JP2002541851A - イソプレノイド合成に関与するタンパク質の核酸配列 - Google Patents
イソプレノイド合成に関与するタンパク質の核酸配列Info
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Abstract
(57)【要約】
イソプレノイド含量及び組成を変えた植物及び種子の生産方法を提供する。本方法は特に植物のイソプレノイド濃度を増加したり、宿主植物細胞に望ましいイソプレノイド組成を提供するのに使用される。
Description
【０００１】 技術分野 本発明は核酸配列、アミノ酸配列及び構築物、並びに関連方法に関する。
【０００２】 背景技術 イソプレノイドは全生物に存在する遍在化合物である。植物は２２，０００種
を越える多種多様のイソプレノイドを合成する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ａｎｄ Ｈ
ｉｌｌ（１９９２）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ， Ｃ
ｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。植物においてイ
ソプレノイドは真核膜構造を形成するステロール、ユビキノンとプラストキノン
の側鎖に存在するアクリルポリプレノイド、成長調節剤（例えばアブシジン酸、
ジベレリン、ブラシノステロイド又は光合成色素クロロフィル及びカロテノイド
）の生産等の特定細胞機能に主要な役割を果たす。他の植物イソプレノイドの生
理的役割は膨大な二次代謝産物と同様に余り分かっていないが、種々の環境攻撃
に対する適応応答を媒介する重要な役割を果たすものがあることが分かっている
。構造と機能の顕著なダイバーシティにも拘らず、全イソプレノイドは単一代謝
前駆物質であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に由来する（Ｗｒｉｇｈｔ，
（１９６１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：５２５−５４８；及び
Ｓｐｕｒｇｅｏｎ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ，（１９８１） ｉｎ Ｂｉｏｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．，Ｐｏｒｔ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｐｕｒｇｅｏｎ編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
） Ｖｏｌ．１，ｐｐ１−４６）。
を越える多種多様のイソプレノイドを合成する（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ａｎｄ Ｈ
ｉｌｌ（１９９２）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ， Ｃ
ｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。植物においてイ
ソプレノイドは真核膜構造を形成するステロール、ユビキノンとプラストキノン
の側鎖に存在するアクリルポリプレノイド、成長調節剤（例えばアブシジン酸、
ジベレリン、ブラシノステロイド又は光合成色素クロロフィル及びカロテノイド
）の生産等の特定細胞機能に主要な役割を果たす。他の植物イソプレノイドの生
理的役割は膨大な二次代謝産物と同様に余り分かっていないが、種々の環境攻撃
に対する適応応答を媒介する重要な役割を果たすものがあることが分かっている
。構造と機能の顕著なダイバーシティにも拘らず、全イソプレノイドは単一代謝
前駆物質であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に由来する（Ｗｒｉｇｈｔ，
（１９６１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：５２５−５４８；及び
Ｓｐｕｒｇｅｏｎ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ，（１９８１） ｉｎ Ｂｉｏｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．，Ｐｏｒｔ
ｅｒ ａｎｄ Ｓｐｕｒｇｅｏｎ編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
） Ｖｏｌ．１，ｐｐ１−４６）。
【０００３】 高等植物の葉緑体にはイソプレノイド経路から二次代謝産物（例えばトコフェ
ロール）を生産する多数の特殊な相互に関連した生化学経路が存在する。トコフ
ェロールは植物で主要な機能を果たすのみならず、哺乳動物栄養の点でも重要で
ある。プラスチドにおいてトコフェロールは総キノンプールの４０％迄を占める
。
ロール）を生産する多数の特殊な相互に関連した生化学経路が存在する。トコフ
ェロールは植物で主要な機能を果たすのみならず、哺乳動物栄養の点でも重要で
ある。プラスチドにおいてトコフェロールは総キノンプールの４０％迄を占める
。
【０００４】 トコフェロールとトコトリエノール（不飽和トコフェロール誘導体）は周知酸
化防止剤であり、細胞をフリーラジカル損傷から保護したり、心疾患、癌、白内
障、網膜症、アルツハイマー病及び神経変性等の多数の疾患を予防するのに重要
な役割を果たし、関節炎の症状と老化防止に有益な効果をもつことが示されてい
る。肉の貯蔵寿命、外観、風味及び酸化安定性を改善し、飼料から卵にトコール
を移送するためにビタミンＥがニワトリ飼料で使用されている。ビタミンＥは正
常生殖に不可欠であることが示されており、総合健康状態を改善し、家禽動物の
免疫コンピテンスを強化する。動物飼料にビタミンＥサプリメントを加えると乳
製品に酸化安定性も加わる。
化防止剤であり、細胞をフリーラジカル損傷から保護したり、心疾患、癌、白内
障、網膜症、アルツハイマー病及び神経変性等の多数の疾患を予防するのに重要
な役割を果たし、関節炎の症状と老化防止に有益な効果をもつことが示されてい
る。肉の貯蔵寿命、外観、風味及び酸化安定性を改善し、飼料から卵にトコール
を移送するためにビタミンＥがニワトリ飼料で使用されている。ビタミンＥは正
常生殖に不可欠であることが示されており、総合健康状態を改善し、家禽動物の
免疫コンピテンスを強化する。動物飼料にビタミンＥサプリメントを加えると乳
製品に酸化安定性も加わる。
【０００５】 サプリメントとしての天然トコフェロールの需要は過去３年間に１０〜２０％
の割合で安定的に増加している。天然トコフェロールは合成トコフェロールのラ
セミ混合物よりも生体効果が高いため、現在、その需要は供給を上回っている。
天然トコフェロールは全てｄ−ステレオマーであり、合成αトコフェロールは８
種のｄ，ｌ−αトコフェロール異性体の混合物であり、天然ｄ−αトコフェロー
ルと同一のものはそのうちの１種（１２．５％）のみである。天然ｄ−αトコフ
ェロールは他の天然トコフェロール又はトコトリエノールに比較してビタミンＥ
活性が最も高い（１．４９ＩＵ／ｍｇ）。合成αトコフェロールのビタミンＥ活
性は１．１ＩＵ／ｍｇである。１９９５年の粗精製トコフェロールの全世界の年
商は１，０２０，０００，０００米ドルであり、合成材料が８５〜８８％であり
、残りの１２〜１５％が天然材料であった。最良の天然トコフェロール及びトコ
トリエノール源は植物油と穀物製品である。現在、天然ビタミンＥの大半は大豆
油加工により得られるγトコフェロールを化学修飾によりαトコフェロールに変
換することにより製造されている（αトコフェロールは最大の生体活性を示す）
。
の割合で安定的に増加している。天然トコフェロールは合成トコフェロールのラ
セミ混合物よりも生体効果が高いため、現在、その需要は供給を上回っている。
天然トコフェロールは全てｄ−ステレオマーであり、合成αトコフェロールは８
種のｄ，ｌ−αトコフェロール異性体の混合物であり、天然ｄ−αトコフェロー
ルと同一のものはそのうちの１種（１２．５％）のみである。天然ｄ−αトコフ
ェロールは他の天然トコフェロール又はトコトリエノールに比較してビタミンＥ
活性が最も高い（１．４９ＩＵ／ｍｇ）。合成αトコフェロールのビタミンＥ活
性は１．１ＩＵ／ｍｇである。１９９５年の粗精製トコフェロールの全世界の年
商は１，０２０，０００，０００米ドルであり、合成材料が８５〜８８％であり
、残りの１２〜１５％が天然材料であった。最良の天然トコフェロール及びトコ
トリエノール源は植物油と穀物製品である。現在、天然ビタミンＥの大半は大豆
油加工により得られるγトコフェロールを化学修飾によりαトコフェロールに変
換することにより製造されている（αトコフェロールは最大の生体活性を示す）
。
【０００６】 化学修飾を伴わずに直接使用でき、植物のトコフェロール及びトコトリエノー
ル濃度、特により望ましい化合物の濃度を増加する方法が得られるならば、この
ような分子はより良好な機能性とバイオアベイラビリティを示すので当分野に有
益であろう。
ル濃度、特により望ましい化合物の濃度を増加する方法が得られるならば、この
ような分子はより良好な機能性とバイオアベイラビリティを示すので当分野に有
益であろう。
【０００７】 更に、宿主植物細胞における他のイソプレノイドから誘導される化合物の生産
を増加する方法も望ましい。更に、宿主植物細胞で特定イソプレノイド化合物を
生産する方法も必要である。
を増加する方法も望ましい。更に、宿主植物細胞で特定イソプレノイド化合物を
生産する方法も必要である。
【０００８】 発明の要約 本発明はＤ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ｄ
ｘｒ）、特にｄｘｒポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。本発明のポリ
ヌクレオチドとポリペプチドは真核源由来のものを含む。
ｘｒ）、特にｄｘｒポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。本発明のポリ
ヌクレオチドとポリペプチドは真核源由来のものを含む。
【０００９】 即ち、本発明の１側面はＤ−１−デオキシキシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列に関する。特に、
植物起源のｄｘｒタンパク質をコードする単離核酸配列を提供する。
ソメラーゼタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド配列に関する。特に、
植物起源のｄｘｒタンパク質をコードする単離核酸配列を提供する。
【００１０】 本発明の別の側面は部分又は完全ｄｘｒコーディング配列を含むオリゴヌクレ
オチドに関する。
オチドに関する。
【００１１】 本発明の別の側面はｄｘｒの転写又は転写翻訳（発現）に使用可能な組換えＤ
ＮＡ構築物を提供する。特に、宿主細胞で転写又は転写翻訳可能な構築物を提供
する。
ＮＡ構築物を提供する。特に、宿主細胞で転写又は転写翻訳可能な構築物を提供
する。
【００１２】 本発明の別の側面では、宿主細胞又はその子孫でｄｘｒを生産させる方法を提
供する。特に、ｄｘｒの転写又は転写翻訳に使用可能なＤＮＡ構築物で宿主細胞
を形質転換又はトランスフェクトする。ｄｘｒを含む組換え細胞も本発明の一部
を構成する。
供する。特に、ｄｘｒの転写又は転写翻訳に使用可能なＤＮＡ構築物で宿主細胞
を形質転換又はトランスフェクトする。ｄｘｒを含む組換え細胞も本発明の一部
を構成する。
【００１３】 別の側面では、本発明はポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を使用して宿
主細胞、特に宿主植物細胞のイソプレノイド含量を調節する方法に関する。この
ようにイソプレノイド含量を変えた植物細胞も本発明に含まれる。
主細胞、特に宿主植物細胞のイソプレノイド含量を調節する方法に関する。この
ようにイソプレノイド含量を変えた植物細胞も本発明に含まれる。
【００１４】 ｄｘｒの発現により得られる改変植物、種子及び油も本発明の一部とみなす。
【００１５】 図面の簡単な説明 図１はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｄｘｒ配列と大腸菌ｄｘｒ配列のアミノ酸ア
ラインメントを示す。 図２はイソプレノイド経路をメバロン酸経路と非メバロン酸経路の両者で示し
た模式図である。
ラインメントを示す。 図２はイソプレノイド経路をメバロン酸経路と非メバロン酸経路の両者で示し
た模式図である。
【００１６】 発明の詳細な説明 本発明は特に、宿主細胞におけるイソプレノイド濃度を変更（例えば増加又は
低減）するため及び／又はその比を調節するための組成物と方法を提供する。特
に、本発明はポリヌクレオチド、ポリペプチド及び宿主植物細胞のイソプレノイ
ド含量を調節するためのその使用を提供する。
低減）するため及び／又はその比を調節するための組成物と方法を提供する。特
に、本発明はポリヌクレオチド、ポリペプチド及び宿主植物細胞のイソプレノイ
ド含量を調節するためのその使用を提供する。
【００１７】 イソプレノイドは遍在イソプレン単位であり一般的なイソプレノイド前駆物質
である５炭素構成単位イソペンテニル二リン酸から誘導される。イソプレノイド
は構造的に多様な化合物群からなり、一次代謝産物と二次代謝産物の２種類に分
類することができる（Ｃｈａｐｐｅｌｌ（１９９５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：５２１−５４７
）。一次代謝産物は膜保全、光保護、発生プログラムの統合、及び特定膜系への
生化学機能の固定に必要なイソプレノイドを含む。このような一次代謝産物の非
限定的な例としては、ステロール、カロテノイド、クロロフィル、成長調節剤、
ドリコールのポリプレノール置換基、キノン及びタンパク質が挙げられる。二次
代謝産物は植物と環境の重要な相互作用を媒介するが、植物の生存に必要ではな
い。二次代謝産物の非限定的な例としては、トコフェロール、モノテルペン、セ
スキテルペン及びジテルペンが挙げられる。
である５炭素構成単位イソペンテニル二リン酸から誘導される。イソプレノイド
は構造的に多様な化合物群からなり、一次代謝産物と二次代謝産物の２種類に分
類することができる（Ｃｈａｐｐｅｌｌ（１９９５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｐｌａ
ｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６：５２１−５４７
）。一次代謝産物は膜保全、光保護、発生プログラムの統合、及び特定膜系への
生化学機能の固定に必要なイソプレノイドを含む。このような一次代謝産物の非
限定的な例としては、ステロール、カロテノイド、クロロフィル、成長調節剤、
ドリコールのポリプレノール置換基、キノン及びタンパク質が挙げられる。二次
代謝産物は植物と環境の重要な相互作用を媒介するが、植物の生存に必要ではな
い。二次代謝産物の非限定的な例としては、トコフェロール、モノテルペン、セ
スキテルペン及びジテルペンが挙げられる。
【００１８】 多年来、ＩＰＰは周知酢酸／メバロン酸経路を介して合成されると認められて
いる。しかし、最近の研究によると、ＩＰＰ生合成に別のメバロン酸非依存性経
路が存在することが立証された（Ｈｏｒｂａｃｈら（１９９３）ＦＥＭＳ， Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０； Ｒｏｈｍｅｒら，（
１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９５：５１７−５２４）。ＩＰＰ生合成のこ
の非メバロン酸経路はまず細菌で決定され、その後、珪藻類と高等植物でも決定
された（最近の文献についてはＬｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９７）Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１０１：６４２−６５２及びＥｉｓｅｎｒｅｉｃｈら
（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：Ｒ２２１−Ｒ２２３参照）。新規メバロ
ン酸非依存性経路の第１反応はピルビン酸から誘導される（ヒドロキシエチル）
チアミンをＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸のＣｌアルデヒド基と縮合させて
Ｄ−１−デオキシキシルロース５リン酸を得る（Ｂｒｏｅｒｓ（１９９４）Ｐｈ
．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ
Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス； Ｒｏｈｍｅｒら，（１９９６
）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：２５６４−２５６６）。大腸菌におい
てＤ−１−デオキシキシルロース（Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸形
態の可能性が高い）はメナキノンとユビキノンのプレニル側鎖に有効に取込まれ
る（Ｂｒｏｅｒｓ，（１９９４）前出； Ｒｏｓａ Ｐｕｔｒａら，（１９９８
）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：２３−２６）。植物でＤ−１−デ
オキシキシルロースをイソプレノイドに取込むことは報告されている（Ｚｅｉｄ
ｌｅｒら，（１９９７）Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ５２ｃ：１５−２３；
Ａｒｉｇｏｎｉら，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９４：１０６００−１０６０５； Ｓａｇｎｅｒら，（１９９８）Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：２２１−２２２）。更に、Ｄ−１−デオキシキシルロー
スはチアミンとピリドキソールの生合成の前駆物質としても記載されている。Ｄ
−１−デオキシキシルロースは大腸菌（Ｔｈｅｒｉｓｏｄら，（１９８１）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．９８：３７４−３７９； Ｄ
ａｖｉｄら，（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：７３４１−７
３４２）及び高等植物葉緑体（Ｊｕｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｄｏｕｃｅ，（１９
９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２０４２−２０
４５）でチアミンのチアゾール環の連続５炭素単位（Ｃ４’−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ５
’−Ｃ５”）の前駆物質分子である。大腸菌でのピリドキソールの生合成におけ
るＤ−１−デオキシキシルロースの役割も詳細に記載されている（Ｈｉｌｌら，
（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１９１６−１９１７； Ｋ
ｅｎｎｅｄｙら，（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１６６１
−１６６２； Ｈｉｌｌら，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３
０４２６−３０４３５）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンター
ゼをコードする遺伝子のクローニングは細菌（Ｓｐｒｅｎｇｅｒら，（１９９７
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２９５７−１２９
６２，Ｌｏｉｓら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９５：２１０５−２１１０）及び植物（Ｌａｎｇｅら，（１９９８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：２１００−２１０４； Ｂｏ
ｕｖｉｅｒら，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７：１４２３−
１４３１）で最近報告されている。図２はイソプレノイド経路の模式図を示す。
いる。しかし、最近の研究によると、ＩＰＰ生合成に別のメバロン酸非依存性経
路が存在することが立証された（Ｈｏｒｂａｃｈら（１９９３）ＦＥＭＳ， Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０； Ｒｏｈｍｅｒら，（
１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９５：５１７−５２４）。ＩＰＰ生合成のこ
の非メバロン酸経路はまず細菌で決定され、その後、珪藻類と高等植物でも決定
された（最近の文献についてはＬｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒら（１９９７）Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１０１：６４２−６５２及びＥｉｓｅｎｒｅｉｃｈら
（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：Ｒ２２１−Ｒ２２３参照）。新規メバロ
ン酸非依存性経路の第１反応はピルビン酸から誘導される（ヒドロキシエチル）
チアミンをＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸のＣｌアルデヒド基と縮合させて
Ｄ−１−デオキシキシルロース５リン酸を得る（Ｂｒｏｅｒｓ（１９９４）Ｐｈ
．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ
Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，スイス； Ｒｏｈｍｅｒら，（１９９６
）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：２５６４−２５６６）。大腸菌におい
てＤ−１−デオキシキシルロース（Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸形
態の可能性が高い）はメナキノンとユビキノンのプレニル側鎖に有効に取込まれ
る（Ｂｒｏｅｒｓ，（１９９４）前出； Ｒｏｓａ Ｐｕｔｒａら，（１９９８
）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：２３−２６）。植物でＤ−１−デ
オキシキシルロースをイソプレノイドに取込むことは報告されている（Ｚｅｉｄ
ｌｅｒら，（１９９７）Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ ５２ｃ：１５−２３；
Ａｒｉｇｏｎｉら，（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９４：１０６００−１０６０５； Ｓａｇｎｅｒら，（１９９８）Ｃｈｅ
ｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：２２１−２２２）。更に、Ｄ−１−デオキシキシルロー
スはチアミンとピリドキソールの生合成の前駆物質としても記載されている。Ｄ
−１−デオキシキシルロースは大腸菌（Ｔｈｅｒｉｓｏｄら，（１９８１）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．９８：３７４−３７９； Ｄ
ａｖｉｄら，（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：７３４１−７
３４２）及び高等植物葉緑体（Ｊｕｌｌｉａｒｄ ａｎｄ Ｄｏｕｃｅ，（１９
９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２０４２−２０
４５）でチアミンのチアゾール環の連続５炭素単位（Ｃ４’−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ５
’−Ｃ５”）の前駆物質分子である。大腸菌でのピリドキソールの生合成におけ
るＤ−１−デオキシキシルロースの役割も詳細に記載されている（Ｈｉｌｌら，
（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１９１６−１９１７； Ｋ
ｅｎｎｅｄｙら，（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１６６１
−１６６２； Ｈｉｌｌら，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３
０４２６−３０４３５）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸シンター
ゼをコードする遺伝子のクローニングは細菌（Ｓｐｒｅｎｇｅｒら，（１９９７
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２９５７−１２９
６２，Ｌｏｉｓら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９５：２１０５−２１１０）及び植物（Ｌａｎｇｅら，（１９９８）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：２１００−２１０４； Ｂｏ
ｕｖｉｅｒら，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１７：１４２３−
１４３１）で最近報告されている。図２はイソプレノイド経路の模式図を示す。
【００１９】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸とＩＰＰの中間体はまだ特性決定
されていないが、細菌でのイソプレノイド生合成に関係する最初の前駆物質とし
て２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸がＲｏｈｍｅｒらにより提案
された（Ｄｕｖｏｌｄら，（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３
８：４７６９−４７７２； Ｄｕｖｏｌｄら，（１９９７）Ｔｅｔｒａｄｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８：６１８１−６１８４）。１−Ｄ−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸への変
換を触媒する酵素１−Ｄ−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソ
メラーゼが最近大腸菌でクローニングされ、特性決定されている（Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５
：９９８７９−９８８４）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の分子
内再配置による植物における２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの生合成はＳ
ａｇｎｅｒら（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：２３−２
６及びＳａｇｎｅｒら（１９９８）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２：２２１−２２
２により最近報告されている。
されていないが、細菌でのイソプレノイド生合成に関係する最初の前駆物質とし
て２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸がＲｏｈｍｅｒらにより提案
された（Ｄｕｖｏｌｄら，（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３
８：４７６９−４７７２； Ｄｕｖｏｌｄら，（１９９７）Ｔｅｔｒａｄｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８：６１８１−６１８４）。１−Ｄ−デオキシ−Ｄ−キシ
ルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸への変
換を触媒する酵素１−Ｄ−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソ
メラーゼが最近大腸菌でクローニングされ、特性決定されている（Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５
：９９８７９−９８８４）。１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸の分子
内再配置による植物における２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの生合成はＳ
ａｇｎｅｒら（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９：２３−２
６及びＳａｇｎｅｒら（１９９８）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．２：２２１−２２
２により最近報告されている。
【００２０】 本発明は１−デオキシキシルロース５−リン酸から２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリ
トリトール４−リン酸の生産に関与するポリヌクレオチド及びポリペプチド（１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ又はｄｘｒとも
言う）を提供する。本発明は宿主細胞でｄｘｒの改変発現物を生産するための構
築物と方法、及びイソプレノイド経路を改変し（イソプレノイド経路の生合成流
量の改変を含む）、宿主細胞で特定類のイソプレノイドを生産するための方法も
提供する。
トリトール４−リン酸の生産に関与するポリヌクレオチド及びポリペプチド（１
−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ又はｄｘｒとも
言う）を提供する。本発明は宿主細胞でｄｘｒの改変発現物を生産するための構
築物と方法、及びイソプレノイド経路を改変し（イソプレノイド経路の生合成流
量の改変を含む）、宿主細胞で特定類のイソプレノイドを生産するための方法も
提供する。
【００２１】 単離ポリヌクレオチド、タンパク質及びポリペプチド 本発明の第１の側面は単離ｄｘｒポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌ
クレオチド配列は配列表に示す配列群から選択される推定アミノ酸配列をもつ本
発明のポリヌクレオチドをコードする単離ポリヌクレオチドと、前記配列及びそ
の変異体に近縁の他のポリヌクレオチド配列を含む。
クレオチド配列は配列表に示す配列群から選択される推定アミノ酸配列をもつ本
発明のポリヌクレオチドをコードする単離ポリヌクレオチドと、前記配列及びそ
の変異体に近縁の他のポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】 本発明は配列表に示すような各コーディング配列に全長にわたって同一のポリ
ヌクレオチド配列を提供する。本発明は更に成熟ポリペプチド又はそのフラグメ
ントのコーディング配列を提供し、更に、他のコーディング配列（例えばリーダ
ーもしくは分泌配列をコードする配列、プレタンパク質配列、プロタンパク質配
列又はプレプロタンパク質配列）と同一読み枠の成熟ポリペプチド又はそのフラ
グメントのコーディング配列も提供する。ポリヌクレオチドは更に非コーディン
グ配列を加えることができ、非限定的な例としては非コーディング５’及び３’
配列（例えば転写、未翻訳配列）、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮ
Ａを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル及び付加アミノ酸を
コードする付加コーディング配列が挙げられる。例えば、融合ポリペプチドの精
製を助長するためにマーカー配列を加えることができる。本発明のポリヌクレオ
チドは更に構造遺伝子と遺伝子発現を制御する天然関連配列を含むポリヌクレオ
チドも含む。
ヌクレオチド配列を提供する。本発明は更に成熟ポリペプチド又はそのフラグメ
ントのコーディング配列を提供し、更に、他のコーディング配列（例えばリーダ
ーもしくは分泌配列をコードする配列、プレタンパク質配列、プロタンパク質配
列又はプレプロタンパク質配列）と同一読み枠の成熟ポリペプチド又はそのフラ
グメントのコーディング配列も提供する。ポリヌクレオチドは更に非コーディン
グ配列を加えることができ、非限定的な例としては非コーディング５’及び３’
配列（例えば転写、未翻訳配列）、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮ
Ａを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル及び付加アミノ酸を
コードする付加コーディング配列が挙げられる。例えば、融合ポリペプチドの精
製を助長するためにマーカー配列を加えることができる。本発明のポリヌクレオ
チドは更に構造遺伝子と遺伝子発現を制御する天然関連配列を含むポリヌクレオ
チドも含む。
【００２３】 本発明は更に式： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ （式中、５’末端のＸは水素であり、３’末端のＹは水素又は金属であり、Ｒ１ とＲ３は任意核酸残基であり、ｎは１〜３０００、好ましくは１〜１０００の整
数であり、Ｒ２は本発明の核酸、特に配列表に示す群から選択される核酸配列、
好ましくは配列番号１の核酸配列である）のポリヌクレオチドを含む。式中、Ｒ ２ はその５’末端残基が左側でＲ１に結合し、その３’末端残基が右側でＲ３に
結合するような向きに配置されている。Ｒが２個以上の場合には、各Ｒ基により
表される核酸残基はヘテロポリマーでもホモポリマーでもよいが、ヘテロポリマ
ーが好ましい。
数であり、Ｒ２は本発明の核酸、特に配列表に示す群から選択される核酸配列、
好ましくは配列番号１の核酸配列である）のポリヌクレオチドを含む。式中、Ｒ ２ はその５’末端残基が左側でＲ１に結合し、その３’末端残基が右側でＲ３に
結合するような向きに配置されている。Ｒが２個以上の場合には、各Ｒ基により
表される核酸残基はヘテロポリマーでもホモポリマーでもよいが、ヘテロポリマ
ーが好ましい。
【００２４】 本発明は更に本発明のポリペプチドの変異体をコードする本発明のポリヌクレ
オチドの変異体にも関する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントの変異体
を使用して本発明の全長ポリヌクレオチドを合成することができる。好ましい態
様は本発明のポリペプチド配列の５〜１０、１〜５、１〜３、２、１又は０個の
アミノ酸残基を任意組合せで置換、付加又は欠失させたポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの性質又
は活性を変えないようにサイレントな置換、付加及び欠失が特に好ましい。
オチドの変異体にも関する。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントの変異体
を使用して本発明の全長ポリヌクレオチドを合成することができる。好ましい態
様は本発明のポリペプチド配列の５〜１０、１〜５、１〜３、２、１又は０個の
アミノ酸残基を任意組合せで置換、付加又は欠失させたポリペプチド変異体をコ
ードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの性質又
は活性を変えないようにサイレントな置換、付加及び欠失が特に好ましい。
【００２５】 本発明の別の好ましい態様は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに全長にわたって少なくとも５０％、６０％又は７０％相同の領域を含むポ
リヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに全長にわたって少なくと
も８０％相同の領域を含むポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチドがより好ましい。この点では、その全長にわたって少なくと
も９０％相同のポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％相同のポリ
ヌクレオチドが更に好ましい。更に、少なくとも９７％相同のポリヌクレオチド
が非常に好ましく、少なくとも９８％及び９９％相同のポリヌクレオチドが更に
好ましく、少なくとも９９％相同のポリヌクレオチドが最も好ましい。
チドに全長にわたって少なくとも５０％、６０％又は７０％相同の領域を含むポ
リヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに全長にわたって少なくと
も８０％相同の領域を含むポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドに相補的
なポリヌクレオチドがより好ましい。この点では、その全長にわたって少なくと
も９０％相同のポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％相同のポリ
ヌクレオチドが更に好ましい。更に、少なくとも９７％相同のポリヌクレオチド
が非常に好ましく、少なくとも９８％及び９９％相同のポリヌクレオチドが更に
好ましく、少なくとも９９％相同のポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００２６】 好ましい態様は配列表に示すポリヌクレオチドによりコードされる成熟ポリペ
プチドと実質的に同一の生物機能又は活性をもつポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドである。
プチドと実質的に同一の生物機能又は活性をもつポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドである。
【００２７】 本発明は更に上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドにも関する。特
に、本発明はストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズ
するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」
及び「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる用語は配列間に少な
くとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の相同が存在する場合にハイブリダ
イゼーションが一般に生じることを意味する。ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件の１例は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）
、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌ変
性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーション後にハイ
ブリダイゼーション支持体を約６５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄する。他のハイブ
リダイゼーション及び洗浄条件も周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２
版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章
に例示されている。
に、本発明はストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズ
するポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」
及び「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる用語は配列間に少な
くとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の相同が存在する場合にハイブリダ
イゼーションが一般に生じることを意味する。ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件の１例は５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）
、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌ変
性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーション後にハイ
ブリダイゼーション支持体を約６５℃の０．１×ＳＳＣで洗浄する。他のハイブ
リダイゼーション及び洗浄条件も周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２
版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特に第１１章
に例示されている。
【００２８】 本発明は更に配列表に示すポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントの配列
をもつプローブと共に前記ポリヌクレオチドの完全遺伝子を含む適当なライブラ
リーをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし、前
記ポリヌクレオチド配列を単離することにより獲得可能なポリヌクレオチド配列
から主に構成されるポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチド
を得るために有用なフラグメントとしては、例えば本明細書に記載するようなプ
ローブとプライマーが挙げられる。
をもつプローブと共に前記ポリヌクレオチドの完全遺伝子を含む適当なライブラ
リーをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングし、前
記ポリヌクレオチド配列を単離することにより獲得可能なポリヌクレオチド配列
から主に構成されるポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチド
を得るために有用なフラグメントとしては、例えば本明細書に記載するようなプ
ローブとプライマーが挙げられる。
【００２９】 本発明のポリヌクレオチドアッセイについて本明細書に記載するように、例え
ば本発明のポリヌクレオチドはあるポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又は
ゲノムクローンを単離するため、及び配列表に示すポリヌクレオチドに高度の配
列類似性をもつ他の遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するために、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用
することができる。このようなプローブは一般に少なくとも１５塩基を含む。こ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を含むことが好ましく、少なくとも５０
塩基を含むものでもよい。特に好ましいプローブは３０塩基以上５０塩基以下で
ある。
ば本発明のポリヌクレオチドはあるポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又は
ゲノムクローンを単離するため、及び配列表に示すポリヌクレオチドに高度の配
列類似性をもつ他の遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムクローンを単離するために、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用
することができる。このようなプローブは一般に少なくとも１５塩基を含む。こ
のようなプローブは少なくとも３０塩基を含むことが好ましく、少なくとも５０
塩基を含むものでもよい。特に好ましいプローブは３０塩基以上５０塩基以下で
ある。
【００３０】 配列表に示すポリヌクレオチド配列を含むか又はこの配列に含まれる各遺伝子
のコーディング領域は配列表に示すＤＮＡ配列を使用してスクリーニングし、オ
リゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離することができる。次に、
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列をもつ標識オリゴヌクレオチドを使用して
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プロ
ーブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、ｄｘｒ
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを作製する。これらのオリゴヌクレオチ
ドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術でプライマーとして使用し、ｄｘｒ遺
伝子の５’及び３’末端配列を得る。あるいは、特定ｄｘｒペプチドから低縮重
オリゴヌクレオチドを作製できる場合には、このようなプローブを直接使用して
ｄｘｒ遺伝子について遺伝子ライブラリーをスクリーニングしてもよい。特に、
このような方法ではバックグラウンドハイブリダイゼーションレベルが低いため
、ｃＤＮＡライブラリーをファージベクターでスクリーニングすると有用である
。
のコーディング領域は配列表に示すＤＮＡ配列を使用してスクリーニングし、オ
リゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離することができる。次に、
本発明の遺伝子の配列に相補的な配列をもつ標識オリゴヌクレオチドを使用して
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、プロ
ーブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、ｄｘｒ
配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを作製する。これらのオリゴヌクレオチ
ドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術でプライマーとして使用し、ｄｘｒ遺
伝子の５’及び３’末端配列を得る。あるいは、特定ｄｘｒペプチドから低縮重
オリゴヌクレオチドを作製できる場合には、このようなプローブを直接使用して
ｄｘｒ遺伝子について遺伝子ライブラリーをスクリーニングしてもよい。特に、
このような方法ではバックグラウンドハイブリダイゼーションレベルが低いため
、ｃＤＮＡライブラリーをファージベクターでスクリーニングすると有用である
。
【００３１】 一般に、核酸プローブを使用して獲得可能なｄｘｒ配列は標的ｄｘｒ配列とプ
ローブとして使用するコーディング配列の間に６０〜７０％の配列相同度を示す
。他方、配列相同度が５０〜６０％程度のより長い配列も得られる。核酸プロー
ブは核酸配列の長いフラグメントでもよいし、短いオリゴヌクレオチドプローブ
でもよい。長い核酸フラグメントをプローブとして使用する場合（約１００ｂｐ
以上）には、プローブとして使用する配列に対して２０〜５０％偏差（即ち５０
〜８０％配列相同度）をもつ標的サンプルから配列を得るために、より低いスト
リンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプロー
ブはｄｘｒ酵素をコードする完全核酸配列よりもかなり短くてもよいが、少なく
とも約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約２０ヌ
クレオチドとすべきである。短い領域を使用する場合には長い領域を使用する場
合よりも高度の配列相同度が望ましい。従って、他の同類ｄｘｒ遺伝子を検出及
び回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するために高度に保存され
たアミノ酸配列の領域を同定することが望ましいと思われる。特に高度に保存さ
れた配列を同定できる場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には短い配列
のほうが特に有利な場合が多い（Ｇｏｕｌｄら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）
８６：１９３４−１９３８参照）。
ローブとして使用するコーディング配列の間に６０〜７０％の配列相同度を示す
。他方、配列相同度が５０〜６０％程度のより長い配列も得られる。核酸プロー
ブは核酸配列の長いフラグメントでもよいし、短いオリゴヌクレオチドプローブ
でもよい。長い核酸フラグメントをプローブとして使用する場合（約１００ｂｐ
以上）には、プローブとして使用する配列に対して２０〜５０％偏差（即ち５０
〜８０％配列相同度）をもつ標的サンプルから配列を得るために、より低いスト
リンジェンシーでスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプロー
ブはｄｘｒ酵素をコードする完全核酸配列よりもかなり短くてもよいが、少なく
とも約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約２０ヌ
クレオチドとすべきである。短い領域を使用する場合には長い領域を使用する場
合よりも高度の配列相同度が望ましい。従って、他の同類ｄｘｒ遺伝子を検出及
び回収するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するために高度に保存され
たアミノ酸配列の領域を同定することが望ましいと思われる。特に高度に保存さ
れた配列を同定できる場合には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には短い配列
のほうが特に有利な場合が多い（Ｇｏｕｌｄら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）
８６：１９３４−１９３８参照）。
【００３２】 本発明の別の側面はｄｘｒポリペプチドに関する。このようなポリペプチドは
配列表に示す単離ポリペプチドとそのフラグメント、特にｄｘｒ活性を示すポリ
ペプチド及び配列表に示す配列から構成される群から選択されるポリペプチド配
列に対して少なくとも５０％、６０％又は７０％の相同度、好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％
の相同度をもつポリペプチドとそのフラグメントを含み、更に好ましくは少なく
とも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む前記ポリペプ
チドの部分も含む。
配列表に示す単離ポリペプチドとそのフラグメント、特にｄｘｒ活性を示すポリ
ペプチド及び配列表に示す配列から構成される群から選択されるポリペプチド配
列に対して少なくとも５０％、６０％又は７０％の相同度、好ましくは少なくと
も８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％
の相同度をもつポリペプチドとそのフラグメントを含み、更に好ましくは少なく
とも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含む前記ポリペプ
チドの部分も含む。
【００３３】 「相同度」は当分野で周知の通り、配列を比較して決定される２種以上のポリ
ペプチド配列又は２種以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当分野にお
いて、「相同度」とはポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の部分間の一
致により決定される前記配列間の配列関係度を意味する。「相同度」は公知方法
により容易に計算することができ、例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）； Ｂｉｏｃｏｍ
ｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃ
ｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆ
ｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９
４）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（
１９８７）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂ
ｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌ
ｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８：１０７３
（１９８８）に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。相
同度の決定方法は試験する配列間に最大の一致が得られるように設計する。更に
、相同度の決定方法は公に入手可能なプログラムで体系化することができる。２
種の配列間の相同度を決定するために使用可能なコンピュータープログラムとし
ては、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）；ヌクレオチド配列照会用に設
計された３種（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ）とタンパク質
配列照会用に設計された２種（ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ）からなる５種の
ＢＬＡＳＴプログラムの組合せ（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：５４３−５５９（１９９７））が挙げられる
が、これらｉ限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他のソース
から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．
ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４； Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９
９０））。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して相同度
を決定することもできる。
ペプチド配列又は２種以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当分野にお
いて、「相同度」とはポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の部分間の一
致により決定される前記配列間の配列関係度を意味する。「相同度」は公知方法
により容易に計算することができ、例えばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）； Ｂｉｏｃｏｍ
ｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃ
ｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆ
ｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９
４）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（
１９８７）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂ
ｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌ
ｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ，４８：１０７３
（１９８８）に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。相
同度の決定方法は試験する配列間に最大の一致が得られるように設計する。更に
、相同度の決定方法は公に入手可能なプログラムで体系化することができる。２
種の配列間の相同度を決定するために使用可能なコンピュータープログラムとし
ては、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４）；ヌクレオチド配列照会用に設
計された３種（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＴＢＬＡＳＴＸ）とタンパク質
配列照会用に設計された２種（ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ）からなる５種の
ＢＬＡＳＴプログラムの組合せ（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：５４３−５５９（１９９７））が挙げられる
が、これらｉ限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他のソース
から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．
ら，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４； Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９
９０））。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して相同度
を決定することもできる。
【００３４】 ポリペプチド配列比較のパラメーターとしては一般に下記のものが挙げられる
。
。
【００３５】 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（
１９９２）によるＢＬＯＳＳＵＭ６２、 ギャップペナルティ：１２、 ギャップ長ペナルティ：４。
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（
１９９２）によるＢＬＯＳＳＵＭ６２、 ギャップペナルティ：１２、 ギャップ長ペナルティ：４。
【００３６】 これらのパラメーターで使用可能なプログラムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから「ギャップ」
プログラムとして公に入手可能である。エンドギャップにぺナルティのない上記
パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである。
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから「ギャップ」
プログラムとして公に入手可能である。エンドギャップにぺナルティのない上記
パラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００３７】 ポリヌクレオチド配列比較のパラメーターとしては一般に下記のものが挙げら
れる。
れる。
【００３８】 アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：マッチ＝＋１０；ミスマッチ＝０、 ギャップペナルティ：５０、 ギャップ長ペナルティ：３。
ｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、 比較マトリックス：マッチ＝＋１０；ミスマッチ＝０、 ギャップペナルティ：５０、 ギャップ長ペナルティ：３。
【００３９】 これらのパラメーターで使用可能なプログラムはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから「ギャップ」
プログラムとして公に入手可能である。上記パラメーターは核酸比較のためのデ
フォルトパラメーターである。
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから「ギャップ」
プログラムとして公に入手可能である。上記パラメーターは核酸比較のためのデ
フォルトパラメーターである。
【００４０】 本発明は更に式： Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙ （式中、アミノ末端のＸは水素であり、カルボキシ末端のＹは水素又は金属であ
り、Ｒ１とＲ３は任意アミノ酸残基であり、ｎは１〜１０００の整数であり、Ｒ ２ は本発明のアミノ酸、特に配列表に示す群から選択されるアミノ酸配列、好ま
しくは配列番号２の配列によりコードされるアミノ酸配列である）のポリペプチ
ドを含む。式中、Ｒ２はそのアミノ末端残基が左側でＲ１に結合し、そのカルボ
キシ末端残基が右側でＲ３に結合するような向きに配置されている。Ｒが２個以
上の場合には、各Ｒ基により表されるアミノ酸残基の任意部分はヘテロポリマー
でもホモポリマーでもよいが、ヘテロポリマーが好ましい。
り、Ｒ１とＲ３は任意アミノ酸残基であり、ｎは１〜１０００の整数であり、Ｒ ２ は本発明のアミノ酸、特に配列表に示す群から選択されるアミノ酸配列、好ま
しくは配列番号２の配列によりコードされるアミノ酸配列である）のポリペプチ
ドを含む。式中、Ｒ２はそのアミノ末端残基が左側でＲ１に結合し、そのカルボ
キシ末端残基が右側でＲ３に結合するような向きに配置されている。Ｒが２個以
上の場合には、各Ｒ基により表されるアミノ酸残基の任意部分はヘテロポリマー
でもホモポリマーでもよいが、ヘテロポリマーが好ましい。
【００４１】 本発明のポリペプチドは本明細書に記載する配列表に含まれる配列の群から選
択される配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドを含
む。
択される配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチドを含
む。
【００４２】 本発明のポリペプチドは成熟タンパク質でもよいし、融合タンパク質の一部で
もよい。
もよい。
【００４３】 ポリペプチドのフラグメントと変異体も本発明の一部とみなされる。フラグメ
ントは上記ポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなく一部と完全に同一のアミ
ノ酸配列をもつ変異ポリペプチドである。フラグメントは「自律」していてもよ
いし、より大きいポリペプチドに含まれ、フラグメントがその一部又は一領域、
最も好ましくは単一連続領域を形成していてもよい。好ましいフラグメントは本
発明のポリペプチドの活性を媒介するフラグメントである生体活性フラグメント
であり、活性が類似又は改善又は低下したものも含む。動物、特にヒトで抗原性
又は免疫原性であるフラグメントも含む。
ントは上記ポリペプチドのアミノ酸配列の全部ではなく一部と完全に同一のアミ
ノ酸配列をもつ変異ポリペプチドである。フラグメントは「自律」していてもよ
いし、より大きいポリペプチドに含まれ、フラグメントがその一部又は一領域、
最も好ましくは単一連続領域を形成していてもよい。好ましいフラグメントは本
発明のポリペプチドの活性を媒介するフラグメントである生体活性フラグメント
であり、活性が類似又は改善又は低下したものも含む。動物、特にヒトで抗原性
又は免疫原性であるフラグメントも含む。
【００４４】 ポリペプチドの変異体は更に、類似特性をもつ別の残基による置換である保存
アミノ酸置換により配列表に示す配列と相違するポリペプチドも含む。一般に、
このような置換はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間、ＳｅｒとＴｈｒ間、Ａ
ｓｐとＧｌｕ間、ＡｓｎとＧｌｎ間、ＬｙｓとＡｒｇ間、又はＰｈｅとＴｙｒ間
である。５〜１０、１〜５、１〜３又は１個のアミノ酸を任意組合せで置換、欠
失又は付加した変異体が特に好ましい。
アミノ酸置換により配列表に示す配列と相違するポリペプチドも含む。一般に、
このような置換はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ間、ＳｅｒとＴｈｒ間、Ａ
ｓｐとＧｌｕ間、ＡｓｎとＧｌｎ間、ＬｙｓとＡｒｇ間、又はＰｈｅとＴｙｒ間
である。５〜１０、１〜５、１〜３又は１個のアミノ酸を任意組合せで置換、欠
失又は付加した変異体が特に好ましい。
【００４５】 本発明のポリペプチドのフラグメントである変異体はペプチド合成により対応
する全長ポリペプチドを生産するために使用することができる。従って、これら
の変異体は本発明の全長ポリペプチドを生産するための中間体として使用するこ
とができる。
する全長ポリペプチドを生産するために使用することができる。従って、これら
の変異体は本発明の全長ポリペプチドを生産するための中間体として使用するこ
とができる。
【００４６】 本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは追って詳述するように例えば植物
宿主細胞等の宿主細胞の形質転換で使用することができる。 本発明は更に、付加アミノもしくはカルボキシ末端アミノ酸を加えた成熟タンパ
ク質、又は成熟ポリペプチド内のアミノ酸（例えば、タンパク質の成熟形態が２
個以上のポリペプチド鎖をもつ場合）であるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドも提供する。このような配列は例えば前駆物質から成熟形態へのタンパ
ク質のプロセッシングで役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質
半減期を増減し、あるいはアッセイ又は生産時にタンパク質の操作を容易にする
。細胞酵素を使用して成熟タンパク質から付加アミノ酸を除去できると考えられ
る。
宿主細胞等の宿主細胞の形質転換で使用することができる。 本発明は更に、付加アミノもしくはカルボキシ末端アミノ酸を加えた成熟タンパ
ク質、又は成熟ポリペプチド内のアミノ酸（例えば、タンパク質の成熟形態が２
個以上のポリペプチド鎖をもつ場合）であるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドも提供する。このような配列は例えば前駆物質から成熟形態へのタンパ
ク質のプロセッシングで役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質
半減期を増減し、あるいはアッセイ又は生産時にタンパク質の操作を容易にする
。細胞酵素を使用して成熟タンパク質から付加アミノ酸を除去できると考えられ
る。
【００４７】 １種以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態をもつ前駆物質タンパ
ク質はポリペプチドの不活性形態であり得る。不活性前駆物質は一般にプロ配列
を除去すると活性化される。活性化前にプロ配列の一部又は全部を除去すればよ
い。このような前駆物質タンパク質を一般にプロタンパク質と言う。
ク質はポリペプチドの不活性形態であり得る。不活性前駆物質は一般にプロ配列
を除去すると活性化される。活性化前にプロ配列の一部又は全部を除去すればよ
い。このような前駆物質タンパク質を一般にプロタンパク質と言う。
【００４８】 構築物と使用方法 本発明のｄｘｒ配列を宿主細胞で転写又は転写翻訳（発現）させるために組換
えＤＮＡ構築物でヌクレオチド配列を使用すると特に有利である。発現構築物は
一般に、宿主細胞で機能的であり、本発明のｄｘｒをコードする核酸配列に作動
的に連結したプロモーターと、宿主細胞で機能的な転写終結領域を含む。本発明
で特に有利な宿主細胞としては真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞及
び植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
えＤＮＡ構築物でヌクレオチド配列を使用すると特に有利である。発現構築物は
一般に、宿主細胞で機能的であり、本発明のｄｘｒをコードする核酸配列に作動
的に連結したプロモーターと、宿主細胞で機能的な転写終結領域を含む。本発明
で特に有利な宿主細胞としては真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、哺乳動物細胞及
び植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】 第１の核酸配列が第２の核酸配列の機能に作用するように配置されているとき
、第１の核酸配列は第２の核酸配列に「作動的に連結」又は「作動的に結合」し
ている。２つの配列は単一連続核酸分子の一部であることが好ましく、隣接して
いるとより好ましい。例えば、プロモーターは細胞で遺伝子の転写を調節又は媒
介する場合には遺伝子に作動的に連結している。
、第１の核酸配列は第２の核酸配列に「作動的に連結」又は「作動的に結合」し
ている。２つの配列は単一連続核酸分子の一部であることが好ましく、隣接して
いるとより好ましい。例えば、プロモーターは細胞で遺伝子の転写を調節又は媒
介する場合には遺伝子に作動的に連結している。
【００５０】 当業者に自明の通り、植物細胞で機能的なプロモーターは多数あり、文献に記
載されている。葉緑体及びプラスチド特異的プロモーター、葉緑体又はプラスチ
ド機能プロモーター、及び葉緑体又はプラスチド作動性プロモーターも含まれる
。
載されている。葉緑体及びプラスチド特異的プロモーター、葉緑体又はプラスチ
ド機能プロモーター、及び葉緑体又はプラスチド作動性プロモーターも含まれる
。
【００５１】 大半の植物器官で高発現レベルを生じるＣａＭＶ３５Ｓ又はＦＭＶ３５Ｓプロ
モーター等の１組の植物機能プロモーターは構成的プロモーターである。ＣａＭ
Ｖ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターの促進又は重複型が本発明の実施に有用
である（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；
Ｒｏｇｅｒｓ，米国特許第５，３７８，６１９号）。更に、葉、茎、根、塊茎、
種子、果実等の植物の特定組織でｄｘｒ遺伝子の発現を引起すことが好ましい場
合もあり、プロモーターは所望組織及び発生特異性をもつように選択すべきであ
る。
モーター等の１組の植物機能プロモーターは構成的プロモーターである。ＣａＭ
Ｖ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターの促進又は重複型が本発明の実施に有用
である（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２；
Ｒｏｇｅｒｓ，米国特許第５，３７８，６１９号）。更に、葉、茎、根、塊茎、
種子、果実等の植物の特定組織でｄｘｒ遺伝子の発現を引起すことが好ましい場
合もあり、プロモーターは所望組織及び発生特異性をもつように選択すべきであ
る。
【００５２】 植物種子組織で優先的に発現される転写開始領域から本発明の核酸配列を発現
させると特に有利である。このような種子優先転写開始配列の例としては、植物
貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列から誘導される配列又は脂肪種子で脂肪
酸生合成に関与する遺伝子から誘導される配列が挙げられる。このようなプロモ
ーターの例としてはナピン（Ｋｒｉｄｌら，Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２
０９−２１９（１９９１））、ファゼオリン、ゼイン、大豆トリプシンインヒビ
ター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、β−コングリシニンの大
豆α’サブユニット（大豆ｓ、（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，８３：８５６０−８５６４（１９８６）））及びオレオシン等の遺伝
子からの５’調節領域が挙げられる。
させると特に有利である。このような種子優先転写開始配列の例としては、植物
貯蔵タンパク質遺伝子をコードする配列から誘導される配列又は脂肪種子で脂肪
酸生合成に関与する遺伝子から誘導される配列が挙げられる。このようなプロモ
ーターの例としてはナピン（Ｋｒｉｄｌら，Ｓｅｅｄ Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２
０９−２１９（１９９１））、ファゼオリン、ゼイン、大豆トリプシンインヒビ
ター、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、β−コングリシニンの大
豆α’サブユニット（大豆ｓ、（Ｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，８３：８５６０−８５６４（１９８６）））及びオレオシン等の遺伝
子からの５’調節領域が挙げられる。
【００５３】 ｄｘｒを付与するタンパク質を特定細胞下区画、例えばミトコンドリア、小胞
体、空胞、葉緑体又は他のプラスチド区画に局限すると有利な場合がある。例え
ば本発明の着目遺伝子をプラスチド（例えば葉緑体）にターゲティングして発現
させる場合には、構築物は遺伝子をプラスチドに誘導するためにも配列を使用す
る。このような配列を本明細書では葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）又は
プラスチドトランジットペプチド（ＰＴＰ）と言う。このように、着目遺伝子を
プラスチドに直接挿入しない場合には、発現構築物は着目遺伝子をプラスチドに
誘導するためにトランジットペプチドをコードする遺伝子も含む。葉緑体トラン
ジットペプチドは着目遺伝子から誘導してもよいし、ＣＴＰをもつ異種配列から
誘導してもよい。このようなトランジットペプチドは当分野で公知である。例え
ばＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ
．９：１０４−１２６； Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：１７５４４−１７５５０； ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８； Ｒｏｍｅｒら（１９９
３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１
４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−
４８１を参照されたい。
体、空胞、葉緑体又は他のプラスチド区画に局限すると有利な場合がある。例え
ば本発明の着目遺伝子をプラスチド（例えば葉緑体）にターゲティングして発現
させる場合には、構築物は遺伝子をプラスチドに誘導するためにも配列を使用す
る。このような配列を本明細書では葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）又は
プラスチドトランジットペプチド（ＰＴＰ）と言う。このように、着目遺伝子を
プラスチドに直接挿入しない場合には、発現構築物は着目遺伝子をプラスチドに
誘導するためにトランジットペプチドをコードする遺伝子も含む。葉緑体トラン
ジットペプチドは着目遺伝子から誘導してもよいし、ＣＴＰをもつ異種配列から
誘導してもよい。このようなトランジットペプチドは当分野で公知である。例え
ばＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ
．９：１０４−１２６； Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：１７５４４−１７５５０； ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８； Ｒｏｍｅｒら（１９９
３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１
４−１４２１；及びＳｈａｈら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−
４８１を参照されたい。
【００５４】 所期用途に応じて構築物は完全ｄｘｒタンパク質又はその一部をコードする核
酸配列を含むことができる。例えば、所与ｄｘｒタンパク質のアンチセンス阻害
が所望される場合には、完全ｄｘｒ配列は必要ない。更に、構築物で使用するｄ
ｘｒ配列をプローブとして使用する場合には、ｄｘｒコーディング配列の特定部
分のみ（例えば高度に保存されたｄｘｒ領域をコードすることが分かっている配
列）を含む構築物を作製すると有利であると思われる。
酸配列を含むことができる。例えば、所与ｄｘｒタンパク質のアンチセンス阻害
が所望される場合には、完全ｄｘｒ配列は必要ない。更に、構築物で使用するｄ
ｘｒ配列をプローブとして使用する場合には、ｄｘｒコーディング配列の特定部
分のみ（例えば高度に保存されたｄｘｒ領域をコードすることが分かっている配
列）を含む構築物を作製すると有利であると思われる。
【００５５】 当業者に自明の通り、宿主細胞で内在配列の発現を阻害する方法は種々のもの
がある。このような方法の非限定的な例としては、アンチセンス抑制（Ｓｍｉｔ
ｈら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２４−７２６）、同時抑制（Ｎａｐ
ｏｌｉら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９）、リボザイ
ム（ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１０３２８）、及びセンスとアンチセンスの組合せ（
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５：１３９５９−１３９６４）が挙げられる。宿主細胞で内在発現を
抑制する方法は一般に抑制すべき配列の少なくとも一部の転写又は転写翻訳を利
用している。このような配列は内在配列のコーディング領域と非コーディング領
域に相同であり得る。
がある。このような方法の非限定的な例としては、アンチセンス抑制（Ｓｍｉｔ
ｈら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２４−７２６）、同時抑制（Ｎａｐ
ｏｌｉら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９）、リボザイ
ム（ＰＣＴ公開ＷＯ９７／１０３２８）、及びセンスとアンチセンスの組合せ（
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５：１３９５９−１３９６４）が挙げられる。宿主細胞で内在発現を
抑制する方法は一般に抑制すべき配列の少なくとも一部の転写又は転写翻訳を利
用している。このような配列は内在配列のコーディング領域と非コーディング領
域に相同であり得る。
【００５６】 本発明の植物発現構築物に更に調節転写終結領域を加えてもよい。転写終結領
域はｄｘｒをコードするＤＮＡ配列により加えてもよいし、別の遺伝子源に由来
する適当な転写終結領域（例えば転写開始領域に天然に関連する転写終結領域）
により加えてもよい。当業者に自明の通り、植物細胞で転写を終結することが可
能な任意の適当な転写終結領域を本発明の構築物で利用することができる。 あるいは、宿主植物細胞プラスチドから直接ｄｘｒ配列を発現させるように構築
物を作製してもよい。このような構築物と方法は当分野で公知であり、例えばＳ
ｖａｂら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：
８５２６−８５３０； Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；及び米国特許
第５，６９３，５０７号に一般的に記載されている。
域はｄｘｒをコードするＤＮＡ配列により加えてもよいし、別の遺伝子源に由来
する適当な転写終結領域（例えば転写開始領域に天然に関連する転写終結領域）
により加えてもよい。当業者に自明の通り、植物細胞で転写を終結することが可
能な任意の適当な転写終結領域を本発明の構築物で利用することができる。 あるいは、宿主植物細胞プラスチドから直接ｄｘｒ配列を発現させるように構築
物を作製してもよい。このような構築物と方法は当分野で公知であり、例えばＳ
ｖａｂら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：
８５２６−８５３０； Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；及び米国特許
第５，６９３，５０７号に一般的に記載されている。
【００５７】 本発明の構築物はイソプレノイドの生産に関与する付加遺伝子を発現させるた
めの付加構築物と共にイソプレノイド経路の流量を調節する方法で使用すること
もできる。このような配列の非限定的な例としては１−デオキシキシルロース５
−リン酸シンターゼが挙げられる。
めの付加構築物と共にイソプレノイド経路の流量を調節する方法で使用すること
もできる。このような配列の非限定的な例としては１−デオキシキシルロース５
−リン酸シンターゼが挙げられる。
【００５８】 更に、本発明の構築物は特定イソプレノイド（例えばトコフェロール、カロテ
ノイド、ステロール、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペン）の生産で
タンパク質をコードする付加核酸配列を発現させる付加構築物と共に形質転換方
法で使用することもできる。カロテノイドの生産に関与する核酸配列と方法は例
えばＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７８６７に記載されている。トコフェロールの生産
に関与する核酸配列の非限定的な例としてはγトコフェロールメチルトランスフ
ェラーゼ（Ｓｈｉｎｔａｎｉら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９６
）：２０９８−２１００）、トコフェロールシクラーゼ、トコフェロールメチル
トランスフェラーゼ、フィチルフェニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニル
ピロリン酸ハイドロゲナーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼが挙げら
れる。
ノイド、ステロール、モノテルペン、セスキテルペン及びジテルペン）の生産で
タンパク質をコードする付加核酸配列を発現させる付加構築物と共に形質転換方
法で使用することもできる。カロテノイドの生産に関与する核酸配列と方法は例
えばＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７８６７に記載されている。トコフェロールの生産
に関与する核酸配列の非限定的な例としてはγトコフェロールメチルトランスフ
ェラーゼ（Ｓｈｉｎｔａｎｉら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（５３９６
）：２０９８−２１００）、トコフェロールシクラーゼ、トコフェロールメチル
トランスフェラーゼ、フィチルフェニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニル
ピロリン酸ハイドロゲナーゼ、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼが挙げら
れる。
【００５９】 発現構築物を含む組換えＤＮＡ構築物を導入した植物細胞、組織、器官又は植
物を形質転換、トランスフェクト又はトランスジェニックとみなす。トランスジ
ェニック又は形質転換細胞又は植物は細胞又は植物の子孫も含み、更に、このよ
うなトランスジェニック植物を交配で親として使用し、ｄｘｒ核酸配列の存在に
起因する表現型の変化を示す育種プログラムから生産した子孫も含む。
物を形質転換、トランスフェクト又はトランスジェニックとみなす。トランスジ
ェニック又は形質転換細胞又は植物は細胞又は植物の子孫も含み、更に、このよ
うなトランスジェニック植物を交配で親として使用し、ｄｘｒ核酸配列の存在に
起因する表現型の変化を示す育種プログラムから生産した子孫も含む。
【００６０】 その発現を増減するための着目ＤＮＡ配列としてｄｘｒコーディング配列をも
つ植物発現又は転写構築物は広範な植物で使用することができる。本発明の方法
で使用するのに特に好ましい植物としてはアカシア、アルファルファ、アニス、
リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、キバナスズシロ、アスパラガス、ア
ボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、
ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、カノラ、カンタループ、ニンジン、キャッ
サバ、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、コリアンダー、柑橘類、クレ
メンタイン、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ベイマツ、ナス、エン
ダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ガーリック、ゴード、
ブドウ、グレープフルーツ、ハネデューメロン、ヒーカマ、キーウィフルーツ、
レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュル
ーム、ネクタリン、ナッツ、エンバク、ギネアアブラヤシ、アブラナ、オクラ、
タマネギ、オレンジ、鑑賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ラッカセ
イ、ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、
ポプラ、ジャガイモ、パンプキン、マルメロ、ラディッキオ、ラディッシュ、ラ
ズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ナンブマツ、ダイズ、ホウレンソウ、カ
ボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ
、タンジェリン、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、シバクサ、カブ、蔓植物
、スイカ、コムギ、ヤムイモ及びズッキーニが挙げられるが、これらに限定され
ない。
つ植物発現又は転写構築物は広範な植物で使用することができる。本発明の方法
で使用するのに特に好ましい植物としてはアカシア、アルファルファ、アニス、
リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、キバナスズシロ、アスパラガス、ア
ボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、
ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、カノラ、カンタループ、ニンジン、キャッ
サバ、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、コリアンダー、柑橘類、クレ
メンタイン、コーヒー、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ベイマツ、ナス、エン
ダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ガーリック、ゴード、
ブドウ、グレープフルーツ、ハネデューメロン、ヒーカマ、キーウィフルーツ、
レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュル
ーム、ネクタリン、ナッツ、エンバク、ギネアアブラヤシ、アブラナ、オクラ、
タマネギ、オレンジ、鑑賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ラッカセ
イ、ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、
ポプラ、ジャガイモ、パンプキン、マルメロ、ラディッキオ、ラディッシュ、ラ
ズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ナンブマツ、ダイズ、ホウレンソウ、カ
ボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ
、タンジェリン、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、シバクサ、カブ、蔓植物
、スイカ、コムギ、ヤムイモ及びズッキーニが挙げられるが、これらに限定され
ない。
【００６１】 食用及び工業用植物油の生産に用いられる植物が特に好ましい。温帯産脂肪種
子作物が最も好ましい。このような温帯産脂肪種子作物の非限定的な例としては
、アブラナ（カノラ及び高エルカ酸品種）、ヒマワリ、サフラワー、ワタ、ダイ
ズ、ラッカセイ、ココヤシ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシが挙げられる。
組換え構築物を宿主細胞に導入する方法によっては他のＤＮＡ配列が必要な場合
もある。要するに、本発明は双子葉種と単子葉種に等しく適用でき、新規及び／
又は改良形質転換及び調節法に容易に適用可能である。
子作物が最も好ましい。このような温帯産脂肪種子作物の非限定的な例としては
、アブラナ（カノラ及び高エルカ酸品種）、ヒマワリ、サフラワー、ワタ、ダイ
ズ、ラッカセイ、ココヤシ、ギネアアブラヤシ及びトウモロコシが挙げられる。
組換え構築物を宿主細胞に導入する方法によっては他のＤＮＡ配列が必要な場合
もある。要するに、本発明は双子葉種と単子葉種に等しく適用でき、新規及び／
又は改良形質転換及び調節法に容易に適用可能である。
【００６２】 植物又は植物部分（非限定的な例として葉、茎、根、生殖器官及び種子）を生
産するために植物でｄｘｒ構築物を使用すると特に有利であり、形質転換植物細
胞をもつ植物部分ではトコフェロール含量が変化する。
産するために植物でｄｘｒ構築物を使用すると特に有利であり、形質転換植物細
胞をもつ植物部分ではトコフェロール含量が変化する。
【００６３】 免疫スクリーニングでは、精製タンパク質又はその一部をウサギ又はマウスに
注入することによりタンパク質に対する抗体を作製することができ、このような
抗体作製方法は当業者に周知である。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体
のどちらも作製できるが、遺伝子単離には一般にポリクローナル抗体のほうが有
用である。ウェスタン分析を実施し、コード化タンパク質に対する抗体との交差
反応により関連タンパク質が所望植物種の粗抽出液中に存在するか否かを決定す
ることができる。交差反応性が観察された場合には、所望植物種に相当する発現
ライブラリーをスクリーニングすることにより関連タンパク質をコードする遺伝
子を単離する。発現ライブラリーはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８
９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているようにλ
ｇｔ１１等の種々の市販ベクターで構築することができる。
注入することによりタンパク質に対する抗体を作製することができ、このような
抗体作製方法は当業者に周知である。モノクローナル抗体とポリクローナル抗体
のどちらも作製できるが、遺伝子単離には一般にポリクローナル抗体のほうが有
用である。ウェスタン分析を実施し、コード化タンパク質に対する抗体との交差
反応により関連タンパク質が所望植物種の粗抽出液中に存在するか否かを決定す
ることができる。交差反応性が観察された場合には、所望植物種に相当する発現
ライブラリーをスクリーニングすることにより関連タンパク質をコードする遺伝
子を単離する。発現ライブラリーはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８
９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているようにλ
ｇｔ１１等の種々の市販ベクターで構築することができる。
【００６４】 同定された核酸配列によりコードされるタンパク質のｄｘｒ酵素としての活性
及び特異性を確認するために、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞培養
物でｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施する。このようなバキュロウイルス発現系
は当分野で公知であり、その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とす
るＬｅｅら，米国特許第５，３４８，８８６号に記載されている。
及び特異性を確認するために、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞培養
物でｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施する。このようなバキュロウイルス発現系
は当分野で公知であり、その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とす
るＬｅｅら，米国特許第５，３４８，８８６号に記載されている。
【００６５】 更に、種々の発現系を利用してタンパク質活性をアッセイするために他の発現
構築物を作製してもよい。このような発現構築物を酵母又は原核宿主に形質転換
し、ｄｘｒ活性をアッセイする。このような発現系は当分野で公知であり、商業
ソースから容易に入手できる。
構築物を作製してもよい。このような発現構築物を酵母又は原核宿主に形質転換
し、ｄｘｒ活性をアッセイする。このような発現系は当分野で公知であり、商業
ソースから容易に入手できる。
【００６６】 本発明に記載する配列に加え、本発明で有用なＤＮＡコーディング配列は藻類
、真菌類、細菌、哺乳動物源、植物等から得られる。ｄｘｒの保存ヌクレオチド
及びアミノ酸配列に対応するシグネーチャー配列を使用して既存データベースで
ホモロジー検索を行うと、植物や微生物等の他のソースから等価の同類遺伝子を
単離することができる。ＥＳＴデータベース検索も利用できる。更に、本明細書
に開示する配列と機能的酵素的に等価の酵素をコードし、遺伝コードの縮重によ
り本明細書に開示する核酸配列の縮重等価物であるＤＮＡ配列の使用も本発明に
含まれる。これらの方法のいずれかにより同定されるコーディング配列の機能性
の立証は特異的生化学反応がないか又は突然変異している適当な生物（例えばＳ
ｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、酵母、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の突然変異体の相補により実施することが
できる。ＤＮＡコーディング領域の配列は特定宿主における最大発現のためにコ
ドン使用に基づく遺伝子再合成により最適化することができる。
、真菌類、細菌、哺乳動物源、植物等から得られる。ｄｘｒの保存ヌクレオチド
及びアミノ酸配列に対応するシグネーチャー配列を使用して既存データベースで
ホモロジー検索を行うと、植物や微生物等の他のソースから等価の同類遺伝子を
単離することができる。ＥＳＴデータベース検索も利用できる。更に、本明細書
に開示する配列と機能的酵素的に等価の酵素をコードし、遺伝コードの縮重によ
り本明細書に開示する核酸配列の縮重等価物であるＤＮＡ配列の使用も本発明に
含まれる。これらの方法のいずれかにより同定されるコーディング配列の機能性
の立証は特異的生化学反応がないか又は突然変異している適当な生物（例えばＳ
ｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、酵母、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の突然変異体の相補により実施することが
できる。ＤＮＡコーディング領域の配列は特定宿主における最大発現のためにコ
ドン使用に基づく遺伝子再合成により最適化することができる。
【００６７】 このようなトランスジェニック植物を得る形質転換法は本発明では限定的でな
く、種々の植物形質転換法が広く利用できる。更に、作物を形質転換する新規方
法が入手可能になれば、その方法を直接適用してもよい。例えば、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ感染に天然に感受性の多くの植物種はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍを介するトリナリー又はバイナリーベクター形質転換法で首尾よく形質転換で
きる。多くの場合には、一端又は両端にＴ−ＤＮＡをもつ構築物、特に左右境界
配列、特に右境界配列をもつ構築物を得ることが望ましい。これは構築物がＡ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを形質転換モードとして
使用する場合に特に有用であるが、他の形質転換モードでもＴ−ＤＮＡ境界配列
を利用できる。更に、種々の単子葉及び双子葉植物種の形質転換を可能にするマ
イクロインジェクション、ＤＮＡ粒子ボンバードメント及びエレクトロポレーシ
ョン技術が開発されている。
く、種々の植物形質転換法が広く利用できる。更に、作物を形質転換する新規方
法が入手可能になれば、その方法を直接適用してもよい。例えば、Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ感染に天然に感受性の多くの植物種はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍを介するトリナリー又はバイナリーベクター形質転換法で首尾よく形質転換で
きる。多くの場合には、一端又は両端にＴ−ＤＮＡをもつ構築物、特に左右境界
配列、特に右境界配列をもつ構築物を得ることが望ましい。これは構築物がＡ．
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを形質転換モードとして
使用する場合に特に有用であるが、他の形質転換モードでもＴ−ＤＮＡ境界配列
を利用できる。更に、種々の単子葉及び双子葉植物種の形質転換を可能にするマ
イクロインジェクション、ＤＮＡ粒子ボンバードメント及びエレクトロポレーシ
ョン技術が開発されている。
【００６８】 一般に、ＤＮＡ構築物は宿主での発現に必要な調節領域をもち且つ形質転換細
胞の選択を可能にする構造遺伝子を含む。構造遺伝子は細胞毒性物質（例えば抗
生物質、重金属、毒素等）に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養を提供する相
補、ウイルス免疫等を提供することができる。発現構築物又はその成分を導入す
る異なる宿主種の数に応じて１種以上のマーカーを使用することができ、宿主に
よって異なる選択条件を使用する。
胞の選択を可能にする構造遺伝子を含む。構造遺伝子は細胞毒性物質（例えば抗
生物質、重金属、毒素等）に対する耐性、栄養要求性宿主に原栄養を提供する相
補、ウイルス免疫等を提供することができる。発現構築物又はその成分を導入す
る異なる宿主種の数に応じて１種以上のマーカーを使用することができ、宿主に
よって異なる選択条件を使用する。
【００６９】 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを植物細胞形質転換に使用する場合には、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に存在するＴ−ＤＮＡ又はＴｉもしくはＲｉプラスミ
ドとの同種組換えのためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に導入可能なベクタ
ーを使用することができる。組換えのためにＴ−ＤＮＡを含むＴｉ又はＲｉプラ
スミドはｖｉｒ遺伝子が形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に存在する限
り、アームドプラスミド（ゴール形成を生じることができる）でもよいし、ディ
スアームドプラスミド（ゴール形成を生じることができない）でもよい。アーム
ドプラスミドでは正常植物細胞とゴールの混合物が得られる。
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に存在するＴ−ＤＮＡ又はＴｉもしくはＲｉプラスミ
ドとの同種組換えのためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に導入可能なベクタ
ーを使用することができる。組換えのためにＴ−ＤＮＡを含むＴｉ又はＲｉプラ
スミドはｖｉｒ遺伝子が形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に存在する限
り、アームドプラスミド（ゴール形成を生じることができる）でもよいし、ディ
スアームドプラスミド（ゴール形成を生じることができない）でもよい。アーム
ドプラスミドでは正常植物細胞とゴールの混合物が得られる。
【００７０】 宿主植物細胞を形質転換するためのビークルとしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍを使用する場合には、文献に記載されているような大腸菌とＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍで複製可能な広範な宿主ベクターにＴ−ＤＮＡ境界領域をもつ発現又
は転写構築物を挿入する。ｐＲＫ２又はその誘導体が広く使用されている。例え
ば参考資料として本明細書の一部とするＤｉｔｔａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７：７３４７−７３５１）及びＥ
ＰＡ０１２０５１５参照。あるいは、一方が大腸菌、他方がＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍでベクターを安定化させる別個の複製配列を含むベクターに植物細胞で
発現させようとする配列を挿入してもよい。例えば、ＭｃＢｒｉｄｅら（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１４：２６９−２７６）では、ｐＲｉＨ
ＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）２０１：
３７０−３７４）複製起点を利用して宿主Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞にお
ける植物発現ベクターの安定性を増している。
ｍを使用する場合には、文献に記載されているような大腸菌とＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍで複製可能な広範な宿主ベクターにＴ−ＤＮＡ境界領域をもつ発現又
は転写構築物を挿入する。ｐＲＫ２又はその誘導体が広く使用されている。例え
ば参考資料として本明細書の一部とするＤｉｔｔａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７：７３４７−７３５１）及びＥ
ＰＡ０１２０５１５参照。あるいは、一方が大腸菌、他方がＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍでベクターを安定化させる別個の複製配列を含むベクターに植物細胞で
発現させようとする配列を挿入してもよい。例えば、ＭｃＢｒｉｄｅら（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１４：２６９−２７６）では、ｐＲｉＨ
ＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）２０１：
３７０−３７４）複製起点を利用して宿主Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞にお
ける植物発現ベクターの安定性を増している。
【００７１】 発現構築物とＴ−ＤＮＡは形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及び形質転換
植物細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーを含む。クロラムフェノコール
、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシン耐性等の多数の
マーカーが植物細胞用として開発されている。使用する特定マーカーは本発明に
重要ではなく、特定宿主及び構築方法に応じて好ましいマーカーは異なる。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する植物細胞の形質転換には、外植片を形質
転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に形質転換に十分な時間インキュベートし
、細菌を死滅させ、植物細胞を適当な選択培地で培養する。カルスが形成された
ら、公知方法により適当な植物ホルモンを使用することにより苗条形成を促進し
、苗条を植物再生用活着培地に移す。次に、植物を種子まで成長させ、種子を使
用して反復世代を確立し、植物油を分離することができる。
植物細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーを含む。クロラムフェノコール
、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシン耐性等の多数の
マーカーが植物細胞用として開発されている。使用する特定マーカーは本発明に
重要ではなく、特定宿主及び構築方法に応じて好ましいマーカーは異なる。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する植物細胞の形質転換には、外植片を形質
転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に形質転換に十分な時間インキュベートし
、細菌を死滅させ、植物細胞を適当な選択培地で培養する。カルスが形成された
ら、公知方法により適当な植物ホルモンを使用することにより苗条形成を促進し
、苗条を植物再生用活着培地に移す。次に、植物を種子まで成長させ、種子を使
用して反復世代を確立し、植物油を分離することができる。
【００７２】 多数の発現構築物を含む本発明の植物細胞を得るには数種の方法が利用できる
。本発明の発現構築物をコードするＤＮＡ配列をもつ構築物を含む植物を生産す
るために任意手段と、酵素をコードする別のＤＮＡ配列をもつ少なくとも１種の
他の構築物も本発明に含まれる。例えば、単一形質転換ベクターに両方の発現構
築物を加えるか又は各々所望の遺伝子を発現する別個のベクターを使用すること
により、発現構築物を使用して第２の構築物と同時に植物を形質転換することが
できる。第２の構築物はｄｘｒ発現構築物で既に形質転換された植物に導入して
もよいし、あるいはｄｘｒを発現する形質転換植物と第２の構築物を発現する形
質転換植物を交配して同一植物で構築物を一つにすることができる。
。本発明の発現構築物をコードするＤＮＡ配列をもつ構築物を含む植物を生産す
るために任意手段と、酵素をコードする別のＤＮＡ配列をもつ少なくとも１種の
他の構築物も本発明に含まれる。例えば、単一形質転換ベクターに両方の発現構
築物を加えるか又は各々所望の遺伝子を発現する別個のベクターを使用すること
により、発現構築物を使用して第２の構築物と同時に植物を形質転換することが
できる。第２の構築物はｄｘｒ発現構築物で既に形質転換された植物に導入して
もよいし、あるいはｄｘｒを発現する形質転換植物と第２の構築物を発現する形
質転換植物を交配して同一植物で構築物を一つにすることができる。
【００７３】 本発明の核酸配列を構築物で使用すると、種々の原核及び真核宿主細胞で配列
を発現させることがてきる。本発明の宿主細胞は単子葉植物細胞と双子葉植物細
胞が好ましい。
を発現させることがてきる。本発明の宿主細胞は単子葉植物細胞と双子葉植物細
胞が好ましい。
【００７４】 一般に、当業者は高分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及
び単離、組換え生物の作製並びにクローンのスクリーニングと単離に関する特定
条件及び手順を記載した標準資料に精通している（例えばその開示内容全体を参
考資料として本明細書の一部とするＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）； その開示内容全体を参考
資料として本明細書の一部とするＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ； その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部と
するＢｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ａｎａｌｙｚｉｎｇ
ＤＮＡ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）
。
び単離、組換え生物の作製並びにクローンのスクリーニングと単離に関する特定
条件及び手順を記載した標準資料に精通している（例えばその開示内容全体を参
考資料として本明細書の一部とするＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）； その開示内容全体を参考
資料として本明細書の一部とするＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ； その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部と
するＢｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ；Ａｎａｌｙｚｉｎｇ
ＤＮＡ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）
。
【００７５】 昆虫宿主細胞で配列を発現させる方法は当分野で公知である。バキュロウイル
ス発現ベクターは選択した外来遺伝子のコーディング配列をウイルス遺伝子（例
えばポリヘドリン）の代わりにバキュロウイルスプロモーターの後方に挿入した
組換え昆虫ウイルスである（その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部
とするＳｍｉｔｈとＳｕｍｍｅｒｓ，米国特許第４，７４５，０５１号）。バキ
ュロウイルス発現ベクターは当分野で公知であり、例えばいずれもその開示内容
全体を参考資料として本明細書の一部とするＤｏｅｒｆｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：５１−６８（１９６８）；
Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６
：４７−５５（１９８８ａ）； Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７−１９９（１９８８）； Ｓｕｍｍｅ
ｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｃｏｍｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｂｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｙ．Ｙ．（１９８８）； Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇ．Ｅｘｐｅｒ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１５５５（１９８８）に記載されている。
ス発現ベクターは選択した外来遺伝子のコーディング配列をウイルス遺伝子（例
えばポリヘドリン）の代わりにバキュロウイルスプロモーターの後方に挿入した
組換え昆虫ウイルスである（その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部
とするＳｍｉｔｈとＳｕｍｍｅｒｓ，米国特許第４，７４５，０５１号）。バキ
ュロウイルス発現ベクターは当分野で公知であり、例えばいずれもその開示内容
全体を参考資料として本明細書の一部とするＤｏｅｒｆｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：５１−６８（１９６８）；
Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６
：４７−５５（１９８８ａ）； Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７−１９９（１９８８）； Ｓｕｍｍｅ
ｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｃｏｍｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｂｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ，Ｙ．Ｙ．（１９８８）； Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａ Ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇ．Ｅｘｐｅｒ．Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１５５５（１９８８）に記載されている。
【００７６】 真菌宿主細胞で着目核酸配列を発現させる方法は当分野で公知である。真菌宿
主細胞としては例えば酵母細胞又は糸状菌細胞が挙げられる。酵母細胞で着目Ｄ
ＮＡ配列を発現させる方法は“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ
Ｆｉｎｋ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄａｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｖｏｌ １９４（１９９１）と“Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏ
ｌ １８５（１９９１）に概説されている。
主細胞としては例えば酵母細胞又は糸状菌細胞が挙げられる。酵母細胞で着目Ｄ
ＮＡ配列を発現させる方法は“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ
Ｆｉｎｋ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄａｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｖｏｌ １９４（１９９１）と“Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｖｏ
ｌ １８５（１９９１）に概説されている。
【００７７】 発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当分野で公知であり、例えばＨ
ｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、乳児ハムスター腎（
ＢＨＫ）細胞及び多数の他の細胞系等のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手
可能な多数の不死化細胞系が挙げられる。利用可能な哺乳動物細胞用プロモータ
ーも当分野で公知であり、非限定的な例としてはサルウイルス４０（ＳＶ４０）
（その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とするＦｉｅｒｓら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９９８））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ア
デノウイルス（ＡＤＶ）及びウシパピローマウシ（ＢＰＶ）に由来するもの等の
ウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞は更にターミネーター配列と
ポリＡ付加配列が必要な場合がある。発現を亢進するエンハンサー配列も加えて
もよく、遺伝子の増幅を助長する配列も望ましい場合がある（例えばメトトレキ
セート耐性遺伝子）。
ｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、乳児ハムスター腎（
ＢＨＫ）細胞及び多数の他の細胞系等のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手
可能な多数の不死化細胞系が挙げられる。利用可能な哺乳動物細胞用プロモータ
ーも当分野で公知であり、非限定的な例としてはサルウイルス４０（ＳＶ４０）
（その開示内容全体を参考資料として本明細書の一部とするＦｉｅｒｓら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２７３：１１３（１９９８））、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ア
デノウイルス（ＡＤＶ）及びウシパピローマウシ（ＢＰＶ）に由来するもの等の
ウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞は更にターミネーター配列と
ポリＡ付加配列が必要な場合がある。発現を亢進するエンハンサー配列も加えて
もよく、遺伝子の増幅を助長する配列も望ましい場合がある（例えばメトトレキ
セート耐性遺伝子）。
【００７８】 哺乳動物細胞で複製するのに利用可能なベクターは当分野で周知であり、ウイ
ルスレプリコン又はエピトープをコードする適当な配列の宿主ゲノム組込みを確
保する配列が挙げられる。組換えウイルスの構築を大いに助長するプラスミドベ
クターは文献に記載されている（例えばいずれもその開示内容全体を参考資料と
して本明細書の一部とするＭａｃｋｅｔｔら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７（
１９８４）； Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：
３４０３（１９８５）； Ｍｏｓｓ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅ
ｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ
Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｎ．Ｙ．，ｐ．１０，（１９８７）参照）。
ルスレプリコン又はエピトープをコードする適当な配列の宿主ゲノム組込みを確
保する配列が挙げられる。組換えウイルスの構築を大いに助長するプラスミドベ
クターは文献に記載されている（例えばいずれもその開示内容全体を参考資料と
して本明細書の一部とするＭａｃｋｅｔｔら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７（
１９８４）； Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：
３４０３（１９８５）； Ｍｏｓｓ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅ
ｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ
Ｃａｌｏｓ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，Ｎ．Ｙ．，ｐ．１０，（１９８７）参照）。
【００７９】 以上、本発明を一般的に説明したが、以下の実施例により更によく理解されよ
う。尚、以下の実施例は単に例示を目的とし、本発明を制限するものではない。
う。尚、以下の実施例は単に例示を目的とし、本発明を制限するものではない。
【００８０】 実施例 実施例１：２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの合成 Ｄｕｖｏｌｄら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３８：４７
６９−４７２２とＤｕｖｏｌｄら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ ３８：６１８１−６１８４をより大量の生産に合うように改変し、約８０％
ｅ．ｅ．の２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールを合成した。３−メチル−２（
５Ｈ）−フラノン（２００ｍｇ，２ｍｍｏｌ）の無水エーテル（２０ｍｌ）溶液
を０℃で１５分間かけてアルゴン下にＬｉＡｌＨ４（４６ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ
）の無水エーテル（２０ｍｌ）撹拌溶液に加えた。反応混合物を０℃で更に２時
間撹拌した。過剰のＬｉＡｌＨ４が消失するまでＮＨ４Ｃｌの飽和溶液（２ｍｌ
）をゆっくりと加えた。全アルミニウム塩が溶解するまで１Ｍ ＨＣｌ溶液で酸
性化した後、水相を酢酸エチル（６×２０ｍｌ）で抽出した。有機層をあわせて
飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去後、塩化メ
チレン（２０ｍｌ）に溶かした粗ジオール（１７７ｍｇ）を触媒量のジメチルア
ミノピリジン（１２ｍｇ）の存在下に無水酢酸／トリエチルアミン混合物（２：
３，ｖ／ｖ，１ｍｌ）で１５分間直接アセチル化した。溶媒と過剰の反応体を減
圧蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌら，１９７８
）（ヘキサン／酢酸エチル，４：１，ｖ／ｖ）により純二酢酸塩（３３０ｍｇ，
８６％）を得た。キラルオスミル化試薬ＡＤ−ｍｉｘ−ｂ（２．５ｇ）とＣＨ３ ＳＯ２ＮＨ２（１５２ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）の存在下に第３ブタノール／水（
１：１，ｖ／ｖ，６ｍｌ）中で０℃で撹拌することにより、二酢酸塩（３００ｍ
ｇ，１．６ｍｍｏｌ）のエナンチオ選択的ジヒドロキシル化を実施した。２４時
間後に固体Ｎａ２ＳＯ３を加えて反応を停止し、更に３０分間撹拌した。酢酸エ
チル（６×２０ｍｌ）抽出とフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル）を繰
返し、（分子内部分エステル交換の結果として）二酢酸２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リトリトールのみを含む混合物を得た（３１２ｍｇ，８８％収率）。メタノール
（３０ｍｌ）中で塩基性Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６（ＯＨ−型）（１ｍｍｏ
ｌ当たり１５０ｍｇ）の存在下に室温で定量的脱アセチル化を一晩実施した（Ｒ
ｅｅｄら，１９８１）。樹脂を濾過し、溶媒を蒸発すると、純２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトリトールが直接得られた（１９０ｍｇ，７５％総収率）。
６９−４７２２とＤｕｖｏｌｄら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔ ３８：６１８１−６１８４をより大量の生産に合うように改変し、約８０％
ｅ．ｅ．の２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールを合成した。３−メチル−２（
５Ｈ）−フラノン（２００ｍｇ，２ｍｍｏｌ）の無水エーテル（２０ｍｌ）溶液
を０℃で１５分間かけてアルゴン下にＬｉＡｌＨ４（４６ｍｇ，１．２ｍｍｏｌ
）の無水エーテル（２０ｍｌ）撹拌溶液に加えた。反応混合物を０℃で更に２時
間撹拌した。過剰のＬｉＡｌＨ４が消失するまでＮＨ４Ｃｌの飽和溶液（２ｍｌ
）をゆっくりと加えた。全アルミニウム塩が溶解するまで１Ｍ ＨＣｌ溶液で酸
性化した後、水相を酢酸エチル（６×２０ｍｌ）で抽出した。有機層をあわせて
飽和食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧除去後、塩化メ
チレン（２０ｍｌ）に溶かした粗ジオール（１７７ｍｇ）を触媒量のジメチルア
ミノピリジン（１２ｍｇ）の存在下に無水酢酸／トリエチルアミン混合物（２：
３，ｖ／ｖ，１ｍｌ）で１５分間直接アセチル化した。溶媒と過剰の反応体を減
圧蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（Ｓｔｉｌｌら，１９７８
）（ヘキサン／酢酸エチル，４：１，ｖ／ｖ）により純二酢酸塩（３３０ｍｇ，
８６％）を得た。キラルオスミル化試薬ＡＤ−ｍｉｘ−ｂ（２．５ｇ）とＣＨ３ ＳＯ２ＮＨ２（１５２ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）の存在下に第３ブタノール／水（
１：１，ｖ／ｖ，６ｍｌ）中で０℃で撹拌することにより、二酢酸塩（３００ｍ
ｇ，１．６ｍｍｏｌ）のエナンチオ選択的ジヒドロキシル化を実施した。２４時
間後に固体Ｎａ２ＳＯ３を加えて反応を停止し、更に３０分間撹拌した。酢酸エ
チル（６×２０ｍｌ）抽出とフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル）を繰
返し、（分子内部分エステル交換の結果として）二酢酸２−Ｃ−メチル−Ｄ−エ
リトリトールのみを含む混合物を得た（３１２ｍｇ，８８％収率）。メタノール
（３０ｍｌ）中で塩基性Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ Ａ−２６（ＯＨ−型）（１ｍｍｏ
ｌ当たり１５０ｍｇ）の存在下に室温で定量的脱アセチル化を一晩実施した（Ｒ
ｅｅｄら，１９８１）。樹脂を濾過し、溶媒を蒸発すると、純２−Ｃ−メチル−
Ｄ−エリトリトールが直接得られた（１９０ｍｇ，７５％総収率）。
【００８１】 実施例２：大腸菌のｄｘｒ遺伝子の部位特異的マーカー挿入突然変異誘発 野生型大腸菌株Ｗ３１１０（Ｋｏｈａｒａら，１９８７）から単離したゲノム
ＤＮＡとプライマーＰ１（５’−ＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴ ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣ
ＡＡＣＴＣ−３’（配列番号３）；下線ＡＴＧはｄｘｒ遺伝子の翻訳開始コドン
に対応する）及びＰ２（５’−ＣＣＧＣＡＴＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＣ−３’
（配列番号４）；ｙａｅＳ遺伝子の３’フランキング領域に配置）を使用するＰ
ＣＲによりｄｘｒ遺伝子の５’領域からｙａｅＳ遺伝子の３’フランキング領域
までの領域を増幅した。ＰＣＲに用いた反応混合物はＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）
、０．５μＭ各プライマー、２００μＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸、ｐＨ
８．８に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び０．１
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む最終容量５０μｌで調製した。サンプルを
鉱油で覆い、９４℃で３分間インキュベートし、８０℃まで冷却した。Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加え、４５秒間
９４℃、４５秒間５９℃及び１０分間７２℃からなる３０サイクルと１０分間７
２℃の最終段階で反応混合物をインキュベートした。増幅後、製造業者のプロト
コールに従ってアデニンをＰＣＲ産物の３’末端に加え、アデニル化産物をｐＧ
ＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、プラスミドｐＭＪ１を
得た。プラスミドｐＣＡＴ１９（Ｆｕｑｕａ，１９９２）に存在するＣＡＴ（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子をＰｓｔＩとＸｂａＩ
で消化して切出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、（Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理後に）平滑末端ライゲーションによりｄｘｒ遺伝子に存在する単一Ａ
ｓｕＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＭＪ２を得た。制限酵素マッピン
グを使用し、ＣＡＴ遺伝子がｄｘｒ遺伝子と同一方向を向いたクローンを同定し
た。プラスミドｐＭＪ２から切出したＳｐｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントをプラス
ミドｐＢＲ３２２のＮｈｅＩ−ＳｐｈＩ部位にサブクローニングすることにより
プラスミドｐＭＪ３を構築した。プラスミドｐＭＪ３をＰｓｔＩで消化して直鎖
化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共にインキュベー
トし、アガロースゲル電気泳動により精製した。精製直鎖プラスミドｐＭＪ３
ＤＮＡ２μｇを使用して大腸菌株ＪＣ７６２３（Ｗｉｎａｎｓら，１９８５）を
形質転換した。２ｍＭ ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＭＥ）とクロラ
ムフェニコール（１７μｇ／ｍＬ）を加えたＬＢプレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，
１９８７）に形質転換細胞をプレーティングした。クロラムフェニコール耐性と
ＭＥ栄養要求性の両方を示すコロニーをその後の試験のために選択した。プライ
マーＰ３（５’−ＧＣＡＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号
５）；ｆｒｒ遺伝子の５’領域に配置）及びＰ２を使用するＰＣＲによりｄｘｒ
遺伝子へのＣＡＴ遺伝子挿入の存在を確認した。これらのコロニーの１個をＪＣ
７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株と命名し、相補試験に使用した。
ＤＮＡとプライマーＰ１（５’−ＣＴＣＴＧＧＡＴＧＴ ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣ
ＡＡＣＴＣ−３’（配列番号３）；下線ＡＴＧはｄｘｒ遺伝子の翻訳開始コドン
に対応する）及びＰ２（５’−ＣＣＧＣＡＴＡＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＣ−３’
（配列番号４）；ｙａｅＳ遺伝子の３’フランキング領域に配置）を使用するＰ
ＣＲによりｄｘｒ遺伝子の５’領域からｙａｅＳ遺伝子の３’フランキング領域
までの領域を増幅した。ＰＣＲに用いた反応混合物はＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）
、０．５μＭ各プライマー、２００μＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸、ｐＨ
８．８に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び０．１
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む最終容量５０μｌで調製した。サンプルを
鉱油で覆い、９４℃で３分間インキュベートし、８０℃まで冷却した。Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加え、４５秒間
９４℃、４５秒間５９℃及び１０分間７２℃からなる３０サイクルと１０分間７
２℃の最終段階で反応混合物をインキュベートした。増幅後、製造業者のプロト
コールに従ってアデニンをＰＣＲ産物の３’末端に加え、アデニル化産物をｐＧ
ＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、プラスミドｐＭＪ１を
得た。プラスミドｐＣＡＴ１９（Ｆｕｑｕａ，１９９２）に存在するＣＡＴ（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子をＰｓｔＩとＸｂａＩ
で消化して切出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、（Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理後に）平滑末端ライゲーションによりｄｘｒ遺伝子に存在する単一Ａ
ｓｕＩＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＭＪ２を得た。制限酵素マッピン
グを使用し、ＣＡＴ遺伝子がｄｘｒ遺伝子と同一方向を向いたクローンを同定し
た。プラスミドｐＭＪ２から切出したＳｐｅＩ−ＳｐｈＩフラグメントをプラス
ミドｐＢＲ３２２のＮｈｅＩ−ＳｐｈＩ部位にサブクローニングすることにより
プラスミドｐＭＪ３を構築した。プラスミドｐＭＪ３をＰｓｔＩで消化して直鎖
化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共にインキュベー
トし、アガロースゲル電気泳動により精製した。精製直鎖プラスミドｐＭＪ３
ＤＮＡ２μｇを使用して大腸菌株ＪＣ７６２３（Ｗｉｎａｎｓら，１９８５）を
形質転換した。２ｍＭ ２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＭＥ）とクロラ
ムフェニコール（１７μｇ／ｍＬ）を加えたＬＢプレート（Ａｕｓｕｂｅｌら，
１９８７）に形質転換細胞をプレーティングした。クロラムフェニコール耐性と
ＭＥ栄養要求性の両方を示すコロニーをその後の試験のために選択した。プライ
マーＰ３（５’−ＧＣＡＣＡＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＧＴＧ−３’（配列番号
５）；ｆｒｒ遺伝子の５’領域に配置）及びＰ２を使用するＰＣＲによりｄｘｒ
遺伝子へのＣＡＴ遺伝子挿入の存在を確認した。これらのコロニーの１個をＪＣ
７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株と命名し、相補試験に使用した。
【００８２】 実施例３：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ） １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）
の相同体をコードする推定植物核酸配列を同定するために、大腸菌から最近クロ
ーニングされたＤＸＲの完全アミノ酸配列（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９８）
を照会として使用してＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の非冗長データベースを
ＴＢＬＡＳＴＮプログラムで検索した。この照会とＡ．ｔｈａｌｉａｎａゲノム
クローンＭＱＢ２（受託番号ＡＢＯＯ９０５３）の７個の予想エキソンによりコ
ードされるアミノ酸配列の間に顕著な相同度（４０〜６４％）が判明した。
の相同体をコードする推定植物核酸配列を同定するために、大腸菌から最近クロ
ーニングされたＤＸＲの完全アミノ酸配列（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９８）
を照会として使用してＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の非冗長データベースを
ＴＢＬＡＳＴＮプログラムで検索した。この照会とＡ．ｔｈａｌｉａｎａゲノム
クローンＭＱＢ２（受託番号ＡＢＯＯ９０５３）の７個の予想エキソンによりコ
ードされるアミノ酸配列の間に顕著な相同度（４０〜６４％）が判明した。
【００８３】 推定Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲ遺伝子に対応するｍＲＮＡ配列の存在を確
認するために、ヌクレオチド２９２４７〜３１３１７のクローンＭＯＢ２のヌク
レオチド配列を照会として使用してＢＬＡＳＴＮプログラムでＮＣＢＩのＥＳＴ
データベース（ｄｂＥＳＴ）を検索した。照会の種々の領域と同一のヌクレオチ
ド配列を含む２個のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＳＴクローン（１２ＯＥ８Ｔ７と
６５Ｆ１１ＸＰ３’、夫々受託番号Ｔ４３９４９及びＡＡ５８６０８７）が見出
された。ｃＤＮＡインサートを配列決定した処、２個のクローンはオーバーラッ
プしていることが判明した。最長ｃＤＮＡは大腸菌ＤＸＲのＣ末端領域と４１．
６％の相同度（類似度５３．２％）を示す３２９残基のポリペプチドをコードす
るオープンリーディングフレームを含んでおり、２個のｃＤＮＡは推定Ａ．ｔｈ
ａｌｉａｎａ酵素の切断形をコードすると予想された。
認するために、ヌクレオチド２９２４７〜３１３１７のクローンＭＯＢ２のヌク
レオチド配列を照会として使用してＢＬＡＳＴＮプログラムでＮＣＢＩのＥＳＴ
データベース（ｄｂＥＳＴ）を検索した。照会の種々の領域と同一のヌクレオチ
ド配列を含む２個のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＥＳＴクローン（１２ＯＥ８Ｔ７と
６５Ｆ１１ＸＰ３’、夫々受託番号Ｔ４３９４９及びＡＡ５８６０８７）が見出
された。ｃＤＮＡインサートを配列決定した処、２個のクローンはオーバーラッ
プしていることが判明した。最長ｃＤＮＡは大腸菌ＤＸＲのＣ末端領域と４１．
６％の相同度（類似度５３．２％）を示す３２９残基のポリペプチドをコードす
るオープンリーディングフレームを含んでおり、２個のｃＤＮＡは推定Ａ．ｔｈ
ａｌｉａｎａ酵素の切断形をコードすると予想された。
【００８４】 １２日齢光成長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉ
ａ品種）苗からの全ＲＮＡを文献に記載されているように精製した（Ｄｅａｎら
，１９８５）。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製品
５’−ＲＡＣＥ−Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を製造業者の指示に
従って使用してｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施した。鋳型としてＲＮ
Ａサンプル１μｇと、特異的下流プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＸＲ−
ＧＳＰ１（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋７６７〜＋７８６に相補的な
５’−ＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧ−３’（配列番号６））を使
用してｃＤＮＡの第１鎖を合成した。ｃＤＮＡの精製とホモポリマーテーリング
後にネスティドＰＣＲ反応を２回実施した。第１回目のＰＣＲでは特異的下流プ
ライマーはオリゴヌクレオチドＤＸＲ−ＧＳＰ２（配列番号１に示す配列のヌク
レオチド＋５３０〜＋５５０に相補的な５’−ＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＣＧ
ＡＴＡＧＡＧ−３’（配列番号７））を使用し、上流プライマーはオリゴヌクレ
オチド５’−ＲＡＣＥ−ＡＡＰ（キットに含む）を使用した。第２回目のＰＣＲ
では特異的下流プライマーはオリゴヌクレオチドＤＸＲ−ＧＳＰ３（配列番号１
に示す配列のヌクレオチド＋４５６〜＋４７５に相補的な５’−ＧＧＣＣＡＴＧ
ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧ−３’（配列番号８））を使用し、上流プライマー
はオリゴヌクレオチドＡＵＡＰ（キットに含む）を使用した。どちらのＰＣＲ反
応もサンプルを変性させ（９４℃で３分間）、８０℃まで冷却し、Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼを加えることにより増幅プロセスを開始した。第１回目のＰＣＲ
の反応混合物は３０秒間９４℃、３０秒間５５℃及び１分間２７℃からなる１５
サイクルと５分間７２℃の最終段階でインキュベートした。得られたサンプルを
第２回目のＰＣＲの反応混合物で１０倍に希釈し、３０秒間９４℃、３０秒間６
１℃及び１分間７２℃からなる３０サイクルと５分間７２℃の最終段階でインキ
ュベートした。最終増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミ
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングし、配列決定した（配列番号
１）。
ａ品種）苗からの全ＲＮＡを文献に記載されているように精製した（Ｄｅａｎら
，１９８５）。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製品
５’−ＲＡＣＥ−Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を製造業者の指示に
従って使用してｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）を実施した。鋳型としてＲＮ
Ａサンプル１μｇと、特異的下流プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＸＲ−
ＧＳＰ１（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋７６７〜＋７８６に相補的な
５’−ＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧ−３’（配列番号６））を使
用してｃＤＮＡの第１鎖を合成した。ｃＤＮＡの精製とホモポリマーテーリング
後にネスティドＰＣＲ反応を２回実施した。第１回目のＰＣＲでは特異的下流プ
ライマーはオリゴヌクレオチドＤＸＲ−ＧＳＰ２（配列番号１に示す配列のヌク
レオチド＋５３０〜＋５５０に相補的な５’−ＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＣＧ
ＡＴＡＧＡＧ−３’（配列番号７））を使用し、上流プライマーはオリゴヌクレ
オチド５’−ＲＡＣＥ−ＡＡＰ（キットに含む）を使用した。第２回目のＰＣＲ
では特異的下流プライマーはオリゴヌクレオチドＤＸＲ−ＧＳＰ３（配列番号１
に示す配列のヌクレオチド＋４５６〜＋４７５に相補的な５’−ＧＧＣＣＡＴＧ
ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧ−３’（配列番号８））を使用し、上流プライマー
はオリゴヌクレオチドＡＵＡＰ（キットに含む）を使用した。どちらのＰＣＲ反
応もサンプルを変性させ（９４℃で３分間）、８０℃まで冷却し、Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼを加えることにより増幅プロセスを開始した。第１回目のＰＣＲ
の反応混合物は３０秒間９４℃、３０秒間５５℃及び１分間２７℃からなる１５
サイクルと５分間７２℃の最終段階でインキュベートした。得られたサンプルを
第２回目のＰＣＲの反応混合物で１０倍に希釈し、３０秒間９４℃、３０秒間６
１℃及び１分間７２℃からなる３０サイクルと５分間７２℃の最終段階でインキ
ュベートした。最終増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミ
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングし、配列決定した（配列番号
１）。
【００８５】 実施例４：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａから１−デオキシ−Ｄ
−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼｃＤＮＡのクローニング 推定ＤＸＲ遺伝子の５’領域を決定するために、ＲＡＣＥ法を使用することに
より対応する転写開始部位をマッピングした。大腸菌からのＤＸＲとＡ．ｔｈａ
ｌｉａｎａゲノムクローンから推定されるアミノ酸配列のアラインメントに基づ
いてプライマーを設計した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｄｘｒ核酸配列（配列番
号１）から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。鋳型としてＡ．ｔｈａ
ｌｉａｎａ苗からのＲＮＡを使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＸ
Ｒ−ＧＳＰ１を使用してｃＤＮＡの第１鎖を合成した。このオリゴヌクレオチド
は配列番号１に示すゲノム配列の＋７６７〜＋７８６位の領域に相補的であった
。次いで入れ子ＰＣＲ反応を２回実施してｍＲＮＡの５’末端を増幅した。第１
回目と第２回目の入れ子ＰＣＲに使用した下流特異的プライマーは夫々＋５３０
〜＋５５０位（プライマーＤＸＲ−ＧＳＰ２）と＋４５６〜＋４７５位（プライ
マーＤＸＲ−ＧＳＰ３）の領域に相補的であった。主要増幅産物に対応する４個
のクローンを配列決定した処、配列番号１に示すゲノム配列の＋１位のアデニン
に対応する同一５’末端をもつことが判明した。
−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼｃＤＮＡのクローニング 推定ＤＸＲ遺伝子の５’領域を決定するために、ＲＡＣＥ法を使用することに
より対応する転写開始部位をマッピングした。大腸菌からのＤＸＲとＡ．ｔｈａ
ｌｉａｎａゲノムクローンから推定されるアミノ酸配列のアラインメントに基づ
いてプライマーを設計した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｄｘｒ核酸配列（配列番
号１）から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。鋳型としてＡ．ｔｈａ
ｌｉａｎａ苗からのＲＮＡを使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＤＸ
Ｒ−ＧＳＰ１を使用してｃＤＮＡの第１鎖を合成した。このオリゴヌクレオチド
は配列番号１に示すゲノム配列の＋７６７〜＋７８６位の領域に相補的であった
。次いで入れ子ＰＣＲ反応を２回実施してｍＲＮＡの５’末端を増幅した。第１
回目と第２回目の入れ子ＰＣＲに使用した下流特異的プライマーは夫々＋５３０
〜＋５５０位（プライマーＤＸＲ−ＧＳＰ２）と＋４５６〜＋４７５位（プライ
マーＤＸＲ−ＧＳＰ３）の領域に相補的であった。主要増幅産物に対応する４個
のクローンを配列決定した処、配列番号１に示すゲノム配列の＋１位のアデニン
に対応する同一５’末端をもつことが判明した。
【００８６】 Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ品種）細胞懸濁系Ｙ８７からのｃＤ
ＮＡライブラリーから２回連続ＰＣＲ反応によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＤＸ
Ｒの完全コーディング配列を含むｃＤＮＡを増幅した。ライブラリーのアリコー
トをエタノール沈殿させ、水に再懸濁した。最初のＰＣＲに使用した反応混合物
はＤＮＡ鋳型（ｃＤＮＡライブラリー４×１０５ｐｆｕに等価）と、０．５μＭ
上流プライマーＤＸＲ−３４（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋３４〜＋
５８に対応する５’−ＣＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧ−
３’（配列番号９））と、０．５μＭ下流プライマーＤＸＲ−Ｅ２（配列番号１
に示す配列のヌクレオチド＋３１４６〜＋３１６９に相補的な５’−ＣＡＧＴＴ
ＴＧＧＣＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１０））と、２００
μＭ各デオキシヌクレオチド、ｐＨ８．８に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０
．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む最終容
量２５μｌで調製した。サンプルを鉱油で覆い、９４℃で３分間インキュベート
し、８０℃まで冷却した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位，Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）を加え、３０秒間９４℃、４０秒間５５℃及び６．５分間７２
℃からなる３５サイクルと１５分間７２℃の最終段階で反応混合物をインキュベ
ートした。反応混合物を水で１０倍に希釈し、５μｌを第２回目のＰＣＲの鋳型
として使用し、反応混合物の容量を５０μｌに増加してサイクル数を１５に減ら
した以外は第１回目の増幅について記載したと同一条件を使用して第２回目のＰ
ＣＲを実施した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした。得られたプラスミドをｐ
ＤＸＲ−Ａｔと命名した。
ＮＡライブラリーから２回連続ＰＣＲ反応によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＤＸ
Ｒの完全コーディング配列を含むｃＤＮＡを増幅した。ライブラリーのアリコー
トをエタノール沈殿させ、水に再懸濁した。最初のＰＣＲに使用した反応混合物
はＤＮＡ鋳型（ｃＤＮＡライブラリー４×１０５ｐｆｕに等価）と、０．５μＭ
上流プライマーＤＸＲ−３４（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋３４〜＋
５８に対応する５’−ＣＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧ−
３’（配列番号９））と、０．５μＭ下流プライマーＤＸＲ−Ｅ２（配列番号１
に示す配列のヌクレオチド＋３１４６〜＋３１６９に相補的な５’−ＣＡＧＴＴ
ＴＧＧＣＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＡＣＡＧ−３’（配列番号１０））と、２００
μＭ各デオキシヌクレオチド、ｐＨ８．８に調節した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０
．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む最終容
量２５μｌで調製した。サンプルを鉱油で覆い、９４℃で３分間インキュベート
し、８０℃まで冷却した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（１．２５単位，Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）を加え、３０秒間９４℃、４０秒間５５℃及び６．５分間７２
℃からなる３５サイクルと１５分間７２℃の最終段階で反応混合物をインキュベ
ートした。反応混合物を水で１０倍に希釈し、５μｌを第２回目のＰＣＲの鋳型
として使用し、反応混合物の容量を５０μｌに増加してサイクル数を１５に減ら
した以外は第１回目の増幅について記載したと同一条件を使用して第２回目のＰ
ＣＲを実施した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、プラスミド
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋にクローニングした。得られたプラスミドをｐ
ＤＸＲ−Ａｔと命名した。
【００８７】 こうして、ゲノム配列の夫々＋３４〜＋５８位と＋３１４６〜＋３１６９位の
領域に対応するプライマーＤＸＲ−３４及びＤＸＲ−Ｅ２を使用してｃＤＮＡラ
イブラリーからＰＣＲにより完全Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲをコードするｃ
ＤＮＡクローンを得た。増幅したｃＤＮＡの同一性をＤＮＡ配列決定により確認
した。ｃＤＮＡ配列とゲノム配列のアラインメントの結果、Ａ．ｔｈａｌｉａｎ
ａ ＤＸＲ遺伝子は３．２Ｋｂ領域にわたって１２エキソンと１１イントロンを
含むことが判明した（配列番号１）。
領域に対応するプライマーＤＸＲ−３４及びＤＸＲ−Ｅ２を使用してｃＤＮＡラ
イブラリーからＰＣＲにより完全Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲをコードするｃ
ＤＮＡクローンを得た。増幅したｃＤＮＡの同一性をＤＮＡ配列決定により確認
した。ｃＤＮＡ配列とゲノム配列のアラインメントの結果、Ａ．ｔｈａｌｉａｎ
ａ ＤＸＲ遺伝子は３．２Ｋｂ領域にわたって１２エキソンと１１イントロンを
含むことが判明した（配列番号１）。
【００８８】 クローン化ｃＤＮＡは予想分子量５２ｋＤａの４７７アミノ酸残基のタンパク
質をコードする。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａと大腸菌ＤＸＲのアラインメント（図１
）の結果、この植物酵素はプラスミドトランジットペプチドの典型的特徴をもつ
７９残基のＮ末端伸長部をもつことが判明した（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら，１９
８９）。２種のタンパク質は４２．７％の相同度（類似度５４．３％）を示す。
質をコードする。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａと大腸菌ＤＸＲのアラインメント（図１
）の結果、この植物酵素はプラスミドトランジットペプチドの典型的特徴をもつ
７９残基のＮ末端伸長部をもつことが判明した（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅら，１９
８９）。２種のタンパク質は４２．７％の相同度（類似度５４．３％）を示す。
【００８９】 実施例５：発現構築物作製 Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲを大腸菌で発現させるために、アミノ酸残基８
１〜４７７をコードするＤＸＲ ｃＤＮＡの領域をプラスミドｐＤＸＲ−Ａｔか
らＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＢＡＤ−ＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
の改変形にクローニングした。アラビノースで誘導でき、グルコースで抑制でき
るＰＢＡＤプロモーターによりこのプラスミドで発現させた。まず、Ｋｕｎｋｅ
ｌら（Ｋｕｎｋｅｌら，１９８７）の方法に従って部位特異的突然変異誘発によ
りｐＢＲ３２２ｏｒｉとａｒａＣコーディング領域（４９２６〜４９３１位）の
間に配置されたＮｄｅＩ部位を除去することによりプラスミドｐＢＡＤ−ＧＦＰ
ｕｖを改変した。オリゴヌクレオチドｐＢＡＤ−ｍｕｔ１（５’−ＣＴＧＡＧＡ
ＧＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号１１
））を突然変異誘発プライマーとして使用した。得られたプラスミドをｐＢＡＤ
−Ｍｉと命名した。次に、プラスミドｐＤＸＲ−Ａｔを鋳型として使用し、オリ
ゴヌクレオチド５’−ＭＶＫＰＩ（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋５２
２〜＋５４４に相補的な５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣ
ＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）；下線配列はＮｄｅＩ部位を
含む）及びＤＸＲ−ＥＮＤ（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋２９９７〜
＋３０１８に相補的な５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧ
ＧＣＣＴＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１３）；下線配列はＥｃｏＲＩ部位を含
む）を突然変異誘発プライマーとして使用してＰＣＲによりＡ．ｔｈａｌｉａｎ
ａ ＤＸＲ ｃＤＮＡの適当な位置にＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を導入し
た。ＰＣＲ増幅産物をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、同一制限酵素で消化して
おいたプラスミドｐＢＡＤ−Ｍ１にクローニングした。こうしてプラスミドｐＢ
ＡＤ−Ｍ１のＧＦＰｕｖコーディング領域をＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの対
応するコーディング配列で置換した。得られたプラスミドをｐＧＡＤ−ＤＸＲと
命名し、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に導入した。ＧＦＰｕｖをコードするプラスミドｐ
ＢＡＤ−Ｍ１を相補試験で対照として使用した。
１〜４７７をコードするＤＸＲ ｃＤＮＡの領域をプラスミドｐＤＸＲ−Ａｔか
らＰＣＲにより増幅し、プラスミドｐＢＡＤ−ＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
の改変形にクローニングした。アラビノースで誘導でき、グルコースで抑制でき
るＰＢＡＤプロモーターによりこのプラスミドで発現させた。まず、Ｋｕｎｋｅ
ｌら（Ｋｕｎｋｅｌら，１９８７）の方法に従って部位特異的突然変異誘発によ
りｐＢＲ３２２ｏｒｉとａｒａＣコーディング領域（４９２６〜４９３１位）の
間に配置されたＮｄｅＩ部位を除去することによりプラスミドｐＢＡＤ−ＧＦＰ
ｕｖを改変した。オリゴヌクレオチドｐＢＡＤ−ｍｕｔ１（５’−ＣＴＧＡＧＡ
ＧＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号１１
））を突然変異誘発プライマーとして使用した。得られたプラスミドをｐＢＡＤ
−Ｍｉと命名した。次に、プラスミドｐＤＸＲ−Ａｔを鋳型として使用し、オリ
ゴヌクレオチド５’−ＭＶＫＰＩ（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋５２
２〜＋５４４に相補的な５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＴＣＴＣ
ＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣ−３’（配列番号１２）；下線配列はＮｄｅＩ部位を
含む）及びＤＸＲ−ＥＮＤ（配列番号１に示す配列のヌクレオチド＋２９９７〜
＋３０１８に相補的な５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧ
ＧＣＣＴＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１３）；下線配列はＥｃｏＲＩ部位を含
む）を突然変異誘発プライマーとして使用してＰＣＲによりＡ．ｔｈａｌｉａｎ
ａ ＤＸＲ ｃＤＮＡの適当な位置にＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を導入し
た。ＰＣＲ増幅産物をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、同一制限酵素で消化して
おいたプラスミドｐＢＡＤ−Ｍ１にクローニングした。こうしてプラスミドｐＢ
ＡＤ−Ｍ１のＧＦＰｕｖコーディング領域をＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの対
応するコーディング配列で置換した。得られたプラスミドをｐＧＡＤ−ＤＸＲと
命名し、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株に導入した。ＧＦＰｕｖをコードするプラスミドｐ
ＢＡＤ−Ｍ１を相補試験で対照として使用した。
【００９０】 実施例６：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｄｘｒの分析 ｄｘｒ遺伝子に破壊をもつ大腸菌株（ＪＣ７６２３ｄｘｒ．：ＣＡＴ株）（実
施例２参照）の相補分析によりクローン化Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの機能
を確認した。この株は増殖に２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＭＥ）を必
要とする。相補試験には推定プラスチドトランジットペプチドを含まない配列番
号２のアミノ酸８１〜４７７のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの領域を使用した
。ＰＢＡＤプロモーターの制御下に適当なｃＤＮＡフラグメントをプラスミドｐ
ＢＡＤ−ＧＦＰｕｖの誘導体にクローニングし、得られたプラスミド（ｐＢＡＤ
−ＤＸＲ）をＪＣ７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株に導入した。ＰＢＡＤプロモーター
からの発現はアラビノースにより誘導可能であり、グルコースにより抑制される
。アラビノースで誘導すると、ＭＥの不在下でプラスミドＰＢＡＤ−ＤＸＲを含
むＪＣ７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株を増殖させることができるが、グルコースの存
在下では増殖は認められなかった。対照プラスミドｐＢＡＤ−Ｍ１をもつＪＣ７
６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株はＭＥを含まない培地でアラビノースの存在下に増殖し
ない。プラスミドＰＢＡＤ−ＤＸＲ又はｐＢＡＤ−ＧＦＰｕｖをもつＪＣ７６２
３ｄｘｒ：ＣＡＴ株はＭＥを含む培地で増殖する。これらの結果からクローン化
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡは機能的ＤＸＲをコードすることが明白である
。
施例２参照）の相補分析によりクローン化Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの機能
を確認した。この株は増殖に２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール（ＭＥ）を必
要とする。相補試験には推定プラスチドトランジットペプチドを含まない配列番
号２のアミノ酸８１〜４７７のＡ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＸＲの領域を使用した
。ＰＢＡＤプロモーターの制御下に適当なｃＤＮＡフラグメントをプラスミドｐ
ＢＡＤ−ＧＦＰｕｖの誘導体にクローニングし、得られたプラスミド（ｐＢＡＤ
−ＤＸＲ）をＪＣ７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株に導入した。ＰＢＡＤプロモーター
からの発現はアラビノースにより誘導可能であり、グルコースにより抑制される
。アラビノースで誘導すると、ＭＥの不在下でプラスミドＰＢＡＤ−ＤＸＲを含
むＪＣ７６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株を増殖させることができるが、グルコースの存
在下では増殖は認められなかった。対照プラスミドｐＢＡＤ−Ｍ１をもつＪＣ７
６２３ｄｘｒ：ＣＡＴ株はＭＥを含まない培地でアラビノースの存在下に増殖し
ない。プラスミドＰＢＡＤ−ＤＸＲ又はｐＢＡＤ−ＧＦＰｕｖをもつＪＣ７６２
３ｄｘｒ：ＣＡＴ株はＭＥを含む培地で増殖する。これらの結果からクローン化
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ｃＤＮＡは機能的ＤＸＲをコードすることが明白である
。
【００９１】 本明細書に引用した全刊行物及び特許出願は本発明が属する分野の当業者の技
術標準を示す。全刊行物及び特許出願は各刊行物又は特許出願が参考資料として
組込まれていると個々に思われるような程度まで参考資料として本明細書に組込
まれる。 以上、分かり易くする目的で図面と実施例により本発明を詳細に説明したが、当
然のことながら、請求の範囲内で所定の変更及び改変を加えることができる。
術標準を示す。全刊行物及び特許出願は各刊行物又は特許出願が参考資料として
組込まれていると個々に思われるような程度まで参考資料として本明細書に組込
まれる。 以上、分かり易くする目的で図面と実施例により本発明を詳細に説明したが、当
然のことながら、請求の範囲内で所定の変更及び改変を加えることができる。
【図１】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｄｘｒ配列と大腸菌ｄｘｒ配列のアミノ酸アライン
メントを示す。
メントを示す。
【図２】 イソプレノイド経路をメバロン酸経路と非メバロン酸経路の両者で示した模式
図である。
図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１０月１７日（２００１．１０．１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＬ，ＡＭ，Ａ Ｔ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，Ｉ Ｄ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 カンポス，ナルシスコ スペイン国、08028・バルセロナ、マルテ イ・イ・フランケス・プリメーロ Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA01 AA03 AA05 AA08 BA07 CA04 DA01 FA02 GA11 4B050 CC03 DD13 EE10 LL05 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA02 CA27 CA41 CA44 CA53
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 真核源からの１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レ
ダクトイソメラーゼをコードする単離核酸配列。 【請求項２】 前記核酸配列を植物源から単離する請求項１に記載の単離核
酸配列。 【請求項３】 前記核酸配列をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離する請求項
２に記載の単離核酸配列。 【請求項４】 ａ）配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含む単離ポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号１を含む単離ポリヌクレオチド、 ｃ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも７０％の相同度をも
つヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、 ｄ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも８０％の相同度をも
つヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、 ｅ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも９０％の相同度をも
つヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、 ｆ）配列番号１の全長にわたって配列番号１と少なくとも９５％の相同度をも
つヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、 ｇ）ストリンジェント条件下で配列番号１とハイブリダイズする単離ポリヌク
レオチド又はそのフラグメント、及び ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のポリヌク
レオチド配列に相補的な単離ポリヌクレオチドから構成される群から選択される
単離ポリヌクレオチド。 【請求項５】 ５’→３’転写方向に作動的に結合した成分として、植物細
胞で機能的なプロモーターと、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダ
クトイソメラーゼをコードする核酸配列と、転写終結配列を含むＤＮＡ構築物。 【請求項６】 前記核酸配列を真核源から単離する請求項５に記載のＤＮＡ
構築物。 【請求項７】 前記核酸配列を植物源から単離する請求項５に記載のＤＮＡ
構築物。 【請求項８】 前記核酸配列をＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離する請求項
５に記載のＤＮＡ構築物。 【請求項９】 請求項５に記載の構築物を含む宿主細胞。 【請求項１０】 宿主細胞が植物細胞である請求項９に記載の宿主細胞。 【請求項１１】 請求項１０に記載の細胞を含む植物。 【請求項１２】 植物中のイソプレノイド含量を変化させるための方法であ
って、作動的に連結した成分として、植物で機能的な転写開始領域と、１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードする核酸配列
と、転写終結領域を含む構築物で前記宿主植物を形質転換することを特徴とする
前記方法。 【請求項１３】 前記核酸配列がセンス方向である請求項１２に記載の方法
。 【請求項１４】 イソプレノイド含量を増加する請求項１３に記載の方法。 【請求項１５】 前記核酸配列がアンチセンス方向である請求項１２に記載
の方法。 【請求項１６】 イソプレノイド含量を低減する請求項１５に記載の方法。 【請求項１７】 植物細胞で着目イソプレノイド化合物を生産するための方
法であって、植物細胞で機能的な転写開始領域に作動的に連結した１−デオキシ
−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼをコードするＤＮＡ配列を
含む一次構築物と、植物細胞で機能的な転写開始領域に作動的に連結した特定イ
ソプレノイドの生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む少なく
とも１種の二次構築物をそのゲノムにもち且つ発現する形質転換植物を得ること
を特徴とする前記方法。 【請求項１５】 前記タンパク質がトコフェロール、カロテノイド、モノテ
ルペン、ジテルペン及びプラストキノンから構成される群から選択されるイソプ
レノイドの生産に関与する請求項１７に記載の方法。 【請求項１６】 宿主植物からの細胞中の非メバロン酸イソプレノイド生合
成流量を増加するための方法であって、作動的に連結した成分として、植物で機
能的な転写開始領域と、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイ
ソメラーゼをコードするＤＮＡと、転写終結領域を含む構築物で前記宿主植物を
形質転換することを特徴とする前記方法。 【請求項１７】 植物の病害耐性を調節するための方法であって、１−デオ
キシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現を可能に
する構築物をそのゲノムに含む植物を培養することを特徴とする前記方法。
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