DE69827264T2

DE69827264T2 - Methode zur herstellung einer dürre-resistenten pflanze

Info

Publication number: DE69827264T2
Application number: DE69827264T
Authority: DE
Inventors: Peter Mccourt; Majid Ghassemian; Sean Cutler; Dario Bonetta
Original assignee: Performance Plants Inc
Current assignee: Performance Plants Inc
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2018-07-30
Also published as: DE69827264D1; EP1564296A1; ES2232000T3; CA2633155A1; CN102174560A; CA2298768C; ATE280832T1; CA2298768A1; BR9810973A; IL134267A; JP2001512027A; CN1314944A; EP1002116B1; EP1002116A2; NZ503146A; AU748407B2; ZA986872B; WO1999006580A3; CN102174560B; WO1999006580A2

Description

Die meisten höheren Pflanzen sind in irgendeinem Stadium ihres Lebenszyklus zumindest vorübergehenden Abnahmen am relativen Wassergehalt ausgesetzt und haben daher mehrere Mechanismen zum Schutz vor Austrocknung entwickelt. Wenn sich jedoch die Änderung im Wassermangel in die Länge zieht, können die Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und Entwicklung tief greifend sein. Ein aufgrund von Trockenheit, Kälte oder Salz Beanspruchung bzw. Stress abgenommener Wassergehalt schädigt die Pflanzenzellen irreparabel, was wiederum das Pflanzenwachstum und die Produktivität der Frucht bzw. Feldfrucht begrenzt.
Die Reaktion der Pflanzen auf widrige Bedingungen von Trockenheit, Salzgehalt und Kälte besteht in einer Vielzahl von morphologischen und physiologischen Änderungen. Obwohl unser Verständnis der pflanzlichen Toleranzmechanismen auf diese Beanspruchung bruchstückhaft ist, wurde vorgeschlagen, dass das Pflanzenhormon Abscisinsäure (ABA) ein essentieller Mediator zwischen umweltbedingtem Reiz und pflanzlichen Reaktionen ist. Als Reaktion auf Wassermangel erhöht sich das ABA Niveau und exogen angewandtes ABA ahmt viele der normalerweise durch Wasserbeanspruchung induzierten Reaktionen nach. Wenn einmal ABA synthetisiert wird, verursacht es das Verschließen der Blattstomata, wodurch der Wasserverlust aufgrund Transpiration abnimmt.
Die Bestimmung von Genen, die ABA in eine zelluläre Reaktion überführen, eröffnet die Möglichkeit diese Regulatoren zu erforschen, um die Toleranz gegenüber Austrocknung von Fruchtarten zu erhöhen. Im Grunde genommen können diese ABA Signalgene mit den geeigneten Steuerelementen gekoppelt werden, um ein bestmögliches Pflanzenwachstum und Entwicklung zu ermöglichen. Daher würden diese Gene nicht nur das genetische Maßschneidern von Früchten ermöglichen, um vorübergehenden umweltbedingten Einflüssen zu widerstehen, sie sollten ebenso die Umweltbereiche ausweiten in denen gewöhnliche Früchte angebaut werden können.
Darüber hinaus ist wenig von den genetischen Mechanismen bekannt, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung steuern. Gene, die weiterhin andere metabolische Vorgänge wie Alterung und Wachstumsgewohnheiten der Pflanzen beeinflussen, können bei einer großen Vielzahl von Früchten und gartenbaulichen Pflanzen von Nutzen sein.
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Trockenheitstoleranz von Pflanzen, wie es in den beigefügten Ansprüchen festgelegt ist. Weiterhin findet die vorliegende Erfindung Verwendung bei der Steuerung von regulatorischen Funktionen in photosynthetischen Organismen; beispielsweise bei der Steuerung von Wachtumsgewohnheiten, des Blühens, Samenerzeugung, Samenkeimung und Alterung in derartigen Organismen.
Diese Erfindung beruht auf einem Verfahren zur Erhöhung der Trockenheitstoleranz von Pflanzen durch Änderungen in isolierten oder rekombinanten Nukleinsäuren, die eine Farnesyltransferase (Ftase) Protein oder sein funktionelles Gegenstück kodieren.
Die Erfindung betrifft ebenso eine transgene Pflanze, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und einen transgenen Samen erhalten werden kann, der aus der transgenen Pflanze erhalten werden kann.
Die 1A–1C zeigen die Nukleinsäuresequenz des ERA1 Gens (SEQ ID NO: 1), in dem die Introns unterstrichen sind und sich das Startkodon (ATG) in den Nukleinsäure-Positionen 1–3 befindet.
Die 2 zeigt die Aminosäuresequenz des ERA1 Proteins (SEQ ID NO: 2).
Die 3A–3B zeigen die Nukleinsäuresequenz des ERA1 Promotors (SEQ ID NO: 3).
Die 4 zeigt die Aminosäuresequenz der β Untereinheit Farnesylierungsdomäne von Arabidopsis (Arab.) (SEQ ID NO: 2) mit der β Untereinheit Farnesylierungsdomänen der Erbse (SEQ ID NO: 4), Hefe (SEQ ID NO: 5) und Ratte (SEQ ID NO: 6) ausgerichtet (aligned). Reste, die zu der Arabidopsis Sequenz identisch sind, werden mit einem Punkt angezeigt. Ein Strich zeigt eine Lücke an. Die Aminosäurepositionen des Arabidopsis Gens werden auf der rechten Seite angezeigt.
Die 5 zeigt eine Photographie einer eral-transformierten Arabidopsispflanze (rechts) im Vergleich zu der Wildtyp (Kontrolle; d. h. natürlich vorkommenden) Pflanze (links) unter extrem trockenen Bedingungen.
Die 6 zeigt eine graphische Darstellung, die den Wassergehalt von Arabidopsispflanzen (rechts) mit inaktivierter oder mutierter Ftase Aktivität (M. Columbia, era 1–2) und Kontrollen (M. C. Kontrolle, era 1–2 Kontrolle) vergleicht.
Die 7 zeigt eine graphische Darstellung, die die Rate des Wasserverlusts für die Arabidopsispflanzen mit inaktivierter oder mutierter Ftase Aktivität (M. Columbia, era 1–2) und Kontrollen (M. C. Kontrolle, era 1–2 Kontrolle) vergleicht.
Die 8 zeigt einen Vergleich von alternden Blättern der Kontrolle (Wildtyp) und era-2 Mutantenpflanzen.
Die 9 zeigt einen Vergleich der Transkriptionsspiegel in alternden Blättern der Kontrolle (Wildtyp) und era-2 Mutantenpflanzen.
Diese Erfindung betrifft ein wie in den beigefügten Ansprüchen festgelegtes Verfahren.
Der ERA1 Promotor, wenn in eine Pflanze aufgenommen, wird in den Schließzellen der Pflanze reguliert und kann den Wasserverlust durch das Stomata beeinflussen. Dieser Promotor besteht aus einer die SEQ ID NO: 3 umfassenden Nukleinsäuresequenz (3).
Transgene Pflanzen und transgene Samen, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind ebenso Teil dieser Erfindung. Das Verfahren kann zur Herstellung eines Genprodukts unter der Kontrolle eines Promotors verwendet werden, der hauptsächlich in Schließzellen durch Expression eines Gens wirkt, das das Genprodukt in der Zelle einer Pflanze kodiert, umfassend die Schritte von: Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem DNA Konstrukt umfassend a) einen Regulatorbereich umfassen SEQ ID NO: 3 oder einen funktionellen Abschnitt davon, DNA umfassend ein ein Genprodukt kodierendes Strukturgen und einen einen polyadenylierten Bereich enthaltenden 3' nicht-translatierten Bereich; Regenerieren einer Pflanze, eines photosynthetischen Organismus oder Gewebekultur der Zelle; und Platzieren der Pflanze, photosynthetischen Organismen oder Gewebekultur und derartigen Bedingungen, dass der Promotor die Transkription des Strukturgens induziert und des Genprodukt exprimiert wird.
Im Zusammenhang mit dieser Offenbarung beziehen sich die Ausdrücke "Regulatorbereich" oder "Promotor" auf eine DNA Sequenz, für gewöhnlich stromaufwärts (5') der kodierenden Sequenz eines Strukturgens, das die Expression des kodierenden Bereichs durch Bereitstellung von Erkennungs- und Bindestellen für die RNA Polymerase und/oder andere für den Transkriptionsstart an der richtigen Stelle benötigten Faktoren steuert. Der Ausdruck "funktioneller Abschnitt" oder "funktionelles Fragment" betrifft eine trunkierte Sequenz eines Promotors dieser Erfindung, der die Fähigkeit zur Transkriptionsinduktion eines ERA Strukturgens unter den beschriebenen Bedingungen für die Aktivität eines Ftase Proteins aufrechterhält.
Die hierein beschriebenen Konstrukte und Verfahren können auf alle Arten von Pflanzen und anderen photosynthetischen Organismen, enthaltend, allerdings nicht darauf beschränkt: Angiospermen (Monocots und Dicots), Gymnospermen, sporentragende oder vegetativreproduzierende Pflanzen und die Algen, beinhaltend die Cyanophyta (blau-grün Algen) angewendet werden. Insbesondere bevorzugte Pflanzen sind solche Pflanzen, die kommerziell wertvolle Früchte bereitstellen, wie beispielsweise Getreide, Weizen, Baumwolle, Reis, Canola, Zuckerrohr, Zuckerrübe, Sonnenblumen, Kartoffeln, Tomaten, Broccoli, Karotten, Salat, Apfel, Pflaume, Orange, Zitrone, Rose und ähnliches.
Weiterhin können die hierin beschriebenen Konstrukte und Verfahren auf jeden Teil einer Pflanze, Protoplasten, oder Gewebezelle angepasst werden, wobei das Gewebe von einem photosynthetischen Organismus gewonnen ist. Der Ausdruck "Teil einer Pflanze" bedeutet einen Abschnitt einer Pflanze zu enthalten, der in der Lage ist eine regenerierte Pflanze herzustellen. Bevorzugte Teile von Pflanzen beinhalten Wurzeln, Triebe und meristematische Abschnitte davon. Andere Teile von Pflanzen, die von dieser Erfindung umfasst werden, sind: Blätter, Blumen, Samen, Epicotylen, Hypocotylen, Cotyledonen, cotyledonischer Knoten, Explants, Pollen, Samenanlagen, meristematisches oder embryonales Gewebe, Protoplasten und ähnliches. Transgene Pflanzen können von irgendwelchen dieser Teile von Pflanzen, Gewebekultur oder Protoplasten beinhaltend, und ebenso von Explants regeneriert werden. Die Verfahren werden gemäß der Pflanzenspezies variieren.
Zusammensetzungen und Konstrukte sind hierin beschrieben, die isolierte Nukleinsäuren (sowohl DNA als auch RNA) umfassen, die eine Ftase und Teile davon von photosyntheitischen Organismen kodieren. Ebenso werden Zusammensetzungen und Konstrukte hierin beschrieben, die einen Ftase Promotor kodierende isolierte Nukleinsäuren umfassen. Insbesondere wurden das ERA1 Gen isoliert und sequenziert, das die β Untereinheit der Ftase von Arabidopsis und eine die Transkription des ERA1 Gens regulierende Regulatorsequenz kodiert. Nukleinsäuren, die Ftasen aus photosynthetischen Organismen kodieren, und Homologe oder Analoge dieser Nukleinsäuren werden beschrieben.
Verfahren werden beschrieben, die isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren (DNA oder RNA) verwenden. Die Nukleinsäuren sind durch ihre Befähigung charakterisiert zu hybridisieren an (a) eine Nukleinsäure, die ein Ftase Protein oder Polypeptid kodiert, wie beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz mit der den Sequenzen von SEQ ID NO: 1 oder (b) ein Abschnitt des Vorstehenden (beispielsweise ein Abschnitt, der die Minimalzahl an Nukleotiden umfasst, um eine funktionelles Ftase Protein zu kodieren); oder durch die Befähigung ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz einer Ftase zu kodieren (beispielsweise SEQ ID NO: 2, oder funktionelle Entsprechungen davon zu kodieren; beispielsweise ein Polypeptid mit zumindest 80% Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID NO: 2, die, wenn in eine Pflanzenzelle aufgenommen, die Wachstumsgewohnheit, Samenkeimung und den Metabolismus in einem photosynthetischen Organismus auf die gleiche Art wie SEQ ID NO: 1 erleichtert). Eine funktionelle Entsprechung einer Ftase würde daher zumindest eine 80% ähnliche Aminosäuresequenz und ähnliche Merkmale wie das durch SEQ ID NO: 2 kodierte Polypeptid aufweisen, oder im Wesentlichen auf dieselbe Art wie es nachzukommen. Eine Nukleinsäure, die an eine ein Ftase Polypeptid wie SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleinsäure kann doppel- oder einzelsträngig vorliegen. Die Hybridisierung an eine DNA, wie die DNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, beinhaltet die Hybridisierung an den gezeigten oder seinen komplementären Strang.
Die prozentuale Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen einem Ftase Polypeptid wie beispielsweise SEQ ID NO: 2 und funktionellen Entsprechungen davon beträgt mindestens um 60% (≥ 60%); oder die prozentuale Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen einem Ftase Polypeptid und funktionellen Entsprechungen davon beträgt mindestens um 75% (≥ 75%); oder die prozentuale Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen einem Ftase Polypeptid und seinen funktionellen Entsprechungen davon beträgt mindestens um 80%, oder mindestens um 90%, wenn aufeinander folgende Aminosäuren verglichen werden.
Isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren, die diese Bedingungen erfüllen, umfassen Nukleinsäuren mit Sequenzen identisch zu Sequenzen von natürlich vorkommenden ERA1 Genen und Abschnitten davon, oder Varianten der natürlich vorkommenden Gene. Derartige Varianten beinhalten Mutanten, die sich durch Hinzufügen, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Nukleotide, modifizierte Nukleinsäuren in denen eines oder mehrere Nukleotide modifiziert wurden (beispielsweise DNA oder RNA Analoge) unterscheiden und Mutanten, die eines oder mehrere modifizierte Nukleotide umfassen.
Derartige Nukleinsäuren, DNA und RNA beinhaltend, können durch Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen oder mäßig stringenten Bedingungen Bestimmt und isoliert werden, wie beispielsweise solche die gewählt sind, um die Hybridisierung von Nukleinsäuren mit nicht-komplementären Sequenzen nicht zu gestatten. "Stringente Bedingungen" für Hybridisierungen stellen einen Ausdruck gemäß dem Stand der Technik dar, der die Bedingungen für Temperatur und Pufferkonzentration betrifft, die die Hybridisierung einer bestimmten Nukleinsäure an eine andere Nukleinsäure gestatten, worin die erste Nukleinsäure vollkommen komplementär zu der zweiten sein kann, oder die erste und die zweite einen gewissen Grad an Komplementarität teilen, der nicht vollkommen ist. Beispielsweise können bestimmte Bedingungen hoher Stringenz verwendet werden, die zwischen vollkommen komplementären Nukleinsäuren von jenen von geringerer Komplementarität unterscheiden. "Hohe stringente Bedingungen" und "mäßige stringente Bedingungen" zur Nukleinsäure Hybridisierung werden auf den Seiten 2.10.1–2.10.16 (siehe insbesondere 2.10.8–11) und den Seiten 6.3.1–6 in Current Protocols of Molecular Biology (Asubel, F. M. et al., eds., Vol. 1, Ergänzungen bis zur Ergänzung 29, 1995 enthaltend) erklärt. Die genauen Bedingungen, die die Stringenz der Hybridisierung festlegen, hängen nicht nur von der Ionenstärke, Temperatur und der Konzentration an destabilisierenden Agenzien, wie beispielsweise Formamid, ab, sondern ebenso von Faktoren wie der Länge der Nukleinsäuresequenz, Basenzusammensetzung, prozentuale Nichtübereinstimmung zwischen hybridisierenden Sequenzen und der Häufigkeit des Auftretens von Teilmengen der Sequenz innerhalb anderer nicht-identischer Sequenzen. Daher können hoch oder mäßig stringente Bedingungen empirisch bestimmt werden.
Hoch stringente Hybridisierungsverfahren können (1) eine geringe Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen verwenden, wie 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat, pH 7.0 (0.1 × SSC) mit 0,1% Natrium-doceylsulfat (SDS) bei 50°C; (2) während der Hybridisierung 50% (Vol/Vol) Formamid mit 5 × Denhardts Lösung (0,1% Gewicht/Volumen hoch gereinigtes Rinder Serumalbumin/0,1% Gew/Vol Ficoll/0,1% Gew/Vol Polyvinylpyrrolidon), 50 mM Natrium Phosphatpuffer bei pH 6.5 und 5 × SSC bei 42°C verwenden; oder (3) Hybridisierung mit 50% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natrium Phosphat (pH 6.8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, mit Ultraschall behandelte Lachssperma DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschschritten (washes) bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS verwenden. Mäßig stringente Bedingungen würden mit der Ausnahme ähnlich sein, dass bei der Hybridisierung 25% Formamid anstelle von 50% Formamid verwendet werden würden.
Durch Variieren der Hybridisierungsbedingungen von einem Stringnzniveau bei dem keine Hybridisierung stattfindet zu einem Niveau bei dem die Hybridisierung zuerst beobachtet wird, können die Bedingungen bestimmt werden, die es einer gegebenen Sequenz gestatten an die am ähnlichsten Sequenzen in der Probe zu hybridisieren.
Beispielhafte Bedingungen werden in Krause, M. H. and S. A. Aaronson (1991) Methods in Enzymology, 200: 546–556 beschrieben. Siehe ebenso insbesondere Seite 2.10.11 in Current Protocols in Molecular Biology (vorstehend), worin beschrieben ist, wie Waschbedingungen für mäßige oder niedrige Stringenzbedingungen bestimmt werden. Das Waschen ist derjenige Schritt, worin die Bedingungen für gewöhnlich derart gewählt werden, um so ein minimales Niveau an Komplementarität der Hybride zu bestimmen. Von der niedrigsten Temperatur bei der nur homologe Hybridisierung auftritt, führt im Allgemeinen eine 1%ige Nichtübereinstimmung zwischen hybridisierenden Nukleinsäuren zu einer Abnahme der Schmelztemperatur T_m um 1°C für irgendeine gewählte SSC Konzentration. Im Allgemeinen führt die Verdopplung der Konzentration an SSC zu einer Zunahme von T_m um ~17°C. Unter Verwendung dieser Richtlinien, kann die Wasch-Temperatur für eine mäßige oder niedrige Stringenz, in Abhängigkeit von dem angestrebten Niveau an Nichtübereinstimmung, empirisch bestimmt werden.
Isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren, die durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind zu hybridisieren an (a) eine ein Ftase Polypeptid kodierende Nukleinsäure, wie beispielsweise die als SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuren, (b) das Komplementäre von SEQ ID NO: 1, (c) oder einen Abschnitt von (a) oder (b) (beispielsweise unter hohen oder mäßigen Stringenz Bedingungen), können weiterhin ein Protein oder Polypeptid mit mindestens einem funktionellen Merkmal eines Ftase Polypeptids kodieren, wie der Regulation seitenständiger Verzweigung unter Tageslichtzyklen, oder Regulation der Reaktion auf ABA, oder Regulation der Alterung.
Enzymassays, Komplementierungstests, oder andere geeignete Verfahren können ebenso bei Prozeduren zur Identifizierung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren verwendet werden, die ein Polypeptid wie das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 oder eine funktionelle Übereinstimmung dieses Polypeptids kodieren. Die antigenen Eigenschaften von Proteinen oder Polypeptiden, die durch hybridisierende Nukleinsäuren kodiert werden, können durch immunologische Verfahren unter Verwendung von Antikörpern bestimmt werden, die an ein Ftase Polypeptid, wie beispielsweise ein Immunoblot, Immunopräzipitat und Radioimmunoassay, binden. PCR Methodik, RAGE (Schnelle Amplifizierung von genomischen DNA Enden) beinhaltend, kann ebenso zur Prüfung und Nachweis auf die Gegenwart von Nukleinsäuren verwendet werden, die Ftaseähnliche Proteine und Polypeptide kodieren, und bei der Klonierung derartiger Nukleinsäuren aus genomischer DNA helfen. PCR Verfahren für diesen Zweck können in Innis, M. A., et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA gefunden werden.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuren werden bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder Polypeptiden verwendet, die in Zellen, Gewebe, Pflanzenteile, Pflanzen oder andere photosynthetische Organismen aufgenommen werden. In einer Ausführungsform enthält die DNA die gesamte oder einen Teil der kodierenden Sequenz für ein Ftase Polypeptid oder DNA, die an DNA mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 hybridisiert, wird in einen Expressionsvektor für die kodierten Polypeptide in geeignete Wirtszellen aufgenommen. Das kodierte Polypeptid, bestehend aus eine Ftase Untereinheit oder seiner funktionellen Übereinstimmung, ist zur Farnesyltransferase-Aktivität befähigt. Der Ausdruck "Vektor", wie hierin verwendet, betrifft ein Nukleinsäure-Molekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an die es verbunden wurde.
Primer und Sonden, bestehend aus 20 oder mehr aufeinander folgenden Nukleinsäuren der vorstehend beschriebenen Nukleinsäwen, werden ebenso hierin beschrieben. Daher umfasst eine Nukleinsäure eine spezifische Sequenz von ungefähr 20 bis ungefähr 200 oder mehr Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer spezifischen Nukleotidsequenz der Ftase Protein kodierenden DNA oder transkribierten mRNA sind. Diese Sonden und Primer können verwendet werden, um Ftase-kodierende Nukleinsäuren von anderen photosynthetischen Organismen zu identifizieren und isolieren.
Hierin als "isoliert" verwiesene Nukleinsäuren sind Nukleinsäwen, die von den Nukleinsäuren der genomischen DNA oder zellulären RNA von ihrer Ursprungsquelle (beispielsweise, wie sie in Zellen oder in einer Mischung von Nukleinsäuren wie einer Bank (library) vorliegt) abgetrennt wurden und einer weiteren Verarbeitung unterzogen werden können. "Isolierte" Nukleinsäuren beinhalten Nukleinsäwen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren, ähnliche Verfahren oder andere geeignete Verfahren erhalten wurden, die im wesentlichen reine Nukleinsäuren, mittels chemischer Synthese hergestellte Nukleinsäwen, durch Kombination von biologischen und chemischen Verfahren, und isolierte rekombinante Nukleinsäuren beinhalten. Hierin als "rekombinant" verwiesene Nukleinsäuren sind Nukleinsäuren, die mittels rekombinanter DNA Methodik hergestellt wurden und jene Nukleinsäuren beinhalten, die durch Prozeduren erzeugt wurden, die auf ein Verfahren zur künstlichen Rekombination beruhen, wie beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder das Klonieren in einen Vektor unter Verwendung von Restriktionsenzymen. "Rekombinante" Nukleinsäuren sind ebenso diejenigen, die aus Rekombinations-Ereignissen herrühren, die sich durch die natürlichen Mechanismen der Zellen ergeben, die allerdings nach dem Einführen in die Zellen auf Nukleinsäuren ausgewählt wurden, die dazu entworfen wurden, ein erwünschtes Rekombinations-Ereigniss zu ermöglichen oder wahrscheinlich zu machen. Abschnitte der isolierten Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit einer bestimmten Funktion kodieren, können durch beispielweise dem Verfahren nach Jasin, M., et al., US Patent 4,952,501 identifiziert und isoliert werden.
Die Erfindung verwendet Antisense Nukleinsäuren oder Oligonukleotide, die gesamt oder teilweise zu einem einen Sensestrang umfassenden Zielmolekül komplementär sind, und mit dem Zielmolekül hybridisieren können. Das Ziel kann DNA oder sein RNA Gegenstück (d. h., worin T Reste in der DNA U Reste in dem RNA Gegenstück sind) sein. Antisense Nukleinsäuren oder Oligonukleotide können, wenn in eine Zelle eingebracht, die Expression des Gens inhibieren, das durch den Sensestrand oder die von dem Sensestrang transkribierte mRNA kodiert wird. Antisense Nukleinsäuren können mittels Standarttechniken hergestellt werden. Siehe beispielsweise Shewmaker, et al., US Patent 5,107,065.
In einer besonderen Ausführungsform ist eine Antisense Nukleinsäure oder Oligonukleotid gesamt oder teilweise zu einer Zielnukleinsäure (entweder DNA oder RNA) komplementär und kann damit hybridisieren, worin die Zielnukleinsäure an eine Nukleinsäure mit der Komplementärsequenz des Strangs in SEQ ID NO: 1 hybridisieren kann. Eine Antisense Nukleinsäure oder Oligonukleotid kann beispielsweise zu einer Zielnukleinsäure mit der Sequenz komplementär sein, die das der Strang des offenen Leserasters von SEQ ID NO: 1, oder einer eine funktionelle Entsprechung einer Ftase kodierende Nukleinsäure, oder an einen zur Ermöglichung der Hybridisierung ausreichenden Abschnitt dieser Nukleinsäuren gezeigt ist. Beispielsweise könnte ein Abschnitt einer Sequenz aus 16 Nukleotiden ausreichend sein, um die Proteinexpression zu inhibieren. Fragmente, die 25 oder mehr aufeinander folgende zu SEQ ID NO: 1 komplementäre Nukleotide umfassen, könnten ebenso verwendet werden. Oder eine Antisense Nukleinsäure oder Oligonukleotid komplementär zu 5' oder 3' nicht-translatierten Bereichen, oder den Translationsstart-Codon (5' nicht-translatierte and translatierte Bereiche) des ERA1 Gens überlappend, oder ein eine funktionelle Entsprechung kodierendes Gen können ebenso wirksam sein. In einer anderen Ausführungsform ist die Antisense Nukleinsäure gesamt oder teilweise zu einer Zielnukleinsäure komplementär und kann daran hybridisieren, die ein Ftase Polypeptid kodiert.
Zusätzlich zu dem Antisense Nukleinsäuren können Oligonukleotide konstruiert werden, die an zweifache Nukleinsäure entweder in dem Gen oder dem DNA : RNA Transkriptionskomplex binden, um eine stabile Dreifachhelix zu bilden, worin die enthaltene Dreifachhelix die Transkription und/oder Expression eines ein Ftase Polypeptid oder seine funktionelle Entsprechung kodierenden Gens inhibiert. Frank-Kamenetskii, M. D. und Mirkin, S. M. (1995) Ann. Rev. Biochem. 64: 65–95. Derartige Oligonukleotide werden unter Verwendung der Basenpaar-Bildungsregeln der Dreifachhelix-Bildung und der Nukleotidsequenz des Gens oder der mRNA für Ftase konstruiert. Diese Oligonukleotide können eine Ftase-ähnliche Aktivität auf eine Vielzahl von Wegen (pathways) inhibieren, die die Verhinderund der Transkription des ERA1 Gens oder durch Binden an mRNA, wie sie vom Gen transkribiert wird, beinhalten.
Proteine oder Polypeptide werden durch die hierin beschriebenen Nukleinsäwen kodiert. Die Proteine oder Polypeptide können isoliert und/oder rekombinant vorliegen. Auf die hierin als "isoliert" verwiesen Proteine oder Polypeptide sind Proteine oder Polypeptide, die zu einem Maße aufgereinigt sind, das über das hinausgeht, in dem sie in Zellen vorliegen. Sie sind mindestens 10% rein; d. h. im Wesentlichen rein. "Isolierte" Proteine oder Polypeptide beinhalten Proteine oder Polypeptide, die gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden, und beinhalten im Grunde reine Proteine oder Polypeptide, Proteine oder Polypeptide, die durch chemische Synthese oder Kombination von biologischen und chemischen Verfahren hergestellt wurden, und rekombinante Proteine oder Polypeptide, die durch die Expression rekombinanter Nukleinsäuren hergestellt wurden.
Das Protein oder der Abschnitt davon weist zumindest ein funktionelles Merkmal einer Ftase auf; beispielsweise eine katalytische Aktivität, wie beispielsweise normale seitliche Verzweigung, Einzelblüten/Blütenstand, Samenkeimung, oder stomatales Öffnen und Bindefunktionen und/oder antigene Funktionen (beispielsweise das Binden von Antikörpern, die ebenso an eine natürlich vorkommende Ftase binden) beeinflussend. Daher werden diese Proteine als Ftasen vom pflanzlichen Ursprung bezeichnet und beinhalten beispielsweise natürlich vorkommende Ftase, Varianten (beispielsweise Mutanten) oder diese Proteine und/oder Abschnitte davon. Derartige Varianten beinhalten Mutanten, die sich durch Hinzufügen, Deletion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäurenreste unterscheiden, oder modifizierte Polypeptide, in denen einer oder mehrere Reste modifiziert wurden, und Mutanten, die einen oder mehrere modifizierte Reste umfassen.
Die Erfindung verwendet eine Antisense Nukleinsäwe einer Nukleinsäuresequenz, die die β Untereinheit eines Ftase Proteins kodiert. Abschnitte des Enzyms können hergestellt werden, die selbst eine vollständige oder teilweise Funktion innehaben, oder die sich, wenn sie zusammen gemischt werden (obgleich vollständig, teilweise oder nicht-funktionell alleine), mit einem oder mehreren anderen Polypeptiden spontan zusammenlagern, um ein funktionelles Protein mit zumindest einem funktionellen Merkmal einer Ftase wieder aufzubauen.
Mehrere Gene wurden identifiziert, die durch ABA induziert werden. Dies legt nahe, dass ABA induzierte Toleranz gegenüber widrigen Umweltbedingungen ein komplexes Ereignis mit vielen beteiligten Genen (multigenic) ist. Daher ist die Identifizierung und der Transfer von einzelnen Genen in Frucht-Pflanzen, der die Lebensfähigkeit der Pflanze unter verschieden Umweltbedingungen aufgrund einer gesteigerten Reaktion auf ABA verbessert, neu und äußerst nützlich.
Zur Identifizierung von Genen, die ABA-regulierte Vorgänge in Pflanzen eher umfassend steuern, wurden genetische Prüfungen bei mehreren Pflanzenspezies angewendet, um Mutationen zu isolieren, die die Reaktion der Pflanze auf das Hormon ändern.
Mutationen, die eine erhöhte Reaktion auf ABA (era) in Arabidopsis Samen hervorrufen, wurden nach ihrer Befähigung zur Verhinderung der Samenkeimung mit niedrigen Konzentrationen an ABA identifiziert, die normalerweise dem Wildtyp (Kontrollen, beispielsweise natürlich vorkommende) Samenkeimung ermöglichen. Von diesen waren die era1 Mutantenklasse, die eine transferierte DNA (T-DNA) Linie (era1-1, Ökotyp Wassilewskija) und zwei Neutron-erzeugte Mutanten (era1-2 und era1-3, Ökotyp Columbi) beinhaltet, von besonderem Interesse, da diese Klasse eine verringerte Keimungsfähigkeit unter gewöhnlicher Nachhemmung (postimhibition) aufwies. Mutanten, die die ABA Reaktion steigern, sollten im Grunde eher ruhend bzw. untätig sein. Untätigkeit in era1 Allelen wurde durch eine 4-tägige Kühlperiode abgeschwächt; die Fähigkeit der era1 Keimung nahm mit der Zeitdauer der Kühlung der Samen zu. In vielen Pflanzenspezies erfordert das Unterbrechen der Untätigkeit, um Keimung zu ermöglichen, Frühling und Ausgesetztsein gegenüber Feuchtigkeit, niedrig Temperaturumgebungen für einen längeren Zeitraum (Baskin and Baskin, 1971). Das Keimungsprofil von era1 Mutanten könnte einen erhöhten Zustand von ABA-induzierter Untätigkeit widerspiegeln; daher benötigen diese Samen einen längeren Frühling zum Keimen. Eine Stütze für diese Behauptung erfolgte durch die Konstruktion von Doppelmutanten von era1 mit sowohl ABA biosynthetischen (aba1-1) und insensitiven Mutanten (abi1-1 und abi3-6). In allen Fällen wiesen die Doppelmutanten eine verringerte Untätigkeit im Vergleich mit era1 auf, was anzeigt, das die Beobachte Zunahme an Untätigkeit in era1 Samen von der ABA Synthese oder Sensitivität abhängig war.
Neben der Verbreiterung des Spektrums von neuen ABA Reaktions-Mutanten wurden ebenso Überempfindlichkeits-Prüfungen verwendet, um negative Regulatoren der ABA Sensitivität zu identifizieren. D. h., dass die Inhibierung dieser Genfunktionen die ABA Reaktion erhöht. Eines dieser Gene (ERA1) wurde kloniert und es wurde bewiesen, dass es die β-Untereinheit eines heterodimeren Farnesyltransferase-Proteins (Ftase) kodiert (Cutler et al., 1996). Die era1-1 Mutation, die aufgrund einer T-DNA Insertion vorliegt, ermöglicht die Isolierung von pflanzlichen Genombereichen, die an die Insertionen angrenzen. Bei Verwendung der angrenzenden Bereiche als Sonden, wurden die Wild-Typ cDNA und genomische Klone isoliert. Deren Sequenzanalyse beschreibt ein 3,5 kb genomische DNA umfassendes Gen. Das Gen beinhaltet 13 Introns, die in den 1A–1C unterstrichen sind, wobei sich die T-DNA Insertionsstelle des era1-1 im Intron 8 befindet. Eine Southern (DNA) Analyse der Wild-Typ DNA, era1-2 und era1-3 mit Era1cDNA als Sonde versehen zeigte, dass beide schnelle Neutronen Allele Deletionen beinhalten, die den ERA1 Locus umfassen. Schnelle-Neutronen Mutagenese induziert geringfügige Deletionen in Arabidopsis (Shirley et al., 1992) und eine nachfolgende Genomanalyse mit einer sen ERA1 Locus umfassenden 14 kb Sonde legte die Größe der era1-2 Deletion auf ungefähr 7,5 kb und die era1-3 Deletion geringfügig größer fest. Daher enthielten alle drei era1 Allele DNA-Brüche in dem gleichen Locus, was die Identität des ERA Locus bestätigt.
Eine konzeptionelle Translation des längsten offenen Leserasters (404 Aminosäuren) in dem ERA1 Gen erzeugte ein Protein (2 und 4) mit einer hohen Sequenzähnlichkeit zu Hefe, Erbse und Säugetier Protein Farnesyltransferase β-Untereinheit Genen (Goodman et al., 1988; Chen et al., 1991; Yang et al., 1993). Farnesyltransferasen bestehen aus α und β Untereinheiten, die dimerisieren und ein Enzym bilden, dass die Anlagerung von Farnesylpyrophosphat (15 Kohlenstoffe) an ein COOH-terminales CaaX Motiv enthaltende Proteine katalysiert, worin C einen Cysteinrest bezeichnet, aa für gewöhnlich aliphatische Aminosäuren sind und X ein Cystein, Serin, Methionin oder Glutaminrest bezeichnet. Beide pflanzlichen Gene mit β Untereinheit enthalten einen Bereich von ungefähr 50 Aminosäuren in der Nähe ihres COOH-Terminus, der in Genen mit β Untereinheit aus Hefen und Säugetieren fehlt.
In Hefe- und Säugetier-Systemen modifizieren Ftasen mehrere signalweitergebende Proteine für die Membranlokalisierung. Dies wird durch die Anlagerung der lipophilen Farnesyl-Seitenkette an das Protein-Ziel mittels der Ftase erreicht. Die Anlagerung der Farnesylgruppe verursacht eine Änderung der Gesamthydrophobizität des Ziels und ermöglicht es dem Protein selbst in der Membran zu ankern, wo es für gewöhnlich mit anderen signalweitergebenden Molekülen wechselwirkt. Da der Verlust der Farnesylierungsaktivität in der era1 Mutante zu einer verstärkten Reaktion des Samens auf ABA führt, liegt es nahe, dass ein Ziel-Protein in Arabidopsis an der Membran lokalisiert sein muss, um das ABA Signal abzuschwächen. Daher scheint die Farnesylierung in Arabidopsis für die normale Funktion eines negativen Regulators der ABA Sensitivität notwendig zu sein.
Nachfolgende Anstrengungen haben gezeigt, dass der Verlust der ERA1 Genfunktion in Arabidopsis eine erhöhte Toleranz gegenüber umweltbedingten Beanspruchungen bei dem Niveau einer reifen Pflanze verleiht. Beispielsweise zeigte ein Vergleich von Wild-Typ Pflanzen und era1 Mutantenpflanzen, die in Erdboden unter gewöhnlichen Laborbedingungen (24 Stunden Licht, 150 μE m^–2 sec^–1, 30% Feuchtigkeit) gezüchtet wurden, dass die Mutanten Wasser nicht so häufig wie die Wild-Typ Pflanzen zum Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit benötigten (5). Wenn Mutanten und Wild-Typ Pflanzen bis zum Auftreten von Blüten gezüchtet wurden, wurde aufgehört zu bewässern und die Pflanzen wurden an jeweils aufeinander folgenden Tagen nach Anzeichen von Beanspruchung beobachtet. Der Wasserverlust in den Mutanten Pflanzen war im Vergleich zu den Wildtyp Pflanzen (6 und 7) deutlich verringert.
Um zu bestimmen, ob die beobachtete erhöhte Trockenheitstoleranz der era1 Mutanten mit der ERA 1 Genfunktion in Zusammenhang stand, wurden transgene Pflanzen konstruiert, die eine ERA1 Promotor-Fusion an ein Reporter GUS Gen (hergestellt durch Insertion ein 5 kb Fragments des ERA1 Promotors in ein promotorenfreies GUS T-DNA Plasmid) enthielten. Analyse der transgenen Pflanzen zeigte, dass ERA1 in dem Edipermalgewebe von Arabidopsis über Transkription exprimiert ist und dass diese Expression Schließzellen spezifisch erfolgt. Expression von ERA1 wurde ebenso im Meristemgewebe der Pflanzen und in Haarwurzeln festgestellt. Die Schließzellen Expression von ERA1 steht im Einklang mit der Trockenheitstoleranz der Mutante, da diese Zellen die Hauptregulatoren der Wasserabsonderung durch die Pflanze darstellen. Es könnte erwarte werden, dass ERA1-regulierte stromatale Leitung die Expression des ERA1 Gens in den Schließzellen benötigen würde. Infolgedessen führt der Verlust der ERA1Genfunktion zu Schließzellen, die besser auf ABA reagieren, das wiederum zu einer verstärkten auf Trockenheit reagierende Schließzellen-Regulation führt. Daher wird die Modifikation der Ftase Expression oder Aktivität in höheren Pflanzen, insbesondere in Kulturpflanzen, tief greifende Auswirkungen auf stromatale Leitung und Absonderungs-Raten in den Pflanzen aufweisen.
Die Beschaffenheit der era1 Mutation in Arabidopsis zeigt, dass die Inhibierung der Farnesylierung die ABA Reaktionen in Pflanzen und eine Änderung dieser Enzymaktivität in Kulturspezies erhöhen wird. Eine Inhibierung der Ftase Aktivität in Kulturpflanzen kann mittels zahlreicher Verfahren erreicht werden. Insbesondere durch Herstellen von ERA1 Antisense DNA in Schließzellen kann die Menge an synthetisierter Ftase auf ein Niveau verringert werden, dass einen ERA Mutanten Phänotyp nachahmen würde. Der ERA1 Promotor wird in zahlreichen verschiedenen Geweben, von Spross-Meristemen bis zu Haarwurzeln, reguliert. Durch Bestimmen der Elemente des ERA1 Promotors, die eine Expression in spezifischen Geweben ermöglichen, ist es möglich die Expression der Antisense ERA1 auf nur ein Gewebe oder Zelltyp, wie Schließzellen, anzupassen.
Ein anderes Verfahren zur Inhibierung der Ftase Aktivität in Pflanzen besteht in der Herstellung von spezifischen Peptidinhibitoren der Farnesylierung in transgenen Pflanzen. In Säugetier- und Hefe-Systemen wurde die Carboxyl-terminale Zielsequenz bzw. Lokalisierungssequenz (CaaX, wobei C = Cystein, x = aliphatisch, X = irgendeine Aminosäure), die die Anlagerung der Farnesylgruppe an spezifische Proteine ermöglicht, eindeutig bestimmt. Peptide, die diese Zielsequenzen nachahmen, wurden hergestellt und zeigten, dass sie die Farnesylierung der endogenen Zielproteine in diesen Systemen inhibieren. Darüber hinaus wird CAIM in vivo in Arabidopsis farnesyliert. Daher können ähnliche Inhibitoren auf höhere Pflanzen zur kompetitiven Inhibierung der Ftase in vivo angewendet werden. Dies kann wieder durch Expression von Inhibierungspeptiden in transgenen Pflanzen durch Synthese der DNA Sequenz für ein CaaX Peptid und ihrer Fusion an einen Schließzellen spezofoschen Promotor bewerkstelligt werden. Bei beiden Verfahren, die die geeigneten Promotoren verwenden, können Antisense Ftase oder Peptidinhibitoren spezifisch gerichtet sein und gesteuert werden.
Diese Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung trockenheitstoleranter Pflanzen bereit, umfassend: Herstellen eines Nukleinsäurekonstrukts, das einen Promotor umfasst, der mit einer Nukleinsäuresequenz wirksam verbunden ist, die eine Antisense zu SEQ ID NO: 1 umfasst oder kodiert, oder eine Nukleinsäure, die ein funktionelles Äquivalent der Antisense umfasst; Einfügen des Nukleinsäurekonstrukts in einen Vektor; Transformieren einer Pflanze, einer Gewebekultur oder Pflanzenzellen mit dem Vektor; und Züchten der Pflanze oder Regenerieren einer Pflanze aus der Gewebekultur oder der Pflanzenzelle, wobei eine trockenheitstolerante Pflanze hergestellt wird. Dieses Verfahren kann verwendet werden, wobei die Nukleinsäure 25–200 oder mehr aufeinander folgende zur SEQ ID NO: 1 komplementäre Nukleinsäuren umfasst, die Oligonukleotide aus 25 oder mehr aufeinander folgenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 1 oder ihrer komplementären bestehen, oder einer Nukleinsäure, die ein Peptidinhibitor der Farnesyltransferase, kodiert.
Zusätzlich zu stomataler Regulation, die gegenüber ABA äußerst empfindlich ist, zeigen era Pflanzen ebenso eine verzögerte Alterung bei Trockenheitsbedingungen, was anzeigt, dass die Farnesylierung mehrere trockenheitsinduzierte Reaktionen in Arabidopsis negativ reguliert. Die unter gewöhnlichen Laborbedingungen gezüchteten era Pflanzen brauchen mehr Zeit um gelb zu werden. Die Mutantenpflanzen bleiben grün und lebensfähig lange nachdem der Wildtyp gealtert und abgestorben ist. Abgelöste Blätter einer era Mutantenpflanze werden nicht so schnell gelb, wie abgelöste Blätter der Wildtyp Pflanzen (8). Blätter von ähnlicher Größe, die sich von der Entwicklung gleichen, wurden von Wildtyp und era Pflanzen genommen und auf Agar-haltigen Petrischalen platziert (siehe Beispiel 7). Gewöhnlich fängt ein Wildtyp Blatt nach ungefähr 5 Tagen an Chlorophyll zu verlieren und bleicht schließlich aus. Die Blätter der Mutantenpflanzen bleiben für den doppelten Zeitraum grün. Da die Blätter in andauernder Berührung mit dem Agar stehen, wurden sie nicht von Trockenheit beansprucht, was anzeigt, dass die verringerte Alterung der era1 Mutante keine Trockenheitsinduziertes Erscheinung ist.
Darüber hinaus kann bei einen 10 Stunden Tag/16 Stunden Nachtzyklus der pflanzliche Lebenszyklus gegenüber dem Wildtyp Pflanzen (3 Monate) verdoppelt werden. Daher wird es ersichtlich, dass der Chlorophyll Umsatz bzw. Erneuerung und Alterungssignale in den era1 Mutanten geändert sind. Beispielsweise wurden Wildtyp und Mutantenpflanzen in Töpfen bei gut-bewässerten Bedingungen bis zu Entwicklungsstufen gezüchtet, bei denen die Blätter der Wildtyp Pflanze zu altern anfangen würden (ungefähr die Zeit der Blütenentwicklung). Zu diesem Zeitpunkt wurden entwicklungsgemäß ähnliche Blätter auf alterungsinduzierte Markergene mittels Northern Blot Analyse (Beispiel 8) untersucht. Zwei Gene, SAG12 und SAG13, in denen die Transkription gewöhnlich während der Alterung in Wildtyppflanzen induziert ist., wurden in der era1 Mutante nicht induziert (9). Weiterhin wird die CAB Transkription beibehalten (9). Insgesamt zeigen diese Ergebnis, dass der Alterungs-Induzierungsvorgang in era1 Mutanten im Vergleich zu Wildtyppflanzen verzögert ist, was zeigt, dass der Verlust der Farnesylierungsaktivität eine Verzögerung der Induzierung der Alterung in der Pflanze selbst bei Bedingungen verursacht, worin Wasser Beanspruchung keinen umweltbedingten Einfluss darstellt.
Die era1 Mutanten zeigen zusätzlich zu Effekten auf Alterung und Wasserverlust einen Unterschied bei der Verzweigung und Blüten Wuchsform bzw. Gewohnheit, wenn sie bei Tageslicht-Zyklen gezüchtet werden. Bei kontinuierlichem (24 Stunden Licht/Tag) unterscheidet sich das Verzweigungsmuster der Mutanten nicht von dem der Wildtyp Pflanzen. Wenn allerdings eine Dunkelperiode gegeben wird, erzeugen die Mutanten nicht so viele seitliche Verzweigungen wie Wildtyp Pflanzen. Bei der Bestimmung erzeugten die Pflanzen mit Verlust an Farnesylierungsaktivität nur 2,4 Verzweigungen pro Pflanze im Vergleich zu 3,6 seitlichen Verzweigungen pro Wildtyp Pflanze. Dies stellt eine 30%ige Abnahme an seitlichen Verzweigungen pro Pflanze dar.
Das Blühen wird durch den Verlust an Ftase Aktivität ebenso beeinflusst. Pflanzen denen Ftase Aktiviät fehlt erzeugen mehr Blumen pro Pflanze (25–30 Knospen/Blütenstand) als Wildtyp Pflanzen (10–15 Knospen/Blütenstand). Im Durchschnitt sind daher zweimal so viele Blütenknospen auf den Mutanten als auf den Wildtyp Pflanzen vorhanden.
Diese pleiotropen Effekte des era1 Verlusts der Funktionsmutanten auf die gesamte pflanzliche Entwicklung zeigen, dass das ERA1 Gen ein koordinierter Regulator einer Ansammlung pflanzlicher Entwicklungsfunktionen sein kann.
Bis jetzt gab es keine bekannte Funktion für die Farnesylierung bei höheren Pflanzen einschließlich einer Rolle bei der ABA Signalweiterleitung. Ftasen wurden bei zahlreichen höheren Pflanzen gefunden, wie beispielsweise Tomate und Erbse, so dass es offensichtlich ist, dass dieses Enzym Funktionen über die Speziesgrenze aufweist. Die Überproduktion der Farnesyltransferase Zielpeptide oder die Verwendung von Farnesylierungsinhibitoren inaktiviert darüber hinaus die Ftase in Säugertier und Hefe Systemen vollständig. Daher können ähnliche Inhibitoren auf höhere Pflanzen zur Inaktivierung der Ftase Aktivität in vivo angewendet werden. Bei beiden Fällen können mit den geeigneten Promotoren Antisense Ftase oder Peptidinhibitoren spezifisch gerichtet und gesteuert werden.
Die farnesylierungsdefizienten Mutanten sind ebenso überempfindlich gegenüber exogenem Auxin. Dass diese Mutanten eine verringerte Verzweigung und kleinere Änderungen bei der Meristem Organisierung zeigen, kann durch eine geänderte Auxinregulation erklärt werden. Andere Hormonfunktionen sind daher in dieser Mutante betroffen, was anzeigt, dass zusätzlich zu ABA Wegen andere hormonregulierte Wege durch Ftase Aktivität gesteuert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das ERA1 Gen einen molekularen Mechanismus zur Koordinierung der Regulation verschiedener Hormon-Signalmoleküle bereitstellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, sind die in dem Bereich dieser Erfindung enthaltenen Pflanzen höhere und niedere Pflanzen des Pflanzenreiches. Reife Pflanzen, Setzlinge und Samen sind im Bereich der Erfindung enthalten. Eine reife Pflanze beinhaltet eine Pflanze in einem Entwicklungsstadium nach dem Setzling. Ein Setzling ist eine sehr junge, unreife Pflanze in den frühen Entwicklungsstadien. Teile von Pflanzen, Protoplasten und eine Gewebekultur werden ebenso von der Erfindung bereitgestellt.
Transgene Pflanzen liegen im Bereich der vorliegenden Erfindung, die den durch die era1 Mutation charakterisierten Phänotyp aufweisen. Samen von transgenen Pflanzen werden durch diese Erfindung bereitgestellt und können zur Propagierung weiterer Pflanzen verwendet werden, die die Konstrukte dieser Erfindung enthalten.
Die ERA1 Funktion bei zahlreichen Kulturpflanzen kann inhibiert werden, um die Reaktion der Pflanze auf ungünstige Umweltbedingungen zu steigern, die eine ABA vermittelte Signalwirkung benötigen. Die Steuerung der Farnesylierung in höheren Pflanzen reguliert sowohl embryonale als auch vegetative Gewebereaktion auf dieses Hormon (Cutter et al., 1996). Die gesteigerte Empfindlichkeit überträgt sich in eine schnellere Reaktion des Gewebes auf Beanspruchungsbedingungen, die wiederum einen gesteigerten Schutz der Pflanze auf umweltbedingte Beanspruchung verleihen. Da dies nur die Steuerung eines einzelnen Gens, ERA1, erfordert, sollte es möglich sein die Farnesylierung in mehreren Pflanzen durch Steuerung der Synthese oder Aktivität dieses Enzyms zu steuern. Die hierin beschriebene Arbeit zeigt weiterhin klar, dass eine Änderung des ABA Signalweiterleitungswegs durch Beeinflussung der Gene, die die ABA Reaktion steuern, es möglich macht, die Reaktion der Pflanze auf ungünstige Wasser Beanspruchungsbedingungen zu verbessern.
Um transgene Pflanzen dieser Erfindung herzustellen, werden ein Konstrukt, das das Ftase kodierende Gen umfasst, oder eine seine funktionelle Entsprechung kodierende Nukleinsäure und ein Promotor in einen Vektor mittels Verfahren eingebracht, die dem Fachmann bekannt sind und von ihm verwendet werden. Der Promotor kann das Gesamte oder einen Teil der SEQ ID NO: 3 umfassen. Das Konstrukt kann ebenso irgendwelche andere notwendige Regulatoren, wie Terminatoren oder ähnliches beinhalten, die wirksam mit der kodierenden Sequenz verbunden sind. Es kann ebenso von Vorteil sein eine 5' Leitsequenz (leader sequence), wie den nicht translatierten Leiter der Schichtprotein bzw. Hüllprotein (coat protein) mRNA des Alfalfa Mosaikvirus (Jobling, S. A. and Gehrke, L. (1987) Nature 325: 622–625) oder das Mais chlorotic mottle Virus (MCMV) Leiter (lommel, S. A., et al. (1991) Viroloy 81: 382–385), einzufügen. Der Fachmann wird die Anwendbarkeit anderer Leitsequenzen für verschiedene Zweeke erkennen.
Zielsequenzen sind ebenso von Nutzen und können in Konstrukte eingefügt werden. Eine Zielsequenz wird für gewöhnlich in ein Peptid translatiert, das das Polypeptid Produkt der kodierenden Nukleinsäuresequenz zu einem gewünschten Ort in der Zelle leitet und von dem Peptid getrennt wird, nachdem der Durchgang des Peptids vollständig oder gleichzeitig mit dem Durchgang ist. Beispiel für in dieser Erfindung nützlicher Zielsequenzen beinhalten die Hefe-Mitochondriale-Präsequenz (Schmitz, et al. (1989) Plant Cell 1: 783–791), die Zielsequenz des Phatogenese-ähnlichen Gens (PR-1) von Tabak (Cornellisen, et al. (1986) EMBO J. 5: 37–40), Vakuole-Zielsequenzen (Chrispeels, M. J. and Raikhel, N. V. (1992) Cell 68: 613–616), sekretorische Wegsequenzen, wie jene des ER oder Golgi (Chrispeels, M. J. (1991) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21–53), sind aber nicht darauf beschränkt. Intraorganelle Sequenzen können ebenso für innere Stellen, so beispielsweise Thylakoide in Chloroplasten, von Nutzen sein. Theg, S. M. and Scott, S. V. (1993) Trends in Cell Biol. 3: 186–190.
Terminatorsequenzen werden für gewöhnlich zusätzlich zu 5' Leitsequenzen in das Konstrukt eingefügt. In pflanzlichen Konstrukten ist ein 3' nicht-translatierter Bereich im Allgemeinen Teil des Expressionsplasmids und beinhaltet eine polyA Terminationssequenz. Der eingesetzte Terminationsbereich wird im Allgemeinen ein vorteilhafter sein, da Terminationssequenzen relativ austauschbar erscheinen. Die Octopin-Synthase und Nopalin-Synthase Terminationsbereich, die von dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens stammen, sind für eine derartige Verwendung in der Erfindung geeignet.
Irgendein geeignetes Verfahren kann zum Einfügen der Nukleinsäuren und Konstrukte dieser Erfindung verwendet werden, um transgene Pflanzen mit einem geänderten Genom zu erzeugen. Für Gräser wie beispielsweise Mais kann ein Mikroprojektil-Beschuss (siehe beispielsweise, Sanford, J. C., et al., US 5,100,792 (1992)) verwendet werden. Ein Nukleotid-Konstrukt oder ein das Konstrukt enthaltender Vektor wird in dieser Ausführungsform auf kleine Teilchen beschichtet, die anschließend mittels Hochgeschwindigkeits-Ballistischer-Durchdringung (high velocity ballistic penetration) in das Zielgewebe (Zellen) eingefügt werden. Der Vektor kann irgendein Vektor sein, der die Expression exogener DNA in pflanzlichen Zellen ermöglicht, in die der Vektor eingefügt wird. Die transformierten Zellen werden anschließend bei zur Regeneration der Pflanzen geeigneten Bedingungen gezüchtet, was zur Herstellung von transgenen Pflanzen führt.
Die das Konstrukt tragende transgene Pflanzen werden unter Verwendung mehrerer Verfahren, die einen geeigneten Phänotyp-Marker, wie beispielsweise eine Antibiotika oder Herbizid Resistenz, oder visuelle Beobachtung der Zeit der Blumeninduktion im Vergleich zu natürlich vorkommenden Pflanzen, einschließen aber nicht darauf beschränkt sind, auf den gewünschten Phänotyp untersucht.
Andere bekannte Verfahren zum Einfügen von Nukleinsäure Konstrukten in Pflanzen schließen die Agrobakterium-übermittelte Transformation (siehe beispielsweise Smith, R. H., et al., US 5,164,310 (1992)), Elektroporation (siehe beispielsweise Calvin, N., US 5,089,843 (1992)), Einfügung unter Verwendung von Laserstrahlen (siehe beispielsweise Kasuya, T., et al., US 5,013,660 (1991)) oder Einfügung unter Verwendung von Agenzien wie beispielsweise Polyethylenglykol (siehe beispielsweise Golds, T. et al. (1993) Biotechnology, 11: 95–97) und ähnliche ein. Pflanzliche Zellen können im Allgemeinen mit mehreren Vektoren, wie beispielsweise viralen, episomalen Vektoren, Ti-Plasmid Vektoren und ähnlichem, gemäß zu gut bekannten Verfahren transformiert werden. Das Verfahren des Einfügens der Nukleinsäure in die pflanzliche Zelle ist für diese Erfindung nicht entscheidend.
Die Verfahren dieser Erfindung können in planta oder Samen Transformationsverfahren verwendet werden, die keine Züchtung oder Regenration erfordern. Beispiele dieser Verfahren sind in Bechthold, N., et al. (1993) CR Acad. Sci. Paris/Life Sciences 316: 118–93; Chang, S. S., et al. (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidospis Research, Vienna, p. 28; Feldmann, K. A. and Marks, D. M. (1987) Mol. Gen. Genet. 208: 1–9; Ledoux, L., et al. (1985) Arabidopsis Inf. Serv. 22: 1–11; Feldmann, K. A. (1992) in: Methods in Arabidopsis Research (Eds. Koncz, C., Chua, n-H, Schell, J.) pp. 274–289; Chee, et al., US Patent Seriennummer 5,376,543 beschrieben.
Der transkriptionelle Initierungsbereich kann für eine konstitutive Expression oder regulierte Expression vorgesehen sein. Zusätzlich zu dem ERA1 Promotor sind viele Promotoren verfügbar, die in Pflanzen funktionell sind.
Konstitutive Promotoren zur pflanzlichen Genexpression schließen die Octopin-Synthase, Nopalin-Synthase, oder Mannopin-Synthase Promotoren von Agrobakterium, den Blumenkohl Mosaikvirus (35S) Promotor, den Braunwurz Mosaikvirus (FMV) Promotor und den Tabak Mosaikvirus (TMV) Promotor ein sind aber nicht darauf beschränkt. Eine konstitutive Genexpression in Pfalnzen kann ebenso durch den Glutamin Synthase Promotor (Edwards, et al. (1990) PNAS 87: 3459–3463), den Mais Sucrose Synthase 1 Promotor (Yang, et al. (1990) PNAS 87: 4144–4148) den Promotor des Rol-C Gens der TLDNA des Ri-Plasmids (Sagaya, et al. (1989) Plant Cell Physiol. 30: 649–654) und den Phloem-spezifischen Bereich des pRVC-S-3A Promotors (Aoyagi, et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 213: 179–185) bereitgestellt werden.
Hitzeschock-Promotoren, der Ribulose-1,6-biphosphat (RUBP) Carboxylase kleine Untereinheit (ssu) Promotor, Gewebe-spezifische Promotoren und ähnliches können zur regulierten Expression pflanzlicher Gene verwendet werden. Entwicklungsmäßig-regulierte, Beanspruchungs-induzierte, Verletzungs-induzierte oder Phatogen-induzierte Promotoren sind ebenso nützlich.
Der Regulatorbereich kann auf einen physischen Reiz, wie beispielweise Licht, wie beim RUBP Carboxylase ssu Promotor, Differenzierungssignale oder Metabolite, reagieren. Die Zeit und das Niveau der Expression der Sense und Antisense Orientierung können eine bestimmte Auswirkung auf den erzeugten Phänotypen haben. Die gewählten Promotoren, verbunden mit der Orientierung der exogenen DNA und der Integrationsstelle eines Vektors ins Genom werden daher die Auswirkung des eingefügten Gens bestimmen.
Spezifische Beispiele regulierter Promotoren können ebenso die Niedrigtemperatur Kin1 und cor6.6 Promotoren (Wang, et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 605; Wang, et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 619–634), den ABA induzierbaren Promotor (Marcotte Jr.; et al. (1989) Plant Cell 1: 969–976), Hitzeschock-Promotoren, wie der induzierbare hsp70 Hitzeschock Promotor aus Drosophila melanogaster (Freeling, M., et al. (1985) Ann. Rev. Of Genetics 19: 297–323), der Kälte induzierbare Promotor von B. napus (White, T. C., et al. (1994) Plant-Physiol. 106: 917), der Alkohol Dehydrogenase Promotor, der durch Ethanol induziert wird (Nagao, R. T., et al., Miflin, B. J., Ed. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, p. 384–438, Oxford Univerity Press, Oxford 1986), der Ploem-spezifische Synthase ASUS1 Promotor aus Arabidopsis (Martin, et al. (1993) Plant J. 4: 367–377), der ACS1 Promotor (Rodrigues-Pousada, et al. (1993) Plant Cell 5: 897–911), der 22 kDa Zein Protein Promoter aus Mais (Unger, et al. (1993) Plant Cell 5: 831–841), the ps1 Lectin Promoter der Erbse (de Pater, et al. (1993) Plant Cell 5: 877–886), der phas Promoter aus Phaseolus vulgaris (Frisch, et al. (1995) Plant J. 7: 503–512), the lea promoter (Thomas, T. L. (1993) Plant Cell 5: 1401–1410), der E8 Gen Promotor aus der Tomate (Cordes, et al. (1989) Plant Cell 1: 1025–1034), der PCNA Promotor (Kosugi, et al. (1995) Plant J. 7: 877–886), der NTP303 Promotor (Weterings, et al. (1995) Plant J. 8: 5563), der OSEM Promotor (Hattori, et al. (1995) Plant J. 7: 913–925), der ADP GP Promotor aus der Kartoffel (Muller-Rober, et al. (1994) Plant Cell 6: 601–604), der Myb Promotor aus Gerste (Wissenbach, et al. (1993) Plant J. 4: 411–422) und der Plastocyanin Promotor aus Arabidopsis (Vorst, et al. (1993) Plant J. 4: 933–945).
Der Vektor kann mit einem für den Typ der Wirtszelle geeigneten Verfahren in Zellen eingefügt werden (beispielsweise Transformation, Elektroporation, Transfection). Zum Zwecke dieser Offenbarung beziehen sich die Ausdrücke "transformiert mit", "Transformante", "Transformation", "transfizieren mit" und "Transfektion" alle auf das Einfügen einer Nukleinsäure in eine Zelle mittels einer der zahlreichen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Transformation prokaryotischer Zellen wird beispielsweise im Allgemeinen durch Behandlung der Zellen mit Calciumchlorid erreicht, um sie so "kompetent " zur Aufnahme exogener DNA zu machen und anschließend solche DNA mit den kompetenten Zellen zu mischen. Prokaryotische Zellen können ebenso mit einem rekombinanten Bakteriophagenvektor infiziert werden.
Nukleinsäuren können iz Zellen höherer Organismen durch virale Infektion, Bakterien-Vermittelte Übertragung (beispielsweise das Agrobakterium T-DNA Liefersystem), Elektroporation, Calcium-Phosphat Ko-Ausfällung, Mikroinjektion, Lipofektion, Beschuss mit Nukleinsäure-Beschichteten Teilchen oder anderen Verfahren, die von dem jeweiligen Zelltyp abhängen, eingefügt werden. Für Gräser wie Getreide und Sorghum kann ein Mikroprojektil-Beschuss wie beschrieben, siehe beispielsweise Sanford, J. C., et al., US 5,100,792 (1992), verwendet werden. Andere nützliche Protokolle zur Transformation von pflanzlichen Zellen werden in Gelvin et al., 1992 bereitgestellt. Geeignete Protokolle zur Transformation und Transfektion von Zellen werden ebenso in Sambrook et al., 1989 gefunden. Die Nukleinsäure-Konstrukte dieser Erfindung können ebenso in spezifische pflanzliche Teile, wie den vorstehend beschriebenen, durch die hierin beschriebenen Transformations- und Transfektions-Verfahren eingefügt werden.
Die Konstrukte können weiter so gehandhabt werden, dass sie für pflanzlich selektierbare Marker kodierende Gene enthalten, um bei der Bestimmung transformierter pflanzlicher Zellen zu helfen. Nützliche selektierbare Marker beinhalten Enzyme, die eine Resistenz für ein Antibiotikum, wie beispielsweise Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin und ähnliches bereitstellen. Ähnlich dazu sind Enzyme nützlich, die zur Herstellung einer Verbindung bereitstellen, die durch eine Farbänderung wie beispielsweise GUS (β-Glucuronidase), oder durch Lumineszenz, wie Luziferase, erkannt werden kann.
Beispielsweise kann Antisense Ftase durch Integration eines Komplementären des ERA1 Gens verbunden mit DNA, umfassend SEQ ID NO: 3, in das Genom eines Virus hergestellt werden, der in die Wirtszellen eindringt. Durch Infektion der Wirtszellen, der Bestandteile eines Systems das die Transkription der in den Wirtszellen vorliegenden Antisense ermöglicht.
Wenn Zellen oder Protoplasten, die das durch einen Promotor der vorliegenden Erfindung gesteuerte Antisense Gen enthalten, erhalten werden, werden die Zellen oder Protoplasten zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die transformierten Zellen werden anschließend bei zur Regenration von Pflanzen geeigneten Bedingungen gezüchtet, was zur Herstellung von transgenen Pflanzen führt. Die Wahl der Methodik für den Regenerierungsschritt ist nicht mit geeigneten Protokollen entscheidend, die für viele Arten von Pflanzen, Geweben und anderen photosynthetischen Organismen verfügbar sind. Siehe beispielsweise Gelvin S. B. and Schilperoort R. A., Eds. Plant Molecular Biology Manual, Second Edition, Suppl. 1 (1995) Kluwer Academic Publishers, Boston MA, U.S.A.
Das Konstrukt tragende transgene Pflanzen wurden auf den gewünschten Phänotyp hin unter Verwendung mehrerer Verfahren untersucht, die einen geeigneten phänotypischen Marker, wie beispielsweise wie vorstehend Antibiotikaresistenz oder Herbizidresistenz, oder die visuelle Beobachtung ihres Wachstums im Vergleich zum Wachstum der natürlich vorkommenden Pflanzen bei den gleichen Bedingungen, einschließen aber nicht darauf beschränkt sind.
Wie hierin verwendet beinhaltet der Ausdruck transgene Pflanzen Pflanzen, die entweder DNA oder RNA enthalten, die nicht natürlich in der Wildtyp (nativen) Pflanze oder bekannten Varianten, oder zusätzlichen oder verkehrten Kopien der natürlich auftretenden DNA vorkommt und die wie hierin beschrieben eingefügt wird. Transgene Pflanzen beinhalten jene, in denen isolierte Nukleinsäuren und ihre Abkömmlinge eingefügt wurden, hergestellt aus Samen, vegetativer Propagierung, Zell, Gewebe oder Protoplasten Kultur oder ähnlichem, worin eine derartige Änderung aufrechterhalten wird.
Derartige transgene Pflanzen beinhalten in einer Ausführungsform transgene Pflanzen, die Angiosperm, sowohl Monocotyledon und Dicotyledon, sind. Transgene Pflanzen beinhalten jene, in die DNA eingefügt wurde, und ihre Nachkommen, die aus Samen, vegetativer Propagierung, Zell, Gewebe oder Protoplasten Kultur oder ähnlichem hergestellt wurden.
Samen können von der regenerierten Pflanze oder durch eine Kreuzung zwischen der regenerierten Pflanze und einer geeigneten Pflanze der gleichen Spezies erhalten werden. Alternativ dazu kann die Pflanze durch gezüchtete pflanzliche Teile vegetativ propagiert werden, die für die Regenerierung solcher pflanzlicher Teile geeignet sind.
Die Erfindung kann verwendet werden, um ein pflanzliche Gewebekultur und Protoplasten bereitzustellen, die DNA enthalten, die eine Antisense oder eine geänderte ERA1 Nukleinsäure wirksam mit einem Promotor verbunden umfassen, der die Reaktion der Gewebekultur oder Protoplasten auf wechselnde Umweltbedingungen ändert.
Die Verfahren dieser Erfindung können ebenso mit in planta oder Samen Transformationsverfahren verwendet werden, die keine Züchtung oder Regenerierung erfordern. Beispiele dieser Verfahren sind in Bechtold, N., et al. (1993) CR Acad. Sci. Paris/Life Sciences 316: 118–93; Chang, S. S., et al. (1990) Abstracts of the Fourth International Conference on Arabidopsis Research, Vienna, p. 28; Feldmann, K. A. and Marks, D. M (1987) Mol. Gen. Genet. 208: 1–9; Ledoux, L., et al. (1985) Arabidopsis Inf. Serv. 22: 1–11; Feldmann, K. A. (1992) In: Methods in Arabidopsis Research (Eds. Koncz, C., Chua, N-H, Schell, J.) pp. 274–289; Chee, et al., US Patent, Seriennummer 5,376,543 beschrieben.
Die Konstrukte und Verfahren dieser Erfindung weisen zahlreiche Anwendung von kommerziellem Wert, insbesondere bei der Verhinderung der Austrocknung von pflanzlichen Geweben bei Zeiten von Wasser-Beanspruchung, auf. Die genetische Manipulation von Kulturpflanzen, die Inhibitoren der Ftase oder Inaktivierung des die exogene pflanzliche Ftase kodierenden Gens beinhalten, würde es solchen Pflanzen ermöglichen vorübergehender umweltbedingter Beanspruchung zu widerstehen und kann die Umgebungen erweitern, wo diese Pflanzen gezüchtet werden können. Eine Verbesserung der Toleranz von Kulturpflanzen gegenüber Kälte, Salz und Trockenheit-Beanspruchung kann daher die Pflanzenausbeute unter solchen ungünstigen Bedingungen verbessern.
Die hierin beschriebene Technologie kann ebenso zur Änderung der Erntezeit und der Erntequalität von Pflanzen verwendet werden. Beispielsweise könnte die Überexpression von Ftase zu schnelleren Trocknungszeiten von Kulturen, wie Getreide und anderen Gräsern, führen. Das Trocknen von Getreide beinhaltet die Verwendung großer Mengen an Propangas. Trockungszeiten von Getreide wie Heu, das normalerweise auf den Feldern trocknet, könnten verkürzt werden und die Wahrscheinlichkeit verringern, das Regen das Getreide verderben könnte.
Die Inhibierung der Farnesylierung in Pflanzen kann zusätzlich zur Steuerung des Alterungsfortschritts der Pflanzen verwendet werden, so dass Blätter länger in einem grünen Zustand und Früchte unreif gehalten werden können. Falls beispielsweise ein Antisense Konstrukt des ERA1 oder CaaX Box Inhibitor Protein Konstrukts unter die Kontrolle eines Alterungsinduzierten Promotors gestellt wurde, würde die Pflanze einen Farnesylierungsinhibitor induzieren, wenn der Alterungsfortschritt ausgelöst wurde, was wiederum die Alterung inhibieren würde. Das Ergebnis würde eine Pflanze sein, die grün bleibt, oder Früchte, die unreif bleiben. Die Pflanze könnte daher viel länger bei der Herstellung eines Produkts, wie eines vegetativen Teils, Blume oder Frucht, gehalten werden. Gartenbauern könnten daher Pflanzen herstellen, die grün verbleiben und weiterhin wachsen, selbst wenn eine Wildtyp Pflanze derselben Art unter den gleichen Bedingungen altern würde. Schnittblumen könnten länger gehalten werden. Oder eine Frucht könnte unreif gehalten werden, ein wichtiges Produkt für die Gemüseindustrie, wo die Herstellungs-Standzeit zum Markt von höchster Wichtigkeit ist.
Die Inhibierung der Ftase in Früchten und Gemüse kann weiterhin das Welken verringern. Das Welken des Produkts könnte daher während der Beförderung oder des Versands verringert werden. Früchte und Gemüse im Regal des Lebensmittelladens würden ebenso weniger Befeuchten benötigen, um sie frisch und aromatisch zu erhalten, und es würde ein geringer Bedarf darin bestehen, Produkte wie Gurken, Äpfel und Orangen zu wachsen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen.
Eine geringere Bewässerung würde ebenso bedeuten, dass ein Befall der Früchte von Pilzen oder Bakterien verringert sein würde. Beispielsweise könnten pflanzliche Erkrankungen auf dem Feld inhibiert werden, die vom Versprühen von Pflanzenpathogenen von dem Boden zu den Blättern und Früchte der Pflanze herrühren.
Im Gebiet des Gartenbaus könnten viele trockenheitsresistente Arten für den Landschaftsbau und zur Verwendung als häusliche Zierdepflanzen hergestellt werden. Von besonderem Wert würden Pflanzenarten sein, die zum Eintopfen in oder außerhalb von Häusern und Büros zur Zierde verwendet werden, und die seltenes Gießen überleben können. Dies würde insbesondere während der trockenen Sommermonate eine beträchtliche Wohltat für Gärtner sein, in denen vergessene Pflanzen schnell unter der Sonne austrocknen. Pflanzen, die unter Bäumen und an anderen schattigen Stellen wachsen, erfahren häufig Trockenheitsbedingungen und begrenztes Licht. Die hierin bereitgestellte Technology kann Pflanzenarten bereitstellen, die besser unter diesen Bedingungen überleben können.
Gartenbauern könnten viele Verwendungszwecke für Pflanzen finden, bei denen seitliche Verzweigung und/oder die Blumenzahlen mittels Licht/Dunkelheits-Zyklen reguliert werden können. Beispiele von Pflanzen bei denen längere, unverzweigte Stiele einen absatzfähigen Vorteil verleihen, beinhalten Rosen, Nelken, Lilien und ähnliches. Die Fähigkeit die Zahl an Blumen oder Blümchen auf der Pflanze zu steigern ist ebenso ein Posten von hohem Wert. Diese Charakteristika könnten ebenso für viele landwirtschaftliche Früchteverwendet werden, dadurch dass Ausbeuten auf eine Art gesteigert werden können, die ebenso eine Ernte der Frucht erleichtert.
Ein anderer Vorteil der hierin bereitgestellten Konstrukte und Verfahren besteht darin, dass der ERA1 Promotor in den Schließzellen der Blätter aktiv ist. Ein Abschnitt des ERA1 Gen Promotors kann an Antisense Nukleinsäure an das ERA1 Gen fusioniert werden, so dass die Ftase Aktivität ausschließlich in den Schließzellen verringert ist.
Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung des trockenheitsresistenten Charakteristikums als ein selektierbarer Marker der Transformation in Pflanzen, pflanzlichen Zellen und pflanzlichem Gewebe. Ein Verfahren zum Nachweisen der Transformation in Pflanzen besteht aus: (a) Einbringen eines Nukleinsäurekonstrukts, das einen an eine Nukleinsäure wirksam verbundenen Promotor umfasst, die eine Antisense zu SEQ ID NO: 1 oder Nukleinsäure umfasst, die eine funktionelle Entsprechung der Antisense umfasst; (b) Einfügen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, pflanzliche Zelle oder pflanzliches Gewebe; (c) Wachsen der Pflanze, oder Regenerieren einer Pflanze aus der pflanzlichen Zelle oder dem pflanzlichen Gewebe bis zur Bildung von Stomata; und (d) Plazieren der Pflanze oder generierten Pflanze zu Bedingungen, worin die Pflanze durch Trockenheit beansprucht wird, worin ein Überleben der Pflanze unter Trockenheitsbedingungen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen ein Transformation anzeigt. Diese Technologie kann daher als ein selektierbarer Marker verwendet werden, d. h. als ein visueller Marker, insbesondere wenn mit pflanzlicher Selektion und Transformation Schemen zusammengefasst.
Zusätzlich kann ohne Beanspruchung einer transgenen Pflanze, die Verzweigungsund/oder Blühen-Wuchsformen von Pflanzen mit Verlust an Ftase Funktion sich wesentlich von dem der Wildtyp Pflanzen unterscheiden und als ein Marker für eine erfolgreiche Transformation verwendet werden. Dieses Verfahren würde insbesondere dort von Nutzen sein, wo in planta Transformationstechniken angewendet wurden. Bei Tageslicht-Bedingungen werden Triebe transgener Pflanzen ein geringeres seitliches Verzweigen als nicht-transformierter Triebe zeigen und daher einen tatsächlichen Verlust an Ftase Aktivität ohne die Verwendung selektiver Antibiotika-Marker zeigen.
Beispiel 1: Mutagenese Bedingungen
In dieser Studie verwendete Arabidopsis Pflanzen wurden bei ständigem Licht in Baden oder Agar enthaltenden Petrischalen gezüchtet, wie bereits anderweit beschrieben (Haughn and Somerville 1986). Es wurden zwei verschiedene Wildtypen von Arabidopsis verwendet: Meyerowitz's Colombia (Col) (Lelhe Seeds, Dripping Springs, TX und Wassilewskija (Ws) (ABRC, Ohio State University). Mutanten, die durch das Durchmustern T-DNA mutagenisierter Samen isoliert wurden, lagen im Wassilewskija Hintergrund vor. Diese wurden von der Ohio Staat Arabidopsis Samenbestandssammlung (ABRC Bestandsnummern CS2606–2654) erhalten. Die T-DNA Samensammlung umfasste 49 Pools von 1200 vierter Generation (T4) Abkömmlinge, die von 100 mutagenisierten Vorgängern abstammen. Ein mutagenisierter Vorgänger wurde durch die Übernacht-Inkubation von Wildtyp Samen (T1) in einer gesättigten Agrobakterium Kultur, die ein T-DNA Plasmid enthält. Die Samen wurden in Wasser gewaschen und in Töpfe gepflanzt. T2 Generationssamen wurden von jeder Pflanze erhalten und auf Kanamycinresistenz (die auf der T-DNA enthalten ist) untersucht. Kanamycinresistente Pflanzen wurden zur T3 Generation befördert. T4 Generationspflanzen wurden dem Bestandszentrum überlassen. Jeder Pool wurde getrennt durchmustert.
Mutanten, die durch das Durchmustern schneller Neutronen bestrahlter Samen isoliert wurden, lagen im Meyerowitz Columbia Hintergrund vor. Mutagenisierte Wildtyp Samen (N1) wurden mit 60 Gy schneller Neutronen bestrahlt und zur nächsten Generation gezüchtet. Die N2 Samen wurden als Poole von näherungsweise 11.000 Samen erhalten, die von 1387 N1 Vorgängern erzeugt wurden. Zehn dieser Polle wurden getrennt auf ABA Überempfindlichkeits-Mutationen durchmustert. Bei der anfänglichen Durchmusterung wurden die Samen bei 4°C gelagert und ohne Imbibition ausplattiert. Für alle folgenden erneuten Durchmusterungen wurden die Samen bei 4°C eine Woche auf 0,3 μM ABA imbibiert und auf das Auskommen von Cotyledon nach 5–7 Tagen bei 22°C im Licht bewertet.
Beispiel 2: Genetische Analyse
Mutantenlinien wurden zu Wildtypen dreimal rückgekreuzt. T-Mutationen wurden zu Ws und schnelle Neutronen Mutanten zu MCol rückgekreuzt. Der Segregation der era Phänotypen folgte das Plattieren der F2 Samen auf sowohl 0,3 μM ABA und Imbibition für vier Tage bei 4°C. Nach der Imbibition wurden die Platten zu Raumtemperatur bei Licht versetzt. Die Keimung wurde als das Vorliegen oder die Abwesenheit von ausgedehnten Cotyledons in Keimlingen eine Woche nach Imbibition bestimmt. Doppelmutanten wurden Kreuzung von für jede Mutation homozygoten Linien konstruiert, gefolgt von Segregation und Bestimmung von Linien, die einen der Mutanten-Phänotypen trugen. Das in dieser Studie verwendete abi3 Allel ist abi3-6 (Nambara et al., 1994) und abi1 is abi1-1 (Koornneef et al., 1982). Das era1-2 Allel wurde als der era Vorgänger verwendet. Eine Segregationsanalyse legte eine teilweise suprimierte era1 nahe. Die Unempfindlichkeit von ab1 auf F2 Pflanzen wurde zuerst auf Unempfindlichkeit auf 3 mM ABA durchmustert und F3 Samen dieser Pflanzen wurden nach Empfindlichkeit gegen 0,3 μM ABA bewertet. Wahrscheinliche Doppelmutanten wurden in der T4 Generation auf Abkömmlinge untersucht und durch DNA Polymorphismen auf sowohl Abi1 und Era1 verifiziert. Für era1 abi3 Doppelmutanten wurden F2 Samen nach Unempfindlichkeit (3 μM ABA) durchmustert und reife Pflanzen wurden auf vorragende Karpelle und unreife grüne Samen (Nambara et al., 1994) bewertet. Wahrscheinliche Doppelmutanten Linien wurden durch DNA Polymorphismen für sowohl Abi3 und ERA1 verifiziert.
Beispiel 3: DNA und RNA Analyse
Die Verfahren zur DNA (Dellaporta et al., 1983) und RNA (Verwoerd et al., 1989) Extraktion waren wie beschrieben. Hochstringente Southerns wurden bei 65°C wie anderweitig beschrieben (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Die gesamte Durchmusterung der genomischen und cDNA Bibliotheken wurde auf Gelman BioTrace NT Membranen gemäß den Herstellerangaben (Gelman Sciences) durchgeführt. Um Insertionsverbindungen zwischen T-DNA und genomischer in der T12W Mutante (era1-1) zu klonieren, wurde eine Bibliothek aus T12W DNA in γ-ZAPII (Stratagene) hergestellt. Genomische Southern Blots von T12W DNA, verdaut mit EcoR1 und mit einer Sonde mit rechtem Rand (right border, RB) versehen, erzeugten drei Banden (13 kb, 7,0 kb und 8,0 kb). Nachfolgende Analyse mit anderen Restriktionsenzymen verifizierte die 7 und 8 kb Banden als die Insertionspunkte der T-DNA und angrenzenden pflanzlichen DNA enthaltend. Diese Fragmente wurden durch Verdauen genomischer DNA mit EcoR1 kloniert und die DNA wurde unter Verwendung eines Prep Cell (Pharmacia) fraktioniert. Fraktionen, die die 7 und 8 kb Fragmente enthielten, wurden mittels Southern Analyse gepoolter Fraktionen unter Verwendung des RB als Sonde bestimmt. Diese Poole wurden an die γ-ZAPII Arme gemäß den Herstellerangaben (Stratagene) ligiert. Eine Bibliothek von 40.000 Rekombinanten wurde durchmustert. Fünf positive Plaques wurden bestimmt und ausgeschnittenes Plasmid, aus den klonierten Inserts gebildet, wurde gemäß den Herstellerangaben (Stratagene) isoliert. Zwei Plasmide, als pL4B und pL7 bezeichnet, die an die RB Sonde hybridisieren wurden weiter charakterisiert. Unter Verwendung von pBluescript wurde ein 2,3 kB EcoRI BamHI Fragment aus p4LB subkloniert und mit pSC10 bezeichnet und ein 1,3 kB HindIII BamHI Fragment aus pL7 wurde subkloniert und mit pSC11 bezeichnet. Diese beiden Plasmide enthalten näherungsweise 1,2 kb T-DNA, die sich an die angrenzende pflanzliche genomische DNA anschließt. pSC10 wurde als eine Sonde zum Durchmustern einer Arabidopsis cDNA Bibliothek, PRL2 1-ZipLox (ABRC, Bestand CD4-7) verwendet. Fünf positive cDNA wurden bestimmt und das längste cDNA Insert, pZL23, wurde zur Durchmusterung eines zusätzlichen 200.000 PRL2 Phagen verwendet. Von dieser Durchmusterung wurde ein längeres cDNA Insert, pZL51, (1,35 kb) isoliert. Diese Klone wurden sequenziert und zur Durchmusterung von 30.000 γ-ZAPII Plaques verwendet, die durch teilweise verdaute EcoR1 Wildtyp Columbia genomische DNA hergestellt wurden. Die Konstruktion dieser Bibliothek war wie vorstehend beschrieben, mit Ausnahme eine Fraktionierung der verdauten DNA. Vier positive Klone wurden bestimmt. Die Inserts wurden ausgeschnitten und ein 6 kB Bereich, der den pZL51 Klon umfasst, wurde vollständig sequenziert. Dieses genomische Insert und ein 14 kb genomisches Insert, das aus einer 1-FIX Lansberg erecta genomischen Bibliothek mittels ähnlicher Verfahren (ABRC, Bestand CD4-8) isoliert wurde, wurden als Sonden verwendet, um Deletionen in den schnellen Neutronen Mutanten (era1-2, era1-3) auszumessen.
Beispiel 4: Protein Farnesyltransferase Assay
Farnesyltransferase (Ftase) Assays wurden unter Verwendung zellfreier Extrakte von Wildtyp und Mutanten Pflanzen als der Ftase Quelle und synthetischen Heptapeptiden als Reaktionssubstrat durchgeführt. Peptide wurden von Genemed Biotechnologies, Inc. erworben. Die geeigneten Sequenzen für die Peptide beruhten auf den Daten von Randall et al. (1993); diese waren GGCCAIM(-CAIM) und GGCCAIL(-CAIL). Lösungen der Peptide wurden in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO), enthaltend 10 mM Dithiotreitol (DTT) und verdünnt in 10 mMDTT in der Abwesenheit von DMSO, hergestellt. Die Quelle der Ftase für Transferaseassays waren lösliche Proteinextrakte aus den Knospen drei Wochen alter Pflanzen. Für beide Wildtyp und Mutanten Pflanze wurden 1 g (Frischgewicht (fresh weight)) Knospen gesammelt und in einem Puffer homogenisiert, der 50 mM Hepes (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 5 mM DTT, 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Aprotinin, and 1 mM PMSF enthält. Zelltrümmer und Membranen wurden durch Zentrifugation bei 4°C bei 10.000 g für 10 Min. und 100.040 g für 30 Min. entfernt. Der Überstand wurde aufbewahrt und eine Quantifizierung des gesamten löslichen Proteins wurde gemäß Bradford (1976) vorgenommen. Lösliche Extrakte wurden bei 30°C mit einem Peptidsubstrat und ³H-Farnesylpyrosphat (Amersham) für 40 Min. inkubiert. Jede Reaktionsmischung enthielt die folgenden Bestandteile in einem Endvolumen von 25 μl: 50 mM Hepes (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 50 μM Peptid, 0.5 μM [³H]FPP, and 100 μg löslichen Proteinextrakt. Als eine Kontrolle enthielt eine Reaktion lösliche Extrakte, die 5 Min. gekocht wurden. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 50 mM beendet und anschließend auf Silica Gel 60 Dünnschicht-Chromatographieplatten (Millipore) gespottet. Die Platten wurden mit n-Propanol-Wasser (7 : 3 v/v) für 4–5 h entwickelt. Die Platten wurden getrocknet, mit En³Hance (New England Nuclear) besprüht und einem Kodak X-OMAT AR Film bei –70°C für 4 Tage ausgesetzt.
Beispiel 5: ERA1-GUS Gen Konstrukte und transgene Pflanzen
ERA1-GUS Fusionskonstrukte wurden durch Einfügen eines 5 kb EcoR1-HindIII Genomfragments des ERA1 Promotors in das promotorenlose GUS T-DNA Plasmid (pBI121) hergestellt. Dieses Konstrukt wurde in den Agrobakterium Stamm LB4404 transformiert. Das Agrobakterium wurde gezüchtet (0,8 OD Einheiten, 595 nm) und anschließend gründlich in Wasser gewaschen, die Zellen wurden in 10% Glycerol resuspendiert und anschließend in einem Elektroporator bei 200 Ohm, 25 μF und 2,5 kVolt gepulst. Die Zellen wurden anschließend auf LB Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert und für 2 Tage bei 28°C gezüchtet. Ampicillinresistente Transformanten wurden in nachfolgenden pflanzlichen Transformationsexperimenten verwendet. Die transgenen Pflanzen wurden durch Vakuum infiltrierende (vacuum infiltrating) Pflanzen mit einer gesättigten Agrobakterium Kultur (0,8 OD Einheiten, 595 nm) hergestellt. Wildtyp Pflanzen wurden unter gewöhnlichen Laborbedingungen (25°C, 150 μE m^–2 sec^–1, Feuchtigkeit, andauerndes Licht) gezüchtet bis sie ihre ersten vorzeitigen Samen (bolts) nach näherungsweise 5 Wochen erzeugten. Die Stiele wurden entfernt und die Pflanzen wurden in Lösung von Agrobakterium unter Wasser gehalten und unter Vakuum (20 mBar) für 5 Min. platziert. Nach Unterbrechung des Vakuums wurden die Pflanzen auf Boden übertragen und es ihnen ermöglicht sich unter gewöhnlichen Laborbedingungen zu erholen. Die Pflanzen erzeugten neue Blumen und Samen, der nach 2 Monaten geerntet wurde und dem es ermöglicht wurde 2 Wochen zu trocknen. Samen von einzelnen Pflanzen wurden in Minimalmedium MS Platten gepflanzt, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten. Grüne Kanamycinresistente Pflänzchen wurden bestimmt und nach 2 Wochen auf Boden überführt und es ihnen ermöglicht für Saatgut zu wachsen. Diese Samen wurden gekeimt und die Setzlinge wurden unter Verwendung des fluoreszierenden GUS Substrats Imagene Green (Molecular Probes, Eugen, Oregon) auf GUS Aktivität untersucht. Der Assay wurde durch Suspendieren der Setzlinge in GUS-Puffer (50 mM Natriumphosphat pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 0.1% Natriumsarcosyl, 4 mM Imagene Green) für 2–4 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Setzlinge wurden direkt unter einem Mikroskop (25 ×) unter Verwendung blauen Anregungslichts für ein positives Fluoreszenzsignal betrachtet, das auf einem roten Chlorophyll-Autofluoreszierenden Hintergrund gelb ist.
Beispiel 6: Trockenheitsversuche
Sechs einzelne Wildtyp und sechs era1-2 Setzlinge wurden vier Wochen unter beständigem Licht mit beständiger Bewässerung (25°C, 150 μE m^–2 sec^–1, 70% Feuchtigkeit, beständiges Licht) gezüchtet. Die Töpfe wurden anschließend mit Aluminiumfolie bedeckt, um die Bodenverdunstung zu verzögern, und die Pflanze und der Topf wurden gewogen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Pflanzen nicht mehr bewässert und jeder Topf wurde täglich gewogen. Am Versuchende wurden die Pflanzen entfernt und es wurde den Töpfen ermöglicht weiter zwei Wochen zu trocknen und anschließend gewogen, um das Gewicht des trockenen Bodens und des Topfes zu bestimmen. Dieses Gewicht wurde von jeder Probe abgezogen.
Beispiel 7: Mit dem Alter in Beziehung stehende Änderungen bei abgelösten Blättern
Der Chlorophyllgehalt in reifen Rosettenblättern bei Wildtyp Columbia und era1-2 Mutanten wurde nach Ablösung von jenen mit Arabidopsis Pflanzen verglichen. Die Pflanzen wurden unter beständigem Licht (150 μEinstein/m² sec) und Temperatur (22°C) bis zu einem ähnlichen entwicklungsgemäßen Alter (3 Wochen anschließend Keimung) gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurden die fünften Blätter mehrerer Pflanzen entfernt, die nach der Keimung entstanden sind, und auf Minimalsalze enthaltendem 0,8% Agar in Petrischalen platziert. Die Platten wurden abgedichtet und bei 22°C unter beständigem Licht (50 μEinstein/m² sec) für 12 Tage platziert. Fotografien wurden aufgenommen und Farbvergleiche wurden bei 0, 3, 6, 9 und 12 Tagen vorgenommen.
Beispiel 8: Bestimmung von Transkriptionsniveaus ausgewählter Gene in alternden Blättern
Die Pflanzen wurden unter beständigem Licht (150 μEinstein/m² sec) und Temperatur (22°C) bis zu einem ähnlichen entwicklungsgemäßen Alter (3 Wochen anschließend Keimung) gezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt das fünfte Rosettenblatt, das anschließend an die Keimung entstanden ist, von Mutanten (era1-2) und Wildtyp Pflanzen entfernt wurde. Diese Blätter wurden auf die Expression dreier Gene (CAB, SAG12 und SAG13) mittels Northern Analyse (0, 4, 8 Tage nachdem Schossen (bolted) der Pflanzen) untersucht. Das CAB Gen kodiert das Arabidopsis Chlorophyll Bindeprotein, das bei dem Einfangen von Licht zur Photosynthese beteiligt ist. CAB wird für die grüne Blattfarbe benötigt und stellt einen guten Marker für den Chlorophyll-Durchsatz in der Pflanze dar. CAB in Wildtyp Pflanzen zeigt eine Transkriptionsniveau-Erniedrigung, sobald die Alterung induziert ist. Keine Erniedrigung des Transkriptionsniveaus wurde bei alternden Blättern der era1-2 Mutanten beobachtet. SAG12 und SAG13 sind Arabidopsis Gene, die durch differentielle Expression währen der Alterung (SAG steht für Alterungs-Aktiviertes Gen, senescence Activated Gene) kloniert wurden. Die Transkription beider Gene wird während dem Beginn Wildtyp Arabidopsis Pflanzen induziert. Es wurde bestimmt, dass diese Gene bei den gleichen entwicklungsgemäßen Bedingungen in den era1-2 Mutanten nicht induziert wurden.
Literaturnachweis

Baskin, JM and Baskin, CC (1971) Can J Bot 50: 277.
Chandler, PM and Robertson, M (1994) Gene expression regulated by abscisic acid and its relationship to stress tolerance. Ann Rev Plant Physiol and Plant Mol Biol 45: 113141.
Chen, W-J, Anders, DA, Goldstein, JL, Russell, DW, Brown, MS (1991) Cell 66: 327
Cutler, S, Ghassemian, M, Bonetta, D, Cooney, S, McCourt, P (1996) A protein farnesyl transferase involved in abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. Science 273: 12391241.
Dellaporta, S. L., Wood, J. and Hicks, J. B. (1983). A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1: 19–21.
Eisenmann, D. M. and Kim, S. K. (1994). Signal transduction and cell fate specification during Caenorhabditis elegans vulval development. Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 508–516.
Ellington, A. (1987). Preparation and Analysis of DNA. In Current Protocols in Molecular Biology F. Ausubel et al. eds. (Boston, Greene). pp 2.0.1–2.12.5.
Goodman, LE, Perou, CM, Fujiyama, A, Tamanoi, F (1988) Yeast 4: 271
Haughn, G. and Somerville C. R. (1986). Sulfonylurearesistant mutants of Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 204: 430–434.
Koornneef, M, Reuling, G and Karssen, CM (1984) The isolation and characterization of abscisic acid insensitive mutants of Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 61: 377–383.
Leung, J, Bouvier-Durand, M, Morris, P-C, Guerrier, D, Chefdor, F, and Giraudat, J (1994) Arabidopsis ABA response gene ABI1: features of a calcium-modulated protein phosphatase. Science 264: 1448–1452.
Meyer, K, Leube, MP, and Grill, E (1994) A protein phosphatase 2C involved in ABA signal transduction in Arabidopsis thaliana. Science 264: 1452–1455.
Randall, SK, Marshall, MS, Crowell, DN (1993) Protein isoprenylation in suspensioncultured tobacco cells. Plant Cell 5: 433–442.
Reid, JB, and Howell, SH (1995) The function of hormones in plant growth and development. In Plant Hormones Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. 2nd ed. P. Davies ed. (DortrechtKluwer) pp. 448–485.
Sambrook, J., E. F. Fritsch and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Schafer, WR, and Rine, J (1992) Protein Prenylation: Genes, Enzymes, Targets and Functions. Ann Rev Genet 30: 209–237.
Shirley, BW, Hanley, S, Goodman, HM (1992) Plant Cell 4: 333.
Verwoerd, T. C., Dekker, B. M. M. and Hoekema, A. (1989). A small-scale procedure for the rapid isolation of plant RNA's. Nucleic Acids Research 17: 2362.
Yang, Z, Cramer, CL, and Watson, JC (1993) Protein farnesyl transferase in plants. Plant Physiology 101: 667–674.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer gegenüber Trockenheit toleranten Pflanze, umfassend: a) Bereitstellen eines Nukleinsäurekonstrukts, das einen Promotor umfasst, der mit einer Antisense-Nukleinsäure einer Nukleinsäuresequenz wirksam verbunden ist, die eine Beta-Untereinheit eines Farnesyltransferasepolypeptids kodiert; b) Einbauen des Nukleinsäurekonstrukts in einen Vektor; c) Transformieren einer Pflanze, einer Gewebekultur oder einer Pflanzenzelle mit dem Vektor; und d) Züchten der Pflanze oder Regenerieren einer Pflanze aus der Gewebekultur oder der Pflanzenzelle, wobei eine gegenüber Trockenheit tolerante Pflanze hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Antisense-Nukleinsäure 25 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleinsäuren umfasst, die zu der in 1 gezeigten SEQ ID Nr. 1 identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein Schließzellen spezifischer Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Promotor der era-1 Promotor ist, der die in 3 gezeigte SEQ ID Nr. 3 aufweist.
Transgene, gegenüber Trockenheit tolerante Pflanze, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhältlich ist.
Transgener Samen, der durch die transgene Pflanze von Anspruch 5 erhältlich ist, wobei der Samen eine gegenüber Trockenheit tolerante Pflanze erzeugt.