MX2010011003A - Elementos regulatorios en las plantas y usos de los mismos. - Google Patents

Elementos regulatorios en las plantas y usos de los mismos.

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Stanislaw Flasinski
Charles R Dietrich
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Abstract

La presente invención da a conocer novedosos elementos regulatorios para usar en plantas; la presente invención también da a conocer construcciones de ADN que contienen estos novedosos elementos regulatorios; células transgénicas y semillas que contienen estos novedosos elementos regulatorios; como asi también métodos para la preparación y uso de los mismos.

Description

ELEMENTOS REGU LATO RIOS EN LAS PLANTAS Y USOS DE LOS MISMOS La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisoria de los Estados Unidos No. 61/042,957 presentada el 7 de abril de 2008, que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.
INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias contenido en el archivo denominado "MONS222WO_Sequence_Listing", que tiene 30,2 Kbytes (medidos de acuerdo con Microsoft Windows®) y que fuera generado el 21 de marzo de 2009, se presenta con la presente mediante remisión electrónica y que se incorpora a la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la biología molecular de las plantas e ingeniería genética de plantas y con moléculas de ADN útiles para la modulación de la expresión génica en las plantas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los elementos regulatorios son elementos genéticos que regulan la actividad de los genes mediante la modulación de la transcripción de una moléculas polinucleotídica transcribible operativamente ligada. Dichos elementos incluyen promotores, líderes, ¡ntrones y regiones 3' sin traducir y son de utilidad en el campo de la biología molecular de las plantas y la ingeniería genética de las plantas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención da a conocer novedosos elementos regulatorios del Panizo Blanco ("Foxtail millet") (Setaria itálica (L.) Beauv) para usar en plantas. La presente invención da a conocer asimismo construcciones de ADN que comprenden los elementos regulatorios. La presente invención exhibe asimismo células, plantas y semillas de plantas transgénicas que comprenden los elementos regulatorios operativamente ligados a una molécula polinucleotídica transcribible. La presente invención también da a conocer métodos para la preparación y uso de los elementos regulatorios, las construcciones de DNA que comprenden los elementos regulatorios, y las células de plantas transgénicas, plantas y semillas que comprenden los elementos regulatorios operativamente ligados a una molécula polinucleotídica transcribible.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra las tres variantes de promotores diseñadas a partir de los elementos regulatorios del gen de la Proteína de transferencia de lípidos. SEQ ID NO: 15 corresponde a P-SETit.Rcc3-1 :1 :1 y tiene una longitud de 2062 pares de bases nucleotídicas; SEQ ID NO: 20 corresponde a P-SETit.Rcc3-1:1 :11 y tiene una longitud de 915 pares de bases nucleotídicas y SEQ ID NO: 18 corresponde a P-SETit.Rcc3-1 :1 :10 y tiene una longitud de 1563 pares de bases nucleotídicas.
La figura 2 ilustra las dos variantes de promotores diseñados partir de los elementos regulatorios del gen de la Proteína tipo metalotioneína. SEQ ID NO: 5 corresponde a P-SETit.Mtha-1:1 :1 y tiene una longitud de 483 pares de bases; SEQ ID NO: 8 corresponde a P-SETit.Mthb-1 :1 :2 y tiene una longitud de 1516 pares de bases.
Las figuras 3A y 3B ilustran colectivamente un alineamiento de secuencias producido con el uso de alineamiento de secuencias múltiples por CLUSTAL W (1.82) de las dos variantes alélicas de los promotores del gen de la Proteína relacionada con la deshidratación. En el consenso debajo de las secuencias alineadas, los apareamientos están marcados con "*", las faltas de apareamiento están marcados con "." y las deleciones/inserciones están marcados con Las dos variantes alélicas tenían secuencias líder idénticas, aunque las secuencias promotoras eran variantes de secuencia al alinearse. SEQ ID NO: 10 es P-SETit.DRPa-1 :1 :1 y SEQ ID NO: 13 es P-SETit.DRPb- 1 :1 :1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las siguientes definiciones y métodos se presentan con el fin de dar a conocer la invención y para guiar a las personas con capacitación normal en la técnica al poner en práctica la presente invención. A menos que específicamente se indique lo contrario, los términos se deben interpretar de acuerdo con el uso convencional dado por las personas con capacitación normal en la técnica.
Moléculas de ADN En el presente contexto, el término "ADN" o "molécula de ADN" se refiere a una molécula de ADN bicatenario de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótidos o una molécula polinucleotídica, leída desde el extremo 5' (secuencia arriba) hacia el extremo 3' (secuencia abajo). En el presente contexto, el término "secuencia de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en la presente es la impuesta por el Título 37 del Código de Normas Federales de los Estados Unidos § 1.822 y expuesta en los cuadros de la Norma WIPO ST.25 (1998), Apéndice 2, cuadros 1 y 3.
En el presente contexto, el término "molécula aislada de ADN" se refiere a una molécula de ADN separada, por lo menos parcialmente, de otras moléculas normalmente asociadas con la misma en su estado nativo o natural. En una modalidad, el término "aislada" se refiere a una molécula de ADN que está separada por lo menos parcialmente de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean a la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por consiguiente, en este contexto se consideran aisladas las moléculas de ADN fusionadas a secuencias regulatorias o codificadoras con las cuales no están asociadas normalmente, por ejemplo como resultado de técnicas recombinantes. Dichas moléculas se consideran aisladas aun y cuando estén integradas al cromosoma de una célula huésped o presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN.
Se puede utilizar cualquier número de métodos muy conocidos por las personas con capacitación normal en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, descripta en la presente invención. Por ejemplo, se puede emplear la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar y/o para producir vanantes de la molécula original. También se pueden utilizar moléculas de ADN, o un fragmento de las mismas, mediante otras técnicas, como por ejemplo sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como se hace habitualmente mediante el uso de un sintetizador automático de oligonucleótidos.
En el presente contexto, el término "identidad de secuencia" se refiere al grado en el cual dos secuencias de polinucleótidos son idénticas. Se genera un alineamiento óptimo de secuencias alineando manualmente dos secuencias, por ejemplo una secuencia de referencia y otra secuencia, para maximizar el número de apareamientos de nucleótidos en el alineamiento de secuencias con inserciones, deleciones o brechas internas apropiadas. En el presente contexto, el término "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia que se presenta como SEQ ID NO: 1-20.
En el presente contexto, el término "porcentaje de identidad de secuencia" o "por ciento de identidad" o "% de identidad" se refiere a la fracción de identidad por 100. La "fracción de identidad" con respecto a una secuencia alineada en forma óptica con una secuencia de referencia es el número de apareamientos de nucleótidos en el alineamiento óptimo, dividido por el número total de nucleótidos de la secuencia de referencia, por ejemplo el número total de nucleótidos de la secuencia de referencia completa. Por consiguiente, una modalidad de la presente invención consiste en una molécula de ADN que comprende una secuencia que, al alinearse de manera óptima con una secuencia de referencia presentada aquí como SEQ ID NO: 1-20, tiene aproximadamente 85 por ciento de identidad o más, aproximadamente 85 por ciento de identidad o más, aproximadamente 90 por ciento de identidad o más, aproximadamente 95 por ciento de identidad o más, o por lo menos 96 por ciento de identidad, 97 por ciento de identidad, 98 por ciento de identidad o 99 por ciento de identidad con la secuencia de referencia y tiene actividad regulatoria de los genes.
Elementos regulatorios Un elemento regulatorio es una molécula de ADN que tiene actividad regulatoria génica, es decir la que tiene la capacidad de afectar la transcripción y/o traducción de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada. El término "actividad regulatoria de los genes" se refiere, por consiguiente, a la capacidad de afectar el patrón de expresión de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada al afectar la transcripción y/o traducción de esa molécula polinucleotídica operativamente ligada. La actividad regulatoria de los genes puede ser positiva y/o negativa y el efecto se puede caracterizar por sus cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, tisulares, ambientales, fisiológicas, patológicas, del ciclo celular y/o de respuesta química, como así también por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
Los elementos regulatorios tales como promotores, líderes, intrones y regiones de terminación de la transcripción son moléculas de ADN con actividad regulatoria de la actividad y desempeñan un papel de importancia en la expresión génica en células vivas, en general. El término "elemento regulatorio" se refiere a una molécula de ADN con actividad regulatoria de los genes, es decir la que afecta la transcripción y/o traducción de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada. Por lo tanto, los elementos regulatorios aislados, tales como promotores y líderes, que funcionan en las plantas, son ventajosos para la modificación de fenotipos de las plantas por métodos de ingeniería genética.
Los elementos regulatorios se pueden caracterizar por su patrón de expresión, es decir, por su patrón de expresión constitutivo o su patrón de expresión temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológico, patológico, del ciclo celular y/o de respuesta química, y cualquier combinación de los mismos, como así también por indicaciones cuantitativas y cualitativas. Un promotor es útil como elemento regulatorio para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada.
En el presente contexto, un "patrón de expresión génica" es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN operativamente ligada en una molécula de ADN transcripta. La expresión se puede caracterizar por sus propiedades cualidades temporales, espaciales, de desarrollo, tisulares, ambientales, fisiológicas, patológicas, del ciclo celular y/o de respuesta química, como así también por indicaciones cuantitativas o cualitativas. La molécula de ARN transcripto se puede traducir para producir una molécula de proteína o se puede dar origen a una molécula de ARN antisentido o regulatorio de otro tipo, como por ejemplo un dsARN, un ARNt, un ARNr, un miARN y demás.
En el presente contexto, el término "expresión de proteína" es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrpta en una molécula de proteína. La expresión de proteínas se puede caracterizar por sus características temporales, espacíale, de desarrollo o morfológicas, como así también por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
En el presente contexto, el término "promotor" se refiere, en general, a una molécula de ADN que está implicada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción de acción en trans) para dar comienzo a la transcripción. Se puede aislar un promotor inicialmente de la región 5' sin traducir (5' UTR) de una copia genómica de un gen. Por otro lado, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas en forma sintética o manipuladas. Los promotores también pueden ser quiméricos, es decir promotores producidos por la fusión de dos o más moléculas de ADN heterólogas. Entre los promotores convenientes para poner en práctica la presente invención se incluyen SEQ ID NO: 2, 5, 8, 10, 13 y 20 o fragmentos o variantes de los mismos.
En una modalidad, se producen fragmentos de una secuencia promotora descripta en la presente. Los fragmentos de promotor pueden exhibir actividad promotora y pueden ser de utilidad solos o en combinación con otros promotores y fragmentos de promotores, como por ejemplo en la construcción de promotores quiméricos. En modalidades específicas, se presentan fragmentos de un promotor que comprenden por lo menos aproximadamente 50, 95, 150, 250, 500 o aproximadamente 750 nucleótidos contiguos de una molécula polinucleotídica con actividad de promotor de acuerdo con lo aquí descripto. Dichos fragmentos pueden exhibir por lo menos aproximadamente 85 por ciento, aproximadamente 90 por ciento, aproximadamente 95 por ciento, aproximadamente 98 por ciento o aproximadamente 99 por ciento, o más, de identidad con una secuencia de referencia cuyo están alineados de manera óptima con la secuencia de referencia.
También se puede analizar un promotor o fragmento de promotor para detectar la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, las características de la secuencia de ADN, como por ejemplo una caja TATA y otros motivos conocidos de sitios de unión a factores de transcripción. Una persona con capacitación en la técnica puede utilizar la identificación de dichos elementos promotores conocidos para diseñar variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar a los del promotor original.
En el presente contexto, el término "potenciador" o "elemento potenciador" se refiere a un elemento regulatorio de la transcripción de acción en cis, también conocido como elemento cis, que confiere un aspecto del patrón de expresión global, aunque habitualmente es insuficiente por sí solo para impulsar la transcripción, de una secuencia de polinucleótidos operativamente ligada. A diferencia de los promotores, los elementos potenciadores no incluyen por lo general un sitio de iniciación de la transcripción (TSS) ni una caja TATA. Un promotor puede comprender, en la naturaleza, uno o más elementos potenciadores que afectan la transcripción de una secuencia polinucleotídica operativamente ligada. También puede haber un elemento potenciador aislado fusionado a un promotor para producir un promotor.elemento cis quimérico, que confiere un aspecto de la modulación total de la expresión génica. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender uno o más elementos potenciadores que afectan la transcripción de genes operativamente ligados. Se cree que muchos elementos promotores potenciadores se unen a las proteínas que fijan el ADN y/o afectan la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa al modelo de ADN o que facilitan la apertura selectiva de la doble hélice en el sitio de iniciación de la transcripción. Un elemento potenciador puede cumplir la función de unirse a factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos potenciadores se unen a más de un factor de transcripción y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades con más de un dominio potenciador. Los elementos potenciadores se pueden identificar mediante un número de técnicas, incluyendo análisis por deleción, es decir, suprimiendo uno o más nucleótidos del extremo 5' o internos de un promotor, análisis de proteínas que se unen al ADN empleando la toma de huellas digitales con DNAsa I, interferencia por metilación, ensayos de electroforesis de movilidad-desplazamiento, toma de huellas digitales genómicas in vivo mediante PCR mediada por ligamiento y otros ensayos convencionales, o bien mediante el análisis de similitud de secuencias de ADN utilizando motivos conocidos de elementos cis o elementos potenciadores como secuencia de destino o motivo de destino con métodos de comparación de secuencias de ADN convencionales, como por ejemplo BLAST. Se puede estudiar más profundamente la estructura fina de un dominio potenciador mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos, o por otros métodos convencionales. Los elementos potenciadores se pueden obtener mediante síntesis química o mediante aislamiento de elementos regulatorios que incluyan esos elementos, y se los puede sintetizar con otros nucleótidos flanqueantes que contienen sitios de enzimas de restricción convenientes para facilitar la manipulación de subsecuencias. Por consiguiente, el diseño, construcción y uso de los elementos potenciadores de acuerdo con los métodos aquí descriptos para la modulación de la expresión de moléculas polinucleotídicas transcribibles operativamente ligadas están abarcados en la presente invención.
En el presente contexto, el término "líder" se refiere a una molécula de ADN aislada de la región 5' sin traducir (5' UTR) de una copia genómica de un gen y se define en general como segmento nucleotídico entre el sitio de comienzo de la transcripción (TSS) y el sitio de comienzo de la secuencia codificadora de la proteína. Por otro lado, las líderes pueden ser elementos de ADN producidos en forma sintética o manipulados. Se puede utilizar una líder como elemento regulatorio 5' para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada. Las moléculas líder se pueden utilizar con un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Por consiguiente, las moléculas promotoras de la presente invención pueden estar ligadas operativamente a su líder nativa o pueden estar ligadas operativamente a una líder heteróloga. Las líderes ventajosas para poner en práctica la presente invención incluyen SEQ ID NO: 3, 6, 11 y 16 o fragmentos o variantes de las mismas.
En el presente contexto, el término "quimérica" se refiere a una molécula individual de ADN producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontrarían normalmente en esa configuración, o sea fusionadas entre si. La molécula de ADN quimérica es, por lo tanto, una nueva molécula de ADN que de lo contrario no se encontraría normalmente en la naturaleza. En el presente contexto, el término "promotor quimérico" se refiere a un promotor producido por medio de la manipulación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN; un ejemplo de esto sería la fusión de un promotor a un elemento potenciador. Por consiguiente, el diseño, construcción y uso de promotores quiméricos de acuerdo con los métodos descriptos en la presente para la modulación de la expresión de moléculas polinucleotídicas transcribibles operativamente ligadas está comprendido en la presente invención.
En el presente contexto, el término "variante" se refiere a una segunda molécula de ADN que es de composición similar, aunque no idéntica, a una primera molécula de ADN y donde, sin embargo, la segunda molécula de ADN mantiene la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, que la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión más corta o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión modificada de la secuencia de la primera molécula de ADN, como por ejemplo una que incluya diferentes sitios de restricción enzimática y/o deleciones, sustituciones y/o inserciones internas. En la presente invención, se puede utilizar una secuencia polinucleotídica presentada bajo la denominación SEQ ID NO: 1-20 para generar variantes que son similares, aunque no idénticas, en su composición, a la secuencia polinucleotídica del elemento regulatorio original, y que de todas maneras mantienen la funcionalidad general, es decir, un patrón de expresión igual o similar, del elemento regulatono original. La producción de tales variantes de la presente invención está muy al alcance de las personas con capacitación normal en la técnica a la luz de la descripción y está abarcada en el alcance de la presente invención.
Construcciones En el presente contexto, el término "construcción" se refiere a cualquier molécula de polinucleótido recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, molécula polinucleotídica de replicación autónoma, fago o molécula polinucleotídica de ADN bicatenario o ARN lineal o circular derivada de cualquier origen, con capacidad de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula polinucleotídica, donde se ha ligado una o más moléculas polinucleotídica de manera funcíonalmente operativa, es decir que está operativamente ligada. En el presente contexto, el término "vector" se refiere a cualquier construcción polinucleotídica recombinante que se puede utilizar con el propósito de transformación, es decir, la introducción del ADN heterólogo en una célula huésped.
En el presente contexto, el término "operativamente ligada" se refiere a una primera molécula unida a una segunda molécula, donde las moléculas están dispuestas de tal manera que la primera molécula afecta la función de la segunda molécula. Las dos moléculas pueden, o no, ser partes de una única molécula contigua o pueden, o no, estar adyacentes. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible si el promotor modula la transcripción de la molécula polinucleotídica de interés en una célula.
Los construcciones de acuerdo con la presente invención son generalmente construcciones de ADN de borde de plásmidos Ti dobles que tienen regiones de borde derecho (RB o AGRtu.RB) y de borde izquierdo (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un ADN-T, que junto con las moléculas de transferencia provistas por las células de Agrobacterium tumefaciens, permiten la integración del ADN al genoma de una célula vegetal (ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,603,061). Los construcciones pueden contener además segmentos de ADN del esqueleto plasmídico que otorgan la función de repllcación y selección antibiótica en las células bacterianas, por ejemplo un origen de replicación de Escherichia coli tal como on'322, un origen de replicación de una amplia gama de huéspedes tales como orN o oriRi, y una región codificadora para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp que codifica para Tn7 aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación de plantas, la cepa bacteriana huésped es a menudo Agrobacterium tumefaciens ABI, C58 o LBA4404; aunque otras cepas conocidas por las personas con capacitación normal en la técnica pueden funcionar también en la presente invención.
En la técnica se conocen métodos para el ensamble e introducción de construcciones en una célula de tal manera que la molécula polinucleotídica transcribi le se transcriba en una molécula de ARNm funcional que se traduce y expresa en forma de producto proteico. Para la práctica de la presente invención, las composiciones y métodos convencionales para la preparación y uso de construcciones y células huésped son muy conocidos por las personas con capacitación normal en la técnica; ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición Tomos 1, 2, y 3 (2000) J.F. Sambrook, D.W. Russell, y N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los métodos para la preparación de vectores recombinantes adecuados para la transformación de plantas incluyen, aunque no a modo de limitación, los descriptos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.971.908; 4.940.835; 4.769.061 ; y 4.757.011 , que se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Estos tipos de vectores también han sido reseñados en la literatura científica (ver, por ejemplo, Rodríguez, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors y Their Uses, Butterworths, Boston, (1988) y Glick, et al., Methods in Plant Molecular Biology y Biotechnology, CRC Press, Boca Ratón, FL. (1993)). Los vectores habituales ventajosos para la expresión de ácidos nucleicos en las plantas superiores son muy conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (Rogers, et al., Methods in Enzymology, 153: 253-277 (1987)). También se han descripto en la literatura científica otros vectores recombinantes útiles para la transformación de las plantas, incluyendo el vector de control de transferencia pCaMVCN (ver, por ejemplo, Fromm, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 5824-5828 (1985)).
En una construcción se pueden incluir varios elementos regulatorios. Se puede presentar cualquiera de esos elementos regulatorios en combinación con otros elementos regulatorios. Dichas combinaciones pueden ser diseñadas o modificadas para producir características regulatorias ventajosas. Los construcciones de acuerdo con la presente invención comprenderían, por lo general, por lo menos un elemento regulatorio operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada a una molécula de terminación de la transcripción 3'.
Las construcciones de acuerdo con la presente invención pueden incluir cualquier promotor o líder conocido en la técnica. Por ejemplo, un promotor de acuerdo con la presente invención puede estar operativamente ligado a una líder heteróloga sin traducir 5' tal como la derivada de un gen de proteína termosensible (ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,659,122 y 5,362,865). Por otro lado, una líder de acuerdo con la presente invención puede estar operativamente ligada a un promotor heterologo tal como el promotor transcripto del Virus del Mosaico de la Coliflor (ver la Patente de los Estados Unidos No. 5,352,605).
En el presente contexto, el término "intrón" se refiere a una molécula de ADN que puede ser aislada o identificada de la copia genómica de un gen y que se puede definir, en términos generales, como región cortada durante el procesamiento del ARNm con anterioridad a la traducción. Por dtro lado, un intrón puede ser un elemento de ADN producido por medio de síntesis o manipulado. Un intrón puede contener elementos potenciadores que afecten la transcripción de los genes operativamente ligados. Se puede utilizar un intrón como elemento regulatorio para modular la expresión de una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada. Una construcción de ADN puede comprender un intrón, y el intrón puede o no ser heterólogo con respecto a la secuencia de la molécula polinucleotídica transcribible. Entre los ejemplos de intrones conocidos en la técnica se cuenta el intrón de la actina del arroz (Patente de los Estados Unidos No. 5.641.876) y el intrón del maíz HSP70 (Patente de los Estados Unidos No. 5,859,347).
En el presente contexto, el término "molécula de terminación de la transcripción3'" o "3' UTR" se refiere a una molécula de ADN que se utiliza durante la transcripción para producir la región 3' sin traducir (3' UTR) de una molécula de ARNm. La región 3' sin traducir de una molécula de ARNm se puede generar mediante escisión específica y poliadenilación en 3', la que también se conoce como cola poliA. Una 3' UTR puede estar operativamente ligada a una molécula polinuccleotídica transcribible y situada detrás de la misma y puede incluir polinucleótidos que producen una señal de poliadenilación y otras señales regulatorias con capacidad para afectar la transcripción, el procesamiento del ARNm o la expresión génica. Se cree que las colas PoliA cumplen la función de estabilizar el ARNm y dar comienzo a la traducción. Los ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción 3' conocidos en la técnica son la región 3' de la nopalina sintasa (ver, Fraley, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807 (1983)); la región hsp17 3' del trigo; la región 3' de pequeñas subunidades rubisco de la arveja; la región 3' E6 del algodón (Patente de los Estados Unidos No. 6.096.950); las regiones 3' descriptas en WO0011200A2; y la 3' UTR de coixina (Patente de los Estados Unidos No. 6,635,806).
Los construcciones y vectores pueden incluir además una secuencia codificadora de péptido de tránsito que expresa un péptido ligado que sirve para el direccionamiento a un producto proteico, especialmente a un cloroplasto, leucoplasto u otra organela plastídica, mitocondrias, peroxisoma, vacuola, o a una ubicación extracelular. Para obtener descripciones del uso de péptidos de tránsito al cloroplasto, ver la Patente de los Estados Unidos No. 5,188,642 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,728,925. Muchas proteínas localizadas en el cloroplasto se expresan de genes nucleares como precursores y se dirigen al cloroplasto por medio de un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP). Entre los ejemplos de dichas proteínas aisladas en el cloroplasto se cuentan, aunque no a modo de limitación, las asociadas con la pequeña subunidad (SSU) de ribulosa-1 ,5,-bisfosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, el complejo colector de luz proteína I y proteína II, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS) y los péptidos de tránsito descriptos en la Patente de los Estados Unidos No. 7,193,133. Se ha demostrado, tanto in vivo como in vitro, que se pueden dirigir proteínas que no son del cloroplasto al cloroplasto mediante el uso de fusiones proteicas con un CTP heterólogo y que el CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. Se ha demostrado que la incorporación de un péptido de tránsito al cloroplasto adecuado, tal como CTP EPSPS de Arabidopsis thaliana (CTP2) {Ver, Klee et al., Mol. Gen. Genet, 210:437-442 (1987)) o el CTP EPSPS de Petunia hybrída (CTP4) {Ver, della-Cioppa et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:6873-6877 (1986)) dirige secuencias proteicas heterólogas EPSPS a los cloroplastos de plantas transgénicas {Ver, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,627,061 ; 5,633,435; y 5,312,910 y EP 0218571 ; EP 189707; EP 508909; y EP 924299).
Moléculas polinucleotídicas transcribióles En el presente contexto, el término "molécula polinucleotídica transcribible" se refiere a cualquier molécula de ADN con capacidad para ser transcripta en una molécula de ARN incluyendo, aunque no a modo de limitación, las que tienen secuencias codificadoras de proteínas y lasa que tienen secuencias útiles para la supresión de genes. Un "transgén" se refiere a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga con respecto a una célula huésped y/o una molécula polinucleotídica transcribible artificialmente incorporada al genoma de una célula huésped.
Un promotor de la presente invención puede estar operativamente ligada a una molécula polinucleotídica transcribible que es heteróloga con respecto a la molécula del promotor. En el presente contexto, el término "heteróloga" se refiere a la combinación de dos o más moléculas polinucleotídicas cuando dicha combinación no se encontraría normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas pueden derivar de diferentes especies y/o las dos moléculas pueden derivar de diferentes genes por ejemplo genes diferentes de la misma especie o los mismos genes de diferentes especies. Por lo tanto, un promotor es heterólogo con respecto a una molécula polinucleotídica transcribible operativamente ligada si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, que esa molécula polinucleotídica transcribible no aparece naturalmente operativamente ligada en combinación con esa molécula promotora.
La molécula polinucleotídica transcribible puede ser, en general, cualquier molécula de ADN para la cual se pretende la expresión de una transcripción de ARN. Dicha expresión de una transcripción de ARN puede dar lugar a la traducción de la molécula de ARNm obtenida y, por consiguiente, a la expresión de la proteína. Por otro lado, se puede diseñar una molécula polinucleotídica transcribible de manera que, en última instancia, cause la expresión reducida de un gen o proteína específica. Esto se puede lograr mediante el uso de una molécula polinucleotídica transcribible que está orientada en la dirección antisentido. Una persona con capacitación normal en la técnica está familiarizada con dicha tecnología antisentido. En pocas palabras, al transcribirse la molécula polinucleotídica transcribible antisentido, el producto ARN se híbrida y secuestra una molécula de ARN complementario dentro de la célula. Esta molécula de ARN en dúplex no puede ser traducida en una proteína por la maquinaria de traducción de la célula y se degrada en la célula. De esa manera se puede regular negativamente cualquier gen.
Por consiguiente, una modalidad de la presente invención consiste en un elemento regulatorio de la presente invención, tal como el que se presenta en SEQ ID NO: 1-20, operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible con el fin de modular la transcripción de la molécula polinucleotídica transcribible en un nivel pretendido o en un patrón pretendido tras la introducción de dicha construcción en una célula vegetal. En una modalidad, la molécula polinucleotídica transcribible comprende una región codificadora de proteínas de un gen y el promotor afecta la transcripción de una molécula de ARN que se traduce y expresa en forma de producto proteico. En otra modalidad, la molécula polinucleotídica transcribible comprende una región antisentido de un gen y el promotor afecta la transcripción de una molécula de ARN antisentido u otra molécula de ARN inhibitoria similar para inhibir la expresión de una molécula específica de ARN de interés en una célula huésped de destino.
Genes de Interés Agronómico Las moléculas polinucleotídicas transcribibles pueden ser genes de interés en la agronomía. En el presente contexto, el término "gen de interés agronómico" se refiere a una molécula polinucleotídica transcribible que, al expresarse en un tejido, célula o tipo de célula vegetal específico, confiere una característica conveniente asociada a la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, producto, perfil nutricional, resistencia a las enfermedades o plagas y/o tolerancia ambiental o química de las plantas. Los genes de interés agronómico incluyen, aunque no a modo de limitación, los que codifican una proteína de rendimiento, una proteína de resistencia al stress, una proteína de control del desarrollo, una proteína de diferenciación tisular, una proteína del meristema, una proteína de respuesta ambiental, una proteína de senescencia una proteína de respuesta a las hormonas, una proteína de abscisión, una proteína de origen, una proteína de destino, una proteína de control de la floración, una proteína de las semillas, una proteína de resistencia a los herbicidas, una proteína de resistencia a las enfermedades, una enzima para la biosíntesis de ácidos grasos, una enzima para la biosíntesis del tocoferol, una enzima para la biosíntesis de aminoácidos, una proteína pesticida o cualquier otro agente tal como una molécula de ARN antisentido o ARNi que toma como blanco a un gen específico para la supresión. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta a fin de causar un efecto sobre la fisiología o el metabolismo de la planta o puede actuar como agente pesticida en la dieta dé una plaga que se alimenta de la planta.
En una modalidad de la invención, un promotor de la presente invención se incorpora a una construcción de tal manera que el promotor esté operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible que es un gen de interés agronómico. La expresión del gen de interés agronómico es conveniente para conferir un rasgo ventajoso para la agronomía. Un rasgo ventajoso para la agronomía puede ser, por ejemplo, aunque no a modo de limitación, tolerancia a los herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a las enfermedades fúngicas, resistencia a los virus, resistencia a los nematodos, resistencia a las enfermedades bacterianas, el crecimiento y desarrollo de las plantas, la producción de almidón, la producción modificada de aceites, la producción de alto contenido de aceite, contenido de ácidos grasos modificado, producción de alto contenido proteico, maduración de los frutos, potenciación de la nutrición para animales y humanos, biopolímeros, resistencia al stress ambiental, péptidos farmacéuticos y péptidos secretables, rasgos de procesamiento mejorados, digestibilidad mejorada, producción de enzimas, sabor, fijación de nitrógeno, producción de semillas híbridas, producción de fibra y producción de biocombustibles. Entre los ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica se incluyen los de resistencia a los herbicidas (Patente de los Estados Unidos No. 6,803,501 ; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; y 5,463,175), rendimiento incrementado (Patentes de los Estados Unidos Nos. USRE38.446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441 ,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211 ; 6,235,971 ; 6,222,098; y 5,716,837). control de insectos (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521 ,442; 6,501 ,009; 6,468,523; 6,326,351 ; 6,313,378; 6,284,949; 6,281 ,016; 6,248,536; 6,242,241 ; 6,221 ,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091 ; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; y 5,763,241 ), resistencia a las enfermedades fúngicas (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,653,280; 6,573,361 ; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671 ; 5,773,696; 6,121 ,436; 6,316,407; y 6,506,962), resistencia a los virus (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,617,496; 6,608,241 ; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; y 5,304,730), resistencia a los nematodos (Patente de los Estados Unidos No. 6,228,992), resistencia a las enfermedades bacterianas (Patente de los Estados Unidos No. 5,516,671), crecimiento y desarrollo de las plantas (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,723,897 y 6,518,488), producción de almidón (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,538,181 ; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295). producción modificada de aceites (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,444,876; 6,426,447; y 6,380,462), elevada producción de aceites (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; y 6,476,295), contenido modificado de ácidos grasos (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,828,475; 6,822,141 ; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461 ; y 6,459,018), elevada producción de proteínas (Patente de los Estados Unidos No. 6,380,466), maduración de los frutos (Patente de los Estados Unidos No. 5,512,466), nutrición animal y humana mejorada (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; y 6,171 ,640). biopolímeros (Patentes de los Estados Unidos Nos. USRE37,543; 6,228,623; y 5,958,745 y 6,946,588), resistencia al stress ambiental (Patente de los Estados Unidos No. 6,072,103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; y 6,080,560), rasgos de procesamiento mejorados (Patente de los Estados Unidos No. 6,476,295), digestibilidad mejorada (Patente de los Estados Unidos No. 6,531 ,648) bajo contenido de rafinosa (Patente de los Estados Unidos No. 6,166,292), producción de enzimas industriales (Patente de los Estados Unidos No. 5,543,576), sabor mejorado (Patente de los Estados Unidos No. 6,011 ,199), fijación de nitrógeno (Patente de los Estados Unidos No. 5,229,114), producción de semillas híbridas (Patente de los Estados Unidos No. 5,689,041), producción de fibra (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,576,818; 6,271 ,443; 5,981 ,834; y 5,869,720) y producción de biocombustibles (Patente de los Estados Unidos No. 5,998,700).
Por otro lado, un gen de interés agronómico puede afectar la característica o fenotipo de la planta antes mencionado al codificar una molécula de ARN que causa la modulación pretendida de la expresión génica de un gen endógeno, por ejemplo por medio de tecnología antisentido (ver, por ejemplo la Patente de los Estados Unidos No. 5,107,065); ARN inhibitorio ("ARNi", incluyendo la modulación de la expresión génica mediante mecanismos mediados por miARN, siARN, siARN de expresión en trans, y sARN en fases, por ejemplo de acuerdo con lo descripto en las solicitudes publicadas US 2006/0200878, US 2008/0066206, y US2009/0070898; o mecanismos mediados por cosupresión. El ARN también podría ser una molécula catalítica de ARN (por ejemplo, una ribozima o un riboswitch, ver, por ejemplo, US 2006/0200878) diseñado para la escisión de un producto de - ARNm endógeno pretendido. Por consiguiente, cualquier molécula polinucleotídica transcribible que codifica una molécula de ARN transcripto que afecta un fenotipo o cambio de morfología de interés importante desde el punto de vista agronómico puede ser de utilidad para poner en práctica la presente invención. Los métodos para la construcción e introducción de construcciones en una célula de tal manera que la molécula polinucleotídica transcribible se transcriba en una molécula con capacidad de causar la supresión del gen son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la supresión postranscripción de un gen utilizando una construcción con una molécula polinucleotídica transcribible orientada en antisentido para regular la expresión génica en las células vegetales, ha sido descripta en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,107,065 y 5,759,829, y la supresión génica postranscripción utilizando una construcción con una molécula polinucleotídica transcribible orientada en sentido para regular la expresión génica en las plantas fue descripta en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,283, 184 y 5,231 ,020. También se puede emplear la expresión de un polinucleótido transcribible en una célula vegetal para suprimir plagas de las plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de plagas de coleópteros (Publicación de Patente de los Estados Unidos US2007/0124836) y composiciones aisladas de plagas de nematodos (Publicación de Patente de los Estados Unidos No. US2007/0250947). Las plagas de las plantas incluyen, aunque no a modo de limitación, plagas de artrópodos, plagas de nematodos y plagas fúngicas o microbianas. Entre las moléculas polinucleotídicas transcribibles ilustrativas para la incorporación a las construcciones de acuerdo con la presente invención se cuentan, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de una especie diferente de la especie tomada como objetivo que se originan o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan a células receptoras por medio de métodos de ingeniería genética en lugar de técnicas de reproducción o clásica o reproducción asexual. El tipo de molécula polinucleotídica puede incluir, aunque no a modo de limitación, una molécula polinucleotídica que ya está presente en la célula vegetal, una molécula polinucleotídica de otra planta, una molécula polinucleotídica de un organismo diferente o una molécula polinucleotídica generada en forma externa, tal como una contiene un mensaje antisentido de un gen, o bien una molécula polinucleotídica que codifica una versión artificial, sintética o de otro modo modificada de un transgén.
Marcadores seleccionables En el presente contexto el término "marcador" se refiere a cualquier molécula polinucleotídica transcribible cuya expresión, o falta de la misma, puede ser analizada para su detección o puntuación de alguna manera. Los genes marcadores para usar en la práctica de la presente invención incluyen, aunque no a modo de limitación, moléculas polinucleotídicas transcribibles que codifican ß-glucuronidasa (GUS descripta en la Patente de los Estados Unidos No. 5,599,670), la proteína fluorescente verde y variantes de la misma (GFP descripta en la Patente de los Estados Unidos No. 5,491 ,084 y 6,146,826), proteínas que confieren resistencia a los antibióticos o proteínas que confieren tolerancia a los herbicidas. Los marcadores útiles de resistencia a los antibióticos incluyen los que codifican proteínas que confieren resistencia a la kanamicina {nptlf), higromicina B {aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, spec/strep) y gentamicina (aac3 y aacC4) son conocidos en la técnica. Los herbicidas para los cuales se ha demostrado la tolerancia de las plantas transgénicas y para lo cual se puede aplicar el método de la presente invención incluyen, aunque no a modo de limitación, herbicidas de: ácido aminc-metil fosfónico, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, dalapón, dicamba, ciclohexandiona, inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa e isoxaflutol. Las moléculas polinucleotídicas transcribibles que codifican las proteínas implicadas en la tolerancia a los herbicidas son conocidas en la técnica e incluyen, aunque no a modo de limitación, una molécula polinucleotídica transcribible que codifica 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS para tolerancia al glifosato descripto en las Patente de los Estados Unidos Nos. 5,627,061 ; 5,633,435; 6,040,497; y 5,094,945); una molécula polinucleotídica transcribible que codifica una glifosato oxidorreductasa y una glifosato-N-acetil transferasa (GOX descripta en la Patente de los Estados Unidos No. 5,463,175; GAT descripta en la publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0083480, y dicamba monooxigenasa, publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0135879); una molécula polinucleotídica transcribible que codifica bromoxinil nitrilasa {Bxn para tolerancia al Bromoxinil descripto en la Patente de los Estados Unidos No. 4,810,648); una molécula polinucleotídica transcribible que codifica fitoeno desaturasa (crtl) descripta por Misawa, et al., Plant Journal, 4:833-840 (1993) y Misawa, et al., Plant Journal, 6:481-489 (1994) para tolerancia al norflurazón; una molécula polinucleotídica transcribible que codifica acetohidroxiácido sintasa (AHAS, también conocida como ALS) descripta por Sathasiivan, et al., Nucí. Acids Res., 18:2188-2193 (1990) para tolerancia a los herbicidas de sulfonílurea y el gen bar descripto por DeBlock, eí al., EMBO Journal, 6:2513-2519 (1987) para tolerancia al glufosinato y bialafos. Las moléculas promotoras de la presente invención pueden expresar moléculas polinucleotídicas transcribibles ligadas que codifican para fosfinotricina acetiltransferasa, EPSPS resistente al glifosato, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotransferasa, dalapon deshalogenasa, nitrilasa resistente al bromoxinil, antranilato sintasa, ariloxialcanoato dioxigenasas, acetil CoA carboxilasa, glifosato oxidorreductasa, y glifosato-N-acetil transferasa.
También están incluidos dentro del término "marcadores seleccionares" los genes que codifican un marcador secretable cuya secreción se puede detectar como medio para la identificación o selección para células transformadas. Entre los ejemplos se cuentan los marcadores que codifican un antígeno secretable que puede ser identificado mediante interacción con anticuerpos, o incluso enzimas secretables que se pueden detectar en forma catalítica. Las proteínas marcadores secretados seleccionabas se clasifican en un número de clases, incluyendo pequeñas proteínas difundibles que son detectables (por ejemplo mediante ELISA), pequeñas enzimas activas que se pueden detectar en solución extracelular (por ejemplo, alfa-amilasa, beta-lactamasa, fosfinotricin transferasa), o proteínas que se insertan o atrapan en la pared celular (tales como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como las que se encuentran en la unidad de expresión de extensión o las proteínas relacionadas con la patogénesis del tabaco también conocidas como PR-S del tabaco). Otros genes marcadores seleccionabas posibles han de ser obvios para las personas con capacitación normal en la técnica y están comprendidos en la presente invención.
Transformación de Células La invención se refiere además a un método para la producción de células y plantas transformadas que comprenden un promotor operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible.
El término "transformación" se refiere a la introducción de ácido nucleico en un huésped receptor. En el presente contexto, el término "huésped" se refiere a bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquier célula, tejido, órgano o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Entre los tejidos y células vegetales de particular interés se cuentan los protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, almácigos, embriones y polen.
En el presente contexto, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido una molécula polinucleotídica extraña, tal como una construcción. La molécula polinucleotídica introducida se puede integrar al ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de tal manera que la molécula polinucleotídica introducida sea heredada por la progenie posterior. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también incluye la progenie de la célula u organismo y la progenie producida mediante un programa de reproducción asexual que emplea dicho organismo transgénico como progenitor en una cruza y que exhibe un fenotipo alterado producido como resultado de la presencia de una molécula polinucleotídica extraña. El término "transgénico" se refiere a una bacteria, hongo o planta que contiene una o más moléculas de ácido polinucleico heterólogo.
Hay numerosos métodos para la introducción de moléculas de ácido polinucleico en las células vegetales. El método comprende, en general, los pasos de selección de una célula huésped adecuada, la transformación de la célula huésped con un vector recombinante y la obtención de la célula huésped transformada. Los métodos adecuados incluyen la infección bacteriana {por ejemplo Agrobacterium), vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios, administración directa de ADN {por ejemplo mediante transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio y aceleración de partículas revestidas con ADN, etc. (reseñados por Potrykus, er a/., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42:205 (1991)).
La tecnología para la introducción de una molécula de ADN en las células es muy conocida por las personas con capacitación normal en la técnica. Los métodos y materiales para la transformación de células vegetales mediante la introducción de una construcción de ADN vegetal en el genoma de una planta para poner en práctica la presente invención incluyen cualquiera de los métodos muy conocidos y comprobados incluyendo, aunque no a modo de limitación: (1) métodos químicos (Graham y Van der Eb, Virology, 54:536-539 (1973) y Zatloukal, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136-153 (1992)); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, Cell, 22:479-488 (1980)), electroporación (Wong y Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun., 107:584-587 (1982); Fromm, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828 (1985); Patente de los Estados Unidos No. 5.384.253), aceleración de partículas (Johnston y Tang, Methods Cell Biol., 43(A):353-365 (1994); Fynan, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:1 1478-1 1482 (1993)): y bombardeo de microproyectiles (como se ilustra en la Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861 ; y 6,403,865); (3) vectores virales (Clapp, Clin. Perinatol., 20:155-168 (1993); Lu, et al., J. Exp. Med., 178:2089-2096 (1993); Eglitis y Yerson, Biotechniques, 6:608-614 (1988)); (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., Hum. Gen. Ther., 3:147-154 (1992) y Wagner, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:6099-6103 (1992); (5) mecanismos mediados por bacterias tales como la transformación mediada por Agrobacterium (como se ilustra en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,824,877; 5,591 ,616; 5,981 ,840; y 6,384,301); (6) la introducción directa en el polen mediante inyección en los órganos reproductivos de la planta (Zhou, et al., Methods in Enzymology, 101 :433, (1983); Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo, et al., Plant MoI Biol. Repórter, 6:165 (1988); Pena, er a/., Nature, 325:274 (1987)); (7) transformación de protoplastos (como se ilustra en la Patente de los Estados Unidos No. 5,508,184); e (8) inyección en embriones inmaduros (Neuhaus, et al., Theor. Appl. Genet, 75:30 (1987)).
Se puede utilizar cualquiera de los métodos antes descriptos para transformar una célula huésped con uno o más promotores y/o construcciones de la presente invención. Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo tal como una célula vegetal, una célula de algas, algas, una célula fúngica, hongos, una célula bacteriana o una célula de insecto. Los huésped y células transformadas preferidas incluyen células de: plantas, Aspergillus, levaduras, insectos, bacterias y algas.
Los métodos para la transformación de plantas dicotiledóneas, principalmente mediante el uso de Agrobacterium tumefaciens y la obtención de plantas transgénicas, han sido publicados con referencia al algodón (Patente de los Estados Unidos No. 5,004,863; 5,159,135; y 5,518,908); soja (Patente de los Estados Unidos Nos. 5,569,834 y 5,416,01 1 ; ver también, McCabe, et al., Biotechnology, 6:923 (1988) y Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)); Brassica (Patente de los Estados Unidos No. 5,463,174); maní (Cheng et al., Plant Cell Rep., 15:653-657 (1996) y McKently et al., Plant Cell Rep., 14:699-703 (1995)); papaya; y arveja (Grant et al., Plant Cell Rep., 15:254-258 (1995)).
También se han dado a conocer transformaciones de plantas monocotiledóneas empleando electroporación, bombardeo de partículas y Agrobacterium. Se ha obtenido la transformación y regeneración de plantas en espárragos (Bytebier, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84:5354 (1987); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol, 104:37 (1994)); maíz (Rhodes, et al., Science 240:204 (1988), Gordon-Kamm, et al., Plant Cell, 2:603-6 8 ( 990), Fromm, et al., Bio/Technology, 8:833 (1990), Koziel et al., Bio/Technology, 1 1 :194 (1993), y Armstrong, et al., Crop Science, 35:550-557 (1995)); avena (Somers, et al., Bio/Technology, 10:1589 (1992)); pasto ovillo ("orchard grass") (Horn, et al., Plant Cell Rep.. 7:469 (1988)); centeno (De la Pena, et al., Nature, 325:274 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant Journal, 2:409 (1992)); festuca alta (Wang, et al., Bio/Technology, 10:691 (1992)); y trigo (Vasil, et al., Bio/Technology, 10:667 (1992) y Patente de los Estados Unidos No. 5,631 ,152).
La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de protoplastos de plantas transformadas o explantes son muy conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988) y Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985)). Por lo general se cultivan las células transformadas en presencia de un medio selectivo, que selecciona las células trasformadas favorablemente e induce la regeneración de brotes y raíces de las plantas para obtener plantas intactas (Fraley, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803 (1983)). Por lo general se obtienen plantas transformadas en el término de dos a cuatro meses.
Las plantas transgénicas regeneradas se autopolinizan para producir plantas transgénicas homocigotas. Por otro lado, se puede cruzar el polen obtenido de las plantas transgénicas regeneradas con plantas no transgénicas, preferentemente líneas endogámicas de especies de importancia agronómica. Las descripciones de los métodos de reproducción asexual que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en uno de varios libros de referencia; remitirse, por ejemplo, a Allard, Principies of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principies of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing y Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production y Uses, 2a Edición, Monograph., 16:249 (1987); Fehr, Principies of variety development, Theory y Technique, (Vol 1 ) y Crop Species Soybean (Vol 2), lowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). A la inversa, se puede utilizar el polen de plantas no transgénicas para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.
Se puede analizar las plantas transformadas para detectar la presencia de los genes de interés y el nivel y/ o perfil de expresión conferido por los elementos regulatorios de la presente invención. Las personas con capacitación normal en la técnica han de conocer los numerosos métodos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los métodos para el análisis de las plantas incluyen, aunque no a modo de limitación, transferencias Southern o transferencias northern, estrategias basadas en PCR; análisis bioquímicos, métodos de análisis de detección de fenotipos, evaluaciones en el campo y ensayos de inmunodiagnóstico. La expresión de una molécula polinucleotídica transcribible se puede medir utilizando reactivos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y métodos descriptos por el fabricante y duraciones de los ciclos de PCR determinadas mediante -el uso de TaqMan® Testing Matrix. Por otro lado, se pueden utilizar los reactivos y métodos Invader® (Third Wave Technologies, Madison, Wl) descriptos por el fabricante para la expresión de transgenes.
Se pueden cosechar semillas de las plantas de acuerdo con la presente invención de las plantas transgénicas fértiles y utilizarlas para cultivar generaciones de la progenie de las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención, incluyendo líneas de plantas híbridas que comprenden la construcción de la presente invención y que expresan un gen de interés agronómico.
La presente invención también permite la producción de partes de las plantas de la presente invención. Las partes de plantas incluyen, aunque no a modo de limitación, hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endosperma, óvulos, y polen. La invención incluye asimismo, y produce plantas transformadas que comprenden una molécula de ácido nucleico de la presente invención.
La planta transgénica puede pasar la molécula polinucleotídica trangénica a su progenie. La progenie incluye cualquier parte de planta o semilla regenerable que comprenda el transgén derivado de una planta antecesora. La planta transgénica es preferentemente homocigota para la molécula polinucleotídica transformada y transmite esa secuencia a todos sus retoños como resultado de la reproducción sexual. Se puede cultivar la progenie a partir de semillas producidas por la planta transgénica. Más tarde se puede hacer que estas plantas adicionales se autopolinicen para generar una línea de plantas de reproducción real. La progenie de estas plantas es evaluada, entre otras cosas, con respecto a la expresión del gen. Se puede detectar la expresión del gen mediante varios métodos habituales tales como transferencia western, transferencia northern, inmunoprecipitación y ELISA.
Habiendo ya descripto la invención, la misma podrá ser comprendida con más facilidad con referencia a los siguientes ejemplos que se presentan a título de ilustración y que no pretenden ser limitante de la presente invención, a menos que así se especifique. Las personas con capacitación normal en la técnica deben tener en cuenta que las técnicas descriptas en los siguientes ejemplos representan técnicas que los inventores han descubierto que dan buen resultado en la práctica de la presente invención. Sin embargo, las personas con capacitación normal en la técnica han de saber apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden efectuar numerosos cambios a las modalidades específicas aquí descriptas y obtener, de todas maneras, un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Por lo tanto, todo material expuesto o ilustrado en los dibujos adjuntos ha de ser considerado ilustrativo y no en sentido limitante.
EJEMPLOS Se aislaron elementos regulatorios útiles para dirigir la expresión de un polinucleótido transcribible operativamente ligado en plantas transgénicas y se analizó el patrón de expresión de estos elementos regulatorios operativamente ligados a una molécula polinucleotídica transcribible en plantas transgénicas de maíz.
EJEMPLO 1 Identificación y Clonación de Elementos regulatorios Se identificaron y aislaron novedosos elementos regulatorios de ARN genómico de especies monocotiledóneas, panizo blanco {Setaria itálica (L.) Beauv). Se utilizó la secuencia EST para diseñar cebadores, que luego fueron utilizados con genotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construidas siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 5' de la correspondiente secuencia de ADN genómico. Esta región clonada contenía la secuencia 5' UTR secuencia arriba con respecto a la región codificadora de proteínas correspondiente a cada gen de S. itálica. Usando esta secuencia, se identificaron los elementos regulatorios por bioinformática dentro de la 5' UTR de cada gen. Se utilizó el análisis bioinformático para identificar el sitio de iniciación de la traducción (TSS) y cualquier bidireccionalidad, intrones o secuencias codificadoras anteriores presentes en la secuencia. Utilizando los resultados de este análisis, se definieron los elementos regulatorios dentro de la secuencia 5' UTR. A continuación se diseñaron cebadores para amplificar los elementos regulatorios. Se amplificó la molécula de ADN correspondiente a cada elemento regulatorio utilizando condiciones standard de reacción en cadena de la polimerasa con cebadores que contenía sitios de restricción únicos y ADN genómico aislado de S. itálica. Los fragmentos de ADN así obtenidos fueron ligados en un vector base para la expresión en plantas utilizando digestión enzimática standard de los sitios de restricción compatibles y métodos de ligamiento de ADN. Los vectores de expresión en plantas así obtenidos contenían una región del borde derecho de Agrobacterium tumefaciens (B-AGRtu.right border), uno o más elementos regulatorios operativamente ligados a un intrón derivado de la proteína termosensible HSP70 de Zea mays, operativamente ligado a una secuencia codificadora para ß-glucuronidasa (GUS), operativamente ligado a la región de terminación 3' de Nopalina sintasa 3' de A. tumefaciens, y una región de borde izquierdo de A. tumefaciens (B-AGRtu.left border).
Las secuencias de los elementos regulatorios se presentan en este documento con el título SEQ ID NO: 1-20 y están enumeradas en el siguiente cuadro 1. Las secuencias promotoras se presentan aquí como SEQ ID NO: 2, 5, 8, 10, 13, y 20. Las secuencias líderes se presentan aquí bajo el nombre SEQ ID NO: 3, 6, 11 , y 16. Las secuencias aquí presentadas como SEQ ID NO: 1 , 4, 7, 9, 12, 14, 17, y 19 son una secuencia promotora y líder operativamente ligadas.
CUADRO 1 Elementos regúlatenos El elemento de expresión, EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) está compuesto por el promotor P-SETit.Tip-1 :1:1 (SEQ ID NO: 2) y la líder L-SETit.Tip-1:1:1 (SEQ ID NO: 3).
En el caso de los elementos regulatorios del gen de la Proteína de transferencia de lípidos, se diseñaron tres variantes del promotor (Figura 1). P-SETit.Rcc3-1 :1 :1 , una versión de 2062 nucleótidos (SEQ ID NO:15); P-SETit.Rcc3-1 :1 :10, una versión de 1563 nucleótidos (SEQ ID NO:18); y P-SETit.Rcc3-1:1 :11 , una versión de 915 nucleótidos (SEQ ID NO:20). El elemento de expresión EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) está compuesto por el promotor P-SETit.Rcc3-1 :1 :1 (SEQ ID NO: 15) y la líder P-SETit.Rcc3-1 :1 :2 (SEQ ID NO: 16). El elemento de expresión EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO: 17) está compuesto por el promotor P-SETit.Rcc3-1:1 :10 (SEQ ID NO: 18) y la lider L-SETit.Rcc3-1:1 :2 (SEQ ID NO: 16). El elemento de expresión EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO: 19) está compuesto por el promotor P-SETit.Rcc3-1 :1 :11 (SEQ ID NO: 20) y la líder P-SETit.Rcc3-1 :1 :2 (SEQ ID NO: 16).
En el caso de los elementos regulatorios del gen de la Proteína tipo metalotioneína, se diseñaron dos variantes de promotor (Figura 2). P-SETit.Mtha-1 :1 :1 es una versión más corta de 483 nucleótidos; P-SETit. thb-1 :1 :2 es una versión más larga, de 1516 nucleótidos de éste. El elemento de expresión EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4) está compuesto por el promotor P-SETit.Mtha-1 :1 :1 (SEQ ID NO: 5) y la líder L-SETit.Mth-1 :1 :1 (SEQ ID NO: 6). El elemento de expresión EXP-SETit.Mthb (SEQ ID NO: 7) está compuesto por el promotor P-SETit.Mthb-1:1 :2 (SEQ ID NO: 8) y la líder L-SETit.Mth-1 : 1 :1 (SEQ ID NO: 5).
En el caso de los elementos regulatorios del gen de la Proteína relacionada con la deshidratación, se aislaron los elementos regulatorios de dos variantes alélicas (Figuras 3A y 3B). Las dos variantes alélicas tienen secuencias líder idénticas, aunque las secuencias promotoras son variantes con varios cambios de bases e inserciones/deleciones al alinearse. El elemento de expresión EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9) está compuesto por el promotor P-SETit.DRP-1 :1 :1 (SEQ ID NO: 10) y la líder L-SETit.DRP-1:1 :2 (SEQ ID NO: 11). El elemento de expresión EXP-SETit.DRPb (SEQ ID NO: 12) está compuesto por el promotor P-SETit.DRPb-1:1.1 (SEQ ID NO: 13) y la líder L-SETit.DRP-1 :1 :2 (SEQ ID NO: 11).
EJEMPLO 2 Análisis de los Elementos regulatorios que dirigen a GUS en el Maíz Transgénico Se transformaron plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían los elementos regulatorios de ensayo que dirigen la expresión del transgén de ß-glucuronidasa (GUS) y se analizaron las plantas obtenidas para detectar la expresión de la proteína GUS.
Se transformaron plantas de maíz con las construcciones de expresión de GUS en plantas, pMON101552 (EXP-SETit.TIP, SEQ ID NO: 1), PMON99662 (EXP-SETit.Mtha, SEQ ID NO: 4), y pMON99663 (EXP-SETit.DRPa, SEQ ID NO: 9). Se transformaron las plantas empleando métodos de bombardeo de partículas conocidos por las personas con capacitación normal en la técnica y embriones cigóticos inmaduros H99 de maíz para producir plantas transgénics de maíz. En pocas palabras, se recogieron mazorcas de plantas H99 de maíz 10-13 días después de la polinización de plantas cultivadas en invernadero y esterilizadas. Se extirparon los embriones cigóticos inmaduros de 1.2-1.5 mm de la mazorca y se los incubó a 28° Celsius en la oscuridad por espacio de 3-5 días antes de usarlos como tejido blanco para el bombardeo. Se digirió el vector de transformación de plantas que contenía el marcador seleccionare para resistencia a la kanamicina resistance (gen NPTII) y el cassette de expresión de GUS con endonucleasas de restricción. Se purificó en gel un solo fragmento de ADN que contenía tanto el marcador seleccionable como el cassette de expresión GUS y se lo utilizó para revestir partículas de oro de 0,6 micrón (Catalog #165-2262 Bic—Rad, Hercules, CA) para el bombardeo. Se cargaron macroportadores con las partículas de oro revestidas con ADN (# Catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules CA). Se transfirieron los embriones a medio osmótico, con el escutelo hacia arriba.. Se empleó una pistola biolística PDS 1000/He para la transformación (# Catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules CA). Se cultivaron los embriones inmaduros bombardeados y se los transfirió a medio de regeneración de tejidos. Se regeneraron plantas transgénicas de maíz a partir de los callos transgénicos y se las transfirió al invernadero.
Se utilizó el análisis histoquímico de GUS para el análisis cualitativo de expresión de las plantas transformadas. Se incubaron secciones enteras de tejidos con la solución de tinción de GUS X-Gluc (5-bromo—4-cloro-3-indolil-b-glucuronido) (1 miligramo/mililitro) durante un lapso de tiempo apropiado, se las enjuagó e inspeccionó visualmente para detectar la coloración azul. Se determinó cualitativamente la actividad de GUS mediante inspecciono visual directa o inspección bajo un microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales selectos. Se inspeccionaron las plantas R0 para comprobar la expresión en las raíces y hojas. Los elementos regulatorios EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1), EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4), y EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9) demostraron expresión de GUS tanto en las raíces como en las hojas de las transformantes Ro.
Se cruzaron plantas transformadas con la expresión de GUS dirigida por EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) o EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4) con plantas H99 no transformadas para producir una población de transformantes F-i. Se midieron los niveles de expresión de GUS en los tejidos seleccionados durante el curso del desarrollo. Los tejidos F-? utilizados para este estudio incluían: embrión de semilla embebida, endosperma de semilla embebida, raíz (3 días después de la germinación), coleóptilos (3 días después de la germinación), raíz V3 principal y corona, hoja V3, raíz V7 seminal y corona, hoja inmadura V7, raíz seminal VT (en el momento de la formación de panojas, antes de la reproducción), internodos VT, mazorcas VT, anteras VT, polen VT, filamentos VT, granos 7 días después de la polinización, embriones a los 21 días de la polinización, endosperma 21 días después de la polinización, embriones 35 días después de la polinización, endosperma 35 días después de la polinización. Se observó la expresión de GUS Fi en todos los tejidos estudiados tanto en lo que respecta al eventos transformado EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) como a EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4).
EJEMPLO 3 Análisis de los Elementos regúlatenos que dirigen TIC809 en el Maíz Transgénico Se transformaron plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían los elementos regulatorios de ensayo que dirigen la expresión del transgén TIC809 transgene, y y se analizaron las plantas obtenidas para detectar la expresión de la proteína TIC809.
Se ligaron operativamente los elementos regulatorios al transgén de la toxina de insectos TIC809 (PCTUS2006/033867) en vectores de transformación de plantas. El cassette del transgén estaba compuesto por el o los elementos regulatorios operativamente ligados a un intrón derivado de la proteína termosensible HSP70 de Zea mays, operativamente ligada al transgén TIC809, operativamente ligado a una 3' UTR derivada del gen HSP17 de Tríticum aestivum L. Los vectores de transformación en plantas contenían asimismo un marcador seleccionable de tolerancia al glifosato para la selección de células de las plantas transformadas.
Se transformó tejido de maíz de la variedad LH244 utilizando una transformación mediada por A. tumefaciens con los plásmidos pMON70539 (EXP-SETit.TIP, SEQ ID NO: 1 ), pMON70540 (EXP-SETit.Mtha, SEQ ID NO: 4), y pMON70538 (EXP-SETit.DRPa, SEQ ID NO: 9) usando métodos conocidos en la técnica. Se regeneraron plantas Ro del tejido de maíz transformado y se las analizó para confirmar la presencia e integridad del transgén TIC809. Se analizaron las hojas y raíces de estas plantas en la etapa V4 o V6 utilizando un Ensayo InmunoSorbente Ligado a Enzimas de TIC809 (ELISA) para determinar los niveles de acumulación de la proteína TIC809. Se determinaron los valores proteicos utilizando una muestra de referencia de TIC809 y se los expresó en términos de unidades de partes por millón (ppm). En el siguiente cuadro 2 se presentan los datos de ELISA, donde "N" indica el número de plantas analizadas.
CUADRO 2 Datos de ELISA de TIC809 Rn Se vio la expresión de TIC809, dirigida por los elementos de expresión EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1), EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4), y EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9) tanto en las raíces como en las hojas, demostrando así la capacidad de los elementos regulatorios EXP-SETit.TIP, EXP-SETit.Mtha, y EXP-SETit.DRPa para modular la transcripción de un transgén de interés agronómico en las plantas operativament eligado. El promedio de expresión de TIC809 dirigida por EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1), EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4), y EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9) fue por lo menos el doble o más en la hoja con respecto a la raíz en los tres casos de construcciones.
Se cruzaron plantas transformadas RO que contenían los vectores pMON70539 (EXP-SETit.TIP, SEQ ID NO: 1), pMON70540 (EXP-SETit.Mtha, SEQ ID NO: 4), y pMON70538 (EXP-SETit.DRPa, SEQ ID NO: 9) con la variedad LH59, usando LH59 como planta hembra y LH244 transformada como macho, para producir poblaciones transformadas Fi. En el caso de las plantas que contenían EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) y EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4), se midieron luego los niveles de proteína TIC809 empleando ELISA en las hojas Fi en las etapas V3, V7, y VT; e las raíces en las etapas V3 y V7; en los tejidos reproductivos alrededor de la etapa VT (antera, polen y filamentos) y en la semilla o grano en desarrollo. Los resultados de ELISA se expresan en partes por millón (ppm) con las mediciones de error standard indicadas como "SE" y se presentan en el siguiente cuadro 3. En el caso de las plantas que contenían EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9), se midieron los niveles de proteína TIC809 en las raíces utilizando ELISA con tejido extraído en la etapa v9. Los resultados de ELISA se expresan en partes por millón (ppm) y se presentan en el siguiente cuadro 4.
CUADRO 3 Datos de ELISA de TIC809 Fi correspondientes a EXP-SETit.TIP y EXP- SETi Mtha Los niveles promedio de expresión de la proteína TIC809 dirigida por los elementos regulatorios EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) y EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4) en las poblaciones F1 coincidieron con los niveles de expresión observados en las transformantes R0, confirmando la capacidad de los elementos regulatorios TIP y Mtha para dirigir la expresión de un transgén operativamente ligado. EXP-SETit.TIP (SEQ ID NO: 1) parece tener su nivel de expresión más elevado en V3 en las raíces y hojas, y la expresión declina hacia la etapa V6 y es baja en los tejidos reproductivos y en la semilla en desarrollo. EXP-SETit.Mtha (SEQ ID NO: 4) exhibe la expresión constante de TIC809 en las raíces y hojas entre las etapas V3 y V7, con una declinación de la expresión en la hoja de la etapa VT, expresión más reducida en el tejido reproductivo y sin expresión en la semilla en desarrollo.
CUADRO 4 Datos de ELISA DE TIC809 F1 correspondientes a EXP-SETit.DRPa Los niveles de expresión de la proteína TIC809 dirigida por el elemento regulatorio EXP-SETit.DRPa (SEQ ID NO: 9) en las raíces de la población F1 coincidieron con los niveles de expresión observados en las transformantes R0, confirmando la capacidad de los elementos regulatorios DRPa para dar lugar a la expresión e las raíces de un transgén operativamente ligado.
Se produjeron poblaciones R0 de plantas transformadas con pMON120408 (EXP-SETit.Rcc3-1 , SEQ ID NO: 14), pMON120407 (EXP-SETit.Rcc3-10, SEQ ID NO: 17), y pMON120410 (EXP-SETit.Rcc3-11 , SEQ ID NO: 19) de la manera antes descripta. Se midieron los niveles de expresión de la proteína TIC809 en estas plantas, en las hojas y raíces utilizando ELISA con tejido extraído en la etapa V4 o V6. Los resultados de ELISA se expresan en partes por millón (ppm) y se presentan en la siguiente cuadro 5.
CUADRO 5 Datos de ELISA de TIC809 Ro correspondientes a EXP-SETit.Rcc3-1.
EXP-SETit.Rcc3-10. y EXP-SETit.Rcc3-11 Nombre del Elemento Evento Raíz (ppm) Hoja (ppm) EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) 1 0.292 0 EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) 2 2.79 0 EXP-SET¡t.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) 3 1.171 0 EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) Promedio 1.42 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 1 2.129 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 2 1.793 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 3 0.425 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 4 0.677 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 5 0.877 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 6 1.847 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 7 1.479 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 8 0.359 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 9 1.84 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 10 3.309 0 EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 11 1.589 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 12 3.652 0.294 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 13 1.019 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 14 2.715 0.56 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 15 0.981 0 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) 16 3.147 0.317 EXP-SET¡t.Rcc3-10 (SEQ ID NO 17) Promedio 1.74 0.07 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 1 2.356 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 2 2.343 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 3 1.465 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO : 19) 4 2.271 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO : 19) 5 0.247 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO : 19) 6 2.949 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO : 19) 7 3.36 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO . 19) 8 4.771 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 9 1.757 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 10 2.255 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 11 3.314 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 12 4.958 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 13 0.232 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 14 1.503 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 15 1.425 0 EXP-SET¡t.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 16 3.6 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 17 3.533 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO 19) 18 2.158 0 EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO: 19) Promedio 2.47 0 La expresión de TIC809, cuando es dirigida por los elementos de expresión variantes EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14), EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO: 17), y EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO: 19) fue fuerte en las raíces y débil o ausente en las hojas. Se observó escasa o nula expresión en las hojas en el caso de las tres variantes SETit.Rcc3 a excepción de los tres eventos transformados en los cuales el elemento de expresión variante, EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO: 17) exhibió un bajo nivel de expresión de TIC809 e las hojas. El promedio de expresión en las raíces de la proteína TIC809 fue más elevado utilizando el elemento de expresión variante EXP-SETit.Rcc3-11 (SEQ ID NO: 19) que las variantes EXP-SETit.Rcc3-1 (SEQ ID NO: 14) y EXP-SETit.Rcc3-10 (SEQ ID NO: 17), aunque las tres variantes produjeron la expresión en las raíces del transgén operativamente ligado.
Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, las personas con capacitación normal en la técnica deben considerar evidentes que la invención puede ser modificada en su disposición y detalle sin apartarse de dichos principios. Reivindicamos todas las modificaciones que estén dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones. Todas las publicaciones y documentos de patente publicados citados en la presente se incorporan a la presente como referencia en el mismo alcance que si se indicara que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora específicamente como referencia.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una molécula de ADN que comprende un elemento regulatorio que consta de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20, (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20, y (c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-20 con actividad promotora, donde dicho elemento regulatorio está operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga.
2 - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia tiene por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20.
3. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia tiene por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20.
4. - Una construcción de ADN que comprende un elemento regulatorio que tiene una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia con por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20, (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-20, y (c) un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 1-20 con actividad promotora, donde dicho elemento regulatorio está operativamente ligado a una molécula polinucleotídica transcribible heteróloga.
5. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la molécula polinucleotídica transcribible es un gen de interés agronómico.
6. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la molécula polinucleotídica transcribible es un gen con capacidad para conferir resistencia a los herbicidas en las plantas.
7. - La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la molécula polinucleotídica transcribible es un gen con capacidad para conferir a las plantas el control de plagas de las plantas.
8. - Una célula de planta transgénica transformada de manera estable con la molécula de ADN de la reivindicación 1.
9. - La célula de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha célula de planta transgénica es una célula de una planta monocotiledónea.
10. - Una planta transgénica transformada con la molécula de ADN de la reividnciación 1.
11. - Una parte de planta de la planta transgénica de la reivindicación 10, en donde la parte de planta comprende la molécula de ADN.
12.- Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 10, en donde la semilla comprende la molécula de ADN.
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