CN102016049B - 植物调控元件及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于植物中的新型调控元件。本发明还提供含有这些新型调控元件的DNA构建体；含有这些新型调控元件的转基因细胞、植物和种子；以及制备和使用它们的方法。

Description

植物调控元件及其应用
本申请要求于2008年4月7日提交的美国临时申请第61/042,957号的优先权，其全部内容通过引用方式结合在本文中。
序列表引入
包含于文件名为“MONS222WO_Sequence_Listing”的文件中的序列表(其按Microsoft Windows
Figure BPA00001250370700011
测定为30.2千字节，并且于2009年3月30日创建)，在此通过电子方式提交并且以引用方式结合在本文中。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程和用于调节植物中基因表达的DNA分子的领域。
背景技术
调控元件为通过调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录、以调控基因活性的遗传元件。这样的元件包括启动子、前导序列、内含子和3’非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。
发明内容
本发明提供用于植物中的来自小米(Foxtail millet)(小米(Setaria italica(L.)Beauv))的新型调控元件。本发明还提供含有调控元件的DNA构建体。本发明还提供包含可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。本发明还提供制备和使用调控元件、包含调控元件的DNA构建体和包含可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。
附图简述
图1表示根据来自脂质转移蛋白基因的调控元件设计的三个启动子变体。SEQ ID NO：15为P-SETit.Rcc3-1:1:1，长度为2062个核苷酸碱基对；SEQ ID NO：20为P-SETit.Rcc3-1:1:11，长度为915个核苷酸碱基对；以及SEQ ID NO：18为P-SETit.Rcc3-1:1:10，长度为1563核苷酸碱基对。
图2表示根据来自类金属硫蛋白基因的调控元件设计的两个启动子变体。SEQ ID NO：5为P-SETit.Mtha-1:1:1，长度为483个碱基对；SEQ ID NO：8为P-SETit.Mthb-1:1:2，长度为1516个碱基对。
图3A和3B共同表示通过使用CLUSTAL W(1.82)多序列比对来自脱水相关蛋白基因的启动子的两个等位基因变体，得到的序列比对。在比对序列下的共有序列中，将匹配标记为“*”，将错配标记为“.”，以及将缺失/插入标记为“-”。当比对时，两个等位基因变体具有相同的前导序列，但是启动子序列为序列变体。SEQ ID NO：10为P-SETit.DRPa-1:1:1，SEQ ID NO：13为P-SETit.DRPb-1:1:1。
具体实施方式
提供了以下定义和方法以更好地限定本发明并且指导本领域普通技术人员实施本发明。除非特殊说明，根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解这些术语。
DNA分子
如本文所使用的，术语“DNA”或“DNA分子”是指基因组双链DNA分子或合成的双链DNA分子，即脱氧核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，从5’(上游)端至3’(下游)端读取。如本文所使用的，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文中所使用的命名按美国联邦法规(United States Code of Federal Regulations)§1.822第37款所规定的，并且在WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1和3的表格中有所阐述。
如本文所使用的，术语“分离的DNA分子”是指与其自然或天然状态存在时通常与其相伴的其他分子至少部分分离的DNA分子。在一个实施方式中，术语“分离的”是指与其自然或天然状态存在时通常与其侧翼相接的核酸至少部分分离的DNA分子。因此，融合至通常与它们不相关的调控或编码序列的DNA分子(例如作为重组技术的结果)，在本文中被认为是分离的。即使被整合至宿主细胞的染色体中或者与其他DNA分子存在于核酸溶液中，这样的分子也被认为是分离的。
本领域内技术人员公知的任何方法均可用于分离和操作本发明公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链反应)技术可用于扩增特定的起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段也可通过其他技术(例如用化学手段直接合成片段，正如通常使用自动化寡核苷酸合成仪进行的)获得。
如本文所使用的，术语“序列一致性”是指两个优化比对的多核苷酸序列为一致的程度。优化的序列比对是通过手动比对两个序列(例如，参考序列和另一序列)产生的，以最大化在序列比对中具有适合的内部核苷酸的插入、缺失或间隙的核苷酸匹配的数目。如本文所使用的，术语“参考序列”是指SEQ ID NO：1-20所示的序列。
如本文所使用的，术语“百分比序列一致性”或“百分比一致性”或“％一致性”为一致性分数乘以100。同参考序列优化比对的序列的“一致性分数”为在优化的比对中核苷酸匹配除以参考序列中的核苷酸总数(例如整个参考序列总长度的核苷酸总数)。因此，本发明的一个实施方式为当与参考序列(在此为SEQ ID NO：1-20)优化比对时，包含与参考序列具有约85％或更高的一致性、约90％或更高的一致性、约95％或更高的一致性，或至少96％的一致性、97％的一致性、98％的一致性，或99％的一致性并且具有基因调控活性的序列的DNA分子。
调控元件
调控元件为具有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此术语“基因调控活性”是指通过影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译而影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达模式的能力。基因调控活性可以为正向和/或负向，并且该影响可通过其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性以及定量或定性指标进行表征。
例如启动子、前导序列、内含子和转录终止区域的调控元件为具有基因调控活性以及对活体细胞的基因整体表达起重要作用的DNA分子。术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。因此，在植物中起作用的例如启动子和前导序列的分离的调控元件可用于通过遗传工程方法修饰植物表型。
调控元件可通过它们的表达模式进行表征，即作为构成性的和/或通过它们的时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达模式以及其任意组合，和定量或定性指标进行表征。启动子被用作调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的调控元件。
如本文所使用的，“基因表达模式”为将可操作地连接的DNA分子转录为转录的RNA分子的任何模式。表达可通过其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应特性以及定量或定性指标进行表征。转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子或可提供反义或其他调控RNA分子，例如dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA等。
如本文所使用的，术语“蛋白质表达”为将转录的RNA分子翻译为蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态学特性以及定量或定性指标进行表征。
如本文所使用的，术语“启动子”通常是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用(trans-acting)转录因子)以启动转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5’UTR)分离。可选地，启动子可为合成产生的或操控的DNA分子。启动子也可为嵌合的，也就是通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。可用于本发明的启动子包括SEQ ID NO：2、5、8、10、13和20或其片段或变体。
在一个实施方式中，提供了本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可具有启动子活性，并且可单独使用，或在例如构建嵌合的启动子中与其他启动子和启动子片段联合使用。在具体的实施方式中，提供了包含具有本文公开的启动子活性的多核苷酸分子的至少约50、95、150、250、500或约750个连续核苷酸的启动子片段。当与参考序列优化比对时，该片段可显示出与参考序列具有至少约85％、约90％、约95％、约98％、或约99％或更高的一致性。
也可以分析启动子或启动子片段中已知启动子元件的存在，即例如TATA-框和其他已知转录因子结合位点基序的DNA序列特性。本领域技术人员可通过这些已知启动子元件的识别来设计具有与原始启动子有相似表达模式的启动子的变体。
如本文所使用的，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用(cis-acting)转录调控元件，也就是顺式元件，其提供整体表达模式的一个方面，但是通常不足以单独促使可操作地连接的多核苷酸序列的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA框。启动子可以天然包含一个或多个影响可操作地连接的多核苷酸序列的转录的增强子元件。分离的增强子元件也可与启动子融合以产生嵌合的启动子顺式元件，其提供基因表达的整体调节的一方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个影响可操作地连接的基因的转录的增强子元件。据认为，许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白和/或影响DNA拓扑学，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接触DNA模板或在转录起始位点促进双螺旋选择性打开的局部构型。增强子元件可起作用以结合调控转录的转录因子。一些增强子元件结合多于一种转录因子，并且转录因子可通过不同的亲和力与多于一个增强子结构域相作用。增强子元件可通过多种技术进行识别，包括缺失分析(即从启动子5’端或内部缺失一个或多个核苷酸)；DNA结合蛋白分析，使用DNase I足印法、甲基化干扰、电泳迁移率改变测试、通过连接介导PCR的体内基因组足印法和其他常规测试；或通过使用已知顺式元件基序或增强子元件作为靶标序列或靶标基序、使用常规DNA序列比较方法(例如BLAST)进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过其他常规方法进一步研究。增强子元件可通过化学合成获得，或从包括该元件的调控元件中分离获得，并且它们可与另外的含有可用的限制性酶切位点的侧翼核苷酸一起合成以有利后续操作。因此，根据本文公开的用于调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的方法的增强子元件的设计、构建和使用包含于本发明中。
如本文所使用的，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的5’非翻译区(5’UTR)分离、并且通常定义为在转录起始位点(TSS)以及蛋白编码序列起始位点之间的核苷酸节段的DNA分子。可选地，前导序列可为合成产生的或操控的DNA元件。前导序列可用作5’调控元件，以调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达。前导序列分子可与异源启动子或它们的天然启动子共同使用。因此，本发明的启动子分子可以可操作地连接至它们的天然前导序列或可操作地连接至异源前导序列。可用于实现本发明的前导序列包括SEQ ID NO：3、6、11和16或其片段或变体。
如本文所使用的，术语“嵌合的”是指通过将第一个DNA分子与第二个DNA分子融合而生成的单个DNA分子，其中第一个或第二个DNA分子通常都不会在该构型、即融合其他的构型中发现。因此，嵌合的DNA分子为新的DNA分子而不是通常在自然界中发现的。如本文所使用的，术语“嵌合的启动子”是指通过对DNA分子进行这样的操作而生成的启动子。嵌合的启动子可以结合两个或多个DNA片段；例子可为启动子与增强子元件的融合。因此，根据本文公开的用于调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达的方法的嵌合的启动子的设计、构建和使用包含于本发明中。
如本文所使用的，术语“变体”是指与第一个DNA分子组成相似但不相同的第二个DNA分子，而第二个DNA分子仍保持通常的功能，即与第一个DNA分子具有相同或相似的表达模式。变体可为第一个DNA分子的较短或截短形式和/或第一个DNA分子的序列变化形式(例如具有不同的限制性酶切位点和/或内部缺失、取代和/或插入的DNA分子)。在本发明中，SEQ ID NO：1-20所示的多核苷酸序列可用于生成与原始调控元件的多核苷酸序列组成相似但不相同的变体，而它们仍保持通常功能(即与原始的调控元件相同或相似的表达模式)。本领域中普通技术人员根据说明书的公开内容熟知本发明中这样的变体的生成，其包含在本发明的范围内。
构建体
如本文所使用的，术语“构建体”是指衍生自任何来源、能够进行基因组整合或自主复制、包含多核苷酸分子(其中一个或多个核苷酸分子已经以功能性操作方式连接，即操作性地连接的)的任何重组多核苷酸分子(例如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体，或线状或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子)。如本文所使用的，术语“载体”是指任何可用于转化目的(即将异源DNA引入宿主细胞)的重组多核苷酸构建体。
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指第一个分子连接到第二个分子，其中分子如此排列以使第一个分子影响第二个分子的功能。两个分子可以或可以不是单个连续分子的一部分，并且可以或可以不相邻。例如，如果启动子调控细胞中目的可转录的多核苷酸分子的转录，则启动子可操作地连接至可转录的多核苷酸分子。
本发明的构建体通常为双Ti质粒边界(border)DNA构建体，其具有从根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的包含T-DNA的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区域，随着根癌土壤杆菌细胞提供的转化分子，允许T-DNA整合至植物细胞的基因组中(参见，例如，美国专利6,603,061)。构建体也可包含可在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择性的质粒骨架DNA节段，例如，大肠杆菌复制起点(例如ori322)、广范围宿主复制起点(例如oriV或oriRi)，以及编码Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶(aminoglycoside adenyltransferase)(aadA)从而对壮观霉素或链霉素耐受的可选择标记(如Spec/Strp)或者庆大霉素(Gm，Gent)可选择性标记基因的编码区。对于植物的转化，宿主细菌菌株通常为根癌土壤杆菌ABI、C58或LBA4404；然而，植物转化领域技术人员公知的其他菌株也可以在本发明中起作用。
通过将可转录的多核苷酸分子转录为可翻译和表达为蛋白质产物的功能性mRNA分子的方式，将构建体组装和导入细胞中的方法在本领域是已知的。对于本发明的实施，本领域技术人员熟知制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法，参见，例如，MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd edition Volumes 1、2和3(2000)J.F.Sambrook、D.W.Russell和N.Irwin，Cold Spring HarborLaboratory Press。制备特别适合于植物转化的重组载体的方法包括但不局限于整体记载于美国专利4,971,908、4,940,835、4,769,061和4,757,011中的那些。这些类型的载体也已在科技文献中综述过(参见，例如，Rodriguez等人，Vectors：A Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses，Butterworths，Boston，(1988)和Glick等人，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，FL.(1993))。用于在高等植物中表达核酸的典型载体是本领域已知的，并且包括衍生自根癌土壤杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体(Rogers等人，Methods in Enzymology，153：253-277(1987))。用于植物转化的包括pCaMVCN转化控制载体的其他重组载体也已经描述在科技文献中(参见，例如，Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828(1985))。
构建体可包含不同的调控元件。任何该调控元件可与其他调控元件联合提供。该组合可被设计或改造以产生所需的调控特性。本发明的构建体可典型地包含至少一个可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件，所述可转录的多核苷酸分子可操作地连接至3’转录终止分子。
本发明的构建体可包括本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接至异源5’非翻译前导序列(例如衍生自热休克蛋白基因的异源5’非翻译前导序列)(参见，例如，美国专利No.5,659,122和5,362,865)。可选地，本发明的前导序列可以可操作地连接至例如花椰菜花叶病毒35S转录启动子的异源启动子(参见，美国专利No.5,352,605)。
如本文所使用的，术语“内含子”是指可被从基因的基因组拷贝中分离或识别、并且通常定义为在翻译前在mRNA的处理过程中剪接出的区域的DNA分子。可选地，内含子可为合成产生的或操控的DNA元件。内含子可包含影响可操作地连接的基因转录的元件增强子元件。内含子可用作调控元件以调节可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的表达。DNA构建体可包含内含子，该内含子与可转录的多核苷酸分子序列可以是或者不是异源的。本领域的内含子的例子包括水稻肌动蛋白内含子(美国专利No.5,641,876)以及玉米HSP70内含子(美国专利No.5,859,347)。
如本文所使用的，术语“3’转录终止分子”或“3’UTR”是指在转录中用于生成mRNA分子3’非翻译区(3’UTR)的DNA分子。mRNA分子的3’非翻译区可通过特定的切割和3’多腺苷酸化(即聚A尾)产生。3’UTR可以可操作地连接至多核苷酸分子并且位于可转录的多核苷酸分子的下游，并且可包括提供多腺苷酸化信号和其他能够影响转录、mRNA加工或基因表达的调控信号的多核苷酸。聚A尾被认为在稳定mRNA和启动翻译中起作用。本领域的3’转录终止分子的例子为胭脂碱合成酶3′区域(参见，Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803-4807(1983))；小麦hsp17 3′区域；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)小亚基3′区域；棉花E63′区域(美国专利6,096,950)；WO0011200A2公开的3′区域；以及薏苡辛(coixin)3’UTR(美国专利No.6,635,806)。
构建体和载体也可包含表达连接的肽类的转运肽编码序列，该连接的肽用于将蛋白质产物靶向至特别是叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡或细胞外部位。使用叶绿体转运肽的记载，可参见美国专利No.5,188,642和美国专利No.5,728,925。许多叶绿体-定位(chloroplast-localized)蛋白质从核基因中表达为前体，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。该分离的叶绿体蛋白质的例子包括但不局限于：与核酮糖-1，5，-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、获光复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶(EPSPS)相关的那些以及记载于美国专利No.7,193,133的转运肽类。已在体内和体外证明，通过与异源CTP的蛋白质融合可将非-叶绿体蛋白质靶向叶绿体，并且CTP足够将蛋白质靶向叶绿体。适合的叶绿体转运肽(例如拟南芥(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP2)(参见，Klee等人，Mol.Gen.Genet.，210：437-442(1987))或矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(CTP4)(参见，della-Cioppa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6873-6877(1986)))的引入已显示在转基因植物中将异源EPSPS蛋白质序列靶向叶绿体(参见，美国专利No.5,627,061、5,633,435和5,312,910和EP 0218571、EP 189707、EP 508909和EP924299)。
可转录的多核苷酸分子
如本文所使用的，术语“可转录的多核苷酸分子”是指任何能够被转录为RNA分子的DNA分子，包括但不局限于具有蛋白质编码序列的那些以及具有用于基因抑制的序列的那些。“转基因”是指与宿主细胞异源的可转录的多核苷酸分子和/或人工掺入宿主细胞基因组的可转录的多核苷酸分子。
本发明的启动子可以可操作地连接至相对于启动子分子为异源的可转录的多核苷酸分子。如本文所使用的，术语“异源的”是指当该组合通常不存在于自然界时的两个或多个多核苷酸分子的组合。例如，两个分子可衍生自不同种类和/或两个分子可衍生自不同基因，比如，来自相同种类的不同基因或来自不同种类的相同基因。因此如果该组合通常不存在于自然界，则启动子相对于可操作地连接的可转录的多核苷酸分子为异源的，即该可转录的多核苷酸分子与该启动子分子的组合不是自然发生的可操作地连接的。
可转录的多核苷酸分子通常可为表达RNA转录体所需的任何DNA分子。RNA转录体的该表达可导致所得到的mRNA分子的翻译以及蛋白质的表达。可选地，可转录的多核苷酸分子可设计为最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。这可通过使用以反义方向定向的可转录的多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员熟悉该反义技术的使用。简而言之，当反义可转录的多核苷酸分子被转录时，RNA产物在细胞中与互补RNA分子杂交并且隔绝(sequester)互补RNA分子。该双螺旋RNA分子不能通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，并且在细胞中降解。可以这种方式反向调控任何基因。
因此，本发明的一个实施方式为本发明的调控元件(例如SEQID NO：1-20所示的调控元件)，其可操作地连接至可转录的多核苷酸分子，从而当将所述构建体引入植物细胞中时以需要的水平或以需要的模式调控可转录的多核苷酸分子的转录。在一个实施方式中，可转录的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区域，并且启动子影响被翻译和表达为蛋白质产物的RNA分子的转录。在另一个实施方式中，可转录的多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子影响反义RNA分子或其他相似抑制性RNA分子的转录以抑制靶标宿主细胞中特定目的RNA分子的表达。
农学目的基因
可转录的多核苷酸分子可为农学目的基因。如本文所使用的，术语“农学目的基因”是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时提供与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的所需特征的可转录的多核苷酸分子。农学目的基因包括但不局限于编码产量蛋白、抗压蛋白、发育控制蛋白、发育调控蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白(abscissionprotein)、来源蛋白、SINK蛋白、花调控蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或例如靶向抑制特定基因的反义或RNAi分子的任何其他试剂的基因。农学目的的基因产物可在植物中起作用以对植物生理学或代谢起作用，或可作为以植物为食的害虫的食物的杀虫剂起作用。
在本发明的一个实施方式中，本发明的启动子被引入构建体中，以使启动子可操作地连接至作为农学目的基因的可转录的多核苷酸分子。为了获得农学有益特征，农学目的基因的表达是想要的。有益农学特性可为但不局限于，例如除草剂耐受性、昆虫控制、改良的产量、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、淀粉生产、改良的油生产、高油生产、改良的脂肪酸含量、高蛋白质生产、果实成熟、提高的动物和人类营养、生物聚合物、环境压力抗性、药用肽类和可分泌肽类、改良的加工特性、改良的消化率、酶生产、味道、固氮、杂交制种、纤维生产和生物燃料生产。本领域已知的农学目的基因的例子包括具有除草剂抗性(美国专利No.6,803,501、6,448,476、6,248,876、6,225,114、6,107,549、5,866,775、5,804,425、5,633,435和5,463,175)、提高的产量(美国专利No.USRE38,446、6,716,474、6,663,906、6,476,295、6,441,277、6,423,828、6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098和5,716,837)、昆虫控制(美国专利No.6,809,078、6,713,063、6,686,452、6,657,046、6,645,497、6,642,030、6,639,054、6,620,988、6,593,293、6,555,655、6,538,109、6,537,756、6,521,442、6,501,009、6,468,523、6,326,351、6,313,378、6,284,949、6,281,016、6,248,536、6,242,241、6,221,649、6,177,615、6,156,573、6,153,814、6,110,464、6,093,695、6,063,756、6,063,597、6,023,013、5,959,091、5,942,664、5,942,658、5,880,275、5,763,245和5,763,241)、真菌疾病抗性(美国专利No.6,653,280、6,573,361、6,316,407、6,215,048、5,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美国专利No.6,617,496、6,608,241、6,015,940、6,013,864、5,850,023和5,304,730)、线虫抗性(美国专利No.6,228,992)、细菌疾病抗性(美国专利No.5,516,671)、植物生长和发育(美国专利No.6,723,897和6,518,488)、淀粉生产(美国专利No.6,538,181、6,538,179、6,538,178、5,750,876、6,476,295)、改良的油生产(美国专利No.6,444,876、6,426,447和6,380,462)、高油生产(美国专利No.6,495,739、5,608,149、6,483,008和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利No.6,828,475、6,822,141、6,770,465、6,706,950、6,660,849、6,596,538、6,589,767、6,537,750、6,489,461和6,459,018)、高蛋白质生产(美国专利No.6,380,466)、果实成熟(美国专利No.5,512,466)、提高的动物和人类营养(美国专利No.6,723,837、6,653,530、6,5412,59、5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美国专利No.USRE37543、6,228,623和5,958,745和6,946,588)、环境压力抗性(美国专利No.6,072,103)、药用肽类和可分泌肽类(美国专利No.6,812,379、6,774,283、6,140,075和6,080,560)、改良的加工特性(美国专利No.6,476,295)、改良的消化率(美国专利No.6,531,648)、低棉子糖(美国专利No.6,166,292)、工业酶生产(美国专利No.5,543,576)、改良的味道(美国专利No.6,011,199)、固氮(美国专利No.5,229,114)、杂交制种(美国专利No.5,689,041)、纤维生产(美国专利No.6,576,818、6,271,443、5,981,834和5,869,720)和生物燃料生产(美国专利No.5,998,700)。
可选地，农学目的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子而影响以上所述的植物特征或表型，例如通过反义(参见，例如，美国专利5,107,065)、抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA-、siRNA-、反式作用siRNA-和相控sRNA-调节机理调节基因表达，例如，如描述于发表的申请US2006/0200878、US2008/0066206和US2009/0070898)，或共抑制-调节机理。RNA也可以为催化的RNA分子(例如，核酶或核开关；参见例如，US2006/0200878)，其经工程化用于切割需要的内源性mRNA产物。因此，任何编码影响农学重要表型或目的形态学变化的可转录的RNA分子的可转录的多核苷酸分子，可对本发明的实施有益处。构建构建体和将构建体导入细胞内从而将可转录的多核苷酸分子转录至能够引起基因抑制的分子中的方法在本领域是已知的。例如，在植物中使用构建体和反义方向的可转录的多核苷酸分子以调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利No.5,107,065和5,759,829中，并且在植物中使用构建体和正义方向可转录的多核苷酸分子以调控基因表达的转录后基因抑制公开于美国专利No.5,283,184和5,231,020中。在植物细胞中表达可转录的多核苷酸也可用于抑制食用植物细胞的植物害虫，例如，从鞘翅目害虫分离的组合物(美国专利公布No.US2007/0124836)和从线虫害虫分离的组合物(美国专利公布No.US2007/0250947)。植物害虫包括但不局限于节肢类害虫、线虫害虫和真菌或微生物害虫。导入本发明的构建体的示例性的可转录的多核苷酸分子包括，例如，来自于不同于目标物种之物种的DNA分子或基因，或起始于或存在于相同物种但通过遗传工程方法而不是传统的繁殖或育种技术掺入受体细胞中的基因。多核苷酸分子的类型包括但不局限于已经存在于植物细胞中的多核苷酸分子、来自另一植物的多核苷酸分子、来自不同机体的多核苷酸分子或外部产生的多核苷酸分子(例如含有基因反义信使的多核苷酸分子，或编码人工、合成的或另外的改良类型的转基因的多核苷酸分子)。
可选择性标记
如在本文中所用术语“标记”是指任何可转录的多核苷酸分子，其表达或不表达可以某种方式筛选或评分。用于实施本发明的标记基因包括但不局限于，编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS，描述于美国专利5,599,670中)、绿色荧光蛋白及其变体(GFP，描述于美国专利5,491,084和6,146,826中)、提供抗生素耐药性的蛋白质或提供除草剂耐受性的蛋白质的可转录的多核苷酸分子。可用的抗生素耐药性的标记，包括编码提供卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aad，spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)耐药性的蛋白质的那些标记在本领域为已知的。已证实转基因植物的耐受性并且可应用本发明方法的除草剂，包括但不局限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草丁膦(glufosinate)、磺酰脲类、咪唑啉酮、溴草腈、茅草枯、二氯甲氧苯酸、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和异噁唑草酮(isoxaflutole)除草剂。编码与除草剂耐受性有关的蛋白质的可转录的多核苷酸分子在本领域为已知的，并且包括但不局限于，编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(用于草甘膦耐受性的EPSPS，描述于美国专利5,627,061、5,633,435、6,040,497和5,094,945中)的可转录的多核苷酸分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶(GOX描述于美国专利5,463,175中、GAT描述于美国专利公布No.2003/0083480中)以及二氯甲氧苯酸单加氧酶(美国专利公布No.2003/0135879中)的可转录的多核苷酸分子；编码溴草腈腈水解酶(用于溴草腈耐受性的Bxn，描述于美国专利4,810,648中)的可转录的多核苷酸分子；用于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素去饱和酶(crtI)的可转录的多核苷酸分子(描述于Misawa等人，Plant Journal，4：833-840(1993)和Misawa等人，Plant Journal，6：481-489(1994)中)、用于磺酰脲类除草剂耐受性的编码乙酰羟酸合成酶(AHAS，也就是ALS)的可转录的多核苷酸分子(描述于Sathasiivan等人，Nucl.Acids Res.，18：2188-2193(1990))，以及用于草丁膦和双丙氨磷耐受性的bar基因(描述于DeBlock等人，EMBO Journal，6：2513-2519(1987)中)。本发明的启动子分子可表达连接的可转录的多核苷酸分子，其编码草胺膦(phosphinothricin)乙酰基转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸酯脱氢酶、潮霉素磷酸转移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱卤素酶、溴草腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合成酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶。
包含于术语“可选择性标记”中的也有编码可分泌的标记的基因，其分泌可作为识别或选择转化细胞的方式。例子包括编码可通过抗体相互作用识别的可分泌的抗原的标记或甚至编码可催化检测的可分泌的酶的标记。可选择的分泌的标记蛋白质划分为几个类型，包括可被检测的(例如通过ELISA)小的可扩散的蛋白质、可在细胞外溶液中检测到的小的活性酶(例如，α-淀粉酶、β-内酰胺酶、草胺膦转移酶)或插入或禁锢在细胞壁中的蛋白质(例如包括在例如延伸表达单元中发现的前导序列的蛋白质或者与烟草致病相关的蛋白质，也就是烟草PR-S)。其他可能的可选择性标记基因对于本领域的技术人员是明显的并且包含在本发明中。
细胞转化
本发明还涉及产生包含可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的启动子的转化的细胞和植物的方法。
术语“转化”是指将核苷酸导入受体宿主。如本文所使用的，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或子代。特定的目标植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚芽和花粉。
如本文所使用的，术语“转化的”是指被导入外源多核苷酸分子(例如构建体)的细胞、组织、器官或生物体。导入的多核苷酸分子可被整合至受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA，因而被导入的多核苷酸分子被遗传至后续后代。“转基因的”或“转化的”细胞或生物体也包括细胞或生物体的子代，以及产生于应用了该转基因生物体做为母代杂交并且显示来自外源多核苷酸分子的改变的表型的育种程序的子代。术语“转基因”是指含有一个或更多个异源多核苷酸分子的细菌、真菌或植物。
存在许多将多核苷酸分子导入植物细胞的方法。方法通常包括选择合适的宿主细胞、使用重组载体转化宿主细胞以及获得转化的宿主细胞的步骤。合适的方法包括细菌转染(例如土壤杆菌属)、双元细菌人工染色体载体、DNA的直接递送(例如，通过PEG-介导的转化)、干燥/抑制-介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅动以及DNA涂层颗粒的加速等(综述在Potrykus等人，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42：205(1991)中)。
将DNA分子导入细胞的技术为本领域技术人员公知的。在本发明的实施中，通过将植物DNA构建体导入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何公知的和证实的方法，包括但不局限于：
(1)化学方法(Graham和Van der Eb，Virology，54：536-539(1973)和Zatloukal等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153(1992))；
(2)物理方法，例如显微注射(Capecchi，Cell，22：479-488(1980))、电穿孔(Wong和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107：584-587(1982)；Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828(1985)；美国专利No.5,384,253)、粒子加速(Johnston和Tang，Methods Cell Biol.，43(A)：353-365(1994)；Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11478-11482(1993))和微粒轰击(如描述于美国专利No.5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中)；
(3)病毒载体(Clapp，Clin.Perinatol.，20：155-168(1993)；Lu等人，J.Exp.Med.，178：2089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6：608-614(1988))；
(4)受体介导的机理(Curiel等人，Hum.Gen.Ther.，3：147-154(1992)和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6099-6103(1992))；
(5)细菌介导的机理，例如土壤杆菌属-介导的转化(如描述于美国专利No.5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301中)；
(6)通过注射植物再生器官向花粉的直接导入(Zhou等人，Methodsin Enzymology，101：433，(1983)；Hess，Intern Rev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等人，Plant Mol Biol.Reporter，6：165(1988)；Pena等人，Nature，325：274(1987))；
(7)原生质体转化(如描述于美国专利No.5,508,184中)；以及
(8)注射入未成熟的胚芽(Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.，75：30(1987))。
上述任何方法均可以应用于用本发明的一个或多个启动子和/或构建体转化宿主细胞。宿主细胞可为例如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞的任何细胞或生物体。优选的宿主和转化的细胞包括来自于植物、曲霉属、酵母、昆虫、细菌和藻类的细胞。
主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物以及获得转基因植物的方法已经发表，用于棉花(美国专利No.5,004,863、5,159,135和5,518,908)；大豆(美国专利No.5,569,834和5,416,011；也参见，McCabe等人，Biotechnology，6：923(1988)和Christou等人，PlantPhysiol.87：671-674(1988))；芸苔(美国专利No.5,463,174)；花生(Cheng等人，Plant Cell Rep.，15：653-657(1996)和McKently等人，Plant Cell Rep.，14：699-703(1995))；番木瓜；和豌豆(Grant等人，PlantCell Rep.，15：254-258(1995))。
已经报道了使用电穿孔、粒子轰击和土壤杆菌属转化单子叶植物的方法。已经在芦笋(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5354(1987)；大麦(Wan和Lemaux，Plant Physiol，104：37(1994))；玉米(Rhodes等人，Science 240：204(1988)，Gordon-Kamm等人，PlantCell，2：603-618(1990)，Fromm等人，Bio/Technology，8：833(1990)，Koziel等人，Bio/Technology，11：194(1993)和Armstrong等人，CropScience，35：550-557(1995))；燕麦(Somers等人，Bio/Technology，10：1589(1992))；鸭茅(orchard grass)(Horn等人，Plant Cell Rep..7：469(1988))；黑麦(De la Pena等人，Nature，325：274(1987))；甘蔗(Bower和Birch，Plant Journal，2：409(1992))；高羊茅(tall fescue)(Wang等人，Bio/Technology，10：691(1992))；和小麦(Vasil等人，Bio/Technology，10：667(1992)和美国专利No.5,631,152)中实现了转化和植物再生。
从转化的植物原生质体或外植体再生、发育和栽培植物在本领域为公知的(参见，例如，Weissbach和Weissbach，Methods for PlantMolecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1988)和Horsch等人，Science，227：1229-1231(1985))。转化的细胞通常在选择的培养基存在下栽培，其选择出成功转化的细胞并且诱发植物芽和根再生成完整的植物(Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：4803(1983))。转化的植物通常在二至四个月间获得。
再生的转基因植物进行自花授粉，以提供纯合的转基因植物。可选地，来自再生的转基因植物的花粉可与非转基因植物杂交，优选为农学重要物种的自交系。通常用于不同特性和作物的育种方法的描述可见于几本参考书中的一本，参见，例如，Allard，Principles of PlantBreeding，John Wiley & Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98(1960)；Simmonds，Principles of crop improvement，Longman，Inc.，NY，369-399(1979)；Sneep和Hendriksen，Plant breeding perspectives，Wageningen(ed)，Center for Agricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr，Soybeans：Improvement，Production and Uses，2nd Edition，Monograph.，16：249(1987)；Fehr，Principles of variety development，Theory andTechnique，(Vol 1)and Crop Species Soybean(Vol 2)，Iowa State Univ.，Macmillan Pub.Co.，NY，360-376(1987)。相反的，来自非转基因植物的花粉可用于再生的转基因植物的授粉。
可以分析转化的植物的目标基因的存在以及本发明调控元件所赋予的表达水平和/或分布。本领域技术人员知道许多可用于分析转化的植物的方法。例如，植物分析方法包括但不局限于Southern印迹法或northern印迹法、基于PCR的方法、生化分析、表型筛选方法、现场鉴定以及免疫诊断测试。可转录的多核苷酸分子的表达可用TaqMan(Applied Biosystems，Foster City，CA)试剂和制造商描述的方法和使用TaqMan
Figure BPA00001250370700202
Testing Matrix确定的PCR周期时间来测量。可选地，Invader
Figure BPA00001250370700203
(Third Wave Technologies，Madison，WI)试剂和制造商描述的方法可用于转基因表达。
本发明的植物的种子可从能繁殖的转基因植物中收获并且用于生长本发明的转化的植物子代，包括包含本发明构建体和表达农学目标基因的植物杂交系。
本发明还提供本发明植物的部分。不受局限地，植物的部分包括叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。本发明还包括和提供包含本发明的核苷酸分子的转化的植物细胞。
转基因植物可将转基因多核苷酸分子传递至其子代。子代包括任何可再生的包含衍生自祖代植物的转基因的植物部分或种子。转基因植物优选对转化的多核苷酸分子为纯合的，并且作为有性繁殖的结果将该序列传递至所有后代。子代可从产生于转基因植物的种子生长。然后，这些另外的植物可以进行自花授粉，以产生植物的真正的育种系。在其他事项中，评价来自这些植物的子代的基因表达。基因表达可通过例如western印迹法、northern印迹法、免疫沉淀和ELISA的几种常规方法检测。
现已概括地描述了本发明，通过参考以下实施例将会更加容易地理解本发明，除非特别说明，这些实施例仅是示例性的，并不意图限制本发明。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的技术，以很好地实施本发明。但是，本领域技术人员应该理解，根据本发明公开的内容，可以对公开的具体实施方式做出许多改变，并仍然会得到相同或相似的结果，而不会偏离本发明的精神和范围，因此提出或显示在所附附图中的所有内容应被理解为示例性的，而不是限制性的。
实施例
分离了用于促使转基因植物中的可操作地连接的可转录的多核苷酸表达的调控元件，并且在转基因玉米植物中分析了这些可操作地连接至可转录的多核苷酸分子的调控元件的表达模式。
实施例1：调控元件的确定和克隆
从单子叶物种小米(小米(Setaria italica(L.)Beauv))的基因组DNA中识别和分离新型调控元件。EST序列用于设计引物，引物继而用在按照制造商的试验方案构建的GenomeWalkerTM(ClontechLaboratories，Inc，Mountain View，CA)库中，以克隆相应的基因组DNA序列5’区域。该克隆的区域包含来自小米的每个基因的蛋白质编码区域上游的5’UTR序列。使用该序列，在每个基因的该5’UTR内识别出生物信息学意义上的调控元件。生物信息学分析用于识别转录起始位点(TSS)以及序列中存在的任何双向性、内含子或上游编码序列。通过该分析的结果，确定了在5’UTR序列内的调控元件。然后，设计引物以扩增调控元件。采用标准的聚合酶链反应条件、使用含有独特的限制性酶切位点的引物和从小米分离的基因组DNA，扩增每个调控元件的相应的DNA分子。使用兼容限制性位点的标准限制性酶消化和DNA连接方法，产生的DNA片段被连接至基础植物表达载体中。产生的植物表达载体包含来自根癌土壤杆菌的右边界区域(B-AGRtu.右边界)、可操作地连接至衍生自玉米的HSP70热休克蛋白的内含子的测试调控元件、可操作地连接至β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的编码序列的测试调控元件、可操作地连接至来自根癌土壤杆菌的胭脂碱合成酶3’终止区域的测试调控元件以及来自根癌土壤杆菌的左边界区域(B-AGRtu.左边界)。
调控元件序列在此提供为SEQ ID NO：1-20并且列在下面表1中。启动子序列在此提供为SEQ ID NO：2、5、8、10、13和20。前导序列在此提供为SEQ ID NO：3、6、11和16。在此提供的SEQ IDNO：1、4、7、9、12、14、17和19序列为可操作地连接的启动子和前导序列。
表1：调控元件
  SEQ ID   注释   cDNA注释
  1   EXP-SETit.TIP   液泡膜内在蛋白
  2   P-SETit.Tip-1:1:1   液泡膜内在蛋白
  3   L-SETit.Tip-1:1:1   液泡膜内在蛋白
  4   EXP-SETit.Mtha   类金属硫蛋白
  5   P-SETit.Mtha-1:1:1   类金属硫蛋白
  6   L-SETit.Mth-1:1:1   类金属硫蛋白
  7   EXP-SETit.Mthb   类金属硫蛋白
  8   P-SETit.Mthb-1:1:2   类金属硫蛋白
  9   EXP-SETit.DRPa   脱水相关蛋白a
  10   P-SETit.DRPa-1:1:1   脱水相关蛋白a
  11   L-SETit.DRP-1:1:2   脱水相关蛋白a/b
  12   EXP-SETit.DRPb   脱水相关蛋白b
  13   P-SETit.DRPb-1:1:1   脱水相关蛋白b
  14   EXP-SETit.Rcc3-1   脂质转移蛋白
  15   P-SETit.Rcc3-1:1:1   脂质转移蛋白
  16   L-SETit.Rcc3-1:1:2   脂质转移蛋白
  17   EXP-SETit.Rcc3-10   脂质转移蛋白
  18   P-SETit.Rcc3-1:1:10   脂质转移蛋白
  19   EXP-SETit.Rcc3-11   脂质转移蛋白
  20   P-SETit.Rcc3-1:1:11   脂质转移蛋白
表达元件EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)由P-SETit.Tip-1:1:1启动子(SEQ ID NO：2)和L-SETit.Tip-1:1:1前导序列(SEQ ID NO：3)组成。
对于来自脂质转移蛋白基因的调控元件，设计了三个启动子变体(附图1)。P-SETit.Rcc3-1:1:1为2062个核苷酸的版本(SEQ IDNO：15)；P-SETit.Rcc3-1:1:10为1563个核苷酸的版本(SEQ ID NO：18)以及P-SETit.Rcc3-1:1:11为915个核苷酸的版本(SEQ ID NO：20)。表达元件EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)由P-SETit.Rcc3-1:1:1启动子(SEQ ID NO：15)和P-SETit.Rcc3-1:1:2前导序列(SEQ ID NO：16)组成。表达元件EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)由P-SETit.Rcc3-1:1:10启动子(SEQ ID NO：18)和L-SETit.Rcc3-1:1:2前导序列(SEQID NO：16)组成。表达元件EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)由P-SETit.Rcc3-1:1:11启动子(SEQ ID NO：20)和P-SETit.Rcc3-1:1:2前导序列(SEQ ID NO：16)组成。
对于来自类金属硫蛋白基因的调控元件，设计了两个启动子变体(附图2)。P-SETit.Mtha-1:1:1为较短的483个核苷酸的版本；P-SETit.Mthb-1:1:2为其较长的1516个核苷酸的版本。表达元件EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)由P-SETit.Mtha-1:1:1启动子(SEQ ID NO：5)和L-SETit.Mth-1:1:1前导序列(SEQ ID NO：6)组成。表达元件EXP-SETit.Mthb(SEQ ID NO：7)由P-SETit.Mthb-1:1:2启动子(SEQID NO：8)和L-SETit.Mth-1:1:1前导序列(SEQ ID NO：5)组成。
对于来自脱水相关蛋白基因的调控元件，分离了两个等位基因变体的调控元件(附图3A和3B)。两个等位基因变体具有相同的前导序列，但是启动子序列为当比对时有几个碱基改变和插入/缺失的变体。表达元件EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)由P-SETit.DRP-1:1:1启动子(SEQ ID NO：10)和L-SETit.DRP-1:1:2前导序列(SEQ ID NO：11)组成。表达元件EXP-SETit.DRPb(SEQ ID NO：12)由P-SETit.DRPb-1:1:1启动子(SEQ ID NO：13)和L-SETit.DRP-1:1:2前导序列(SEQID NO：11)组成。
实施例2：在转基因玉米中驱动GUS的调控元件的分析
玉米植物转化有含有促使β-葡萄糖醛酸酶(GUS)转基因表达的测试调控元件的植物表达载体，并且在产生的植物中分析GUS蛋白的表达。
玉米植物转化有植物GUS表达构建体-pMON101552(EXP-SETit.TIP，SEQ ID NO：1)、pMON99662(EXP-SETit.Mtha，SEQ IDNO：4)和pMON99663(EXP-SETit.DRPa，SEQ ID NO：9)。使用本领域技术人员已知的粒子轰击方法和玉米H99的未成熟合子胚转化植物，以产生转基因玉米植物。简而言之，玉米H99植物的穗在授粉10-13天后从温室培育植物中收集并且使其绝育。从穗上切除1.2-1.5mm的未成熟合子胚，并且在用作轰击的靶标组织前在黑暗中在28℃培育3-5天。用限制性内切酶水解含有卡那霉素抗性的可选择性标记(NPTII基因)和GUS表达盒的植物转化载体。含有可选择性标记和GUS表达盒两者的单个DNA片段经过凝胶纯化，并用于涂布0.6微米的金颗粒(目录#165-2262 Bio-Rad，Hercules，CA)，以用于轰击。对宏载体装载DNA涂层的金颗粒(目录#165-2335 Bio-Rad，HerculesCA)。将胚芽转移至渗透性培养基，盾片侧向上。PDS 1000/He基因枪(biolistic gun)用于转化(目录#165-2257 Bio-Rad，Hercules CA)。培养了受轰击的未成熟的胚芽，并且选择转基因愈伤组织和转移至组织再生培养基中。转基因玉米植物从转基因愈伤组织中再生并且转移至温室中。
组织化学GUS分析用于转化的植物的定性表达分析。用GUS染色溶液X-葡萄糖(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)(1毫克/毫升)培养整个组织切片适当的时间、润洗，并且视觉上检查蓝色着色。使用选择的植物器官和组织、通过直接视觉检查或在显微镜下检查来定性确定GUS活性。检查R0植物在根和叶中的表达。调控元件EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)证明了GUS在R0转化株中在根和叶两者中的表达。
转化有由EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)或EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)促使的GUS表达的植物与非转化的H99植物杂交，以产生转化株的F1种群。在发育过程中，在选择的组织中测量GUS表达水平。用于该研究的F1组织包括：浸渗的种子胚、浸渗的种子胚乳、根(发芽后3天)、胚芽鞘(发芽后3天)、V3主根和冠根、V3叶、V7种子根和冠根、V7成熟叶、VT(抽穗时，繁殖前)种子根、VT结间、VT穗轴、VT花粉囊、VT花粉、VT穗丝、授粉后7天的种仁、授粉后21天的胚芽、授粉后21天的胚乳、授粉后35天的胚芽、授粉后35天的胚乳。F1 GUS表达可见于研究的转化有EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)的事件(event)两者的所有组织中。
实施例3：在转基因玉米中驱动TIC809的调控元件的分析
用含有促使TIC809转基因表达的测试调控元件的植物表达载体转化玉米植物，并且分析产生的植物的TIC809蛋白表达。
调控元件被可操作地连接至植物转化载体中的昆虫毒素转基因TIC809(PCTUS2006/033867)。转基因盒由可操作地连接至衍生自玉米HSP70热休克蛋白的内含子的调控元件、可操作地连接至TIC809转基因的调控元件、可操作地连接至衍生自小麦HSP17基因3’UTR的调控元件组成。植物转化载体还含有用于选择转化的植物细胞的草甘膦耐受性可选择性标记。
使用本领域已知的方法，采用根癌土壤杆菌介导的与质粒pMON70539(EXP-SETit.TIP，SEQ ID NO：1)、pMON70540(EXP-SETit.Mtha，SEQ ID NO：4)和pMON70538(EXP-SETit.DRPa，SEQ IDNO：9)的转化，转化来自变种LH244的玉米组织。R0植物从转化的玉米组织再生，并且测试以确定TIC809转基因的存在和完整性。在V4或V6阶段使用TIC809用酶联免疫吸附法(ELISA)分析来自这些植物的叶和根，以确定TIC809蛋白聚集程度。通过TIC809对照样品确定蛋白质值，并且以百万分率(ppm)为单位表示。ELISA数据显示于以下表2中，其中“N”表明测试的植物数量。
表2：TIC809 R0 ELISA数据。
Figure BPA00001250370700261
在根和叶两者中观察到由表达元件EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)驱动的TIC809的表达，因此证明了调控元件EXP-SETit.TIP、EXP-SETit.Mtha和EXP-SETit.DRPa对于调控植物中农学目的的可操作地连接的转基因转录的能力。由EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)、EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)和EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)驱动的平均TIC809表达在叶中相对于所有三个构建体的根而言至少为2倍或更高。
含有载体pMON70539(EXP-SETit.TIP，SEQ ID NO：1)、pMON70540(EXP-SETit.Mtha，SEQ ID NO：4)和pMON70538(EXP-SETit.DRPa，SEQ ID NO：9)的转化的R0植物与变种LH59杂交，使用LH59作为雌株植物以及转化的LH244作为雄株植物，以产生转化的F1种群。对于含有EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)的植物，继而使用ELISA，在V3、V7和VT阶段测量F1叶中的TIC809蛋白含量；在V3和V7阶段测量根中的TIC809蛋白含量；在大约VT阶段(花粉囊、花粉和穗丝)测量再生组织中的TIC809蛋白含量；以及测量正在发育的种子或种仁中的TIC809蛋白含量。ELISA结果以百万分率(ppm)表示，其中标准偏差测量表示为“SE”，并显示于下面表3中。对于含有EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)的植物，使用ELISA通过选自V9阶段的组织，测量根中的TIC809蛋白含量。ELISA结果以百万分率(ppm)表示，并显示于以下表4中。
表3：EXP-SETit.TIP和EXP-SETit.Mtha的TIC809 F1 ELISA数据。
Figure BPA00001250370700271
F1种群中由调控元件EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)和EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)驱动的平均TIC809蛋白表达水平与R0转化株中观察到的表达水平一致，因而确定TIP和Mtha调控元件驱动可操作地连接的转基因的表达的能力。EXP-SETit.TIP(SEQ ID NO：1)在根和叶中在V3阶段看起来具有其最高的表达水平，在V7阶段表达下降以及在再生组织和正在发育的种子中表达低。EXP-SETit.Mtha(SEQ ID NO：4)显示在V3和V7阶段中TIC809在根和叶中的表达一致，在VT阶段中叶中的表达降低，在再生组织中的表达降低以及在正在发育的种子中无表达。
表4：EXP-SETit.DRPa的TIC809 F1 ELISA数据。
  F1杂交组织   ppm
  LH59/ZM_S198227   0.95
  LH59/ZM_S198230   2.69
  LH59/ZM_S198235   0.5
  LH59/ZM_S199429   1.26
  LH59/ZM_S201032   1.09
  LH59/ZM_S201049   0.64
  平均TIC809表达   1.19
  标准偏差   0.79
在F1种群的根中由调控元件EXP-SETit.DRPa(SEQ ID NO：9)驱动的平均TIC809蛋白表达水平与R0转化株中所观察到的表达水平相一致，因而确定了DRPa调控元件提供可操作地连接的转基因的根表达的能力。
如上所述产生了用pMON120408(EXP-SETit.Rcc3-1，SEQ ID NO：14)、pMON120407(EXP-SETit.Rcc3-10，SEQ ID NO：17)和pMON120410(EXP-SETit.Rcc3-11，SEQ ID NO：19)转化的植物的R0种群。使用ELISA，采用取自V4或V6阶段的组织，测量了这些植物在根和叶中的TIC809蛋白含量。ELISA结果以百万分率(ppm)表示并显示于以下表5中。
表5：EXP-SETit.Rcc3-1、EXP-SETit.Rcc3-10和EXP-SETit.Rcc3-11的TIC809 R0 ELISA数据。
  元件名称   事件   根(ppm)  叶(ppm)
  EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)   1   0.292  0
  EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)   2   2.79  0
  EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)   3   1.171  0
  EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)   平均   1.42  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   1   2.129  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   2   1.793  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   3   0.425  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   4   0.677  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   5   0.877  0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   6   1.847   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   7   1.479   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   8   0.359   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   9   1.84   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   10   3.309   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   11   1.589   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   12   3.652   0.294
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   13   1.019   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   14   2.715   0.56
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   15   0.981   0
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   16   3.147   0.317
  EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)   平均   1.74   0.07
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   1   2.356   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   2   2.343   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   3   1.465   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   4   2.271   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   5   0.247   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   6   2.949   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   7   3.36   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   8   4.771   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   9   1.757   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   10   2.255   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   11   3.314   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   12   4.958   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   13   0.232   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   14   1.503   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   15   1.425   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   16   3.6   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   17   3.533   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   18   2.158   0
  EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)   平均   2.47   0
由表达元件变体EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ ID NO：14)、EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)和EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ ID NO：19)促驱动的TIC809的表达在根中为强的，且在叶中为弱的或无。除了三个转化的事件中表达元件变体EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)显示出叶中的低TIC809表达水平以外，在三个SETit.Rcc3变体中观察到低或无叶表达。使用表达元件变体EXP-SETit.Rcc3-11(SEQ IDNO：19)的根中平均TIC809蛋白表达比EXP-SETit.Rcc3-1(SEQ IDNO：14)和EXP-SETit.Rcc3-10(SEQ ID NO：17)变体中的高，但是所有三个变体均提供了可操作地连接的转基因的根表达。
已经例证和描述了本发明的原则，对于本领域研究人员应该明白，在不背离该原则的前提下可以改变本发明的安排和细节。我们要求保护权利要求书的精神和范围内的所有变型。本文引用的所有出版物和公布的专利文件在此以引用方式结合入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请均以引用的方式具体地和单独地结合入本文一样。
Figure IPA00001250370300021
Figure IPA00001250370300031
Figure IPA00001250370300041
Figure IPA00001250370300061
Figure IPA00001250370300071
Figure IPA00001250370300081
Figure IPA00001250370300091
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Figure IPA00001250370300121
Figure IPA00001250370300131

Claims (7)

1.一种包含调控元件的DNA分子，该调控元件的DNA序列为SEQ ID NO：1的序列，
其中所述调控元件可操作地连接至异源可转录的多核苷酸分子。
2.一种包含调控元件的DNA构建体，该调控元件的DNA序列为SEQ ID NO：1的序列，
其中所述调控元件可操作地连接至异源可转录的多核苷酸分子。
3.如权利要求2所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷酸分子为农学目的基因，所述农学目的基因是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时提供与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关联的所需特征的可转录的多核苷酸分子。
4.如权利要求2所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷酸分子为在植物中能够提供除草剂抗性的基因。
5.如权利要求2所述的DNA构建体，其中，所述可转录的多核苷酸分子为在植物中能够提供植物害虫控制的基因。
6.一种制备转基因植物的方法，包括用权利要求1所述的DNA分子转化植物。
7.一种制备转基因植物的种子的方法，包括用权利要求1所述的DNA分子转化植物并从所述转化的植物收获种子。
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