ES2562908T3 - Elementos reguladores de plantas y sus usos - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ADN que comprende un elemento regulador que tiene una secuencia de ADN que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos un 95 por ciento con la secuencia de longitud completa de ADN que se selecciona de entre las SEC ID No: 14, 15 y 17-20 y que tiene una actividad genética reguladora, (b) una secuencia que se selecciona de entre las SEC ID Nº: 14, 15 y 17-20, y (c) un fragmento que comprende al menos 250 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN que se selecciona de entre las SEC ID Nº: 14, 15 y 17-20 con actividad promotora, en la que dicho elemento regulador está unido operativamente a una molécula de polinucleótido heterólogo que se puede transcribir.

Description

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5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; y 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (Patentes de EE. UU. Nos 6.653.280; 6.573.361; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (Patentes de EE. UU. Nos 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), resistencia a nematodos (Patente de EE. UU. Nº 6.228.992), resistencia a enfermedad bacteriana (Patente de EE. UU. Nº 5.516.671), desarrollo y crecimiento de la planta (Patentes de EE. UU. Nos 6.723.897 y 6.518.488),
Nos
producción de almidón (Patentes de EE. UU. 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción de aceites modificados (Patentes de EE. UU. Nos 6.444.876; 6.426.447; y 6.380.462), alta producción de aceite (Patentes de EE. UU. Nos 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), modificación del contenido de ácidos grasos (Patentes de EE. UU. Nos 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), alta producción de proteínas (Patente de EE. UU. Nº 6.380.466), maduración de fruta (Patente de EE. UU. Nº 5.512.466), aumento de la nutrición animal y humana (Patentes de EE. UU. Nos 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; y 6,171,640), biopolímeros (Patentes de EE. UU. Nos USRE37.543; 6.228.623; y 5.958.745, y 6.946.588), resistencia a la tensión ambiental (Patente de EE. UU. Nº 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos que se pueden segregar (Patentes de EE. UU. Nos 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; y 6.080.560), mejora de los tratamientos de procesamiento (Patente de EE. UU. Nº 6.476.295), mejora de la digestibilidad (Patente de EE. UU. Nº 6.531.648), baja rafinosa (Patente de EE. UU. Nº 6.166.292), producción industrial de enzimas (Patente de EE. UU. Nº 5.543.576), mejora del sabor (Patente de EE. UU. Nº 6.011.199), fijación de nitrógeno (Patente de EE. UU. Nº 5.229.114), producción de semillas (Patente de EE. UU. Nº 5.689.041), producción de fibra (Patentes de EE. UU. Nos 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y producción de biocombustible (Patente de EE. UU. Nº 5.998.700).
De manera alternativa, un gen de interés agronómico puede afectar las características o fenotipo de la planta que se mencionan anteriormente codificando un molécula de ARN que produce la modulación dirigida de la expresión genética de un gen endógeno, por ejemplo, por la vía antisentido (véase por ejemplo, la Patente de EE. UU. 5.107.065); ARN inhibidor (“ARNi”, que incluye la modulación de la expresión genética por medio de mecanismos mediados por miARN, siARN, siARN que actúa como trans, y sARN en fase, por ejemplo, como se describen en las publicaciones de solicitudes US 2006/0200878, US 2008/0066206, y US2009/0070898; o mecanismos mediados por co-supresión. El ARN podría ser también una molécula de ARN catalítica (por ejemplo, una ribozima o un ribointerruptor; véase, por ejemplo, el documento US 2006/0200878) que se modifica para escindir el producto de ARNm endógeno que se desee. Por lo tanto, cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifique una molécula transcrita de ARN que afecta un fenotipo agronómicamente importante o cambio morfológico de interés, puede ser útil para la práctica de la presente invención. Se conocen procedimientos en la técnica para la construcción e introducción de construcciones en una célula de tal manera que la molécula de polinucleótido que se puede transcribir se transcriba en una molécula que sea capaz de producir la supresión genética. Por ejemplo, se desvela la supresión genética post-transcripcional que utiliza una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada anti-sentido para regular la expresión genética en células vegetales en las Patentes de EE. UU. Nos 5.107.065 y 5.759.829, y se desvela la supresión post-transcripcional utilizando una construcción con una molécula de polinucleótido que se puede transcribir orientada anti-sentido para regular la expresión genética en plantas en las Patentes de EE. UU. Nos 5.283.184 y 5.231.020. La expresión de un polinucleótido que se puede transcribir en una célula vegetal también se puede utilizar para suprimir las pestes de las plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, composiciones aisladas de pestes por coleópteros (Publicación de Patente de EE. UU. Nº US2007/0124836) y composiciones aisladas de pestes por nematodos (Publicación de Patente de EE. UU. Nº US2007/0250947). Las pestes de las plantas incluyen las pestes por artrópodos, pestes por nematodos, y pestes fúngicas y microbianas. Las moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir para la incorporación en construcciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o genes de especies distintas a las especies diana o genes que se originan con o están presentes en la misma especie, pero que se incorporan en células receptoras por procedimientos de modificación genética más que por técnicas de cruce y reproducción clásicas. El tipo de la molécula de polinucleótido puede incluir una molécula de polinucleótido que está presente en la célula vegetal, una molécula de polinucleótido de otra planta, una molécula de polinucleótido de un organismo diferente, o una molécula de polinucleótido generada externamente, tal como una molécula de polinucleótido que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de polinucleótido que codifica un transgén artificial, sintético, o versión modificada de otra manera.
Marcadores genéticos
Como se utiliza en el presente documento el término “marcador” se refiere a cualquier molécula de polinucleótido que se puede transcribir cuya expresión, o la falta de la misma, se puede explorar o valorar de alguna manera. Los genes marcadores para su uso en la práctica de la presente invención incluyen moléculas de polinucleótido que se puede transcribir que codifican la -glucuronidasa (GUS descrita en la Patente de EE. UU. Nº 5.599.670), proteína fluorescente verde, y variantes de la misma (GFP descrita en las Patentes de EE. UU. Nos 5.491.084 y 6.146.826), proteínas que confieren resistencia a antibióticos, o proteínas que confieren tolerancia a herbicidas. Los marcadores útiles de resistencia a antibióticos, que incluyen los que codifican proteínas que confieren resistencia a la kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aad, espec/estrep) y gentamicina (aac3 y aacC4) se conocen en la técnica. Los herbicidas a los cuales se ha demostrado la tolerancia en plantas transgénicas y a los que se puede aplicar el procedimiento de la presente invención, incluyen: herbicidas de ácido amino-metil-fosfónico, glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, dalapon, dicamba, ciclohexanodiona, inhibidores de
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la toporfirinógeno oxidasa, y isoxaflutol. Las moléculas de polinucleótido que se puede transcribir que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas se conocen en la técnica, e incluyen una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS para la tolerancia al glifosato descrita en la Patente de EE. UU. Nos 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; y 5.094.945); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica una oxidorreductasa y glifosato-N-acetil transferasa (GOX descrita en la Patente de EE. UU. Nº 5.463.175; GAT descrita en la Publicación de Patente de EE. UU. Nº 2003/0083480, y dicamba monooxigenasa en la Publicación de Patente de EE. UU. Nº 2003/0135879); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la bromoxinil nitrilasa (Bxn para tolerancia al Bromoxinilo descrita en la Patente de EE. UU. Nº 4.810.648); una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la fitoeno desaturasa (crtI) descrita en Misawa, y col., Plant Journal, 4:833-840 (1993) y Misawa, y col., Plant Journal, 6:481-489 (1994) para la tolerancia a la norflurazona; una molécula de polinucleótido que se puede transcribir que codifica la acetohidroxiácido sintasa (AHAS, aka ALS) descrita en Sathasiivan, y col., Nucl. Acids Res., 18:2188-2193 (1990) para la tolerancia a los herbicidas sulfonilurea; y el gen bar descrito en DeBlock, y col., EMBO Journal, 6:2513-2519 (1987) para la tolerancia a glufosinato y bialafós. Las moléculas promotoras de la presente invención pueden expresar moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir unidas que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, resistencia a glifosato EPSPS, aminoglucósido fosfotransferasa, hidroxifenil piruvato deshidrogenasa, higromicina fosfotransferasa, neomicina fosfotrnasferasa, dalapon deshalogenasa, nitrilasa resistente a bromoxinil, antranilato sintasa, ariloxialcanoato dioxigenasas, acetilCoA carboxilasa, glifosato oxidorreductasa, y glifosato-N-acetil transferasa.
También se incluyen en la expresión “marcadores genéticos” los genes que codifican un marcador genético cuya secreción se puede detectar como un medio para identificar o seleccionar las células transformadas. Los ejemplos incluyen marcadores que codifican un antígeno segregable que se puede identificar por su interacción con anticuerpos, o incluso enzimas segregables que se pueden detectar catalíticamente. Las proteínas marcadores segregadas que se pueden seleccionar se encuentran en varias clases, que incluyen proteínas pequeñas que se pueden difundir que son detectables (por ejemplo, por ELISA), pequeñas enzimas activas que son detectables en una solución extracelular (por ejemplo, alfa-amilasa, beta-lactamasa, fosfinotricina transferasa), o proteínas que están insertadas o atrapadas en la pared celular (tal como proteínas que incluyen una secuencia líder tal como la que se encuentra en la unidad de expresión de extensión o proteínas relacionadas con la patogénesis en el tabaco también conocidas como PR-S del tabaco). Otros posibles genes marcadores genéticos serán evidentes para los expertos en la técnica y están englobados en la presente invención.
Transformación celular
La invención también se refiere a un procedimiento para producir células transformadas y plantas que comprenden un promotor unido operativamente a una molécula de polinucleótido que se puede transcribir.
El término “transformación” se refiere a la introducción de un ácido nucleico en un huésped receptor. Como se utiliza en el presente documento, el término “huésped” se refiere a bacterias, hongos, o plantas, que incluyen cualquier célula, tejido, órgano o progenie de la bacteria, hongo o planta. Los tejidos y células vegetales de particular interés incluyen protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones, y polen.
Como se utiliza en el presente documento, el término “transformado” se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido una molécula de polinucleótido ajena, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido que se introduce puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor tal que la molécula de polinucleótido que se introduce es heredada por la progenie posterior. Una célula u organismo “transgénico” o “transformado” también incluye la progenie de la célula u organismo y la progenie producida a partir de un programa de cruces que emplean tal organismo transgénico como un parental en un cruce y que muestra un fenotipo alterado que resulta de la presencia de una molécula de polinucleótido ajena. El término “transgénico” se refiere a una bacteria, hongo o planta que contiene una o más moléculas de ácido polinucleico heterólogo.
Hay muchos procedimientos para introducir moléculas de ácido polinucleico en células vegetales. El procedimiento en general comprende las etapas de selección de una célula huésped adecuada, la transformación de la célula huésped con un vector recombinante, y obtener la célula huésped transformada. Los procedimientos adecuados incluyen la infección bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium), vectores cromosómicos artificiales bacterianos binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, por medio de transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitado con fibras de carburo de silicio, y aceleración de partículas revestidas de ADN, etc. (revisado en Potrykus, y col., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42:205 (1991)).
La tecnología para la introducción de una molécula de ADN en las células es bien conocida por los expertos en la técnica. Los procedimientos y materiales para la transformación de células vegetales introduciendo una construcción de ADN vegetal en el genoma vegetal en la práctica de la presente invención, pueden incluir cualquiera de los procedimientos bien conocidos y demostrados que incluyen:
(1) procedimientos químicos (Graham y Van der Eb, Virology, 54:536-539 (1973) y Zatloukal, y col., Ann. N.Y.
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(2)
procedimientos físicos tal como microinyección (Capecchi, Cell, 22:479-488 (1980)), electroporación (Wong y Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun., 107:584-587 (1982); Fromm, y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824-5828 (1985); Patente de EE. UU. Nº 5.384.253), aceleración de partículas (Johnston y Tang, Methods Cell Biol., 43(A):353-365 (1994); Fynan, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11478-11482 (1993)), y bombardeo de microproyectiles (como se ilustra en las Patentes de EE. UU. Nos 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; y 6.403.865);
(3)
vectores víricos (Clapp, Clin. Perinatol., 20:155-168 (1993); Lu, y col., J. Exp. Med., 178:2089-2096 (1993); Eglitis y Anderson, Biotechniques, 6:608-614 (1988));
(4)
mecanismos mediados por receptores (Curiel y col., Hum. Gen. Ther., 3:147-154 (1992) y Wagner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6099-6103 (1992);
(5)
mecanismos mediados por bacterias tales como la transformación mediada por Agrobacterium (como se ilustra en las Patentes de EE. UU. Nos 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; y 6.384.301);
(6)
introducción directa en el polen inyectándolo en órganos reproductivos de las plantas (Zhou, y col., Methods in Enzymology, 101:433, (1983); Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo, y col., Plant Mol Biol. Reporter,
6:165 (1988); Pena, y col., Nature, 325:274 (1987));
(7)
transformación de protoplastos (como se ilustra en la Patente de EE. UU. Nº 5.508.184); e
(8)
inyección en embriones maduros (Neuhaus, y col., Theor. Appl. Genet., 75:30 (1987)).
Cualquiera de los procedimientos que se han descrito anteriormente se puede utilizar para transformar una célula huésped con uno o más promotores y/o construcciones de la presente invención. Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo tal como una célula vegetal, célula de alga, alga, célula fúngica, hongo, célula bacteriana, o célula de insecto. Los huéspedes y células transformadas preferidos incluyen las células de: plantas, Aspergillus, levaduras, insectos, bacterias y algas.
Se han publicado procedimientos para la transformación de plantas dicotiledóneas, primariamente por el uso de Agrobacterium tumefaciens y la obtención de plantas transgénicas de algodón (Patentes de EE. UU. Nos 5.004.863; 5.159.135; y 5.518.908); soja (Patentes de EE. UU. Nos 5.569.834 y 5.416.011; véase también, McCabe, y col., Biotechnology, 6:923 (1988) y Christou y col., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)); género Brassica (Patente de EE. UU. Nº 5.463.174); cacahuete (Cheng y col., Plant Cell Rep., 15:653-657 (1996) y McKently y col., Plant Cell Rep., 14:699-703 (1995)); papaya; y guisante (Grant y col., Plant Cell Rep., 15:254-258 (1995)).
También se han comunicado transformaciones en plantas monocotiledóneas utilizando electroporación, bombardeo de partículas, y Agrobacterium. La transformación y regeneración de plantas se ha conseguido en el espárrago (Bytebier, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5354 (1987); cebada (Wan y Lemaux, Plant Physiol, 104:37 (1994)); maíz (Rhodes, y col., Science 240:204 (1988), Gordon-Kamm, y col., Plant Cell, 2:603-618 (1990), Fromm, y col., Bio/Technology, 8:833 (1990), Koziel y col., Bio/Technology, 11:194 (1993), y Armstrong, y col, Crop Science, 35:550-557 (1995)); avena (Somers, y col., Bio/Technology, 10:1589 (1992)); pasto ovillo (Horn, y col., Plant Cell Rep.. 7:469 (1988)); centeno (De la Pena, y col., Nature, 325:274 (1987)); caña de azúcar (Bower y Birch, Plant Journal, 2:409 (1992)); festuca alta (Wang, y col., Bio/Technology, 10:691 (1992)); y trigo (Vasil, y col., Bio/Technology, 10:667 (1992) y Patente de EE. UU. Nº 5.631.152).
La regeneración, desarrollo y cultivo de plantas a partir de protoplastos vegetales o explantas transformadas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1988) y Horsch y col., Science, 227:1229-1231 (1985)). Las células transformadas se cultivan generalmente en presencia de un medio selectivo, que selecciona las células transformadas satisfactoriamente e induce la regeneración de brotes y raíces en plantas intactas (Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803 (1983)). Las plantas transformadas se obtienen típicamente en dos a cuatro meses.
Las plantas transgénicas regeneradas se auto-polinizan para producir plantas transgénicas homocigotas. De manera alternativa, el polen que se obtiene de las plantas transgénicas regeneradas se puede cruzar con plantas no transgénicas, preferentemente en líneas endogámicas de especies agronómicamente importantes. Las descripciones de los procedimientos de cruce que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en uno de varios libros de referencia, véase, por ejemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960); Simmonds, Principles of crop improvement, Longnaan, Inc., NY, 369-399 (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2ª Edición, Monograph.,
16:249 (1987); Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol 1) y Crop Species Soybean (Vol 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987). Por el contrario, el polen de las plantas no transgénicas puede utilizarse para polinizar las plantas transgénicas regeneradas.
Las plantas transformadas se pueden analizar por la presencia de los genes de interés y el nivel de expresión y/o perfil conferido por los elementos reguladores de la presente invención. Los expertos en la técnica están al tanto de los numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de plantas incluyen transferencias de Southern o trasferencias de Northern, estrategias basadas en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración fenotípica, evaluaciones de
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casete de expresión GUS se digirió con endonucleasas de restricción. Se purificó en gel un único fragmento de ADN que contenía el marcador genético y el casete GUS y se utilizó para revestir partículas de oro de 0,6 micrómetros (nº de catálogo 165-2262 Bio-Rad, Hercules, CA) para el bombardeo. Se cargaron macro-portadores con las partículas de oro revestidas de ADN (nº de catálogo 165-2335 Bio-Rad, Hercules CA). Los embriones se transfirieron a un medio osmótico, con el scutellum en el lado de arriba. Se utilizó un arma biolística PDS 1000/Hc para la transformación (nº de catálogo 165-2257 Bio-Rad, Hercules CA). Los embriones inmaduros que se bombardearon se cultivaron y se seleccionaron los callos transgénicos y se transfirieron a un medio de regeneración tisular. Las plantas de maíz transgénico se regeneraron a partir de los callos transgénicos y se transfirieron al invernadero.
Se utilizó un análisis histoquímico para el análisis cualitativo de la expresión de plantas transformadas. Todas las secciones tisulares se incubaron con solución X-Gluc de tinción de GUS (5-bromo-4-cloro-indolil-b-glucurónido) (1 miligramo/mililitro) durante un tiempo apropiado, se aclararon, y se inspeccionaron visualmente por su coloración azul. La actividad de GUS se determinaba cualitativamente por inspección visual directa o inspección bajo el microscopio utilizando órganos y tejidos vegetales seleccionados. Las plantas R0 se inspeccionan por la expresión en raíces y hojas. Los elementos reguladores EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1), EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4), y EXPSETit.DRPa (SEC ID Nº 9) demostraban la expresión de GUS tanto en raíces como en hojas en las transformantes R0.
Las plantas transformadas con la expresión de GUS dirigida por EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1) o EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4) se cruzaron con plantas H99 no transformadas para producir una población F1 de transformantes. Los niveles de expresión de GUS se midieron en tejidos seleccionados durante el curso del desarrollo. Los tejidos de F1 que se utilizaron para este estudio incluían: embriones de semillas embebidas, endospermo de semillas embebidas, raíces (de 3 días tras la germinación), coleoptilos (3 días tras la germinación), V3 raíz principal y corona, V3 hoja, V7 raíz seminal y de corona, V7 hoja madura, VT (en la formación de panojas, antes de la reproducción) raíz seminal, VT intermodal, VT mazorca, VT antera, VT polen, VT seda, granos 7 días tras la polinización, embrión 21 días tras la polinización, endospermo 21 días tras la polinización, embrión 35 días tras la polinización, endospermo 35 días tras la polinización. La expresión de GUS en la F1 se veía en todos los tejidos estudiados en ambos de los eventos transformados EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1) y EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4).
Ejemplo 3: Análisis de los elementos reguladores que dirigen la TIC809 en maíz transgénico
Las plantas de maíz se transformaron con vectores de expresión en plantas que contenían los elementos reguladores de ensayo que dirigían la expresión del transgén TIC809, y las plantas resultantes se analizaron por la expresión de la proteína TIC809.
Los elementos reguladores estaban unidos operativamente al transgén de toxina de insecto, TIC809 (documento PCT US 2006/033867) en vectores de transformación de plantas. El casete del transgén estaba compuesto por elementos reguladores unidos operativamente a un intrón derivado de la proteína de choque térmico HSP70 de Zea mays, unido operativamente al transgén TIC809, unido operativamente a una 3’ UTR derivada del gen HSP17 de Triticum aestivum L.. Los vectores de transformación de plantas también contenían un marcador genético de tolerancia a glifosato para la selección de las células vegetales transformadas.
El tejido de maíz de la variedad LH244 se transformó utilizando la transformación mediada por A. tumefaciens con los plásmidos, pMON70539 (EXP-SETit.TIP, SEC ID Nº 1), pMON70540 (EXP-SETit.Mtha, SEC ID Nº 4), y pMON70538 (EXPSETit.DRPa, SEC ID Nº 9) utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Las plantas R0 se regeneraron a partir del tejido de maíz transformado y se ensayaron para confirmar la presencia e integridad del transgén TIC809. Las hojas y raíces de estas plantas se analizaron en el estadio V4 o V6 utilizando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas TIC809 (ELISA) para determinar los niveles de acumulación de proteína TIC809. Los valores de la proteína se determinaron utilizando una muestra TIC809 de referencia y se expresa en unidades de partes por millón (ppm). Los datos del ELISA se presentan en la Tabla 2 siguiente en la que “N” indica el número de plantas cruzadas.
Tabla 2: Datos del ELISA de TIC809 R0
Nombre del elemento
SEC ID Nº Vector Raíz (ppm) Hoja (ppm) N
EXP-SETit.TIP
1 pMON70539 3 6 26
EXP-SETit.Mtha
4 pMON70540 3 8 20
EXP-SETit.DRPa
9 pMON70538 1 2 24
Se apreciaba la expresión de TI809, dirigida por los elementos de expresión, EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1), EXPSETit.Mtha (SEC ID Nº 4), y EXP-SETit.DRPa (SEC ID Nº 9) tanto en raíces como en hojas, demostrando la capacidad de los elementos reguladores EXP-SETit.TIP, EXP-SETit.Mtha, y EXP-SETit.DRPa para modular la transcripción de un transgén de interés agronómico en plantas al que están unidos operativamente. La media de expresión de TIC809 dirigida por EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1), EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4), y EXP-SETit.DRPa (SEC ID Nº 9) era al menos 2 veces o mayor en la hoja con respecto a la raíz en las tres construcciones.
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Las plantas R0 transformadas que contenían los vectores pMON70539 (EXP-SETit.TIP, SEC ID Nº 1), pMON70540 (EXP-SETit.Mtha, SEC ID Nº 4), y pMON70538 (EXP-SETit.DRPa, SEC ID Nº 9) se cruzaron con variedades LH59, utilizando la LH59 como la planta hembra y la LH244 como macho, para producir poblaciones F1 transformadas. Para las plantas que contenían EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1) y EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4), los niveles de proteínas TIC809 se medían entonces utilizando el ELISA en las hojas de la F1 en los estadios V3, V7, y VT; en las raíces en los estadios V3 y V7; en los tejidos reproductores alrededor del estadio VT (anteras, polen y seda); y en la semilla o grano en desarrollo. Los resultados del ELISA se expresan en partes por millón (ppm) con las mediciones del error estándar que se indica como “SE” y se presentan en la Tabla 3 posteriormente. Para las plantas que contienen EXP-SETit.DRPa (SEC ID Nº 9), se midieron los niveles de proteína TIC809 en las raíces utilizando el ELISA con tejidos tomados en el estadio V9. Los resultados del ELISA se expresan en partes por millón (ppm) y se presentan en la Tabla 4 posteriormente.
Tabla 3: Datos del ELISA TIC809 F1 para EXP-SETit.TIP y EXP-SETit.Mtha.
EXP-SETit.TIP
EXP-SETiT.Mtha
Tejido
ppm SE ppm SE
Hoja V3
1,138 0,32 1,312 0,46
Raíz V3
1,254 0,41 1,242 0,39
Tallo V3
0,694 0,14 0,407 0,19
Hoja V7
0,879 0,31 1,295 0,31
Raíz V7
0,755 0,35 1,185 0,46
Hoja VT
0,308 0,17 0,457 0,35
Antera
0,323 0,06 0,364 0,1
Seda
0,249 0,1 0,222 0,05
Polen
0,315 0,16 0,231 0,01
Semilla
0,138 0,02 0 0
Los niveles medios de expresión de proteína TIC809 dirigidos por los elementos reguladores EXP-SETit.TIP SEC ID Nº 1) y EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4) en las poblaciones F1 eran consistentes con los niveles de expresión que se observan en las R0 transformadas, lo que confirma la capacidad de los elementos reguladores TIP y Mtha para dirigir la expresión de un transgén al que están unidos operativamente. El EXP-SETit.TIP (SEC ID Nº 1) parece que tiene su máximo nivel de expresión en V3 en las raíces y hojas, con un declive de la expresión en el estadio V7 y bajo en los tejidos reproductivos y semillas en desarrollo. El EXP-SETit.Mtha (SEC ID Nº 4) muestra una expresión consistente de TIC809 en las raíces y hojas entre el estadio V3 y V7, con declive de la expresión en las hojas en estadio V7, con menor expresión en tejidos reproductivos, y sin expresión en la semilla en desarrollo.
Tabla 4: Datos de ELISA TIC809 F1 para EXP-SETit.DRPa.
Tejidos del cruce F1
ppm
LII59/ZM_S198227
0,95
LH59/ZM_S198230
2,69
LH59/ZM_S198235
0,5
LH59/ZM_S 199429
1,26
LH59/ZM_S201032
1,09
LH59/ZM_S201049
0,64
Expresión media de TIC809
1,19
Error estándar
0,79
Los niveles de expresión media de proteína TIC809 dirigida por el elemento regulador EXP-SETit.DRPa (SEC ID Nº 9) en las raíces de la población F1 eran consistentes con los niveles de expresión que se observada en la R0 transformada, confirmando la capacidad de los elementos reguladores DRPa para proporcionar la expresión en la raíz de un transgén al que están unidos operativamente.
Las poblaciones R0 de las plantas transformadas con pMON120408 (EXP-SETit.Rcc3-1, SEC ID Nº 14), pMON120407 (EXP-SETit.Rcc3-10, SEC ID Nº 17), y pMON120410 (EXP-SETit.Rcc3-11, SEC ID Nº 19) se produjeron como se ha descrito anteriormente. Los niveles de proteína TIC809 en estas plantas se midieron en hojas y raíces utilizando un ELISA en el tejido tomado en el estadio V4 o V6. Los resultados del ELISA se expresan en partes por millón (ppm) y se presentan en la Tabla 5 posterior.

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