MXPA01010486A - Secuencias de acido nucleico para proteinas implicadas en la sintesis de tocoferol. - Google Patents

Secuencias de acido nucleico para proteinas implicadas en la sintesis de tocoferol.

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Abstract

Se proveen las secuencias de acidos nucleicos y los metodos para producir plantas y semillas que tienen el contenido y composiciones alterados de tocoferol; los metodos para encontrar uso particular para incrementar los niveles de tocoferol en plantas, y para proveer composiciones de tocoferol deseables en una celula vegetal hospedera.

Description

SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO PARA PROTEÍNAS IMPLICADAS EN LA SÍNTESIS DE TOCOFEROL INTRODUCCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud provisional de E.U.A. número de serie 60/129,899, presentada el 15 de abril de 1999, y la solicitud provisional de E.U.A. número de serie 60/146,461 , presentada el 30 de julio de 1999.
CAMPO TÉCNICO La presente invención se dirige a secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos y a construcciones, y a métodos relacionados con los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los isoprenoides son compuestos ubicuos que se encuentran en todos los organismos vivientes. Las plantas sintetizan un conjunto diverso de más de 22,000 isoprenoides (Connolly y Hill (1992) Dictionary of Tefenoids, Chapman y Hall, New York, NY). En las plantas, los isoprenoides desempeñan papeles esenciales en particular funciones celulares tales como la producción de esteroides, contribuyen a la arquitectura de la membrana eucarionte, poliprenoides acíclicos encontrados en la cadena lateral de la ubiquinona y platoquinona, reguladores de crecimiento semejantes a ácido abscícico, giberelinas, brasinosteroides o los pigmentos clorofílicos fotosintéticos y carotenoides. A pesar de que el papel fisiológico de otros isoprenoides vegetales es menos evidente, tales como el vasto conjunto de metabolitos secundarios, se sabe que algunos desempeñar papeles clave que median la respuesta adaptativa a diferentes cambios medioambientales. A pesar de la remarcable diversidad de estructura y función, todos los isoprenoides se originan a partir de un precursor metabólico único, isopentenild ¡fosfato (IPP) (Wright, (1961) Annu. Rev. Biochem. 20:525-548; y Spurgeon y Portes, (1981) ¡n Biosynthesis of Isoprenoid Compounds.. Portes y Spurgeon eds (John Wiley, New York) Vol. 1 , pp1-46). Un número de ruta bioquímicas únicas e interconectadas derivadas a partir de la ruta de isopreno.de llevan a metabolitos secundarios, ¡ncluyendo tocoferoles, que existen en los cloroplastos de plantas superiores. Los tocoferoles no solamente llevan a cabo funciones vitales en las plantas, sino que también son importantes para las perspectivas nutricionales de los mamíferos. En los plastidios, los tocoferoles cuentan para más del 40% del agrupamiento de quinona total. Los tocoferoles y tocotrienoles (derivados de tocoferol insaturado) son antioxidantes bien conocidos, y desempeñan un papel importante para proteger las células a partir del daño de radicales libres, y en la prevención de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades cardiacas, cáncer, cataratas, retinopatía, enfermedad de Alzheimer, y neurodegeneración, y se han encontrado que tienen efectos benéficos sobres síntomas de artritis, y anti-envejecimiento. La vitamina E se utiliza en el alimento para pollo para mejorar la vida de anaquel, apariencia, sabor, y estabilidad oxidativa de la carne, y para transferir tocóles a partir del alimento a los huevos. Se ha demostrado que la vitamina E es esencial para la reproducción normal, mejora el desempeño general, y mejora la inmunocompetencia en los anímales de granja. El suplemento de vitamina E en el alimento animal también mejora la estabilidad oxidativa de los productos lácteos. La demanda de tocoferoles naturales como suplementos ha estado creciendo continuamente a una velocidad de 10-20% durante los últimos 3 años. Actualmente, la demanda excede el abastecimiento de tocoferoles naturales, los cuales se conoce que son más biopotentes que las mezclas racémicas de tocoferoles producidos sintéticamente. Los tocoferoles que ocurren naturalmente son todos -estereómeros, mientras que el a-tocoferol sintético es una mezcla de 8 isómeros d,/-a-tocoferol, solamente uno de los cuales (12.5%) es idéntico al d- - tocoferol natural. El c/-a-tocoferol natural tiene la mayor actividad de vitamina E (1.49 lU/mg) cuando se compara con otros tocoferoles o tocotrienoles naturales. El a-tocoferol sintético tiene una actividad de vitamina E de 1.1 lU/mg. En 1995, el mercado mundial de tocoferoles refinados a partir del material crudo fue de $1020 millones de dólares; los materiales sintéticos comprendió el 85-88% del mercado, el remanente 12-15% siendo de materiales naturales. Las mejores fuentes de tocoferoles y tocotrienoles naturales son aceites vegetales y productos de grano. Actualmente, la mayoría de la vitamina E natural se produce a partir de ?-tocoferol derivado a partir del aceite de soya procesado, el cual se convierte subsecuentemente a a-tocoferol mediante modificación química (a-tocoferol exhibe la mayor actividad biológica). Los métodos para mejorar los niveles de tocoferoles y tocotrienoles en plantas, especialmente los niveles de los compuestos más deseables que pueden utilizarse directamente, sin modificación química, serían útiles en la técnica como dichas moléculas que exhiben una mejor funcionalidad y biodisponibilidad. Además, son deseables los métodos para incrementar la producción de otros compuestos derivados de isoprenoides en una célula vegetal hospedera. Además, también se necesitan métodos para la producción de compuestos isoprenoides particulares en una célula vegetal hospedera.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a preniltransferasa (PT), y en particular polinucleótidos y polipéptidos PT. Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención incluyen aquellos derivados a partir de fuentes procariontes y eucariontes. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican proteínas preniltransferasa. En particular, se proveen las secuencias de ácidos nucleicos aislados codifican proteínas PT a partir de fuentes bacterianas vegetales. Otro aspecto de la presente invención se refiere a oligonucleótidos que incluyen secuencias que codifican PT de manera parcial o completa. También es un aspecto de la presente invención proveer construcciones de ADN recombinante que puede utilizarse para la transcripción o transcripción y traducción (expresión) de preniltransferasa. En particular, se proveen las construcciones que son capaces de transcripción o transcripción y traducción en células hospederas. En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para la producción de preniltransferasa en una célula hospedera o progenie de la misma. En particular, las células hospederas se transforman o transfectan con una construcción de ADN que puede utilizarse para transcripción o transcripción y traducción de preniltransferasa. Las células recombinantes que contienen preniltransferasa también son parte de la presente invención. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a métodos para usar secuencias de polinucleótidos y polipéptidos para modificar el contenido de tocoferol de células hospederas, particularmente en células vegetales hospederas. Las células vegetales que tienen dicho contenido de tocoferol modificado también se contemplan aquí. Las plantas modificadas, semillas y aceites obtenidos mediante la expresión de las preniltransferasas también se consideran parte de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 provee un alineamiento de la secuencia de aminoácidos entre ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8, y ATPT12 que se llevó a cabo utilizando ClustralW. La figura 2 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10800. La figura 3 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10801. La figura 4 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10803.
La figura 5 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10806. La figura 6 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10807. La figura 7 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10808. La figura 8 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10809. La figura 9 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10810. La figura 10 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10811. La figural 1 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10812. La figura 12 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10813. La figura 13 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10814. La figura 14 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10815. La figura 15 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10816.
La figura 16 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10817. La figura 17 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10819. La figura 18 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN10824. La figura 19 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10825. La figura 20 provee una imagen esquemática de la construcción de expresión pCGN 10826. La figura 21 provee un alineamiento de secuencia de aminoácido utilizando Clustal W entre la secuencia Knock-out de Synechocystis. La figura 22 provee una secuencia de aminoácidos de las secuencias de proteínas ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 y ATPT12 a partir de Arabidopsis y las secuencias de aminoácidos slr1736, slr0926, sil 1899, slr0056, y slrM 518 a partir de Synechocystus. La figura 23 provee los resultados del ensayo enzimático a partir de la preparación de la cepa Synechocystis de tipo silvestre 6803, y Synechocystis slrl1736 knock-out. La figura 24 provee una gráfica de barras de los datos HPLC obtenidos a partir de los extractos de semillas de Arabidopsis transgénicas que contienen pCGN 10822, el cual se provee para la expresión de la secuencia ATPT2 en la orientación sentido, a partir del promotor napin. Se proveen las gráficas para alfa, gama, y delta tocoferoles, así como para tocoferol total a partir de 22 líneas transformadas, así como para el tipo no transformados (tipo silvestre). La figura 25 provee una gráfica de barras del análisis HPLC para los extractos de semillas a partir de plantas de Arabidopsis transformadas con pCGN10803 (35S-ATPT2, en la orientación sentido), pCGN10802 (línea 1625, napin ATPT2 en la orientación sentido), pCGN 10809 (línea 1627, 35S-ATPT3 en la orientación sentido), un control no transformado (tipo silvestre) y un control transformado sin vector.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee, entre otros, composiciones y métodos para alterar (por ejemplo, incrementar y disminuir) los niveles de tocoferol y/o modular sus relaciones en células hospederas. En particular, la presente invención provee polinucleótidos, polipéptidos y método de uso de los mismos para la modulación del contenido de tocoferol en células vegetales hospederas. La presente invención provee secuencias de polinucleótidos y polipéptidos implicadas en la prenilación de compuestos aromáticos y de cadena recta. Las prenil transferasas de cadena recta como se utilizan aquí comprenden secuencias que codifican proteínas implicadas en la prenilación de los compuestos de cadena recta, incluyendo, pero no limitadas a, geranil geranil pirofosfato y famesil pirofosfato. Las prenil transferasa aromática, como se utilizan aquí, comprenden secuencias que codifican proteínas implicadas en la prenilación de compuestos aromáticos, ¡ncluyendo, pero no limitados a, menaquinona, ubiquinona, clorofila, y ácido homogentísico. La prenil transferasa de la presente invención preferiblemente prenila ácido homogentísico. La biosíntesis de a-tocoferol en las plantas superiores implican la condensación de ácido homogentísico y pitilpirofosfato para formar 2-metil-6-pitilbenzoquinol que puede, mediante ciclización y subsecuentes metilaciones (Fiedler et al., 1982, Planta, 155:511-515, Solí et al., 1980, Arch, Biochem, Biophys. 204:544-550, Marshall et al., 1985 Phytochem., 24:1705-1711, todos los cuales incorporan aquí como referencia en su totalidad), formar varios tocoferoles. El mutante pds2 de Arabidopsis identificado y caracterizado por Norris et al, (1995), es deficiente en tocoferol y en acumulación de pIastiquinona-9. Los análisis genéticos y bioquímicos adicionales sugieren que la proteína codificada por PDS2 puede ser responsable para la prenilación de ácido homogentísico. Esto puede ser un paso limitante de la velocidad en la biosíntesis de tocoferol, y este gen aún no se ha aislado. Por lo tanto, es un aspecto de la presente invención proveer polinucleótidos y polipéptidos implicados en la prenilación de ácido homogentísico.
Polinucleótidos. proteínas y polipéptidos aislados Un primer aspecto de la presente invención se refiere a polinucleótidos aislados de preniltransferasa. Las secuencias polinucleotídicas de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la invención que tienen una secuencia de aminoácidos deducida seleccionada a partir del grupo de secuencia establecida en el listado de secuencia y a otras secuencias nucleotídicas cercanamente relacionadas a dichas secuencias y variantes de las mismas. La invención provee una secuencia polinucleotídica idéntica en toda su longitud total a cada secuencia codificante como se establece en el listado de secuencias. La invención también provee la secuencia codificante para el polipéptido maduro o un fragmento del mismo, así como la secuencia codificante para el polipéptido maduro o un fragmento del mismo en un marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como aquellas que codifican para una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre-, pro, o pre-proteína. El polinucleótido también puede incluir secuencias no codificantes, que incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, secuencias no codificantes 5' y 3', tales como las secuencias transcritas, no traducidas, señales de terminación, sitios de unión de ribosoma, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones, señales de poliadenilación, y secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales. Por ejemplo, una secuencia marcadora puede incluirse para facilitar la purificación del polípéptido fusionado. Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que comprenden un gen estructural y las secuencias naturalmente asociadas que controlan la expresión del gen. La invención también incluye polinucleótidos de la fórmula: X-(R?)n-(R2)-(R3)n-Y donde, en el extremo 5', X es hidrógeno, en el extremo 3', e Y es hidrógeno o un metal, Ri y R3 son cualquiera residuos de ácido nucleico, n es un entero entre 1 y 3000, preferiblemente entre 1 y 1000 y R2 es una secuencia de ácido nucleico de la invención, particularmente una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo establecido en el listado de secuencia y preferiblemente aquellas de SEQ ID. Nos: 1 ,3,5,7,8,10,11 ,13-16,18,23,29,36 y 38. En la fórmula, R2 se orienta de manera que su residuo terminal 5' esta hacia a la izquierda, unido a Ri, y su residuo terminal 3' está a la derecha, unido a R3. Cualquier extensión de residuos de ácido nucleico denotado ya sea por el grupo R, donde R es mayor que 1 , puede ser ya sea un polímero o un homopolímero de éter, preferiblemente un heteropolímero. La invención también se refiere a variantes de los polinucleótidos descritos aquí que codifican para variantes de los polipéptidos de la invención. Las variantes que son fragmentos de los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse para sintetizar polinucleótidos de longitud total de la invención. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican variantes polipeptídicas donde 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1, o ningún residuo de aminoácido de una secuencia polipeptídica de la invención está sustituida, añadida o delatada, en cualquier combinación. Particularmente preferidas son 3 las sustituciones, adiciones, y deleciones que son silenciosas pero que no alteran las propiedades o actividades del polinucleótido o polipéptido. Las modalidades adicionalmente preferidas de la invención son las al menos 50%, 60%, o 70% idénticas sobre la longitud total de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención, y polinucleótidos que son complementarios a dichos polinucleótidos. Más preferibles son los polinucleótidos que comprenden una región que es al menos 80% idéntica en su longitud total a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y polinucleótidos que son complementarios al mismo. A este respecto, los polinucleótidos al menos 90% idénticos sobre su longitud total son particularmente preferidos, aquellos al menos 95% idénticos son especialmente preferidos. Además, aquellos con al menos 97% de identidad son altamente preferidos y aquellos con al menos 98% y 99% de identidad son particularmente altamente preferidos, con aquellos de al menos 99% siendo los más altamente preferidos. Las modalidades preferidas son polinucleótidos que codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función biológica o actividad como los polipéptidos maduros codificados por los polinucleótidos establecidos en el listado de secuencia. La invención adicíonalmente se refiere a polinucleótidos que hibridan a las secuencias anteriormente descritas. En particular, la invención se refiere a polinucleótidos que hibridan bajo condiciones severas con los polinucleótidos descritos anteriormente. Como se utiliza aquí, ios términos "condiciones severas" y "condiciones de hibridación severas" significa que la hibridación generalmente ocurrirá si hay al menos 95% y preferiblemente 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo de las condiciones de hibridación severas es la incubación durante toda la noche a 42°C en una solución que comprende formamida al 50%, SSC 5x (NaCI 150 Mm, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5x, dextrán sulfato al 10%, y 20 microgramos/mililitro de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, seguido por lavado del soporte de hibridación en SSC 0.1x a aproximadamente 65°C. Otras condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook, eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente capitulo 11. La invención también provee un polinucleótido que consiste esencialmente de una secuencia polinucleotídíca obtenida mediante la selección de una librería apropiada que contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídíca establecida en el listado de secuencia bajo condiciones de hibridación severa con una sonda que tienen la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica o un fragmento de la misma; y aislar dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener dicho polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas e iniciadores como se describe en la presente. Como se discute en la presente con respecto a los ensayos de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse como sondas de hibridación para ARN, ADNc, o ADN genómico para aislar ADNc de longitud total o clonas genómicas que codifican un polipéptido y para aislar ADNc o clonas genómicas de otros genes que tienen una alta similitud de secuencia con un polinucleótido establecido en el listado de secuencia. Dichas sondas generalmente comprenderán al menos quince bases. Preferiblemente dichas sondas tendrán al menos 30 bases y pueden tener al menos 50 bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 base y 50 bases, inclusive. La región codificante que comprende cada gen o está comprendida por una secuencia polinucleotídíca establecida en el listado de secuencia puede aislarse mediante selección utilizando una secuencia de ADN provista en el listado de secuencias para sintetizar una sonda oligonucleótida. Un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria con la de un gen de la invención se utiliza para seleccionar una genoteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para identificar miembros de la genoteca que hibridan con la sonda. Por ejemplo, los oligonucleótidos sintéticos se preparan para que corresponden a las secuencias EST de preniltransferasas. Los oligonucleótidos se utilizan como iniciadores en las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener secuencias terminales 5' y 3' de los genes de prenil transferasa. Alternativamente, donde los oligonucleótidos de baja degeneración pueden prepararse para péptidos prenil transferasas particulares, dichas sondas pueden utilizarse directamente para seleccionar genotecas génicas para secuencias del gen de prenil transferasa. En particular, la selección de genoteca de ADNc en vectores fagos es útil en dichos métodos debido a los bajos niveles de hibridación de fondo. Típicamente, una secuencia preniltransferasa obtenida mediante el uso de sondas de ácido nucleico mostrará 69-79% de identidad de secuencia entre la secuencia blanco de preniltransferasa y la secuencia codificada utilizada como una sonda. Sin embargo, también pueden obtenerse las secuencias más largas con al menos 50-60% de identidad de secuencia. Las sondas de ácido nucleicos pueden ser un fragmento largo de la secuencia de ácido nucleico, o pueden ser una sonda oligonucleótida corta. Cuando los fragmentos de ácido nucleico más largos se utilizan como sondas (mayores que alrededor de 100 pb), uno puede seleccionar a baja severidad con el objeto de obtener secuencias a partir de la muestra blanco que tiene 20-50% de desviación (es decir 50-80% de homología de secuencia) a partir de las - secuencias utilizadas como sonda. Las sondas oligonucleotídicas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa de ácido nucleico que codifica una enzima preniltransferasa, pero deben ser de al menos alrededor de 10, preferiblemente al menos alrededor de 15, y más preferiblemente alrededor de 20 nucleótidos. Un alto grado de identidad de secuencias se desea cuando las regiones más cortas se utilizan en oposición a las regiones más largas. Esto puede ser así deseable para identificar regiones de secuencias de aminoácidos altamente conservados para diseñar sondas oligonucleótidas para detectar y recuperar otros genes relacionados con preniltransferasa. Las sondas más cortas frecuentemente se utilizan particularmente para reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), especialmente cuando pueden identificarse secuencias altamente conservadas, (véase, Gould, et al., PNAS USA (1989) 86:1934-1938). Otro aspecto de la presente invención se refiere a polipéptidos de preniltransferasa. Dichos polipéptidos incluyen polipéptidos aislados establecidos en el listado de secuencia, así como polipéptidos y fragmentos de los mismos, particularmente aquellos polipéptidos que exhiben actividad preniltransferasa y también aquellos polipéptidos que tienen al menos 50%, 60% o 70% de identidad, preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, y más preferiblemente al menos 95% de identidad de una secuencia de polipéptidos seleccionada a partir del grupo de las secuencias establecidas en el listado de secuencia, y también incluye porciones de dichos polipéptidos, donde dicha porción del polipéptido incluye al menos 30 aminoácidos y más preferiblemente incluye al menos 50 aminoácidos. "Identidad", como se entiende bien en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias nucleotídicas, como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de polípéptido o polinucleotídicas, como se determina mediante las coincidencias entre las regiones de dichas secuencias. La "identidad" puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos incluyendo, pero no limitados a aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford Üniversoty Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., Stockton Press, New York (1991 ); y Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988). Los métodos para determinar la identidad se diseñan para dar las mayores coincidencias entre las secuencias probadas. Además, los métodos para determinar la identidad están codificados en programas públicamente disponibles. Los programas de computación que pueden utilizarse para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, GCG (Devereux. J., et al., Nucleic Acid Research 12(1):387 (1984); serie de cinco programas BLAST, tres diseños para búsquedas de secuencias nucleotídícas (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñadas para búsquedas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Bierren , eí ai, Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)). El programa BLAST X está públicamente disponible a partir de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., eí al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, S. eí al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). El algoritmo Smith Waterman bien conocido también puede utilizarse para determinar la identidad. Los parámetros para la comparación de secuencia de polipéptido típicamente incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Comparación de matriz: BLOSSUM62 para Hentikiff y Hentikoff, Proc, Nati. Acad. Sci USA 89: 10915-10919 (1992) Sanción por espacio: 12 Sanción por espacio largo: 4 Un programa que puede utilizarse con estos parámetros se encuentra públicamente disponible como el programa "GAP" a partir de Genetics Computer Group, Madison Wisconsin. Los parámetros anteriores junto con la ausencia de sanción para el espacio final son los parámetros utilizados comúnmente para las comparaciones peptídicas. Los parámetros para la comparación de secuencia polinucleotídica incluyen las siguientes: ' Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Comparación de matriz: = coincidencias + 10; no coincidencias = 0 Sanción por espacio: 50 Sanción por espacio largo: 3 Un programa que puede utilizarse con estos parámetros se encuentra públicamente disponible como el programa "GAP" a partir de Genetics Computer Group, Madison Wisconsin. Los parámetros anteriores son los parámetros que se utilizan comúnmente para las comparaciones de ácido nucleico. La invención también incluye polipéptidos de la fórmula: X-(R?)n-(R2)-(R3)n-Y donde, en el amino terminal, X es hidrógeno, y en el carboxilo terminal, Y es hidrógeno o un metal, Ri y R3 son cualesquiera residuos de aminoácidos, n es un entero entre 1 y 1000, y R2 es una secuencia de aminoácidos de la invención, particularmente una secuencia de aminoácidos seleccionados a partir de un grupo establecido en el listado de secuencias y preferiblemente aquellos codificados por las secuencias provistas en SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 9, 12, 17, 19-22, 24-28, 30, 32-35, 37, y 39. En la fórmula, R2 está orientado de manera que su residuo amino terminal está hacia la izquierda, unido a R-i, y su residuo carboxilo terminal está a la derecha, unido a R3. Cualquier extensión de residuos de aminoácidos denotados por cualquier grupos R, donde R es mayor que 1 , pueden ser cualquiera un heteropolímero o un homopolímero, preferiblemente un heteropolímero. Los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos aislados codificados por un polinucleótido que comprende una secuencias seleccionada a partir del grupo de una secuencia contenida en el listado de secuencia establecido en la presente. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser de proteína madura o puede ser parte de una proteína de fusión.
Los fragmentos y variantes de los polipéptidos también se consideran como parte de la invención. Un fragmento es una variante de polipéptido la cual tiene una secuencia de aminoácidos que es completamente la misma parte pero no de todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos previamente descritos. Los fragmentos pueden estar "establecidos libres" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual el fragmento forma una parte o una región, más preferiblemente como una región única continua. Los fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos que son aquellos fragmentos que median las actividades de los polipéptidos de la invención, incluyendo aquellos con actividad similar o actividad mejorada o con una actividad disminuida. También incluidos están aquellos fragmentos que son antigénicos o inmunogénicos en una animal, particularmente un humano. Las variantes del polipéptido también incluyen polipéptidos que varían a partir de la secuencia establecida en el listado de secuencia mediante sustituciones conservativas de aminoácidos, sustituciones de un residuo por otro con características similares. En general, dichas sustituciones están entre Ala, Val, Leu y lie; entre Ser y Thr; entre Asp y Glu; entre Asn y Gln; ente Lys y Arg; o entre Phe y Tyr. Particularmente preferidas son las variantes en las que 5 a 10; 1 a 5; 1 a 3; o un aminoácido(s) está sustituido, deletado, o añadido, en cualquier combinación. Las variantes que son fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para producir el polipéptido de longitud total correspondiente mediante síntesis peptídica. Por lo tanto, estas variantes pueden utilizarse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud total de la invención. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, en la transformación de células hospederas, tales como células hospederas vegetales, como se discute adicionalmente en la presente. La invención también provee polinucleótidos que codifican un polipéptido que es una proteína madura más aminoácidos adicionales amino o carboxi terminales, o aminoácidos con el polipéptido (por ejemplo, cuando la forma madura de la proteína tiene más de una cadena polipeptídica). Dichas secuencias pueden, por ejemplo, desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor de una forma madura, permitiendo el transporte de la proteína, acortamiento o alargamiento de la vida media de la proteína, o facilitar la manipulación de la proteína en ensayos o producción. Se contempla que las enzimas celulares pueden utilizarse para remover cualquier aminoácido adicional a partir de la proteína madura. Una proteína precursora, que tiene la forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias puede ser una forma inactiva del polipéptido. Los precursores inactivos generalmente se activan cuando las prosecuencias se remueven. Algunas o todas de las prosecuencias pueden ser removidas antes de la activación. Dichas proteínas precursoras son generalmente denominadas proproteínas.
Construcciones vegetales y métodos de uso. De particular interés es el uso de secuencias nucleotídicas en construcciones de ADN recombinante para dirigir la transcripción o transcripción o traducción (expresión) de las secuencias preniltransferasas de la presente invención en una célula vegetal hospedera. Las construcciones de expresión generalmente comprenden un promotor funcional en una célula vegetal hospedera operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico que codifica una preniltransferasa de la presente invención y una región funcional de terminación de la transcripción en una célula hospedera vegetal. Una primera secuencia de ácido nucleico está "operativamente unida" u "operativamente asociada" con una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias están dispuestas de manera que la primera secuencia de ácido nucleico afecta la función de la segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente las dos secuencias son parte de una única molécula de ácido nucleico contigua y más preferiblemente son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a un gen si el promotor regula o media la transcripción del gen en una célula. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que hay un gran número de promotores que son funcionales en células vegetales, y se han descrito en la literatura. También se abarcan los promotores específicos de cloroplasto y de plastidio, promotores funcionales de cloroplasto o plastidio, y promotores operables de cloroplasto o plastidio.
Un juego de promotores funcionales vegetales son promotores constitutivos tales como los promotores 35S de CaMV o 35S de FMV que rinden altos niveles de expresión en la mayoría de los órganos vegetales. Las versiones mejoradas o duplicadas de los promotores 35S de CaMV o 35S de FMV son útiles en la práctica de esta invención (Odell, eí al. (1985) Nature 313: 810-812; Rogers, U.S. Patente Numero 5,378,619). Además, también pueden preferirse para llevar a cabo la expresión del gen preniltransferasa en tejidos específicos de la planta, tales como hoja, tallo, raíz, tubérculo, semilla, fruta, etc., y el promotor elegido debe tener la especificidad deseada de tejido y de desarrollo. De particular interés es la expresión de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención a partir de las regiones de iniciación de la transcripción las cuales se expresan preferiblemente en un tejido de semilla de planta. Los ejemplos de dichas secuencias de inicio de la transcripción preferencial en semilla incluyen aquellas secuencias derivadas a partir de las secuencias que codifican para genes de proteína de almacenamiento de plantas o a partir de genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos en las semillas oleosas. Los ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' a partir de dichos genes como napin (Kridl eí al., Seed Sci. Res. 7:209:219 (1991)), faseolin, zein, inhibidor de tripsina de soya, ACP, estearoil-ACP desaturasa, subunidad a', subunidad de ß-conglicinina (soya 7s, (Chen et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986))) y oleosina.
También puede ser ventajoso dirigir la localización de las proteínas que confieren preniltransferasa a un compartimento subcelular particular, por ejemplo, al compartimento de la mitocondria, retículo endoplásmico, vacuolas, cloroplastos u otro compartimento plastídico. Por ejemplo, donde los genes de interés de la presente invención se dirigen a los plastidios, tal como cloroplastos, para la expresión, las construcciones también emplearan el uso de secuencia para dirigir el gen al plastidio. Dichas secuencias se refieren aquí como péptidos de tránsito al cloroplasto (CTP) o péptidos de tránsito al plastidio (PTP). De esta manera, donde el gen de interés no se inserta directamente dentro del plastidio, la construcción de expresión adicionalmente contendrá un gen que codifica un péptido de tránsito para dirigir el gen de interés al plastidio. Los péptidos de tránsito al cloroplasto pueden derivarse del gen de interés, o pueden derivarse a partir de una secuencia heteróloga que tiene un CTP. Dichos péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Von Heijne eí al. (1991 ) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark eí al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; delIa-Cioppa eí al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer eí /. (1993) Biochem. Biophys. Res Commun. 196:1414-1421 ; y, Shah eí al. (1986) Science 233:478-481. Dependiendo el uso pretendido, las construcciones pueden contener la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína preniltransferasa completa, o una porción de la misma. Por ejemplo donde se desea la inhibición antisentido de una proteína preniltransferasa dada, no se requiere la secuencia completa de preniltransferasa. Además, donde las secuencias de preniltransferasa utilizadas en las construcciones se pretenden para usos como sondas, pueden ser ventajoso preparar construcciones que contienen solamente una porción particular de una secuencia que codifica preniltransferasa, por ejemplo una secuencia que se descubre que codifica una región de preniltransferasa altamente conservada. El experto en la técnica reconocerá que hay varios métodos para la inhibición de la expresión de secuencias endógenas en una célula hospedera. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, supresión antisentido (Smith, eí al. (1988) Nature 334:724-726), cosupresión (Napoli, eí al. (1989) Plant Cell 2:279-289), ribozimas (publicación PCT WO 97/10328), y combinaciones de sentido y antisentido Waterhouse, eí al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13959-13964. Los métodos para la supresión de las secuencias endógenas en una célula hospedera típicamente emplean la transcripción o transcripción y traducción de al menos una porción de la secuencia ha ser suprimida. Dichas secuencias pueden ser homologas para regiones codificantes así como no codificantes para la secuencia endógena. Las regiones reguladoras de terminación de la transcripción pueden proveerse también en las construcciones de expresión vegetal de esta invención. Las regiones de terminación de la transcripción pueden proveerse por la secuencia de ADN que codifica la preniltransferasa o una región de terminación de la transcripción conveniente derivada a partir de una fuente génica diferente, por ejemplo, la región de terminación de la transcripción que naturalmente se asocia con la región de inicio de la transcripción. El experto en la técnica reconocerá que cualquier región de terminación de la transcripción conveniente que sea capaz de terminar la transcripción en una célula vegetal pueden emplearse en las construcciones de la presente invención. Alternamente, las construcciones pueden prepararse para dirigir la expresión de las secuencias de preniltransferasa directamente a partir del plastidio de la célula vegetal hospedera. Dichas construcciones y métodos son conocidos en la técnica y generalmente se describen, por ejemplo, en Svab, eí al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 y Svab y Maliga (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:913-917 y en la patente de E.U.A: No. 5,693,507. Las construcciones de preniltransferasa de la presente invención pueden utilizarse en los métodos de transformación con construcciones adicionales que se proveen para la expresión de otras secuencias de ácido nucleicos que codifican proteínas implicadas en la producción de tocoferoles, o percursores de tocoferoles tales como ácido homogentísico y/o pitilpirofosfato. La secuencias de ácidos nucleico que codifican proteínas implicadas en la producción de ácido homogentísico se conocen en la técnica e incluyen pero no se limitan a, 4-hidrofenilpiruvato dioxigenasa (HPPD.EC 1.13.11.27) descrita por ejemplo, por García, eí al. ((1999) Plant physiol. 119(4):1507-1516), mono o bifuncional (descrita por ejemplo por Xia, eí al. (1992) J. Gen Microbiol. 138:1309-1316, y Hundson, eí al. (1984) J. Mol. Biol. 1810:1023-1051), oxigenasa, 4-hidroxifenilpiruvatodi- (9CI), 4-hidroxifenilpirovatodioxigensa; p-hidroxifenilpirovato dioxigenasa; p-Hidroxipenilpiruvato hidroxiiasa; p-hidroxifenilpiruvato oxidasa; ácido p-Hidroxifenilpiruvato hidroxilasa; p-hidroxifenilpiruvato hidroxilasa; ácido p-Hidroxifenilpirúvico oxidasa), 4-hidroxifenilacetato, NAD(P):oxigen oxidoreductasa (1-hidroxilante); 4-hidroxifenilacetato 1-monooxigenasa, y las similares. Además las construcciones para la expresión de secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas implicadas en la producción de piridilfosfato también pueden emplearse con las construcciones de preniltransferasa de la presente invención. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas implicadas en la producción de pitilpirofosfato se conocen en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a geranilgeranilpirofosfoato sintasa (GGPPS) geranilgeranilpirofosfato reductasa (GGH), 1-deoxixillulosa-5-fosfato sintasa, 1 -deoxi-D-xilolosa-5-fosfato reductoísomerasa, 4-difosfatoc¡tidil-2-C-met¡leritritol sintasa, isopentilpirofosfato isomersa. Las secuencias de preniltransferasa de la presente invención encuentran su uso en la preparación de construcciones de transformación que tienen un segundo cassette de expresión para la expresión de secuencias adicionales implicadas en la biosíntesis de tocoferol. Las secuencias adicionales para biosíntesis de tocoferol de interés en ia presente invención incluyen, pero no se limitan a gama-tocoferolmetiltransferasas (Shintani, el a/.(1998) Science 282(5396):2098-2100), tocoferolciclasa, y tocoferol metiltransferasa. Una célula vegetal, tejido, órgano, o planta dentro de la cual la construcción de ADN recombinante que contiene la construcción de expresión se ha introducido se considera transformada, transfectada, o transgénica. Una célula o planta transgénica o transformada también incluye progenie de las célula o planta y progenie producida a partir de un programa de entrecruzamiento que emplea dicha planta transgénica, como parental en un entrecruzamiento y que exhibe un fenotipo alterado resultando a partir de la presencia de una secuencia de ácido nucleico de preniltransferasa. Las construcciones de expresión o transcripción de plantas que tienen una preniltransferasa como la secuencia de ADN de interés para incrementar o disminuir la expresión de la misma pueden emplearse con una amplia variedad de vida vegetal, particularmente, vida vegetal implicada en la producción de aceites vegetales para usos de consumo e industriales. Las plantas particularmente preferidas para uso en los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: Acacia, alfalfa, aneth, manzana, chabacano, alcachofa, arúgula, espárrago, aguacate, banana, centeno, frijol, remolacha, zarzamora, arándano, bróculi, calabacita de bruselas, calabaza, cañóla, melón, zanahoria, casava, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítrico, clementinas, café, maíz, algodón, pepino, abeto, Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, helécho, higuera, ajo, calabacín, uva, toronja, melón dulce, jicama, kiwi, lechuga, poro, limón, lima, pino Loblolly, mango, melón, hongo, nectarina, nuez, avena, aceite de palma, aceite de semilla de colza, okra, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, chícharo, durazno, cacahuate, pera, pimiento, pérsimo, pina, plátano, ciruela, granada, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino rallado, achicoria, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorbo, pino del sur, frijol de soya, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, azúcar de caña, girasol, patata de dulce, ocozol, tangerina, té, tabaco, tomate, cereal híbrido de trigo/centeno, césped, nabo, sandia, trigo, batata, y calabacín. Más especialmente preferidas son las cosechas de semillas oleosas temperadas. Las cosechas de semilla sólidas temperadas de interés, incluyen, pero no se limitan a, colza (cañóla y variedades de alto ácido erúsico, girasol, cártamo, algodón, soya, cacahuate, coco y aceite de palma y maíz. Dependiendo del método para introducir las construcciones recombinantes dentro de la célula hospedera, pueden requerirse otras secuencias de ADN. Importantemente, está invención es aplicable a especies semejantes dicotiledóneas y monocotiledóneas y será fácilmente aplicable a nuevas y/o técnicas mejoradas para transformación y regulación. De particular interés, es el uso de construcciones de prenil transferasa en plantas para producir plantas o partes de plantas, incluyendo, pero no limitadas a hojas, tallos, raíces, partes reproductivas, y semillas, con un contenido modificado de tocoferoles en las partes vegetales que tienen células vegetales transformadas.
Para la selección inmunológica, los anticuerpos de la proteína pueden prepararse al inyectar conejos o ratones con la proteína purificada o una porción de la misma, dichos métodos para preparar anticuerpos se conocen bien por los expertos en la técnica. Los anticuerpos ya sea monoclonales o policlonales pueden producirse, aunque típicamente los anticuerpos policlonales son más útiles para aislamiento génico. Los análisis Western pueden conducirse para determinar que una proteína relacionada está presente en un extracto crudo de la especie vegetal deseada, como se determina mediante reacción cruzada con los anticuerpos de las proteínas codificadas. Cuando la reactividad cruzada se observa, los genes que codifican las proteína relacionadas se aislan mediante genotecas de expresión de selección que representan las especies vegetales deseadas. Las genotecas de expresión pueden construirse en una variedad de vectores comercialmente disponibles, incluyendo lambda gt 11 , como se describe en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Para confirmar la actividad y especificidad de las proteínas codificadas por la secuencias de ácidos nucleicos identificadas como enzimas preniltransferasas, los ensayos in vitro en cultivos de células de insecto utilizan sistemas de expresión de baculovirus. Dichos sistemas de expresión de baculovirus se conocen en la técnica y se describen por Lee, et al., patente de E.U.A. No. 5,348,886, la totalidad de la cual se incorpora aquí como referencia.
Además, otras construcciones de expresión pueden prepararse para evaluar la actividad de la proteína utilizando distintos sistemas de expresión. Dichas construcciones de expresión se transforman dentro de hospederos levaduras o procariontes y se evalúan para actividad de preniltransferasa. Dichos sistemas de expresión se conocen en la técnica y son fácilmente disponibles a través de fuentes comerciales. Además de las secuencias descritas en la presente invención, las secuencias que codifican ADN útiles en la presente invención pueden derivarse a partir de alga, hongo, bacteria, fuentes de mamífero, plantas, etc. Las búsquedas de homología en las bases de datos existentes utilizando características de secuencias que corresponden a las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos conservados de preniltransferasas que pueden emplearse para aislar genes equivalentes, relacionados a partir de otras fuentes tales como plantas y microorganismos. Las búsquedas en las bases de datos EST también pueden emplearse. Además, también se abarca por la presente invención el uso de secuencias de ADN que codifican enzimas funcionalmente enzimáticamente equivalentes a aquellas descritas aquí, donde dicha secuencias de ADN son equivalentes de generados de las secuencias de ácidos nucleicos descritos aquí de acuerdo con la degeneración del código genético. La demostración de la funcionalidad de las secuencias codificadas identificadas por cualesquiera de estos métodos puede llevarse a cabo mediante la complementación de mutantes de organismos apropiados, tales como Synechocystis, Shewanella, levadura, Pseudomonas, Rhodobacteria, etc., que carecen de reacciones bioquímicas específicas, o que han sido mutados. Las secuencias de las regiones que codifican ADN pueden optimizarse mediante re-síntesis génica, basándose en el uso de codón, para la expresión máxima en hospederos particulares. Para la alteración de la producción de tocoferol en una célula hospedera, una segunda construcción de expresión puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la construcción de expresión de prenil transferasa puede introducirse dentro de una célula hospedera en conjunción con una segunda construcción de expresión que tiene una secuencia nucleotídica para una proteína implicada en la biosíntesís de tocoferol. a El método de transformación para obtener dichas plantas transgénicas no es crítico para la presente invención, y varios métodos de transformación vegetal están actualmente disponibles. Además, conforme nuevos métodos se vuelven disponibles para transformación de cosechas, estos también pueden utilizarse directamente en la presente. Por ejemplo, muchas especies vegetales naturalmente susceptibles a la infección por Agrobacterium pueden transformarse exitosamente vía métodos de vector tripartito o binario de la transformación mediada por Agrobacterium. En muchos casos, será deseable tener la construcción limitada a uno o ambos lados por ADN-T, particularmente hacia los bordes izquierdos y derechos, más particularmente el borde derecho. Esto es particularmente útil cuando se utilizan las construcciones de A. tumefaciens o A rhizogenes como un modo de transformación, aunque el ADN-T que lo limita puede encontrar su uso con otros modos de transformación. Además, las técnicas de microinyección, bombardeo de partículas de ADN, y electroporación se han desarrollado los cuales permiten la transformación de varias especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Normalmente, incluidos con las construcciones de ADN estarán los genes estructurales que tienen las regiones reguladoras necesarias para la expresión en un hospedero y que se proveen para la selección de células transformantes. El gen puede proveerse para la resistencia a un agente citotóxico, por ejemplo, antibiótico, metal pesado, toxina, etc., proveyendo complementacíón de prototropía a una hospedero auxotrófico, inmunidad viral o similar. Dependiendo del número de especies hospederas diferentes la construcción de expresión o los componentes de los mismos se introducen, uno o más marcadores pueden emplearse, donde las condiciones diferentes para la selección se utilizan para los diferentes hospederos. Donde Agrobacterium se utiliza para la transformación de la célula vegetal, un vector puede utilizarse el cual se introduce dentro del hospedero de Agrobacterium para la recombinación homologa con ADN-T o el plásmido Ti o Ri presente en el hospedero Agrobacterium. El plásmido Ti- o Ri que contiene el ADN-T para la recombinación puede armarse (capaz de causar formación de agallas) o desarmarse incapaz de causar formación de agallas), este último siendo permisible, siempre y cuando los genes Agrobacterium estén presentes en el hospedero. Los plásmidos armados pueden dar una mezcla de células vegetales normales y de agallas. En algunos ejemplos donde Agrobacterium se utiliza como el vehículo para las células vegetales hospederas transformadas, la expresión o construcción de transcripción limitada por la región del límite(s) ADN-T se insertará dentro de un vector con un amplio intervalo de hospederos capaz de replicación en E.coli y Agrobacterium, en donde ambos vectores con amplio intervalo de hospedero se describen en la literatura. Comúnmente usado es pRK2 o derivado del mismo. Véase, por ejemplo, Ditta, et al., (Proc. Nat. Acad. Sci, U.S.A. (1990) 77:7347-7351) y EPA 0 120 515, que se incorporan aquí como referencias. Alternativamente, uno puede insertar las secuencias a ser expresadas en las células vegetales dentro de un vector que contiene secuencias de replicación separadas, una de las cuales se estabiliza el vector en E.coli, y la otra en Agrobacterium. Véase, por ejemplo, McBride, et al. (Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276), en donde el pRiHRI (Jouanin, et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201 :370-374) origen de la replicación se utiliza y se provee para la estabilidad añadida de los vectores de expresión vegetal en las células hospederas de Agrobacterium. Incluidos con la construcción de expresión y con el ADN-T estarán uno o más marcadores, que permiten la selección de Agrobacterium transformado y de células vegetales transformadas. Un número de marcadores se ha desarrollado para utilizar con células vegetales, tales como resistencia a cloramfenicol, canamicina, el aminoglucósido G418, higromicina, o similares. El marcador particular empleado no es esencial en esta invención, uno u otro marcador siendo preferidos dependiendo del hospedero particular y la manera de la construcción. Para la transformación de células vegetales utilizando Agrobacterium, los explantes pueden combinarse e incubarse con el Agrobacterium transformado por el tiempo suficiente para la transformación, la bacteria puede eliminarse, y las células vegetales cultivarse en un medio de selección apropiado. Una vez que se forma el callo, la formación de las raíces puede promoverse al emplear las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con métodos conocidos y las plántulas transferirse a medio enrraizante para la regeneración de plantas. Las plantas pueden crecerse para que formen semillas y las semillas utilizarse para establecer generaciones repetitivas y para aislamiento de aceites vegetales. Hay varios modos posibles para obtener las células vegetales de esta invención que contienen múltiples construcciones de expresión. Cualesquiera métodos para producir una planta que comprende una construcción que tiene una secuencia de ADN que codifica la construcción de expresión de la presente invención, y al menos una otra construcción que tiene otra secuencia de ADN que codifica una enzima se abarcan por la presente invención. Por ejemplo, la construcción de expresión puede utilizarse para transformar una planta al mismo tiempo como la segunda construcción ya sea por la inclusión de ambas construcciones de expresión en un vector de transformación único o al usar vectores separados, cada uno de los cuales expresa genes deseados. La segunda construcción puede introducirse dentro de una planta que ha sido transformada con la construcción de expresión de preníltransferasa, o alternativamente, plantas transformadas, una expresando la construcción de preniltransferasa y una expresando la segunda construcción, pueden cruzarse para colocar las construcciones juntas en la misma planta. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse en construcciones para proveer la expresión de la secuencia en una variedad de células hospederas, tanto procariontes como eucariontes. Las células hospederas de la presente invención preferiblemente incluyen células vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas. En general, el técnico experto esta familiarizado con los materiales de fuentes estándares que describen las condiciones específicas y los procedimientos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), generación de organismos recombinantes y selección y aislamiento de clonas, (véase por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga eí al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995), la totalidad de los cuales se incorpora aquí como referencia; Birren eí al., Genoma Analysis: Analyzing DNA, 1 , Cold Spring Harbor, New York, la totalidad de la cual se incorpora aquí como referencia).
Los métodos para la expresión de secuencias en las células hospederas de insecto se conocen en la técnica. Los vectores de expresión de vaculovirus son virus de insectos recombinantes en los que la secuencia codificante para un gen externo elegido sea insertado entre un promotor de vaculovirus en el lugar del gen viral, por ejemplo, polihedrina (Smith y Summers, patente de E. U. A. No., 4,745,051 , la totalidad de los cuales se incorpora aquí como referencia). Los vectores de expresión de vaculovirus se conocen en la técnica, y se describen por ejemplo en Doerfler, Curr. Top. Microbial. Immunol. 731-51-68 (1968); Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47-55 (1988a); Miller, Annual Review of Microbiol. 42: 177-199 (1988); Summers, Curr. Comm. Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Summers y Smith, A Manual of Methods for baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Ag. Exper. Station Bulletin No. 1555 81988), la totalidad de los cuales se incorpora aquí como referencia). Los métodos para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en una célula hospedera fungal se conocen en la técnica. La célula hospedera fungal puede, por ejemplo, ser una célula de levadura o una célula fungal filamentosa. Los métodos para la expresión de las secuencias de ADN de interés en las células hospederas se describen generalmente en "Guide to yeast genetics and molecular biology", Guthrie y Fink, eds. Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. Vol 194 (1991) y Gene expression technology", Goeddel ed, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Vol 185 (1991 ). Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospederos para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), tal como células HeLa, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon de hámster pequeño (BHK) y un número de otras líneas celulares. Diversos promotores para las células de mamífero también se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, promotores vírales tales como el virus del simio 40 (SV40) (Fiers eí al., Nature 273:113 (1978), la totalidad de los cuales se incorpora aquí como referencia), virus del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV) y virus del papiloma de bovino (BPV). Las células de mamífero también pueden requerir secuencias de terminadores y secuencias de poli-A adición. Las secuencias mejoradoras que incrementan la expresión también pueden incluirse y las secuencias que promueven la amplificación de los genes también pueden ser deseables (por ejemplo genes de resistencia a metotrexato). Los vectores adecuados para la replicación en células de mamífero son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir replicones virales, o secuencias con integración garantizada para las secuencias apropiadas que codifican epítopes dentro del genoma hospedero. Los vectores plasmídicos que grandemente facilitan la construcción de virus recombinantes se han descrito (véase, por ejemplo, Mackett eí al., J Virol. 49:857 (1984); Chakrabarti eí al., Mol. Cell. Biol 5:3403 (1985); Moss, Ing: Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., p. 10, (1987); todos los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad. La invención ahora descrita generalmente, será más fácilmente entendida como referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen para propósitos de ilustración solamente y no se pretende que limiten la presente invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de secuencias de preniltransferasa PSI-BLAST (Altschul, et al. (1997) Nucleic. Acid Res 25:3389- 3402) perfiles se generaron a partir de ambas clases de preniltransferasa de cadena recta y aromática. Para generar el perfil de cadena recta, una preníltransferasa a partir de Porphyra purpurea (Genbank acceso 1709766) se utilizó como una búsqueda en contra de NCBI en la base de datos de proteínas no redundantes. La enzima de E. Coli implicada en la formación de ubiquinona, (genbank acceso 1790473) se utilizó como una secuencia de inicio para generar el perfil de preniltransferasa aromática. Estos perfile se utilizaron para buscar ADN y proteína en bases de datos públicas y de propietarios. En Arabidopsis siete preniltransferasas putativas de la clase de cadena recta se identificaron, ATPT1, (SEQ ID NO: 9), ATPT7 (SEQ ID NOMO), ATPT8 (SEQ ID NO:11), ATPT9 (SEQ ID NO:13), ATPT10 (SEQ ID NO:14), ATPT11 (SEQ ID NO:15) y ATPT12 (SEQ ID NO:16) y cinco se identificaron de la clase aromática, ATPT2 (SEQ ID NO:1), ATPT3 (SEQ ID NO:3), ATPT4 (SEQ ID NO:5), ATPT5 (SEQ ID NO:7), ATPT6 (SEQ ID NO:8). Las secuencias de preniltransferasas adicionales para otras plantas relacionadas con la clase aromática de preniltransferasa, tales como soya (SEQ ID NOs: 19-23, la secuencia de aminoácido deducida de SEQ ID NO:23 se provee en SEQ ID NO:24) y maíz (SEQ ID NOs:25-29, y 31 ) también se identificaron. La secuencia de aminoácido deducida de ZMPT5 (SEQ ID NO:29) se provee en SEQ ID NO:30. Las búsquedas se llevaron a cabo en una computadora Silicon Graphics Unix utilizando el hardware adicional Bioaccellerator y el software Gen Web suplementado por Compugen Ltd. Estos software y hardware capacitan el uso del algoritmo de Smith-Waterman en la búsqueda de ADN y proteína en bases de datos utilizando perfiles como búsquedas. El programa utilizado para la búsqueda de bases de datos de proteínas es profilesearch. Esta es una búsqueda donde la búsqueda no es una secuencia única sino un perfil basado en un alineamiento múltiple de una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos. El perfil se utiliza para buscar un juego de datos de secuencias, es decir, un base de datos de secuencia. El perfil contiene toda la información pertinente para evaluar cada posición en una secuencia, reemplazar en efecto la "evaluación de la matriz" utilizado para la búsqueda estándar. El programa utilizado para la búsqueda de base de datos de nucleótidos con un perfil de proteína es tprofilesearch. Las búsquedas tprofilesearch de bases de datos de ácido nucleicos utilizan una búsqueda de perfil de aminoácido. Conforme la búsqueda está corriendo, las secuencias en las bases de datos se traducen a secuencias de aminoácidos en seis marcos de lectura. El archivo de salida para tprofilesearch es idéntico al archivo de salida para profilesearch excepto por una columna adicional que indica el marco en el que ocurre el mejor alineamiento. El algoritmo Smith-Waterman, (Smith y Waterman (1981) anteriormente mencionados), se utiliza para la búsqueda de similitudes entre una secuencia a partir de la búsqueda y un grupo de secuencias contenidas en la base de datos. Los valores de evaluación E así como otra información de secuencia, tales como la secuencia peptídica conservada se utilizan para identificar secuencias relacionadas. Para obtener la región codificante completa que corresponde a la secuencia de freniltransferasa de Arabidopsis, los iniciadores oligo-nucleótidos sintéticos se diseñan para amplificar los extremos 5' y 3' de las clonas parciales de ADNc que contienen secuencias de freniltransferasa. Los iniciadores se diseñan de conformidad con las secuencias de freniltransferasa de Arabidopsis respectivas y se utilizan en las reacciones de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman eí al. (1988) Proc. Nati. Acad.
Sci. USA 85:8998-9002) utilizado en equipo de amplificación Marathón ADNc (Clontech Laboratories Inc. Palo Alto, CA). En adición a las búsquedas BLAST que se llevan a cabo utilizando la secuencia ATPT2, una secuencia en la clase de freniltransferasas aromáticas. Las secuencias adicionales son idénticas en las genotecas de soya que son similares a las secuencia ATPT2. La secuencia de soya adicional demuestra 80% de identidad y 91% de similitud en la secuencia de aminoácidos. Los alineamientos de secuencias de aminoácidos entre ATPT2 (SEQ ID NO: 2), ATPT13 (SEQ ID NO: 4), ATPT4 (SEQ ID NO: 6), ATPT8 (SEQ ID NO: 12), y ATPT12 (SEQ ID NO: 17) se lievan a cabo utilizando ClustalW (figura 1 ), y el porcentaje de identidad y de similitud de se provee en el cuadro 1 a continuación.
CUADRO 1 EJEMPLO 2 Preparación de construcciones de expresión Un plásmido que contiene el cassette napin derivado a partir de pCGN3223 (descrito en USPN 5,639,790), la totalidad de la cual se incorpora aquí como referencia) se modificó para hacerlo más útil para la clonación de fragmentos largos de ADN que contienen múltiples sitios de restricción, y para permitir la clonación de múltiples genes de fusión napin dentro de los vectores de transformación binarios vegetales. Un adaptador que comprendía del oligonucleótido autoacoplado de la secuencia CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCC ATTTAAAT (SEQ ID NO: 40) se ligó dentro del vector de clonación pBC SK+ (Stratagene) después de la digestión con las endonucleasas de restricción BssHIl para el vector de construcción pCGN7765. Los plásmidos pCGN3223 y pCGN7765 se digirieron con Notl y se ligaron juntos. El vector resultante, pCGN7770 contiene la estructura pCGN7765 con el cassette de expresión específico para la semilla de napin a partir de pCGN3223. El cassette de clonación, pCGN7787, esencialmente tiene los mismos elementos reguladores de pCGN7770, con la excepción de las regiones reguladoras de napin de pCGN7770 que han sido reemplazadas con el doble promotor CAMV 35S y con la región de terminación de la transcripción y de poliadenilación tml. Un vector binario para la transformación vegetal, pCGN5139 se construyó a partir de pCGN1558 (McBride y Summerfeit, (1990) Plant Molecular Biology, 14: 269-276). El poliadaptador de pCGN1558 se reemplazó como un fragmento Hindlll/Asp718 con un poliadaptador que contiene un único sitio de endonucleasa de restricción, Ascl, Pací, XabL, SwaI, BamHl, y Notl. Los sitios de endonucleasas de restricción Asp718 y Hindlll se retienen en pCGN5139. Una serie de turbo vectores binarios se construye para permitir la clonación rápida de secuencias de ADN dentro de vectores binarios que contienen regiones de inicio de la transcripción (promotores) y regiones de terminación de la transcripción. El plásmido pCGN8618 se construyó al ligar el oligonucleótido 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 41) y 5'- TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 42) dentro de Sall/Xhol-digerido con pCGN7770. Un fragmento que contiene el promotor napin, poliadaptador y región napin 3' se corto a partir de pCGN8618 mediante la digestión con Asp718l; el fragmento se unió mediante llenado en los extremos 5' con el fragmento Klenow y luego se ligó dentro de pCGN5139 que había sido digerido con Asp718l y Hindlll y se había unido mediante llenado en Iso extremos 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contiene el inserto orientado de manera que el promotor napin estaba más cerca hacia el sitio unido Asp718l de pCGN5139 y el napin 3' estaba más cercano al sitio Hindlll se sometió a análisis de secuencia para confirmar tanto la orientación de la inserción y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante se designó pCGN8622. El plásmido pCGN8619 se construyó al ligar el oligonucleótido 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGCATCC-3 (SEQ ID NO: 43) y 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 44) dentro de Sall/Xhol-digerido con pCGN7770. Un fragmento que contiene el promotor napin, poliadaptador y región napin 3' se corto a partir de pCGN8618 mediante la digestión con Asp718l; el fragmento se unió mediante llenado en los extremos 5' con el fragmento Klenow y luego se ligó dentro de pCGN5139 que había sido digerido con Asp718l y Hindlll y se había unido mediante llenado en Iso extremos 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contiene el inserto orientado de manera que el promotor napin estaba más cerca hacia el sitio unido Asp718l de pCGN5139 y el napin 3' estaba más cercano al sitio Hindlll se sometió a análisis de secuencia para confirmar tanto la orientación de la inserción y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante se designó pCGN8623. El plásmido pCGN8620 se construyó al ligar el oligonucleótido 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT -3' (SEQ ID NO:45) y 5'- CCTGCGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO:46) dentro de Sall/Xhol-digerido con pCGN7770. Un fragmento que contiene el promotor napin, poliadaptador y región napin 3' se corto a partir de pCGN8620 mediante la digestión con Asp718l; el fragmento se unió mediante llenado en los extremos 5' con el fragmento Klenow y luego se ligó dentro de pCGN5139 que había sido digerido con Asp718l y HindIII y se había unido mediante llenado en Iso extremos 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contiene el inserto orientado de manera que el promotor napin estaba más cerca hacia el sitio unido Asp718l de pCGN5139 y el napin 3' estaba más cercano at sitio Hindlll se sometió a análisis de secuencia para confirmar tanto la orientación de la inserción y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante se designó pCGN8624. El plásmido pCGN8621 se construyó al ligar el oligonucleótido 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3' (SEQ ID NO:47) y 5'-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3" (SEQ ID NO:48).dentro de Sall/Xhol-digerido con pCGN7770. Un fragmento que contiene el promotor napin, poliadaptador y región napin 3' se corto a partir de pCGN8621 mediante la digestión con Asp718l; el fragmento se unió mediante llenado en los extremos 5' con el fragmento Klenow y luego se ligó dentro de pCGN5139 que había sido digerido con Asp718l y Hindlll y se había unido mediante llenado en Iso extremos 5' con el fragmento Klenow. Un plásmido que contiene el inserto orientado de manera que el promotor napin estaba más cerca hacia el sitio unido Asp718l de pCGN5139 y el napin 3' estaba más cercano al sitio Hindlll se sometió a análisis de secuencia para confirmar tanto la orientación de la inserción y la integridad de las uniones de clonación. El plásmido resultante se designó pCGN8625. La construcción del plásmido pCGN8640 en una modificación de pCGN8624 descrito anteriormente. Un fragmento A 938bp Pstl aislado a partir de transposón Tn7 que codifica la resistencia a espectinomicina y estreptomicina bacteriana (Fling et al. (1985), Nucleic Acids Research 13(19):7095-7106), un determinante para selección de E. coli y Agrobacterium, se unió con polimerasa Pfu. El fragmento unido se ligó dentro de pCGN8624 que había sido digerido con Spel y unido con polimerasa Pfu. La región que contiene el fragmento Pstl se secuenció para confirmar tanto la orientación del inserto y la integridad de las uniones de clonación. El marcador de resistencia a espectinomecina se introdujo dentro de pCGN8622 y pCGN8623 como sigue. Un fragmento 7.7 Kpb AvrlI-SnaBl a partir de pCGN8640 se ligó a un fragmento 10.9 KbpArrlI-SnaBI a partir de pCGN8623 o pCGN8622, descrito anteriormente. Los plásmidos resultantes fueron pCGN8641 o pCGN8643, respectivamente.
El plásmido pCGN8644 se construyó al ligar los oligonucleótidos 5'-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3' (SEQ ID NO:49) Y 5'- TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGGCAGGT-3' (SEQ ID NO:50) dentro de pCGN8640digerido con BamHI-Pstl. Los oligonucleótidos sintéticos se diseñaron para uso en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencias codificantes de ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT4, ATPT8, y ATPT12 para la preparación de las construcciones de expresión y se proveen en el cuadro 2 a continuación.
CUADRO 2 Las secuencias codificantes de ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT4, ATPT8, y ATPT12 fueron todas amplificadas utilizando los iniciadores de PCR respectivos mostrados en el cuadro 2 anteriormente mencionado y clonados dentro del vector TopoTA (Invitrogen). Las construcciones que contienen la secuencia de preniltransferasa respectiva se digirieron con Notl y Sse838711 y se clonaron dentro los vectores turbo binarios descritos anteriormente. La secuencia que codifica ATPT2 preniltransferasa se clonó en la orientación sentido dentro de pCGN8640 para producir la construcción de transformación vegetal pCGN10800 (figura 2). La secuencia ATPT2 esta bajo control del promotor 35S. La secuencia ATPT2 también se clonó en la orientación antisentido dentro de la construcción pCGN8641 para crear pCGN 10801 (figura 3). Está construcción se provee para la expresión antisentido de la secuencia ATPT2 a partir del promotor napin. La secuencia codificante de ATPT2 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8643 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10802. La secuencia codificante de ATPT2 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8644 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10803 (figura 4). La secuencia codificante de ATPT4 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN864 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10806 (figura 5). La secuencia codificante de ATPT2 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN864 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10807 (figura 6). La secuencia codificante de ATPT3 también se clonó en la orientación antisentido dentro dei vector pCGN864 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10808 (figura 7). La secuencia codificante de ATPT3 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8640 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10809 (figura 8). La secuencia codificante de ATPT3 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8641 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10810 (figura 9). La secuencia codificante de ATPT3 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8643 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10811 (figura 10). La secuencia codificante de ATPT3 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8640 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10812 (figura 11). La secuencia codificante de ATPT4 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8640 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10813 (figura 12). La secuencia codificante de ATPT4 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8643 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10814 (figura 13). La secuencia codificante de ATPT4 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8641 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10815 (figura 14). La secuencia codificante de ATPT4 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8644 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10816 (figura 15). La secuencia codificante de ATPT2 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN??? para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10817 (figura 16). La secuencia codificante de ATPT8 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8643 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10819 (figura 17). La secuencia codificante de ATPT12 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8644 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10824 (figura 18). La secuencia codificante de ATPT12 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN8641 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN10825 (figura 19). La secuencia codificante de ATPT8 también se clonó en la orientación antisentido dentro del vector pCGN844 para crear la construcción de transformación vegetal pCGN 10826 (figura 20).
EJEMPLO 3: Transformación vegetal Las plantas de Brassica transgénicas se obtuvieron mediante transformación mediada por Agrobacterium como se describe por Radke et al. (Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11 :499-505). Las plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana pueden obtenerse mediante transformación mediada por Valverkens et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540), como se describe por Bent et al ((1994), Science 265:1856-1860), o Bechtold et al. ((1993), C. R. Acad. Sci, Life Sciencies 316:1194-1199). Otras especies vegetales pueden similarmente transformarse utilizando técnicas relacionadas. Alternativamente, los métodos de bombardeo por microproyectiles tales como los descritos por Klein et al. (Bio/Technology 10:286-291) plantas transformadas nucleares.
EJEMPLO 4 Identificación de preniltransferasas adicionales Un perfil PSI-Blast generando utilizando el E. coli ubiA (genbank acceso 1790473) secuencia se utilizó para analizar el genoma de Synechocystis. Este análisis identifico 5 marcos de lectura abiertos (ORFs) en el genoma de Synechocystis que fueron preniltransferasas potencialmente; slr0926 (anotado como ubiA (4-hidroxibenzoato-octaprenil transferasa, SEQ ID NO:32), sll1899 (anotado como ctaB (proteína de plegamiento de la citocromo c oxidasa, SEQ ID NO:33), slr0056 (anotada como g4 (clorofil sintasa subunidad de 33 kd, SEQ ID NO:34), slr1518 (anotada como menA (proteína de biosíntesis de menaquinona, (SEQ ID NO: 35), y slr1736 (anotada como proteína hipotética de función desconocida (SEQ ID NO:36).
Para determinar la funcionalidad de estos ORF y su participación si hay alguna, en la biosíntesis de tocoferoles, las construcciones ORF se hicieron para alterar los Synechocystis. Los oligos sintéticos se diseñaron para amplificar regiones a partir de 5'(5'-TAATGTGTACATTGTCGGCCTC (17365') (SEQ ID NO:61 ) y 5'- GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTTGGCTTTCCACAATTCC CCGCACCGTC (1736kanprl)) (SEQ ID NO:62) y 3' (5'-AGGCTAATAAGCACAAATGGGA (17363') (SEQ ID NO:63) y 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGAATTG GTTTAGGTTATCCC (1736kanpr2) (SEQ ID NO:64) extremos del slr1736 ORF. Los oligos 1736kanprl y 1736kranpr2 que contienen 20 pb de homología con el slr736 ORF con 40 pb adicionales de homología de secuencia en los extremos del cassette de resistencia de canamicina. Los pasos de PCR separados se complementaron con estos oligos y los productos se purifican en gel y se combinaron con el gel de resistencia a canamicina a partir de puc4k (Pharmacia) que había digerido con Hindl y purificado a fuera del gel a partir de la estructura del vector. Los fragmentos combinados se dejaron ensamblar sin oligos bajo las siguientes condiciones: 94°C por 1 min, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minutos más 5 segundos por ciclo por 40 ciclos utilizando polimerasa 100ul en un volumen de reacción de (Zhao, H y Arnold (1997) Nucleico Acids Res. 25(6(: 1307-1308). Un microl?to de los 5 microlitros de esta reacción de ensamblaje se amplificaron utilizando oligos agrupados de 5' y 3' dentro de los extremos del fragmento ORF, de manera que el producto resultante contenía 100-200 pb del extremo 5' del gen de Synechocystis para hacer alterado, el cassette de resistencia de canamicina, y 100-200 pb del extremo 3' del gen hacer alterado. Este producto de PCR se clono entonces dentro del vector pGemT fácil (Promega) para crear la construcción pMON21681 y utilizarla para transformación de Synechocystis. Los iniciadores también se sintetizaron a partir de la preparación de construcciones alteradas de Synechocystis para las otras secuencias utilizando el mismo método como se describió anteriormente, con los siguientes iniciadores. La secuencias ubiA 5' se amplifico utilizando el i iniciador 5'-GGATCCATGGTT GCCCAAACCCCATC (SEQ ID NO:65) Y 5'-GCAATGTAACATCAGAGA TTTTGAGACACAACG TGGCTTTGGGTAAGCAACAATGACCGGC (SEQ ID NO:66). La región 3' se amplificó utilizando los iniciadores oligonucleótidos sintéticos 5'-GAATTCTCAAAGCCAAGCCCAGTAAC (SEQ ID NO:67) y 5'-GGTATGAGTC AGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTTCAGCGGGTGCGAAAAGGGTT TTCCC (SEQ ID NO:68). Los productos de amplificación de combinaron con el gen de resistencia canamicina a partir de puc4K (Pharmacia) que había sido dirigido con Hind\ y purificado fuera del a partir de la estructura del vector. El fragmento acopiado se amplificó utilizando oligos agrupados 5' y 3' dentro de los extremos del fragmento ORF (5'-CCAGTGGTTTAGGCTGTGTGGTC (SEQ ID NO:69) y 5'-CTGAGTTGGATGTATTGGATC (SEQ ID NO:70)), de manera que el producto resultante contenía 100-200 pb del extremo 5' del gen de Synechocystis al ser alterado, el cassette de resistencia canamicina, y 100-200 pb del extremo 3' del gen hacer alterado. Este producto de PCR fue entonces clonado dentro del vector pGemT fácil (Promega) para crear la construcción pMON21682 y utilizarla para transformación de Synechocystis. Los iniciadores también se sintetizaron a partir de la preparación de construcciones alteradas de Synechocystis para las otras secuencias utilizando el mismo método como se describió anteriormente, con los siguientes iniciadores. La secuencias sil 1899 5' se amplifico utilizando el iniciador 5'-GGATCCATGGTTACTT CGACAAATCC (SEQ ID NO:71) Y 5'-GCAATGTAACATCAGAG ATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGCTAGGCAACCGCTTAGTAC (SEQ ID NO:72). La región 3' se amplificó utilizando los iniciadores oligonucleótidos sintéticos 5'-GAATTCTTAACCCAAGTAAAGTTCCC (SEQ ID NO:73) y 5'-GGTATGAGTCAGC AACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCGGCATTGTCTTTTACATG (SEQ ID NO:74). Los productos de amplificación de combinaron con el gen de resistencia canamicina a partir de puc4K (Pharmacia) que había sido dirigido con Hindl y purificado fuera del a partir de la estructura del vector. El fragmento acoplado se amplificó utilizando oligos agrupados 5' y 3' dentro de los extremos del fragmento ORF (5'-GGAACCCTTGCAGCCGCTTC (SEQ ID NO:75) y 5'-GTATGCCCAACTGGTGCAGAGG (SEQ ID NO:76)), de manera que el producto resultante contenía 100-200 pb del extremo 5' del gen de Synechocystis al ser alterado, el cassette de resistencia canamicina, y 100-200 pb del extremo 3' del gen hacer alterado. Este producto de PCR fue entonces clonado dentro del vector pGemT fácil (Promega) para crear la construcción pMON21679 y utilizarla para transformación de Synechocystis. Los iniciadores también se sintetizaron a partir de la preparación de construcciones alteradas de Synechocystis para las otras secuencias utilizando el mismo método como se describió anteriormente, con los siguientes iniciadores. La secuencias slr0056 5' se amplifico utilizando el iniciador 5'-GGATCCATGTCTGACACACAAAATACCG (SEQ ID NO:77) Y 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCGCCAATACC AGCCACCAACAG (SEQ ID NO:78). La región 3' se amplificó utilizando los iniciadores oligonucleótidos sintéticos d'-GAATTCTCAAAT CCCCGCATGGCCTAG (SEQ ID NO:67) y 5'-GGTATGAGTC AGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGCCTACGGCTTGACGT GTGGG (SEQ ID NO:80). Los productos de amplificación de combinaron con el gen de resistencia canamicina a partir de puc4K (Pharmacia) que había sido dirigido con Hind\ y purificado fuera del a partir de la estructura del vector. El fragmento acoplado se amplificó utilizando oiigos agrupados 5' y 3' Los iniciadores también se sintetizaron a partir de la preparación de construcciones alteradas de Synechocystis para las otras secuencias utilizando el mismo método como se describió anteriormente, con los siguientes iniciadores. La secuencias slr0056 5' se amplificó utilizando el iniciador 5'- CACTTGGATTCCCCTGATCTG (SEQ ID NO:81) y 5'-CACTTGGATTCCCCTGATCTG (SEQ ID NO:81), de manera que el producto resultante que contiene 100-200 pb del extremo 5' del gen Synechocystis se le haga un knock-out, el cassette de resistencia a canamicina, y 100-200 pb del extremo 3' del gen a hacerle un knock-out. Este producto de PCR se clonó entonces dentro del vector pGemT fácil (Promega) para crear la construcción pMON21677 y utilizarla en la transformación de Synechocystis. Los iniciadores también se sintetizaron a partir de la preparación de construcciones alteradas de Synechocystis para las otras secuencias utilizando el mismo método como se describió anteriormente, con los siguientes iniciadores. La secuencia s1r1518 5' se amplificó utilizando el iniciador 5'-GGATCCATGACCGAATCTTCGCCCCTAGC (SEQ ID NO:83)y 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGA GACACAACGTGGCTTTCAATCCTAGGTAGCCGAGGCG (SEQ ID NO:84). La región 3' se amplificó utilizando los iniciadores oligonucleótidos sintéticos 5'-GAATTCTTAGCCCAGGCC AGCCCAGCC (SEQ ID NO:85) y 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGGGAAT TGATTTAATTACC (SEQ ID NO:86). Los productos de amplificación de combinaron con el gen de resistencia canamicina a partir de puc4K (Pharmacia) que había sido dirigido con H/A?C/I y purificado fuera del gel a partir de la estructura del vector. El fragmento acopiado se amplificó utilizando oligos agrupados 5' y 3' agrupados dentro de los extremos del fragmento ORF (5'-GCGATCGCCATTATCGCTTGG (SEQ ID NO:87) y 5'- GCAGACTGGCAATTATCAGTAACG (SEQ ID NO:88)), de manera que el producto resultante que contiene 100-^00 pb del extremo 5' del gen Synechocystis se le haga un knock-out, el cassette de resistencia a canamicina, y 100-200 pb del extremo 3' del gen a hacerle un knock-out. Este producto de PCR se clonó entonces dentro del vector pGemT fácil (Promega) para crear la construcción pMON21680y utilizarla en la transformación de Synechocystis.
B. Transformación de Svnechocvstis Las células de Synechocystis 6803 se crecieron a una densidad de aproximadamente 2x108 células por ml y se cosecharon mediante centrifugación. El concentrado celular se resuspendió en medio BG-11 fresco (Medio ATCC 616) a una densidad de 1x109 células por ml y se utilizaron inmediatamente para transformación. Cien microlitros de estas células se mezclaron con 5 ul de ADN miniprep y se incubaron con luz a 30Cpor 4 horas. Esta mezcla se colocó sobre filtros de nylon en reposo sobre agar BG-11 suplementado con TES pH8 y se permitió que crecieran durante 12-18 horas. Los filtros entonces se transfirieron a agar BG-11 +TES+5ug/mI canamicina y se permitió que crecieran hasta que las colonias aparecieron dentro de 7-10 (Packer y Glazer, 1988). Las colonias entonces se seleccionaron dentro de medio líquido BG-11 que contenía canamicina 5 ug/ml y se permitió que crecieran por 5 días. Las células entonces se transfirieron a medio Bg-1 1 que contenía 10ug/ml de canamícina y se permitió que crecieran por 5 días y luego se transfirieron a Bg-11+ canamicina y 25ug/ml se permitió que crecieran por 5 días. Las células entonces se cosecharon para análisis de PCR para determinar la presencia de un ORF alterado y también para análisis de HPLC para determinar si la alteración tuvo algún efecto sobre los niveles de tocoferol. El análisis de PCR de los Synechocystis aislados para slrl 736 y SÜI899 mostraron segregación completa para el genoma mutante, significando que no hay copias del genoma de tipo silvestre que pudieron detectarse en estas cepas. Esto sugiere que la función del gen nativo no es esencia para la función celular. El análisis HPLC de estos mismos aislados muestran que la cepa sil 1899 no tuvo una reducción detectable en los niveles de tocoferol. Sin embargo, la cepa que porta la alteración para slr1736 no produjo niveles detectables de tocoferol. Las secuencias de aminoácidos de las alteraciones Synechocystis se compararon utilizando ClustralW, y se provee en el cuadro 3 a continuación. Se proveen las identidades porcentuales, similitudes porcentuales, y el porcentaje de espacio. El alineamiento de las secuencias se provee en la figura 21.
CUADRO 3: Slrí 736 slr0926 slr1899 slr0056 SIM518 slr1736% de identidad 14 12 18 11 % de similitud 29 30 34 26 % de espacio 8 7 10 5 slr0926% de identidad 20 19 14 % de similitud 39 32 28 % de espacio 7 9 4 slr1899% de identidad 17 13 % de similitud 29 29 % de espacio 12 9 slr0056% de identidad 15 % de similitud 31 % de espacio 8 slr1518% de identidad % de similitud % de espacio La comparación de secuencia de aminoácidos se llevó a cabo utilizando varias secuencias de preniltransferasa de Arabidopsis y la secuencias de Synechocystis. Las comparaciones se presentan en el cuadro 4 a continuación. Se proveen las identidades porcentuales, similitud porcentual, y el porcentaje de espacio. El alineamiento de las secuencias se provee en la figura 22.
CUADRO 4: ATPT2 sir1736 ATPT3 slr0926 ATPT4 slr1899 ATPT12 slr0056 ATPT8 slr1518 ATPT2 29 9 9 8 8 12 9 7 9 46 23 21 20 20 28 23 21 20 27 13 28 23 29 11 24 25 24 Sir1736 9 213 8 12 13 15 8 10 19 28 19 28 26 33 21 26 34 12 34 15 26 10 12 11 ATPT3 23 11 14 13 10 5 22 36 26 26 26 21 14 30 29 21 31 16 30 30 14 Slr0926 12 20 17 20 11 29 24 37 28 33 24 9 33 12 25 10 11 7 ATPT4 18 11 8 6 19 33 23 18 16 33 28 19 32 32 12 slr1899 13 17 10 26 24 30 23 11 27 13 10 11 ATPT1 52 8 11 2 66 19 26 18 25 23 Sir0056 9 13 23 32 10 8 7 ATPT8 23 7 Slr1518 4B. Preparación del slr1737 Knock-out El Synechocystis sp. 6803 slr1737 knock-out se construyó mediante el siguiente método: es sistema GPS™-1 Genome Priming (New England Biolabs) se utilizó para insertar, mediante un sistema de transposasa Tm7, un cassette de resistencia a canamicina dentro de slr1737. Un plásmido a partir de ia clona de genoteca genómica de Synechocystis que contenía 652 pares de bases del Synechocystis dirigido (pares de base de genoma de Synechcocystis 1324051-1324703; el pronóstico de pares de bases orf 1323672-1324763, como se anotó mediante cianobase) se utilizó como ADN blanco. La reacción se llevó a cabo de conformidad con el protocolo de los fabricantes. La mezcla de reacción se retransformó entonces dentro de E. coli DH10B células electrocompetentes y sembradas. Las colonias a partir de esta transportación se seleccionaron entonces para inserciones de transposón dentro de la secuencia blanco para amplificar con iniciadores universales hacia delante y reversos M13, produciendo un producto de 652 pares de bases más -1700 pares de bases, el tamaño del cassette de canamicina del transposón, para un tamaño de fragmento total de -2300 pares de bases. Después de esta determinación, fue entonces necesario determinar la ubicación aproximada de la inserción dentro del orf dirigido, como 100 pares de bases de la secuencia orf que se estimaron como necesarias para la recombinación homologa eficiente en Synechocystis. Esto se logro a través de reacciones amplificación utilizando ya sea los iniciadores de estos extremos del transposón, iniciador S (extremo 5') o N (extremo 3'), en combinación con ya sea el iniciador hacia delante o reverso de M13. Es decir, cuatro diferentes iniciadores y combinaciones se utilizaron para mapear cada construcción knock-out potencial; iniciador S-M13 hacia delante, iniciador S-M13 reverso, iniciador N-M13 hacia delante, iniciador N-M13 reverso. La construcción utilizada para Synechocystis y knock-out slr1737 se determinó que consiste de aproximadamente 150 pares de bases de la secuencia slrl 737 del extremo 5' de la inserción del transposón y aproximadamente 500 pares de bases en el extremo 3', con la transcripción del orf y del cassette de canamicina en la misma dirección. La secuencia de ácido nucleico de slr1737 provee en SEQ ID NO:38 la secuencia deducida de aminoácidos se provee en SEQ ID NO:39. Las células de Synechocystis 6803 se crecieron a una densidad de aproximadamente 2x108 células por ml y se cosecharon mediante centrifugación. El concentrado celular se resuspendió en medio BG-11 fresco (Medio ATCC 616) a una densidad de 1x109 células por ml y se utilizaron inmediatamente para transformación. Cien mícrolitros de estas células se mezclaron con 5 ul de ADN miniprep y se incubaron con luz a 30Cpor 4 horas. Esta mezcla se colocó sobre filtros de nylon en reposo sobre agar BG-11 suplementado con TES pH8 y se permitió que crecieran durante 12-18 horas. Los filtros entonces se transfirieron a agar BG-11 +TES+5ug/ml canamicina y se permitió que crecieran hasta que las colonias aparecieron dentro de 7-10 (Packer y Glazer, 1988). Las colonias entonces se seleccionaron dentro de medio líquido BG-11 que contenía canamicina 5 ug/ml y se permitió que crecieran por 5 días. Las células entonces se transfirieron a medio Bg-1 1 que contenía 10ug/ml de canamicina y se permitió que crecieran por 5 días y luego se transfirieron a Bg-11+ canamicina y 25ug/ml se permitió que crecieran por 5 días. Las células entonces se cosecharon para análisis de PCR para determinar la presencia de un ORF alterado y también para análisis de HPLC para determinar si la alteración tuvo algún efecto sobre los niveles de tocoferol. 4C Pitil Preniltransferasa ensayos enzimáticos Acido [3H] homogentístico en G3PO4 0.1% (radioactividad específica 40/mmol). El pitil pirofostato se sintetizó como se describe por Joo, eí al. (1973) Can J. Biochem. 51 :1527. 2— metil-6-pitilquinol y 2,3-dimetil-5- pitilquinol se sintetizaron como se describió por Solí, eí al. (1980) Phytochemistry 19:215. El ácido homogentístico, a, ß, d, y ? tocoferol, y el tocol, se consiguieron comercialmente. La sepa de tipo silvestre de Synechocystis sp. PCC 6803 se creció en medio BG11 con aire burbujeante a 30°C bajo 50 µE.m"2.s"1 luz fluorescente, 70% de humedad relativa. El medio de crecimiento de slr1736 knock-out (PPT potencial) sepa de este organismo fue suplementada con 25 µg mL"1 de canamicina. Las células se colectaron a partir de 0.25 a un litro de • cultivo mediante centrifugación a 5000 g por 10 minutos y se almacenaron a - 80°C. Las membranas totales se aislaron de conformidad con el procedimiento de Zak con algunas modificaciones (Zak, eí al. (1999) Eur J.
Biochem 261 :311). Las células se rompieron en una prensa francesa. Antes del tratamiento de la prensa francesa, las células se encubaron durante una hora con lisozima (0.5%, p/v) a 30°C en un medio que contienen 7 mM EDTA, 5 mM NaCI y 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4. Los esferoplastos se colectaron mediante centrifugación a 5000 g por 10 minutos y se resuspendieron a 0.1- 0.5 mg clorofila mL"1 en amortiguador de fosfato de potasio 20 mM, pH 7.8. La cantidad apropiada para el cóctel de inhibición de proteasa y ADNasa I de Boehringer Mannheim se añadieron a la solución. Los tratamientos con la prensa francesa se llevaron a cavo dos a tres veces a 100 MPa. Después del rompimiento, la suspención celular se centrifugó por 10 minutos a 5000 g para concentrar las células no rotas y esto siguió por centrifugación a 100 000 g por 1 hora para colectar las membranas totales. El concentrado final se resuspendió en un amortiguador que contiene 50 mM Tris-HCL y 4 mM MgCI2. El concentrado de cloroplastos se aisló a partir 250g de hojas de espinacas obtenidas a partir del mercado local. Las secciones de las hojas se cortaron dentro de un amortiguador de mezclado (21/250 hoja) que contenía 2 mM EDTA, 1 mM MgCI2, 1 mM MnCI2, 0.33 M sorbitol, 0.1 % ácido ascórbico, y 50 mM Hepes a pH 7.5. las hojas se homogeneizaron por tres segundos tres veces en un mezclador 1-L, y se filtraron a través de 4 capas de micropaño. El sobrenadante entonces se centrifugó a 5000 g por 6 minutos. Los concentrados de cloroplastos se resuspendieron en una pequeña cantidad de amortiguador de mezclado (Douce, eí al Methods in Chioroplast Molecular Biology, 239 (1982)). Los cloroplastos en los concentrados pueden romperse de tres maneras. Los concentrados de cloroplastos primero se alicuotaron en 1 mg de clorofila por tubo, se centrifugaron a 6000 rpm por 2 minutos en una microcentrífuga, y el amortiguador de mezclado se removió. Doscientos microlitros de Tritón X.-100 amortiguador (0.1 % Tritón X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7.6 y 4 mM MgCI2) o amortiguador de hinchado (10 mM Tris pH 7.6 y 4 mM MgCI2) se añadieron a cada tubo y se incubaron por Y horas a 4°C.
Luego los concentrados de cloroplastos rotos se utilizaron para el ensayo inmediatamente. En adición, los cloroplastos rotos pueden obtenerse mediante congelación en nitrógeno líquido y almacenarlo a -80°C por horas, y luego usarlos para el ensayo. En algunos casos los concentrados de cloroplastos se purificaron adicionalmente con 49%/80% gradiente de percoll para obtener cloroplastos intactos. Los cloroplastos intactos se rompieron con amortiguador de hinchado, luego ya sea se utilizaron para el ensayo o se purificaron adicionalmente para membranas de cubierta con 20.5%/31.8% de gradiente de densidad de sacarosa (Sol, eí al (1980) anteriormente mencionado). Las fracciones membranales se centrifugaron a 100 000 g por 40 minutos y se resuspendieron en 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 4 mM Mg Cl2. Varias cantidades de [3H]HGA, 40 a 60µM de HGA no marcado con actividad específica en el intervalo de 0.16 a 4Ci/mmol se mezclaron con una cantidad adecuada de 1 M Tris-NaOH pH 10 para ajustar el pH a 7.6. HGA se redujo por 4 minutos con una cantidad grasa de NaBH4. En adición a HGA, la mezcla de incubación estándar (volumen final 1 mL) que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 3-5 mM MgCI2, y 100 µM pitil pirofosfato. La reacción se inhibió mediante la adición de las membranas totales de Synechocystis, los concentrados de cloroplastos de espinaca, los cloroplastos fragmentados de espinaca, o las membranas de cubierta de espinaca. La reacción enzimática se llevó a cabo por 2 horas a 23°C o 30°C en la oscuridad o en luz. La reacción se paró al congelar con nitrógeno líquido, y se almacenó a -80°C o directamente mediante extracción. Una cantidad constante de tocol se añadió a la mezcla de ensayo fácil y los productos de reacción se extrajeron con una mezcla de 2 mL de cloroformo/metanol (1 :2, p/p) para dar una solución monofásica. La solución de NaCI (2 mL: 0.9%) se añadió con vigorosa agitación. Este procedimiento de extracción se repitió tres veces. La capa orgánica que contiene las prenilquinonas se filtró a través de un filtro de 20 mµ, se evaporó bajo N2, y luego se resuspendió en 100µL de etanol Las muestras se analizaron principal mediante método de HPLC de fase normal (Isocratic 90% hexano y 10% metil-t-butiléter), y se utiliza como columna de sílice Zorbax, 4.6 x 250 mm. Las mezclas también se analizaron mediante método de HPLC de fase reversa (Isocratic 0.1% H3PO4 en MeOH), y se utilizó una columna Vydac 201HS54 C18; 4.6 x 250 mm acoplada con una columna de guarda A!l-tech C18. La cantidad de productos se calcularon basándose en la redioactividad específica de substrato, y se ajustaron de conformidad con el % de recuperación basado en la cantidad de estándar interno. La cantidad de clorofila se determinó como se describe en Amon (1949) Plant Physiol. 24:1. La cantidad de proteína se determinó mediante el método de Bradford utilizando gama globulina como un estándar (Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72:248).
Los resultados del ensayo demuestran que 2-metil-6-pitílplastoquinona se producen en las preparaciones Synechocystis slr1736 knockout. Los resultados del ensayo de actividad de la enzima pitílpreniltransferasa para el slr1736 knock out se presentan en la figura 23. 4D. Complementación del slrl 736 knockout con ATPT2 Con el objeto de determinar si ATPT2 pudo complementar el knockout de slr1736 en Synechocystis 6803 un plásmido se construyó para expresar la secuencia ATPT2 a partir del promotord TAC. Un vector, plásmido psI1211 , se obtuvo a partir de laboratorio de Dr. Himadri Pakrasi Unicersidad de Washington, y se basa en el plásmido RSF1010 el cual es un plásmido de amplio intervalo de hospedero (Ng W.-O., Zentella R., Wang, Y., Taylor J-S.A., Pakrasi, H.B. 2000. PhrA. el mayor factor de fotoreactividad en la cianobacteria Synechocystis sp. cepa PCC 6803 codifica para un dímero ciclobutano pirimidina específico de fotoliasa de ADN . Arch. Microbiol. (en prensa)). El gen ATPT2 se aisló a partir del vector pCG 10817 por PCR utilizando los siguientes iniciadores. ATPT2nco.pr 5'- CCATGGATTCGAGTAAAGTTGTCGC (SEQ ID NO:89); ATPT2ri.pr-5'-GAATTCACTTCAAAAAAGGTAACAG (SEQ ID NO:90). Estos iniciadores se removerán aproximadamente 1132 BP a partir del extremo 5' de la secuencia ATPT2, la cual se piensa que el péptido de tránsito del cloroplasto. Estos iniciadores también añadirán un sito Ncol en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3' el cual puede utilizarse para sub-clonación dentro de vectores subsecuentes. El producto de PCR a partir de usar estos iniciadores pCGN10817 se ligo dentro de4 pGEM T fácil y el vector resultante pMON21689 se confirmó mediante la secuenciación utilizando los iniciadores m13 hacia delante y m13 reverso. El fragmento Ncol/EcoRI a partir de Pmon21689 entonces se ligó con los fragmentos Eagl/EcoRI y Eagl/Ncol a partir de psl1211 resultando en pMON21690. El plásmido pMON21690 se introdujo dentro de slr1736 Synechocystis 6803 KO cepa vía la conjugación. Las células de s1906 (una cepa auxiliar) y células DH10B que contienen pMON21690 se crecieron en una fase log (O.D. 600 = 0.4) y 1 ml se cosechó mediante centrifugación. Los concentrados celulares se lavaron dos veces con una solución estéril BG-11 y se resuspendieron en 200 ul de BG-11. Lo siguiente fue una mezcla en un tubo ependor estéril: 50 ul SL906, 50 ul DH10B células que contienen pMON21690, y 100 ul de un cultivo fresco de la cepa sir1736 Synechocystic 6803 KO (O.D. 730 = 0.2-0.4). La mezcla celular se transfirió inmediatamente a un filtro de nitrocelulosa que se encontraba sobre BG-11 y se incubó por 24 horas a 30°C y 2500 LUCX (50 ue) de luz. El filtro entonces se transfirió a BG-11 suplementado con 10ug/ml gentamicina e incubado como anteriormente se mencionó por ~5 días. Cuando las colonias aparecieron, éstas se seleccionaron y se crecieron en líquido BG-11 Gentamycin 10 ug/ml. (Elhai, J. And Wolk, P. 1988. Conjugal transfer of DNA to Cyanobacteria. Methods in Enzymology 167, 747-54). Lo cultivos líquidos entonces se ensayaron para tocoferoles mediante la cosecha de 1 ml de cultivo mediante centrifugación, extrayendo con etanol/pirogalol, y separación por HPLC. La cepa slr1736 Synechocystic 6083 KO, no contenía ningún cotoferol detectable, mientras que la cepa slr1736 Synechocystic 6083 KO transformada con pmon21690 contenía tocoferol alfa detectable. Una cepa slr1736 Synechocystic 6083 transformada con psl1211 (vector control) produjo alfa tocoferol también.
EJEMPLO 5 Análisis de plantas transgénicas Las plantas de arabidopsis transformadas con las construcciones para la expresión sentido o antisentido de las proteínas ATPT se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para los niveles alterados de tocoferoles totales, así como para niveles alterados de tocoferoles específicos (alfa, beta, gama, y delta tocoferol). Los extractos de hojas y semillas se prepararon para HPLC como siguen. Para los extractos de semilla, 10 mg de semilla se añadió a 1 g de microcamas (Biospec) en un tubo de microfuga estéril para el cual 500 ul 1% pyrogallol (Sigma Chem)/etanol se añadió. La mezcla se agitó por 3 minutos en un mini agitador (Biospec) a velocidad "rápida". El extracto se filtró a través de un filtro 0.2 um dentro de un tubo de automuestra. Los extractos filtrados entonces se utilizaron en análisis HPLC descrito a continuación. Los extractos de hojas se prepararon al mezcla 30-50 mg de tejido de hoja con 1 g de microcamas y se congeló en nitrógeno líquido hasta la extracción. Para la extracción, 500 ul 1% de pirogalol en etanol se añadió a la mezcla de hoja/cama y se agitó por 1 minuto en un microagitador (Biospec) a velocidad "rápida". La mezcla resultante se centrifugó por 4 minutos a 14,000 rpm y se filtró como se describió anteriormente para el análisis de HPLC. HPLC se llevó a cabo en una columna de Zorbax de sílice HPLC (4.6 mm x 250 mm) con un detector fluorescente, y la excitación a 290 mm, y emisión a 335nm, y paso de banda y espacios el solvente A fue hexano y el solvente B fue metil-t-butio éter. El volumen de inyección fue 20 ul, la velocidad de flujo fue 1.5 ml/min, el tiempo de corrida fue 12 minutos (40°C) utilizando el gradiente (cuadro 5): CUADRO 5 Tiempo Solvente A Solvente B O min. 90% 10% 10 min. 90% 10% 11 min. 25% 75% 12 min. 90% 10% Los estándares de tocoferol en pirogalol/etanol 1 % también se corrieron para comparación (alfa tocoferol, gama tocoferol, beta tocoferol, delta tocoferol, y tocoferol (tocol) (todos a partir de Matreya). Las curvas estándar para alfa, beta, delta, y gama tocoferol se calcularon utilizando el Chemstation software. La cantidad absoluta de componentes x es: cantidad absoluta de x = Respuestax x RFX x factor de dilución donde la respuestax es al área de pico x, RFX es ia respuesta factor para el componente x (cantidadx/respuestax) y el factor de dilución es 500 µl. El tejido ng/mg se encuentra por: total de ng componente/tejido vegetal mg. Los resultados del análisis HPLC de los extractos de semilla para las líneas transgénicas de Arabidopsis contienen pMON10822 para la expresión de ATAT2 a partir del promotor napin que se proveen en la figura 24. Los análisis HPLC resultan de la expresión de tejido de semilla de Arabidopsis de la secuencia ATAT2 a partir del promotor napin (pMON10822) demuestra un nivel incrementado de tocoferoles en la semilla. Los niveles totales de tocoferol se incrementaron cuando mucho hacia 50 a 60% sobre el nivel total de tocoferol en las plantas Arabidopsis no transformadas (de tipo silvestre) (figura 24). Además, los incrementos de los tocoferoles particulares también se incrementan en las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan la secuencia de ácido nucleico ATAT2 a partir del promotor napin. Los niveles de detal tocoferof en estas líneas se incrementan más de tres veces sobre los niveles de delta tocoferol obtenidos a partir de las semillas de las líneas Arabidopsis de tipo silvestre. Los niveles de gama tocoferol en las líneas Arabidopsis transgénicas expresan la secuencia de ácido nucleico ATAT2 se incrementan en tanto como 60% sobre los niveles obtenidos en las semillas a partir de líneas control no transgénicas. Además, los niveles de alfa tocoferol se incrementan cuando mucho tres veces sobre aquellos obtenidos a partir de las líneas no transgénicas control. Los resultados del análisis HPLC de los extractos de semilla de las líneas Arabidopsis transgénicas que contienen pMON10803 para la expresión de ATAT2 a partir del promotor mejorado 35S se proveen en la figura 25. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se indican en el nivel de los expertos en la técnica al cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan aquí como referencia en el mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente se especificara e indicara individualmente para ser incorporada como referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito en algún detalle por medio de las ilustraciones y los ejemplos para propósitos de claridad del entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
LISIADO DE SECUENCIA <110> Lassner, Michael Post-Beittenmiller, Martha Savidge, Beth Weiss, James <120> Secuencias de Ácidos Nucleicos implicadas en la sínteis de Tocoferol <130> 17133/00/WO <150> 60/129,899 <151> 1999-04-15 <150> 60/146,461 <151> 1999-07-30 <150> PCT/US00/10368 <151> 2000-04-14 <160> 94 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 1182 <212> -ADN < 13> Arabidopsis sp <400> 1 atggagtctc tgctctctag ttcttctctt gtttccgctg ctggtgggtt ttgttggaag 60 aagcagaatc taaagctcca ctctttatca gaaatccgag ttctgcgttg tgattcgagt 120 aaagttgtcg caaaaccgaa gtttaggaac aatcttgtta ggcctgatgg tcaaggatct 180 tcattgttgt tgtatccaaa acataagtcg agatttcggg ttaatgccac tgcgggtcag 240 cctgaggctt tcgactcgaa tagcaaacag aagtctttta gagactcgtt agatgcgttt 300 tacaggtttt ctaggcctca tacagttatt ggcacagtgc ttagcatttt atctgtatct 360 ttcttagcag tagagaaggt ttctgatata tctcctttac ttttcactgg catcttggag 420 gctgttgttg cagctctsat gatgaacatt tacatagttg ggctaaatca gttgtctgat 480 gttgaaatag ataaggttaa caagccctat cttccattgg catcaggaga atattctgtt 540 aacaccggca ttgcaatagt agcttccttc tccatcatga gtttctggct tgggtggatt 600 gttggttcat ggccattgtt ctgggctctt tttgtgagtt tcatgctcgg tactgcatac 660 tctatcaatt tgccactttt acggtggaaa agatttgcat tggttgcagc aatgtgtatc 720 ctcgctgtcc gagctattat tgttcaaatc gccttttatc tacatattca gacacatgtg 780 tttggaagac caatcttgtt cactaggcct cttattttcg ccactgcgtt tatgagcttt 840 ttctctgtcg ttattgcatt gtttaaggat atacctgata tcgaagggga taagatattc 5 900 ggaatccgat cattctctgt aactctgggt cagaaacggg tgttttggac atgtgttaca 960 ctacttcaaa tggcttacgc tgttgcaatt ctagttggag ccacatctcc attcatatgg 1020 agcaaagtca tctcggttgt gggtcatgtt atactcgcaa caactttgtg ggctcgacjct 1080 aagtccgttg atctgagtag caaaaccgaa ataacttcat gttatatgtt catatggaag 1140 ctcttttatg cagagtactt gctgttacct tttttgaagt ga 1182 10 <210> 2 <211> 393 < 12> PRT <213> Arabidopsis sp <400> 2 Met Glu Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Val Ser Ala Ala Gly Gly 1 5 10 15 Plie Cys Trp Lys Lys Gln Asn Leu Lys Leu His Ser Leu Ser Glu He 20 25 30 .Arg Val Leu Arg Cys Asp Ser Ser Lys Val Val Ala Lys Pro Lys Phe 35 40 45 •J5 .Arg Asn Asn Leu Val Arg Pro Asp Gly Gln Gly Ser Ser Leu Leu Leu 50 55 60 Tyr Pro Lys His Lys Ser Arg Phe Arg Val Asn Ala Thr Ala Gly Gln 65 70 75 80 Pro Glu Ala Phe Asp Ser Asn Ser Lys Gln Lys Ser Phe Arg Asp Ser 85 90 95 Leu Asp Ala Phe Tyr Arg Phe Ser Arg Pro His Thr Val He Gly Thr 100 105 110 Val Leu Ser He Leu Ser Val Ser Phe Leu Ala Val Glu Lys Val Ser 115 120 125 Asp He Ser Pro Leu Leu Phe Thr Gly He Leu Glu Ala Val Val Ala 130 135 140 2Q Ala Leu Met Met Asn He Tyr He Val Gly Leu Asn Gln Leu Ser Asp 145 150 155 160 Val Glu He Asp Lys Val Asn Lys Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Gly 165 170 175 Glu Tyr Ser Val Asn Thr Gly He Ala He Val Ala Ser Phe Ser He 180 185 190 Met Ser Phe Trp Leu Gly Trp He Val Gly Ser Trp Pro Leu Phe Trp 195 200 205 .Ala Leu Phe Val Ser Phe Met Leu Gly Thr Ala Tyr Ser He Asn Leu 210 215 220 Pro Leu Leu Arg Trp Lys Arg Phe Ala Leu Val Ala Ala Met Cys He 225 230 235 240 Leu Ala Val Arg Ala He He Val Gln He Ala Phe Tyr Leu His He 245 250 255 Gln Thr His Val Phe Gly Arg Pro He Leu Phe Thr Arg Pro Leu He 260 265 270 Phe Ala Thr Ala Phe Met Ser Phe Phe Ser Val Val He Ala Leu Phe 275 280 285 Lys Asp He Pro Asp He Glu Gly Asp Lys He Phe Gly He Arg Ser 290 295 300 Phe Ser Val Thr Leu Gly Gln Lys Arg Val Phe Trp Thr Cys Val Thr 305 310 315 320 Leu Leu Gln Met Ala Tyr Ala Val Ala He Leu Val Gly Ala Thr Ser 325 330 335 Pro Phe He Trp Ser Lys Val He Ser Val Val Gly His Val He Leu 340 345 350 Ala Thr Thr Leu Trp Ala Arg Ala Lys Ser Val Asp Leu Ser Ser Lys 10 355 360 365 Thr Glu He Thr Ser Cys Tyr Met Phe He Trp Lys Leu Phe Tyr Ala 370 375 380 Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Phe Leu Lys 385 390 <210> 3 <211> 1224 <212> ADN <213> Arabidopsis sp <400> 3 -|5 atggcgtttt ttgggctctc ccgtgtttca agacggttgt tgaaatcttc cgtstccgta 60 actccatctt cttcctctgc tcttttgcaa tcacaacata aatccttgtc caatcctgtg 120 actacccatt acacaaatcc tttcactaag tgttatcctt catggaatga taattaccaa 180 gtatggagta aaggaagaga attgcatcag gagaagtttt ttggtgttgg ttggaattac 240 agattaattt gtggaatgtc gtcgtcttct tcggttttgg agggaaagcc gaagaaagat 300 gataaggaga agagtgatgg tgttgttgtt aagaaagctt cttggataga tttgtattta 360 n ccagaagaag ttagaggtta tgctaagctt gctcgattgg ataaacccat tggaacttgg 420 ttgcttgcgt ggccttgtat gtggtcgatt gcgttggctg ctgatcctgg aagccttcca 480 agttttaaat atatggcttt atttggttgc ggagcattac ttcttagagg tgctggttgt 540 actataaatg atctgcttga tcaggacata gatacaaagg ttgatcgtac aaaactaaga 600 cctatcgcca gtggtctttt gacaccattt caagggattg gatttctcgg gctgcagttg 660 cttttaggct tagggattct tctccaactt aacaattaca gccgtgtttt aggggcttca 720 tctttgttac ttgtcttttc ctacccactt atgaagaggt ttacattttg gcctcaagcc 780 tttttaggtt tgaccataaa ctggggagca ttgttaggat ggactgcagt taaaggaagc 840 atagcaccat ctattgtact ccctctctat ctctccggag tctgctggac ccttgtttat 900 gatactattt atgcacatca ggacaaagaa gatgatgtaa aagttggtgt taagtcaaca 960 gcccttagat tcggtgataa tacaaagctt tggttaactg gatttggcac agcatccata 1020 ggttttcttg cactttctgg attcagtgca gatctcgggt ggcaatatta cgcatcactg 1080 gccgctgcat caggacagtt aggatggcaa atagggacag ctgacttatc atctggtgct 1140 gactgcagta gaaaatttgt gtcgaacaag tggtttggtg ctattatatt tagtggagtt 1200 gtacttggaa gaagttttca ataa 1224 <210> 4 *211> 407 <212> PRT <213> Arabidopsis sp <400> 4 Met Ala Phe Phe Gly Leu Ser Arg Val Ser Arg Arg Leu Leu Lys Ser 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Thr Pro Ser Ser Ser Ser Ala Leu Leu Gln Ser Gln 20 25 30 His Lys Ser Leu Ser Asn Pro Val Thr Thr His Tyr Thr Asn Pro Phe 35 40 45 Thr Lys Cys Tyr Pro Ser Trp Asn Asp Asn Tyr Gln Val Trp Ser Lys 50 55 60 Gly Arg Glu Leu His Gln Glu Lys Phe Phe Gly Val Gly Trp Asn Tyr 65 70 75 80 Arg Leu He Cys Gly Met Ser Ser Ser Ser Ser Val Leu Glu Gly Lys 85 90 95 Pro Lys Lys Asp Asp Lys Glu Lys Ser Aep Gly Val Val Val Lys Lys 100 105 110 Ala Ser Trp He Asp Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Val Arg Gly Tyr Ala 115 120 125 Lys Leu Ala Arg Leu Asp Lys Pro He Gly Thr Trp Leu Leu Ala Trp 130 135 140 Pro Cys Met Trp Ser He Ala Leu Ala Ala Asp Pro Gly Ser Leu Pro 145 150 155 160 Ser Phe Lys Tyr Met Ala Leu Phe Gly Cys Gly Ala Leu Leu Leu Arg 165 170 175 Gly Ala Gly Cys Thr He Asn Asp Leu Leu Asp Gln Asp He Asp Thr 180 185 190 Lys Val Asp Arg Thr Lys Leu Arg Pro He Ala Ser Gly Leu Leu Thr 195 200 205 Pro Phe Gln Gly He Gly Phe Leu Gly Leu Gln Leu Leu Leu Gly Leu 210 215 220 Gly He Leu Leu Gln Leu Asn Asn Tyr Ser Arg Val Leu Gly Ala Ser 225 230 235 240 Ser Leu Leu Leu Val Phe Ser Tyr Pro Leu Met Lys Arg Phe Thr Phe 245 250 255 Trp Pro Gln Ala Phe Leu Gly Leu Thr He Asn Trp Gly Ala Leu Leu 260 265 270 Gly Trp Thr Ala Val Lys Gly Ser He Ala Pro Ser He Val Leu Pro 275 280 285 Leu Tyr Leu Ser Gly Val Cys Trp Thr Leu Val Tyr Asp Thr He Tyr 290 295 300 Ala His Gln Asp Lys Glu Asp Asp Val Lys Val Gly Val Lys Ser Thr 305 310 315 320 Ala Leu Arg Phe Gly Asp Asn Thr Lys Leu Trp Leu Thr Gly Phe Gly 325 330 335 Thr Ala Ser He Gly Phe Leu Ala Leu Ser Gly Phe Ser Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Trp Gln Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Ala Ala Ser Gly Gln Leu Gly 355 360 365 Trp Gln He Gly Thr Ala Asp Leu Ser Ser Gly Ala Asp Cys Ser Arg 370 375 380 Lys Phe Val Ser Asn Lys Trp Phe Gly Ala He He Phe Ser Gly Val 385 ^ 390 395 400 Val Leu Gly Arg Ser Phe Gln 405 <210> 5 <211> 1296 <212> ADN <213> Arabidopsis sp <400> 5 atgtggcgaa gatctgttgt ttctcgttta tcttcaagaa tctctgtttc ttcttcgtta 60 ccaaacccta gactgattcc ttggtcccgc gaattatgtg ccgttaatag cttctcccag 120 cctccggtct cgacggaatc aactgctaag ttagggatca ctggtgttag atctgatgcc 180 aatcgagttt ttgscactgc tactgccgcc gctacagcta cagctaccac cggtgagatt 240 tcgtctagag ttgcggcttt ggctggatta gggcatcact acgctcgttg ttattgggag 300 ctttctaaag ctaaacttag tatgcttgtg gttgcaactt ctggaactgg gtatattctg 360 ggtacgggaa atgctgcaat tagcttcccg gggctttgtt acacatgtgc aggaaccatg 420 atgattgctg catctgctaa ttccttgaat cagatttttg agataagcaa tgattctaag 480 atgaaaagaa cgatgctaag gccattgcct tcaggacgta ttagtgttcc acacgctgjtt 540 gcatgggcta ctattgctgg tgcttctggt gcttgtttgt tggccagcaa gactaatatg 600 ttggctgctg gacttgcatc tgccaatctt gtactttatg cgtttgttta tactccgttg 660 aagcaacttc accctatcaa tacatgggtt ggcgctgttg ttggtgctat cccacccttg 720 cttgggtggg cggcagcgtc tggtcagatt tcatacaatt cgatgattct tccagctgct 780 ctttactttt ggcagatacc tcattttatg gcccttgcac atctctgccg caatgattat 840 gcagctggag gttacaagat gttgtcactc tttgatccgt cagggaagag aatagcagca 900 gtggctctaa ggaactgctt ttacatgatc cctctcggtt tcatcgccta tgactggggg 960 ttaacctcaa gttggttttg cctcgaatca acacttctca cactagcaat cgctgcaaca 1020 gcattttcat tctaccgaga ccggaccatg cataaagcaa ggaaaatgtt ccatgscagt 1080 cttctcttcc ttcctgtttt catgtctggt cttcttctac accgtgtctc taatgataat 1140 cagcaacaac tcgtagaaga agccggatta acaaattctg tatctggtga agtcaaaact 1200 cagaggcgáa agaaacgtgt ggctcaacct ccggtggctt atgcctctgc tgcaccgttt 1260 cctttcctcc cagctccttc cttctactct ccatga 1296 <210> 6 <211> 431 < 12> PRT <213> Arabidopsis sp <400> 6 Met Trp .Arg .Arg Ser Val Val Tyr .Arg Phe Ser Ser Arg He Ser Val 1 5 10 15 Ser Ser Ser Leu Pro Asn Pro Arg Leu He Pro Trp Ser Arg Glu Leu 20 25 30 Cys Ala Val Asn Ser Phe Ser Gln Pro Pro Val Ser Thr Glu Ser Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Gly He Thr Gly Val Arg Ser Asp Ala Asn Arg Val Phe 50 55 60 Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Glu He 65 70 75 80 Ser Ser Arg Val Ala Ala Leu Ala Gly Leu Gly His His Tyr Ala Arg 85 90 95 Cys Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Ala Lys Leu Ser Met Leu Val Val Ala 100 105 110 Thr Ser Gly Thr Gly Tyr He Leu Gly Thr Gly Asn Ala Ala He Ser 115 120 125 Phe Pro Gly Leu Cys Tyr Thr Cys Ala Gly Thr Met Met He Ala Ala 130 135 140 Ser Ala Asn Ser Leu Asn Gln He Phe Glu He Ser Asn Asp Ser Lys 145 150 155 160 Met Lys Arg Thr Met Leu Arg Pro Leu Pro Ser Gly Arg He Ser Val 165 170 175 Pro His Ala Val Ala Trp Ala Thr He Ala Gly Ala Ser Gly Ala Cys 180 185 190 Leu Leu Ala Ser Lys Thr Asn Met Leu Ala Ala Gly Leu Ala Ser Ala 195 200 205 Asn Leu Val Leu Tyr Ala Phe Val Tyr Thr Pro Leu Lys Gln Leu His 210 215 220 Pro He Asn Thr Trp Val Gly Ala Val Val Gly Ala He Pro Pro Leu 225 230 235 240 Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ser Gly Gln He Ser Tyr Asn Ser Met He 245 250 255 Leu Pro Ala Ala Leu Tyr Phe Trp Gln He Pro His Phe Met Ala Leu 260 265 270 Ala His Leu Cys .Arg Asn Asp Tyr Ala Ala Gly Gly Tyr Lys Met Leu 275 280 285 Ser Leu Phe Asp Pro Ser Gly Lys Arg He Ala Ala Val Ala Leu Arg 290 295 300 Asn Cys Phe Tyr Met He Pro Leu Gly Phe He Ala Tyr Asp Trp Gly 305 310 . 315 320 Leu Thr Ser Ser Trp Phe Cys Leu Glu Ser Thr Leu Leu Thr Leu Ala 325 330 335 He Ala Ala Thr Ala Phe Ser Phe Tyr Arg Asp Arg Thr Met His Lys 340 345 350 Ala .Arg Lys Met Phe His Ala Ser Leu Leu Phe Leu Pro Val Phe Met 355 360 365 Ser Gly Leu Leu Leu His Arg Val Ser Asn Asp Asn Gln Gln Gln Leu 370 375 380 Val Glu Glu Ala Gly Leu Thr Asn Ser Val Ser Gly Glu Val Lys Thr 385 390 395 400 Gln Arg Arg Lys Lys Arg Val Ala Gln Pro Pro Val Ala Tyr Ala Ser 405 410 415 Ala Ala Pro Phe Pro Phe Leu Pro Ala Pro Ser Phe Tyr Ser Pro 420 425 430 <210> 7 <211> 479 <212> ADN <213> Arabidopsis sp <400> 7 ggaaactccc ggagcacctg tttgcaggta ccgctaacct taatcgataa tttatttctc 60 ttgtcaggaa ttatgtaagt ctggtggaag gctcgcatac catttttgca ttgcctttcg 120 ctatgatcgg gtttactttg ggtgtgatga gaccaggcgt ggctttatgg tatggcgaaa 180 acccattttt atccaatgct gcattccctc ccgatgattc gttctttcat tcctatacag 240 gtatcatgct gataaaactg ttactggtac tggtttgtat ggtatcagca agaagcgcgg 300 cgatggcgtt taaccggtat ctcgacaggc attttgacgc gaagaacccg cgtactgcca 360 tccgtgaaat acstgcgggc gtcatatctg ccaacagtgc gctggtgttt acgataggst 420 gctgcgtggt attctgggtg gcctgttatt tcattaacac gatctgtttt tacctggcg 479 <210> 8 <211> 551 <212> ADN <213> .Arabidopsis sp <220> <221> caracteristica_variable <222> (1) - a a (55l) <223> n = A, T,C or G <400> 8 ttgtggctta caccttaatg agcatacgcc agnccattac ggctcgttaa tcggcgccat 60 ngccggngct gntgcaccgg tagtgggcta ctgcgccgtg accaatcagc ttgatctagc 120 ggctcttatt ctgtttttaa ttttactgtt ctggcaaatg ccgcattttt acgcgatttc 180 cattttcagg ctaaaagact tttcagcggc ctgtattccg gtgctgccca tcattaaaga 240 cctgcgctat accaaaatca gcatgctggt ttacgtgggc ttatttacac tggctgctat 300 catgccggcc ctcttagggt atgccggttg gatttatggg atagcggcct taattttagg 360 cttgtattgg ctttatattg ccatacaagg attcaagacc gccgatgatc aaaaatggtc 420 tcgtaagatg tttggatctt cgattttaat cattaccctc ttgtcggtaa tgatgcttgt 480 ttaaacttac tgcctcctga agtttatata tcgataattt cagcttaagg aggcttagtg 540 gttaattcaa t 551 <210> 9 <211> 297 <212> PRT <213> Arabidopsis sp <400> 9 Met Val Leu Ala Glu Val Pro Lys Leu Ala Ser Ala Ala Glu Tyr Phe 1 5 10 15 Phe Lys Arg Gly Val Gln Gly Lys Gln Phe Arg Ser Thr He Leu Leu 20 25 30 Leu Met Ala Thr Ala Leu Asn Val Arg Val Pro Glu Ala Leu He Gly 35 40 45 Glu Ser Thr Asp He Val Thr Ser Glu Leu Arg Val Arg Gln Arg Gly 50 55 60 He Ala Glu He Thr Glu Met He His Val Ala Ser Leu Leu His Asp 65 70 75 80 Asp Val Leu Asp Asp Ala Asp Thr Arg Arg Gly Val Gly Ser Leu Asn. 85 90 95 Val Val Met Gly Asn Lys Val Val Ala Leu Leu Ala Thr Ala Val Glu 100 105 110 His Leu Val Thr Gly Glu Thr Met Glu He Thr Ser Ser Thr Glu Gln 115 120 125 Arg Tyr Ser Met Asp Tyr Tyr Met Gln Lys Thr Tyr Tyr Lys Thr Ala 130 135 140 Ser 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(299) <223> n = A, T,C or G <400> 22 ccanaatang tnsatcttng aaagacaatt ggcctcttca acacacaagt ctgcatgtga 60 agaagaggcc aattgtcttt csaagatsac ttatngtggc tattgtaatc atgaacttct 120 tctttgtggg tatggcattg gcaaaggata tacstanstg ttgaaggaga taaaatatat 180 ggcattgata cttttgcaat acgtataggt caaaaacaag tattttggat ttgtattttc 240 ctttttgaaa ggctttcgga gtttccctag tggcaggagc aacatcttct agccttggt 299 <210> 23 <211> 767 <212> ADN <213> sp Glycine <400> 23 gtggaggstg tggttgstgs cctgtttatg aatatttata ttgttggttt gaatsaattg 60 tctgatgttg aaatagacaa gataaacaag ccgtatcttc cattagcatc tggggaatat 120 tcctttgaaa ctggtgtsac tattgttgca tctttttcaa ttctgagttt ttggcttggc 180 tgggttgtag gttsatggcc attattttgg gssctttttg taagctttgt gctaggaact 240 gcttattcaa tcaatgtgcc tctgttgaga tggaagaggt ttgcagtgct tgcagcgatg 300 tgcattctag ctgttcgggs agtaatagtt caacttgsat ttttccttca catgsagast 360 catgtgtaca agaggccacc tgtcttttca agaccattga tttttgctac tgcattcatg 420 agsttsttst ctgtagttat agcactgttt aaggatatac ctgacattga aggagataaa 480 gtatttggca tccaatcttt ttcagtgtgt ttaggtcaga agccggtgtt ctggacttgt 540 gttassstts ttgaaatags ttatggagtc gccctcctgg tgggagctgc atctccttgt 600 ctttggagca aaattttcas gggtstggga cacgstgtgs tggcttsaat tststggttt 660 satgccaaat ctgtagattt gaaaagcaaa gcttcgataa catccttcta tatgtttatt 720 tggaagctat tttatgcaga atacttactc attcsttttg ttagatg 767 <210> 24 <211> 255 <212> PRT <213> sp Glycine <400> 24 Val Glu Ala Val Val Ala Ala Leu Phe Met Asn He Tyr He Val Gly 1 5 10 15 Leu Asn Gln Leu Ser Asp Val Glu He Asp Lys He Asn Lys Pro Tyr 20 25 30 Leu Pro Leu Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Phe Glu Thr Gly Val Thr He 35 40 45 Val Ala Ser Phe Ser He Leu Ser Phe Trp Leu Gly Trp Val Val Gly 50 55 60 Ser Trp Pro Leu Phe Trp Ala Leu Phe Val Ser Phe Val Leu Gly Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Ser He Asn Val Pro Leu Leu Arg Trp Lys Arg Phe Ala Val 85 90 95 Leu Ala Ala Met Cys He Leu Ala Val Arg Ala Val He Val Gln Leu 100 105 110 Ala Phe Phe Leu His Met Gln Thr His Val Tyr Lys Arg Pro Pro Val 115 120 125 Phe Ser .Arg Pro Leu He Phe Ala Thr Ala Phe Met Ser Phe Phe Ser 130 135 140 Val Val He Ala Leu Phe Lys Asp He Pro Asp He Glu Gly Asp Lys 145 150 155 160 Val Phe Gly He Gln Ser Phe Ser Val Cys Leu Gly Gln Lys Pro Val 165 170 175 Phe Trp Thr Cys Val Thr Leu Leu slu He Ala Tyr Gly Val Ala Leu 180 185 190 Leu Val Gly Ala Ala Ser Pro Cys Leu Trp Ser Lys He Phe Thr Gly 195 200 205 Leu Gly His Ala Val Leu Ala Ser He Leu Trp Phe His Ala Lys Ser 210 215 220 Val Asp Leu Lys Ser Lys Ala Ser He Thr Ser Phe Tyr Met Phe He 225 230 235 240 Trp Lys Leu Phe Tyr .Ala Glu Tyr Leu Leu He Pro Phe Val Arg 245 250 255 <210> 25 <211> 360 <212> .ADN <213> sp Zea <220> <221> caracteristica_variable <222> (1) ... (360) <223> n = A,T,C o G <400> 25 ggcgtcttca cttgttctgg tcttctcgta tcccctgatg aagaggttca cattttggcc 60 tcaggcttat cttggcctga cattcaactg gggagcttta ctagggtggg ctgctattaa 120 ggaaagcata gaccctgcaa atcatccttc cattgtatac agctggtatt tgttggacgc 180 tggtgtatga tactatatat gcgcatcagg tgtttcgcta tccctacttt catattaatc 240 cttgatgaag tggccatttc atgttgtcgc ggtggtctta tacttgcata tctccatgca 300 tctcaggaca aagangatga cctgaaagta ggagtccaag tccacagctt aagatttggg 360 <210> 26 <211>' 299 <212> .ADN <213> sp Zea <220> <221> caracteristica_variable <222> (1) ... (299) <223> n = A, ,C o G <400> 26 gatggttgsa gcatstgsaa atascctcaa csaggtgttt gngataaaaa atgatgctaa 60 aatgaaaagg acaatgcgtg ccccctgcca tctggtcgca ttagtcctgc acatgctgcg 120 atgtgggcta caagtgttgg agttgcagga acagctttgt tggcctggaa ggctaatggs 180 ttggcagstg ggsttgcagc ttctaatctt gttctgtatg satttgtgta tasgccgttg 240 aagcaaatas accctgttaa tacatgggtt ggggcagtcg ttggtgccat cccaccact 299 <210> 27 <211> 255 < 12> ADN <213> sp Zea <220> <221> caracteristisa_variable <222> (1) ... (255) <223> n = A,T,C o G <400> 27 anacttgcat atctccatgc ntctcaggac aaagangatg acctgaaagt aggtgtcaag 60 tccacagcat taagatttgg agatttgass nnatastgna tcagtggctt tggcgcggca 120 tgsttcggca gcttagcact cagtggttac aatgstgacc ttggttggtg tttagtgtga 180 tgcttgagcg aagaatggta tngtttttac ttgatattga ctccagacct gaaatcatgt 240 tggacagggt ggsss 255 <210> 28 <211> 257 <212> ADN <213> sp Zea <400> 28 attgaagggg ataggactct ggggcttcag tcacttcctg ttgcttttgg gatggaaact 60 gcaaaatgga tttgtgttgg agcaattgat atcastsaat tatctgttgc aggttaccta 120 ttgagcacsg gtaagctgta ttatgccctg gtgttgcttg ggctaacaat tcctsaggtg 180. ttctttcagt tccagtastt cctgaaggas sstgtgaagt atgatgtcaa atatcaggca 240 agsgsacaac cattctt 257 <210> 29 <211> 368 <212> ADN <213> sp Zea <400> 29 atcsagttgs aaataataat ggcgttcttc tctgttgtaa tagsactatt caaggatata 60 cctgacatcg aaggggaccg satattsggg atssgatsst tcagcgtccg gttagggcaa 120 aagaaggtct tttggatctg cgttggcttg sttgagatgg cstacagcgt tgcgatactg 180 atgggagcta sctcttcctg tttgtggagc aaaasagsaa ccatcgstgg ccattccata 240 cttgcsgcga tcstatggag ctgcgcgcga tsggtggast tgasgagcaa agcsgsaata 300 acgtscttct asatgttcat stggaagctg ttctasgsgg agtacctgct satssstctg 360 gtgcggtg 368 <210> 30 <211> 122 <212> PRT <213> sp Zea <400> 30 He Gln Leu Gln He He Met Ala Phe Phe Ser Val Val He Ala Leu 1 5 10 15 Phe Lys Asp He Pro Asp He slu sly Asp Arg He Phe Gly He Arg 20 25 30 Ser Phe Ser Val Arg Leu sly Oln Lys Lys Val Phe Trp He Cys Val 35 40 45 Gly Leu Leu slu Met Ala Tyr Ser Val Ma He Leu Met Gly Ala Thr 50 55 60 Ser Ser Cys Leu Trp Ser Lys Thr Ala Thr He Ala Gly His Ser He 65 70 75 80 Leu Ala Ala He Leu Trp Ser Cys Ala Arg Ser Val Asp Leu Thr Ser 85 90 95 Lys Ala Ala He Thr Ser Phe Tyr Met Phe He Trp Lys Leu Phe Tyr 100 105 110 .Ala Glu Tyr Leu Leu He Pro Leu Val Arg 115 120 <210> 31 <211> 278 <212> .ADN <213> sp Zea <400> 31 tattsagsas casctctsaa gctcaagcag aatggatgga ttgggaactt cgctctgggt 60 gcgagttaca tcagcttgss ctggtgggct ggcsaggsgt tatttggaac tsttacacca 120 gatatcattg tcttgactac tttgtacags atagstgggc tagggattgs tattgtaaat 180 gatttcaaga gtattgaagg ggataggast stggggctts agtcacttcc tgttgctttt 240 gggatggaaa stgcaaaatg gatttgtgtt ggagcaat 278 <210> 32 <211> 292 <212> PRT <213> sp Syneshosystis <400> 32 Met Val Ala Gln Thr Pro Ser Ser Pro Pro Leu Trp Leu Thr He He 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Arg Trp His Lys Pro Ala Oly Arg Leu He Leu Met He 20 25 30 Pro Ala Leu Trp Ala Val Cys Leu Ala Ala Gln sly Leu Pro Pro Leu 35 40 45 Pro Leu Leu Gly Thr He Ala Leu Gly Thr Leu Ala Thr Ser Gly Leu 50 55 60 Gly Cys Val Val Asn Asp Leu Trp Asp Arg Asp He Asp Pro Gln Val 65 70 75 80 Glu Arg Thr Lys Gln Arg Pro Leu Ala Ala Arg Ala Leu Ser Val Gln Val Oly He sly Val Ala Leu Val Ala Leu Leu Cys Ala Ala Gly Leu 100 105 110 Ala Phe Tyr Leu Thr Pro Leu Ser Phe Trp Leu Cys Val Ala Ala Val 115 120 125 Pro Val He Val Ala Tyr Pro sly Ala Lys Arg Val Phe Pro Val Pro 130 135 140 Oln Leu Val Leu Ser He Ala Trp Gly Phe Ala Val Leu He Ser Trp 145 150 155 160 Ser Ala Val Thr sly Asp Leu Thr Asp Ala Thr Trp Val Leu Trp sly 165 170 175 Ala Thr Val Phe Trp Thr Leu Gly Phe Asp Thr Val Tyr Ala Met Ala 180 185 190 Asp Arg Glu Asp Asp Arg Arg He Gly Val Asn Ser Ser Ala Leu Phe 195 200 205 Phe Oly sin Tyr Val Oly Olu Ala Val Gly He Phe Phe Ala Leu Thr 210 215 220 He aly Cys Leu Phe Tyr Leu Gly Met He Leu Met Leu Asn Pro Leu 225 230 235 240 Tyr Trp Leu Ser Leu Ala He Ala He Val Gly Trp Val He Gln Tyr 245 250 255 He sln Leu Ser Ala Pro Thr Pro Glu Pro Lys Leu Tyr Gly Gln He 260 265 270 Phe Gly Gln Asn Val He He sly Phe Val Leu Leu Ala Gly Met Leu 275 280 285 Leu sly Trp Leu 290 <210> 33 <211> 316 <212> PRT <213> sp Syneshocystis <400> 33 Met Val Thr Ser Thr Lys He His Arg Gln His Asp Ser Met Gly Ala 1 5 10 15 Val Cys Lys Ser Tyr Tyr Gln Leu Thr Lys Pro Arg He He Pro Leu 20 25 30 Leu Leu He Thr Thr Ala Ala Ser Met Trp He Ala Ser Glu Gly Arg 35 40 45 Val Asp Leu Pro Lys Leu Leu .He Thr Leu Leu Gly Gly Thr Leu Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ala Gln Thr Leu Asn Cys He Tyr Asp Gln Asp He Asp 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Arg Thr Arg Ala Arg Pro He Pro Ala Gly Lys Val 85 90 95 Gln Pro Arg His Ala Leu He Phe Ala Leu Ala Leu Gly Val Leu Ser 100 105 110 Phe Ala Leu Leu Ala Thr Phe Val Asn Val Leu Ser Gly Cys Leu Ala 115 120 125 Leu Ser Gly He Val Phe Tyr Met Leu Val Tyr Thr His Trp Leu Lys 130 135 140 Arg His Thr Ala sln Asn He Val He sly sly Ala Ala Gly Ser He 145 150 155 160 Pro Pro Leu Val Gly Trp Ala Ala Val Thr Gly Asp Leu Ser Trp Thr 165 170 175 Pro Trp Val Leu Phe Ala Leu He Phe Leu Trp Thr Pro Pro His Phe 180 185 190 Trp Ala Leu Ala Leu Met He Lys Asp Asp Tyr Ala Gln Val Asn Val 195 200 205 Pro Met Leu Pro Val He Ala Gly Glu Glu Lys Thr Val Ser Gln He 210 215 220 Trp Tyr Tyr Ser Leu Leu Val Val Pro Phe Ser Leu Leu Leu Val Tyr 225 230 235 240 Pro Leu His sln Leu Oly He Leu Tyr Leu Ala He Ala He He Leu 245 250 255 Gly sly Gln Phe Leu Val Lys Ala Trp Gln Leu Lys Gln Ala Pro Gly 260 265 270 Asp Arg Asp Leu Ala Arg Gly Leu Phe Lys Phe Ser He Phe Tyr Leu 275 280 285 Met Leu Leu Cys Leu Ala Met Val He Asp Ser Leu Pro Val Thr His 290 295 300 Gln Leu Val Ala Gln Met Gly Thr Leu Leu Leu Gly 305 310 315 <210> 34 <211> 324 < 12> PRT <213> sp Synechocystis <400> 34 Met Ser Asp Thr Gln Asn Thr Gly Gln Asn Gln Ala Lys Ala Arg Gln 1 5 10 15 Leu Leu Gly Met Lys Gly Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ser He Trp Lys 20 25 30 lie .Arg Leu Gln Leu Met Lys Pro He Thr Trp He Pro Leu He Trp 35 40 45 Gly Val Val Cys Gly Ala Ala Ser Ser Gly Gly Tyr He Trp Ser Val 50 55 60 Glu Asp Phe Leu Lys Ala Leu Thr Cys Met Leu Leu Ser Gly Pro Leu 65 70 75 80 Met Thr Gly Tyr Thr Gln Thr Leu Aßn Asp Phe Tyr Asp Arg Asp He 85 90 95 Asp Ala He .Asn Glu Pro Tyr Arg Pro He Pro Ser sly Ala He Ser 100 105 110 Val Pro Gln Val Val Thr Gln He Leu He Leu Leu Val Ala Gly He 115 120 125 Gly Val .Ala Tyr Gly Leu Asp Val Trp Ala Gln His Asp Phe Pro He 130 135 140 Met Met Val Leu Thr Leu Gly Gly Ala Phe Val Ala Tyr He Tyr Ser 145 150 155 160 Ala Pro Pro Leu Lys Leu Lys Gln Asn Gly Trp Leu Gly Asn Tyr Ala 165 170 175 Leu Gly Ala Ser Tyr He Ala Leu Pro Trp Trp Ala Gly His Ala Leu 180 185 190 Phe Gly Thr Leu .Asn Pro Thr He Met Val Leu Thr Leu He Tyr Ser 195 200 205 Leu Ala Gly Leu Gly He Ala Val Val Asn Asp Phe Lys Ser Val Glu 210 215 220 Gly Asp Arg Gln Leu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Val Met Phe Gly He 225 230 235 240 Gly Thr Ala Ala Trp He Cys Val He Met He Asp Val Phe sln Ala 245 250 255 Gly He Ala Gly Tyr Leu He Tyr Val His Gln Gln Leu Tyr Ala Thr 260 265 270 He Val Leu Leu Leu Leu He Pro Gln He Thr Phe Gln Asp Met Tyr '275 280 285 Phe Leu .Arg Asn Pro Leu Glu Asn Asp Val Lys Tyr Gln Ala Ser Ala 290 295 300 Gln Pro Phe Leu Val Phe Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Gly 305 310 315 320 His Ala Gly He <210> 35 <211> 307 <212> PRT <213> sp Synechocystis <400> 35 Met Thr Glu Ser Ser Pro Leu Ala Pro Ser Thr Ala Pro Ala Thr Arg 1 5 10 15 Lys Leu Trp Leu Ala Ala He Lys Pro Pro Met Tyr Thr Val Ala Val 20 25 30 Val Pro He Thr Val Gly Ser Ala Val Ala Tyr aiy Leu Thr Gly sln 35 40 45 Trp His Gly Asp Val Phe Thr He Phe Leu Leu Ser Ala He Ala He 50 55 60 He Ala Trp He Asn Leu Ser Asn Asp Val Phe Asp Ser Asp Thr Gly 65 70 75 80 He Asp Val Arg Lys Ala His Ser Val Val Asn Leu Thr Gly Asn Arg 85 90 95 Asn Leu Val Phe Leu He Ser Asn Phe Phe Leu Leu Ala Gly Val Leu 100 105 110 Gly Leu Met Ser Met Ser Trp Arg Ala Gln Asp Trp Thr Val Leu Glu 115 120 125 Leu He Gly Val Ala He Phe Leu Gly Tyr Thr Tyr Gln Gly Pro Pro 130 135 140 Phe Arg Leu Gly Tyr Leu Gly Leu Gly Glu Leu He Cys Leu He Thr 145 150 155 160 Phe Gly Pro Leu Ala He Ala Ala Ala Tyr Tyr Ser sln Ser Gln Ser 165 170 175 Phe Ser Trp Asn Leu Leu Thr Pro Ser Val Phe Val sly He Ser Thr 180 185 190 Ala He He Leu Phe Cys Ser His Phe His Gln Val Olu Asp Asp Leu 195 200 205 Ala Ala Gly Lys Lys Ser Pro He Val Arg Leu aly Thr Lys Leu Gly 210 215 220 Ser Gln Val Leu Thr Leu Ser Val Val Ser Leu Tyr Leu He Thr Al 225 230 235 240 He Gly Val Leu Cys His Gln Ala Pro Trp sin Thr Leu Leu He He 245 250 255 Ala Ser Leu Pro Trp Ala Val Oln Leu He Arg His Val Gly Gln Tyr 260 265 270 His Asp Gln Pro Glu Gln Val Ser Asn Cys Lys Phe He Ala Val Asn 275 280 285 Leu His Phe Phe Ser Gly Met Leu Met Ala Ala Gly Tyr Gly Trp Ala 290 295 300 Gly Leu Gly 305 <210> 36 <211> 927 <212> ADN < 13> sp Synechosystis <400> 36 atggcaacta tccaagcttt ttggcgcttc tcccgccccc ataccatcat tggtacaact 60 ctgagcgtct gggctgtgta tctgttaact attctcgggg at'ggaaactc agttaactcc 120 cctgcttccc tggatttagt gttcggcgct tggctggcct gcctgttggg taatgtgtac 180 attgtcggcc tcaaccaatt gtgggatgtg gacattgacc gcatcaataa gccgaatttg 240 cccctagcta acggagattt ttctatcgcc cagggccgtt ggattgtggg actttgtggc 300 gttgcttsct tggcgatcgc ctggggatta gggstatggs tggggctaac ggtgggcatt 360 agtttgatta ttggcacggc ctattcggtg csgccagtga ggttaaagcg cttttccctg 420 ctggcggscc tgtgtattct gasggtgcgg ggaattgtgg ttaacttggg cttattttta 480 ttttttagaa ttggtttagg ttatcccscc actttaataa cccccatctg ggttttgact 540 ttatttatct tagttttcac cgtggcgatc gcsattttta aagatgtgcc agatatggaa 600 ggcgatcggc aatttaagat tcaaacttta actttgsaaa tsggsaaaca aaacgttttt 660 cggggaacct taattttact cactggttgt tatttagcca tggcaatctg gggcttatgg 720 gcggctatgc ctttaaatas tgstttcttg attgtttcsc atttgtgctt attagcstta 780 ctctggtggc ggagtcgaga tgtacactta gaaagcaaaa ccgaaattgc tagtttttat 840 cagtttattt ggaagctatt tttsttagag tacttgctgt atcccttggc tctgtggtta 900 cstaattttt ctaatactat tttttag 927 <210> 37 <211> 308 <212> PRT <213> sp Synechocystis <400> 37 Met Ala Thr He Gln Ala Phe Trp Arg Phe Ser Arg Pro His Thr He 1 5 10 15 He Gly Thr Thr Leu Ser Val Trp Ala Val Tyr Leu Leu Thr He Leu 20 25 30 Gly Asp Gly Asn Ser Val Asn Ser Pro Ala Ser Leu Asp Leu Val Phe 35 40 45 Gly Ala Trp Leu Ala Cys Leu Leu Gly Asn Val Tyr He Val sly Leu 50 55 60 Asn Gln Leu Trp Asp Val Asp He Asp Arg He Asn Lys Pro Asn Leu 65 70 75 80 Pro Leu Ala Asn Gly Asp Phe Ser He Ala Gln Gly Arg Trp He Val 85 90 95 Gly Leu Cys Gly Val Ala Ser Leu Ala He Ala Trp Gly Leu sly Leu 100 105 110 Trp Leu Gly Leu Thr Val Gly He Ser Leu He He Gly Thr Ala Tyr 115 120 125 Ser Val Pro Pro Val .Arg Leu Lys Arg Phe Ser Leu Leu Ala Ala Leu 130 135 140 Cys He Leu Thr Val Arg Gly He Val Val Asn Leu Gly Leu Phe Leu 145 150 155 160 Phe Phe Arg He Gly Leu Gly Tyr Pro Pro Thr Leu He Thr Pro He 165 170 175 Trp Val Leu Thr Leu Phe He Leu Val Phe Thr Val Ala He Ala He 180 185 190 Phe Lys Asp Val Pro Asp Met Glu Gly Asp Arg Gln Phe Lys He Gln 195 200 205 Thr Leu Thr Leu Gln He Gly Lys Gln Asn Val Phe Arg Gly Thr Leu 210 215 220 He Leu Leu Thr sly Cys Tyr Leu Ala Met Ala He Trp sly Leu Trp 225 230 235 240 Ala Ala Met Pro Leu Asn Thr Ala Phe Leu He Val Ser His Leu Cys 245 250 255 Leu Leu Ala Leu Leu Trp Trp Arg Ser Arg Asp Val His Leu slu Ser 260 265 270 Lys Thr slu He Ala Ser Phe Tyr sln Phe He Trp Lys Leu Phe Phe 275 280 285 Leu slu Tyr Leu Leu Tyr Pro Leu Ala Leu Trp Leu Pro Asn Phe Ser 290 295 300 Asn Thr He Phe 305 <210> 38 <211> 1092 <212> .ADN <213> sp Synechocystis <400> 38 atgaaatttc cgcccsacag tggttacsat tggcaaggtc aatcascttt ctttgaaggt 60 tggtacgtgc gcctgstttt gcccsaatcs ggggaaagtt ttgsttttat gtastccatc 120 gaaaatcctg ctagcgatca tcattacggc ggcggtgstg tgsaaatttt agggssggct iso acgaaaaaas aagaaaatca ggaagacsaa sttgtttggc ggacatttcs ctsggtaaaa 240 aaattttggg ssagtsstsg scagtttgcc stagggcatt ggggaaaatg tagggataac " 300 aggcaggcga aacccctact ctcsgaagaa ttttttgsca cggtcaagga aggttatcaa 360 atccatcaaa atcagsassa aggasaaats attsatggsg atsgssattg tcgttggcag 420 ttcaccgtag aaccggaagt aacttggggg agtcctaacc gatttcctcg ggctacagcg 480 ggttggsttt sstttttass cttgtttgat cssggttggs aaattctttt agcccaaggt 540 agagcgcacg gstggstgaa atggsagagg gaasagtatg aatttgacca cgssstagtt 600 tatgccgaaa aaaattgggg tcastccttt csctccsgst ggttttggst ccaagcaaat 660 tattttcctg accatccagg actgagcgtc actgccgctg gcggggaacg gattgttctt 720 ggtcgssccg aagaggtagc tttaattggc ttacatcass aaggtaattt ttacgaattt 780 ggcccgggcc atggsacagt sasttggsaa gtagctcsst ggggssgttg gsaattaaaa 840 gcsagsaatg ataggtattg ggtcaagttg tccggaaaaa cagataaaaa aggcagttta 900 gtccacactc ccacsgccca gggcttasaa stsaastgcc gagataccac taggggctat 960 ttgtatttgc aattgggats tgtgggtcac ggcctgatag tgcaagggga aacggacacc 1020 gcggggctag aagttggagg tgattggggt ttaacagagg aaaatttgag caaaaaaacá 1080 gtgcsattst ga 1092 <210> 39 i <211> 363 <212> PRT <213> sp Syneshosystis <400> 39 Met Lys Phe Pro Pro His Ser Gly Tyr His Trp Gln Gly Gln Ser Pro 1 5 10 15 Phe Phe slu Gly Trp Tyr Val Arg Leu Leu Leu Pro Gln Ser Gly Glu 20 25 30 Ser Phe Ala Phe Met Tyr Ser He Glu Asn Pro Ala Ser Asp His His 35 40 45 Tyr Gly Gly Gly Ala Val Gln He Leu Gly Pro Ala Thr Lys Lys sln 50 55 60 slu Asn sln slu Asp Gln Leu Val Trp Arg Thr Phe Pro Ser Val Lys 65 70 75 80 Lys Phe Trp Ala Ser Pro Arg Gln Phe Ala Leu sly His Trp aiy Lys 85 90 95 Cys Arg Asp Asn Arg Oln Ala Lys Pro Leu Leu Ser slu Glu Phe Phe 100 105 110 Ala Thr Val Lys Glu Gly Tyr Gln He His Gln Asn Gln His sln Oly 115 120 125 Oln He He His Gly Asp Arg His Cys Arg Trp Gln Phe Thr Val slu 130 135 140 Pro Glu Val Thr Trp Gly Ser Pro Asn Arg Phe Pro Arg Ala Thr Ala 145 150 155 160 Gly Trp Leu Ser Phe Leu Pro Leu Phe Asp Pro Gly Trp Gln He Leu 165 170 175 Leu Ala sln Oly Arg Ala His sly Trp Leu Lys Trp sln Arg Olu sln 180 185 190 His Pro Gly Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Gly Glu Arg He Val Leu 225 230 235 240 Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Leu He Gly Leu His His Gln sly Asn 245 250 255 Phe Tyr Glu Phe Gly Pro Gly His Gly Thr Val Thr Trp Gln Val Ala 260 265 270 Pro Trp Gly Arg Trp Gln Leu Lys Ala Ser Asn Asp Arg Tyr Trp Val 275 280 285 Lys Leu Ser sly Lys Thr Asp Lys Lys sly Ser Leu Val His Thr Pro 290 295 300 Thr Ala Gln Gly Leu Gln Leu Asn Cys Arg Asp Thr Thr Arg Gly Tyr 305 310 315 320 Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Ser Val Gly His Gly Leu He Val Gln Gly 325 330 335 Glu Thr Asp Thr Ala Gly Leu Glu Val Gly Gly Asp Trp Gly Leu Thr 340 345 350 Glu Glu Asn Leu Ser Lys Lys Thr Val Pro Phe 355 360 <210> 40 <211> 56 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsidn de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 40 cgcgatttaa atggcgcgcc ctgcaggcgg ssgcctgcag ggcgsgccat ttaaat 56 <210> 41 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 41 tcgaggatcc gcggssgcaa gcttsstgca gg 32 <210> 42 <211> 32 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuensia .Artificial : Oligonucleótido <400> 42 tcgacctgca ggaagcttgc ggccgcggat ce 32 <210> 43 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial: Oligonucleótido <400> 43 tcgacctgca ggaagcttgc ggccgcggat ce 32 <210> 44 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 44 tcgaggatcc gcggccgcaa gcttcctgca gg 32 <210> 45 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucledtido <400> 45 tcgaggatsc gcggccgcaa gcttcctgca ggaget 36 <210> 46 <211> 28 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 46 cctgcaggaa gcttgcggcc gcggatcc 28 <210> 47 <211> 36 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 47 tcgacctgca ggaagcttgc ggccgcggat ccagct 36 <210> 48 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 48 ggatccgcgg ccgcaagctt cctgcagg 28 <210> 49 <211> 39 <212> ADN <213> Secuensia .Artificial «220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 49 gatcacctgc aggaagcttg cggssgcgga tccaatgca 39 <210> 50 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuensia Artifisial: Oligonucleótido <400> 50 ttggatcsgc ggcsgcaagc ttsstgsagg t 31 <210> 51 <211> 41 <212> .ADN <213> Sesuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuensia Artifisial: Oligonusleótido <400> 51 ggatscgcgg ccgcasaatg gagtststgc tctctagttc t 41 <210> 52 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 52 ggatcctgca ggtcacttca aaaaaggtaa cagcaagt 38 <210> 53 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial: Oligonucleótido <400> 53 ggatccgcgg csgcacaatg gcgttttttg ggctctsccg tgttt 45 <210> 54 <211> 40 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucledtido <400> 54 ggatcctgca ggttattgaa aacttsttss aagtasaact 40 <210> 55 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 55 ggatccgcgg ccgcacaatg tggcgaagat ctgttgtt 38 <210> 56 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Sesuencia Artifisial: Oligonusleótido <400> 56 ggatsctgca ggtcatggag agtagaagga aggagct 37 <210> 57 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuensia .Artificial: Oligonucleótido <400> 57 ggatccgcgg ccgcacaatg gtacttgccg aggttccaaa gcttgcctct 50 <210> 58 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuensia .Artifisial: Oligonusleótido <400> 58 ggatcctgsa ggtsasttgt ttctggtgat gactctat 38 <210> 59 <211> 38 <212> .ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucledtido <400> 59 ggatccgsgg scgcacaatg acttcgattc tcaacact 38 <210> 60 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucledtido <400> 60 ggatcctgca ggtcagtgtt gsgatgstaa tgccgt 36 <210> 61 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Dessripsión de Sesuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 61 taatgtgtac attgtcggcc tc 22 <210> 62 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuensia Artifisial: Oligonucleótido <400> 62 gcaatgtaac atcagagatt ttgagacasa asgtggsttt scacaattcs ccgcaccgtc 60 <210> 63 <211> 22 <212> .ADN <213> Sesuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 63 aggctaataa gcacaaatgg ga 22 <210> 64 <211> 63 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuensia Artifisial: Oligonucleótido <400> 64 ggtatgagts agcaacacct tcttsasgag gsagasstca gcggaattgg tttaggttat 60 eco 63 <210> 65 <211> 26 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Dessripsión de Sesuensia .Artifisial: Oligonusleótido <400> 65 ggatccatgg ttgcccaaac cccatc 26 <210> 66 <211> 61 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial : Oligonucleótido <400> 66 gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca acgtggcttt gggtaagcaa caatgaccgg 60 c 61 <210> 67 <211> 25 <212> .ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia .Artificial : Oligonucleótido <400> 67 gaattctcaa agscagcsca gtaac 25 <210> 68 <211> 63 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 68 ggtatgagtc agcaasacct tcttcacgag gsagasstsa gcgggtgcga aaagggtttt 60 CCC 63 <210> 69 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 69 scagtggttt aggctgtgtg gtc 23 <210> 70 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 70 ctgagttgga tgtattggat c 21 <210> 71 <211> 28 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 71 ggatcsatgg ttasttsgac aaaaatcc 28 <210> 72 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 72 gcaatgtaac atcagagatt ttgagacasa asgtggcttt gctaggcaac cgcttagtac 60 <210> 73 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 73 gaattcttaa cccaacagta aagttccc 28 <210> 74 <211> 63 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 74 ggtatgagtc agsaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgccggcat tgtcttttac 60 atg 63 <210> 75 <211> 20 <212> .ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia .Artificial : Oligonucleótido <4O0> 75 ggaacccttg cagccgcttc 20 <210> 76 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial: Oligonucleótido <400> 76 gtatgcccaa ctggtgcaga gg 22 <210> 77 <211> 28 <212> .ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 77 ggatccatgt stgacacaca aaataccg 28 <210> 78 <211> 62 <212> ADN <213> Secuensia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial: Oligonucleótido <400> 78 gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca acgtggcttt cgccaatacc agccaccaac 60 ag 62 <210> 79 <211> 27 <212> .ADN <213> Secuensia Artifisial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 79 gaattctcaa atcsccgcat ggsstag 27 <210> 80 <211> 65 <212> ,ADN <213> Sesuensia Artifisial <220> . <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 80 ggtatgagtc agcaasasct tcttcacgag gcagasctca gcggsctacg gcttggacgt 60 gtggg 65 <210> 81 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223> Descripción de Secuensia Artificial: Oligonucleótido <400> 81 cacttggatt cccctgatst g 21 <210> 82 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia .Artificial : Oligonucleótido <400> 82 gcaatacscg cttggaaaac g 21 <210> 83 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia .Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 83 ggatccatga ccgaatcttc gsscctagc 29 <210> 84 <211> 61 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótído <400> 84 gcaatgtaas atsagagatt ttgagasasa asgtggsttt saatcctagg tagccgaggc 60 g 61 <210> 85 <211> 27 <212> ADN <213> Sesuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 85 gaattcttag cscaggccag sscagcc 27 <210> 86 <211> 66 <212> .ADN <213> Secuensia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 86 ggtatgagtc agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcggggaatt gatttgttta 60 attacc 66 <210> 87 <211> 21 <212> ADN <2Í3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripsión de Sesuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 87 5 gcgatcgcca ttatcgcttg g 21 <210> 88 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuensia Artifisial: Oligonucledtido <400> 88 •JO gcagactggc aattatsagt aasg 24 <210> 89 <211> 25 <212> ADN <213> Sesuencia .Artificial <220> <223> Descripsión de Secuencia .Artificial: Oligonucleótido <400> 89 15 csatggattc gagtaaagtt gtcgs 25 <210> 90 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 90 gaattcactt caaaaaaggt aacag 20 25 <210> 91 <211> 4550 <212> ADN <213> sp Arabidopsis <400> 91 attttacacc aatttgatca cttaastaaa ttaattaaat tagatgatta tcccaccata 60 tttttgagsa ttaaaccata aaassatagt tataagtaac tgttttaats gaatatgact 120 cgattaagat taggaaaaat ttataassgg taattaagaa aasattaacc gtagtaaccg 180 taaatgccga ttcctccctt gtctaaaaga cagaaaacat atattttatt ttgccccata 240 tgtttcactc tatttaattt caggcacaat acttttggtt ggtaacaaaa ctaaaaagga 300 caacacgtga tacttttcst cgtccgtcag tcagattttt tttaaactag aaasaagtgg 360 caaatctaca ccacattttt tgcttaatct attaacttgt aagttttaaa ttsctaaaaa 420 agtctaacta attcttctaa tataagtaca ttscctaaat ttcccaaaaa gtcaaattaa 480 taattttcaa aatctaatct aaatatctaa taattcaaaa tcattaaaaa gacacgcaac 540 aatgacacca attaatcatc ctcgacccac asaattstac agttctcatg staaassata 600 ttttttgctc tstgttsstt caaaatcatt tctttststt ctttgattcc caaagatcac 660 ttctttgtct ttgatttttg attttttttc. tctctggcgt gaaggaagaa gctttattts 720 atggagtctc tgctctctag ttcttctctt gtttccgctg gtaaatctcg tccttttctg 780 gtttcaggtt ttatttgttg tttaggtttc gtttttgtga ttcagaasca tacaaaaagt 840 ttgaactttt ctgaatataa aataaggaaa aagtttcgat ttttataatg aattgtttac 900 tagatsgaag taggtgasaa aggttattgt gtggagaagc ataatttctg ggcttgactt 960 tgaattttgt ttstsatgsa tgcaacttat saatsagstg gtgggttttg ttggaagaag 1020 cagaatctaa agctccactc tttatcaggt tcgttagggt tttatgggtt tttgaaatta 1080 aatactcaat catcttagts tcattattct attggttgaa tcacattttc taatttggaa 1140 tttatgagac aatgtatgtt ggacttagtt gaagttcttc tctttggtta tagttgaagt 1200 gttactgatg ttgtttagct ctttacacca atatatacac ccaattttgc agaaatccga 1260 gttctgcgtt gtgattcgag taaagttgtc gcaaaacsga agtttaggaa caatcttgtt 1320 aggcstgatg gtcaaggats ttcattgttg ttgtatssaa aacataagtc gagatttcgg 1380 gttaatgcca ctgcgggtca gcctgaggct ttcgactcga atagcaaaca gaagtctttt 1440 agagactcgt tagatgcgtt ttacaggttt tctaggssts atacagttat tggcacagtt 1500 aagtttctct ttaaaaatgt aactctttta aaacgcaatc tttcagggtt ttcaaggaga 1560 taacattagc tctgtgattg gatttgdagg tgcttagcat tttatctgta tctttcttag 1620 cagtagagaa ggtttctgat atatctcctt tacttttcac tggcatcttg gaggtaatga 1680 atatataaca cataatgacc gatgaagaag atacattttt ttcgtctctc tgtttaaaca 1740 attgggtttt gttttcaggc tgttgttgca gctctcatga tgaacattta catagttggg 1800 ctaaatcagt tgtctgatgt tgaaatagat aaggtaacat gcaaattttc ttcatatgag 1860 ttcgagagac tgatgagatt aatagcagct agtgcctaga tcatctctat gtgggttttt 1920 gcaggttaac aagccctatc ttccattggc atcaggagaa tattctgtta acaccggcat 1980 tgcaatagta gcttcsttst ccatcatggt atggtgcsat tttcacaaaa tttcaasttt 2040 tagaattcta taagttactg aaatagtttg ttataaatcg ttatagagtt tctggcttgg 2100 gtggattgtt ggttcatggc cattgttctg ggctcttttt gtgagtttca tgctcggtac 2160 tgcatastst atcaatgtaa gtaagtttct caatactaga atttggctca aatcaaaatc 2220 tgcagtttct agttttaggt taatgaggtt ttaataactt acttctacta caaacagttg 2280 ccacttttas ggtggaaaag atttgcattg gttgcagcaa tgtgtatcct cgctgtccga 2340 gctattattg ttcaaatcgc cttttatcta catattcagg tactaaacca ttttccttat 2400 gttttgtagt tgttttcatc aaaatcactt ttatattact aaagctgtga aastttgttg 2460 cagasasatg tgtttggaag accaatcttg ttcastaggs ctcttatttt cgccactgcg 2520 tttatgagct ttttctstgt cgttattgsa ttgtttaagg taaacaaaga tggaaaaaga 2580 ttaaatctat gtatacttaa agtaaagcat tctactgtta ttgatgagaa gttttctttt 2640 ttggttggat gcaggatata cctgatatcg aaggggataa gatattsgga atssgatcat 2700 tctctgtaac tctgggtcag aaacgggtac gatatctaaa ctaaagaaat tgttttgact 2760 caagtgttgg attaagatta cagaagaaag aaaactgttt ttgtttcttg caaaattcag 2820 gtgttttgga catgtgttac actacttcaa atggcttacg ctgttgcaat tctagttgga 2880 gccacatctc cattcatatg gagcaaagtc atctcggtaa caatctttct ttacccatcg 2940 aaaactcgct aattcatsgt ttgagtggta ctggtttsat tttgttccgt tctgttgatt 3000 ttttttcagg ttgtgggtsa tgttatactc gcaacaactt tgtgggctcg agctaagtcc 3060 gttgatctga gtagcaaaac cgaaataact tcatgttata tgttcatatg gaaggttaga 3120 ttsgtttata aatagagtst ttactgcctt tttatgsgst ssaatttgga attaaaatag 3180 cctttcagtt tcatcgaatc acsattatac tgataaattc tcatttctgs atcagctctt 3240 ttatgcagag tacttgctgt tacctttttt gaagtgactg acattagaag agaagaagat 3300 ggagataaaa gaataagtca tcastatgst tctgttttta ttacaagttc atgaaattag 3360 gtagtgaact agtgaattag agttttatts tgaaasatgg cagactgcaa aaatatgtca 3420 aagatatgaa tttctgttgg gtaaagaagt ctctgcttgg gcaaaatctt aaggttsggt 3480 gtgttgatat aatgctaagc gaagaaatsg attctatgta gaaatttccg aaastatgtg 3540 taaacatgtc agaasatctc cattctatat sttsttctgc aagaaagcts tgtttttats 3600 acctaaactc tttatctctg tgtagttaag atatgtatat gtacgtgact asattttttt 3660 gttgatgtaa tttgcagaac gtatggattt ttgttagaaa gcatgagttc gaaagtatat 3720 gtttatatat atggataatt sagacctaac gtcgaagstc asaagcataa attcactact 3780 atagtttgct ctgtaataga tagttccatt gatgtcttga aactgtacgt aactgsstgg 3840 gcgttttgtg gttgatactg actactgagt gttctttgtg agtgttgtaa gtatasaaga 3900 agaagaatat aggstsacgg gaasgastgt ggtggaagat gaaatggaga tsatsasgta 3960 gsggctttgc caaagaccga gtsasgatsg agtstatgaa gtctttacag ctgctgatta 4020 tgattgacca ttgcttagag acgcattgga atcttactag ggacttgcct gggagtttct 4080 tcaagtasgt gtcagatcat acgatgtagg agatttcasg gctttgatgt gtttgtttgg 4140 agtcacaatg cttaatgggc ttattggccc aataatagct agctcttttg ctttagccgt 4200 ttcgtttgtc ccctggtggt gagtattatt agggtatggt gtgacsaaag tcacsagasc 4260 tagagtgaat ctagtagagt cstagassat ggtccatggc ttttatttgt aatttgaaaa 4320 atgaasaatt ctttttgtaa ggaaaacttt tatatagtag acgtttacta tatagaaact 4380 agttgaasta asttsgtgsa attgcataat aatggtgtga aatagagggt gcaaaactca 4440 ataaasattt cgacgtacca agagttsgaa acaataagca aaatagattt ttttgcttca 4500 gastaatttg tacaatgaat ggttaataaa ccattgaagc ttttattaat 4550 <210> 92 <211> 4450 <212> .ADN <213> sp Arabidopsis <400> 92 tttaggttac aaaatcaatg atattgcgta tgtcaactat aaaagccaaa agtaaagcct 60 cttgtttgac cagaaggtca tgatsattgt atacatasag ccaaastasc tcstggaaga 120 aaagacatgg atcccaaaca acaacaatag cttcttttac aagaaccagt agtaactagt 180 cactaatcta aaagagttaa gtttcagstt ttctggcaat ggctscttga tcatttcaat 240 cctgaaggag acccastttg tagcaagacc atgtcctctg tttcasttac agtgtgtctc 300 aaaagtctas ttcaattctt catatatagg ttcctcacac tacagcttca tcctcattcg 360 ttgacagaga gagagtcttt attgaaaact tcttcsaagt acaactccac taaatataat 420 agcaccaaac cacttgttcg acacaaatct gtacagatat aaaaacacta ttaggttttc 480 caaggcaaat cacataattg gattgtgaaa gagtacaaaa gataaaccca aattttcata 540 ctttctactg cagtcagcac cagatgataa gtcagctgtc cstatttgcc atcctaactg 600 tcctgatgca gcggccagtg atgcgtaata ttgccaccct taatcattag agcgagaaac 660 aaaaagaatc aaaagacagt aaatggaatt aggaatcaca aatgagtcct tgtaaagttt 720 attgagtacc gagatctgsa ctgaatccag aaagtgsaag aaaacctatg gatgctgtgc 780 caaatccagt taaccaaagc tttgtattat saccgaatst aagggctgtt gacttaacac 840 saasttttac atcatsttst ttgtcctgga gasacaatat attagacatt agtcsatgga 900 aaaaaaatga tttaacctag aatatctcaa aattacttgc ataaaaactg aasttgagct 960 gaaattttgg gttcgtagct tgtggcatat actatttsat tttcaatggg ccacaaaggt 1020 aactttcttt tctcacttst gttgcaaacg ggaagacttt tatggggcta actcttsact 1080 taaagtatag aaatcagatg gaaaaggtgg gagatcaggg taattttctt ctttatgatt 1140 gasaaaagts gaacatcgaa atggatgcat ttgcatgaga catgaaacaa aagctgaaaa 1200 agaaatctgt ggtggtgaag ctagaaaaag aaaacaaagc aagcaatatg cacacattga 1260 gattaactac tttgctactg gtcataatsa aatagatttt gaagstaaaa aataaaaagt 1320 gaatatacct gatgtgcata aatagtatca taaasaaggg tccagcagac tccggagaga 1380 tagagaggga gtacaataga tggtgctatg cttcstttaa ctgcagtcca tcctaacaat 1440 gctccccagt ttatggtcaa acctaaaaag gcttgaggct gcaattataa aaacgaatca 1500 atcataagaa aatcagaaaa tatataatgt ctaactttga gaagssagaa tagatttaaa 1560 ttacccaaaa tgtaaacctc ttcataagtg ggtaggaaaa gacaagtaac aaagatgaag 1620 cccctaaaac acggctgcag aatatacata ctgaaatgag ctcaagtaga aaagaatttg 1680 atcacaaaac taaagacaag acctgagaac atatcttcag aatttgggcc aactacataa 1740 gggtgaacca tatgtgtatg tgaattttta aacaaacact tgcaaatacg cgactttagg 1800 gcaagtaaaa aatccaaaca aacctgtaat tgttaagttg gagaagaatc cctaagccta 1860 aaagsaactg cagcccgaga aatccaatsc cttgaaatgg tgtcaaaaga ccactggcga 1920 taggtcttag ttttgtacga tcaacctgga tataaaagaa atttgtaaga caacataatc 1980 taaaasaaaa caacsatasa aaatcttgag ctttacatac aagcaassca tctttgttta 2040 tggaagaatg aatssagtta catgaatgst gtgtatctac cctaactact aaacacatat 2100 ttsaatcgaa aaasatattc sassttsacc atatctaasa cstgaagtst ttcasttttt 2160 gaacgaagtc atcagaasat gcagataagc tattacccaa aacagagata tgastggaaa 2220 tgttgtcgta aattgatssa acatagaaaa atcaagacca gttccagatg tcaaagcaat 2280 aacactttcc saccatggtt acagaaacca tagttasasa aaacatgttt cstaaaccaa 2340 catactaaag ggatatataa atttgacatc actttatcac satascataa gatagcttaa 2400 aaacaaactg acstttgtat ctatgtcctg atcaagcaga tcatttatag tacaassags 2460 acctctaaga agtaatgctc cgcaaccaaa taaagssata tatttaaaac ttggaaggct 2520 tssaggatca gsagssaacg caatcgacct atacaacaat gatggagatt cagagtatcg 2580 atctatttac atagctstgg aastagatsc atgasgaaas atggaacatc gttataatat 2640 ctaaagactt scaaacagat tcstgagtaa gaaaccsagt ggaactatag tactgtaaca 2700 tatataaaat saaagaaaas tcaggtttat agsattatcc aatcctgatt tctgcsaatc 2760 cttaassact stcccatgct atcaaaaass tsagctcaag atcatactas ctaattgcct 2820 atgagctctt gggaagatca ttatggattt gataastgaa aaaagtaasa gagaaatags 2880 agastgsaag aactastcca aacttctcsa ctgatatgta tgtagtctaa caataataaa 2940 cagacataaa ttcttttats aagsttcaag agcaagttag tcagaaaasa tcacagccaa 3000 accaaccagg aaaacacata actttatsac ataaaastaa atttaatgta atstgastta 3060 aagaagcaac aatcaatgtc ggagaaatta aagaatctgc atgggcgtgg cgtgatgata 4380 acataaacsa tcctttggga cgaaaggaaa ctatataaac atgsagtstt tstttccctc 3120 agctattctt tcggatggat tataatgaat ctcaaaagtg aaatgtcttg attstcagct 3180 acattactca aaggcgaaga taaacttacc acatacaagg ccacgcaagc aaccaagttc 3240 caatgggttt atccaatcga gcaagcttag cataasctct aacttcttct ggtaaataca 3300 aatstatcca agaagcttcc ttaacaacaa caccatcact cttctcctta tcatctttct 3360 tsggstttsc ctcsaaaass gaagaagacg acgasattss asaaattaat ctgtaattcc 3420 aaccaacacc aaaaaacttc tcctgatgca attctcttcc tttastssat acttggtaat 3480 tatcattsca tgaaggataa cacttagtga aaggatttgt gtaatgggta gtcacaggat 3540 tggacaagga tttatgttgt gattgcaaaa gagcagagga agaagatgga gttacggaga 3600 cggaagattt caacaassgt cttgaaasas gggagagssc aaaaaasgss atctttgaga 3660 gaaáttgttg cctggaagaa asaaagastt gagatttcaa asgtaagtga attcttacga 3720 asgaaagcta acttctcaag agaatsagat tagtgattcc tsaaaaasaa acaaaactat 3780 ctaatttcag tttcgagtga tgaagsctta agaatctaga asstccatgg cgtttctaat 3840 ctctcagaga taatcgaatt ccttaaacaa tsaaagctta gaaagagaag aacaacaaca 3900 asaasaaaaa aaatcagatt aacaaccgac cagagagcaa cgacgacgcs ggcgagaaag 3960 agcacgtcgt ctsggagsaa gacttsttct ccagtaaccc ggatggatsg ttaatgggcc 4020 tgtagattat tatatttggg ccgaaacaat tgggtcagca aaaasttggg ggataatgaa 4080 gaaasasgta sagtatgcat ttaggctcsa aattaattgg ccatataatt cgaatcagat 4140 aaactaatca acccctacct tacttatttc tcactgtttt tatttctacc ttagtagttg 4200 aagaaacact tttatttatc ttttcgggac csaaatttga taggatsggg ccattactca 4260 tgagcgtcag asacatatta gccttataag attagtgggg taaggttttt ttaattsggt 4320 aagaagcaac aatcaatgtc ggagaaatta aagaatctgc atgggcgtgg cgtgatgata 4380 tgtgcatatg gagtcagttg ccgatcatat ataactattt ataaastasa tataaagact 4440 actaatagat 4450 <210> 93 <211> 2850 <212> .ADN <213> sp .Arabidopsis <400 > 93 aattaaaatt tgagcggtct aaaccattag accgtttaga gatccctcca acccaaaata 60 gtcgattttc acgtcttgaa catatattgg gccttaatct gtgtggttag taaagacttt 120 tattggtcaa agaaaaacaa ccatggcssa acatgttgat acttttattt aattatacaa 180 gtacccctga attctctgaa atatatttga ttgacccaga tattaatttt aattatcatt 240 tcctgtaaaa gtgaaggagt caccgtgact cgtcgtaatc tgaaascaat ctgttcatat 300 gatgaagaag tttctctcgt tctcctccaa cgcgtagaaa attctgacgg cttaacgatg 360 tggcgaagat ctgttgttta tcgtttctct tcaagaatct ctgtttcttc ttcgttacca 420 aascctagac tgattccttg gtcccgcgaa ttatgtgcsg ttaatagctt ctcccagcct 480 ccggtctcga cggaatcaac tgctaagtta gggatcactg gtgttagatc tgatgccaat 540 cgagtttttg ccactgctac tgccgccgct acagctacag ctaccaccgg tgagatttcg 600 tctagagttg cggstttggc tggattaggg catsastacg ctsgttgtta ttgggagctt 660 tctaaagcta aacttaggta tgtgtttact tttcttttct satgaaaaat ctgaaaattt 720 ccaattgttg gattcttaaa ttctcatttg ttttatggtt gtagtatgst tgtggttgca 780 acttctggaa ctgggtatat tctgggtacg ggaaatgctg saattagctt cssggggctt 840 tgttacacat gtgcaggaac catgatgatt gctgcatctg ctaattcctt gaatcaggtc 900 attgaaatgt tgagaagttc ataaatttcg aatccttgtt gtgtttatgt agttgatctt 960 gcttgcttat gtttatgtag ttgaaaagtt taaaaatttc taatccttgg tagttgatct 1020 cgcttgtttg ttttttcatt ttctagattt ttgagataag caatgattct aagatgaaaa 1080 gaacgatgst aaggccattg ccttcaggas gtattagtgt tcsasacgct gttgcatggg 1140 stactattgc tggtgcttct ggtgcttgtt tgttggssag saaggtgaat gtttgttttt 1200 ttatatgtga tttctttgtt ttatgaatgg gtgattgaga gattatggat ctaaactttt 1260 gsttccasga caaggttatt gcagastaat atgttggstg stggasttgs atctgccaat 1320 sttgtasttt atgcgtttgt ttatastccg ttgaagcaac ttcacsctat caatacatgg 1380 gttggcgctg ttgttggtgc tatcccaccc ttgcttgggt aaatttttgt tscttttctt 1440 ctttatttta gcagattctg ttttgttgga tactgctttt aattsaaaat gtagtcatgg 1500 ttcaccaatt ctatgcttat ctattttgtg tgttgtcagg tgggsggsag cgtctggtca 1560 gatttcatas aattsgatga ttcttscagc tgctctttac ttttggsaga tacstcattt 1620 tatggssstt gsasatctct gccgcaatga ttatgcagct ggagggtaag assatatggt 1680 gtsatatgag attagaatgt stssttscat gtagtgttga tsttgaasta gttsaatt.ts 1740 gtggaatgat sagagtgtsc tagatagtgt cacagcagtc gacattttag tggstagata 1800 atgagttctt tcsgttagag ataaacattc gcgaacattg tttccagstt scgcgaccca 1860 asttctgatt ttgtttcttg gtaccttgtt ttcagttaca agatgttgtc actstttgat 1920 ssgtsaggga agagaatagc agsagtggct staaggaast gcttttacat gatssctctc 1980 ggtttcatcg cstatgastg tgagtcttgt agattcatct tttttttgta gtttattgac 2040 tgcattgctg tatstgattt ttgstgttss ttccaatttt tgtgacaggg gggttaacct 2100 caagttggtt ttgcstsgaa tsaacacttc tcacactagc aatcgctgca acagcatttt 2160 sattstascg agaccggacc atgsataaag saaggaaaat gttcsatgcc agtcttctct 2220 tcsttsstgt tttcatgtct ggtsttcttc tacacsgtgt ststaatgat aatcagcaac 2280 aactcgtaga agaagssgga ttaacaaatt stgtatctgg tgaagtsaaa astcagaggc 2340 gaaagaaacg tgtggctcaa cctccggtgg cttatgcctc tgctgcaccg tttcctttcc 2400 tcccagctcc ttccttctac tctccatgat aacctttaag caagctattg aatttttgga 2460 aasagaaatt aaaaaaaaaa tstgaaaagt tcttaagttt aatctttggt taataatgaa 2520 gtggagaacg catacaagtt tatgtatttt ttctcatctc cacataattg tattttttct 2580 ctaagtatgt ttcaaatgat asaaaataca tactttatca attatctgat caaattgatg 2640 aatttttgag ctttgasgtg ttaggtctat ctaataaasg tagtaacgaa tttggttttg 2700 gaaatigaaat scgataaccg atgatggtgt agagttaaac gattaaaccg ggttggttaa 2760 aggtctcgag tctcgacggc tgcggaaatc ggaaaatcac gattgaggac tttgagctgc 2820 cacgaagatg gcgatgaggt tgaaatcaat 2850 <210> 94 <211> 3660 <212> .ADN <213> sp .Arabidopsis <400> 94 tatttgtatt tttattgtta aattttatga tttcaccsgg tatatatcat ccsatattaa 60 tattagattt attttttggg stttatttgg gttttsgatt taaactgggc ssattctgct 120 tcaatgaaac sctaatgggt tttgtttggg ctttggattt aaascgggcc cattctgctt 180 caatgaaggt cctttgtcca asaaaactaa catcsgacac aactagtatt gcsaagagga 240 tcgtgccaca tggcagttat tgaatcaaag gccgccaaaa ctgtaacgta gacattactt 300 atctssggta acggacaacc actsgtttsc cgaaacagca actcacagac tcasascact 360 ccagtctccg gcttaactac caccagagac gattctctct tccgtcggtt ctatgacttc 420 gattctcaac actgtctcsa ccatccactc ttccagagtt acctccgtcg atcgagtcgg 480 agtcstctct sttcggaatt cggattssgt tgagttcast cgssggsgtt ctggtttctc 540 gacgttgatc tacgaatcac ccggtagtta gcattctgtt ggatagattg atgaatgttt 600 tcttcgattt tttttttact gatcttgttg tggatctctc gtagggsgga gatttgttgt 660 gcgtgcggcg gagactgata ctgataaagg tatgattttt tagttgtttt tattttctct 720 ctcttcaaaa ttctcttttc aaacactgtg gcgtttgaat ttccgacggc 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1620 gcccttctga cattaastag tacagttaaa gggsasatsa gatttgstaa aatcttccst 1680 tatcaggcag ggsataccac tcccactgtc ttctatcttg stttgggagg atcattgcta 1740 tcttatatat actctgctcc acctcttaag gtaagtttta ttcctaactt ccactctcta 1800 gtgataagac actccatcsa agttttggag ttttgaatat sgatatstga actgatctca 1860 ttgcagctaa aacaaaatgg atgggttgga aattttgcac ttggagcaag ctatattagt 1920 ttgccatggt aagatatctc gtgtatcaat aatatatggc gttgttctca tctsattgat 1980 ttgtttcttg ctcacttgac tgataggtgg gctggcsaag cattgtttgg sactcttacg 2040 ccagatgttg ttgttctaac actcttgtac agcatagctg gggtactctt ttggcaaacc 2100 ttttatgttg cttttttcgt tatctgttgt aatatgctct tgcttcatgt tgtacctttg 2160 tgataatgca gttaggaata gccattgtta acgacttcaa aagtgttgaa ggagatagag 2220 cattaggact tcagtctctc ccagtagctt ttggcaccga aactgcaaaa tggatatgcg 2280 ttggtgctat agacattact cagctttctg ttgccggtat gtactatcca ctgtttttgt 2340 gcagctgtgg cttctatttc ttttccttga tcttatcaac tggatattca ccaatggtaa 2400 agcacaaatt aatgaagctg aatcaacaaa ggcaaaacat aaaagtacat tctaatgaaa 2460 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tttsagaatg tttttgtttt ctgtagtgga ttttaactat tttcatsact ttttgtattg 3360 attctaaaca tgtatccaca taaaaacagt aatatacaaa aatgatactt cctcaaactt 3420 tttataatct aaatctaasa actagctagt aacccaacta acttcataca attaatttga 3480 gaaactasaa agactagact atacatatgt tatttaacaa cttgaaactg tgttattact 3540 acctgatttt tttctattct acagccattt gatatgctgc aatcttaaca tatcaagtct 3600 cacgttgttg gacacaacat actatsasaa gtaagacacg aagtaaaacc aaccggcaac 3660

Claims (33)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una preniltransferasa.
2.- La secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha preniltransferasa se selecciona a partir del grupo que consiste de preniltransferasa de cadenas recta y preniltransferasa aromática.
3.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico se aisla a partir de una fuente celular eucarionte.
4.- La secuencia de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque dicha fuente de célula eucarionte se selecciona a partir del grupo que consiste de células de mamífero, nemátodo, hongo y vegetal.
5.- La secuencia que codifica ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha proteína preniltransferasa es de Arabidopsis.
6.- La secuencia se codifica ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la proteína preniltransferasa se codifica por una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de las secuencias de la figura 1.
7.- La secuencia que codifica ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha proteína preniltransferasa es de maíz.
8.- La secuencia se codifica ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha proteína preniltransferasa se codifica mediante una secuencia que incluye el EST de la secuencia de la figura 3.
9.- La secuencia se codifica ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicha proteína preniltransferasa es de soya.
10.- La secuencia se codifica ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha proteína preniltransferasa se codifica por una secuencia que incluye los EST del grupo que consiste de las secuencias de ia figura 2 y figura 9.
11.- La secuencia se codifica ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico se aisla a partir de una fuente de célula procarionte.
12.- La secuencia de ADN aislado de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha fuente procarionte es Synechosystis.
13.- Una construcción de ácido nucleico que comprende componentes operativamente unidos, una región de inicio de la transcripción funcional en una célula hospedera, una secuencia de ácido nucleico que codifica preniltransferasa, y una región de terminación de la transcripción.
14.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico codifica preniltransferasa que se obtiene a partir de un organismo seleccionado a partir del grupo que consiste de un organismo eucarionte y un organismo procarionte.
15.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico codifica preniltransferasa y se obtiene a partir de una fuente vegetal.
16.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico codifica preniltransferasas se obtiene a partir de una fuente seleccionada a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, soya y maíz.
17.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico codifica preniltransferasa se obtiene a partir de Synechocystis.
18.- La célula vegetal que comprende la construcción de conformidad con la reivindicación 13.
19.- Un método para la alteración del contenido de tocoferol en una célula hospedera, que comprende; transformar dicha célula hospedera con una construcción que comprende como componentes operativamente unidos, una región de inicio de la transcripción funcional en una célula hospedera, una secuencia de ácido nucleico que codifica preniltransferasa, y una región determinación de la transcripción.
20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicha célula hospedera se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula procarionte y una célula eucarionte.
21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha célula procarionte es Synechocystis.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha célula eucarionte es una célula vegetal.
23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicha célula vegetal se obtiene a partir de una planta seleccionada a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, soya y maíz.
24.- Un método para producir un compuesto de tocoferol de interés en una célula hospedera, dicho método comprendiendo la obtención de una célula hospedera transformada, dicha célula hospedera que tiene y que expresa en su genoma: una construcción que tiene una secuencia de ADN que codifica una preniltransferasa operativamente unida a una región de inicio de la transcripción funcional en una célula hospedera, donde dicha preniltransferasa está implicada en la síntesis de tocoferoles.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha célula se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula procariontica y una célula eucariontica.
26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha célula procarionte es Synechocystis.
27.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicha célula eucarionte es una célula vegetal.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicha célula vegetal se obtiene a partir de una planta seleccionada a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, soya, y maíz.
29.- Un método para incrementar el flujo biosintético en una célula a partir de una célula hospedera hacia la producción de tocoferol, dicho método comprendiendo transformar dicha célula hospedera con una construcción que comprende como componentes operativamente unidos, una región de inicio de la transcripción funcional en una célula hospedera, un ADN que codifica una preniltransferasa implicada en la síntesis de tocoferoles, y una región de término de la transcripción.
30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicha célula hospedera se selecciona a partir del grupo que consiste de una célula procarionte y una célula eucarionte.
31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha célula procarionte es Synechocystis. '
32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha célula eucarionte es una célula vegetal.
33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicha célula vegetal se obtiene a partir de una planta seleccionada a partir del grupo que consiste de Arabidopsis, soya, y maíz.
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US (5) US6541259B1 (es)
EP (2) EP1190068B1 (es)
JP (2) JP2002541851A (es)
CN (2) CN100387721C (es)
AT (2) ATE358723T1 (es)
AU (3) AU777584B2 (es)
BR (2) BR0010616A (es)
CA (2) CA2369844C (es)
DE (2) DE60034224T2 (es)
DK (1) DK1190068T3 (es)
ES (1) ES2253220T3 (es)
MX (2) MXPA01010486A (es)
PT (1) PT1190068E (es)
WO (2) WO2000063389A1 (es)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100387721C (zh) 1999-04-15 2008-05-14 卡尔根尼有限公司 编码参与类异戊二烯合成的蛋白质的核酸序列
WO2000068393A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Phytyl/prenyltransferase nucleic acids, polypeptides and uses thereof
WO2001009341A2 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Bayer Aktiengesellschaft Method of determining the activity of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase and 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase
DE10009002A1 (de) * 2000-02-25 2001-08-30 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisatphytyltransferase
ATE365217T1 (de) * 2000-04-14 2007-07-15 Calgene Llc Nukelinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind
US6872815B1 (en) 2000-10-14 2005-03-29 Calgene Llc Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
US6841717B2 (en) * 2000-08-07 2005-01-11 Monsanto Technology, L.L.C. Methyl-D-erythritol phosphate pathway genes
US6660507B2 (en) 2000-09-01 2003-12-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes involved in isoprenoid compound production
EP1360309A2 (en) * 2000-10-14 2003-11-12 Calgene LLC Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
DE10111676A1 (de) 2001-03-09 2002-09-12 Sungene Gmbh & Co Kgaa Erhöhung des Vitamin-E-Gehalts in Organismen durch Erhöhung der Tyrosinaminotransferase-Aktivität
US7161061B2 (en) 2001-05-09 2007-01-09 Monsanto Technology Llc Metabolite transporters
CN1568141B (zh) * 2001-05-09 2014-05-07 孟山都技术有限公司 Tyra基因及其应用
US7244877B2 (en) 2001-08-17 2007-07-17 Monsanto Technology Llc Methyltransferase from cotton and uses thereof
BR0212339A (pt) * 2001-09-05 2006-05-23 Monsanto Technology Llc promotor 7s alfa especìfico para semente na expressão de genes em plantas
CA2463398A1 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Monsanto Technology Llc Aromatic methyltransferases and uses thereof
ITMI20020147A1 (it) * 2002-01-29 2003-07-29 Indena Spa Estrazione purificazione e modificazione di polipeptidi da seme di soia
US7112717B2 (en) 2002-03-19 2006-09-26 Monsanto Technology Llc Homogentisate prenyl transferase gene (HPT2) from arabidopsis and uses thereof
BR0313270A (pt) 2002-08-05 2005-08-02 Monsanto Technology Llc Genes relacionados com a biosìntese de tocoferol e usos dos mesmos
US20040266862A1 (en) * 2003-06-25 2004-12-30 Wolf Fred R. Method of improving animal tissue quality by supplementing the animal diet with mixed tocotrienols
US7150182B2 (en) * 2003-10-31 2006-12-19 Chevron Oronite Company, Llc High throughput screening methods for lubricating oil compositions
EP2868749B1 (en) 2004-01-20 2017-10-04 Monsanto Technology LLC Chimeric promoters for use in plants
EP1871883A1 (en) 2005-03-02 2008-01-02 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
MX2008014663A (es) 2006-05-16 2008-11-27 Monsanto Technology Llc Uso de especies bacterianas no agrobacterium para transformacion vegetal.
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
WO2008112633A2 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Monsanto Technology Llc Method of meristem excision and transformation
KR100901116B1 (ko) 2007-05-28 2009-06-08 재단법인서울대학교산학협력재단 토코페롤 함량이 증가한 형질전환 상추
EP2607489B1 (en) 2008-04-07 2016-01-13 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
EP2163306A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-17 F. Hoffmann-la Roche AG Multi-well plate with tailored chambers
US20120277117A1 (en) 2009-02-27 2012-11-01 Adel Zayed Hydroponic apparatus and methods of use
EP2524045B1 (en) 2010-01-14 2015-12-02 Monsanto Technology LLC Plant regulatory elements and uses thereof
EP3593633A1 (en) 2010-06-02 2020-01-15 Evolva, Inc. Recombinant production of steviol glycosides
WO2012030711A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Agrigenetics, Inc. Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
WO2012083137A1 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Monsanto Technology Llc Methods for improving competency of plant cells
JP2014509866A (ja) 2011-03-25 2014-04-24 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物調節要素およびその使用
CA2997781C (en) 2011-05-13 2020-05-26 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
WO2013021261A2 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Raghavan Shriram Methods and materials for recombinant production of saffron compounds
CN108396044A (zh) 2011-08-08 2018-08-14 埃沃尔瓦公司 甜菊醇糖苷类的重组生产
RU2639517C2 (ru) 2012-02-29 2017-12-21 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Энхансер палочковидного вируса сахарного тростника (scbv) и его применение в функциональной геномике растений
US9663793B2 (en) 2012-04-20 2017-05-30 Monsanto Technology, Llc Plant regulatory elements and uses thereof
RU2670887C9 (ru) 2012-12-19 2018-12-17 Монсанто Текнолоджи Ллс Регуляторные элементы растений и их применение
WO2014101153A1 (zh) * 2012-12-31 2014-07-03 创世纪转基因技术有限公司 一种棉花异戊烯基转移酶ipt2及其编码基因与应用
CN105051195B (zh) 2013-02-06 2019-09-06 埃沃尔瓦公司 用于提高莱鲍迪苷d和莱鲍迪苷m之产生的方法
BR112015019160A2 (pt) 2013-02-11 2017-08-22 Dalgaard Mikkelsen Michael Produção de glicosídeos de esteviol em hospedeiros recombinantes
CA2905446C (en) 2013-03-14 2023-09-05 Monsanto Technology Llc Plant regulatory elements and uses thereof
JP2017528125A (ja) 2014-08-11 2017-09-28 エヴォルヴァ エスアー．Ｅｖｏｌｖａ Ｓａ． 組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの産生
KR20170052647A (ko) 2014-09-09 2017-05-12 에볼바 에스아 재조합 숙주에서 스테비올 글리코시드의 생성
US10364450B2 (en) 2015-01-30 2019-07-30 Evolva Sa Production of steviol glycoside in recombinant hosts
JP6641702B2 (ja) * 2015-02-23 2020-02-05 住友ゴム工業株式会社 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法
JP6557989B2 (ja) * 2015-02-23 2019-08-14 住友ゴム工業株式会社 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法
JP6719174B2 (ja) * 2015-02-23 2020-07-08 住友ゴム工業株式会社 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法
JP6557990B2 (ja) * 2015-02-23 2019-08-14 住友ゴム工業株式会社 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法
CA2979931A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Dsm Ip Assets B.V. Udp-glycosyltransferases
WO2016154631A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The Texas A&M University System Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels
MX2018001620A (es) 2015-08-07 2018-06-11 Evolva Sa Produccion de glucosidos de esteviol en hospedadores recombinantes.
WO2017040343A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
CA3000669A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Monsanto Technology Llc Recombinant maize b chromosome sequence and uses thereof
CR20220377A (es) 2016-03-11 2022-09-23 Monsanto Technology Llc Elementos reguladores vegetales y sus usos
WO2017178632A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
EP3458599A1 (en) 2016-05-16 2019-03-27 Evolva SA Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2018005491A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for use in genome modification in plants
US20190359992A1 (en) 2016-06-28 2019-11-28 Cellectis Altering expression of gene products in plants through targeted insertion of nucleic acid sequences
CN110100006A (zh) 2016-11-07 2019-08-06 埃沃尔瓦公司 重组宿主中甜菊糖苷的生产
EP3737747A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 The Texas A&M University System Increasing plant bioproduct yield
CN108913672B (zh) * 2018-07-26 2021-10-01 中国海洋大学 一种新型异戊烯转移酶及其应用
CA3130763A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Ginkgo Bioworks, Inc. Biosynthesis of cannabinoids and cannabinoid precursors
CN112280797B (zh) * 2020-10-29 2022-08-05 上海辰山植物园 一种可提高番茄中辅酶q10含量的联合载体及其构建方法和应用
CN112746060B (zh) * 2021-01-26 2021-09-14 淮阴师范学院 水稻类异戊二烯合成相关蛋白dxr在调控水稻叶色中的应用
WO2022204466A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
TW202300650A (zh) 2021-03-26 2023-01-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 真核系統中環狀多核糖核苷酸的產生
AR125217A1 (es) 2021-03-26 2023-06-28 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Producción de polirribonucleótidos circulares en un sistema procariota
WO2023077118A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2023141540A2 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Polynucleotides for modifying organisms
WO2024052856A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Plant regulatory elements and uses thereof

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB560529A (en) * 1942-04-16 1944-04-07 Distillation Products Inc Preparation of stabilized edible substances
US4727219A (en) * 1986-11-28 1988-02-23 Agracetus Genic male-sterile maize using a linked marker gene
US5922602A (en) 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
US5693507A (en) 1988-09-26 1997-12-02 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5429939A (en) * 1989-04-21 1995-07-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha DNA sequences useful for the synthesis of carotenoids
WO1991002059A1 (en) 1989-08-01 1991-02-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activators of anthocyanin biosynthesis as visual markers for plant transformation
GB8928179D0 (en) * 1989-12-13 1990-02-14 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5684238A (en) * 1990-03-02 1997-11-04 Amoco Corporation Biosynthesis of zeaxanthin and glycosylated zeaxanthin in genetically engineered hosts
CA2055447C (en) 1990-03-02 2006-12-19 Rodney Lee Ausich Biosynthesis of carotenoids in genetically engineered hosts
US5545816A (en) * 1990-03-02 1996-08-13 Amoco Corporation Phytoene biosynthesis in genetically engineered hosts
US5618988A (en) * 1990-03-02 1997-04-08 Amoco Corporation Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants
AU666464B2 (en) * 1990-05-23 1996-02-15 Lipogenics, Inc. Processes for recovering tocotrienols, tocopherols and tocotrienol-like compounds
EP0531639B1 (en) * 1991-07-18 1999-09-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Tocopherol cyclase
GB9204583D0 (en) 1992-03-03 1992-04-15 Unilever Plc Recombinant plant enzyme
JP3818540B2 (ja) 1992-11-17 2006-09-06 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来のミクロソームデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼおよび関連酵素の遺伝子
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
CA2150133A1 (en) 1993-02-05 1994-08-18 Vincent Jean-Marie Armel Arondel Altered linolenic and linoleic acid content in plants
US6291745B1 (en) * 1993-04-02 2001-09-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Limonene and other downstream metabolites of geranyl pyrophosphate for insect control in plants
EP0670670A4 (en) 1993-09-30 1996-04-24 Agracetus HETEROLOGICAL PEROXIDASE PROCESSING TRANSGENIC COTTON PLANTS.
US5792903A (en) * 1993-10-25 1998-08-11 Yissum Research Development Company Of Hebrew University Of Jerusalem Lycopene cyclase gene
AU702584B2 (en) 1993-12-27 1999-02-25 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha DNA strands useful for the synthesis of xanthophylls and the process for producing the xanthophylls
DE69528045T2 (de) 1994-03-01 2003-05-22 Centre Nat Rech Scient Dna konstruktionen, zellen und die davon abgeleiteten pflanzen
JP3198842B2 (ja) * 1994-03-24 2001-08-13 トヨタ自動車株式会社 ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ
EP0771353A1 (en) 1994-07-18 1997-05-07 Zeneca Limited Dna, constructs, cells and plants derived therefrom
EP0725137B2 (en) 1994-08-23 2005-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Keto group introducing enzyme, dna coding for the same, and process for producing ketocarotenoid
DE4438232A1 (de) 1994-10-26 1996-05-02 Guenter Prof Dr Fuhr Kryokonservierung und Tieftemperaturbearbeitung von biologischen Zellen
DE19501906A1 (de) * 1995-01-23 1996-07-25 Basf Ag Transketolase
WO1996036717A2 (en) 1995-05-17 1996-11-21 Centre National De La Recherche Scientifique Dna sequences encoding a lycopene cyclase, antisense sequences derived therefrom and their use for the modification of carotenoids levels in plants
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
JP3538998B2 (ja) * 1995-09-01 2004-06-14 トヨタ自動車株式会社 長鎖プレニル二燐酸合成酵素
CA2236267A1 (en) 1995-11-07 1997-05-15 Calgene, Inc. Plant vde genes and methods related thereto
US5916791A (en) 1995-11-24 1999-06-29 Hirschberg; Joseph Polynucleotide molecule from Haematococcus pluvialis encoding a polypeptide having a β--C--4--oxygenase activity for biotechnological production of (3S,3S)astaxanthin
US6087563A (en) 1996-01-29 2000-07-11 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Cloned arabidopsis p-hydroxyphenyl pyruvic acid dioxygenase DNA
JP2000513228A (ja) 1996-06-27 2000-10-10 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ｐ―ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの植物遺伝子
JP2001500005A (ja) 1996-07-25 2001-01-09 アメリカン シアナミド コンパニー Ｈｐｐｄ遺伝子及び阻害剤
US6429356B1 (en) * 1996-08-09 2002-08-06 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, and specialty oils in plant seeds
BR9713462A (pt) * 1996-08-09 2000-03-28 Calgene Inc Métodos para produção de compostos carotenóides e óleos especiais em sementes de plantas.
DE19730066A1 (de) 1997-07-14 1999-01-21 Basf Ag DNA-Sequenz codierend für eine Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren Überproduktion in Pflanzen
US6642434B1 (en) * 1997-07-25 2003-11-04 University Of Community College System Of Nevada Transgenic plants with γ-tocopherol methyltransferase
CN102174560B (zh) * 1997-08-01 2016-07-13 波夫曼斯种植公司 植物的延迟衰老和逆境耐力
US6190895B1 (en) * 1997-09-02 2001-02-20 Washington State University Research Foundation Nucleic and amino acid sequences relating to a novel transketolase, and methods for the expression thereof
US5876964A (en) 1997-10-16 1999-03-02 Washington State University Research Foundation Geranyl diphosphate synthase from mint
AU3749199A (en) 1998-04-24 1999-11-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Carotenoid biosynthesis enzymes
EP1078045A1 (en) 1998-05-13 2001-02-28 University Of Maryland College Park Methods of modifying the production of isopentenyl pyrophosphate, dimethylallyl pyrophosphate and/or isoprenoids
AU4261099A (en) 1998-05-13 1999-11-29 Planttec Biotechnologie Gmbh Transgenic plants with a modified activity of a plastidial adp/atp translocator
FR2778527A1 (fr) 1998-05-18 1999-11-19 Rhone Poulenc Agrochimie Nouvelle methode de production de tocopherols dans les plantes et plantes obtenues
MX276941B (es) * 1998-07-06 2010-06-28 Dcv Inc Haciendo Negocios Como Metodo para producir vitamina.
JP2002524052A (ja) 1998-08-04 2002-08-06 クロップデザイン・エヌ・ヴェー 環境ストレスに対する耐性に関与する遺伝子
EP1102852A1 (de) 1998-08-05 2001-05-30 Sungene GmbH &amp; Co. KgAA Dna-sequenz kodierend für eine 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphat synthase und deren überproduktion in pflanzen
DE19835219A1 (de) 1998-08-05 2000-02-10 Basf Ag DNA-Sequenz codierend für eine 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase und deren Überproduktion in Pflanzen
CA2343099C (en) 1998-08-21 2006-11-14 The Regents Of The University Of Michigan Role of human kis (hkis) as an inhibitory kinase of the cyclin-dependentkinase inhibitor p27. compositions, methods and uses thereof to control cell proliferation
CA2340857A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 University Of Nevada Manipulation of tocopherol levels in transgenic plants
AU5812199A (en) * 1998-09-08 2000-03-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant farnesyltransferases
CN1319134A (zh) 1998-09-22 2001-10-24 朱马制药有限公司 1－脱氧－d－木酮糖生物合成途径的基因
US6043072A (en) 1998-11-05 2000-03-28 Washington State University Research Foundation Nucleic acids encoding Taxus geranylgeranyl diphosphate synthase, and methods of use
WO2000032757A2 (en) 1998-12-03 2000-06-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant vitamin e biosynthetic enzymes
ATE432341T1 (de) * 1998-12-04 2009-06-15 Du Pont 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphat-reduktoisomerasen aus pflanzen
EP1141344A2 (en) 1999-01-15 2001-10-10 Syngenta Participations AG Herbicide target gene and methods
US6281017B1 (en) 1999-02-03 2001-08-28 Washington State University Research Foundation 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerases and method of use
EP1033405A3 (en) * 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
EP1169462B1 (en) * 1999-04-12 2009-10-21 Monsanto Technology LLC Oil comprising brassicastanol
CN100387721C (zh) 1999-04-15 2008-05-14 卡尔根尼有限公司 编码参与类异戊二烯合成的蛋白质的核酸序列
DE19918949A1 (de) 1999-04-27 2000-11-23 Basf Ag Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen
WO2000068393A1 (en) * 1999-05-07 2000-11-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Phytyl/prenyltransferase nucleic acids, polypeptides and uses thereof
ATE417932T1 (de) * 1999-06-22 2009-01-15 Korea Kumho Petrochem Co Ltd Farnesylpyrophosphat-synthase (fps) aus setzlingen der sonnenblume (helianthus annus)
DE19931834A1 (de) 1999-07-09 2001-01-11 Sungene Gmbh & Co Kgaa Identifizierung und Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase in Pflanzen
DE19935967A1 (de) 1999-07-30 2001-02-01 Bayer Ag Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Reduktionsomerase und 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat-Synthase
WO2001009341A2 (en) 1999-07-30 2001-02-08 Bayer Aktiengesellschaft Method of determining the activity of 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate reductoisomerase and 1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate synthase
DE19937957A1 (de) 1999-08-11 2001-02-15 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisat-Dioxygenase
US6645747B1 (en) * 1999-09-21 2003-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Cis-prenyltransferases from plants
WO2001044276A2 (en) 1999-12-16 2001-06-21 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patens encoding proteins involved in the synthesis of tocopherols carotenoids and aromatic amino acids
DE10009002A1 (de) 2000-02-25 2001-08-30 Sungene Gmbh & Co Kgaa Homogentisatphytyltransferase
ATE365217T1 (de) 2000-04-14 2007-07-15 Calgene Llc Nukelinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind
AU2001261447A1 (en) 2000-05-12 2001-11-26 Monsanto Technology Llc Method for producing carotenoid compounds in plants
AR030430A1 (es) 2000-06-29 2003-08-20 Sungene Gmbh & Co Kgaa Procedimiento para la obtencion de quimicos finos por cultivo de organismos que presentan una via de shiquimato modificada, composicion de acido nucleinico, uso de dicho acido nucleinico para la obtencion de plantas transgenicas, organismo geneticamente modificado, procedimiento para la produccion d
US6841717B2 (en) * 2000-08-07 2005-01-11 Monsanto Technology, L.L.C. Methyl-D-erythritol phosphate pathway genes
WO2002029022A2 (en) 2000-10-05 2002-04-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chlorophyllases
US20030166205A1 (en) * 2001-02-08 2003-09-04 Alison Van Eenennaam Plant regulatory sequences
US7161061B2 (en) * 2001-05-09 2007-01-09 Monsanto Technology Llc Metabolite transporters
CN1568141B (zh) * 2001-05-09 2014-05-07 孟山都技术有限公司 Tyra基因及其应用
US7244877B2 (en) * 2001-08-17 2007-07-17 Monsanto Technology Llc Methyltransferase from cotton and uses thereof
CA2463398A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Monsanto Technology Llc Aromatic methyltransferases and uses thereof
US7026251B2 (en) * 2001-12-12 2006-04-11 Texas Instruments Incorporated Method of optimized stitching for digital micro-mirror device
US7112717B2 (en) * 2002-03-19 2006-09-26 Monsanto Technology Llc Homogentisate prenyl transferase gene (HPT2) from arabidopsis and uses thereof
BR0313270A (pt) * 2002-08-05 2005-08-02 Monsanto Technology Llc Genes relacionados com a biosìntese de tocoferol e usos dos mesmos

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