作に供して培養上清を得る。培養上清から目的物であるフェニルプロパン系化合物を精製し、不活性ガス下で乾固して、固体状のフェニルプロパン系化合物を得る。
本発明の製造方法によって得られたフェニルプロパン系化合物は、例えば、樹脂、接着剤、レジスト材料、医薬品などの原料又はその中間体として利用することができる。具体的には、本発明の製造方法によって３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンが得られる場合、該化合物は、１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，３−プロパンジオールを経由して、医薬品、香料、食品材料などの原料として産業上有用なコニフェリルアルコールなどへと転換することができる。
本発明の微生物は、本発明の製造方法において使用され得る、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７）である。ＭＢＥＳ０４株は、微生物の識別の表示を「Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＭＢＥＳ０４」とし、かつ、国際寄託番号を「ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１４年１月３０日付けで国内寄託されたものに基づいて国際寄託されている。
本発明の微生物は、上述したとおり、例えば、ＭＢＥＳ０４株の菌学的性質、生理学的性質、基質資化性及び／又は塩基配列を指標として、腐食や腐敗が見られる木材などのリグニン含有バイオマスに存在する微生物の中から単離することができる。
ＭＢＥＳ０４株の培養法は特に限定されないが、例えば、液体培養法（振とう培養法や通気攪拌培養法）が挙げられ、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。培養時間はＭＢＥＳ０４株が増殖し始める時間以上の時間であればよく、例えば、８〜１２０時間である。ＭＢＥＳ０４株の増殖を確認する方法は特に限定されないが、例えば、培養物を採取して顕微鏡で観察することや吸光度で観察することなどが挙げられる。また、培養液の溶存酸素濃度は特に限定されず、例えば、０．５〜２０ｐｐｍである。好気的な培養条件を維持するために、通気量を調節すること、撹拌すること、通気に酸素を追加することなどを実施する。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養、灌流培養のいずれでもよい。
本発明の微生物は、これまでに知られている微生物利用技術を適用したものであることができ、液体中に存在する状態のものに限定されず、例えば、担体に吸着や埋入などした状態のもの、凍結乾燥された状態のものなどの種々の態様を採り得る。また、本発明の微生物は、フェニルプロパン系化合物の製造キットの一成分とすることができる。リグニンの抽出に適した溶媒、培地成分などの成分と同梱されることにより、例えば、入手したバイオマスが、フェニルプロパン系化合物の原料になり得るかを判断することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
［実施例１．リグニン代謝微生物のスクリーニング］
０．２％Ｗ／Ｖ ブナオガクズ及び２％Ｗ／Ｖ バクトアガーを人工海水に懸濁した混合物を、１２１℃、１５分間でオートクレーブ処理した。オートクレーブ後の混合物を６０℃まで冷却し、ＩＭＫ培地（ダイゴ社製）をメーカー添付の手順書に従い添加した。ＩＭＫ培地添加後の混合物を、シャーレ内で固化させ、微生物単離用の固体培地とした。
駿河湾深度２６０ｍの海底から、フナクイムシに浸食され腐食が進んだ針葉樹沈木を回収した。この沈木サンプル０．１ｇを人工海水（ダイゴ社製）に懸濁し、懸濁液数滴を上記微生物単離用の固体培地上に塗布し、２５℃で１０日間保温した。固体培地上にコロニーを形成した微生物をＤｉｆｃｏマリンアガー２２１６(べクトンディッキンソン社製)に移し、２５℃にて繰り返し画線培養することにより、単一の微生物１，０００株程度を得た。
トリプチケースソイブロス（ベクトンディッキンソン社製）とＤｉｆｃｏマリンブロス２２１６(ベクトンディッキンソン社製)培地とを1対１に混合した培地に１ｍＭの終濃度となるようにグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ）を添加して化合物Ｉ含有培地を調製した。この化合物Ｉ含有培地に、単離した微生物を個別に植菌した。２５℃、１２０ｒｐｍで３日間培養した後、４８００ｒｐｍ、５分間の遠心操作により培養上清を得た。本培養上清０．１ｍＬに０．９ｍＬのメタノールを添加して混合したものを、４８００ｒｐｍ、５分間の遠心操作に供した。得られた培養上清を、以下の条件で逆相ＨＰＬＣ分析に供した。ＵＶ２７０ｎｍにおける吸光度を示すクロマトグラムに基づき、保持時間５．７分付近のピークの消失から、化合物Iの減少を検出した。
逆相ＨＰＬＣ条件
カラム；Ｘｂｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８（ウォーターズ製）、４．６ ｍｍ Ｉ.ｄ. ｘ １００ ｍｍ Ｌ.溶離液；（Ａ）［２ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ ギ酸]、（Ｂ）メタノール、送液：０−１ｍｉｎ １０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）１−８ｍｉｎ、１０％Ｖ／Ｖ−９０％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ、検出 フォトダイオードアレイ検出器 ＵＶ２００-５００nm（ＰＤＡ モデル２９９８、ウォーターズ製）
培養上清の逆相クロマトグラフィー分析の結果、ＭＢＥＳ０４株と名付けた微生物株を植菌した培養上清から化合物Ｉが完全に消滅していることが分かった。この結果、ＭＢＥＳ０４株は、リグニンやリグニン関連物質を資化する可能性がある微生物であることが判明した。
［実施例２．ＭＢＥＳ０４株による化合物Ｉ分解代謝物の同定］
トリプチケースソイブロス（ベクトンディッキンソン社製）とＤｉｆｃｏマリンブロス２２１６(ベクトンディッキンソン社製)培地とを1対１に混合した培地に３ｍＭの終濃度となるように化合物Iを添加した化合物Ｉ含有培地に、ＭＢＥＳ０４株を植菌した。植菌後６時間ごとに培養液の一部を抜き取り、遠心操作により得た培養上清を逆相ＨＰＬＣ分析に供した。その結果、化合物Ｉの減少に伴い、保持時間４．４分付近と５．５分付近の位置に新たな化合物が生成されることが分かった（図１を参照）。これらの化合物をそれぞれ化合物ＩＩＩ及び化合物ＶＩとした。化合物ＶＩはその保持時間と吸光スペクトルからグアイアコール（図２中のグアヤコール）と同定された。化合物ＩＩＩは、さらなる代謝変換を受けることなく、培地中に蓄積していることが確認された。
化合物ＩＩＩを同定するために、上記培養上清を固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、以下の条件で逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）−飛行時間型精密質量分析（ＡＣＣＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ―Ｃｌａｓｓ, ＸｅｖoＧ２ ＱＴＯＦ,ウォーターズ社製）に供した。
逆相ＵＰＬＣ条件（ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析）
カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ，１３０オングストローム， １．７ μｍ、（ウォーターズ製）、２．１ ｍｍ Ｉ.ｄ. ｘ １００ ｍｍ Ｌ（Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ：１８６００２３５２）
溶離液；（Ａ）［２ｍＭ 酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ ギ酸]、（Ｂ）［９５％Ｖ／Ｖ アセトニトリル］、送液 ０−５分 ５％Ｖ／Ｖ−９５％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、５−７分 ９５％Ｖ／Ｖ（Ｂ）、カラム温度；４０℃、流速；０．４ｍｌ／ｍｉｎ
質量分析条件（ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析）
検出質量範囲１００−１０００ Ｄａ、データ取得スキャン間隔０．１秒、デソルベーションガス温度 ５００℃、イオンソース ＥＳＩネガティブモード イオンソース温度１５０℃、コーン電圧２０ Ｖ
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、化合物ＩＩＩから、ｍ／ｚ１９５．１のイオンが検出され、化合物ＩＩＩの分子量は１９６．１、組成式はＣ１０Ｈ１２Ｏ４と推定された。
続いて、微生物培養上清３００ｍＬから化合物ＩＩＩを酢酸エチル１００ｍＬで３回抽出した。酢酸エチル層を減圧下、濃縮乾固して、粗製物０．５ｇを得た。これを以下のカラムクロマトグラフィー精製にかけ、化合物ＩＩＩを含有するフラクションから、溶離溶媒を留去することにより、０．１４ｇの精製品結晶を得た。
カラム：シリカゲル、（ワコーゲル２００、和光純薬製）２．１ ｃｍ Ｉ.ｄ. ｘ １１０ ｍｍ Ｌ
溶離液：酢酸エチル／トルエン＝２／３
分取した化合物ＩＩＩを重クロロホルムに溶解し、４００ＭＨｚの核磁気共鳴装置にかけ、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを得た。
精製化合物ＩＩＩのＮＭＲ分析で得られたケミカルシフト値を以下に示す：
１Ｈ―ＮＭＲ δ（ｐｐｍ）:３．１９（ｔ,Ｊ＝４．４,２Ｈ,β―Ｈ），３．９６（ｓ,３Ｈ，Ｏ―ＣＨ３）,4.０２（ｔ，Ｊ＝４．４，２Ｈ，γ―Ｈ)，６．１２（ｓ，１Ｈ,ｐｈｅｎｏｌ―ＯＨ）,６．９７（ｄ，Ｊ＝６．８，１Ｈ,Ａｒ―Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ, Ａｒ―Ｈ）．１３Ｃ―ＮＭＲ δ（ｐｐｍ）:３９．７５３（β―Ｃ）,５６．０８６（ＯＣＨ３−Ｃ）,５８．３３３（γ―Ｃ）,１０９．５４９,１１３．９２７,１２３．６６０,１２９．６５８,１４６．６７７,１５０．７４４（Ａｒ―Ｃ），１９９．０９６（α―Ｃ）.
これらの分析の結果から、化合物ＩＩＩが３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンであると同定され、フェニルプロパン構造を有する化合物が得られたことが分かった。
［実施例３．ＭＢＥＳ０４株の同定］
ＭＢＥＳ０４株をトリプチケースソイブロス（ベクトンディッキンソン社製）とＤｉｆｃｏマリンブロス２２１６(ベクトンディッキンソン社製)培地とを1対１に混合した培地で２５℃、１２０ｒｐｍで３日間培養した後、４８００ｒｐｍ、５分間の遠心操作により沈殿したＭＢＥＳ０４株細胞を得た。ＭＢＥＳ０４株細胞より、ＤＮＡ抽出キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） Ｐｌａｎｔ ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて全ＤＮＡを抽出した。全ＤＮＡを鋳型として、プライマー２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号１）、１５２５ｒ（５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’）（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅断片の塩基配列を解析した。ＰＣＲ及び塩基配列解析の条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件
１× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ （ＭｇＣｌ２含有）２００ μｍ ｄＮＴＰｓ, ０．６ μｍ ２７ｆ, ０.６ μｍ １５２５ｒ, １．４ Ｕ ｏｆ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ (ポリメラーゼタカラバイオ社製)
サーマルサイクラー温度条件９７℃ ２分、［９７℃３０秒、６０℃１分、７２℃９０秒］×３０サイクル、７２℃ ５分
塩基配列解析
ＢｉｇＤｙｅ（登録商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
ＡＢＩ ３７３０ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
上記塩基配列解析した塩基配列（１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡをコードするＤＮＡ塩基配列）（配列番号３）（アクセッション番号：ＡＢ７３３５７６）をＮＣＢＩ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａｂａｓｅ１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ａｒｃｈａｅａ）（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）に対してＭｅｇａｂｌａｓｔ（Ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ)法にてＢＬＡＳＴ検索したところ、ＭＢＥＳ０４株はノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属に属する微生物であることが分かった。
また、ＭＢＥＳ０４株にもっとも近縁な種は、ノボスフィンゴビウム・ペンタロマチボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐｅｎｔａｒｏｍａｔｉｖｏｒａｎｓ）（アクセッション番号ＮＲ＿０４１０４６）及びノボスフィンゴビウム・パニパテンス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｐａｔｅｎｓｅ）（アクセッション番号ＮＲ＿０４４２１０）であった。しかし、１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ−ＤＮＡの一致性（同一性）が９７％であったことから、ＭＢＥＳ０４株はノボスフィンゴビウム属細菌に属する新種細菌であると判断した。そこで本発明者らは、ＭＢＥＳ０４株をノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４と命名し、保存サンプルを、微生物の識別の表示を「Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＭＢＥＳ０４」とし、かつ、国際寄託番号を「ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２０１４年１月３０日付けで国内寄託されたものに基づいて国際寄託した。
［実施例４．ＭＢＥＳ０４株の性質調査］
ＭＢＥＳ０４株は以下の条件で培養が可能であった。
培地：０．１％Ｗ／Ｖ ＭｇＳＯ４を含む栄養液体・固体培地
温度：１０−４５℃（最適温度３０℃）
ｐＨ：５．５−８．５（最適ｐＨ６）
ＮａＣｌ濃度：０−６％Ｗ／Ｖ（最適濃度１％Ｗ／Ｖ）
ＭＢＥＳ０４株の菌学的性質は以下の通りである。
（１）形態的性質
０．３〜０．８×２〜３μｍの桿菌である。
（２）培養的性質
寒天平板培養（０．１％Ｗ／Ｖ ＭｇＳＯ４添加ＬＢ培地）；３０℃、４８時間で直径０．５〜１．５ｍｍの円形コロニーを形成する。コロニーは、その全縁はなめらかであり、低凸状であり、光沢があり、黄色を呈する。
ＭＢＥＳ０４株の生理学的性質について、アピザイムによる生理学的性質試験結果を以下の表１に示す。酵素活性が認められた場合を＋、認められなかった場合を−とした。
バイオログ社製ＧＮ２プレートを用いたＭＢＥＳ０４株の基質資化能の試験結果を表２に示す。資化性が認められた場合を＋、認められなかった場合を−とした。
また、非特許文献Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ；５９（Ｐｔ １）：１５６−６１. Ｇｕｐｔａ ＳＫ ｅｔ ａｌ．に記載のＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐｅｎｔａｒｏｍａｔｉｖｏｒａｎｓ及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｐａｔｅｎｓｅの性状とＭＢＥＳ０４株の性状を比較した。結果を表３に示す。ＭＢＥＳ０４株の性質調査結果から、ＭＢＥＳ０４株は、少なくともキシロース資化能を有する点で、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐｅｎｔａｒｏｍａｔｉｖｏｒａｎｓ及びＮｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｐａｔｅｎｓｅと相違する微生物株であることがわかった。
［実施例５．草植物系バイオマスからのフェニルプロパン構造を有する化合物の生産］
イナワラ抽出液からのフェニルプロパン構造を有する化合物の製造を、以下の手順で行った。
乾燥イナワラ粉末５０ｇを、リグニンを抽出するのに適した溶媒として広く認められているジオキサン３００ｍＬ及び水１５ｍＬの混合液に懸濁し、室温で６日間浸漬した。浸漬後、懸濁液をろ紙で固形物をろ別し、ろ液を得た。ろ液をエバポレーターで減圧乾固した後、デシケーターにて乾燥させ、２．６５ｇの固形物を得た。固形物に酢酸エチル５０ｍｌ、純水７０ｍＬを添加し固形物を溶解した。酢酸エチル層を抜き取りエバポレーターで減圧乾固し、固形物０．８６ｇを得た。この固形物を１０％Ｗ/ＶとなるようにＤＭＦに溶解して、リグニン含有イワナラ抽出液を得た。
イオン交換水にＤｉｆｃｏイーストエキストラクト（ベクトンディッキンソン社製）を０．５％Ｗ／Ｖ、ＭｇＳＯ４（和光純薬社製）を０．1％Ｗ／Ｖ終濃度となるように添加した後、少量の１Ｎ ＮａＯＨを滴下してｐＨを６．５に調製し、０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した。得られたろ液に、上記リグニン含有イナワラ抽出液１／４０容量を無菌的に添加し、無菌培地とした。本無菌培地中のジオキサン抽出物濃度は２．５ｍｇ／ｍＬである。本無菌培地を実施例２に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供したところ、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ）は検出されなかった。
得られた無菌培地に、ＭＢＥＳ０４株を植菌し、３０℃で４８時間振とう培養した後、培養液を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心操作に供して培養上清を得た。得られた培養上清０．５ｍＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ アセトニトリルに溶解し、実施例２に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。比較対象として、ＭＢＥＳ０４株を植菌しないサンプルを同様に処理し、同分析に供した。
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、ＭＢＥＳ０４株の作用により、化合物ＩＩＩ １．１０μｇ／ｍＬが生成されていることが確認された。ＭＢＥＳ０４株を接種しない場合は０．０２μg/mLであった。収率は、イナワラジオキサン酢酸エチル可溶性画分乾燥固形物に対して０．０４％Ｗ／Ｗであった。また、分析の結果、化合物ＩＩＩよりも分子量が３０ほど大きなイオン（２２５．１ｍ／ｚ）が検出された。これは化合物ＩＩＩと比較してメトキシ基が一つ多い化合物に相当する。マスクロマトグラムの面積値から、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの検量線（感度補正無）に基づいて計算すると、０．０８μｇ／ｍＬ相当の濃度と計算された。また、化合物ＩＩＩと比較して、分子量が３０小さいイオン（ｍ／ｚ１６５．１）が検出された。これは化合物ＩＩＩと比較してメトキシ基が一つ少ない化合物に相当する。マスクロマトグラムの面積値から、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン検量線（感度補正無）に基づいて計算すると、本化合物が０．７３μｇ／ｍＬ相当の濃度で生成されていることが確認された。ＭＢＥＳ０４株を接種しない場合は、化合物ＩＩＩとその誘導体は０．０１μｇ／ｍＬ以下であった。
［実施例６．木質系バイオマスからのフェニルプロパン構造を有する化合物の生産］
カシオガクズ抽出液からのフェニルプロパン構造を有する化合物の製造を、以下の手順で行った。
乾燥カシオガクズ粉末２０ｇを、ジオキサン１００ｍL及び水５ｍLの混合液中に懸濁し、室温にて５日間浸漬した。浸漬後の懸濁液から、ろ紙でろ過することにより固形分を除去し、ろ液を得た。
得られたろ液をエバポレーターで減圧乾固し、カシジオキサン抽出物０．５３ｇを得た。このカシジオキサン抽出物を１０％Ｗ／Ｖ ＤＭＦに溶解した。イオン交換水にＤｉｆｃｏイーストエキストラクト（ベクトンディッキンソン社製）を０．５％Ｗ／Ｖ ＭｇＳＯ４（和光純薬社製）を０．1％Ｗ／Ｖ終濃度となるように添加した後、少量の１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、ｐＨを６．５に調製し、０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した。得られたろ液に、カシジオキサン抽出物ＤＭＦ溶液１／４０容量を無菌的に添加し、無菌培地とした。本無菌培地中のカシジオキサン抽出物濃度は２．５ｍｇ／ｍＬである。本無菌培地を前述の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供したところ、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ）は検出されなかった。
得られた無菌培地に、ＭＢＥＳ０４株を植菌し、３０℃で４８時間振とう培養した後、培養液を１００００ｒｐｍ、５分間の遠心操作に供して培養上清を得た。得られた培養上清０．５ｍＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ アセトニトリルに溶解し、前述の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。比較対象として、ＭＢＥＳ０４株を植菌しないサンプルを同様に処理し、同分析に供した。
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、ＭＢＥＳ０４株の作用により、化合物ＩＩＩが０．９３μｇ／ｍＬが生成されていることが確認された。ＭＢＥＳ０４株を接種しない場合は０．０２μｇ／ｍＬであった。収率は、カシジオキサン抽出物に対して０．０４％Ｗ／Ｗであった。また、分析の結果、化合物ＩＩＩよりも分子量が３０ほど大きなイオン（２２５．１ｍ／ｚ）が検出された。これは化合物ＩＩＩと比較してメトキシ基が一つ多い化合物に相当する。マスクロマトグラムの面積値から０．３０μｇ／ｍＬの濃度と計算された。逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、ＭＢＥＳ０４株の作用により、化合物ＩＩＩと比較して、分子量が３０小さいイオン（ｍ／ｚ１６５．１）も検出された。マスクロマトグラムの面積値から、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン検量線（感度補正無）に基づいて計算すると、本化合物が０．９０μｇ／ｍＬ相当の濃度で生成されていることが確認された。
［実施例７．農業廃棄物系バイオマスからのフェニルプロパン構造を有する化合物の生産］
シイタケ廃菌床からのフェニルプロパン構造を有する化合物の製造を、以下の手順で行った。
乾燥シイタケ廃菌床粉末１０ｇを１０％Ｗ／Ｖとなるようにイオン交換水中に懸濁し、６０℃にて３時間水浴中で保温した。保温後の懸濁液から、ろ紙でろ過することにより固形分を除去して、ろ液を得た。除去した固形分の乾燥重量は１．８８ｇであった。また、ろ液をＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供したところ、ろ液中のグアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ）は検出されなかった。
得られたろ液に少量の１Ｎ ＮａＯＨを滴下し、ｐＨを６．５に調製した後、Ｄｉｆｃｏイーストエキストラクト（ベクトンディッキンソン社製）を０．５％Ｗ／Ｖ終濃度になるように、さらにＭｇＳＯ４（和光純薬社製）を０．1％Ｗ／Ｖ終濃度となるように添加した。得られた液体を０．２２μＭのフィルターでろ過滅菌した無菌培地に、ＭＢＥＳ０４株を植菌した。３０℃で７２時間培養した後、培養液を１００００ｒｐｍ、５分の遠心操作に供して培養上清を得た。得られた培養上清０．５ｍＬを固相抽出法（ＯＡＳＩＳ ＷＡＸ ；ウォーターズ社製）にて精製し、窒素ガス下にて乾固した。乾固後の残渣を、０．５ｍＬの２０％Ｖ／Ｖ アセトニトリルに溶解し、実施例２に記載の条件で逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析に供した。
逆相ＵＰＬＣ−飛行時間型精密質量分析の結果、ＭＢＥＳ０４株の作用により、化合物ＩＩＩ ２．９６μｇ／ｍＬが生成されていることが確認された。ＭＢＥＳ０４株を接種しない場合は０．０９μｇ／ｍＬであった。収率は、シイタケ廃菌床温水抽出物に対して０．０２％Ｗ／Ｗであった。また、分析の結果、化合物ＩＩＩよりも分子量が３０ほど大きいイオン（２２５．１ｍ／ｚ）が検出された。マスクロマトグラムの面積値から、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン検量線（感度補正無）に基づいて計算すると、本化合物が１．６１μｇ／ｍＬ相当の濃度で生成されていることが確認された。また化合物ＩＩＩよりも分子量が３０ほど小さいイオン（１６５．１ｍ／ｚ）も検出され、５．８９μｇ／ｍＬの濃度と計算された。
［実施例８．ＭＢＥＳ０４株による３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンの生成効率の測定］
１Ｍ グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテル（化合物Ｉ・ＧＧＧＥと略記）、５ｍＭ ＭｇＳＯ４ＬＢ培地を含む培地１２０ｍＬにＭＢＥＳ０４株を接種し、３０℃で振とう培養を行った。培養開始から４８時間後までは６時間経過するごとに、４８時間経過後は２４時間経過ごとに培養液を２ｍＬ抜き取り１４０００ｒｐｍ ５分間の遠心操作で培養上清を得た。培養上清に９−ヒドロキシフルオレンを内部標準物質として終濃度０．０２５ｍＭとなるよう添加し、メタノールで１０倍希釈した後、１４０００ｒｐｍ ５分間の遠心で不溶性物を除去した。得られた上清を実施例１に記載されているのと同一の条件でＨＰＬＣ分析に供し、化合物Ｉの減少と新たに生成した代謝生成物を定量した。分析操作中の誤差による影響を防ぐため、定量値は内部標準物質の面積値を基に補正した。それぞれの成分が、初期添加濃度の１ｍＭの濃度で回収された場合を１００％として生成率を算出した。その結果、化合物ＩＩＩを３０時間以降、５０％以上の収率で回収することができた。化合物ＩＩＩは、培養時間を１２０時間に延長しても減少せず、ＭＢＥＳ０４株の培養液から５０％以上の収率で回収可能であった（図１を参照）。４８時間のサンプルを用いて得られたクロマトグラムを図２に示した。
［配列番号１］プライマー２７ｆ
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
［配列番号２］プライマー１５２５ｒ
AAAGGAGGTGATCCAGCC
［配列番号３］ＭＢＥＳ０４株の１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ−ＤＮＡ
AACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAACCCTTCGGGGTTAGTGGCGCACGGGTG
CGTAACACGTGGGAATCTGCCTCTTGGTTCGGAATAACAGTGAGAAATTACTGCTAATACCGGATGATGA
CTTCGGTCCAAAGATTTATCGCCAAGAGATGAGCCCGCGCAGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCT
ACCAAGCCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGT
GATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCAGGGATGATAATGACAGTACCTGGAGAATAAGCTCC
GGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGAGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAA
GCGCGCGTAGGCGGTTACTCAAGTCAGAGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGAAACT
AGGTGACTAGAATCTTGGAGAGGTCAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAG
AACACCAGTGGCGAAGGCGACTGACTGGACAAGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGTGTGGGGAGCAAACA
GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTTCTTGGAATTTGGGT
GGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC
GGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGA
CATCCTCATCGCGATTTCCAGAGATGGATTTCTTCAGTTCGGCTGGATGAGTGACAGGTGCTGCATGGCT
GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCATCCTTAGTTGCCA
GCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCC
TCATGGCCCTTACACGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACAGTGGGCAGCAAGTGCGCGAGC
ACAAGCTAATCTCCAAAAGCCGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATC
GCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACC
ATGGGAGTTGGTTTCACCCGAAGGTAGTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGTGGGATCAGCG
ACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGC
本発明の製造方法や微生物によって、天然のリグニンやリグニン関連物質を含むバイオマスから３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンが得られる。３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノンは、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、樹脂、接着剤、レジスト材料、医薬品などの原料として利用することが期待できる１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，３−プロパンジオールなどの製造方法の原料として利用することができる。

Claims (3)

  1. 天然物に由来するリグニン及び／又はリグニン関連物質を含むバイオマスに、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７）を作用させることにより、フェニルプロパン系化合物を得る工程を含む、フェニルプロパン系化合物の製造方法。
  2. 前記フェニルプロパン系化合物が、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−プロパノン、３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシ−３、５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノン及び３−ヒドロキシ−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の製造方法。
  3. ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．） ＭＢＥＳ０４（国際寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−０１７９７）。
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