JP2020110167A - 植物調節エレメントおよびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】植物における遺伝子発現を調節するのに有用な組換えＤＮＡ分子、コンストラクト、並びに、これらのヌクレオチド配列の提供。【解決手段】異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されたＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物部分、及び、種子、並びに、これらの使用。【選択図】なし

Description

（関連出願に対する参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月１４日出願の米国仮出願番号第６１／７８５，２４５号の利益を請求する。

（配列表の組み込み）
５４．４キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり、かつ２０１４年３月１２日に作成されたファイル名「ＭＯＮＳ３３１ＷＯ．ｔｘｔ」に含まれている配列表は、本明細書とともに電子提出によって出願され、参照により本明細書に組み込まれる。

（本発明の分野）
本発明は、植物における遺伝子発現を調節するのに有用な植物分子生物学、植物遺伝子工学、およびＤＮＡ分子の分野に関する。

調節エレメントは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節することによって遺伝子活性を調節する遺伝的要素である。このようなエレメントにはプロモーター、リーダー、イントロン、および３’非翻訳領域を含み、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野において有用である。

本発明は、植物における使用のための新規の遺伝子調節エレメント、ならびに当該調節エレメントを含む植物およびコンストラクトを提供する。本発明はまた、当該調節エレメントを含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物部分、および種子を提供する。一実施形態において、本発明は、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された、本明細書に開示される調節エレメントを提供する。ある実施形態において、当該転写可能なＤＮＡ分子は、本明細書に提供される調節配列に関して異種性である。また、当該調節エレメントを含むコンストラクト、ならびに当該調節エレメントに関して異種性である転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された当該調節エレメントを含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物部分、および種子を含む、本明細書に開示される調節エレメントを作製および使用するための方法も本明細書が提供される。

したがって、一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１〜２０のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜２０のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜２０のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供し、この中で、当該ＤＮＡ配列は、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。「異種性の転写可能なＤＮＡ分子」によって意図されるのは、当該転写可能なＤＮＡ分子が当該ＤＮＡ配列に関して異種性であることである。具体的な実施形態において、当該組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜２０のうちのいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも約８５％、少なくとも約８６％少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。詳細な実施形態において、当該異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、植物における除草剤抵抗性または病虫害抵抗性を提供することのできる遺伝子などの農学上関心対象の遺伝子を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、本明細書に提供されるような組換えＤＮＡ分子を含むコンストラクトを提供する。

別の態様において、本明細書に提供されるのは、（ａ）配列番号１〜２０のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜２０のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜２０のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、この中で、当該断片は遺伝子調節活性を有し、この中で当該ＤＮＡ配列は異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。ある実施形態において、当該トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態において、当該トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞である。

さらにまた別の態様において、本明細書にさらに提供されるのは、（ａ）配列番号１〜２０のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜２０のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜２０のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部分であって、この中で当該断片は遺伝子調節活性を有し、この中で当該ＤＮＡ配列は異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。具体的な実施形態において、当該トランスジェニック植物は、出発トランスジェニック植物に対する何らかの世代の子孫植物であり、当該組換えＤＮＡ分子を含む。生育した場合にこのようなトランスジェニック植物を作出する組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子も本発明によって提供される。

別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物から商品用産物を生産する方法を提供する。本発明の商品用産物は、検出可能な量の配列番号１〜２０を含有する。本明細書で使用する場合、「商品用産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物、植物部分、植物細胞、または種子に由来する材料から構成された何らかの組成物または生成物を指す。商品用産物には、加工した種子、穀粒、植物部分、および食品を含むが、これらに限定されない。本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物を使用して、植物から典型的に獲得される何らかの商品用産物を製造することができる。本発明の商品用産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する検出可能な量のＤＮＡを含有する。試料におけるこの組換えＤＮＡ分子のうちの１つ以上の検出は、商品用産物の含有量または源を測定するのに使用してもよい。本明細書に開示される検出方法を含むＤＮＡ分子のための何らかの標準的な検出方法を使用してもよい。

さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物を得てかつ当該植物を栽培することによってトランスジェニック植物における農学上関心対象の遺伝子などの転写可能なＤＮＡ分子を発現する方法を提供する。

また本明細書に提供されるのは、形質転換した植物細胞を産生するために本発明の組換えＤＮＡ分子を用いて植物細胞を形質転換すること、およびトランスジェニック植物を作出するために当該形質転換した植物細胞を再生することによってトランスジェニック植物を提供する方法である。

また本発明によって提供されるのは、コドンを再設計したエシェリカ・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列であり、この中で当該コドンを再設計したＧＵＳコード配列は、無損傷のＥ．ｃｏｌｉ ＧＵＳコード配列よりもトランスジェニック植物における高い発現を示す。一実施形態において、当該コドンを再設計したＧＵＳコード配列は、配列番号２９および３０からなる群から選択することができる。当該トランスジェニック植物は、単子葉植物であってもよい。一実施形態において、当該単子葉植物は、トウモロコシ（ギョクショクショ）、コメ（イネ）、コムギ（トリチカム属）、オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）（オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、モロコシ（モロコシ種）、アワ（Ｍｉｌｌｅｔ）、トウジンビエ（Ｐｅａｒｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、シコクビエ（Ｆｉｎｇｅｒ Ｍｉｌｌｅｔ）（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、 キビ（野生キビ）、アワ（Ｆｏｘｔａｉｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、カラスムギ（エンバク）、ライコムギ、ライムギ（Ｒｙｅ）（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、フォニオ（メヒシバ属）、タマネギ（ネギ種）、パイナップル（パイナップル種）、芝草、サトウキビ（サトウキビ種）、ヤシ（ヤシ科）、タケ（Ｂａｍｂｏｏ）（タケ（Ｂａｍｂｕｓｅａｅ））、バナナ(バショウ科)、ショウガ科（Ｇｉｎｇｅｒ ｆａｍｉｌｙ）（ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））、ユリ（ユリ属）、ラッパズイセン（スイセン属）、アイリス（Ｉｒｉｓｅｓ）（アイリス（Ｉｒｉｓ））、アマリリス（ラン科）、カンナ、ブルーベル（ヒアシントイデス属）、およびチューリップ（チューリップ属）からなる群から選択される。当該トランスジェニック植物はまた、双子葉植物であってもよい。一実施形態において、当該双子葉植物は、ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ）（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、ツルマメ（Ｗｉｌｄ Ｓｏｙｂｅａｎ）（ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ））、ワタ（ワタ属）、トマト（Ｔｏｍａｔｏ）（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、コショウ（コショウ属）、カボチャ（カボチャ属）、エンドウマメ（エンドウ）、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、タルウマゴヤシ、マメ（インゲンマメ属）、ヒヨコマメ（Ｃｈｉｃｋ ｐｅａ）（ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、ヒマワリ（Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ジャガイモ（バレイショ）、ピーナッツ（ラッカセイ）、キノア、ソバ（Ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）（ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、イナゴマメ（オニア・シリクア（ｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ））、テンサイ（サトウダイコン）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｈ）（ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ））、およびキュウリ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ）（キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））からなる群から選択される。

図１ａ〜図１ｃは、無傷のＥ．ｃｏｌｉβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ−１：１：４、配列番号３１）およびコドンを再設計したＥ．ｃｏｌｉ ＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＿ｎｎｏ−１：１：１、配列番号３０）の間の配列比較を示す。当該配列比較における同一のヌクレオチドは、星印によって示される。

（配列の簡単な説明）
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、および２３はプロモーター配列である。

配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４はリーダー配列である。

配列番号２５〜２８は増幅プライマー配列である。

配列番号２９および３０は、コドンを再設計したＧＵＳコード配列である。配列番号２９は加工可能なイントロンを含むのに対し、配列番号３０は連続したコード配列である。

配列番号３１は、無傷の大腸菌β−グルクロニダーゼコード配列である。

配列番号３２は、配列番号３１の無傷のＥ．ｃｏｌｉのβグルクロニダーゼを基にした加工可能なイントロンを有するＧＵＳコード配列である。

配列番号３３、３９および４０は、３’ＵＴＲ配列である。

配列番号３４〜３７、４１および４４は、イントロン配列へ操作可能に５’で連結されたリーダー配列へ操作可能に５’で連結されたプロモーター配列、または、配列番号４４の場合、リーダー配列へ操作可能に５’で連結されたプロモーター配列のいずれかを含む、転写調節発現エレメント群（ＥＸＰ）の配列である。

配列番号３８は、イントロン配列である。

配列番号４２および４４はそれぞれ、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のルシフェラーゼタンパク質についてのコード配列である。

本発明は、植物における遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は配列番号１〜２０として提供される。これらのＤＮＡ分子は、例えば、植物組織における操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響することができ、それゆえ、トランスジェニック植物において操作可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節する。本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物部分および種子を含む組成物、ならびにこれらを調製および使用するための方法を提供する。

以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するよう、および本発明の実施において当業者を誘導するよう提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野における当業者による従来の使用法に従って理解されることになっている。

（ＤＮＡ分子）
本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」は、ゲノム起源または合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の重合体を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用する命名法は、合衆国法典の特許、商標および著作権に関する連邦規則第１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、補遺２、表１および表３における表に示されている。

本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介在無しでは互いに天然に生じることがないであろうＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに関して異種性の少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されたＤＮＡ分子、天然に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換によって宿主細胞のＤＮＡへと組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。

本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」とは、２つの最適に整列したポリヌクレオチド配列または２つの最適に整列したポリペプチド配列が同一である程度を指す。最適な配列整列化は、２つの配列、例えば、基準配列および別のＤＮＡ配列を手動で整列させて、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、または間隙を伴う配列整列化におけるヌクレオチドの一致数を最大限にすることによってなされる。本明細書で使用する場合、用語「基準配列」とは、配列番号１〜２０として提供されたＤＮＡ配列を指す。

本明細書で使用する場合、用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「％同一性」とは、１００を乗じられた同一性分率である。基準配列と最適に整列した配列についての「同一性分率」とは、基準配列におけるヌクレオチドの総数、例えば完全な基準配列の全長におけるヌクレオチドの総数によって除された最適な整列化におけるヌクレオチド一致数である。したがって、本発明の一実施形態は、配列番号１〜２０として本明細書に提供される基準配列に対して最適に整列した場合に、基準配列と少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％の同一性、少なくとも約８７％の同一性、少なくとも約８８％の同一性、少なくとも約８９％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、または少なくとも約１００％の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子を提供する。

（調節エレメント）
プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、および転写終結領域（もしくは３’ＵＴＲ）などの調節エレメントは、生細胞における遺伝子の全体的な発現における統合部分を担っている。用語「調節エレメント」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。用語「遺伝子調節活性」とは、本明細書で使用する場合、例えば操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響することによって、当該操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響する能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロンおよび３’ＵＴＲなどの調節エレメントはそれゆえ、遺伝子工学を通じて植物の表現型を修飾するのに有用である。

本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの操作可能に連結された調節エレメントの群を指してもよい。したがって、調節発現エレメント群は、例えば、リーダー配列へ５’で操作可能に連結されたプロモーターから構成されてもよく、これが順にイントロン配列へ５’で操作可能に連結される。

調節エレメントは、その遺伝子発現パターン、例えば、恒常的な発現または時間的、空間的、発達上の、組織の、環境の、生理学的、病理学的、細胞周期の、および／もしくは化学的に応答性のある発現、ならびにこれらの何らかの組み合わせによって、ならびに定量的もしくは定性的なによって示度によって特徴づけられることがある。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、操作可能に連結されたＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子への転写に関する何らかのパターンである。転写されたＲＮＡ分子は、タンパク質分子を生成するよう翻訳されもよく、またはアンチセンス分子もしくは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびこれらに類するものなど、他の調節ＲＮＡ分子を提供してもよい。

本明細書で使用する場合、用語「タンパク質発現」とは、転写されたＲＮＡ分子からタンパク質分子への翻訳に関する何らかのパターンである。タンパク質発現は、時間的、空間的、発達上の、もしくは形態学的な量によって、および定量的もしくは定性的な示度によって特徴づけられてもよい。

プロモーターは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは概して、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび、トランス作用型転写因子などの他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から生じ得る。あるいは、プロモーターは、合成で生成されたまたは操作されたＤＮＡ分子であってもよい。プロモーターはまた、キメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種性ＤＮＡ分子の融合を通じて生成される。本発明を実施する上で有用なプロモーターには、その断片またはバリアントを含む配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９を含む。本発明の具体的な実施形態において、このようなＤＮＡ分子および本明細書に説明されるようなその何らかのバリアントまたは誘導体は、プロモーター活性を含むものとしてさらに定義されてもよく、すなわち、トランスジェニック植物などにおける宿主細胞におけるプロモーターとして作用することができる。さらなる具体的な実施形態において、断片は、由来する出発プロモーター分子によって有されるプロモーター活性を呈示するものとして定義してもよく、または断片は、基本レベルの転写を提供しかつ転写の開始のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩの認識および結合のためのＴＡＴＡボックスまたは等価のＤＮＡ配列から構成された「最小プロモーター」を含んでもよい。

一実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター配列の断片が提供される。プロモーター断片は、先に説明したようにプロモーター活性を含んでいてもよく、単独で、またはキメラプロモーターを構築するなどの上で他のプロモーターおよびプロモーター断片と組み合わせで有用であってもよい。具体的な実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター活性を有するポリヌクレオチド分子の少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチドまたはそれより長いものを含むプロモーターの断片が提供される。このような断片を出発プロモーター分子から生成するための方法は、当該技術分野で周知である。

内部のもしくは５’の欠失など、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として呈されるプロモーターのうちの何らかに由来する組成物は、例えば、発現に及ぼす正もしくは負のいずれかの効果を有する要素を除去すること、発現に及ぼす正もしくは負の効果を有する要素を複製すること、および／または発現に及ぼす組織特異的もしくは細胞特異的な効果を有する要素を複製もしくは除去することによって発現を改善もしくは変更するために、当該技術分野で公知の方法を用いて生成することができる。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその等価の配列および下流の配列が除去された３’での欠失から構成された、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として呈されるプロモーターのうちのいずれかに由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作ることができる。さらなる欠失は、発現に及ぼす正もしくは負の、組織特異的、細胞特異的、もしくはタイミング特異的（概日リズムなどだがこれに限定されない。）な効果を有する何らかのエレメントを除去するために行うことができる。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として呈されるプロモーターのうちの何らか、およびそこから由来する断片もしくはエンハンサーを使用して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として呈されるプロモーターならびにそこから由来し他のエンハンサーおよびプロモーターへ操作可能に連結された断片もしくはエンハンサーのうちの何らかから構成されるキメラ転写調節エレメント組成物を作ることができる。

本発明に従って、プロモーターまたはプロモーター断片は、公知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび他の公知の転写因子結合部位モチーフなどの、ＤＮＡ配列特徴の存在について分析されてもよい。このような公知のプロモーターエレメントの識別は、元のプロモーターと類似の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために、当業者によって使用されてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「リーダー」とは、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）由来のＤＮＡ分子を指し、概して、転写出発部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列出発部位の間のヌクレオチドセグメントとして定義される。あるいは、リーダーは、合成で生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための５’調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子は、異種性のプロモーターとともにまたはその天然のプロモーターとともに使用してもよい。本発明のプロモーター分子はしたがって、その無傷のリーダーへ操作可能に連結されてもよく、または異種性のリーダーへ操作可能に連結されてもよい。本発明を実施する上で有用なリーダーには、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０またはその断片もしくはバリアントを含む。具体的な実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、例えば、トランスジェニック植物細胞を含む宿主細胞におけるリーダーとして作用することができるものとして定義してもよい。一実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、リーダー活性を含むものとして解読される。

配列番号２，４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０として呈されるリーダー配列（５’ＵＴＲ）は、調節エレメントから構成されてもよく、または操作可能に連結されたＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に及ぼす効果を有することのできる二次構造を採用してもよい。配列番号２，４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０として呈されるリーダー配列は本発明に従って使用して、操作可能に連結されたＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に影響するキメラ調節エレメントを作ることができる。加えて、配列番号２，４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０として呈されるリーダー配列を使用して、操作可能に連結されたＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に影響するキメラリーダー配列を作ることができる。

本明細書で使用する場合、用語「イントロン」とは概して、遺伝子から識別されてもよくかつ翻訳の前に伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシングの間にスプライスして外れる領域として定義されてもよいＤＮＡ分子を指す。あるいは、イントロンは、合成で生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして使用してもよい。コンストラクトはイントロンを含んでいてもよく、当該イントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に関して異種性であってもよくまたは異種性でなくてもよい。当該技術分野におけるイントロンの例として、コメアクチンイントロンおよびトウモロコシＨＳＰ７０イントロンがある。

植物において、遺伝子コンストラクトにおけるいくつかのイントロンの包含は、当該イントロンを欠失するコンストラクトと比較して高いｍＲＮＡおよびタンパク質の蓄積をもたらす。この効果は、遺伝子発現の「イントロン仲介性亢進」（ＩＭＥ）と呼ばれる（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：９１３〜９２０，１９９０）。植物における発現を刺激することが公知のイントロンは、トウモロコシ遺伝子において（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、およびＵｂｉ１）、コメ遺伝子において（例えば、ｔｐｉ）、ならびにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ−ｌｓ１）由来およびシロイヌナズナ（例えば、ｕｂｑ３およびｐａｔ１）由来のもののような双子葉植物遺伝子においてすでに識別されている。イントロンのスプライシング部位内の欠失もしくは突然変異が遺伝子発現を低下させることはすでに示されており、このことは、スプライシングがＩＭＥに必要かもしれないことを示す。しかしながら、双子葉植物におけるＩＭＥがシロイヌナズナ由来のｐａｔ１遺伝子のスプライシング部位内の点突然変異によって示されているので、スプライシングはそれ自体、必要ではないのかもしれない。１つの植物における同じイントロンの複数回使用は、不利を呈することが示されている。それらの場合において、適切な組換えＤＮＡエレメントの構築のための基本制御エレメントの収集を有することは必要である。

本明細書で使用する場合、本明細書における用語「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡ分子の３’部分の非翻訳領域への転写中に使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的開裂およびポリＡ尾部としても公知の３’ポリアデニル化によって生じてもよい。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されて当該ＤＮＡ分子の下流に位置してもよく、ポリアデニル化シグナルおよび転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響することにできる他の調節シグナルを含んでもよい。ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの安定性において、および翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼの３’領域、コムギｈｓｐ１７の３’領域、エンドウマメリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットの３’領域、ワタＥ６の３’領域、およびコイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）の３’ＵＴＲである。

３’ＵＴＲによって、典型的には、特異的ＤＮＡ分子の組換え発現のための有益な使用が見出される。弱い３’ＵＴＲは、リードスルーを生じる能力を有し、このことは、隣接する発現カセットに位置するＤＮＡ分子の発現に影響するかもしれない。転写終止の適切な制御は、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防止することができ、さらに、ＲＮＡポリメラーゼの効率的な再利用が遺伝子発現を改善することを可能にすることができる。転写の効率的な終止（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開のための前提条件であり、それにより全体的な転写レベルに直接影響する。転写終結の後、成熟ｍＲＮＡは、合成部位から放出され、テンプレートは細胞質へと輸送される。真核生物ｍＲＮＡは、インビボでポリ（Ａ）形態として蓄積され、そのことによって、従来の方法によって転写終結部位を検出することは困難となる。さらに、バイオインフォマティクス法による機能的かつ効率的な３’ＵＴＲの予測は、有効な３’ＵＴＲの容易な予測を許容するであろう保存されたＤＮＡ配列がない点で困難である。

実務的な見地から、発現カセットにおいて使用される３’ＵＴＲが次の特徴を有することは典型的には有益である。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子の転写を効率的かつ有効に終結することができるべきであり、かつある転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）、またはＴ−ＤＮＡが挿入した隣接する染色体ＤＮＡに存在する多重発現カセットにおけるような別の発現カセットから構成することのできる何らかの隣接するＤＮＡ配列への転写産物のリードスルーを防止することができるべきである。３’ＵＴＲは、当該ＤＮＡ分子の発現を駆動するのに使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、およびイントロンによって与えられる転写活性における低下を生じるべきではない。植物生物工学において、３’ＵＴＲはしばしば、形質転換した植物から抽出される逆転写したＲＮＡの増幅反応の刺激に使用され、かつ（１）植物染色体へ一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価するために、（２）当該植物ＤＮＡ内の挿入のコピー数を評価するために、および（３）育種後に結果として生じる種子の接合状態を評価するために使用される。３’ＵＴＲはまた、挿入されたカセットの無傷性を特徴づけるために、形質転換された植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応において使用される。

本明細書で使用する場合、用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」とは、全体的な発現パターンの態様を与えるが、操作可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を駆動するために単独では通常不十分な、シス作用性調節エレメント、別名シスエレメントを指す。プロモーターと違い、エンハンサーエレメントは通常、転写開始部位（ＴＳＳ）あるいはＴＡＴＡボックスまたは等価のＤＮＡ配列を含まない。プロモーターまたはプロモーター断片は、操作可能に連結されたＤＮＡ配列の転写に影響する１つ以上のエンハンサーエレメントを天然に含んでもよい。エンハンサーエレメントはまた、プロモーターへ融合してキメラプロモーターシスエレメントを生成してもよく、このことが遺伝子発現の全体的な調節の態様を与える。

多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質を結合しおよび／またはＤＮＡトポロジーに影響すると考えられており、ＤＮＡテンプレートへのＲＮＡポリメラーゼのアクセスを選択的に許容または制限し、あるいは転写開始部位における二重らせんの選択的開口を容易にする局所的なコンフォメーションを生じる。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子を結合するよう機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは、１つを超える転写因子を結合し、転写因子は、１つを超えるエンハンサードメインと異なる親和性で相互作用し得る。エンハンサーエレメントは、欠失分析、すなわち５’末端からまたはプロモーターに対して内部の１つ以上のヌクレオチドを欠失すること、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法を用いるＤＮＡ結合タンパク質分析、メチル化干渉、電気泳動移動度−シフトアッセイ、ライゲ―ション仲介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるインビボでのゲノムフットプリント法、および他の従来のアッセイを含むいくつかの技術によって、あるいはＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法を用いて標的配列または標的モチーフとして公知のシスエレメントモチーフまたはエンハンサーエレメントを用いるＤＮＡ配列類似性分析によって識別することができる。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの突然変異誘発（または置換）によって、または当該技術分野で公知の他の従来法によってさらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成によってまたはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの分離によって得ることができ、当該エレメントは、有用な制限酵素部位を含有してその後の操作を容易にする追加的な隣接するヌクレオチドを用いて合成することができる。したがって、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための、本明細書に開示される方法によるエンハンサーエレメントの設計、構築、および使用は、本発明によって包含される。

本明細書で使用する場合、用語「キメラの」とは、第一のＤＮＡ分子を第二のＤＮＡ分子と融合させることによって生成される単一のＤＮＡ分子を指し、ここで、第一のＤＮＡ分子も第二のＤＮＡ分子もその立体配置で正常に見られず、すなわち、もう一方に融合している。キメラＤＮＡ分子はしたがって、天然では通常含有されない新たなＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、用語「キメラプロモーター」とは、ＤＮＡ分子のこのような操作を通じて生成されるプロモーターを指す。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡ断片、例えば、プロモーターのエンハンサーエレメントへの融合を組み込んでもよい。したがって、操作可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現を調節するための本明細書に開示される方法によるキメラプロモーターの設計、構築、および使用は、本発明によって包含される。

本明細書で使用する場合、用語「バリアント」とは、第一のＤＮＡ分子と組成においては類似しているが同一ではない、調節エレメントなどの第二のＤＮＡ分子を指し、この中で第二のＤＮＡ分子は、第一のＤＮＡ分子の一般的な機能性、すなわち同じまたは類似の発現パターンをなおも維持する。バリアントは、第一のＤＮＡ分子の短くなったもしくは先端を切ったバージョンならびに／あるいは、異なる制限酵素部位を有するものおよび／または内部の欠失、置換、および／もしくは挿入を有するもの第一のＤＮＡ分子のＤＮＡ配列の変化したバージョンであってもよい。調節エレメントの「バリアント」はまた、細菌細胞および植物細胞の形質転換において天然に生じる突然変異から生じるバリアントを包含する。本発明において、配列番号１〜２０として提供されるＤＮＡ配列を使用して、元の調節エレメントの一般的な機能性、すなわち同じまたは類似の発現パターンをなおも維持しながら、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成では類似しているが当該ＤＮＡ配列と同一ではないバリアントを作製してもよい。本発明のこのようなバリアントの生成は、本開示の点において当該技術分野の通常の技術内に十分あり、および本発明の範囲内に包含される。

キメラ調節エレメントは、制限酵素切断およびライゲ―ション、ライゲ―ション非依存性クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュール組み立て、または調節エレメントの直接的な化学合成などの当該技術分野で公知の種々の方法、ならびに当該技術分野で公知の他の方法によって操作上連結されてもよい種々の構成因子エレメントを含むよう設計することができる。結果として生じる種々のキメラ調節エレメントは、当該キメラ調節エレメント、またはそのバリアントからなることができるが、構成因子エレメントは、構成因子部分が操作上連結できる連結している１つのもしくは複数のＤＮＡ配列を含む１つのもしくは複数のＤＮＡ配列において異なる。本発明において、配列番号１〜２０として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント基準配列を提供し得、この中で、当該基準配列を含む構成因子エレメントは、当該技術分野で公知の方法によって接合してもよく、ならびに１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／もしくは挿入、または細菌細胞および植物細胞の形質転換において天然に生じる突然変異を含んでもよい。

特定の導入遺伝子の所望の発現態様に及ぼす、本明細書に説明される修飾、重複または欠失の効力は、結果を確証するために本明細書の作業実施例において説明されるものなど、安定したおよび一過性の植物アッセイにおいて経験的に検査してもよく、当該結果は、出発ＤＮＡ分子においてなされた変化および変化の目標に応じて変わり得る。

（コンストラクト）
本明細書で使用する場合、用語「コンストラクト」とは、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子へ、機能的に操作する様式で連結された、すなわち操作可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、何らかの源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子などの、何らかの組換えＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、形質転換、すなわち、異種性ＤＮＡまたはＲＮＡの宿主細胞への導入の目的に使用してもよい何らかのコンストラクトを意味する。コンストラクトには典型的には、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーターおよび３’ＵＴＲへ操作可能に連結された少なくとも転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。

本明細書で使用する場合、用語「操作可能に連結された」とは、第二のＤＮＡ分子へ結合した第一のＤＮＡ分子を指し、この中で当該第一のおよび第二のＤＮＡ分子は、当該第一のＤＮＡ分子が当該第二のＤＮＡ分子の機能に影響するよう配置される。当該２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部であってもよくまたはそうでなくてもよく、隣接していてもよくまたはそうでなくてもよい。例えば、プロモーターは、細胞における関心対象の転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節する場合、当該転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響することができる場合、当該ＤＮＡ配列へ操作可能に連結されている。

本発明のコンストラクトは、一実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって提供される転移分子とともに、植物細胞のゲノムへのＴ−ＤＮＡの組み込みを可能にするＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスから単離された二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドの右の太線領域（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）および左の太線領域（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）を有するＴｉプラスミド境界コンストラクトとして提供してもよい（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照されたい。）。当該コンストラクトはまた、細菌細胞における複製機能および抗生物質選択を提供するプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、大腸菌のｏｒｉ３２２などの複製起点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広範な宿主範囲の複製起点、およびスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシン、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択的マーカー遺伝子に対する耐性を与えるＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）についてコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択可能なマーカーについてのコード領域を含有してもよい。植物の形質転換については、宿主細菌株はしばしば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物の形質転換に関する当業者に公知の他の株は、本発明において機能することができる。

転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳および発現する機能的ｍＲＮＡ分子へと転写されるような様式で、コンストラクトを組み立てて細胞へと導入するための方法は、当該技術分野で公知である。本発明の実施のために、コンストラクトおよび宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者に周知である。より高次の植物における核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当該技術分野で周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドおよびｐＣａＭＶＣＮ転移制御ベクターに由来するベクターを含む。

種々の調節エレメントは、本明細書に提供されるもののうちの何らかを含むコンストラクトに含まれてもよい。このような何らかの調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供してもよい。このような組み合わせは、望ましい調節特徴を生じるよう設計または改変することができる。一実施形態において、本発明のコンストラクトは、３’ＵＴＲへ操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む。

本発明のコンストラクトは、本明細書に提供されるまたは当該技術分野で公知の何らかのプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。例えば、本発明のプロモーターは、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するものなど、異種性の非翻訳の５’リーダーへ操作可能に連結されてもよい。あるいは、本発明のリーダーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写プロモーターなどの異種性プロモーターへ操作可能に連結してもよい。

発現カセットはまた、特に葉緑体、白色体、もしくは他のプラスミド小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液泡、または細胞外位置へ操作可能に連結されたタンパク質の細胞内標的化に有用なペプチドをコードする移行ペプチドコード配列を含んでもよい。多くの葉緑体局在性タンパク質は、前駆体として核遺伝子から発現し、葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体へ標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、リブロース−１，５，−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドリダクターゼ、光収穫複合体タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキマートホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）と結合しているものを含むが、これらに限定されない。葉緑体移行ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号に説明されている。非葉緑体タンパク質が、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子へ操作可能に連結された異種性ＣＴＰの発現によって、葉緑体へ標的化されてもよいことは実証されている。

（転写可能なＤＮＡ分子）
本明細書で使用する場合、用語「転写可能なＤＮＡ分子」とは、タンパク質コード配列を有するものおよび遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を生成するものを含むがこれらに限定されない、ＲＮＡ分子へ転写することのできる何らかのＤＮＡ分子を指す。ＤＮＡ分子の種類には、同じ植物由来のＤＮＡ分子、別の植物由来のＤＮＡ分子、異なる生体由来のＤＮＡ分子、あるいは遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ分子または導入遺伝子の人工的な、合成の、もしくは修飾されたバージョンをコードするＤＮＡ分子などの合成ＤＮＡ分子を含むことができるが、これらに限定されない。本発明のコンストラクトへの組み込みのための例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれた種以外の種に由来するＤＮＡ分子または遺伝子、あるいは、同じ種に由来するもしくは存在するが、古典的な育種技術よりもむしろ遺伝子工学法によって受け手細胞へと組み込まれる遺伝子を含む。

「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノムにおけるその位置に関する宿主細胞に対して異種性の転写可能なＤＮＡ分子、および／または当該細胞の現行世代もしくは何らかの先行世代における宿主細胞のゲノムへ人工的に組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。

本発明のプロモーターなどの調節エレメントは、当該調節エレメントに関して異種性である転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結してもよい。本明細書で使用する場合、用語「異種性の」とは、２つ以上のＤＮＡ分子の組み合わせが通常では天然に認められない場合のこのような組み合わせを指す。例えば、当該２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来してもよく、および／または当該２つのＤＮＡ分子は、異なる遺伝子、例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子に由来してもよい。調節エレメントはしたがって、このような組み合わせが通常天然では認められない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が調節エレメントへ操作可能に連結されるのが天然では生じない場合、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に関して異種性である。

転写可能なＤＮＡ分子は概して、転写産物の発現が所望の何らかのＤＮＡ分子であってもよい。このような転写産物の発現は結果的に、結果的として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、したがってタンパク質の発現を生じてもよい。あるいは例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、特異的な遺伝子もしくはタンパク質の発現低下を究極的に生じるよう設計してもよい。一実施形態において、このことは、アンチセンス方向に向いている転写可能なＤＮＡ分子を用いることによって達成してもよい。当業者は、このようなアンチセンス技術を用いることに精通している。何らかの遺伝子はこの様式で負に調節されてもよく、一実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現を通じての特異的な遺伝子の抑制について設計してもよい。

したがって、本発明の一実施形態は、当該コンストラクトがトランスジェニック植物細胞のゲノムに組み込まれる場合に所望の水準でまたは所望のパターンで転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節するよう、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された、配列番号１〜２０として提供されるものなどの、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。一実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のアンチセンス領域を含む。

（農学上関心対象の遺伝子）
転写可能なＤＮＡ分子は、農学上関心対象の遺伝子であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「農学上関心対象の遺伝子」とは、特定の植物の組織、細胞、または細胞型において発現した場合に所望の特徴を与える、転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学上関心対象の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学的状態、生育、発達、収量、穀粒組成、栄養特性、疾患もしくは病害虫への抵抗性、および／または環境上のもしくは化学的な耐性に及ぼす効果を生じるために、当該植物内で作用してもよく、あるいは、当該植物において供給する病害虫の食餌における殺虫薬として作用してもよい。本発明の一実施形態において、本発明の調節エレメントは、農学上関心対象の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子へ調節エレメントが操作可能に連結されるよう、コンストラクトへと組み込まれる。このようなコンストラクトを含有するトランスジェニック植物において、農学上関心対象の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を与えることができる。有益な農学的形質には、除草剤耐性、昆虫駆除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物の生育および発達、改変されたデンプン含有量、改変された含油量、改変された脂肪酸含有量、改変されたタンパク質含有量、改変された果実成熟、亢進した動物およびヒトの栄養状態、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬ペプチド、改善されたプロセシングの質、改善された風味、複合種子産生有用性、改善された繊維産生、ならびに所望のバイオ燃料産生を含んでもよいがこれらに限定されない。

当該技術分野で公知の農学上関心対象の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号、第６，４４８，４７６号、第６，２４８，８７６号、第６，２２５，１１４号、第６，１０７，５４９号、第５，８６６，７７５号、第５，８０４，４２５号、第５，６３３，４３５号、および第５，４６３，１７５号）、収量の増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号、第６，７１６，４７４号、第６，６６３，９０６号、第６，４７６，２９５号、第６，４４１，２７７号、第６，４２３，８２８号、第６，３９９，３３０号、第６，３７２，２１１号、第６，２３５，９７１号、第６，２２２，０９８号、および第５，７１６，８３７号）、昆虫駆除（米国特許第６，８０９，０７８号、第６，７１３，０６３号、第６，６８６，４５２号、第６，６５７，０４６号、第６，６４５，４９７号、第６，６４２，０３０号、第６，６３９，０５４号、第６，６２０，９８８号、第６，５９３，２９３号、第６，５５５，６５５号、第６，５３８，１０９号、第６，５３７，７５６号、第６，５２１，４４２号、第６，５０１，００９号、第６，４６８，５２３号、第６，３２６，３５１号、第６，３１３，３７８号、第６，２８４，９４９号、第６，２８１，０１６号、第６，２４８，５３６号、第６，２４２，２４１号、第６，２２１，６４９号、第６，１７７，６１５号、第６，１５６，５７３号、第６，１５３，８１４号、第６，１１０，４６４号、第６，０９３，６９５号、第６，０６３，７５６号、第６，０６３，５９７号、第６，０２３，０１３号、第５，９５９，０９１号、第５，９４２，６６４号、第５，９４２，６５８号、第５，８８０，２７５号、第５，７６３，２４５号、および第５，７６３，２４１号）、菌類病抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号、第６，５７３，３６１号、第６，５０６，９６２号、第６，３１６，４０７号、第６，２１５，０４８号、第５，５１６，６７１号、第５，７７３，６９６号、第６，１２１，４３６号、第６，３１６，４０７号、および第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号、第６，６０８，２４１号、第６，０１５，９４０号、第６，０１３，８６４号、第５，８５０，０２３号、および第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物の生育および発達（米国特許第６，７２３，８９７号および第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号、第６，５３８，１７９号、第６，５３８，１７８号、第５，７５０，８７６号、第６，４７６，２９５号）、改変された産油性（米国特許第６，４４４，８７６号、第６，４２６，４４７号、および第６，３８０，４６２号）、高い産油性（米国特許第６，４９５，７３９号、第５，６０８，１４９号、第６，４８３，００８号、および第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含有量（米国特許第６，８２８，４７５号、第６，８２２，１４１号、第６，７７０，４６５号、第６，７０６，９５０号、第６，６６０，８４９号、第６，５９６，５３８号、第６，５８９，７６７号、第６，５３７，７５０号、第６，４８９，４６１号、および第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、高い動物およびヒトの栄養状態（米国特許第６，７２３，８３７号、第６，６５３，５３０号、第６，５４１２，５９号、第５，９８５，６０５号、および第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号、第６，２２８，６２３号、および第５，９５８，７４５号、および第６，９４６，５８８号）、環状ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、第６，７７４，２８３号、第６，１４０，０７５号、および第６，０８０，５６０号）、改善されたプロセシング形質（米国特許第６，４７６，２９５号）、改善された消化性（米国特許第６，５３１，６４８号）低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、産業用酵素産物（米国特許第５，５４３，５７６号）、改善された風味（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、複合種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号、第６，２７１，４４３号、第５，９８１，８３４号、および第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）のためのものがある。

あるいは、農学上関心対象の遺伝子は、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号を参照されたい）、阻害性ＲＮＡ（例えば、公開された出願Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８およびＵ．Ｓ．２００８／００６６２０６において、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号において説明されるようなｍｉＲＮＡ仲介性、ｓｉＲＮＡ仲介性、トランス作用性ｓｉＲＮＡ仲介性、および段階的なｓＲＮＡ仲介性の機序による遺伝子発現の調節を含む、「ＲＮＡｉ」）、または共抑制仲介性機序によって内在性遺伝子の遺伝子発現の標的化された調節を生じるＲＮＡ分子をコードすることによって、先に記載した植物の特徴または表現型に影響することができる。当該ＲＮＡはまた、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を開裂するよう操作された触媒性ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ、例えば、Ｕ.Ｓ. ２００６／０２００８７８を参照されたい）であり得る。遺伝子抑制を生じることのできる分子へと転写可能なＤＮＡ分子が転写されるような様式で、コンストラクトを構築して細胞へと導入するための方法は、当該技術分野で公知である。

植物細胞における転写可能なＤＮＡ分子の発現はまた、植物細胞における植物病害虫摂餌を抑制するのに使用することができ、例えば、甲虫類病害虫から単離された組成物および先週病害虫から単離された組成物である。植物病害虫としては、節足動物病害虫、線虫病害虫、および真菌病害虫もしくは微生物病害虫があるが、これらに限定されない。

（選択可能なマーカー）
選択可能なマーカー導入遺伝子はまた、本発明の調節エレメントともに使用してもよい。本明細書で使用する場合、用語「選択可能なマーカー導入遺伝子」とは、トランスジェニック植物、組織または細胞における発現あるいはその欠失がいくつかの方法でスクリーニングされ、または点数化することのできる何らかの転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施における使用のための選択可能なマーカー遺伝子ならびにその関連する選択およびスクリーニングの技術は、当該技術分野で公知であり、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を与えるタンパク質、および除草剤耐性を与えるタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。

（β−グルクロニダーゼ）
大腸菌Ｋ−１２から単離されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は、植物生物工学においてもっとも広範に使用されるリポート遺伝子のうちの１つである。大腸菌ＧＵＳ遺伝子ｕｉｄＡは、細菌染色体上のＧＵＳオペロンの一部である。ｕｉｄＡは、広範な種々のβ−Ｄ−グルクロニドによって誘導される。当該ＧＵＳ酵素は、β−Ｄ−グルクロニドからＤ−グルクロン酸およびアグリコンへの加水分解を触媒するエキソヒドロラーゼである。大腸菌は、ヒトを含む脊椎動物の消化管の中で生きている。脊椎動物は、グルクロン酸抱合経路を利用して、薬物動態ならびにステロイド類、脂肪族アルコール類、フェノール類、カルボン酸類、糖類および種々の他の代謝産物などの内在性廃棄化合物を解毒する。グルクロン酸抱合は、Ｄ−グルクロン酸との共役を包含する。このことは主として肝臓で生じるが、腎臓、副腎、および消化管などの他の組織および器官においても生じる。グルクロン酸は、大腸菌によって炭素およびエネルギーのための主要源として利用することができる。大腸菌ＧＵＳタンパク質はそれゆえ、当該細菌が脊椎動物の消化管におけるグルクロン酸抱合経路の産物を分解してグルクロン酸を炭素およびエネルギーの源として生じることができる手段を提供する。またＧＵＳ酵素によって遊離するアグリコンは概して、当該細菌によって分解されるだけでなく、Ｄ−グルクロン酸のためのシャトルとしても利用される（Ｇｉｌｉｓｓｅｎら，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７：１５７〜１６３，１９９８）。

リポーターとしての大腸菌β−グルクロニダーゼ遺伝子の使用は、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：８４４７〜８４５１，１９８６）によって最初に説明され、その導入以来最初に説明されたのとほぼ同じ様式で使用されてきた。当該ＧＵＳ遺伝子は、植物遺伝子発現をモニターするのに使用され、プロモーターまたは他の発現エレメントを特徴づけるのに頻繁に採用される。しかしながら、いくつかの植物プロモーターは非常に低水準で発現するので、ＧＵＳ系アッセイを用いて検出することはできないことがある。これらの比較的低く発現するプロモーターは、改善された収量などの所望の発現型を有するトランスジェニック作物の開発に価値があるかもしれない。

トランスジェニック作物植物の開発において初期には、高い恒常的発現を提供するプロモーターが最も望まれていた。カリフラワーモザイクウイルスおよびゴマノハグサモザイクウイルスなどの植物ウイルスゲノムに由来するこれらの高い恒常的プロモーターを使用して、除草剤耐性または昆虫抵抗性を与える導入遺伝子を駆動した。植物生物工学の分野が複雑性を増すにつれ、より特異的な発現パターンまたはより低水準の発現を必要とするさらに新たなトランスジェニック形質が開発中である。不適切な植物組織における過剰発現または発現は、形質転換した植物における望ましくない効果をもたらす可能性がある。例えば、植物における酵素遺伝子の異所性発現（生体の異常な場所における遺伝子の発現）は結果的に、代謝経路の分岐点における前駆体の不足により、所望の最終産物の減少を生じる可能性がある（Ｉｗａｓｅら，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：２９〜３８，２００９）。

転写因子（ＴＦ）は、細胞内過程の主要調節因子として天然に作用するので、ＴＦは、作物植物における複雑な形質を改変するための優れた候補であると期待され、ＴＦ系の技術は、好結果の生物工学作物に関する次世代の傑出した部分であるようである。ＴＦ技術はしばしば、生育遅滞などの望ましくない副作用を低下させるため、または所望の形質を商業的価値がある水準まで高めるためのいずれかのために最適化を必要とする。最適化はしばしば、ＴＦ導入遺伝子の発現を改変することによってアプローチされる。通常の恒常的プロモーターよりもむしろ、組織特異的、発達上の、または誘導性のプロモーターは、導入遺伝子の発現を適切な組織または環境条件に制限するのに利用することができる（Ｃｅｎｔｕｒｙら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１４７：２０〜２９，２００８）。

これらの開発に一部起因して、所望の発現水準および発現パターンを提供する発現エレメントを識別するために、発現エレメント特徴づけのためのより感度のあるアッセイが必要である。本発明は、プロモーターへ操作可能に連結された場合に、当該技術分野で通常使用される天然の大腸菌ＧＵＳコード配列よりも良好に発現する、改善されコドンの再設計されたＧＵＳコード配列を提供する。この改善されコドンの再設計されたＧＵＳコード配列を使用して、定量的および定性的の両方でより優れたアッセイ感度を提供することができ、天然の大腸菌ＧＵＳコード配列では不可能であり得る、プロモーターおよび他の発現エレメントの特徴づけが可能となる。改善されコドンの再設計されたＧＵＳコード配列を使用して、単子葉植物および双子葉植物における発現エレメントを特徴づけることができる。本発明を実施するのに有用な単子葉植物には、トウモロコシ（ギョクショクショ）、コメ（イネ）、コムギ（トリチカム属）、オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）（オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、モロコシ（モロコシ種）、アワ（Ｍｉｌｌｅｔ）、トウジンビエ（Ｐｅａｒｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、シコクビエ（Ｆｉｎｇｅｒ Ｍｉｌｌｅｔ）（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、 キビ（野生キビ）、アワ（Ｆｏｘｔａｉｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、カラスムギ（エンバク）、ライコムギ、ライムギ（Ｒｙｅ）（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、フォニオ（メヒシバ属）、タマネギ（ネギ種）、パイナップル（パイナップル種）、芝草、サトウキビ（サトウキビ種）、ヤシ（ヤシ科）、タケ（Ｂａｍｂｏｏ）（タケ（Ｂａｍｂｕｓｅａｅ））、バナナ(バショウ科)、ショウガ科（Ｇｉｎｇｅｒ ｆａｍｉｌｙ）（ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））、ユリ（ユリ属）、ラッパズイセン（スイセン属）、アイリス（Ｉｒｉｓｅｓ）（アイリス（Ｉｒｉｓ））、アマリリス（ラン科）、カンナ、ブルーベル（ヒアシントイデス属）、およびチューリップ（チューリップ属）が含まれるが、これらに限定されない。本発明を実施するのに有用な双子葉植物には、ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ）（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、ツルマメ（Ｗｉｌｄ Ｓｏｙｂｅａｎ）（ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ））、ワタ（ワタ属）、トマト（Ｔｏｍａｔｏ）（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、コショウ（コショウ属）、カボチャ（カボチャ属）、エンドウマメ（エンドウ）、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、タルウマゴヤシ、マメ（インゲンマメ属）、ヒヨコマメ（Ｃｈｉｃｋ ｐｅａ）（ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、ヒマワリ（Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ジャガイモ（バレイショ）、ピーナッツ（ラッカセイ）、キノア、ソバ（Ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）（ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、イナゴマメ（オニア・シリクア（ｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ））、テンサイ（サトウダイコン）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｈ）（ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ））、およびキュウリ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ）（キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））が含まれるが、これらに限定されない。

（細胞の形質転換）
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む形質転換した細胞および植物を作る方法に関する。

用語「形質転換」とは、受け手宿主へのＤＮＡ分子の導入を指す。本明細書で使用する場合、用語「宿主」とは、細菌、真菌、または植物の何らかの細胞、組織、器官、または子孫を含む、細菌、真菌、または植物を指す。特定の関心対象の植物の組織および細胞には、原形質体、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、および花粉を含む。

本明細書で使用する場合、用語「形質転換した」とは、コンストラクトなどの外来のＤＮＡ分子が導入された細胞、組織、器官、または生体を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子はその後の子孫によって受け継がれるよう、受け手の細胞、組織、器官、または生体のゲノムＤＮＡへと組み込まれてもよい。「トランスジェニック」細胞もしくは生体または「形質転換した」細胞もしくは生体はまた、当該細胞もしくは当該生体の子孫、あるいは交差における親のようなトランスジェニック生体を採用しかつ外来のＤＮＡ分子の存在から結果的に生じる変化した表現型を呈する育種プログラムから生じる子孫を含んでもよい。導入されたＤＮＡ分子はまた、導入されたＤＮＡ分子はその後の子孫によって受け継がれないように、受け手の細胞へと一過性に導入されてもよい。用語「トランスジェニック」とは、１つ以上の異種性のＤＮＡ分子を含有する細菌、真菌、または植物を指す。

植物細胞へＤＮＡ分子を導入するための、当業者に周知の多くの方法がある。当該過程は概して、適切な宿主細胞を選択する工程、当該宿主細胞をベクターで形質転換する工程、および当該形質転換した宿主細胞を得る工程を含む。本発明の実施においてコンストラクトを植物ゲノムへ導入することによって植物細胞を形質転換するための方法および材料には、周知のおよび実証された方法のうちの何らかを含むことができる。適切な方法にはとりわけ、細菌感染（例えば、アグロバクテリウム）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接的な送達（例えば、ＰＥＧ仲介性形質転換、乾燥／阻害仲介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、ならびにＤＮＡ被覆した粒子の加速）が含まれるがこれらに限定されない。

宿主細胞は、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞などの何らかの細胞または生体であってもよい。具体的な実施形態において、宿主細胞および形質転換した細胞には、作物植物由来の細胞を含んでもよい。

トランスジェニック植物はその後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生してもよい。従来の育種技術または自家受粉を使用して、種子は、このトランスジェニック植物から産生してもよい。このような種子、およびこのような種子から生育する結果として生じる子孫植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有し、それゆえトランスジェニックである。

本発明のトランスジェニック植物は自家受粉して、本発明のホモ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてホモ接合性）のための種子を提供することができ、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交雑して本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてヘテロ接合性）のための種子を提供することができる。このようなホモ接合性およびヘテロ接合性のトランスジェニック植物は両方とも、本明細書で「子孫植物」と呼ばれる。子孫植物とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する元のトランスジェニック植物から下ったトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子は、収穫して、本発明のコンストラクトを含みおよび農業上関心対象の遺伝子を発現する本発明のトランスジェニック植物、すなわち、子孫植物の世代を生育させることができる。異なる作物に通常使用される育種方法に関する説明は、いくつかの参考書籍のうちの１つに見ることができ、例えば、Ａｌｌａｒｄ，植物育種の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，カリフォルニア大学，カリフォルニア州デイヴィス市，５０〜９８（１９６０）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，作物改良の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ），Ｌｏｎｇｍａｎ社，ニューヨーク，３６９〜３９９（１９７９）、ＳｎｅｅｐおよびＨｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，植物育種の展望（Ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ），Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（編），Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）、Ｆｅｈｒ，ダイズ：改良、生産および使用（Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ），第２版，モノグラフ，１６：２４９（１９８７）、Ｆｅｈｒ，種の発達、理論および技術に関する原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ），（第１巻）ならびに作物種ダイズ（Ｃｒｏｐ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｏｙｂｅａｎ）（第２巻），アイオワ州立大学，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ．社，ニューヨーク，３６０〜３７６（１９８７）を参照されたい。

形質転換した植物は、関心対象の１つのまたは複数の遺伝子の存在、ならびに本発明の調節エレメントによって与えられる発現水準および／または発現特性について分析してもよい。当業者は、形質転換した植物の分析について利用可能な数多くの方法に気付いている。例えば、植物分析のための方法には、サザンブロットもしくはノザンブロット、ＰＣＲ系のアプローチ、生化学的分析、表現型スクリーニング法、現地調査、および免疫診断アッセイを含むがこれらに限定されない。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスター市）試薬および製造元によって説明されるような方法、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）検査マトリックスを用いて測定されるＰＣＲサイクル時間を用いて測定することができる。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マジソン市）試薬および製造元によって説明されるような方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価することができる。

本発明はまた、本発明の植物の複数の部分を提供する。植物の複数の部分には、葉、茎、根、塊茎、種子、内胚乳、胚珠および花粉を含むがこれらに限定されない。本発明の複数の植物部分は、生存可能、生存不可能、再生可能および／または再生不可能であってもよい。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換した植物細胞を含みおよび当該植物細胞を提供する。本発明の形質転換した植物細胞またはトランスジェニック植物細胞には、再生可能なおよび／または再生不可能な植物細胞を含む。

本発明は、以下の実施例に対する参照を通じてより容易に理解され得、当該実施例は、説明として提供されているものであって、別段の指定がない限り、本発明を制限するよう意図するものではない。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するよう本発明者らによって発見された技術を表すことは当業者によって認められるべきである。しかし、当業者は、本開示の点において、多くの変更が開示された具体的な実施形態においてなされることができ、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様なまたは類似の結果をなおも得ることができることを認めるべきであり、それゆえ、添付の図に明らかにされまたは示されるものはすべて、実例として解釈されることになっており、制限する意味にはない。

（実施例１）
（調節エレメントの識別およびクローニング）
新規のＲＣｃ３プロモーターおよびリーダーを単子葉植物種ハトムギ（Ｃｏｉｘ）（ハトムギ（Ｃｏｉｘ ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ））、オニメヒシバ（Ｈａｉｒｙ ｃｒａｂｇｒａｓｓ）（オニメヒシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ （Ｌ．） Ｓｃｏｐ．））、イトススキ（Ｍａｉｄｅｎ ｇｒａｓｓ）（イトススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｆ． ｇｒａｃｉｌｌｉｍｕｓ））、ガマグラス（Ｇａｍａ ｇｒａｓｓ）（トリプサクム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ））およびサトウキビ（Ｓｕｇａｒｃａｎｅ）（サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ））のゲノムＤＮＡから識別およびクローニングした。ＲＣｃ３タンパク質は、プロラミンスーパーファミリーに属し、その名前は、穀類のアルコール可溶性プロリンおよびグルタミン富化貯蔵タンパク質に由来する。プロラミンスーパーファミリー（プロテアーゼ阻害薬／脂質転移タンパク質／種子貯蔵２Ｓアルブミンファミリーとも呼ぶ；Ｐｆａｍ ＩＤ：ＰＦ００２３４）は、当該植物ゲノムにおける最も広範性のあるタンパク質スーパーファミリーのうちの１つを表す。プロラミンスーパーファミリーのメンバーは、種々の植物の果実、木の実、種子、および野菜において豊富である。当該メンバーは、種子の貯蔵および防護、脂質の結合もしくは輸送、ならびに酵素阻害を含む多岐にわたる機能を呈することが知られている。脂質輸送タンパク質（ＬＴＰ）は、プロラミンスーパーファミリーに属し、種々の植物組織において発現する。コメＲＣｃ３タンパク質は、コメの根に発現するＬＴＰであるが、ＬＴＰタンパク質がすべて根に特異的であるわけではない。

ＤＮＡ増幅プライマー（配列番号２５〜２８として表す）は、ギョクショクショ、イネ、モロコシおよびミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）由来の二十四（２４）のＬＴＰタンパク質のコード配列を用いて設計した。増幅プライマーを、製造元のプロトコルに従って構築したＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，カリフォルニア州マウンテンビュー市）ライブラリーとともに使用して、対応するゲノムＤＮＡ配列の５’領域をクローン化した。

バイオインフォマティクス分析を実施して、増幅したＤＮＡ内の調節エレメントを識別した。この分析結果を用いて、調節エレメントをＤＮＡ配列内で定義し、プライマーを設計して調節エレメントを増幅した。各調節エレメントについての対応するＤＮＡ分子を、独特な制限酵素部位を含有するプライマーならびにハトムギ、オニメヒシバ、トリプサクム・ダクチロイデス（Ｔ．ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）およびサトウキビから単離したゲノムＤＮＡを用い、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件を用いて増幅した。結果として生じるＤＮＡ断片をベクターへとライゲートし、配列決定した。

識別したＲＣｃ３プロモーターおよびリーダーのＤＮＡ配列を表１に列挙する。プロモーター配列は本明細書で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として提供する。リーダー配列は本明細書で配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０として提供する。

（実施例２）
（トランスジェニックトウモロコシにおけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析）
トウモロコシ植物をベクター、具体的にはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する天然のＲＣｃ３リーダーへ操作可能に連結したＲＣｃ３プロモーターを含むバイナリープラスミドコンストラクトを用いて形質転換した。結果として生じる形質転換した植物をＧＵＳタンパク質発現について分析した。

これらの実験に利用するベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域、アワＳ−アデノシルメチオニンシンテターゼ１遺伝子由来の３’ＵＴＲ（Ｔ−ＳＥＴｉｔ．Ａｍｓ１−１：１：１、配列番号１５９）へ５’で操作可能に連結されたプロセシング可能なイントロンＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：３（配列番号２９）を有するＧＵＳについてのコドンの再設計されたコード配列へ操作可能に連結されたＲＣｃ３プロモーター／リーダー配列を分析するための第一の導入遺伝子発現カセット、除草剤グリホサートに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞（コメアクチン１プロモーターによって駆動）の選択に使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域からなった。結果として生じるプラスミドを用い、当該技術分野で公知の方法を用いてトウモロコシ植物を形質転換した。新規のＲＣｃ３プロモーターおよびリーダーによって与えられるＧＵＳ発現を、アワおよびコメのＲＣｃ３ホモログプロモーターおよびリーダーによって駆動される発現と比較した。表２は、プラスミドコンストラクト、ＲＣｃ３プロモーターおよびリーダーの配列、ならびに配列番号を提供する。

ある場合において、植物を当該技術分野で公知の、および米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号において説明するような、アグロバクテリウム仲介性形質転換法を用いて形質転換した。

形質転換した植物の定性的発現分析に組織化学的ＧＵＳ分析を用いた。組織全体の切片をＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ｍｇ／ｍｌ）とともに適切な長さの時間インキュベートし、すすぎ、青色の着色について目視検査した。ＧＵＳ活性は、選択された植物の器官および組織を用いた直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に判定した。Ｒ_０植物を根および葉ならびに葯、生糸、ならびに発達中の種子および受粉後２１日胚（２１ＤＡＰ）における発現について検査した。

定量的な分析については、形質転換したトウモロコシ植物の選択した組織から総タンパク質を抽出した。５０μｌの総反応容積において、総タンパク質１μｇを蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｅｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とともに使用した。反応産物４−メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｌｙｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大に蛍光を発し、当該ｐＨではヒドロキシ基がイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の添加は、本アッセイを即時停止させ、蛍光産物を定量化するためにｐＨを調整した。励起時２ｎｍ、発光時３ｎｍにスリット幅を設定したＭｉｃｒｏｍａｘ Ｒｅａｄｅｒを備えたＦｌｕｏｒｏｍａｘ−３（堀場製作所、日本国京都市）を用いて、励起時３６５ｎｍ、発光時４４５ｎｍで蛍光を測定した。平均発現値は、４ＭＵｐｍｏｌ／タンパク質μｇ／時として提供した。

各形質転換について観察された平均Ｒ_０ＧＵＳ発現を記録し、平均発現水準および標準誤差は、複数回の形質転換事象に由来する試料について取った測定値を基に判定した。

（実施例３）
（調節エレメント由来のエンハンサー）
エンハンサーは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９として呈されるものなど、本明細書に提供されるプロモーターエレメントに由来し得る。これらのエンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結されたまたはプロモーターへ操作可能に連結された追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結された場合、転写可能なＤＮＡ分子の発現を亢進もしくは調節することができ、あるいは特異的な細胞型もしくは植物器官におけるまたは発達もしくは該日リズムの特定の時点における転写可能なＤＮＡ分子の発現を提供することができる１つ以上のシス調節エレメントから構成してもよい。エンハンサーは、ＴＡＴＡボックスもしくは機能的に類似のエレメントおよび何らかの下流のＤＮＡ配列を、その断片を含む先に説明したような本明細書に提供されるプロモーターから開始できるように転写するプロモーターから除去することによって作られ、当該プロモーターにおいて、ＴＡＴＡボックスもしくは機能的に類似のエレメントおよびＴＡＴＡボックスの下流のＤＮＡ配列は除去される。

エンハンサーエレメントは、本明細書に提供されるプロモーターエレメントに由来し、当該技術分野で公知の方法を用いてクローン化してプロモーターエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され、またはプロモーターへ操作可能に連結された追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され得る。エンハンサーエレメントは、異なる属の生体由来のプロモーターへ５’もしくは３’で操作可能に連結されるよう、あるいは他の属の生体由来の追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され、あるいは同じもしくは異なる属のいずれかの生体に由来するプロモーターへ操作可能に連結された他の属の生体もしくは同じ属の生体に由来する追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結されるようクローン化して、結果的にキメラ調節エレメントを生じることができる。先行実施例において説明したコンストラクトと類似のＧＵＳ発現ベクターを、当該技術分野で公知の方法を使用して構築し得、当該先行実施例において、結果として生じる植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域；アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のノパリンシンターゼ３’ＵＴＲ（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号３９）もしくはコメ脂質輸送タンパク質遺伝子由来の３’ＵＴＲ（Ｔ−Ｏｓ.ＬＴＰ−１：１：１、配列番号４０）へ操作可能に連結されたプロセシング可能なイントロン（ＧＵＳ−２、配列番号３２）もしくはイントロンなし（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ−１：１：４ （ＧＵＳ．ｎａｔ）、配列番号３１）のいずれかを有するＧＵＳについてのコード配列へ操作可能に連結された、ギョクショクショのＨＰＳ７０熱ショックタンパク質由来のイントロン（Ｉ-Ｚｍ.ＤｎａＫ-１：１：１、配列番号３８）もしくは本明細書に呈されるイントロンのうちのいずれかもしくはその他のイントロンへ操作可能に連結された、調節エレメントもしくはキメラ調節エレメント；除草剤グリホサート（コメアクチン１プロモーターによって駆動）もしくはそれに替わるものとして抗生物質カナマイシン（コメアクチン１プロモーターによって駆動）に対する抵抗性を与える形質転換された植物細胞の選択に使用される第二の導入遺伝子選択カセット；ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域から構成される。結果として生じるプラスミドを使用して、先に説明した方法によって、もしくは当該技術分野で公知の他の方法によって、トウモロコシ植物もしくは他の属の植物を形質転換してもよい。あるいは、トウモロコシまたは他の属の植物に由来する原形質体細胞を当該技術分野で公知の方法を用いて形質転換して、一過性アッセイを実施してもよい。

１つ以上のエンハンサーを含む調節エレメントによって駆動されるＧＵＳ発現は、導入遺伝子の発現に及ぼすエンハンサーエレメントの効果を判定するために、安定したもしくは一過性の植物アッセイにおいて評価してもよい。１つ以上のエンハンサーエレメントに対する修飾または１つ以上のエンハンサーエレメントの複製は、経験的な実験法および各調節エレメント組成を用いて観察される結果として生じる遺伝子発現調節を基に実施してもよい、結果として生じる調節エレメントまたはキメラ調節エレメントにおける１つ以上のエンハンサーの相対的な位置を変更することは、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントの転写活性または特異性に影響することがあるので、トウモロコシ植物または他の属の植物内での所望の導入遺伝子発現特性についての最良のエンハンサーを識別するよう経験的に判断される。

（実施例４）
コドンの再設計されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いたより高いアッセイ感度
植物プロモーターはしばしば、多くの定量的アッセイの正常検出閾値を下回る水準で発現するにもかかわらず、当該プロモーターの発現特徴は、ある導入遺伝子の発現について非常に価値があり得る。より初期の植物生物工学において、高い恒常的発現を駆動するプロモーターは望ましく、当該プロモーターを用いて、除草剤耐性もしくは昆虫抵抗性などの高い恒常的発現を必要とする特異的な表現型を生じる転写可能なＤＮＡ分子を駆動した。これらの高い恒常的プロモーターはしばしば、植物ゲノムよりもむしろ植物ウイルスのゲノムに由来し、例えば、３５Ｓプロモーターはカリフラワーモザイクウイルスおよびゴマノハグサモザイクウイルスに由来した。明白に、ある場合においては、ある転写可能なＤＮＡ分子の高い恒常的発現は、導入遺伝子のサイレンシング、表現型の発現停止、または収量低下など、負の結果をもたらし得る。例えば、サトウキビ由来の２つの異なるユビキチンプロモーターおよびトウモロコシのユビキチンプロモーターを用いたトランスジェニックサトウキビ植物におけるＧＵＳ遺伝子の高い発現は、ＧＵＳ遺伝子の転写後遺伝子サイレンシングを結果として生じた（Ｗｅｉら，Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６０：１２４１〜１２５１，２００３）。

さらに、近年、特異的な発現パターンを示すまたは植物の特定の組織により高度に発現するプロモーターについての需要がある。例えば、植物における酵素遺伝子の異所性発現は、代謝経路の分岐点における前駆体の不足により、所望の最終産物の減少を生じる可能性がある（Ｉｗａｓｅら，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：２９〜３８，２００９）。これらの場合において、正確な組織もしくは細胞型におけるまたは特定の発達窓における操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子を発現させるプロモーターを使用することが望ましい。植物ゲノム由来のプロモーターはしばしば、所望の組織細胞または発達中の発現特徴を実証することができる。これらの植物プロモーターのより低い発現水準により、発現アッセイはしばしば、定量的アッセイにおける検出を可能にするよう発現水準を上げるためにエンハンサーの使用を必要とする。しかしながら、このようなエンハンサーの使用はしばしば、植物プロモーターの全体的な発現パターンを変化させる。

本アッセイにおいて使用するリポーター遺伝子の発現を改善することは、植物由来のプロモーターの亢進についての必要性を排除し、したがって、プロモーターによって与えられた発現パターンのより正確な評価を提供する。本実施例は、イントロン配列へ５’で操作可能に連結されたリーダー配列へ５’で操作可能に連結されたプロモーター配列から構成された数個の異なるＥＸＰを特徴づける上で定量的アッセイの感度を改善するための、コドンの再設計されたＧＵＳコード配列の使用を実証する。

天然の大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子またはコドンの再設計されたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ．ｎｎｏ）導入遺伝子のいずれかの発現を駆動するＥＸＰ配列を含有する植物発現ベクターを用いてトウモロコシ植物を形質転換し、結果として生じる植物をＧＵＳタンパク質発現について分析した。ＥＸＰおよびＧＵＳコード配列は、当該技術分野で公知の方法を用いて、バイナリープラスミドコンストラクトへとクローン化した。

結果として生じる植物発現コンストラクトは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域；天然の大腸菌ＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ−１：１：４ （ＧＵＳ．ｎａｔ）、配列番号３１）またはコメ脂質輸送タンパク質遺伝子由来の３’ＵＴＲ（Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ−１：１：１、配列番号４０）へ５’で操作可能に連結されコドンの再設計されたＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＿ｎｎｏ−１：１：１ （ＧＵＳ．ｎｎｏ）、配列番号３０）のいずれかへ操作可能に連結されたＥＸＰから構成される２つのＧＵＳコード配列のアッセイ感度を実証する第一の導入遺伝子カセット；除草剤グリホサートに対する抵抗性（コメアクチン１プロモーターによって駆動）を与える形質転換された植物細胞の選択に使用される第二の導入遺伝子選択カセット；ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域を含有する。図１ａ〜図１ｃは、天然のＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ−１：１：４）およびコドンの再設計されたＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＿ｎｎｏ−１：１：１）の間の整列化を示す。当該整列化における同一のヌクレオチドは、星印によって示される。コドンの再設計されたＧＵＳ配列は、天然のＧＵＳコード配列と７７．９％同一であり、当該植物においてより良好に発現するよう設計されている。

三つ（３つ）の異なるＥＸＰクラスを使用し、各々特異的な発現パターンを与えた。ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｃａｂ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１（配列番号３４）およびＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｃａｂ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：２（配列番号３５）というＥＸＰは、トウモロコシにおける葉の発現特性を与え、ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｃａｂ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：２のヌクレオチド位置１４０８〜１４１２における５’−ＣＣＧＧＡ−３’の５ヌクレオチドの挿入を除き、本質的に同一である。ＥＸＰ配列（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｏｓ．Ｒｃｃ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：５（配列番号３６））は、トウモロコシにおける亢進した根の発現特性を提供する。ＥＸＰ配列（ＥＸＰ−ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：２（配列番号３７））は、トウモロコシにおける高い恒常的発現特性を提供する。結果として生じるプラスミドを用い、当該技術分野で公知の方法を用いてトウモロコシ植物を形質転換した。表３は、プラスミドコンストラクトの名称、ならびに対応するＥＸＰ配列およびＧＵＳ配列を列挙する。

ある場合において、当該技術分野で公知のおよび米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５号において説明されるようなアグロバクテリウム仲介性形質転換法を用いて、植物を形質転換した。

形質転換した植物の定性的発現分析に組織化学的ＧＵＳ分析を用いた。組織全体の切片をＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ｍｇ／ｍｌ）とともに適切な長さの時間インキュベートし、すすぎ、青色の着色について目視検査した。ＧＵＳ活性は、選択された植物の器官および組織を用いた直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に判定した。Ｒ０植物を根および葉ならびに葯、生糸、ならびに発達中の種子および受粉後２１日胚（２１ＤＡＰ）における発現について検査した。

定量的な分析については、形質転換したトウモロコシ植物の選択した組織から総タンパク質を抽出した。５０μｌの総反応容積において、総タンパク質１μｇを蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｅｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とともに使用した。反応産物４−メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｌｙｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大に蛍光を発し、当該ｐＨではヒドロキシ基がイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の添加は、本アッセイを即時停止させ、蛍光産物を定量化するためにｐＨを調整した。励起時２ｎｍ、発光時３ｎｍにスリット幅を設定したＭｉｃｒｏｍａｘ Ｒｅａｄｅｒを備えたＦｌｕｏｒｏｍａｘ−３（堀場製作所、日本国京都市）を用いて、励起時３６５ｎｍ、発光時４４５ｎｍで蛍光を測定した。

Ｒ_０世代の形質転換体についての平均ＧＵＳ発現値は、表４、５および６に提供する。

表４〜表６でわかるように、天然のＧＵＳコード配列と比較した場合、コドンの再設計されたＧＵＳコード配列を用いた定量的アッセイにおいてより高い感度がある。Ｔ−ＤＮＡの挿入部位によって発現が影響され得るので、ＧＵＳ．ｎｎｏ集団およびＧＵＳ．ｎａｔ集団の間のいくばくかの変動性は期待されることになるが、しかしながら、感度の全体的な傾向は、ＧＵＳ．ｎｎｏを用いて非常により高い感度を実証する。ＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｃａｂ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１（配列番号３４）およびＥＸＰ−ＳＥＴｉｔ．Ｃａｂ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：２（配列番号３５）により駆動されるＧＵＳは、ＧＵＳ．ｎａｔと比較した場合、ＧＵＳ．ｎｎｏを用いると２．２６〜８．１倍高い感度を実証した。同様に、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｏｓ．Ｒｃｃ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：５（配列番号３６）によって提供される亢進した根の特性は、ＧＵＳ．ｎａｔよりもＧＵＳ．ｎｎｏを用いた場合、１６．０６〜１９．０６倍高く、このコドンの再設計されたＧＵＳコード配列を、根のプロモーター、特に低水準で発現する当該プロモーターについてのスクリーニングに対して理想的にし、天然のＧＵＳコード配列を用いた場合、背景水準以下のＧＵＳ水準を実証し得る。ＥＸＰ−Ｚｍ．ＵｂｑＭ１：１：２（配列番号３７）によって与えられる高い恒常的発現特性は、ＧＵＳ．ｎａｔと比較してＧＵＳ．ｎｎｏを用いた場合、１．４２〜４．０９倍高い定量的感度を実証した。

定性的には、ＧＵＳ染色は、より高感度であり、コドンの再設計されたＧＵＳコード配列を用いた組織試料において一貫して観察された。概して、定性的な染色の観察は、定量的なアッセイよりも感度が低い傾向にある。コドンの再設計されたＧＵＳコード配列の使用は、染色した組織のより良好かつより一貫した顕微鏡検査を提供する。例えば、ＧＵＳをＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｏｓ．Ｒｃｃ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：５（配列番号３６）によって駆動する根組織においては、コドンの再設計されたＧＵＳコード配列を用いて形質転換した組織の組織化学的染色はより顕著であり、皮層、表皮、内胚乳、根毛および二次根端からなるＶ７の根の試料全部において見えた。対照的に、ＧＵＳ染色は、天然のＧＵＳコード配列がＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｏｓ．Ｒｃｃ３＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：５によって駆動された場合、対応するＶ７の根の組織において定性的に観察されなかった。改善されたコドンの再設計されたＧＵＳコード配列（ＣＲ−Ｅｃ.ｕｉｄＡ＿ｎｎｏ−１：１：１、配列番号３０）は、より高いアッセイ感度を提供し、低水準で発現するプロモーターの発現を測定する上で特に価値があった。

（実施例５）
（トウモロコシの葉および根の原形質体におけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析）
トウモロコシの葉および根の原形質体を、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する天然のＲＣｃ３リーダーへ操作可能に連結されたＲＣｃ３プロモーターを含むベクターを用いて形質転換し、結果として生じる形質転換した原形質体をＧＵＳタンパク質発現について分析した。ＲＣｃ３プロモーター配列およびリーダー配列を、当該技術分野で公知のおよび実施例２においてすでに説明したとおりの方法を用いて、バイナリープラスミドコンストラクトへとクローン化した。

同時形質転換およびデータの標準化における使用のための２つのプラスミドコンストラクトも、当該技術分野で公知の方法を用いて構築した。これらのプラスミドコンストラクトの各々は、恒常的なＥＸＰによって駆動される特異的なルシフェラーゼコード配列を含有していた。ベクターｐＭＯＮ１９４３７は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号３９）由来の３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結されたホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ：１：３、 配列番号４２）へ５’で操作可能に連結されたイントロン（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１、配列番号４１）へ５’で操作可能に連結された恒常的プロモーターを備えた発現カセットを含んでいた。ベクターｐＭＯＮ６３９３４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号３９）由来の３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結されたウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＣＲ−Ｒｅｎ．ｈＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅ−０：０：１、配列番号４３）へ５’で操作可能に連結された恒常的ＥＸＰ配列（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−Ｌｈｃｂ１、配列番号４４）を備えた発現カセットを含んでいた。

トウモロコシの根および葉の原形質体を、当該技術分野で周知であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系の形質転換法を用いて形質転換した。原形質体細胞をｐＭＰＮ１９４３７、ｐＭＯＮ６３９３４を用いて形質転換し、当該プラスミドのうちの１つを表７に呈した。形質転換後、形質転換した原形質体を全体として暗所で一晩インキュベートした。次に、ＧＵＳおよびルシフェラーゼの両方の測定を、先に記載したとおり形質転換した細胞の溶解した調製物の一定分量を２つの異なる小孔トレイへと入れることによって実施した。１つのトレイはＧＵＳ測定に使用し、第二のトレイは二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステムを用いた二重ルシフェラーゼアッセイを実施するために使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン市、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ Ｍａｇａｚｉｎｅ，第５７巻，１９９６，ｐ．０２を参照されたい）。

各ＥＸＰまたはプロモーター＋リーダー＋イントロン配列について４つの形質転換を実施した。各ＥＸＰまたはプロモーター＋リーダー＋イントロン配列についての平均発現値を、各形質転換由来のいくつかの試料から測定した。試料の測定は、各ＥＸＰまたはプロモーター＋リーダー＋イントロン配列プラスミドコンストラクト形質転換の４つの複製物を用いて実施した。背景ＧＵＳ発現は、ＧＵＳ導入遺伝子を欠失している陰性対照プラスミドコンストラクトを用いて測定した。平均ＧＵＳおよびルシフェラーゼ発現水準は、表７（葉）および表８（根）に提供する。これらの表において、ホタルルシフェラーゼ値（例えば、ｐＭＯＮ１９４３７の発現由来）は、「ＦＬＵＣ」と標識した列に提供し、ウミシイタケルシフェラーゼ値（例えば、ｐＭＯＮ６３９３４の発現由来）は、「ＲＬＵＣ」と標識した列にあるものとして提供する。また、表７および表８に提供されるのは、平均のＧＵＳ／ＦＬＵＣ比およびＧＵＳ／ＲＬＵＣ比であり、当該比は、原形質体アッセイにおける発現強度の相対的な尺度を提供する。

表７に示すように、ＲＣｃ３ホモログプロモーターはすべて、トウモロコシの葉の原形質体における導入遺伝子の発現を駆動する能力を実証した。ＲＣｃ３ホモログプロモーターのうちのいくつかはＧＵＳ／ＦＬＵＣ比およびＧＵＳ／ＲＬＵＣ比を基にした本アッセイにおいてその他のものより高い発現を駆動した。さらに先の表８に示すように、ＲＣｃ３ホモログプロモーターはすべて、トウモロコシの根の原形質体における導入遺伝子の発現を駆動する能力を変動する程度まで実証した。

（実施例６）
トランスジェニックトウモロコシにおけるＧＵＳを駆動する調節エレメントの分析
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する天然のＲＣｃ３リーダーへ操作可能に連結したＲＣｃ３プロモーターを含むベクターを用いて、トウモロコシ植物を形質転換した。結果として生じる形質転換した植物を、ＧＵＳタンパク質発現について分析した。

ＲＣｃ３プロモーター配列およびリーダー配列を、実施例２において説明したものなど、当該技術分野で公知の方法を用いてバイナリープラスミドコンストラクトへとクローン化した。結果として生じるバイナリープラスミドコンストラクトは、ｐＭＯＮ２６４１４６、ｐＭＯＮ２６４１４８、ｐＭＯＮ２６４０８８、ｐＭＯＮ２６４１０７、ｐＭＯＮ２６４１８６、ｐＭＯＮ２６４１８７、ｐＭＯＮ２６４０４９、ｐＭＯＮ２６４０５０、ｐＭＯＮ２６４１４７およびｐＭＯＮ２６４１６６であった。トウモロコシ植物はまた、ｐＭＯＮ２６４１０８およびｐＭＯＮ２６４２０６を用いて安定的に形質転換した。定性的および定量的なＧＵＳ発現分析は、実施例２において説明したとおり実施した。当該植物は、Ｖ４、Ｖ７およびＶＴの発達段階においてアッセイした。Ｒ１およびＲ３における試料採取を示す。表９は、安定的に形質転換したトウモロコシ植物についての平均の定量的なＧＵＳ発現を示す。

表９に示すように、ＲＣｃ３プロモーターホモログはすべて、安定的に形質転換したトウモロコシ植物におけるＧＵＳ導入遺伝子の発現を駆動することができた。さらに、各プロモーターは、特定のプロモーターに対して独特である発現パターンを有していた。例えば、ＶＴ花／葯における発現は、ＲＣｃ３プロモーターホモログ間で異なっていた。Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿３：１（配列番号１７）によって駆動される発現は、プロモーターすべてについて観察される最高の発現であったのに対し、Ｐ−ＭＩＳｇｒ.ＲＣｃ３−２：２（配列番号１１）によって駆動される発現は最低であった。Ｒ１Ｃｏｂ／生糸発現に関して、Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿３：１（配列番号１７）はこれらの組織における最高の発現を実証し、Ｐ−ＭＩＳｇｒ．ＲＣｃ３−２：２（配列番号１１）は最低で発現した。Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿３：１（配列番号１７）によって駆動される発現は、より後期の発達する組織で高まった。発現はＶ４〜ＶＴ段階で根において高まり、ＶＴ花／葯、Ｒ１Ｃｏｂ／生糸ならびにＲ３ ２１ＤＡＰの胚および内胚乳においてより高かった。Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿３：１によって駆動される発現は、ＶＴ花／葯、Ｒ１Ｃｏｂ／生糸ならびにＲ３ ２１ＤＡＰの胚および内胚乳におけるＲＣｃ３プロモーターホモログのうちで最高であった。

葉および根の発現に関して、ＲＣｃ３プロモーターホモログのうちのいくつかは、根における発現が葉に対して高いことを実証した。表１０は、アッセイしたＲＣｃ３プロモーターすべてについての根：葉の発現比を示す。

表１０に示すように、各ＲＣｃ３プロモーターホモログは、異なる根：葉発現比および異なるパターンをＶ４〜ＶＴ段階で示した。例えば、Ｐ−Ｃｌ．ＲＣｃ３：３（配列番号１）は、Ｖ４〜ＶＴで類似の発現比を維持するとともに、Ｖ７段階でわずかな低下が生じた。表９に見られるような根における発現は、Ｖ４〜Ｖ７でわずかに低下した後、ＶＴ段階によって高まった。プロモーターＰ−Ｄｓ．ＲＣｃ３＿３：１（配列番号７）は、Ｖ４〜ＶＴ段階で発現比の変化を示すとともに、Ｖ４およびＶ７段階における葉に対する根におけるより高い発現の後に、ＶＴ段階における根に対する葉におけるほぼ等しい発現へと移行した（１．２５）。このプロモーターを用いて、表９に示す平均の発現は、Ｖ４〜ＶＴ段階で葉における発現の亢進を示すのに対し、根における発現はＶ７〜ＶＴ段階で低下した。プロモーターＰ−Ｓｏ．ＲＣｃ３：２（配列番号１９）は、Ｖ４で６．３３およびＶ７段階で６．７９の根：葉発現比を維持したが、後にＶＴ段階で２．９９まで低下した。しかしながら、このプロモーターを用いた発現は、Ｖ４〜Ｖ７段階で葉および根においてそれぞれ３．６９および３．９６倍高まった後、ＶＴ段階でＶ４に対して２．３３および１．１０まで低下した。

明らかに、プロモーターのすべてがより高い根：葉比を有しているわけではなかった。例えば、プロモーターＰ−Ｄｓ．ＲＣｃ３＿１：１（配列番号３）およびＰ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１：１（配列番号１３）は、Ｖ４段階において１未満の根／葉比を有していた。しかしながら、Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿１：１によって駆動される発現は、Ｖ４根においてＰ−Ｄｓ．ＲＣｃ３＿１：１よりも６．６倍高かった。Ｖ４段階における根／葉の最高比は、Ｐ−Ｔｄ．ＲＣｃ３＿２：１（配列番号１５）を用いて達成された。Ｐ−Ｄｓ．ＲＣｃ３＿１：１によって駆動される根／葉の発現比は、Ｖ４（０．７６）〜Ｖ７（２．９５）で高まった後、Ｖ４（０．７９）における比と類似の比まで戻った。

プロモーターＰ−ＭＩＳｇｒ．ＲＣｃ３−２：２（配列番号１１）は、Ｖ４〜ＶＴ段階では葉および根の両方における発現の亢進を実証した。このプロモーターは、３つの段階すべてを通じて６．９を上回る根：葉の比を有していたが、当該比は、Ｖ４段階における７．４６からＶ７段階における６．９２へと進んだ後、ＶＴ段階における１１．４４まで上昇した。Ｐ−ＭＩＳｇｒ．ＲＣｃ３−２：２によって駆動される発現は、Ｖ４〜ＶＴ段階の葉および根において高まった。

ＲＣｃ３ホモログプロモーターの各々は、特にトウモロコシなどの異種性の種を形質転換するのに使用した場合に、相同遺伝子に由来することでは必ずしも推定できない安定的に形質転換したトウモロコシにおける発現パターンを示した。当該プロモーターのほとんどはＶ４、Ｖ７またはＶＴ段階のいずれかにおいて、あるいはアッセイした全段階において、いくつかの時点で葉に関して根におけるより高い発現を実証した。明らかに、発現の程度は当該プロモーター間で広範に異なっていた。ＲＣｃ３プロモーターホモログの各々の独特な発現特性は、ある種類の転写可能なＤＮＡ分子発現について、いくつかをその他のものよりも適切とする。例えば、土壌における栄養物質の同化に対して決定的であり得る、および当該植物が繁殖し始めて種子を産生しようとしている場合により後期の発達段階において最良に発現する、転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＶＴ段階の根における発現を高めるＰ−ＭＩＳｇｒ．ＲＣｃ３−２：２（配列番号１１）などのプロモーターから最良に恩恵を受けるかもしれない。

本発明の原理を例証および説明したが、本発明が、このような原理から逸脱することなく配置および詳細において改変することができることは、当業者に対して明白である。本発明者らは、特許請求の範囲に関する精神および範囲内である改変をすべて請求する。本明細書に引用される公開物および公開された特許文書はすべて、各個々の公開物または特許出願が、参照により組み込まれるよう具体的かつ個々に示される場合と同じ程度まで、参照により本明細書により組み込まれる。

Claims (21)

1. ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、
   ａ）配列番号１〜２０のうちのいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、
   ｂ）配列番号１〜２０のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および
   ｃ）配列番号１〜２０のうちのいずれかであって、遺伝子調節活性を有する、断片、
   からなる群から選択されるＤＮＡ配列であって、前記配列は異種性の転写可能なポリヌクレオチド分子へ操作可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子。
2. 前記ＤＮＡ配列は、配列番号１〜２０のいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
3. 前記ＤＮＡ配列は、配列番号１〜２０のいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
4. 前記異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、農学上関心対象の遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
5. 前記農学上関心対象の遺伝子は、植物における除草剤耐性を与える、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
6. 前記農学上関心対象の遺伝子は、植物における昆虫抵抗性を与える、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
7. ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、前記配列は、異種性の転写可能なポリヌクレオチド分子へ操作可能に連結されている、前記トランスジェニック植物細胞：
   ａ）配列番号１〜２０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、
   ｂ）配列番号１〜２０のいずれかを含むＤＮＡ配列、および
   ｃ）配列番号１〜２０のいずれかであって、遺伝子調節活性を有する、断片、
   からなる群から選択されるＤＮＡ配列であって、前記配列は、異種性の転写可能なポリヌクレオチド分子へ操作可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
8. 前記トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。
9. 前記トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。
10. ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部分であって、
    ａ）配列番号１〜２０のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、
    ｂ）配列番号１〜２０のいずれかを含むＤＮＡ配列、および
    ｃ）配列番号１〜２０のいずれかであって、遺伝子調節活性を有する、断片、
    からなる群から選択されるＤＮＡ配列であって、前記配列は、異種性の転写可能なポリヌクレオチド分子へ操作可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその部分。
11. 前記トランスジェニック植物の子孫植物またはその部分は、前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック植物の子孫植物。
12. 前記種子は前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック植物のトランスジェニック種子。
13. 請求項１０に記載のトランスジェニック植物またはその部分を得ること、およびそこから商品用産物を生産することを含む、商品用産物を生産する方法。
14. 前記商品用産物は、加工した種子、穀粒、植物部分、および食品である、請求項１３に記載の方法。
15. トランスジェニック植物を作出する方法であって、
    ａ）形質転換した植物細胞を産生するために、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植物細胞を形質転換すること、および
    ｂ）前記形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
    を含む、方法。
16. コドンの再設計された大腸菌β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列であって、前記コドンの再設計されたＧＵＳコード配列は、天然の大腸菌ＧＵＳコード配列よりもトランスジェニック植物における高い発現を示す、コドンの再設計された大腸菌ＧＵＳコード配列。
17. 配列番号２９および３０からなる群から選択される、請求項１６に記載のコドンの再設計されたＧＵＳコード配列。
18. 前記トランスジェニック植物は、単子葉植物である、請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
19. 前記トランスジェニック植物は、双子葉植物である、請求項１６に記載のトランスジェニック植物。
20. 前記単子葉植物は、トウモロコシ（ギョクショクショ）、コメ（イネ）、コムギ（トリチカム属）、オオムギ（Ｂａｒｌｅｙ）（オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、モロコシ（モロコシ種）、アワ（Ｍｉｌｌｅｔ）、トウジンビエ（Ｐｅａｒｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、シコクビエ（Ｆｉｎｇｅｒ Ｍｉｌｌｅｔ）（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、 キビ（野生キビ）、アワ（Ｆｏｘｔａｉｌ Ｍｉｌｌｅｔ）（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、カラスムギ（エンバク）、ライコムギ、ライムギ（Ｒｙｅ）（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、フォニオ（メヒシバ属）、タマネギ（ネギ種）、パイナップル（パイナップル種）、芝草、サトウキビ（サトウキビ種）、ヤシ（ヤシ科）、タケ（Ｂａｍｂｏｏ）（タケ（Ｂａｍｂｕｓｅａｅ））、バナナ(バショウ科)、ショウガ科（Ｇｉｎｇｅｒ ｆａｍｉｌｙ）（ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））、ユリ（ユリ属）、ラッパズイセン（スイセン属）、アイリス（Ｉｒｉｓｅｓ）（アイリス（Ｉｒｉｓ））、アマリリス（ラン科）、カンナ、ブルーベル（ヒアシントイデス属）、およびチューリップ（チューリップ属）からなる群から選択される、請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
21. 前記双子葉植物は、ダイズ（Ｓｏｙｂｅａｎ）（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、ツルマメ（Ｗｉｌｄ Ｓｏｙｂｅａｎ）（ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ））、ワタ（ワタ属）、トマト（Ｔｏｍａｔｏ）（トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、コショウ（コショウ属）、カボチャ（カボチャ属）、エンドウマメ（エンドウ）、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、タルウマゴヤシ、マメ（インゲンマメ属）、ヒヨコマメ（Ｃｈｉｃｋ ｐｅａ）（ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、ヒマワリ（Ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ジャガイモ（バレイショ）、ピーナッツ（ラッカセイ）、キノア、ソバ（Ｂｕｃｋｗｈｅａｔ）（ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、イナゴマメ（オニア・シリクア（ｏｎｉａ ｓｉｌｉｑｕａ））、テンサイ（サトウダイコン）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｈ）（ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ））、およびキュウリ（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ）（キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））からなる群から選択される、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。

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