JP6719174B2 - 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 - Google Patents
特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 Download PDFInfo
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- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/03—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing C=C bonds (5.3.3)
- C12Y503/03002—Isopentenyl-diphosphate DELTA-isomerase (5.3.3.2)
Description
天然ゴムは、パラゴムノキやインドゴムノキなどの特定のイソプレノイド産出植物の乳管で生産される乳液から得られるものであることから、乳液の生産性を向上させて天然ゴムの生産量を向上させることを目的として、遺伝子組換え技術の開発が検討されているが、未だ改善の余地があった。
[A1]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列からなるDNA
[A2]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[A3]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[B1]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列からなるDNA
[B2]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[B3]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[C1]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列からなるDNA
[C2]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[C3]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D1]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列からなるDNA
[D2]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D3]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D4]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列からなるDNA
[D5]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D6]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D7]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列からなるDNA
[D8]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D9]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D10]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列からなるDNA
[D11]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D12]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[E1]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列からなるDNA
[E2]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[E3]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F1]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列からなるDNA
[F2]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F3]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F4]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列からなるDNA
[F5]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F6]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[G1]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列からなるDNA
[G2]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[G3]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[H1]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列からなるDNA
[H2]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[H3]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するRubber Elongation Factor(REF)をコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能となる。これは、乳液の生産性向上のために導入した外来遺伝子の発現が乳管以外の部位で促進されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷がかかり、悪影響を及ぼすためと推測される。
上記REFをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産出植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、グアユール、ロシアンタンポポ、セイタカアワダチソウ、ノゲシ、レタス、又はヒマワリ由来であることが更に好ましい。特に好ましくは、パラゴムノキ由来である。
なお、本明細書において、ポリイソプレノイド産出植物とは、ポリイソプレノイドを産出可能な植物を意味し、その具体例は後述する。
[A1]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列からなるDNA
[A2]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[A3]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
上記ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子は、ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、cis−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Small Rubber Particle Proteinをコードする遺伝子、及び、Rubber Elongation Factorをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子であることが好ましい。なかでも、ポリイソプレノイドの生産量をより向上させることができることから、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、cis−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、Small Rubber Particle Proteinをコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子がより好ましく、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼをコードする遺伝子、又は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子が更に好ましく、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼをコードする遺伝子が特に好ましい。
また、本明細書において、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPS)は、イソペンテニル二リン酸(IPP)、ジメチルアリル二リン酸(DMAPP)、ゲラニル二リン酸(GPP)及びファルネシル二リン酸(FPP)を基質としてゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)の生合成反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ(IPPイソメラーゼ、IPI)は、イソペンテニル二リン酸(IPP)と、その異性体であるジメチルアリル二リン酸(DMAPP)の間の異性化反応を触媒する酵素である。
また、本明細書において、cis−プレニルトランスフェラーゼ(cis型プレニルトランスフェラーゼ、CPT)は、イソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素である。ここで、本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位(C5H8)を有する化合物を意味する。また、cis型イソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり、例えばcis−ファルネシル二リン酸、ウンデカプレニル二リン酸、天然ゴムなどが挙げられる。
また、本明細書において、Small Rubber Particle Protein(SRPP)は、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のポリイソプレノイド産出植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
また、本明細書において、Rubber Elongation Factor(REF)は、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のポリイソプレノイド産出植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
上記ファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼをコードする遺伝子、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子、cis−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、Small Rubber Particle Proteinをコードする遺伝子、Rubber Elongation Factorをコードする遺伝子は、いずれもその由来は特に制限されず、植物由来であることが好ましく、ポリイソプレノイド産出植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、グアユール、ロシアンタンポポ、セイタカアワダチソウ、ノゲシ、レタス、又はヒマワリ由来であることが更に好ましい。特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[B1]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列からなるDNA
[B2]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[B3]配列番号2で表される塩基番号1−1029の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[C1]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列からなるDNA
[C2]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[C3]配列番号4で表される塩基番号1−1113の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D1]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列からなるDNA
[D2]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D3]配列番号6で表される塩基番号1−1728の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D4]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列からなるDNA
[D5]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D6]配列番号7で表される塩基番号1−1761の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D7]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列からなるDNA
[D8]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D9]配列番号8で表される塩基番号1−1821の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D10]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列からなるDNA
[D11]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[D12]配列番号9で表される塩基番号1−1581の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[E1]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列からなるDNA
[E2]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[E3]配列番号14で表される塩基番号1−705の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F1]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列からなるDNA
[F2]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F3]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F4]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列からなるDNA
[F5]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F6]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[G1]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列からなるDNA
[G2]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[G3]配列番号18で表される塩基番号1−615の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[H1]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列からなるDNA
[H2]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
[H3]配列番号61で表される塩基番号1−417の塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質をコードするDNA
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したcDNAを鋳型にしてRT−PCRを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
上記ファルネシル二リン酸シンターゼの具体例としては、下記[b1]が挙げられる。該[b1]で表される蛋白質は、上記[B1]で表されるDNAにコードされている蛋白質である。
[b1]配列番号3で表されるアミノ酸番号1−342のアミノ酸配列からなる蛋白質
[c1]配列番号5で表されるアミノ酸番号1−370のアミノ酸配列からなる蛋白質
[d1]配列番号10で表されるアミノ酸番号1−575のアミノ酸配列からなる蛋白質
[d2]配列番号11で表されるアミノ酸番号1−586のアミノ酸配列からなる蛋白質
[d3]配列番号12で表されるアミノ酸番号1−606のアミノ酸配列からなる蛋白質
[d4]配列番号13で表されるアミノ酸番号1−526のアミノ酸配列からなる蛋白質
[e1]配列番号15で表されるアミノ酸番号1−234のアミノ酸配列からなる蛋白質
[f1]配列番号17で表されるアミノ酸番号1−290のアミノ酸配列からなる蛋白質
[f4]配列番号68で表されるアミノ酸番号1−284のアミノ酸配列からなる蛋白質
[g1]配列番号19で表されるアミノ酸番号1−204のアミノ酸配列からなる蛋白質
[h1]配列番号62で表されるアミノ酸番号1−138のアミノ酸配列からなる蛋白質
[b2]配列番号3で表されるアミノ酸番号1−342のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[c2]配列番号5で表されるアミノ酸番号1−370のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d5]配列番号10で表されるアミノ酸番号1−575のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d6]配列番号11で表されるアミノ酸番号1−586のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d7]配列番号12で表されるアミノ酸番号1−606のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d8]配列番号13で表されるアミノ酸番号1−526のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[e2]配列番号15で表されるアミノ酸番号1−234のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[f2]配列番号17で表されるアミノ酸番号1−290のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[f5]配列番号68で表されるアミノ酸番号1−284のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[g2]配列番号19で表されるアミノ酸番号1−204のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
[h2]配列番号62で表されるアミノ酸番号1−138のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
[b3]配列番号3で表されるアミノ酸番号1−342のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[c3]配列番号5で表されるアミノ酸番号1−370のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸とを基質とする反応、イソペンテニル二リン酸とゲラニル二リン酸とを基質とする反応、又はイソペンテニル二リン酸とファルネシル二リン酸とを基質とする反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d9]配列番号10で表されるアミノ酸番号1−575のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d10]配列番号11で表されるアミノ酸番号1−586のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d11]配列番号12で表されるアミノ酸番号1−606のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[d12]配列番号13で表されるアミノ酸番号1−526のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAを還元する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[e3]配列番号15で表されるアミノ酸番号1−234のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソペンテニル二リン酸又はジメチルアリル二リン酸を異性化する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[f3]配列番号17で表されるアミノ酸番号1−290のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[f6]配列番号68で表されるアミノ酸番号1−284のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[g3]配列番号19で表されるアミノ酸番号1−204のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
[h3]配列番号62で表されるアミノ酸番号1−138のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質
本発明のベクター(Rubber Elongation Factorをコードする遺伝子のプロモーターに、ポリイソプレノイドの生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクター)を植物に導入することにより、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質を乳管特異的に発現するように形質転換された生物体(形質転換体)が得られる。そして、当該形質転換体では、ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質が乳管特異的に発現することにより、本発明のベクターが導入された植物体内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性等の機能が乳管内で増強されてポリイソプレノイドの生合成経路の一部が増強され、結果的に植物体でのポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。
また、上記アグロバクテリウム属菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)菌株(C58、LBA4404、EHA101、EHA105、C58C1RifR、GV3101等)を用いることができる。
本発明の形質転換植物を作製する方法の一例としては、植物由来の組織をカルス誘導化条件で5〜9週間培養(誘導工程)して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる感染工程と、当該ベクターの導入されたカルスを選択的に生育させる選択培養工程と、カルスから不定胚を誘導する工程(再生誘導工程)とを含む方法が挙げられる。このような作製方法では、上記感染工程と、上記選択培養工程とにより、形質転換植物細胞(形質転換されたカルス)を作成した後、上記再生誘導工程により、該カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養してカルスを植物に再生し、形質転換植物を作成することができる。カルスを植物に再生する方法としては、より具体的には、カルスから不定胚を誘導し、該不定胚を培養することにより、シュートを形成させ、該シュートを培養することにより、カルスを植物に再生すればよい。
まず、カルスの調製方法(誘導工程)について説明する。
誘導工程では、例えば、植物の組織片(組織)を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
モノテルペン化合物としては、D−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、l−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、D−リモネン、α−ピネンが好ましい。
なお、本明細書において、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類(培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類)は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることが好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のpHは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のpHを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が0〜0.1lxであることを意味し、明所とは、照度が0.1lxを超えていることを意味する。
感染工程では、植物由来の組織をカルス誘導化条件で例えば5〜9週間培養して得られたカルスに、本発明のベクターを含有するアグロバクテリウム属菌を感染させる。
共存培養工程では、例えば、感染工程により得られたカルス(アグロバクテリウム属菌が感染したカルス)を共存培養培地中で培養する。これにより、感染によりカルスに導入された本発明のベクターに含まれる遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換植物細胞を得ることができる。
選択培養工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、形質転換されたカルスと、形質転換されていないカルスを選別できる。
再生誘導工程では、植物生長ホルモン及び炭素源を含む再生誘導培地中で、形質転換されたカルス(形質転換されたカルスを増殖させたものであってもよい)を培養することにより不定胚及びシュートを形成させる。カルスから不定胚を誘導(形成)し、不定胚を培養することにより、安定的にシュートの形成を行うことができるため、再生誘導工程の培養条件は、カルスから不定胚を誘導できる条件であれば、特に限定されない。
伸長工程では、形成されたシュートを伸長培地で培養することによりシュートを伸長させる。
発根工程では、シュートを発根培地で培養することにより発根させる。ここで、シュートとしては、伸長工程により伸長させたシュートを使用してもよく、再生誘導工程により形成されたシュートを直接使用してもよい。
なお、上記重量平均分子量は、実施例に記載された方法により測定できる。
パラゴムノキの葉由来のRubber Elongation Factor(REF)をコードする遺伝子とそのプロモーターを含むDNA断片を以下の手順でクローニングした。まず、パラゴムノキの葉からゲノムDNAを抽出した。抽出はCTAB法で行った。REFをコードする遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子の増幅は、下記プライマー1〜3に示すようなランダムプライマーとREFをコードする遺伝子に対応したプライマーを用いたTAIL−PCR法により行った。
(プライマー1:配列番号20)
5′−ACWGNACWANCANAGA−3′
(プライマー2:配列番号21)
5′−GTTTGAGAAGGTAGTCACAGC−3′
(プライマー3:配列番号22)
5′−GTAGTCACAGCATAAGTTGCC−3′
なお、プライマー1中のWは、アデニン又はチミンを表しており、Nは、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンを表す。
植物用ベクターに組み込むことができるように制限酵素サイトを付加した下記プライマー4、5を設計し、PCRを行って、上記同定されたREFをコードする遺伝子のプロモーター配列−1〜−1650bpを増幅した。
(プライマー4:配列番号23)
5′−GATTCCGGAGCAAACACACAAAACTACAGG−3′
(プライマー5:配列番号24)
5′−ACTAGTAATCGAAGATTTCCTTTTGC−3′
パラゴムノキの葉よりTotal RNAを抽出し、Oligo−dT primerを用いて逆転写反応によりcDNAを合成した。
次にパラゴムノキのDNAデータベースを基に、下記プライマー6〜23、42〜43、46〜47を設計し、RT−PCRを行って、目的蛋白質の全長のDNA断片を増幅し、そのDNA断片の塩基配列及び目的蛋白質の全長のアミノ酸配列を同定した。それぞれの目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号2、4、6〜9、14、16、18、61、67に、当該目的蛋白質のアミノ酸配列を配列番号3、5、10〜13、15、17、19、62、68に示した。
(プライマー6:配列番号25)
5′−GAATCCATGGCGGATCTGAAG−3′
(プライマー7:配列番号26)
5′−GTCCATGTATCTGGATACCC−3′
(プライマー8:配列番号27)
5′−CAAGATGAGTTCAGTGAATTTGGG−3′
(プライマー9:配列番号28)
5′−TGCATTAGTTTTGCCTGTGAGC−3′
(プライマー10:配列番号29)
5′−ATTTTTACATGGACACCACCG−3′
(プライマー11:配列番号30)
5′−ACCAGATTCCCACTAAGATGC−3′
(プライマー12:配列番号31)
5′−TCCATATATGGACGAGGTTCG−3′
(プライマー13:配列番号32)
5′−GCAGCTGTGTTACCCTTCAG−3′
(プライマー14:配列番号33)
5′−CAGTCGCTCCAAAATGGATGTGC−3′
(プライマー15:配列番号34)
5′−GATTTTCTTAGGAAGAAGGCTTGG−3′
(プライマー16:配列番号35)
5′−CTAGCTGGTCTATAATGGATGCC−3′
(プライマー17:配列番号36)
5′−GAATCAATTTACCTCAATAGAAGGC−3′
(プライマー18:配列番号37)
5′−TTCCACCATGGGTGAGGCTCC−3′
(プライマー19:配列番号38)
5′−TCTCAACTCAACTTGTGAATCG−3′
(プライマー20:配列番号39)
5′−ATGGAATTATACAACGGTGAGAGG−3′
(プライマー21:配列番号40)
5′−TTTTAAGTATTCCTTATGTTTCTCC−3′
(プライマー46:配列番号69)
5′−ATGGAATTATACAACGGTGAGAGG−3′
(プライマー47:配列番号70)
5′−TTTTAAGTATTCCTTATGTTTCTCC−3′
(プライマー22:配列番号41)
5′−TATGGCTGAAGAGGTGGAGG−3′
(プライマー23:配列番号42)
5′−TGATGCCTCATCTCCAAACACC−3′
(プライマー42:配列番号63)
5′−ATGGCTGAAGACGAAGACAACC−3′
(プライマー43:配列番号64)
5′−ATTCTCTCCATAAAACACCTTAGC−3′
植物用ベクターに組み込むことができるように制限酵素サイトを付加した下記プライマー24〜41、44〜45、48〜49を設計し、RT−PCRを行って、目的蛋白質をコードする遺伝子の全長を増幅した。
(プライマー24:配列番号43)
5′−CTCGAGAACAATGGCGGATCTGAAGTCAAC−3′
(プライマー25:配列番号44)
5′−GGTACCTGTTTCTGTCTCTTGTAAATTTTGGC−3′
(プライマー26:配列番号45)
5′−CTCGAGAACAATGAGTTCAGTGAATTTGGG−3′
(プライマー27:配列番号46)
5′−GGATCCTTGTTTTGCCTGTGAGCGATGTAATTAGC−3′
(プライマー28:配列番号47)
5′−CTCGAGACAAATGGACACCACCGGCCGGCTCC−3′
(プライマー29:配列番号48)
5′−GGTACCACAGATGCAGCTTTAGACATATCTTTGC−3′
(プライマー30:配列番号49)
5′−CTCGAGACAAATGGACGAGGTTCGCCGGCGACC−3′
(プライマー31:配列番号50)
5′−GGTACCACGAAAGTTATTTTGGATACATCTTTTGC−3′
(プライマー32:配列番号51)
5′−AAGCTTACAAATGGATGTGCGCCGGCGACC−3′
(プライマー33:配列番号52)
5′−GGTACCACGGAAGAAGGCTTGGAAACAGC−3′
(プライマー34:配列番号53)
5′−AAGCTTACAAATGGATGCCCGCCGGCGACC−3′
(プライマー35:配列番号54)
5′−GGTACCACATTTACCTCAATAGAAGGCATTGTC−3′
(プライマー36:配列番号55)
5′−CTCGAGAACAATGGGTGAGGCTCCAGATGTCG−3′
(プライマー37:配列番号56)
5′−GGTACCTGACTCAACTTGTGAATCGTTTTCATGTC−3′
(プライマー38:配列番号57)
5′−CTCGAGCCAACAATGGAATTATACAACG−3′
(プライマー39:配列番号58)
5′−GGATCCTCTTTTAAGTATTCCTTATGTTTCTCC−3′
(プライマー48:配列番号71)
5′−CTCGAGCCAACAATGGAATTATACAACG−3′
(プライマー49:配列番号72)
5′−GGATCCTCTTTTAAGTATTCCTTATGTTTCTCC−3′
(プライマー40:配列番号59)
5′−CTCGAGAACAATGGCTGAAGAGGTGGAGG−3′
(プライマー41:配列番号60)
5′−GGATCCTGTGATGCCTCATCTCCAAACACC−3′
(プライマー44:配列番号65)
5′−CTCGAGAACAATGGCTGAAGACGAAGACAACC−3′
(プライマー45:配列番号66)
5′−GGATCCAAATTCTCTCCATAAAACACCTTAGC−3′
pH35GSバイナリーベクター(INPLANTA INNOVATIONS社製)を制限酵素EcoRI、SpeIで消化し、(ベクターに導入するためのプロモーター配列の増幅)で増幅したREFをコードする遺伝子のプロモーター配列を同様に制限酵素処理して、Ligation high(TOYOBO社製)を用いて結合させた。
また、(ベクターに導入するための、目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列の増幅)で増幅した目的蛋白質をコードする遺伝子(塩基配列)を制限酵素で消化し、Gateway sGFP エントリークローンベクター(Evorogen社製)を同様に制限酵素処理して、Ligation high(TOYOBO社製)を用いて結合させた。
そして、作製したバイナリーベクターとエントリークローンベクターとを、LR Clonase II enzyme mix(Invitrogen社製)を用いて反応させ、エントリークローン上の目的蛋白質をコードする遺伝子配列及びGFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子の塩基配列をpH35GSに挿入した。これにより、REFをコードする遺伝子のプロモーター配列(HbREF pro)に、目的蛋白質をコードする遺伝子配列及びGFP遺伝子の塩基配列が機能的に連結された発現ベクターを構築した。なお、pH35GSベクターは、ハイグロマイシン耐性遺伝子(HPT)を有している。
(発現ベクターの構築)で構築した各種発現ベクターをそれぞれアグロバクテリウムに感染させ、発現ベクター導入アグロバクテリウムを作製した。具体的には、エレクトロポレーション法により、発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、YEB培地にて28℃で24時間振とう培養した。その後、培養液を遠心分離してアグロバクテリウムを回収し、O.D.600=0.6の濃度となるように懸濁液(MS培地)に懸濁した。
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
NAA:ナフタレン酢酸
2,4−D:2,4−ジクロロフェノキシ酢酸
IBA:インドール酪酸
BA:ベンジルアデニン
KI:カイネチン
パラゴムノキ:東京大学大学院農学生命科学研究科附属科学の森教育研究センター樹芸研究所より入手
パラゴムノキから葉を採取した。次に、採取した葉の表面を流水で洗浄し、さらに70%エタノールで洗浄した後、約5〜10%に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
(発現ベクター導入アグロバクテリウムの調製)で作製した発現ベクター導入アグロバクテリウムを含む懸濁液(MS培地)に、誘導したカルスを30分間接触させた後、カルスをMS培地で暗所条件下、28℃で3日間培養した。
ここで、実施例1では図7で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例2では図8で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例3では図9で表される発現ベクターのうちHMGR1を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例4では図10で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例5では図11で表される発現ベクターのうちCPT1を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例6では図12で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例7では図13で表される発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例8では図9で表される発現ベクターのうちHMGR3を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例9では図9で表される発現ベクターのうちHMGR4を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例10では図9で表される発現ベクターのうちHMGR5を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、実施例11では図11で表される発現ベクターのうちCPT2を有する発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを、それぞれ用いた。
次いで、カルベニシリンにより滅菌されたカルスをハイグロマイシン耐性MS選択培地に移し、28℃で16時間日長培養を2ヶ月行い、形質転換体を作製した。
次に、形質転換体(選択培養工程で生存していたカルス)を用いて、該カルスからMS培地により不定胚及びシュートを形成させた(再生誘導工程)。すなわち、形質転換体を該培地上で培養温度25℃、24時間中12時間の照明下(10000lx)で3〜6ヶ月培養した。なお、1ヶ月培養する毎に培地を交換した。その結果、不定胚の形成後にシュートの形成も観察された。
次に、シュート伸長のために、形成されたシュートを、再生誘導培地と同様の組成の培地で継代培養した。すなわち、培養温度25℃、24時間中12時間の照明下(10000lx)で8週間培養した。これにより、良好なシュートの伸長が観察された。
次に、発根のために、3cm程度に成長したシュートを、1/2MS培地に移植した。培養温度25℃、24時間中12時間の照明下(10000lx)で8週間培養した。これにより、良好に発根が観察され、形質転換植物体が得られた。
実施例1〜7において得られた形質転換植物体の茎を傷つけた際に漏出する乳液を200μl回収し、そのうちの100μlに対して、99%エタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後99%トルエンでさらに抽出することで、ポリイソプレノイドを精製回収した。そして、製造されたポリイソプレノイド(回収したトルエン抽出物)の量(形質転換植物体内に蓄積されているポリイソプレノイドの量(ポリイソプレノイド細胞内蓄積量)、すなわちポリイソプレノイドの生産量)を算出した。
ポリイソプレノイドの蓄積量は、回収したトルエン抽出物を乾燥させた後、該形質転換植物体から精製回収したポリイソプレノイドの量の、野生型(非組み換え体;「Control」とも称する。)のポリイソプレノイド蓄積量に対する割合(質量%)として算出した。結果を表1に示す。
ポリイソプレノイドの重量平均分子量(Mw)は、下記の条件(1)〜(7)でゲルパーミエーションクロマトグラフ(GPC)法により測定した。結果を表1に示す。
(1)装置:東ソー社製HLC−8020
(2)分離カラム:東ソー社製GMH−XL
(3)測定温度:40℃
(4)キャリア:テトラヒドロフラン
(5)流量:0.6ml/分
(6)検出器:示差屈折、UV
(7)分子量標準:標準ポリスチレン
プロモーターとして、REFをコードする遺伝子のプロモーターの代わりに、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターを用いた以外、すなわち、(ベクターに導入するためのプロモーター配列の増幅)で増幅したREFをコードする遺伝子のプロモーター配列を導入しなかった以外は、実施例1〜7と同様にして形質転換植物体を得、ポリイソプレノイドの蓄積量を算出し、ポリイソプレノイドの重量平均分子量を測定した。結果を表1に示す。
REF pro:REF(Rubber Elongation Factor)をコードする遺伝子のプロモーター
35S:カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター
FPS:ファルネシル二リン酸シンターゼ
GGPS:ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ
HMGR1:3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ1
IPI:イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ
CPT1:cis−プレニルトランスフェラーゼ1
SRPP:Small Rubber Particle Protein
REF:Rubber Elongation Factor
また特に、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質として、ファルネシル二リン酸シンターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、Small Rubber Particle Protein、又はRubber Elongation Factorをコードする遺伝子を導入した形質転換植物体では、野生型(非組み換え体)や、REFをコードする遺伝子のプロモーターの代わりにカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターを用いた形質転換植物体に比べて、植物体内に蓄積されるポリイソプレノイドの重量平均分子量が増大していることも確認された(実施例1、2、6、7)。
配列番号1:パラゴムノキ由来のRubber Elongation Factorをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号2:パラゴムノキ由来のファルネシル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号3:パラゴムノキ由来のファルネシル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号4:パラゴムノキ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号5:パラゴムノキ由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号6:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号7:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ3をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号8:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ4をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号9:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ5をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号10:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ1のアミノ酸配列
配列番号11:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ3のアミノ酸配列
配列番号12:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ4のアミノ酸配列
配列番号13:パラゴムノキ由来の3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリルCoAレダクターゼ5のアミノ酸配列
配列番号14:パラゴムノキ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号15:パラゴムノキ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列
配列番号16:パラゴムノキ由来のcis−プレニルトランスフェラーゼ1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号17:パラゴムノキ由来のcis−プレニルトランスフェラーゼ1のアミノ酸配列
配列番号18:パラゴムノキ由来のSmall Rubber ParticleProteinをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号19:パラゴムノキ由来のSmall Rubber ParticleProteinのアミノ酸配列
配列番号20:プライマー1
配列番号21:プライマー2
配列番号22:プライマー3
配列番号23:プライマー4
配列番号24:プライマー5
配列番号25:プライマー6
配列番号26:プライマー7
配列番号27:プライマー8
配列番号28:プライマー9
配列番号29:プライマー10
配列番号30:プライマー11
配列番号31:プライマー12
配列番号32:プライマー13
配列番号33:プライマー14
配列番号34:プライマー15
配列番号35:プライマー16
配列番号36:プライマー17
配列番号37:プライマー18
配列番号38:プライマー19
配列番号39:プライマー20
配列番号40:プライマー21
配列番号41:プライマー22
配列番号42:プライマー23
配列番号43:プライマー24
配列番号44:プライマー25
配列番号45:プライマー26
配列番号46:プライマー27
配列番号47:プライマー28
配列番号48:プライマー29
配列番号49:プライマー30
配列番号50:プライマー31
配列番号51:プライマー32
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配列番号53:プライマー34
配列番号54:プライマー35
配列番号55:プライマー36
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配列番号57:プライマー38
配列番号58:プライマー39
配列番号59:プライマー40
配列番号60:プライマー41
配列番号61:パラゴムノキ由来のRubber Elongation Factorをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号62:パラゴムノキ由来のRubber Elongation Factorのアミノ酸配列
配列番号63:プライマー42
配列番号64:プライマー43
配列番号65:プライマー44
配列番号66:プライマー45
配列番号67:パラゴムノキ由来のcis−プレニルトランスフェラーゼ2をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号68:パラゴムノキ由来のcis−プレニルトランスフェラーゼ2のアミノ酸配列
配列番号69:プライマー46
配列番号70:プライマー47
配列番号71:プライマー48
配列番号72:プライマー49
Claims (5)
- Rubber Elongation Factorをコードする遺伝子のプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたcis−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
- 前記Rubber Elongation Factorをコードする遺伝子のプロモーターが、以下の[A1]〜[A3]のいずれかに記載のDNAからなる請求項1記載のベクター。
[A1]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列からなるDNA
[A2]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[A3]配列番号1で表される塩基番号1−1650の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA - 前記cis−プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、以下の[F1]〜[F6]のいずれかに記載のDNAからなる請求項1又は2記載のベクター。
[F1]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列からなるDNA
[F2]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F3]配列番号16で表される塩基番号1−873の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F4]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列からなるDNA
[F5]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[F6]配列番号67で表される塩基番号1−855の塩基配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA - 請求項1、2、又は3に記載のベクターが導入された形質転換植物。
- 請求項1、2、又は3に記載のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法。
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