CN117897491A - 植物调控元件及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可用于调节植物中的基因表达的重组DNA分子和构建体以及它们的核苷酸序列。本发明还提供了包含重组DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子，所述重组DNA分子与异源可转录DNA分子可操作地连接。还提供了使用重组DNA分子和构建体以及包含所述重组DNA分子和构建体的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子的方法。

Description

植物调控元件及其用途
相关申请的引用
本申请要求2021年8月17日提交的美国临时申请号63/234,175的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
序列表的并入
包含在名为“BCS216120_01_SEQLIST_ST26.XML”的文件中的27,581字节(如在Microsoft 中测量的)的序列表创建于2022年8月11日，并且通过电子递交在此提交且通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程领域。更具体地，本发明涉及可用于调节植物中的基因表达的DNA分子。
背景技术
调控元件是通过调节可操作地连接的可转录DNA分子的转录来调控基因活性的遗传元件。此类元件可包括启动子、前导序列、内含子和3'非翻译区，并且可用于植物分子生物学和植物遗传工程领域。
发明内容
本节提供本公开的总体概述，并且不是其全部范围或其所有特征的全面公开。
本文提供了用于植物中的基因调控元件。若干个实施方案涉及包含调控元件的重组DNA分子。还提供了包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。在一个实施方案中，调控元件可操作地连接至可转录DNA分子。在某些实施方案中，可转录DNA分子对于调控序列可以是异源的。因此，在特定的实施方案中，本文提供的调控元件序列可以被定义为可操作地连接至异源可转录DNA分子。若干个实施方案涉及使用调控元件以及制备和使用包含调控元件的重组DNA分子、以及包含与可转录DNA分子可操作地连接的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。
在一些实施方案中，提供了一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ IDNO:1-3中的任一个的序列；和(c)SEQ ID NO:1-3中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在具体的实施方案中，重组DNA分子包含与SEQ ID NO:1-3中任一个的DNA序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的DNA序列。
在另一个方面，本文提供了包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：(a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少约85％序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列；和(c)SEQ ID NO:1-3中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述DNA序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在某些实施方案中，转基因植物细胞是单子叶植物细胞。在其他实施方案中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
在另一个方面，本文还提供了一种包含重组DNA分子的转基因植物或其部分，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列；和(c)SEQ ID NO:1-3中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。在具体的实施方案中，转基因植物是包含重组DNA分子的任何世代的后代植物。还提供了包含重组DNA分子的转基因种子，其在生长时产生这种转基因植物。
若干个实施方案涉及一种生产商业产品的方法，其包括获得含有如本文所述的重组DNA分子(诸如包含选自SEQ ID NO:1-3的序列的那些)的转基因植物或其部分，以及由其生产商业产品。在一个实施方案中，商业产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
若干个实施方案涉及一种生产包含重组DNA分子的转基因植物的方法，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的DNA序列：a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；b)包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列；和(c)SEQ ID NO:1-3中的任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性，所述方法包括用重组DNA分子转化植物细胞以产生转化的植物细胞并且由转化的植物细胞再生转基因植物。
序列简述
SEQ ID NO:1是调控表达元件组或EXP，EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2的DNA序列，其包含启动子(P-ANDge.LTP:1)，可操作地连接至来源于大须芒草(Andropogon gerardii)的前导序列(L-ANDge.LTP:1)的5'，可操作地连接至来源于栗(Setaria italica)的内含子(I-SETit.eIF5A3-2-1:1:3)的5'。
SEQ ID NO:2是来源于大须芒草的启动子P-ANDge.LTP:1的DNA序列。
SEQ ID NO:3是来源于大须芒草的前导序列或5'UTR，L-ANDge.LTP:1的DNA序列。
SEQ ID NO:4是来源于栗的内含子I-SETit.eIF5A3-2-1:1:3的DNA序列。
SEQ ID NO:5是优化用于β-葡糖醛酸苷酶的植物表达的合成编码序列(GUS，GOI-Ec.uidA+St.LS1.nno:1)，其具有来源于马铃薯光诱导组织特异性St-LS1基因(基因库登录号：X04753)的可加工内含子。
SEQ ID NO:6是来源于沙生蔗茅(Saccharum ravennae)的3'UTR，T-SACra.Hsp16.9:2的DNA序列。
具体实施方式
现在将更全面地描述示例性实施方案。本文包括的描述和具体实例仅旨在用于说明的目的，并且不旨在限制本公开的范围。除非另有说明，否则术语应根据相关技术领域普通技术人员的常规用法来理解。
本文提供了在植物中具有基因调控活性的调控元件。这些调控元件的核苷酸序列提供为SEQ ID NO:1-3。这些调控元件能够影响植物组织中的可操作地连接的可转录DNA分子的表达，因此调控转基因植物中的可操作地连接的转基因的基因表达。还提供了修饰、生产和使用含有所提供的调控元件的重组DNA分子的方法。还提供了包括转基因植物细胞、植物、植物部分和种子的组合物以及用于制备和使用所述组合物的方法，所述转基因植物细胞、植物、植物部分和种子含有包含如本文所述的一个或多个调控元件的重组DNA分子。
DNA分子
如本文所用，术语“DNA”或“DNA分子”是指从5'(上游)端至3'(下游)端读取的基因组或合成来源的双链DNA分子，即，脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或DNA分子。如本文所用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。本文使用的命名法对应于美国联邦规则汇编§1.822(United States Code of Federal Regulations§1.822)的标题37，并且在WIPO标准ST.25(1998)，附录2，表1和3的表中阐明。
如本文所用，“重组DNA分子”是包含在没有人为干预的情况下不会天然一起存在的DNA分子组合的DNA分子。例如，重组DNA分子可以是由相对于彼此异源的至少两个DNA分子组成的DNA分子、包含与自然界中存在的DNA序列有偏差的DNA序列的DNA分子、包含合成DNA序列的DNA分子、或已通过遗传转化或基因编辑并入宿主细胞的DNA中的DNA分子。
本申请中提到的“分离的DNA分子”或等同的术语或短语旨在意指所述DNA分子是单独存在或与其他组分组合存在的，但不在其天然环境中的DNA分子。例如，只要在生物体的基因组的DNA中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，所述元件就不被认为是“分离的”。然而，只要这些元件中的每一个以及这些元件的子部分不在生物体的基因组内并且不在其天然存在的基因组内的位置处，所述元件在本公开的范围内就是“分离的”。类似地，只要编码杀昆虫蛋白或该蛋白的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列不在编码所述蛋白的序列天然存在的细菌的DNA中，所述核苷酸序列就是分离的核苷酸序列。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成核苷酸序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，例如插入植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的DNA的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、存在于植物或细菌的基因组中或以可检测的量存在于衍生自植物或细菌的组织、后代、生物样品或商业产品中。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最佳比对的多肽序列相同的程度。通过比对两个序列(例如，参考序列和另一个序列)产生最佳序列比对，以使序列比对中具有适当内部核苷酸插入、缺失或缺口的核苷酸匹配数最大化。在一些实施方案中，提供为SEQ ID NO:1-4的DNA序列用作参考序列。
如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“百分比同一性”或“％同一性”是同一性分数乘以100。与参考序列最佳比对的序列的“同一性分数”是最佳比对中的核苷酸匹配数，除以参考序列中的核苷酸总数，例如，整个参考序列全长中的核苷酸总数。因此，若干个实施方案涉及包含序列的DNA分子，所述序列在与本文提供为SEQ ID NO:1-4的参考序列最佳比对时，与参考序列具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。
调控元件
调控元件，诸如启动子、前导序列(也称为5'UTR)、增强子、内含子和转录终止区(或3'UTR)，在活细胞中基因的整体表达中发挥着不可或缺的作用。如本文所用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子。如本文所用，术语“基因调控活性”是指影响可操作地连接的可转录DNA分子的表达的能力，例如通过影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译。在植物中发挥作用的调控元件，诸如启动子、前导序列、增强子、内含子和3'UTR，可用于通过遗传工程来修饰植物表型。
如本文所用，“调控表达元件组”或“EXP”序列可指代一组可操作地连接的调控元件，诸如增强子、启动子、前导序列和内含子。例如，调控表达元件组可以例如包含可操作地连接至前导序列5'、可操作地连接至内含子序列5'的启动子。在一些实施方案中，EXP表示为SEQ ID NO:1。
调控元件可通过其基因表达模式来表征，例如，正性和/或负性效应，诸如组成性表达或时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应表达及其任何组合，以及通过定量或定性指示来表征。如本文所用，“基因表达模式”是可操作地连接的DNA分子转录成转录的RNA分子的任何模式。转录的RNA分子可被翻译以产生蛋白质分子或者可提供反义或其他调控RNA分子，诸如双链RNA(dsRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)等。
如本文所用，术语“蛋白质表达”是转录的RNA分子翻译成蛋白质分子的任何模式。蛋白质表达可通过其时间、空间、发育或形态性质，以及通过定量或定性指示来表征。
启动子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。如本文所用，术语“启动子”总体上是指涉及识别和结合RNA聚合酶(例如，RNA聚合酶II)和其他蛋白质(诸如反式作用转录因子)以启动转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5'非翻译区域(5'UTR)分离。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至前导序列的5'。启动子可以是合成产生或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的。嵌合启动子通过两个或更多个异源DNA分子的融合来产生。在一些实施方案中，启动子表示为SEQ ID NO:2或其片段或变体。在一些实施方案中，如本文所述的要求保护的DNA分子及其任何变体或衍生物被进一步定义为包含启动子活性，即能够在宿主细胞中(诸如在转基因植物细胞中)充当启动子。在其他具体的实施方案中，片段可以被定义为表现出其所衍生自的起始启动子分子所具有的启动子活性，或者片段可包含“最小启动子”，其提供基础水平的转录并且包含用于识别和结合RNA聚合酶II复合物以启动转录的TATA盒或等效DNA序列。
在一个实施方案中，提供了本文公开的启动子序列的片段。启动子片段可包含如上所述的启动子活性，并且可以单独使用或与其他启动子和启动子片段组合使用，诸如在构建嵌合启动子时，或者与其他表达元件和表达元件片段组合使用。在一些实施方案中，提供了启动子的片段，其包含具有如本文所公开的启动子活性的DNA分子的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个、或至少约1000个连续核苷酸或更长。在一些实施方案中，提供了启动子的片段，其包含DNA序列的至少约50个、至少约75个、至少约95个、至少约100个、至少约125个、至少约150个、至少约175个、至少约200个、至少约225个、至少约250个、至少约275个、至少约300个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约750个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个、至少约1050个、至少约1100个、或至少约1150个连续核苷酸，所述DNA序列包含TATA盒并且与具有如本文所公开的启动子活性的SEQ ID NO.2具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。用于由起始启动子分子产生此类片段的方法是本领域众所周知的。
衍生自SEQ ID NO:2的启动子元件(诸如内部或5'缺失)的组合物例如可以使用本领域已知的方法产生以改善或改变表达，包括通过去除对表达具有正面或负面影响的元件；复制对表达具有正面或负面影响的元件；和/或复制或去除对表达具有组织或细胞特异性影响的元件。衍生自SEQ ID NO:2的启动子元件的组合物可用于例如制备增强子元件，所述启动子元件包含3'缺失，其中TATA盒元件或其等效序列和下游序列被去除。可以进一步删除以去除对表达具有正面或负面；组织特异性；细胞特异性；或时间特异性(诸如但不限于昼夜节律)影响的任何元件。提供为SEQ ID NO:2的启动子元件及来源于其的片段或增强子可用于制备嵌合转录调控元件组合物。
可以分析如本文所述的启动子或启动子片段是否存在已知的启动子元件，例如DNA序列特性，诸如TATA盒和其他已知的转录因子结合位点基序。本领域技术人员可以使用此类已知的启动子元件的鉴定来设计与原始启动子具有类似表达模式的启动子的变体。
如本文所用，术语“前导序列”是指从基因的非翻译5'区(5'UTR)分离的DNA分子并且总体上定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。替代地，前导序列可以是合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的5'调控元件。前导序列分子可以与异源启动子或与其原生启动子一起使用。若干个实施方案涉及表示为SEQ ID NO:3的前导序列或其片段或变体。在具体的实施方案中，此类DNA序列可被定义为能够充当宿主细胞(包括例如转基因植物细胞)中的前导序列。在一个实施方案中，此类序列被解码为包含前导序列活性。在一些实施方案中，提供了前导序列的片段，其包含DNA序列的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、或至少约95个连续核苷酸，所述DNA序列与具有如本文所公开的前导序列活性的SEQ ID NO.3具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。
SEQ ID NO:3的前导序列(也称为5'UTR)可包含调控元件，或者可以采用可以对可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译具有影响的二级结构。SEQ ID NO：3的前导序列或其片段或变体可用于制备影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录或翻译的嵌合调控元件。
如本文所用，术语“内含子”是指可以从基因分离或鉴定的DNA分子并且可总体上定义为在翻译之前的信使RNA(mRNA)处理期间剪接的区域。替代地，内含子可以是合成产生或操纵的DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作用于调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达的调控元件。构建体可包括内含子，并且内含子可相对于可转录DNA分子是异源的或不是异源的。内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子和玉米HSP70内含子。
在植物中，相对于缺乏内含子的构建体，在基因构建体中包含一些内含子导致mRNA和蛋白质积累增加。这种效应被称为基因表达的“内含子介导的增强”(IME)。已知刺激植物中的表达的内含子已在玉米基因(例如，tubA1、Adh1、Sh1和Ubi1)、水稻基因(例如，tpi)和双子叶植物基因(例如，rbcS)中得到鉴定，所述双子叶植物基因如来自矮牵牛花(petunia)(例如，rbcS)、马铃薯(例如，st-ls1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(例如，ubq3和pat1)的那些。研究表明，内含子剪接位点内的缺失或突变会降低基因表达，表明IME可能需要剪接。然而，双子叶植物中的IME已通过拟南芥pat1基因剪接位点内的点突变得到证实。在一种植物中多次使用同一内含子已经显示表现出缺点。在那些情况下，有必要收集基本控制元件来构建适当的重组DNA元件。可以与其他调控元件(例如，表示为SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3的调控元件)组合使用的内含子的实例表示为SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，内含子可以设置为与SEQ ID NO.4具有至少约85％同一性、至少约86％同一性、至少约87％同一性、至少约88％同一性、至少约89％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性、或至少约100％同一性。
如本文所用，术语“3'转录终止分子”、“3'非翻译区”或“3'UTR”是指在mRNA分子的3'部分的非翻译区的转录期间所使用的DNA分子。mRNA分子的3'非翻译区(也称为聚腺苷酸尾部)可以通过特异性切割和3'聚腺苷酸化生成。3'UTR可以可操作地连接至可转录DNA分子并位于其下游，并且可以包括聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其他调控信号。聚腺苷酸尾部被认为在mRNA稳定性和翻译起始中发挥作用。3'转录终止分子的实例为胭脂碱合酶3'区、小麦hsp173'区、豌豆rubisco小亚基3'区、棉花E6 3'区和薏苡仁(coixin)3'UTR。
3'UTR通常有益于特定DNA分子的重组表达。弱3'UTR有可能生成通读，这可能会影响位于相邻表达盒中的DNA分子的表达。转录终止的适当控制可以防止通读位于下游的DNA序列(例如，其他表达盒)，并且可以进一步允许RNA聚合酶的有效再循环以改善基因表达。转录的有效终止(从DNA中释放RNA聚合酶II)是重新启动转录的先决条件，从而直接影响总体转录水平。转录终止后，成熟的mRNA从合成位点释放，并且模板被转运至细胞质。真核mRNA在体内以poly(A)形式积累，使得很难通过常规方法检测转录终止位点。然而，很难通过生物信息学方法预测功能性的和高效的3'UTR，因为没有保守的DNA序列允许轻松预测有效的3'UTR。
从实际角度来看，表达盒中使用的3'UTR具有以下特性通常是有益的。第一，3'UTR应当能够高效且有效地终止可转录DNA分子(例如，转基因)的转录，并且防止转录物通读任何相邻的DNA序列，所述相邻的DNA序列可包含另一个表达盒，如多个表达盒存在于一个转运DNA(T-DNA)中或存在于已经插入T-DNA的相邻染色体DNA中的情况下。第二，3'UTR不应导致用于驱动可转录DNA分子表达的启动子、前导序列、增强子和内含子所赋予的转录活性降低。最后，在植物生物技术中，3'UTR通常用于引发从转化的植物中提取的逆转录RNA的扩增反应，并且用于：(1)评估表达盒整合到植物染色体中之后的转录活性或表达；(2)评估植物DNA内的插入的拷贝数；以及(3)评估育种后的所得种子的接合性。3'UTR还用于从转化的植物中提取的DNA的扩增反应，以表征插入盒的完整性。可以与调控元件(例如，表示为SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的调控元件)组合使用的3'UTR表示为SEQ ID NO:6。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接的可转录DNA分子的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效DNA序列。启动子或启动子片段可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的DNA序列的转录的增强子元件。增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。
据信许多启动子增强子元件结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA拓扑结构，产生选择性地允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或者促进转录起始位点处的双螺旋的选择性打开的局部构象。增强子元件可起到与调控转录的转录因子结合的作用。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。增强子元件可以通过多种技术来鉴定，包括删除分析，即从启动子的5'端或内部删除一个或多个核苷酸；使用DNase I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电移位切测定、通过连接介导的聚合酶链反应(PCR)进行的体内基因组足迹法和其他常规测定，或通过使用已知的顺式元件基序或增强子元件作为靶序列或靶基序，使用常规DNA序列比较方法(诸如BLAST)进行DNA序列相似性分析。增强子结构域的精细结构可以通过一个或多个核苷酸的诱变(或取代)或通过本领域已知的其他常规方法来进一步研究。增强子元件可以通过化学合成或通过从包含此类元件的调控元件分离来获得，并且它们可以与含有有用的限制酶位点的附加侧翼核苷酸一起合成以促进后续操作。因此，本文考虑了根据本文公开的方法设计、构建和使用增强子元件来调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达。增强子可以衍生自表示为SEQ ID NO:2的启动子。
如本文所用，术语“嵌合”是指通过将第一DNA分子融合至第二DNA分子而产生的单个DNA分子，其中第一DNA分子和第二DNA分子都不会以该构型(即，彼此融合)正常存在。因此，嵌合DNA分子是自然界中原本正常不存在的新的DNA分子。如本文所用，术语“嵌合启动子”是指通过DNA分子的这种操作产生的启动子。嵌合启动子可以组合两个或更多个DNA片段，例如启动子与增强子元件的融合。因此，本文考虑了根据本文公开的方法设计、构建和使用嵌合启动子来调节可操作地连接的可转录DNA分子的表达。
嵌合调控元件可被设计成包含可通过本领域已知的各种方法可操作地连接的各种组成元件，所述方法诸如限制酶消化和连接、不依赖于连接的克隆、扩增期间PCR产物的模块化组装、或调控元件的直接化学合成、以及本领域已知的其他方法。所得的各种嵌合调控元件可以包含相同的组成元件或其变体，但在包含一个或多个允许组成部分可操作地连接的连接DNA序列的一个或多个DNA序列方面有所不同。在一些实施方案中，提供为SEQ IDNO:1-3的DNA序列可提供调控元件参考序列，其中包含参考序列的组成元件可以通过本领域已知的方法连接并且可以包含一个或多个核苷酸的取代、缺失、和/或插入或在细菌和植物细胞转化中自然存在的突变。
如本文所用，术语“变体”是指组成与第一DNA分子类似但不相同的第二DNA分子(诸如调控元件)，并且其中第二DNA分子仍然保持第一DNA分子的一般功能性，例如，相同或相似的表达模式，例如通过或多或少等效的转录活性。变体可以是第一DNA分子的缩短或截短版本或第一DNA分子的序列的改变版本，诸如具有不同限制酶位点和/或内部缺失、取代或插入的DNA分子。“变体”还可以涵盖具有核苷酸序列的调控元件，所述核苷酸序列包含参考序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，其中衍生的调控元件具有与对应的亲本调控分子相比或多或少或同等的转录或翻译活性。调控元件“变体”还涵盖由细菌和植物细胞转化中天然存在的突变产生的变体。在一些实施方案中，提供为SEQ ID NO:1-4的多核苷酸序列可用于产生变体，所述变体与原始调控元件的DNA序列组成相似但不相同，同时仍保持原始调控元件的一般功能性，例如相同或相似的表达模式。鉴于本公开，此类变体的产生完全在本领域的普通技能范围内并且本文考虑了这一点。
本文所述的修饰、复制或缺失对特定转基因的期望表达方面的功效可以在稳定和瞬时的植物测定(诸如本文的工作实施例中描述的那些)中凭经验进行测试，以便验证结果，所述结果可根据在起始DNA分子中进行的改变和改变的目标而变化。
构建体
如本文所用，术语“构建体”意指任何重组DNA分子，诸如质粒、粘粒、病毒、噬菌体、或线性或环状DNA或RNA分子，其来源于任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包含DNA分子，其中至少一个DNA分子已经以功能性操作方式连接(即，可操作地连接)至另一DNA分子。如本文所用，术语“载体”意指可用于转化目的(即，将异源DNA或RNA引入宿主细胞中)的任何构建体。构建体通常包含一个或多个表达盒。如本文所用，“表达盒”是指至少包含可操作地连接至一个或多个调控元件(通常至少启动子和3'UTR)的可转录DNA分子的重组DNA分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一DNA分子与第二DNA分子连接，其中第一和第二DNA分子如此排列，使得第一DNA分子影响第二DNA分子的功能。两个DNA分子可以是或可以不是单个连续DNA分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中的感兴趣的可转录DNA分子的转录，则启动子与可转录DNA分子可操作地连接。例如，当前导序列能够影响DNA序列的转录或翻译时，所述前导序列与DNA分子可操作地连接。
在一些实施方案中，如本文所述与可转录DNA分子可操作地连接的一种或多种调控元件提供在双肿瘤诱导(Ti)质粒边界构建体中，所述构建体具有包含T-DNA的从根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分离的Ti质粒的右边界(RB或AGRtu.RB)和左边界(LB或GRtu.LB)区，所述一种或多种调控元件与由根瘤农杆菌细胞提供的转运分子一起，允许T-DNA整合到植物细胞基因组中(参见，例如，美国专利6,603,061)。构建体还可以含有在细菌细胞中提供复制功能和抗生素选择的质粒骨架DNA区段，例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)复制起点，诸如ori322，广泛宿主范围复制起点，诸如oriV或oriRi，以及选择性标志物的编码区，诸如编码赋予对大观霉素(spectinomycin)或链霉素(streptomycin)或庆大霉素(Gm，Gent)选择性标志物基因的抗性的Tn7氨基糖苷类腺苷酸转移酶(aadA)的Spec/Strp。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404，然而植物转化领域技术人员已知的其他菌株也可以发挥作用。
用于以使得可转录DNA分子转录成翻译并表达为蛋白质的功能性mRNA分子的方式将构建体组装并引入细胞中的方法是本领域已知的。用于制备和使用构建体和宿主细胞的组合物和方法是本领域技术人员众所周知的。可用于在植物中表达核酸的典型载体是本领域众所周知的，并且包括来源于根癌农杆菌的Ti质粒的载体和pCaMVCN转运控制载体。
构建体中可以包含各种调控元件，包括本文提供的那些中的任一种。任何此类调控元件可以与其他调控元件组合提供。可以设计或修改此类组合以产生期望的调控特征。在一个实施方案中，构建体可包含至少一个与可转录DNA分子可操作地连接的调控元件，所述可转录DNA分子与3'UTR可操作地连接。
在一些实施方案中，构建体可包括本文提供的或本领域已知的任何启动子或前导序列。例如，启动子(例如，SEQ ID NO:2或其片段或变体)可以可操作地连接至异源非翻译5'前导序列，诸如来源于热休克蛋白基因的前导序列。或者，前导序列(例如，SEQ ID NO:3或其片段或变体)可以可操作地连接至异源启动子，诸如花椰菜花叶病毒35S转录物启动子。
表达盒还可以包括转运肽编码序列，其编码可用于可操作地连接的蛋白质的亚细胞靶向，特别是亚细胞靶向至叶绿体、白色体或其他质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡；或细胞外位置的肽。许多叶绿体定位蛋白作为前体由核基因表达，并且通过叶绿体转运肽(CTP)靶向叶绿体。此类分离的叶绿体蛋白的实例包括但不限于与以下相关的那些：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、光捕获复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F和烯醇式丙酮酸莽草酸磷酸合酶(EPSPS)。叶绿体转运肽描述于例如美国专利号7,193,133中。已经证明，非叶绿体蛋白可以通过与编码非叶绿体蛋白的转基因可操作地连接的异源CTP的表达而靶向叶绿体。
可转录DNA分子
如本文所用，术语“可转录DNA分子”是指能够转录成RNA分子的任何DNA分子，包括但不限于具有蛋白质编码序列的那些分子、编码指导RNA(gRNA)的那些分子、和产生具有可用于基因抑制的序列的RNA分子(例如，siRNA、miRNA和dsRNA)的那些分子。DNA分子的类型可包括但不限于来自相同植物的DNA分子、来自另一种植物的DNA分子、来自不同生物体的DNA分子、或合成DNA分子，诸如含有基因的反义信息的DNA分子、或编码人工、合成或另外修饰版本的转基因的DNA分子。用于并入到如本文所述的构建体中的可转录DNA分子的实例包括，例如，来自与并入DNA分子的物种不同的物种的DNA分子或基因，或来源于或存在于相同物种中，但通过遗传工程方法而不是经典育种技术并入到受体细胞中的基因。
如本文所用，术语“异源可转录DNA分子”是指相对于与其可操作地连接的一个或多个调控元件是异源的可转录DNA分子。
“转基因”是指至少相对于其在宿主细胞基因组中的位置对于宿主细胞异源的可转录DNA分子和/或在当前或任何以前世代的细胞中人工并入宿主细胞基因组中的可转录DNA分子。
调控元件，诸如启动子(例如，SEQ ID NO:2或其片段或变体)，可以可操作地连接至相对于调控元件异源的可转录DNA分子。如本文所用，术语“异源”是指两个或更多个DNA分子(或核苷酸序列)的组合，这种组合通常不存在于自然界中。例如，两个DNA分子(或核苷酸序列)可以来源于不同物种且/或两个DNA分子(或核苷酸序列)可以来源于不同基因，例如，来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果这种组合通常不存在于自然界中，即，可转录DNA分子并非天然地与调控序列可操作地连接，则调控元件相对于可操作地连接的可转录DNA分子是异源的。
可转录DNA分子总体上可以是期望转录物的表达的任何DNA分子。转录物的这种表达可导致所得mRNA分子的翻译，从而导致蛋白质表达。或者，例如，可转录的DNA分子可被设计为最终导致特定基因或蛋白质的表达减少。在一个实施方案中，这可以通过使用沿反义方向定向的可转录DNA分子来实现。本领域普通技术人员熟悉使用这种反义技术。任何基因都可以此方式负性调控，并且在一个实施方案中，可转录DNA分子可被设计成通过dsRNA、siRNA或miRNA分子的表达来抑制特定基因。
因此，一个实施方案提供了一种包含调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些)的重组DNA分子，所述调控元件可操作地连接至异源可转录DNA分子，使得当构建体整合到转基因植物细胞的基因组中时，以期望的水平或以期望的模式调节可转录DNA分子的转录。在一个实施方案中，可转录DNA分子包含基因的蛋白质编码区，并且在另一实施方案中，可转录DNA分子包含基因的反义区。
具有农艺价值的基因
可转录DNA分子可以包含具有农艺价值的基因。如本文所用，术语“具有农艺价值的基因”是指当在特定植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予期望特性的可转录DNA分子。具有农艺价值的基因的产物可以在植物内发挥作用，以便对植物形态学、生理学、生长、发育、产量、谷物组成、营养状况、疾病或害虫抗性和/或环境或化学耐受性产生影响，或者可以充当以植物为食的害虫的饮食中的杀虫剂。在一个实施方案中，将调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些)并入到构建体中，使得调控元件可操作地连接至作为具有农艺价值的基因的可转录DNA分子。在含有这种构建体的转基因植物中，具有农艺价值的基因的表达可以赋予有益的农艺性状。有益的农艺性状可包括例如但不限于除草剂耐受性、昆虫防治、改良的产量、疾病抗性、病原体抗性、改良的植物生长和发育、改良的淀粉含量、改良的油含量、改良的脂肪酸含量、改良的蛋白质含量、改良的水果成熟度、增强的动物和人类营养、生物聚合物生产、环境压力抗性、药用肽、改进的加工质量、改进的风味、杂交种子生产效用、改进的纤维生产、加强的碳封存和期望的生物燃料生产。
本领域已知的具有农艺价值的基因的实例包括以下的基因：除草剂抗性(美国专利号6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；和5,463,175)、增加的产量(美国专利号USRE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；和5,716,837)、昆虫防治(美国专利号6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658；5,880,275；5,763,245；和5,763,241)、真菌疾病抗性(美国专利号6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；和6,506,962)、病毒抗性(美国专利号6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；和5,304,730)、线虫抗性(美国专利号6,228,992)、细菌疾病抗性(美国专利号5,516,671)、植物生长和发育(美国专利号6,723,897和6,518,488)、淀粉生产(美国专利号6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)、改良的油生产(美国专利号6,444,876；6,426,447；和6,380,462)、高油生产(美国专利号6,495,739；5,608,149；6,483,008；和6,476,295)、改良的脂肪酸含量(美国专利号6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；和6,459,018)、高蛋白生产(美国专利号6,380,466)、水果成熟(美国专利号5,512,466)、增强的动物和人类营养(美国专利号6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；和6,171,640)、生物聚合物(美国专利号USRE37,543；6,228,623；和5,958,745和6,946,588)、环境压力抗性(美国专利号6,072,103)、药用肽和可分泌肽(美国专利号6,812,379；6,774,283；6,140,075；和6,080,560)、改进的加工性状(美国专利号6,476,295)、改进的消化性(美国专利号6,531,648)、低棉子糖(美国专利号6,166,292)、工业酶生产(美国专利号5,543,576)、改进的风味(美国专利号6,011,199)、固氮作用(美国专利号5,229,114)、杂交种子生产(美国专利号5,689,041)、纤维生产(美国专利号6,576,818；6,271,443；5,981,834；和5,869,720)和生物燃料生产(美国专利号5,998,700)。
或者，具有农艺价值的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调节的RNA分子来影响上述植物特性或表型，例如通过反义(参见，例如，美国专利5,107,065)；抑制性RNA(“RNAi”，包括通过miRNA、siRNA、反式作用siRNA和定相sRNA介导的机制来调节基因表达，例如，如已发表的申请U.S.2006/0200878和U.S.2008/0066206以及美国专利申请11/974,469中所述)；或共抑制介导的机制。RNA还可以是经工程改造以切割期望的内源mRNA产物的催化RNA分子(例如，核酶或核糖开关；参见，例如U.S.2006/0200878)。以使得可转录DNA分子转录成能够引起基因抑制的分子的方式用于构建构建体并将其引入细胞中的方法是本领域已知的。
选择性标志物
编码选择性标志物的可转录DNA分子也可以与调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些)一起使用。如本文所用，术语“选择性标志物”是指其在转基因植物、组织或细胞中的表达或表达的缺乏可以以一些方式进行筛选或评分的任何可转录DNA分子。可选择标志物及其相关选择和筛选技术是本领域已知的，并且包括但不限于，编码β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、赋予抗生素抗性的蛋白质、和赋予除草剂耐受性的蛋白质的可转录DNA分子。选择性标志物转基因的实例提供为SEQ ID NO:5。
基因组编辑
若干个实施方案涉及包含表达盒的重组DNA构建体，所述表达盒包含与SEQ IDNO:1-3或其片段具有至少约85％序列同一性、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性或更高序列同一性的序列，所述SEQ ID NO:1-3或其片段可操作地连接至编码用于进行基因组修饰的位点特异性基因组修饰酶和/或任何相关蛋白的异源DNA序列。这些一个或多个位点特异性基因组修饰酶表达盒可以与用于模板编辑的供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体上(反式)。若干种编辑方法是本领域已知的，其涉及修饰基因组DNA的不同序列特异性基因组修饰酶(或蛋白质和/或指导RNA的复合物)。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过在期望的基因组位点或基因座处诱导双链断裂(DSB)或切口对基因组进行修饰。在一些实施方案中，在修复由基因组修饰酶引入的DSB或切口的过程期间，供体模板DNA可以在DSB或切口的位点处被整合到基因组中。在一些实施方案中，在修复由基因组修饰酶引入的DSB或切口的过程期间，可以将插入或缺失突变(插入缺失)引入到基因组中。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含腺嘌呤脱氨酶。在本公开中，位点特异性基因组修饰酶包括核酸内切酶、重组酶、转座酶、脱氨酶、解旋酶、逆转录酶及其任何组合。
若干个实施方案涉及如本文所述的基因调控元件，其可操作地连接至编码基因组编辑系统的一种或多种组分的异源可转录DNA分子。基因组编辑系统可用于将一个或多个插入、缺失、取代、碱基修饰、易位或倒位引入到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码序列特异性DNA结合结构域(诸如CRISPR-Cas效应蛋白、锌指蛋白或转录激活因子(TAL)蛋白)的异源可转录DNA分子。在一些实施方案中，序列特异性DNA结合结构域可以是融合蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码CRISPR-Cas效应蛋白的异源可转录DNA分子。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应蛋白选自I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至编码指导RNA的异源可转录DNA分子。如本文所用，“指导RNA”或“gRNA”是指识别靶DNA序列并且将CRISPR效应蛋白引导或“指导”至靶DNA序列的RNA。指导RNA包含与靶DNA互补的区域(称为crRNA)和结合CRISPR效应蛋白的区域(称为tracrRNA)。指导RNA可以是单个RNA分子(sgRNA)或两个单独的RNA分子(2片gRNA(2-piece gRNA))。在一些实施方案中，gRNA还可包含逆转录酶的RNA模板(pegRNA)。
若干个实施方案涉及如本文所述的基因调控元件，其可操作地连接至编码CRISPR-Cas基因组编辑系统的一种或多种组分的异源可转录DNA分子，所述CRISPR-Cas基因组编辑系统包含CRISPR-Cas效应蛋白。CRISPR-Cas效应蛋白的实例包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12h、Cas12i、Cas12g、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)、Csf5、Cas14a、Cas14b和Cas14c效应蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至在其核酸酶活性位点(例如，RuvC、HNH和/或NUC结构域)中包含突变的CRISPR-Cas效应蛋白。在其核酸酶活性位点中具有突变并因此不再包含核酸酶活性的CRISPR-Cas效应蛋白通常被称为“死的”，例如dCas。在一些实施方案中，与不具有突变的相同CRISPR-Cas效应蛋白相比，在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应蛋白结构域或多肽可以具有受损的活性或降低的活性。在一些实施方案中，如本文所述的基因调控元件可操作地连接至在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应蛋白，以生成可操作地连接至逆转录酶的切口酶活性。
细胞转化
还提供了产生转化细胞和植物的方法，所述转化细胞和植物包含与可转录DNA分子可操作地连接的一种或多种调控元件，诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些。
术语“转化”是指将DNA分子引入到受体宿主中。如本文所用，术语“宿主”是指细菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。特别感兴趣的植物组织和细胞包括原生质体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、秧苗、胚和花粉。
如本文所用，术语“转化”是指已经向其中引入外来DNA分子(诸如如本文所述的构建体)的细胞、组织、器官或生物体。引入的DNA分子被整合到受体细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的DNA分子被随后的后代继承。“转基因”或“转化的”细胞或生物体也可包括细胞或生物体的后代以及由杂交中使用这种转基因生物体作为亲代并且表现由外部DNA分子的存在引起的改变表现型的育种计划中产生的后代。引入的DNA分子还可以瞬时引入到受体细胞中，使得引入的DNA分子不被随后的后代继承。术语“转基因”是指含有一个或多个异源DNA分子的细菌、真菌或植物。
存在许多本领域技术人员众所周知的用于将DNA分子引入到植物细胞中的方法。所述方法通常包括选择合适的宿主细胞、用载体转化宿主细胞、以及获得转化的宿主细胞的步骤。通过将植物构建体引入到植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何众所周知的和已证明的方法。合适方法包括但不限于细菌感染(例如，农杆菌)、二元BAC载体、直接递送DNA(例如，通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA吸收、电穿孔、使用碳化硅纤维的搅拌和DNA涂布粒子的加速)、基因编辑(例如，CRISPR-Cas系统)等。
宿主细胞可以是任何细胞或生物体，诸如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或昆虫细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞和转化的细胞可包括来自作物植物的细胞。
随后可以由如本文所述的转基因植物细胞再生转基因植物。使用常规育种技术或自花授粉，可以由这种转基因植物产生种子。这种种子和由这种种子生长的所得的后代植物将含有如本文所述的重组DNA分子(诸如包含选自SEQ ID NO:1-3的序列的重组DNA分子)，并因此将是转基因的。
转基因植物可以自花授粉以提供纯合转基因植物(对于如本文所述的重组DNA分子是纯合的)的种子，或者与非转基因植物或不同的转基因植物杂交以提供杂合转基因植物(对于如本文所述的重组DNA分子是杂合的)的种子。此类纯合和杂合转基因植物在本文中均称为“后代植物”。后代植物是起源于原始转基因植物并且含有如本文所述的重组DNA分子的转基因植物。可以收获使用转基因植物产生的种子并将其用于培育转基因植物的世代，即包含如本文所述的重组DNA分子并表达具有农艺价值的基因的后代植物。通常用于不同作物的育种方法的描述可见于若干本参考书之一，参见，例如，Allard,Principles ofPlant Breeding,John Wiley&Sons,NY,U.of CA,Davis,CA,50-98(1960)；Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman,Inc.,NY,369-399(1979)；Sneep和Hendriksen,Plant breeding Perspectives,Wageningen(编辑),Center forAgricultural Publishing and Documentation(1979)；Fehr,Soybeans:Improvement,Production and Uses,第2版,Monograph,16:249(1987)；Fehr,Principles of VarietyDevelopment,Theory and Technique,(第1卷)和Crop Species Soybean(第2卷),IowaState Univ.,Macmillan Pub.Co.,NY,360-376(1987)。
可以分析转化的植物中是否存在一个或多个感兴趣的基因以及由调控元件(诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些)赋予的表达水平和/或谱(profile)。本领域技术人员知道可用于分析转化的植物的多种方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生化分析、表型筛选方法、现场评估和免疫诊断测定。可转录DNA分子的表达可以使用(Applied Biosystems,Foster City,CA)试剂和如制造商所述的方法进行测量，并且使用/>测试矩阵确定PCR循环时间。或者，可以使用/>(Third Wave Technologies,Madison,WI)试剂和如制造商所述的方法来评价转基因表达。
还提供了如本文所述的植物的部分。植物部分包括但不限于叶、茎、根、块茎、种子、胚乳、胚珠和花粉。植物部分可以是存活的、非存活的、可再生的和/或不可再生的。还提供了转化的植物细胞，其包含如本文所述的DNA分子，诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些。转化的或转基因植物细胞包括可再生和/或不可再生的植物细胞。
由含有如本文所述的重组DNA分子(诸如提供为SEQ ID NO:1-3的那些)的转基因植物或其部分产生的商业产品。在一些实施方案中，商业产品含有可检测量的DNA，所述DNA包含选自由SEQ ID NO:1-3或其片段或变体组成的组的DNA序列。如本文所用，“商业产品”是指包含来源于转基因植物、种子、植物细胞或植物部分的材料的任何组合物或产物，所述转基因植物、种子、植物细胞或植物部分含有如本文所述的重组DNA分子，诸如提供为SEQID NO:1-3的那些。商业产品包括但不限于加工的种子、谷物、植物部分和粗粉。考虑了包含可检测量的DNA的商业产品，所述DNA对应于如本文所述的重组DNA分子，诸如提供为SEQ IDNO:1-3的那些。样品中这种DNA的一种或多种的检测可用于确定商业产品的含量或来源。可以使用检测DNA分子的任何标准方法，包括本文公开的检测方法。
本文所述的实施方案可通过参考以下实施例来更容易理解，所述实施例通过说明提供，并且不旨在限制本发明，除非指定。本领域技术人员应当理解，在以下实施例中公开的技术代表本发明者发现的在实践本发明中发挥较好作用的技术。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应当理解可以在公开的具体实施方案中进行许多变化，并且仍然获得同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围，因此提出的所有事项应理解为例示性的，而不具有限制意义。
实施例
实施例1
调控元件的鉴定和克隆
本实施例描述了来源于大须芒草(Big bluestem)的调控表达元件的鉴定、合成和克隆。
从单子叶植物物种大须芒草(Big bluestem)的基因组DNA中鉴定并分离出一种新型脂质转运蛋白(LTP)启动子和前导序列。使用专有组装的基因组DNA序列的生物信息分析来查找同源LTP基因序列。合成了大须芒草LTP基因的已鉴定的启动子和前导序列，并将其可操作地连接至来源于栗的内含子。内含子的选择基于实验数据，其证明当内含子与根优选的启动子和前导序列可操作地连接时，内含子增强玉米中的根表达。
表1呈现了来自大须芒草的已鉴定的EXP及其对应的启动子和前导序列，以及来自栗的内含子。
表1.调控表达元件组、启动子、前导序列和内含子。
使用本领域已知的方法合成已鉴定的EXP并克隆到二元植物转化载体构建体中，位于用于驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)表达的表达盒内，以评估稳定转化的玉米植物中的EXP的活性，如实施例2中所述。
实施例2
稳定转化的玉米植物中的EXP-ANDge.Ubq:5驱动的GUS表达的分析
用载体转化玉米植物，特别是用含有驱动β-葡糖醛酸苷酶(GUS)转基因表达的EXP，EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2(SEQ ID NO:1)的植物表达载体。分析所得植物的GUS蛋白表达，以评估调控元件组(EXP)对表达的影响。
用植物GUS表达构建体转化玉米植物。使用本领域已知的标准方法将EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2(SEQ ID NO:1)克隆到基础植物表达载体中。所得植物表达载体包含来自根瘤农杆菌的左边界区域(B-AGRtu.左边界)、第一转基因选择盒，其用于选择赋予除草剂草甘膦抗性的转化的植物细胞、第二转基因盒，其用于评估包含转基因盒的EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2的活性，所述转基因盒包含EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2(SEQ ID NO:1)，其可操作地连接至包含可加工内含子(SEQ ID NO:5)的GUS编码序列的5'，可操作地连接至3'UTR(T-SACra.Hsp16.9:2，SEQ ID NO:6)、以及来自根瘤农杆菌的右边界区域(B-AGRtu.右边界)。
如本领域众所周知的，使用上述二元转化载体构建体通过农杆菌介导的转化来转化玉米植物细胞。诱导所得转化的植物细胞以形成完整的玉米植物。
使用定性和定量GUS分析来评价转化的植物中的所选植物器官和组织中的表达元件活性。为了通过组织化学染色来定性分析GUS表达，将整块或切片组织与含有1mg/mL X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-葡糖苷酸)的GUS染色溶液在37℃下孵育5小时并用35％EtOH和50％乙酸脱色。通过在解剖显微镜或复合显微镜下目视检查所选择的植物器官或组织的蓝色染色来定性确定GUS的表达。
为了通过酶测定来定量分析GUS表达，从转化的玉米植物的所选择组织中提取总蛋白。将一至两微克的总蛋白与1mM浓度的荧光底物4-甲基伞形酰基(eumbelliferyl)--D-葡糖苷酸(MUG)在50微升的总反应体积中孵育。在37℃下孵育1小时后，通过添加350微升的200mM碳酸氢钠溶液来停止反应。反应产物4-甲基伞形酮(4-MU)在高pH下发出最大的荧光，其中羟基被电离。添加碱性碳酸钠溶液同时停止测定，并且调节pH以量化荧光产物4-MU。通过使用FLUOstar Omega微板读板器(BMG LABTECH)测量荧光来估计形成的4-MU的量(在355nm处激发，在460nm处发射)。以4-MU/小时/mg总蛋白的纳摩尔数提供GUS活性值。/>
对于R0世代中的GUS表达，对以下组织进行取样：V4阶段叶和根；V7阶段叶和根；VT阶段叶和茎/节间；R1阶段穗轴/丝；以及授粉后(DAP)21天的R3阶段种子胚。表2示出了采样组织的平均定量GUS表达。
表2.稳定转化的玉米植物的平均GUS表达。
在表2中可以观察到，在V4和V7根以及VT茎/节间中观察到最高的GUS表达。定性地，在整个主根、侧根和根尖的V4根中观察到GUS表达。在V7根横截面中，在皮层组织中观察到GUS表达。EXP-ANDge.LTP+ANDge.LTP+SETit.eIF5A3-2:2(SEQ ID NO:1)主要在根和茎中驱动表达。
已经示出和描述本发明的原理，本领域技术人员显而易知本发明可在安排和细节上改进而不背离此类原则。我们要求保护在权利要求的精神和范围内的所有修改。本文中的所有出版物和公开的专利文件都通过引用并入本文，引用的程度就如同已明确且个别地指示将各个别出版物或专利申请通过引用并入一般。

Claims (26)

1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的DNA序列：
a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列；以及
c)SEQ ID NO:1-3中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；
其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:1-3中任一个的DNA序列具有至少90％序列同一性。
3.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO:1-3中任一个的DNA序列具有至少95％序列同一性。
4.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA序列包含基因调控活性。
5.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子包含具有农艺价值的基因。
6.如权利要求5所述的重组DNA分子，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。
7.如权利要求5所述的重组DNA分子，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物抗虫性。
8.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述异源可转录DNA分子编码dsRNA、miRNA或siRNA。
9.一种包含重组DNA分子的转基因植物细胞，所述重组DNA分子包含选自由以下组成的组的序列：
a)与SEQ ID NO:1-3中的任一个具有至少85％序列同一性的序列；
b)包含SEQ ID NO:1-3中的任一个的序列；以及
c)SEQ ID NO:1-3中任一个的片段，其中所述片段具有基因调控活性；
其中所述序列可操作地连接至异源可转录DNA分子。
10.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
11.如权利要求9所述的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
12.一种转基因植物或其部分，其包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
13.一种如权利要求12所述的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含所述重组DNA分子。
14.一种转基因种子，其中所述种子包含如权利要求1所述的重组DNA分子。
15.一种生产商业产品的方法，其包括获得根据权利要求12所述的转基因植物或其部分并由其生产所述商业产品。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述商业产品是种子、加工的种子、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、淀粉、谷物、植物部分、种子油、生物质、面粉和粗粉。
17.一种表达可转录DNA分子的方法，其包括获得根据权利要求12所述的转基因植物并培养植物，其中所述可转录DNA被表达。
18.一种在根组织中优先表达可转录DNA分子的方法，其包括：
a)用载体转化植物细胞，所述载体包含与SEQ ID NO:2或其活性片段具有至少85％序列同一性的启动子，所述启动子可操作地连接至异源可转录DNA分子；以及
b)诱导所述细胞以形成植物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述载体还包含可操作地连接至所述启动子的包含SEQ ID NO:3的序列。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述载体还包含可操作地连接至所述启动子的包含SEQ ID NO:4的序列。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述载体还包含可操作地连接至所述启动子的包含SEQ ID NO:6的序列。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述异源可转录DNA分子包含具有农艺价值的基因。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物除草剂耐受性。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述具有农艺价值的基因赋予植物抗虫性。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述异源可转录DNA分子编码dsRNA、miRNA或siRNA。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述植物细胞选自由玉米细胞、大豆细胞、棉花细胞、小麦细胞、油菜细胞、水稻细胞和番茄细胞组成的组。
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