ES2769898T3 - Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en: a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; b) una secuencia de DNA que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en la que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; y en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
Description
DESCRIPCIÓN
Elementos reguladores en plantas y usos de los mismos
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de la biología molecular, la modificación genética de plantas, y moléculas de ADN útiles para la modulación de la expresión genética en plantas.
Antecedentes
Los elementos reguladores son elementos genéticos que regulan la actividad genética modulando la transcripción de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente. Dichos elementos incluyen promotores, líderes, intrones, y regiones 3' no traducidas, y son útiles en el campo de la biología molecular vegetal y modificación genética en plantas.
Sumario de la invención
La invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en: (a) una secuencia de ADN con al menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17; (b) una secuencia de DNA que comprenda cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17; y (c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en las que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17; y en la que la secuencia de ADN está unida operativamente a una moléculas de ADN heteróloga que se puede transcribir. En ciertas realizaciones, la molécula de ADN heteróloga que se puede transcribir comprende un gen de interés agronómico y el gen de interés agronómico transmite tolerancia a los herbicidas o resistencia a las plagas a las plantas.
En otro aspecto, se proporciona adicionalmente una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en: (a) una secuencia de ADN con al menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17; (b) una secuencia de DNA que comprenda cualquiera de las Se Q ID NO: 13, 15 y 17; y (c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en las que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17; y en la que la secuencia de ADN está unida operativamente a una moléculas de ADN heteróloga que se puede transcribir. En realizaciones específicas, la célula vegetal transgénica es una célula vegetal de monocotiledónea o una célula vegetal de dicotiledónea. También se proporciona por la invención una planta transgénica, o parte de la misma que comprende la molécula de ADN recombinante. En realizaciones particulares, también se proporciona por la invención una progenie vegetal de la planta transgénica, o parte de la misma o una semilla transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante.
También se proporciona en el presente documento un procedimiento de provisión de una planta transgénica transformando una célula vegetal con una molécula de ADN recombinante de la invención para producir una célula vegetal transformada, y la regeneración de la célula vegetal transformada para producir una planta transgénica.
La planta transgénica puede ser una planta monocotiledónea. En una realización, la planta monocotiledónea se selecciona de entre el grupo que consiste en Maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa), Trigo (Triticum), Cebada (Hordeum vulgare), Sorgo (Sorghum spp.), Mijo, Mijo perla (Pennisetum glaucum), Mijo de dedo (Eleusine coracana), Mijo común (Panicum miliaceum), Moha itálica (Setaria italica), Avena (Avena sativa), Triticale, Centeno (Secale cereale), Poáceas (Digitada), Cebollas (Allium spp.), Piña (Ananas spp.), Céspedes, Caña de azúcar (Saccharum spp.), Palma (Arecaceae), Bambú (Bambuseae), Banana (Musaceae), familia de Gengibres (Zingiberaceae), Lirios (Lilium), Narcisos (Narcissus), Iris (Iris), Amarilis, Orquídeas (Orchidaceae), Cañas, Jacintos (Hyacinthoides), y Tulipanes (Tulipa). La planta transgénica también puede ser una planta dicotiledónea. En una realización, la planta dicotiledónea se selecciona de entre el grupo que consiste en Soja (Glycine max), Soja silvestre (Glycine soja), Algodón (Gossypium), Tomate (Solanum lycopersicum), Pimienta (Piper), Calabacín (Cucurbita), Guisante (Pisum sativum), Alfalfa (Medicago sativa), Medicago truncatula, Alubias (Phaseolus), Garbanzo (Cicer arietinum), Girasol (Helianthus annuus), Patata (Solanum tuberosum), Maní (Arachis hipogea), Quinoa, trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum), Algarrobo (Ceratonia siliqua), Remolacha (Beta vulgaris), Espinaca (Spinacia oleracea), y Pepino (Cucumis sativus).
Breve descripción de las figuras
Las FIG. 1a-1c muestran un alineamiento entre la secuencia codificante de la B-glucuronidasa (GUS) de E. coli (CR-Ec.uidA-1:1:4, SEQ ID NO: 31) y la secuencia codificante de GUS de E. coli con el codón rediseñado (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1, SEQ ID NO: 30). Los nucleótidos idénticos en el alineamiento se indican mediante un asterisco.
Breve descripción de las Secuencias
Las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23 son secuencias promotoras.
Las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 son secuencias líder.
Las SEQ ID NO: 25-28 son secuencias de cebador de amplificación.
Las SEQ ID NO: 29 y 30 son secuencias codificantes de GUS con el codón rediseñado. Las SEQ ID NO: 29 comprende un intrón procesable, mientras que la SEQ ID NO: 30 es una secuencia codificante contigua.
La SEQ ID NO: 31 es la secuencia codificante de p-glucuronidasa nativa de Escherichia coli.
La SEQ ID NO: 32 es una secuencia codificante de GUS con un intrón procesable basado en la p-glucuronidasa de E. coli de SEQ ID NO: 31.
Las SEQ ID NO: 33, 39 y 40 son secuencias de UTR 3'.
Las SEQ ID NO: 34-37, 41 y 44 son secuencias de grupos de elementos transcripcionales reguladores de la expresión (EXP) que comprenden una secuencia promotora unida operativamente en 5' a una secuencia líder que está unida operativamente en 5' a una secuencia de intrón, o en el caso de la SEQ ID NO: 44 una secuencia promotora unida operativamente en 5' a una secuencia líder.
La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de intrón.
Las SEQ ID NO: 42 y 44 son secuencias codificantes para las luciferasas proteicas derivadas de Photinus pyralis y Renilla reniformis, respectivamente.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona moléculas de ADN que tienen actividad genética reguladora en plantas como se ha descrito anteriormente. Estas moléculas de ADN son capaces, por ejemplo, de afectar la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se unen operativamente en los tejidos vegetales, y, por lo tanto, de regular selectivamente la expresión genética de un transgén unido operativamente en plantas transgénicas. La invención también proporciona procedimientos de modificación, producción y utilización de los mismos. La invención también proporciona composiciones que incluyen células vegetales, plantas, partes de plantas, y semillas transgénicas que contienen moléculas de ADN recombinante de la invención, y procedimientos para preparar y utilizar las mismas.
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la invención. A menos de que se señale otra cosa, los términos se tienen que entender de acuerdo con el uso convencional por los expertos habituados en la técnica relevante.
Moléculas de ADN
Como se utiliza en el presente documento, el término "ADN" o "molécula de ADN" se refiere a una molécula de ADN de cadena doble de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótido. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de ADN" se refiere a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en el presente documento se corresponde con la del Título 37 del Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos § 1.822, y que se expone en las tablas de Referencia WIPO ST.25 (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3.
Como se utiliza en el presente documento, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no existirían juntas en la naturaleza sin la intervención humana. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede ser una molécula de ADN que comprende al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre ellas, una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que se desvía de las secuencias de ADN que existen en la naturaleza, o una molécula de ADN que se ha incorporado en un ADN de una célula huésped mediante transformación genética.
Como se utiliza en el presente documento "identidad de secuencia" se refiere a la extensión en la que dos secuencias de polinucleótido alineadas óptimamente o dos secuencias de polipéptido alineadas óptimamente son idénticas. Un alineamiento de secuencias óptimo se crea mediante el alineamiento manual de dos secuencias, por ejemplo, una secuencia de referencia y otra secuencia de ADN, para maximizar el número de coincidencias de nucleótidos en el alineamiento de secuencias con un inserciones, eliminaciones o huecos adecuados de nucleótidos internos. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de referencia" se refiere a una secuencia de ADN proporcionada como las SEQ ID NO: 1-20.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "porcentaje de identidad de secuencia" o " % de identidad" es la fracción de identidad multiplicada por 100. La "fracción de identidad" para una secuencia alineada óptimamente con una secuencia de referencia es el número de coincidencias de nucleótidos en un alineamiento óptimo, dividido por el
número total de nucleótidos en la secuencia de referencia, por ejemplo, el número total de nucleótidos en la secuencia de referencia completa o de longitud completa. Por lo tanto, una realización de la invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia que cuando se alinea óptimamente con una secuencia de referencia tiene al menos aproximadamente un 85 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 86 por ciento de identidad, al menos aproximadamente 87 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 88 por ciento de identidad al menos aproximadamente un 89 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 90 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 91 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 92 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 93 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 94 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 95 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 96 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 97 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 98 por ciento de identidad, al menos aproximadamente un 99 por ciento de identidad, o al menos aproximadamente un 100 por ciento de identidad respecto a la secuencia de referencia.
Elementos reguladores
Los elementos reguladores tales como promotores, líderes, amplificadores, intrones, y regiones de terminación de la transcripción (o UTR 3') son una parte integral de la expresión total de genes en células vivas. La expresión "elemento regulador" como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN que tienen actividad reguladora genética. La expresión "actividad genética reguladora" como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad para afectar la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente, por ejemplo, afectando a la transcripción y/o traducción de la molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente. Los elementos reguladores, tales como los promotores, líderes, amplificadores, intrones y UTR 3' que funcionan en plantas son por lo tanto útiles para la modificación de fenotipos vegetales mediante modificación genética.
Como se utiliza en el presente documento, un "grupo de elementos reguladores de la expresión" o secuencia "EXP" puede referirse a un grupo de elementos reguladores unidos operativamente, tales como amplificadores, promotores, líderes, e intrones. Por lo tanto, un grupo de elementos reguladores de la expresión puede estar comprendido, por ejemplo, por un promotor unido operativamente en 5' a una secuencia líder, que a su vez está unida en 5' a una secuencia de intrón.
Los elementos reguladores se pueden caracterizar por su patrón de expresión genética, por ejemplo, efectos positivos y/o negativos, tales como de expresión constitutiva, temporal, espacial, de desarrollo, tisular, ambiental, fisiológico, patológico, de ciclo celular, y/o expresión de respuesta química, y cualquier combinación de los mismos, así como mediante indicaciones cuantitativas o cualitativas. Como se utiliza en el presente documento, un "patrón genético de expresión " es cualquier patrón de transcripción de una molécula de ADN unida operativamente en una molécula de ARN transcrita. La molécula de ARN transcrita puede traducirse para producir una molécula de proteína o puede proporcionar una molécula de ARN antisentido o reguladora diferente, tal como un ARN de cadena doble (ARNds), un ARN de transferencia (ARNt), un ARN ribosómico (ARNr) y un microARN (miARN), y similares.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "expresión proteica" es cualquier patrón de traducción de una molécula de ARN transcrita en una molécula proteica. La expresión proteica se puede caracterizar por sus cualidades temporal, espacial, del desarrollo, o morfológicas, así como por indicaciones cuantitativas o cualitativas.
Un promotor puede ser útil como elemento regulador para la modulación de la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente. Como se utiliza en el presente documento, el término "promotor" se refiere en general a una molécula de ADN que está implicada en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas, tales como factores de transcripción activos trans, para iniciar la transcripción. Un promotor se puede originar a partir de la región no traducida 5' (UTR 5') de un gen. De manera alternativa, los promotores pueden ser moléculas de ADN producidas por síntesis o modificadas. Los promotores también pueden ser quiméricos. Los promotores quiméricos se producen mediante la fusión de dos o más moléculas heterólogas de ADN. Los promotores útiles en la práctica de la presente invención incluyen las SEQ ID NO: 13, 15, y 17, incluyendo fragmentos o variantes de las mismas como se ha descrito anteriormente. Las variantes o derivados comprenden actividad promotora, es decir, son capaces de actuar como un promotor en una célula huésped, tal como en una planta transgénica. En realizaciones específicas adicionales, un fragmento se puede definir como el que presenta la actividad promotora que posee la molécula promotora de partida de la que se deriva.
En una realización, los fragmentos de una secuencia promotora desvelada en el presente documento se proporcionan como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos promotores pueden comprender actividad promotora, como se ha descrito anteriormente, y pueden ser útiles solos o en combinación con otros promotores o fragmentos de promotor, tal como en la construcción de promotores quiméricos.
Las composiciones derivadas de cualquiera de los promotores que se presentan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19, tales como con eliminaciones internas o en 5', por ejemplo, se pueden producir utilizando procedimientos conocidos en la técnica para mejorar o alterar la expresión, incluyendo la eliminación de elementos que tengan efectos positivos o negativos sobre la expresión, la duplicación de elementos que tengan efectos positivos o negativos sobre la expresión; y/o duplicando o eliminando elementos que tengan efectos sobre la expresión
específicos del tejido o la célula. Las composiciones derivadas de cualquiera de los promotores que se presentan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15. 17, y 19 que comprendan eliminaciones en 3' en las que se han eliminado el elemento de caja TATA o una secuencia equivalente de la misma y la secuencia corriente abajo. Se pueden hacer eliminaciones adicionales para retirar cualquiera de los elementos que tengan efectos positivos o negativos; específicos del tejido; específicos de la célula; o específicos temporales (tales como, pero sin limitarse a, los de ritmo circadiano) sobre la expresión. Cualquiera de los promotores que se presentan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, y 19 y fragmentos o amplificadores derivados de las mismas para producir composiciones de elementos transcripcionales reguladores quiméricos que comprendan cualquiera de los promotores que se presentan en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, y 19 y los fragmentos o amplificadores derivados de las mismas unidos operativamente a otros amplificadores y promotores.
De acuerdo con la invención, un promotor o fragmento de promotor se puede analizar en cuanto a la presencia de elementos promotores conocidos, es decir, las características de la secuencia de ADN, tales como una caja TATA y otros motivos del sitio de unión del factor de transcripción. La identificación de dichos elementos promotores conocidos puede ser utilizada por un experto en la técnica para diseñar variantes del promotor que tengan un patrón de expresión similar al promotor original.
Como se utiliza en el presente documento, el término "líder" se refiere a una molécula de ADN a partir de una región no traducida 5' (5' UTR) de un gen y que se define en general como un segmento de nucleótido entre el sitio de inicio de la transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de la proteína. De manera alternativa, los líderes pueden ser elementos de ADN producidos por síntesis o modificados. Un líder puede ser utilizarse como elemento regulador en 5' para la modulación de la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente. Las moléculas líder se pueden utilizar como un promotor heterólogo o con su promotor nativo. Las moléculas promotoras de la presente invención pueden por lo tanto estar unidas operativamente a su líder nativo o pueden estar unidas operativamente a un líder heterólogo. Los líderes útiles en la práctica de la invención incluyen las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 o fragmentos o variantes de las mismas. En realizaciones específicas, dichas secuencias de ADN se pueden definir como que son capaces de actuar como un líder en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, una célula vegetal transgénica. En una realización, dichas secuencias de ADN se descifran como que comprenden actividad líder.
Las secuencias líder (UTR 5') que se presentan como las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 pueden estar comprendidas por elementos reguladores o puede adoptar estructuras secundarias que pueden tener un efecto sobre la transcripción o traducción de una molécula de ADN a la que se unen operativamente. Las secuencias líder que se presentan como las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 se pueden utilizar de acuerdo con la invención para producir elementos reguladores quiméricos que afecten a la transcripción o traducción de una molécula de ADN a la que se unen operativamente. Además, las secuencias líder que se presentan como las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20 se pueden utilizar de acuerdo con la invención para producir elementos reguladores quiméricos que afecten a la transcripción o traducción de una molécula de ADN a la que se unen operativamente.
Como se utiliza en el presente documento, el término "intrón" se refiere a una molécula de ADN que se puede identificar en un gen y se puede definir en general como una región recortada durante el procesamiento del ARN mensajero (ARNm) antes de la traducción. De manera alternativa, un intrón pueden ser un elemento de ADN producido por síntesis o modificado. Un intrón puede contener elementos amplificadores que efectúen la transcripción de genes unidos operativamente. Un intrón puede ser utilizarse como elemento regulador para la modulación de la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente. Una construcción puede comprender un intrón, y el intrón puede ser heterólogo o no con respecto a la molécula de ADN que se puede transcribir. Ejemplos de intrones en la técnica, incluyen el intrón de actina del arroz y el intrón HSP70 del maíz.
En las plantas, la inclusión de algunos intrones en las construcciones genéticas da lugar a un aumento del ARNm y la acumulación con respecto a las construcciones que carecen del intrón. Este efecto se ha denominado "aumento mediado por el intrón" (IME) de la expresión genética (Mascarenhas y col., Plant Mol. Biol. 15:913-920, 1990). Los intrones que se sabe que estimulan la expresión en plantas se han identificado en los genes del maíz (por ejemplo, tubAl, Adhl, Sh1, y Ubil), en los genes del arroz (por ejemplo, tpi) y en genes de plantas dicotiledóneas como las de petunia (por ejemplo, rbcS), patata (por ejemplo, st-lsl) y de Arabidopsis thaliana (por ejemplo, ubq3 y pat1). Se ha demostrado que las eliminaciones o mutaciones dentro de los sitios de corte y empalme de un intrón reducen la expresión genética, indicando que el corte y empalme puede ser necesario para el IME. Sin embargo, el corte y empalme per se puede no ser necesario, ya que se ha presentado IME en plantas dicotiledóneas mediante mutaciones puntuales dentro de los sitios de corte y empalme del gen pat1 de A. thaliana. Se ha demostrado que el uso múltiple del mismo intrón en una planta presenta desventajas. En esos casos, es necesario tener una colección de elementos de control básicos para construcción de elementos de ADN recombinante apropiados.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de terminación de la transcripción en 3'", "región no traducida 3'" o UTR 3'" en el presente documento se refiere a una molécula de ADN que se utiliza durante la transcripción de la región no traducida de la parte 3' de una molécula de ARNm. La región no traducida 3' de una molécula de ARNm puede generarse mediante escisión específica y poliadenilación 3', también conocida como cola poliA. Una UTR 3' puede estar unida operativamente a y localizarse corriente debajo de una molécula de ADN que se puede transcribir y puede incluir una señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar a la
transcripción, el procesamiento del ARNm, o la expresión genética. Se cree que las colas poliA funcionan en la estabilidad del ARNm y en el inicio de la traducción. Ejemplos de moléculas de terminación de la transcripción en 3' de la técnica son la región 3' de la nopalina sintasa; la región 3' de la hsp17 del trigo; la región 3' de la subunidad pequeña rubisco del guisante, la región 3' E6 del algodón, y la UTR 3' de coixina.
La utilización de las UTR 3' normalmente es beneficioso para la expresión recombinante de moléculas de ADN específico. Una UTR 3' débil tiene el potencial para generar una translectura, que puede afectar a la expresión de la molécula de ADN localizada en los casetes de expresión vecinos. El control apropiado de la terminación de la transcripción puede prevenir la translectura en secuencias de ADN (por ejemplo, en otros casetes de expresión) localizadas corriente abajo y pueden permitir adicionalmente el reciclado eficaz de ARN polimerasa para mejorar la expresión genética. La terminación eficaz de la transcripción (liberación de ARN polimerasa II del ADN) es un prerrequisito para el reinicio de la transcripción y de esta manera afecta directamente el nivel total de transcripción. Posteriormente a la terminación de la transcripción, el ARNm maduro se libera del sitio de síntesis y la matriz se transporta al citoplasma. Los ARNm de eucariotas se acumulan como formas poli(A) in vivo, haciendo difícil detectar los sitios de terminación transcripcional por procedimientos convencionales. Adicionalmente, la predicción de UTR 3' funcionales y eficaces mediante procedimientos bioinformáticos es difícil ya que son secuencias de ADN no conservadas lo que haría posible la predicción fácil de una UTR 3' eficaz.
Desde un punto de vista práctico, normalmente es beneficioso que una UTR 3' que se utilice en un casete de expresión posea ciertas características. La UTR 3' debería ser capaz de terminar eficiente y eficazmente la transcripción de la molécula de ADN que se puede transcribir y evitar la translectura de la transcripción en cualquier secuencia de ADN vecina, que puede estar comprendida por otro casete de expresión, como en el caso de múltiples casetes de expresión que residen en un ADN de transferencia (T-ADN), o en la vecindad del ADN cromosómico en la que se ha insertado el T-ADN. La UTR 3' no debería producir una reducción de la actividad transcripcional transmitida por el promotor, líder, amplificadores e intrones que se utilizan para dirigir la expresión de la molécula de ADN. En la biotecnología vegetal, la UTR 3' a menudo se utiliza para cebar las reacciones de amplificación del ARN transcrito inversamente extraído de la planta transformada y que se utiliza para: (1) evaluar la actividad transcripcional o expresión de los casetes de expresión una vez que se integran en el cromosoma de la planta; (2) evaluar el número de copias de inserciones dentro del ADN vegetal; y (3) evaluar la cigosis de la semilla resultante después del cruzamiento. La UTR 3' también se utiliza en las reacciones de amplificación del ADN extraído de la planta transformada para caracterizar que el casete insertado está intacto.
Como se utiliza en el presente documento, el término "amplificador" o "elemento amplificador" se refiere a un elemento regulador actuante cis, conocido como elemento cis, que transmite un aspecto del patrón de expresión total, pero que habitualmente es insuficiente por sí solo para dirigir la transcripción de una secuencia de ADN a la que se une operativamente. A diferencia de los promotores los elementos amplificadores no incluyen habitualmente un sitio de inicio de la transcripción (TSS) o caja TATA o secuencia de ADN equivalente. Un promotor o fragmento de promotor puede comprender naturalmente uno o más elementos amplificadores que afectan a la transcripción de una secuencia de ADN a la que se une operativamente. Un elemento amplificador también se puede fusionar con un promotor para formar un elemento cis promotor quimérico, que transmite un aspecto de la modulación total de la expresión genética.
Se cree que muchos elementos promotores amplificadores se unen a proteínas de unión al ADN y/o afectan a la topología del ADN, produciendo conformaciones locales que permiten o restringen selectivamente el acceso de la ARN polimerasa a la matriz de ADN o que facilitan selectivamente la apertura de la doble hélice en el sitio de inicio de la transcripción. Un elemento amplificador puede funcionar para unir factores de transcripción que regulan la transcripción. Algunos elementos amplificadores se unen a más de un factor de transcripción, y los factores de transcripción pueden interactuar con diferentes afinidades como más de un dominio amplificador. Los elementos amplificadores se pueden identificar por varias técnicas, incluyendo análisis de eliminación, es decir, eliminación de uno o más nucleótidos desde el extremo 5' o interno hasta un promotor; análisis de las proteínas de unión a ADN utilizando la huella de DNasa I, interferencia por metilación, ensayos de cambio de movilidad en electroforesis, huella genómica in vivo mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) mediada por ligadura, y otros ensayos convencionales; o mediante similitud de secuencia de ADN utilizando los motivos de elementos cis conocidos o elementos amplificadores como secuencia diana o motivo diana con procedimientos de comparación de secuencias de ADN convencionales, tales como BLAST. La estructura fina de un dominio amplificador se puede estudiar adicionalmente mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos o mediante otros procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Los elementos amplificadores se pueden obtener mediante síntesis química o mediante el aislamiento de los elementos reguladores que incluyen dichos elementos y se pueden sintetizar con nucleótidos flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar la modificación posterior. Por lo tanto, el diseño, construcción, y uso de elementos amplificadores de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para la modulación de la expresión de moléculas de ADN que se pueden transcribir a las que se unen operativamente están englobados en la invención.
Como se utiliza en el presente documento, el término "quimérico" se refiere a una única molécula de ADN producida fusionando una primera molécula de ADN a una segunda molécula de ADN, en el que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente en esa configuración, es decir, fusionada una con otra. La molécula de ADN quimérica es por lo tanto una nueva molécula de ADN no encontrada de otra manera normalmente en la naturaleza. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "promotor quimérico" se refiere a un promotor
producido mediante dicha modificación de moléculas de ADN. Un promotor quimérico puede combinar dos o más fragmentos de ADN, por ejemplo, la fusión de un promotor a un elemento amplificador. Por lo tanto, el diseño, construcción, y uso de promotores quiméricos de acuerdo con los procedimientos desvelados en el presente documento para la modulación de la expresión de moléculas de polinucleótido que se pueden transcribir a las que se unen operativamente están englobados en la invención.
Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" se refiere a una segunda molécula de ADN, tal como un elemento regulador que es similar en composición, pero no idéntica a, una primera molécula de ADN, y en la que la segunda molécula de ADN sigue manteniendo la funcionalidad general, es decir, el mismo o similar patrón de expresión, de la primera molécula de ADN. Una variante puede ser una versión acortada o truncada de la primera molécula de ADN y/o una versión alterada de la secuencia de ADN de la primera molécula de ADN, tal como la que tenga sitios de restricción enzimática de y/o eliminaciones, sustituciones y/o inserciones internas diferentes. Las "variantes" de elementos reguladores también engloban variantes que aparecen por mutaciones que se producen naturalmente en la transformación celular bacterianas y vegetales. En la invención, se puede utilizar una secuencia como se ha descrito anteriormente para crear variantes que sean similares en composición, pero no idénticas a la secuencia de ADN del elemento regulador original, mientras que aún mantenga la funcionalidad general, es decir, el mismo patrón de expresión o similar, que el elemento regulador original. La producción de dichas variantes de la invención está bien dentro de la experiencia habitual en la técnica a la luz de la divulgación y está englobada dentro del ámbito de la divulgación.
Los elementos reguladores quiméricos se pueden diseñar para que comprendan distintos elementos constituyentes que pueden estar unidos operativamente mediante distintos procedimientos conocidos en la técnica, tales como digestión por enzimas de restricción, y clonación independiente de la ligadura, ensamblaje modular de productos de PCR durante la amplificación, o síntesis química directa del elemento regulador, así como otros procedimientos conocidos en la técnica. Los distintos elementos reguladores quiméricos resultantes puede estar comprendidos por los mismos, o variantes de los mismos elementos constituyentes, pero se diferencian en la secuencia de ADN o secuencias de ADN que comprenden la secuencia de ADN de unión o secuencias que permitan que las partes constituyentes estén unidas operativamente. En la invención, una secuencia de ADN como se ha descrito anteriormente puede proporcionar una secuencia de referencia de un elemento regulador, en la que los elementos constituyentes que comprenden la secuencia de referencia se pueden unir por procedimientos conocidos en la técnica y pueden comprender sustituciones, eliminaciones, y/o inserciones de uno o más nucleótidos o mutaciones que se producen naturalmente en la transformación de células bacterianas y vegetales.
La eficacia de las modificaciones, duplicaciones o eliminaciones que se describen en el presente documento sobre los aspectos deseados de la expresión de un transgén en particular se pueden ensayar empíricamente en ensayos transitorios o estables con plantas, tales como se describen en los ejemplos de trabajo del presente documento, así como para validar los resultados, que pueden variar dependiendo de los cambios que se hagan y el objetivo del cambio en la DNA molécula de partida.
Construcciones
Como se utiliza en el presente documento, el término "construcción" significa cualquier molécula de ADN recombinante tal como un plásmido, cósmido, virus, fago, o molécula de ADN o ARN de replicación autónoma, fago, o molécula de polinucleótido de ADN o ARN lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de la integración genómica o la replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN, donde al menos una molécula de ADN se ha unido a la otra molécula de ADN de una manera funcionalmente operativa, es decir, están unidas operativamente. Como se utiliza en el presente documento, el término "vector" significa cualquier construcción que pueda utilizarse con fines de transformación, es decir, la introducción de ADN o ARN heterólogos en una célula huésped. Una construcción incluye normalmente uno o más casetes de expresión. Como se utiliza en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a una molécula de ADN que comprende al menos una molécula de ADN que se puede transcribir unida operativamente a uno o más elementos reguladores, normalmente al menos un promotor y una UTR 3'.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unida operativamente" se refiere a una primera molécula de ADN unida a una segunda molécula de ADN, en el que la primera y segunda moléculas de ADN se disponen de manera que la primera molécula de ADN afecta la función de la segunda molécula de ADN. Las dos moléculas pueden ser parte o no de una única molécula contigua de ADN y pueden ser adyacentes o no. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir si el promotor modula la transcripción de la molécula de ADN de interés que se puede transcribir en una célula. Un líder, por ejemplo, está unido operativamente a una secuencia de ADN cuando es capaz de afectar a la transcripción o traducción de la secuencia de ADN.
Las construcciones de la invención pueden proporcionarse, en una realización, como construcciones plasmídicas inductoras de tumor (Ti) de doble límite que tienen regiones limítrofe derecha (RB o AGRtu.RB) y limítrofe izquierda (LB o AGRtu.LB) del plásmido Ti aislado de Agrobacterium tumefaciens que comprende un T-ADN, que junto con las moléculas de transferencia proporcionadas por las células de A. tumefaciens permiten la integración del T-ADN en el genoma de una célula vegetal (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. 6.603.061). Las construcciones también pueden contener segmentos de la matriz del ADN plasmídico que proporcionen la función de replicación y la selección por antibióticos en células bacterianas, por ejemplo, un origen de replicación en Escherichia coli tal como ori322, un
origen de replicación con un intervalo de huéspedes amplio tal como oriV u oriRi, y una región codificante para un marcador genético tal como Spec/Strp que codifica una Tn7 aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) que transmite resistencia a la espectinomicina o la estreptomicina, o un marcador genético seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación en plantas, la cepa bacteriana huésped a menudo es ABI, C58, o LBA4404 de A. tumefaciens; sin embargo, pueden funcionar en la invención otras cepas conocidas por los expertos en la técnica de transformación de plantas.
Se conocen procedimientos en la técnica para ensamblar e introducir construcciones en una célula de manera que la molécula de ADN que se puede transcribir se transcribe en una molécula de ARNm funcional que se traduce y expresa como una proteína. Para la práctica de la invención, las composiciones convencionales y procedimientos para la preparación y utilización de las construcciones y las células huésped son bien conocidas por el experto en la técnica. Los vectores típicos útiles para la expresión de ácidos nucleicos en plantas superiores se conocen bien en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido Ti de A. tumefaciens y el vector de control de transferencia pCaMVCN.
Se pueden incluir distintos elementos reguladores en una construcción, incluyendo cualquiera de los que se proporcionan en el presente documento. Cualquiera de estos elementos reguladores puede proporcionarse en combinación con otros elementos reguladores. Dichas combinaciones se pueden diseñar o modificar para producir características reguladoras deseables. En una realización, las construcciones de la invención comprenden al menos un elemento regulador unido operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir unida operativamente a una UTR 3'.
Las construcciones de la invención pueden incluir cualquier promotor o líder que se proporciona en el presente documento o se conozca en la técnica. Por ejemplo, un promotor de la invención puede estar unido operativamente a un líder no traducido heterólogo en 5' tal como uno derivado de un gen de la proteína de choque térmico. De manera alternativa, un líder de la invención puede estar unido operativamente a un promotor heterólogo tal como el promotor de transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor.
Los casetes de expresión también pueden incluir una secuencia codificante de un péptido de tránsito que codifica un péptido que sea útil para el direccionamiento subcelular de una proteína unida operativamente, particularmente a un cloroplasto, leucoplasto y otro orgánulo plastídico; mitocondria, peroxisoma, vacuola; o una localización extracelular. Muchas proteínas localizadas en los cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursoras y se dirigen al cloroplasto mediante un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP). Ejemplos de dichas proteínas del cloroplasto aisladas incluyen, pero no se limitan a, los que se asocian con la subunidad pequeña (SSU) de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa, ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo cosecha-luz, tiorredoxina F, enolpiruvil shikimato fosfato sintasa (EPSPS). Los péptidos de tránsito de cloroplasto se describen, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 7.193.133. Se ha demostrado que las proteínas no cloroplásticas se pueden dirigir al cloroplasto mediante la expresión de un CTP heterólogo unido operativamente al transgén que codifica proteínas no cloroplásticas.
Moléculas de ADN que se pueden transcribir
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de ADN que se puede transcribir" se refiere a cualquier molécula de ADN capaz de ser transcrita en una molécula de ARN, que incluye, pero no se limita a, las que tienen secuencias codificantes de proteínas y las que producen moléculas de ARN que tienen secuencias útiles para la supresión genética. El tipo de molécula de ADN puede incluir, pero no se limita a, una molécula de ADN de la misma planta, una molécula de ADN de otra planta, una molécula de ADN de un organismo diferente, o una molécula de ADN sintética, tal como una molécula de ADN que contenga un mensaje antisentido de un gen, o una molécula de ADN que codifique un transgén artificial, sintético o una versión de un transgén modificada de otra manera. Las moléculas de ADN que se pueden transcribir ejemplares para la incorporación en construcciones de la invención incluyen, por ejemplo, las moléculas de ADN o genes de una especie distinta de la especie en la que se incorpora la molécula de ADN o los genes que se originan, o están presentes en la misma especie, pero se incorporan en células receptoras por procedimientos de modificación genética más que por técnicas de cruzamiento clásicas.
Un "transgén" se refiere a una molécula de ADN que se puede transcribir heteróloga respecto a la célula huésped al menos con respecto a su localización en el genoma de la célula huésped y/o a una molécula de ADN que se puede transcribir incorporada artificialmente al genoma de una célula huésped en la generación actual o cualquiera anterior de la célula.
Un elemento regulador, tal como un promotor de la invención, puede estar unido operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir que sea heteróloga con respecto al elemento regulador. Como se utiliza en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a la combinación de dos o más moléculas de ADN cuando dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, las dos moléculas de ADN se pueden derivar de diferentes especies y/o las dos moléculas de ADN se pueden derivar de diferentes genes, por ejemplo, diferentes genes de la misma especie, o los mismos genes de diferentes especies. Un elemento regulador es por lo tanto heterólogo con respecto a una molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente si dicha combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, es decir, que la molécula de ADN que se puede transcribir no existe naturalmente unida operativamente al elemento regulador.
La molécula de ADN que se puede transcribir puede ser en general cualquier molécula de ADN de la que se desee la expresión de una transcripción. Dicha expresión de una transcripción puede dar como resultado la traducción de la molécula de ARNm resultante y por tanto la expresión proteica. De manera alternativa, por ejemplo, una molécula de ADN que se puede transcribir puede diseñarse para a producir en último término una disminución de la expresión de un gen o proteína específica. En una realización, esto se puede conseguir utilizando una molécula de ADN que se puede transcribir que se oriente en dirección antisentido. Un experto habituado en la técnica está familiarizado con la utilización de dicha tecnología antisentido. Cualquier gen se puede regular negativamente de esta manera, y, en una realización, se puede diseñar una molécula de ADN que se puede transcribir para la supresión de un gen específico mediante la expresión de una molécula de dsARN, ARNip o miARN.
Por lo tanto, una realización de la invención es una molécula de ADN recombinante que comprende un elemento regulador de la invención como se ha descrito anteriormente unido operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir de manera que module la transcripción de la molécula de ADN que se puede transcribir a un nivel deseado o en un patrón deseado cuando la construcción se integra en el genoma de una célula vegetal transgénica. En una realización, la molécula de ADN que se puede transcribir comprende una región codificante de proteína de un gen y en otra realización, la molécula de ADN que se puede transcribir comprende una región antisentido de un gen.
Genes de interés agronómico
Una molécula de ADN que se puede transcribir puede ser un gen de interés agronómico. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "genes de interés agronómico" se refiere a una molécula de ADN que se puede transcribir que, cuando se expresa en un tejido vegetal particular, célula o tipo celular, transmite una característica deseable. El producto de un gen de interés agronómico puede actuar dentro de la planta con el fin de afectar la morfología, fisiología, crecimiento, desarrollo, rendimiento, composición del grano, perfil nutricional, enfermedad o resistencia a plagas o enfermedades, y/o tolerancia ambiental o química o puede actuar como un agente plaguicida en la dieta de una plaga que se alimente en la planta. En una realización de la invención, se incorpora un elemento regulador de la invención en una construcción de manera que el elemento regulador se une operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir que sea un gen de interés agronómico, en una planta transgénica que contenga dicha construcción, la expresión del gen de interés agronómico puede transmitir un rasgo agronómico beneficioso. Un rasgo agronómico beneficioso puede incluir, pero no se limita a, tolerancia a herbicidas, control de insectos, rendimiento modificado, resistencia a enfermedades, resistencia a agentes patógenos, crecimiento y desarrollo vegetativo modificado, contenido de almidón modificado, contenido de aceites modificado, contenido en ácidos grasos modificado, contenido proteico modificado, maduración de los frutos modificada, aumento de la nutrición animal y humana, producciones de biopolímeros, resistencia al estrés ambiental, péptidos farmacéuticos, mejores cualidades de procesamiento, sabor mejorado, utilidad de producción de semillas híbridas, producción mejorada de fibra, y producción de biocombustible deseable.
Ejemplos de genes de interés agronómico conocidos en la técnica incluyen los de resistencia a herbicidas (Patentes de EE. UU. N.° 6.803.501; 6.448.476; 6.248.876; 6.225.114; 6.107.549; 5.866.775; 5.804.425; 5.633.435; y 5.463.175), aumento del rendimiento (Patentes de EE. UU. N.° USRE38.446; 6.716.474; 6.663.906; 6.476.295; 6.441.277; 6.423.828; 6.399.330; 6.372.211; 6.235.971; 6.222.098; y 5.716.837), control de insectos (Patente de EE. UU. N.° 6.809.078; 6.713.063; 6.686.452; 6.657.046; 6.645.497; 6.642.030; 6.639.054; 6.620.988; 6.593.293; 6.555.655; 6.538.109; 6.537.756; 6.521.442; 6.501.009; 6.468.523; 6.326.351; 6.313.378; 6.284.949; 6.281.016; 6.248.536; 6.242.241; 6.221.649; 6.177.615; 6.156.573; 6.153.814; 6.110.464; 6.093.695; 6.063.756; 6.063.597; 6.023.013; 5.959.091; 5.942.664; 5.942.658. 5.880.275; 5.763.245; y 5.763.241), resistencia a enfermedades fúngicas (Patentes de EE. UU. N.° 6.653.280; 6.573.361; 6.506.962; 6.316.407; 6.215.048; 5.516.671; 5.773.696; 6.121.436; 6.316.407; y 6.506.962), resistencia a virus (Patentes de EE. UU. N.° 6.617.496; 6.608.241; 6.015.940; 6.013.864; 5.850.023; y 5.304.730), resistencia a nematodos (Patente de EE. UU. N.° 6.228.992), resistencia a enfermedades bacterianas (Patente de EE. UU. N.° 5.516.671), desarrollo y crecimiento vegetativo (Patentes de EE. UU. N.° 6.723.897 y 6.518.488), producción de almidón (Patentes de EE. UU. N.° 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), producción modificada de aceites (Patentes de EE. UU. N.° 6.444.876; 6.426.447; y 6.380.462), producción alta de aceite (Patentes de EE. UU. N.° 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; y 6.476.295), contenido modificado de ácidos grasos (Patentes de EE. UU. N.° 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; y 6.459.018), alta producción proteica (Patente de EE. UU. N.° 6.380.466) maduración de frutos (Patente de EE. UU. N.° 5.512.466), aumento de nutrición animal y humana (Patentes de EE. UU. N.° 6.723.837; 6.653.530; 6.5412.59; 5.985.605; y 6.171.640), biopolímeros (Patentes de EE. UU. N.° USRE37.543; 6.228.623; y 5.958.745. y 6.946.588), resistencia a estrés ambiental (Patente de EE. UU. N.° 6.072.103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (Patentes de EE. UU. N.° 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; y 6.080.560), rasgos de procesamiento mejorado (Patente de EE. UU. N.° 6.476.295), digestibilidad mejorada (Patente de EE. UU. N.° 6.531.648), rafinosa baja (Patente de EE. UU. N.° 6.166.292), producción enzimática industrial (Patente de EE. UU. N.° 5.543.576), sabor mejorado (Patente de EE. UU. N.° 6.011.199), fijación de nitrógeno (Patente de EE. UU. N.° 5.229.114), producción de semillas híbridas (Patente de EE. UU. N.° 5.689.041), producción de fibra (Patentes de EE. UU. N.° 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; y 5.869.720) y producción de biocombustible (Patente de EE. UU. N.° 5.998.700).
De manera alternativa, un gen de interés agronómico puede afectar las características o fenotipos de las plantas mencionados anteriormente codificando una molécula de ARN que produzca la modulación dirigida de la expresión genética de un gen endógeno, por ejemplo, mediante antisentido (véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.°
5.107.065), ARN inhibidor ("ARNi", incluyendo la modulación de la expresión genética mecanismos mediados por miARN, ARNip, ARNip activo trans, y sARN de fase, por ejemplo, como se describe en las solicitudes publicadas U.S.
2006/0200878 y U.S. 2008/0066206 y en la solicitud de patente de EE. UU. 11/974.469); o mecanismos mediados por cosupressión. El ARN también puede ser una molécula de ARN catalítica (por ejemplo, una ribozima, o ribointerruptor; véase, por ejemplo, el documento 2006/0200878) modificada para escindir un producto de ARNm endógeno deseado. Se conocen procedimientos en la técnica para la construcción y la introducción de construcciones en una célula de manera que la molécula de ADN que se puede transcribir se transcriba en una molécula que sea capaz de producir la supresión genética.
La expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir en una célula vegetal también se puede utilizar para suprimir las plagas de plantas que se alimentan de la célula vegetal, por ejemplo, las composiciones aisladas de plagas de coleópteros y composiciones aisladas de plagas de nematodos. Las plagas de las plantas incluyen, pero no se limitan a, las plagas de artrópodos, plagas de nematodos, y plagas fúngicas o microbianas.
Marcadores genéticos
Los marcadores genéticos transgénicos también se pueden utilizar con los elementos reguladores de la invención. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "marcador genético transgénico" se refiere a cualquier molécula de ADN que se puede transcribir cuya expresión en una planta, tejido o célula transgénicos, o falta de la misma, puede explorarse o valorarse de alguna manera. Los genes de los marcadores genéticos, y sus técnicas de selección y exploración asociadas, para su uso en la práctica de la invención son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ADN que se pueden transcribir que codifican la p-glucuronidasa (GUS), la proteína fluorescente verde (GFP), proteínas que transmiten resistencia a antibióticos, y proteínas que transmiten tolerancia a herbicidas.
P-Glucuronidasa
El gen de la p-glucuronidasa (GUS) aislado de la Escherichia coli K-12 es uno de los genes indicadores utilizados más ampliamente en biotecnología vegetal. El gen de GUS de E. coli, uidA, es parte del operón GUS del cromosoma bacteriano. Está inducido por una amplia variedad de p-D-glucurónidos. La enzima GUS es un exohidrolasa que cataliza la hidrólisis de p-D-glucurónicos en ácido D-glucurónico y la aglicona. La E. coli vive en el tracto digestivo de los vertebrados, incluido el hombre. Los vertebrados utilizan la ruta de glucuronidación para la detoxicación de xenobióticos y compuestos de desecho endógenos tale como los esteroides, alcoholes alifáticos, fenol, ácidos carboxílicos, azúcares, y otros metabolitos distintos. La glucuronidación implica la conjugación con ácido D-glucurónico. Esto se produce principalmente en el hígado, pero también se produce en otros tejidos y órganos tales como el riñón, las glándulas adrenales y el tracto alimentario. El ácido glucurónico puede ser utilizado por la E. coli como fuente principal de carbono y energía. La GUS proteica de E. coli proporciona por lo tanto de un medio por el cual la bacteria puede degradar los productos de la ruta de glucuronidación en el tracto alimentario de los vertebrados para dar lugar a ácido glucurónico como una fuente de carbono y energía. Las agliconas que también se liberan por la enzima GUS no son degradadas en general por la bacteria, sino que se utiliza como una lanzadera para el ácido D-glucurónico (Gilissen y col., Transgenic Research, 7: 157-163, 1998).
El uso del gen de la p-glucuronidasa de E. coli como indicador se describió por primera vez por Jefferson y col. (Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8447-8451, 1986) y se ha utilizado sobre todo de la misma manera que se describió desde su introducción. El gen de GUS se utiliza para monitorizar la expresión genética de plantas y se emplea frecuentemente para caracterizar promotores u otros elementos de expresión. Sin embargo, algunos promotores vegetales se expresan a niveles muy bajos y pueden ser indetectables utilizando el ensayo basado en GUS. Estos promotores de expresión más baja pueden ser valiosos para el desarrollo de cultivos transgénicos con fenotipos deseables tales como un rendimiento mejorado.
Al principio del desarrollo de plantas de cultivo transgénicas, los promotores que proporcionaban la expresión constitutiva más alta eran los más deseados. Estos promotores constitutivos altos, derivados de genomas de virus de plantas tales como el virus del mosaico de la coliflor y el virus del mosaico de la escrofularia, se utilizaron para dirigir los transgenes que transmitían tolerancia a herbicidas o resistencia a insectos. Según aumenta de complejidad el campo de biotecnología vegetal, se han desarrollado nuevos rasgos transgénicos que necesitan patrones de expresión más específicos, o menores niveles de expresión. La sobre expresión o expresión en tejidos vegetales erróneos puede dar lugar a efectos no deseados en la planta transformada. Por ejemplo, la expresión ectópica (expresión de un gen en un lugar anormal en un organismo) de genes enzimáticos en plantas puede dar como resultado la reducción del producto final deseado debido al acortamiento del precursor en un punto de ramificación de una ruta metabólica (Iwase y col., Plant Biotech. 26: 29-38, 2009).
Debido a que los factores de transcripción (TF) actúan naturalmente como reguladores maestros de los procesos celulares, se espera que sean candidatos excelentes para la modificación de rasgos complejos en plantas de cultivo, y las tecnologías basadas en TF son probablemente una parte prominente de la nueva generación de cultivos biotecnológicos satisfactorios. Las tecnologías TF a menudo necesitan una optimación, bien para reducir efectos secundarios indeseados tales como retraso del crecimiento o para aumentar el rasgo deseado hasta el nivel que tenga un valor comercial. La optimización se consigue frecuentemente modificando la expresión del transgén TF. Los
promotores específicos de tejido, del desarrollo, o inducibles, más que los promotores constitutivos habituales, se pueden utilizar para limitar la expresión del transgén a los tejidos o las condiciones ambientales apropiados (Century y col., Plant Physiology, 147: 20-29, 2008).
Debido en parte a estos desarrollos, existe la necesidad de un ensayo más sensible para la caracterización de elementos de expresión para identificar los elementos de expresión que proporcionan un nivel y un patrón de expresión deseados. La presente invención proporciona una secuencia codificante de GUS, mejorada con el codón rediseñado que, cuando se une operativamente a un promotor, se expresa mejor que la secuencia codificante de GUS de E. coli que se utiliza comúnmente en la técnica. La secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado se puede utilizar para proporcionar una mayor sensibilidad del ensayo, tanto cuantitativa como cualitativamente, y permite la caracterización de promotores y otros elementos de expresión que puede no ser posible de otra manera con la secuencia codificante de GUS nativa de E. coli. La secuencia codificante de Gus mejorada con el codón rediseñado se puede utilizar para caracterizar elementos de expresión en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las plantas monocotiledóneas útiles en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a Maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa), Trigo (Triticum), Cebada (Hordeum vulgare), Sorgo (Sorghum spp.), Mijo, Mijo perla (Pennisetum glaucum), Mijo de dedo (Eleusine coracana), Mijo común (Panicum miliaceum), Moha itálica (Setaria italica), Avena (Avena sativa), Triticale, Centeno (Secale cereale), Poáceas (Digitada), Cebollas (Allium spp.), Piña (Ananas spp.), Céspedes, Caña de azúcar (Saccharum spp.), Palma (Arecaceae), Bambú (Bambuseae), Banana (Musaceae), familia de Gengibres (Zingiberaceae), Lirios (Lilium), Narcisos (Narcissus), Iris (Iris), Amarilis, Orquídeas (Orchidaceae), Cañas, Jacintos (Hyacinthoides), y Tulipanes (Tulipa). Las plantas dicotiledóneas útiles en la práctica de la invención, incluyen, pero no se limitan a, Soja (Glycine max), Soja silvestre (Glycine soja), Algodón (Gossypium), Tomate (Solanum lycopersicum), Pimienta (Piper), Calabacín (Cucurbita), Guisante (Pisum sativum), Alfalfa (Medicago sativa), Medicago truncatula, Alubias (Phaseolus), Garbanzo (Cicer arietinum), Girasol (Helianthus annuus), Patata (Solanum tuberosum), Maní (Arachis hipogea), Quinoa, trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum), Algarrobo (Ceratonia siliqua), Remolacha (Beta vulgaris), Espinaca (Spinacia oleracea), y Pepino (Cucumis sativus).
Transformación celular
La invención también se refiere a un procedimiento de producción de células y plantas transformadas que comprenden uno o más elementos reguladores unidos operativamente a una molécula de ADN que se puede transcribir.
El término "transformación" se refiere a la introducción de una molécula de ADN en un huésped receptor. Como se utiliza en el presente documento, el término "huésped" se refiere bacterias, hongos o plantas, incluyendo cualquiera de las células, tejidos, órganos, o progenie de las bacterias, hongos o plantas. Los tejidos y células vegetales de interés particular incluyen los protoplastos, callos, raíces, tubérculos, semillas, tallos, hojas, plántulas, embriones y polen.
Como se utiliza en el presente documento, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano, u organismo en el que se ha introducido una molécula de ADN ajena tal como una construcción. La molécula de ADN introducida puede integrarse en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de manera que la molécula de ADN introducida es heredada por la progenie siguiente. Una célula u organismo "transgénicos" o "transformados" también puede incluir la progenie de la célula u organismo y la progenie producida por un programa de cruzamiento que emplee dicho organismo transgénico como parental en un cruzamiento y presente un fenotipo alterado que sea el resultado de la presencia de una molécula de ADN ajena. La molécula de ADN introducida puede introducirse transitoriamente en la célula receptora de manera que la molécula de ADN introducida no se hereda por la progenie siguiente. El término "transgénico" se refiere a una bacteria, hongo o planta que contienen una o más moléculas de ADN heterólogo.
Hay muchos procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para la introducción de moléculas de ADN en células vegetales. El procedimiento comprende en general las etapas de selección de una célula huésped adecuada, la transformación de la célula huésped con un vector, y la obtención de una célula huésped transformada. Los procedimientos y materiales para la transformación de células vegetales mediante la introducción de una construcción en el genoma de una planta en la práctica de la presente invención pueden incluir cualquiera de los procedimientos bien conocidos y demostrados. Los procedimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, infección bacteriana (por ejemplo, con, Agrobacterium), vectores BAC binarios, el suministro directo de ADN (por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitado con fibras de carburo de silicio, y aceleración de partículas revestidas con ADN), entre otros.
Las células huésped pueden ser cualquier célula u organismo, tal como una célula vegetal, célula de alga, algas, célula fúngica, hongos, célula bacteriana, o célula de insecto. En realizaciones específicas, las células huésped y las células transformadas incluyen células de plantas de cultivo.
Se puede regenerar posteriormente una planta transgénica a partir de la célula vegetal transgénica de la invención. Utilizando técnicas de cruzamiento convencionales o auto-polinización, se pueden producir semillas a partir de esta planta transgénica. Dicha semilla, y la planta de la progenie resultante que crece a partir de dicha semilla, contendrán la molécula de ADN recombinante de la invención, y, por lo tanto, serán transgénicas.
Las plantas transgénicas de la invención pueden auto-polinizarse para proporcionar semillas de plantas transgénicas homocigotas de la invención (homocigota para la molécula de ADN recombinante) o cruzarse con plantas no transgénicas u otras plantas transgénicas diferentes para proporcionar semillas de plantas transgénicas heterocigotas de la invención (heterocigotas para la molécula de ADN recombinante). Se hace referencia en el presente documento a ambas de dichas plantas homocigotas y heterocigotas como "plantas transgénicas". Las plantas de la progenie son plantas transgénicas descendientes de la planta transgénica original que contiene la molécula de ADN recombinante de la invención. Las semillas producidas utilizando una planta transgénica de la invención se pueden recolectar y utilizar para cultivar generaciones de plantas transgénicas, es decir, la progenie de plantas de la invención, que comprenden la construcción de la presente invención y que expresan un gen de interés agronómico. Las descripciones de los procedimientos de cruzamiento que se utilizan comúnmente para los diferentes cultivos se pueden encontrar en uno de los varios libros de referencia, véase, por ejemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, (1960); Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman, Inc., NY, 369-399, (1979); Sneep y Hendriksen, Plant breeding Perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, (1979); Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2a Edición, Monograph, 16:249, (1987); Fehr, Principles of Variety Development, Theory and Technique, (Vol. 1) y Crop Species Soybean (Vol. 2), lowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376 (1987).
Las plantas transformadas se pueden analizar en cuanto a la presencia del gen o genes de interés y el nivel de expresión y/o perfil transmitido por los elementos reguladores de la invención. Los expertos en la técnica son conscientes de los numerosos procedimientos disponibles para el análisis de plantas transformadas. Por ejemplo, los procedimientos para el análisis de plantas incluyen, pero no se limitan a, las transferencias de Southern o transferencias de Northern, estrategias basadas en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración fenotípica, evaluaciones de campo, y ensayos inmunodiagnósticos. La expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir se puede medir utilizando los reactivos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los procedimientos que describe el fabricante y los tiempos de ciclo de PCR determinados utilizando la Matriz de ensayo TaqMan®. De manera alternativa, se pueden utilizar los reactivos de Invader® (Third Wave Technologies, Madison, WI) y los procedimientos descritos por el fabricante para evaluar la expresión transgénica.
La invención también proporciona partes de una planta de la invención. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, las hojas, tallos, raíces, tubérculos, semillas, endospermo, óvulo y polen. Las partes de la planta de la invención pueden ser viables, no viables, regenerables, y/o no regenerables. La invención también incluye y proporciona células vegetales transformadas que comprenden una molécula de ADN de la invención. Las células vegetales transformadas o transgénicas de la invención incluyen células vegetales regenerables y/o no regenerables.
La invención puede entenderse más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos. Se debería apreciar por los expertos en la técnica, que las técnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Identificación y clonación de elementos reguladores
Se identificaron nuevos promotores RCc3 y líderes y se clonaron a partir del ADN genómico de las especies de monocotiledónea lágrimas de Job (Coix lacryma jobi) grama sanguina (Digitaria sanguinalis (L.) Scop.), Eulalia (Miscanthus sinensis f. gracillimus), maicillo oriental (Tripsacum dactyloides) y caña de azúcar (Saccharum officinarum). La proteína RCc3 pertenece a la superfamilia de prolaminas, que deriva su nombre de las proteínas de almacenamiento ricas en prolina soluble en alcohol y glutamina de los cereales. La superfamilia de las prolaminas (también llamada familia de albúmina 2S de almacenamiento en semillas/proteína de transferencia de lípidos/inhibidora de proteasas; Pfam ID: PF00234) representa una de las superfamilias proteicas más ampliamente dispersas en el genoma vegetal. Los miembros de la superfamilia de las prolaminas son abundantes en los frutos, frutos secos, semillas, y vegetales de una variedad de plantas. Se sabe que presentan funciones diversas incluyendo el almacenamiento y protección de semillas, unión o transferencia de lípidos, e inhibición enzimática. Las proteínas de transferencia de lípidos (LTP) pertenecen a la superfamilia de las prolaminas y se expresan en una variedad de tejidos vegetales. La proteína RCc3 del arroz es una LTP que se expresa en las raíces del arroz, aunque no todas las LTP son específicas de la raíz.
Se diseñaron cebadores de amplificación de ADN (que se presentan como las SEQ ID NO: 25-28) utilizando las secuencias codificantes de veinticuatro (24) proteínas LTP de Zea mays, Oryza sativa, Sorghum bicolor y Brachypoium distachyon. Los cebadores de amplificación se utilizaron con bibliotecas GenomeWalker™ (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) que se construyeron siguiendo el protocolo del fabricante para clonar la región 5' de la secuencia de ADN genómico correspondiente.
Se llevó a cabo un análisis bioinformático para identificar elementos reguladores dentro del ADN amplificado. Utilizando los resultados de este análisis, se definieron los elementos reguladores dentro de las secuencias de ADN y los cebadores se diseñaron para amplificar los elementos reguladores. La molécula de ADN correspondiente de cada
elemento regulador se amplificó utilizando las condiciones convencionales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que contenían sitios de enzimas de restricción únicos y el ADN genómico aislado de C. lacrymajobi, D. sanguinalis (L.) Scop., M. sinensis f. gracillimus, T. dactyloides, y S. officinarum. Los fragmentos de ADN resultantes se ligaron en vectores y se secuenciaron.
Las secuencias de ADN de los promotores y líderes RCc3 identificadas se enumeran en la Tabla 1. Las secuencias de promotor se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. Las secuencias líder se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20.
Tabla 1. Promotores y líderes RCc3 aislados de distintas especies herbáceas.
Ejemplo 2
Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en el maíz transgénico
Se transformaron las plantas de maíz con vectores, específicamente construcciones plasmídicas binarias, que comprenden un promotor RCc3 unido operativamente a su líder RCc3 nativo que dirigen la expresión del transgén de la p-glucuronidasa (GUS). Las plantas transformadas resultantes se analizaron en cuanto a la expresión de proteína GUS.
Los vectores utilizados en estos experimentos se construyeron utilizando procedimientos de clonación conocidos en la técnica. Los vectores resultantes comprendían una región limítrofe derecha de A. tumefaciens;; un primer casete de expresión transgénico para ensayar la secuencia de promotor/líder RCc3 unida operativamente a una secuencia codificante con el codón rediseñado para GUS que poseía un intrón procesable GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:3 (SEQ ID NO: 29) unido operativamente en 5' a la UTR 3' del gen de S-adenosil-metionina sintetasa del mijo cola de zorro (T-SETitAms1-1:1:1, SEQ ID NO: 159); un segundo casete transgénico de selección que se utilizó para la selección de las células vegetales transformadas que transmite la resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor de Actina 1 del arroz); y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar las plantas de maíz utilizando procedimientos conocidos en la técnica. La expresión de GUS transmitida por los nuevos promotores y líderes RCc3 se comparó con la expresión dirigida por el mijo cola de zorro y los promotores y líderes homólogos de RCc3 del arroz. La Tabla 2 proporciona las construcciones plasmídicas, las secuencias de promotor y líder RCc3, y la SEQ ID NO.
Tabla 2. Plásmidos binarios de transformación de plantas y secuencias de promotor/líder RCc3 asociadas.
En ciertos casos, las plantas se transformaron utilizando procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica y como se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU.
2009/0138985.
Se utilizó el análisis histoquímico de GUS para el análisis de la expresión cualitativa de las plantas transformadas. Se incubaron secciones de tejido completo con solución de tinción de GUS, X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-pglucurónido) (1 mg/ml) durante una cantidad de tiempo apropiada, se aclararon, y se inspeccionaron visualmente en cuanto a su coloración azul. La actividad de GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección bajo un microscopio utilizando órganos y tejidos seleccionados de la planta. Se inspeccionaron las plantas Ro en cuanto a la expresión en las raíces y hozas, así como en las anteras, sedas, y semillas en desarrollo y en embriones 21 días después de la polinización (21 DAP).
Para el análisis cuantitativo, se extrajo el total de proteínas de los tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Un microgramo de proteína total se utilizó con el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen total de reacción de 50 microlitros. El producto de reacción, 4-metilumbeliferona (4-MU), es máximamente fluorescente a pH alto, cuando se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato sódico para simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para la cuantificación del producto fluorescente. Se midió la fluorescencia con una excitación a 365 nm, emisión a 445 nm, utilizando un Lector Micromax con Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japón), con una anchura de hendidura fijada en 2 nm en excitación, 3 nm en emisión. Los valores de expresión media se proporcionaron como pmol de 4-MU/pg de proteína/hora.
La expresión de GUS media de la R0 que se observaba para cada transformación se registró y se determinó una media del nivel de expresión y el error estándar basándose en las mediciones tomadas de las muestras derivadas de múltiples eventos de transformación.
Ejemplo 3
Amplificadores derivados de los elementos reguladores
Los amplificadores se pueden derivar a partir de los elementos promotores proporcionados en el presente documento, tal como los que se presentan como las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 y 19. Estos elementos amplificadores pueden estar comprendidos por uno o más elementos reguladores cis que, cuando se unen operativamente en 5' o 3' a un elemento promotor o se unen operativamente en 5' o 3' a elementos amplificadores adicionales que estén unidos operativamente a un promotor, pueden aumentar o modular la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir, o que proporciona la expresión de una molécula de ADN que se puede transcribir en un tipo celular u órgano vegetales específicos, o en un momento particular del desarrollo o del ritmo circadiano. Los amplificadores se producen retirando la caja TATA o elementos funcionalmente similares y cualquier secuencia de ADN corriente abajo desde los promotores que permiten que se inicie la transcripción a partir de los promotores proporcionados en el presente documento como se ha descrito anteriormente, incluyendo los fragmentos de los mismos, en los que se ha retirado la caja TATA o elementos funcionalmente similares y la secuencia de ADN corriente abajo de la caja TATA.
Los elementos amplificadores se pueden derivar de los elementos promotores proporcionados en el presente documento y se clonan utilizando procedimientos conocidos en la técnica para unirse operativamente en 5' o 3' a un elemento promotor o se une operativamente en 5' o 3' a elementos amplificadores adicionales que estén unidos operativamente a un promotor. Los elementos amplificadores se pueden clonar para unirse operativamente en 5' o 3' a un elemento promotor derivado de un organismo de género diferente o unirse operativamente en 5' o 3' a elementos amplificadores adicionales derivados de organismos de otros géneros o de un organismo del mismo género que estén unidos operativamente a un promotor derivado de un organismo del mismo o diferente género, dando como resultado un elemento regulador quimérico. Un vector de expresión de GUS se puede construir utilizando procedimientos conocidos en la técnica de manera similar a las construcciones descritas en los Ejemplos previos en los que los vectores de expresión en plantas contienen una región limítrofe derecha de A. tumefaciens;; un primer casete transgénico para ensayar el elemento regulador o regulador quimérico comprendido por un elemento regulador o regulador quimérico unido operativamente a un intrón derivado de la proteína HSP70 de choque térmico de Z. mays (I-Zm.DnaK-1:1:1, SEQ ID NO: 38) o cualquiera de los intrones presentados en el presente documento o cualquier otro intrón, unido operativamente a una secuencia codificante de GUS que posea un intrón procesable (GUS-2, SEQ ID NO: 32) o sin intrón (CR-Ec.uidA-1:1:4 (GUS.nat), SEQ ID NO: 31) unido operativamente a la UTR 3' de la Nopalina sintasa de A. tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 39) o la UTR 3' del gen de la proteína de transferencia
lipídica del arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 40); un segundo casete transgénico de selección que se utiliza para la selección de las células vegetales transformadas que transmite la resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor de Actina 1 del arroz), o de manera alternativa, el antibiótico kanamicina (dirigido por el promotor de Actina 1 del arroz); y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens. Los plásmidos resultantes se pueden utilizar para transformar plantas de maíz o plantas de otros géneros mediante procedimientos descritos anteriormente o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica. De manera alternativa, las células de protoplasto derivadas del maíz o plantas de otros géneros se pueden transformar utilizando procedimientos conocidos en la técnica para llevar a cabo ensayos transitorios.
La expresión de GUS dirigida por elementos reguladores que comprenden uno o más amplificadores se puede evaluar en ensayos de plantas estables o transitorias para determinar los efectos del elemento amplificador sobre la expresión de un transgén. Las modificaciones de uno o más elementos amplificadores o la duplicación de uno o más elementos amplificadores se puede llevar a cabo basándose en la experimentación empírica y la regulación de la expresión genética resultante que se observa utilizando cada composición de elemento regulador. Al alterar las posiciones relativas de uno o más amplificadores del elemento regulador o regulador quimérico resultante se puede afectar la actividad transcripcional o la especificidad del elemento regulador o regulador quimérico y se determina empíricamente para identificar los mejores amplificadores para el perfil de expresión transgénica deseado dentro de la planta de maíz o planta de otro género.
Ejemplo 4
Mayor sensibilidad del ensayo con un codón rediseñado de la p-glucuronidasa (GUS)
Los promotores vegetales se expresan a menudo a niveles que están por debajo del umbral de detección normal de muchos ensayos cuantitativos, aunque sus características de expresión sean altamente valiosas para la expresión de ciertos genes. En la biotecnología vegetal anterior, los promotores que dirigían la alta expresión constitutiva eran deseable y se utilizaban para dirigir moléculas de ADN que se puede transcribir que producían un fenotipo específico que necesita una alta expresión constitutiva, tal como la tolerancia a herbicidas o la resistencia a insectos. Estos altos promotores constitutivos a menudo se derivan de los genomas de virus de las plantas más que de los genomas de las plantas, por ejemplo, los promotores 35S derivados del virus del mosaico de la coliflor y el virus del mosaico de la escrofularia. Extraordinariamente, en ciertos casos, la alta expresión constitutiva de ciertas moléculas de ADN que se pueden transcribir puede dar lugar a consecuencias negativas tales como el silenciamiento genético, bloqueo de fenotipos, o resistencia al rendimiento. Por ejemplo, la alta expresión del gen GUS en plantas transgénicas de caña de azúcar utilizando dos promotores ubiquitina derivados de caña de azúcar, así como un promotor ubiquitina del maíz resultaba en un silenciamiento genético post transcripcional del gen de GUS (Wei y col., J. Plant Physiol. 160: 1241 1251, 2003).
Adicionalmente, actualmente existe una demanda de promotores que demuestren patrones específicos de expresión o se expresen en tejidos específicos de la planta más altamente. Por ejemplo, la expresión ectópica de genes enzimáticos en plantas puede dar como resultado la reducción del producto final deseado debido a un acortamiento del precursor en un punto de ramificación de una ruta metabólica (Iwase y col., Plant Biotech. 26:29-38, 2009). En estos casos, es deseable utilizar un promotor que exprese la molécula de ADN que se puede transcribir a la que se une operativamente en el tipo tisular o celular correctos, o en una ventana particular de desarrollo. Los promotores derivados del genoma vegetal pueden demostrar características de expresión deseables en el tejido, célula o desarrollo. Debido a los niveles de expresión de estos promotores vegetales, los ensayos de expresión a menudo necesitan amplificadores para reforzar el nivel de expresión para permitir la detección en un ensayo cuantitativo. Sin embargo, el uso de dichos amplificadores a menudo cambia el patrón total de expresión del promotor vegetal.
La mejora de la expresión del gen indicador que se utiliza en el ensayo elimina la necesidad de aumentar el promotor derivado de una planta y, por lo tanto, proporciona una evaluación más precisa del patrón de expresión transmitido por un promotor. Este Ejemplo muestra el uso de una secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado para mejorar la sensibilidad del ensayo cuantitativo en la caracterización de varios EXP diferentes comprendidos por una secuencia promotora, unida operativamente en 5' a una secuencia líder, unida operativamente en 5' a una secuencia de intrón.
Se transformaron plantas de maíz con vectores de expresión en plantas que contenían las secuencias EXP que dirigen la expresión del transgén de p-glucuronidasa (GUS) nativa de Escherichia coli o el transgén de la p-glucuronidasa (GUS.nno) con el codón rediseñado, y las plantas resultantes se analizaron en cuanto a la expresión proteica de GUS. Las secuencias codificantes de GUS y los EXP se clonaron en construcciones plasmídicas binarias utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Las construcciones de expresión en plantas resultantes contienen una región limítrofe derecha de A. tumefaciens; un primer casete transgénico que muestra la sensibilidad del ensayo de las dos secuencias codificantes de GUS, comprendidas por un EXP unido operativamente a la secuencia codificante de GUS nativa de E. coli (CR-Ec.uidA-1:1:4 (GUS.nat), SEQ ID NO: 31) o una secuencia codificante de GUS de E. coli con el codón rediseñado (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1 (GUS.nno), SEQ ID NO: 30) unida operativamente en 5' a la UTR 3' del gen de la proteína de transferencia lipídica del arroz (T-Os.LTP-1:1:1, SEQ ID NO: 40); un segundo casete transgénico de selección que se
utilizó para la selección de las células vegetales transformadas que transmite la resistencia al herbicida glifosato (dirigido por el promotor de Actina 1 del arroz); y una región limítrofe izquierda de A. tumefaciens. Las FIG. 1a a 1c muestran un alineamiento entre la secuencia codificante de GUS nativa (CR-Ec.uidA-1:1:4) y la secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1). Los nucleótidos idénticos en el alineamiento se indican mediante un asterisco. La secuencia de GUS con el codón rediseñado es un 77,9 % idéntica a la secuencia codificante de la GUS nativa y se ha diseñado para expresarse mejor en plantas.
Se utilizaron tres (3) clases diferentes de EXP, que transmitía cada una un patrón de expresión específico. Los EXP: EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 34) y EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 35) transmite un perfil de expresión en hojas del maíz y son esencialmente idénticas con la excepción de una inserción de cinco nucleótidos de 5-CCGA-3' en las posiciones de nucleótidos 1408 a 1412 de EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2. La secuencia de EXP: EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5 (SEQ ID NO: 36) proporciona un perfil de expresión en raíces aumentado en el maíz. La secuencia del EXP: EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 37) proporciona un alto perfil de expresión constitutiva en el maíz. Los plásmidos resultantes se utilizaron para transformar plantas de maíz utilizando procedimientos conocidos en la técnica. La Tabla 3 enumera las denominaciones de las construcciones plasmídicas, y las secuencias de EXP y GUS correspondientes.
Tabla 3. Construcciones plasmídicas, secuencias EXP y patrones de expresión utilizados para comparar las secuencias codificantes de GUS nativa vs. GUS con el codón rediseñado.
En ciertos casos, las plantas se transformaron utilizando procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium conocidos en la técnica y como se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU.
2009/0138985.
Se utilizó el análisis histoquímico de GUS para el análisis de la expresión cualitativa de las plantas transformadas. Se incubaron secciones de tejido completo con solución de tinción de GUS X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-bglucurónido) (1 mg/ml) durante una longitud de tiempo apropiada, se aclararon, y se inspeccionaron visualmente para ver la coloración azul. La actividad de GUS se determinó cualitativamente mediante inspección visual directa o inspección bajo un microscopio utilizando órganos y tejidos seleccionados de la planta. Se inspeccionaron las plantas R0 en cuanto a la expresión en las raíces y hojas, así como en las anteras, sedas, y semillas en desarrollo y en embriones 21 días después de la polinización (21 DAP).
Para el análisis cuantitativo, se extrajo el total de proteínas de los tejidos seleccionados de las plantas de maíz transformadas. Un microgramo de proteína total se utilizó con el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-p-D-glucurónido (MUG) en un volumen total de reacción de 50 |jl. El producto de reacción, 4-metilumbeliferona (4-MU), es máximamente fluorescente a pH alto, cuando se ioniza el grupo hidroxilo. La adición de una solución básica de carbonato sódico para simultáneamente el ensayo y ajusta el pH para la cuantificación del producto fluorescente. Se midió la fluorescencia con una excitación a 365 nm, emisión a 445 nm, utilizando un Lector Micromax con Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japón), con una anchura de hendidura fijada en 2 nm en excitación, 3 nm en emisión.
Los valores de expresión de GUS medios para los transformantes de la generación R0 se proporcionan en las Tablas 4, 5 y 6.
Tabla 4. Media de la expresión de GUS en la generación R0 de una secuencia codificante de GUS nativa y con el codón rediseñado utilizando un EXP con un perfil de expresión en hojas.
Tabla 5. Media de la expresión de GUS en la generación Ro de una secuencia codificante de GUS nativa y con el codón rediseñado utilizando un EXP con un perfil aumentado de expresión en raíces.
Tabla 6. Media de la expresión de GUS en la generación R0 de una secuencia codificante de GUS nativa y con el codón rediseñado utilizando un EXP con un perfil de expresión constitutivo.
Como se puede ver en las tablas 4 a 6, existe una mayor sensibilidad en los ensayos cuantitativos utilizando la secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado cuando se compara con la secuencia codificante de GUS nativa. Se espera alguna variabilidad entre las poblaciones GUS.nno y GUS.nat, ya que la expresión puede estar afectada por los sitios de inserción del T-ADN; sin embargo, la tendencia general en la sensibilidad muestra una sensibilidad mucho mayor utilizando GUS.nno. La GUS dirigida por EXP: EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 34) y EXP-SETit.Cab3+Zm.DnaK:1:2 (SEQ ID NO: 35) mostraban una sensibilidad de 2,26 a 8,1 veces mayor utilizando GUS.nno cuando se comparaba con GUS.nat. De la misma manera, el perfil aumentado en raíces proporcionado por EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5 (SEQ ID NO: 36) era 16,06 a 19,06 veces mayor utilizando GUS.nno que GUS.nat, haciendo que esta secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado ideal para la exploración de promotores de raíces, especialmente los promotores que se expresan a niveles bajos, y puede mostrar valores de GUS en o por debajo de niveles de fondo cuando se utiliza la secuencia codificante de GUS nativa. El alto perfil de expresión constitutiva transmitido por EXP-Zm.UbqM1:1:2 (SEQ ID NO: 37) mostraba una sensibilidad cuantitativa 1,42 a 4,09 veces mayor cuando se utilizaba GUS.nno en comparación con GUS.nat.
Cualitativamente, la tinción de GUS era más sensible y se observaba constantemente en muestras de tejido utilizando la secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado. En general, las observaciones de tinción cualitativas tendían a ser menos sensibles que los ensayos cuantitativos. El uso de una secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado proporciona inspecciones mejores y más constantes de los tejidos teñidos. Por ejemplo, en los tejidos radicales, cuando se dirigía la GUS mediante el EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5 (s Eq ID NO: 36), la
tinción histoquímica de los tejidos transformados con la secuencia codificante de GUS con el codón rediseñado era más pronunciada y visible en las muestras de raíces V7 de la corteza, epidermis, endodermis, pelos radicales y puntas radicales secundarias. Por el contrario, la tinción de GUS no se observaba cualitativamente en los tejidos radicales V7 correspondientes cuando la secuencia codificante de GUS era dirigida por el EXP-CaMV.35S-enh+Os.Rcc3+Zm.DnaK:1:5. La secuencia codificante de GUS mejorada con el codón rediseñado, (CR-Ec.uidA_nno-1:1:1, SEQ ID NO: 30), proporcionaba mayor sensibilidad del ensayo y era particularmente valioso en la medición de la expresión de promotores que se expresan a niveles bajos.
Ejemplo 5
Análisis de los elementos reguladores que dirigen la GUS en protoplastos de hojas y raíces del maíz
Se transformaron protoplastos de hojas y raíces de maíz con vectores que comprendían un promotor RCc3 unido operativamente a su líder RCc3 nativo que dirigen la expresión del transgén de p-glucuronidasa (GUS), y los protoplastos transformados resultantes se analizaron en cuanto a la expresión de la GUS proteica. Las secuencias del promotor y el líder RCc3 se clonaron en construcciones plasmídicas binarias utilizando procedimientos conocidos en la técnica y como se ha descrito previamente en el Ejemplo 2.
También se construyeron dos construcciones plasmídicas para su uso en la co-transformación y normalización de los datos, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Cada una de estas construcciones plasmídicas contenía una secuencia codificante de luciferasa que estaba dirigida por un EXP constitutivo. El vector pMON19437 comprendía un casete de expresión con un promotor constitutivo unido operativamente en 5' a un intrón, (EXP-CaMV.35S-enh+Zm.DnaK:1, SEQ ID NO: 41), unido operativamente en 5' a una secuencia codificante de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (LUCIFERASE:1:3, Se Q ID NO: 42), unida operativamente en 5' a una UTR 3' del gen de nopalina sintasa del Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 39). El vector pMON63934 comprendía un casete de expresión con una secuencia de un EXP constitutivo (EXP-CaMV.35S-enh-Lhcbl, SEQ ID NO: 44), unido operativamente en 5' a una secuencia codificante de luciferasa de pensamiento de mar (Renilla reniformis) (CR-Ren.hRenilla Lucife-0:0:1, SEQ ID NO: 43), unida operativamente en 5' a una UTR 3' del gen de nopalina sintasa del Agrobacterium tumefaciens (T-AGRtu.nos-1:1:13, SEQ ID NO: 39).
Los protoplastos de hojas y raíces de maíz se transformaron utilizando un procedimiento de transformación basado en polietilenglicol (PEG), que se conoce bien en la técnica. Las células protoplásticas se transformaron con el pMON19437, pMON63934, y uno de los plásmidos presentados en la Tabla 7. Después de la transformación, los protoplastos transformados se incubaron durante una noche en total oscuridad. A continuación, se llevó a cabo la medición de GUS y luciferasa colocando alícuotas de una preparación de células transformadas lisadas como se ha señalado anteriormente en dos bandejas de pocillos pequeños diferentes. Una bandeja se utilizó para las mediciones de GUS y una segunda bandeja se utilizó para llevar a cabo un ensayo dual de luciferasa utilizando el sistema de ensayo dual de indicador de luciferasa (Promega Corp., Madison, WI; véase, por ejemplo, Promega Notes Magazine, No: 57, 1996, p.02).
Se llevaron a cabo cuatro transformaciones para cada secuencia de EXP o promotor líder intrón. Se determinaron los valores medios de la expresión para cada secuencia de EXP o promotor líder intrón de varias muestras de cada transformación. Las mediciones de las muestras si hicieron utilizando cuatro repeticiones de la transformación con la construcción plasmídica con cada secuencia de EXP o promotor líder intrón. Se determinó el fondo de expresión GUS utilizando una construcción plasmídica de control negativo que carecía del transgén GUS. Los niveles medios de expresión de GUS y luciferasa se proporcionan en las Tablas 7 (hojas) y 8 (raíces). En estas tablas, los valores de luciferasa de luciérnaga (por ejemplo, de la expresión de pMON19437) se proporcionan en la columna marcada con "FLUC" y los valores de luciferasa de pensamiento de mar (por ejemplo, de la expresión de pMON63934) se proporcionan en la columna marcada con "RLUC". También se proporcionan en las Tablas 7 y 8 las medias de las relaciones GUS/FLUC y GUS/RLUC que proporcionan una medida relativa de la fuerza de expresión en los ensayos con protoplastos.
Tabla 7. Valores medios de GUS, FLUC y RLUC derivados de los protoplastos de hojas de maíz
transformados.
Tabla 8. Valores medios de GUS, FLUC y RLUC derivados de los protoplastos de raíces de maíz transformados.
continuación
Como se muestra en la Tabla 7 todos los promotores homólogos RCc3 presentaban la capacidad de dirigir la expresión transgénica en los protoplastos de hojas de maíz. Algunos de los homólogos del promotor RCc3 dirigían la expresión de manera más alta que otros en este ensayo basado en las relaciones de GUS/FLUC y GUS/RLUC. Adicionalmente, como se muestra en la Tabla 8 todos los homólogos del promotor RCc3 presentaban la capacidad de dirigir la expresión transgénica en los protoplastos de raíces de maíz en grados variables.
Ejemplo 6
Análisis de elementos reguladores que dirigen la GUS en el maíz transgénico.
Se transformaron las plantas de maíz con vectores que comprendían un promotor RCc3 unido operativamente a su líder RCc3 nativo que dirigen la expresión del transgén de la p-glucuronidasa (GUS). Las plantas transformadas resultantes se analizaron en cuanto a la expresión de proteína GUS.
Las secuencias del promotor y el líder RCc3 se clonaron en construcciones plasmídicas binarias utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en el Ejemplo 2. Las construcciones plasmídicas binarias resultantes eran pMON264146, pMON264148, pMON264088, pMON264107, pMON264186, pMON264187, pMON264049, pMON264050, pMON264147 y pMON264166. Las plantas de maíz también se transformaron establemente con pMON264108 y pMON264206. Se llevó a cabo el análisis cualitativo y cuantitativo de expresión de GUS como se describe en el Ejemplo 2. Las plantas se ensayaron en estadios de desarrollo V4, V7 y VT. Se muestra el muestreo en R1 y R3. La tabla 9 muestra la media de expresión de GUS cuantitativa para las plantas de maíz transformadas establemente.
Como se muestra en la Tabla 9, todos los homólogos del promotor RCc3 eran capaces de dirigir la expresión del transgén de GUS en las plantas de maíz transformadas establemente. Adicionalmente, cada promotor tenía un patrón de expresión que era único del promotor específico. Por ejemplo, la expresión en flores/anteras en VT se diferenciaba entre los homólogos del promotor RCc3. La expresión dirigida por P-Td.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 17) era la más alta expresión observada de todos los promotores, mientras que la expresión dirigida por P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) era la más baja. Con respecto a la expresión en Mazorca/sedas en R1, el P-Td.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 17) presentaba la expresión más alta en estos tejidos y el P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) era el menos expresado. La expresión dirigida por P-Td.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 17) aumentaba en tejidos de desarrollo más tardío. La expresión aumentaba en las raíces desde el estadio V4 a VT y era incluso mayor en las flores/anteras en VT, mazorca/sedas en R1 y embrión de 21DAP y endospermo en R3. La expresión dirigida por P-Td.RCc3_3:1 era la más alta entre los homólogos del promotor RCc3 en flores/anteras en VT, mazorca/sedas en R1, y embrión de 21DAP y endospermo en R3.
Con respecto a la expresión en hojas y raíces, algunos homólogos del promotor RCc3 presentaban una expresión más alta en la raíz con respecto a las hojas. La Tabla 10 muestra las relaciones de expresión en raíces respecto a hojas para todos los promotores RCc3 ensayados.
Tabla 10. Relaciones de expresión en raíces/hojas para las plantas de maíz transformadas establemente.
Como se demuestra en la Tabla 10, cada homólogo del promotor RCc3 mostraba diferentes relaciones de la expresión en raíces respecto a hojas y diferentes patrones desde el estadio V4 a VT. Por ejemplo, el P-Cl.RCc3:3 (SEQ ID NO: 1) mantenía una relación similar de expresión desde V4 a VT con un ligero declive que se producía en el estadio V7. La expresión en las raíces como se ve en la Tabla 9 caía ligeramente desde V4 a V7, y luego aumentaba por el estadio VT. El promotor P-Ds.RCc3_3:1 (SEQ ID NO: 7) mostraba un cambio en las relaciones de expresión desde el estadio V4 al VT con una expresión más alta en las raíces con respecto a las hojas en el estadio V4 y V7 y luego un cambio que se aproximaba a la misma expresión en las hojas con respecto a las raíces en el estadio VT (1,25). Con este promotor la media de expresión que se muestra en la tabla 9, presentaba un aumento de la expresión en las hojas desde el estadio V4 al VT mientras que la expresión en las raíces disminuía desde el estadio V7 al VT. El promotor P-So.RCc3:2 (SEQ ID NO: 19) mantenía una relación de expresión en raíces respecto a hojas de 6,33 en el estadio V4 y 6,79 en V7, pero luego caía a 2,99 en el estadio VT. Sin embargo, la expresión con este promotor aumentaba 3,69 y 3,96 veces en las hojas y raíces respectivamente, desde el estadio V4 al V7 y luego disminuía a 2,33 y 1,10 con respecto al V4 en el estadio VT.
Extraordinariamente, no todos los promotores tenían una relación raíces respecto a hojas más alta. Por ejemplo, los promotores P-Ds.RCc3_1:1 (SEQ ID NO: 3) y P-Td.RCc3_1:1 (SEQ ID NO: 13) tenían relaciones raíces/hojas menores de uno en el estadio V4. Sin embargo, la expresión dirigida por P-Td.RCc3_1:1 era 6,6 veces mayor que la de P-Ds.RCc3_1:1 en raíces en V4. La relación más alta de raíces/hojas en el estadio V4 se alcanzaba utilizando el P-Td.RCc3_2:1 (SEQ ID NO: 15). La relación de la expresión en raíces/hojas dirigida por P-Ds.RCc3_1:1 aumentaba desde V4 (0,76) a V7 (2,95) y luego volvía a una relación similar a la de V4 (0,79).
El promotor P-MISgr.RCc3-2:2 (SEQ ID NO: 11) mostraba un aumento de expresión tanto en hojas como raíces desde
Claims (10)
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en:
a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17;
b) una secuencia de DNA que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17;
c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en la que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; y
en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN heteróloga que se puede transcribir comprende un gen de interés agronómico y en la que el gen de interés agronómico transmite tolerancia a los herbicidas o resistencia a las plagas en las plantas.
3. Una célula vegetal transgénica que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en:
a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17;
b) una secuencia de DNA que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17;
c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en la que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; y
en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
4. La célula vegetal transgénica de la reivindicación 3, en la que dicha célula vegetal transgénica es una célula vegetal de monocotiledónea o una célula vegetal de dicotiledónea.
5. Una planta transgénica, o parte de la misma, que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo que consiste en:
a) una secuencia de ADN con al menos un 95 por ciento de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17 de longitud completa, en la que la secuencia de ADN tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17;
b) una secuencia de DNA que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17;
c) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos contiguos de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15 y 17, en la que el fragmento tiene la actividad promotora de cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 15, y 17; y
en la que dicha secuencia está unida operativamente a una molécula de polinucleótido heteróloga que se puede transcribir.
6. Una planta de la progenie de la planta transgénica de la reivindicación 5, o una parte de la misma, en la que la planta de la progenie o parte de la misma comprende dicha molécula de ADN recombinante.
7. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 5, en la que la semilla comprende la molécula de ADN recombinante.
8. Un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende:
a) la transformación de una célula vegetal con la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1 para producir una célula vegetal transformada; y
b) la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.
9. La planta transgénica de la reivindicación 5, en la que dicha planta transgénica es una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea.
10. La planta transgénica de la reivindicación 9, en la que
(a) dicha planta es una planta monocotiledónea seleccionada de entre el grupo que consiste en Maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa), Trigo (Triticum), Cebada (Hordeum vulgare), Sorgo (Sorghum spp.), Mijo, Mijo perla (Pennisetum glaucum), Mijo de dedo (Eleusine coracana), Mijo común (Panicum miliaceum), Moha itálica (Setaria italica), Avena (Avena sativa), Triticale, Centeno (Secale cereale), Poáceas (Digitada), Cebollas (Allium spp.), Piñas
(Ananas spp.), Césped, Caña de azúcar (Saccharum spp.), Palmas (Arecaceae), Bambú (Bambuseae), Banana (Musaceae), la familia de Gengibre (Zingiberaceae), Lirios (Lilium), Narcisos (Narcissus), Iris (Iris), Amarilis, Orquídeas (Orchidaceae), Cañas, Jacintos (Hyacinthoides), y Tulipanes (Tulipa); o
(b) dicha planta es una planta dicotiledónea seleccionada de entre el grupo que consiste en Soja (Glycine max), Soja silvestre (Glycine soja), Algodón (Gossypium), Tomate (Solanum lycopersicum), Pimientas (Piper), Calabacines (Cucurbita), Guisante (Pisum sativum), Alfalfa (Medicago sativa), Medicago truncatula, Alubias (Phaseolus), Garbanzo (Cicerarietinum), Girasol (Helianthus annuus), Patata (Solanum tuberosum), Maní (Arachis hipogea), Quinoa, Trigo sarraceno (Fagopyrum esculentum), Algarrobo (onia siliqua), Remolacha (Beta vulgaris), Espinaca (Spinacia oleracea), y Pepino (Cucumis sativus).
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