NL9300646A - Werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten welke een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen. - Google Patents

Description

WERKWIJZE VOOR HET VERKRIJGEN VAN TRANSGENE PLANTEN WELKE EEN GEMODIFICEERD FRUCTAAN-PATROON VERTONEN

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten, die in vergelijking met de wildtype planten een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen, een DNA-construct voor het produceren'van dergelijke transgene planten of planteweefsels, welke in vergelijking met wildtype planten of wildtype planteweefsels een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen.

Planten produceren vele koolwaterstoffen die bruikbaar zijn voor food- en non-foodtoepassingen. Belangrijke voorbeelden van dergelijke koolwaterstoffen zijn zetmeel, cellulose en sucrose. Deze verbindingen worden door de mens ofwel als zodanig of in een gemodificeerde vorm voor voedsel en industriële doeleinden gebruikt. Gewassoorten die deze koolhydraten produceren worden verkregen door traditionele plantekweekmethoden. Naast de bovengenoemde goed bekende koolhydraten kunnen vele andere plantekoolhydraten met eigenschappen die bruikbaar zijn voor de mens in planten aanwezig zijn.

Koolhydraten van een plant kunnen verdeeld worden in twee groepen, afhankelijk van hun functie voor de plant. De eerste groep omvat structurele koolhydraten, die gewoonlijk deel uitmaken van de extracellulaire matrix. Het belangrijkste lid van deze groep is cellulose. De tweede groep omvat de niet-structurele opslagkoolhydraten die kunnen dienen als een lange termijn- of korte termijn (transitoire) koolhy-draat-voorraad. Voorbeelden van dergelijke koolhydraten zijn zetmeel, sucrose en fructanen.

Fructaan is een polymeer, dat in hoofdzaak bestaat uit repeterende fructose-eenheden. Fructanen worden meestal gevonden in plantesoorten die niet zijn aangepast aan de economische kweekpraktijk. Fructanen komen voor in eenzaad-lobbigen (in het bijzonder Poaceae. Liliaceae) en in twee-zaadlobbigen (in het bijzonder Compositae) (Pollock en Cairns 1991, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 77-101; Hendry 1987, New Phytol. 106, 201-216).

Naast hun rol als een plantekoolhydraatreserve zijn voor fructanen andere functies voorgesteld. Deze functies omvatten bijvoorbeeld tolerantie tegen droge en koude klimaten (koude geïnduceerde dehydratie) (Pontis 1989, J. Plant Physiol. 134, 148-150; Gonzales et al. 1990, New Phytol.

115, 319-323).

De fructanen die gewoonlijk door planten geproduceerd worden hebben echter een beperkte functionaliteit. Om deze reden hebben fructanen tot nu toe nog geen grote toepassing gevonden in food- en non-foodprodukten ondanks hun erkende grote commerciële potentieel in het bijzonder in vergelijking met andere koolhydraten (Fuchs 1991, Biochem. Soc. Transact. 19, 555-560, A. Fuchs, ed. Inulin and Inulin-containing Crops, Elsevier, 1993).

Eén van de belangrijkste problemen welke de bruikbaarheid van plantefructanen beperkt is het gelimiteerde bereik van plantesoorten waarin fructanen tot een aanzienlijk niveau accumuleren. In veel belangrijke gebruikelijke gewasplanten, waaronder suikerbiet en aardappel, zijn fructanen ofwel afwezig of worden zij in zeer lage niveaus gevonden. Planten die fructanen in enige mate opslaan hebben vaak ongunstige agronomische eigenschappen. Een voorbeeld van een dergelijke plant is Helianthus tuberosus.

Een ander probleem is de beperkte functionaliteit van de geproduceerde fructanen. De functionaliteit wordt onder andere bepaald door de lengte van de fructaanketens welke in planten zelden een zogeheten "polymerisatie-graad" (PG) van de monosacchariden van 100 overschrijdt. Gewoonlijk worden veel kleinere fructanen gevonden en vaak neemt de PG van deze fructanen dramatisch af voorafgaand aan de oogst of volgend op de oogst en/of opslag. Lage PG's beperken de bruikbaarheid van fructanen in opvolgende processen in ernstige mate en kunnen resulteren in verminderde opbrengsten.

Er is voorgesteld in de internationale octrooiaanvrage W089/12386 om transgene planten te produceren welke een vreemd gen bevatten dat codeert voor een enzym dat in staat is een koolhydraat te polymeriseren, zoals bijvoor- beeld verschillende sucrasen, teneinde de vaste-stof-samenstelling van de plantencellen te modificeren. W089/12386 beschrijft onder andere een expressiecassette die de mas-levansucrase cassette omvat.

De onderhavige uitvinders verwachtten dat het door de aanwezigheid van het microbiële 5' niet-getransleerde gebied, waarin één ATG codon, dat niet in leesraam ligt, het initiator ATG codon in de cassette voorafgaat, niet mogelijk is acceptabele expressieniveaus van het levansucrasegen te verkrijgen.

Gevonden werd dat geschikte modificatie van het 5* niet-getransleerde gebied van een fructosyltransferasegen het expressieniveau van het fructosyltransferasegen in de plantecel verhoogt. Een geschikte modificatie omvat elke modificatie waardoor het expressieniveau van het fructosyltransferasegen niet negatief beïnvloed wordt. In de praktijk betekent dit dat elke sequentie, die het expressieniveau negatief beïnvloedt, verwijderd dient te worden. Bij voorkeur wordt het 5' niet-getransleerde gebied tot aan het ATG codon volledig verwijderd uit het gen.

Met de term "fructaan-patroon" wordt bedoeld de verdeling van het fructaan in verschillende planteweefsels en plantecelcompartimenten zoals cytosol, vacuole, apoplast etc.. Sommige planten produceren van nature fructanen terwijl anderen dat niet doen. Het fructaan-patroon van een plantesoort, die geen fructanen produceert in de wildtype plant, kan veranderd worden door de introductie van een gen dat codeert voor een fructosyltransferase. De fructaandis-tributie in een plant kan eveneens veranderd worden door het opnieuw richten van de metabolische stroom in planten of plantecellen naar bepaalde plante- of plantecel-comparti-menten.

Sucrose, het substraat voor de fructosyltransfe-rasen, is een koolhydraat dat op vele verschillende lokaties in de plant gevonden wordt. Het wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma en belangrijke hoeveelheden kunnen gevonden worden in het cytosol, de vacuole en de extracellulaire ruimte (de apoplast).

Aangezien biochemische processen in plantecellen eveneens vaak beperkt zijn tot een enkele of een aantal cellulaire compartimenten is het wenselijk de accumulatie van de produkten van de nieuw-geïntroduceerde genen in een specifiek compartiment te stimuleren. Derhalve kunnen zogeheten ,,targeting"-sequenties die specifiek zijn voor cellulaire compartimenten aanwezig te zijn in de fructosyltrans-ferase-constructen, die tot expressie gebracht worden in de transgene planten. Specifieke aminozuurgebieden voor de targeting naar de verschillende cellulaire lokaties zijn geïdentificeerd en geanalyseerd. De DNA-sequenties die voor deze targetinggebieden coderen kunnen op zodanige wijze gekoppeld worden aan de genen, welke van belang zijn, dat na expressie van het chimere gen (targeting-sequentie en fruc-tosyltransferase-gen) een eiwit geproduceerd wordt, waarin de targeting-informatie herkend en gebruikt wordt door de cel voor de correcte targeting naar de cellulaire lokatie die van belang is (Oakes et al. EPO 0486683, WO 91/19808, Symons et al., Bio/Technology 8, 217-221 (1990), Pen J. et al., Bio/Technology 10, 292-296 (1992)).

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding omvat de expressiecassette derhalve eveneens een targeting-sequentie voor het richten van de fructosyltransferasen naar één of meer specifieke plante- of plantecelcompartimenten.

De targetinggebieden kunnen gevormd worden door elke DNA-sequentie, die het vermogen heeft de fructosyltransferasen naar één of meer van deze specifieke plante- of plantecelcompartimenten te richten. Voorbeelden van voorkeurstarge-tinggebieden zijn de signaalsequentie en vacuolaire targe-ting-sequentie van het carboxypeptidase Y (cpy)-gen, of de signaalsequentie en apoplasmatische targeting-sequentie van het pathogenese-gerelateerde eiwit S-gen (pr-s^. Door het toevoegen van de targeting-sequentie aan het DNA-construct verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het produceren van transgene planten waarin het fructosyltrans-ferase gericht kan zijn naar één of meer specifieke celcom-partimenten, hetgeen op deze wijze leidt tot een gewenst fructaanpatroon in de plant of plantecel.

Vaak is het voordelig voor de plant niet slechts de lokatie maar eveneens het tijdstip van expressie van de geïntroduceerde genen te reguleren. Het is bijvoorbeeld gewoonlijk gewenst de expressie van de nieuw-geïntroduceerde enzymatische aktiviteiten te beperken tot specifieke delen van de plant, bijvoorbeeld oogstbare organen zoals knollen, vruchten of zaden. Bovendien is het vaak gewenst expressie in deze organen in een bepaald ontwikkelingsstadium te initiëren. Dit is zeker het geval wanneer de expressie van de geïntroduceerde genen interfereert met de normale ontwikkeling van dergelijke organen.

De fructosyltransferasen van de onderhavige uitvinding gebruiken sucrose als een substraat voor het synthetiseren van fructanen met een hoog molecuulgewicht. Vele micro-organismen bevatten fructosyltransferasen, welke het vermogen bezitten fructanen (vaak levanen genoemd) te produceren uit sucrose (A. Fuchs 1959, Thesis, University of Leiden, Han 1989, Adv. Appl. Microbiol. 35, 171-194). Deze enzymen kunnen fructose-eenheden van sucrose overbrengen naar een fructaan-acceptormolecuul voor het produceren van fructanen met een hoog molecuulgewicht. Aangezien deze fructaan-acceptormoleculen oorspronkelijk afgeleid zijn van sucrose kunnen zij nog steeds een terminaal glucose-molecuul bevatten. Het reactiemechanisme is als volgt (voor een overzicht zie Han 1989, Adv. Appl. Microbiol. 35, 171-194):

G-F = sucrose, G = glucose, F = fructose

De glycosidische binding die de fructose-eenheden koppelt kan een (2-1)- of een (2-6)-type binding zijn afhankelijk van het specifieke fructosyltransferase. In micro-organismen kunnen beide koppelingstypen gevonden worden in één enkel fructaanmolecuul. De functionaliteit van een fructaanmolecuul hangt af van het type skelet ((2-1)- of (2-6)-) en de mate van vertakking.

Vele micro-organismen, zoals bacteriën, gisten, schimmels etc. bevatten fructosyltransferasen, die fructanen met een hoog PG uit sucrose synthetiseren. Gewoonlijk worden de fructanen buiten de cel afgezet.

Twee voorbeelden van fructosyltransferase producerende bacteriën zijn Bacillus subtilis (Steinmetz et al.

1985, Mol. Gen. Genet. 200, 220-228) en Streptococcus mutans (Shiroza en Kuramitsu 1988, J. Bacteriol. 170, 810-816). In B. subtilis codeert het sacB-gen voor het structurele gen voor levansucrase, een fructosyltransferase. Dit enzym kan sucrose omzetten in een fructosepolymeer met PG's die gemakkelijk boven 10.000 kunnen liggen. Het koppelingstype dat in dit fructaan, dat geproduceerd is door het levansucrase, gevonden wordt is in hoofdzaak van het (2-6)-type met uitgebreide (2-1)-vertakking.

In een ander micro-organisme, S. mutans. codeert het ftf-gen voor een fructosyltransferase dat eveneens fructanen met een zeer hoog PG kan produceren. De fructose-eenheden in dit fructaan zijn in hoofdzaak van het (2-1)-gekoppelde type met (2-6)-vertakking (Rosell en Birkhed 1974, Acta Chem. Scand. B28, 589).

Bacteriële fructosyltransferasen hebben een relatief lage Km voor sucrose, ongeveer 20 mM. In de meeste planten liggen de sucroseconcentraties echter aanzienlijk hoger en derhalve zouden deze enzymen aktief moeten zijn in planten. Een andere belangrijke eigenschap van bacteriële fructosyltransferasen is hun vermogen levanen bij lage temperaturen tot 0°C toe te synthetiseren (Tanaka et al. 1978, Agric. Biol. Chem. 42, 323-326). Planten komen dergelijke temperaturen vaak tegen, maar in dergelijke omstandigheden zouden deze enzymen nog steeds aktief zijn.

Welke structurele fructosyltransferase gen(en) de voorkeur heeft (hebben) hangt in hoge mate af van de vereisten wat betreft de polymerisatiegraad van het polymeer en zijn mate van vertakking van de fructanen met betrekking tot de verschillende gebruiken.

De onderhavige uitvinding is niet beperkt tot microbiële fructosyltransferasen, maar het is eveneens moge- lijk fructosyltransferasen die afkomstig zijn van planten of andere prokaryotische of eukaryotische bronnen te gebruiken.

In planten is fructaanbiosynthese en degradatie onderzocht met name onderzocht in Helianthus tuberosus en in verschillende grassen (Pollock en Cairns 1991, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 77-101; Pollock 1986,

New Phytol. 104, 1-24). In verschillende planten worden verschillende fructaantypen gesynthetiseerd, lineair of vertakt, met (2-1)- en (2-6)-glycosidische bindingen tussen de fructose moleculen. In planten worden fructanen opgeslagen in de vacuole. Het substraat voor fructose biosynthese is sucrose, de affiniteit van deze enzymen voor sucrose is echter lager (ongeveer Km=100) dan het geval is met de bacteriële enzymen. De plante-enzymen die betrokken zijn bij het fructaanmetabolisme zijn zeer koude-tolerant (Pontis 1989, J. Plant Physiol. 134, 148-150; Gonzales et al. 1990, New Phytol. 115, 319-323) en kunnen derhalve zeer bruikbaar zijn in verschillende toepassingen.

Bijna alle planten zijn in staat tot sucrosesynthe-se, welke plaats vindt in het cytosol. Sucrose is het belangrijkste koolhydraat-translokatiesuiker en het wordt getransporteerd van "source" (netto koolhydraat exporterend weefsel) naar "sink" (netto koolhydraat importerend weefsel) via het vasculaire systeem. Dit transport omvat vaak vervoer van sucrose door de extracellulaire ruimte, de apoplast. Bovendien kan sucrose eveneens door planten gebruikt worden voor koolhydraatopslag. In het laatste geval accumuleert het gewoonlijk in de vacuole van de plantecellen, bijvoorbeeld in de wortels van suikerbietplanten. Samenvattend zijn er twee belangrijke cellulaire lokaties waar sucrose in plantecellen gevonden wordt: het cytosol en de vacuole. Daarnaast zijn belangrijke hoeveelheden sucrose aanwezig in de extracellulaire ruimte (de apoplast) van vele planten.

De voorkeurstargeting-sequentie zou het fructosyl-transferase moeten leiden naar compartimenten waar substraat beschikbaar is, respectievelijk vacuole, cytosol en de apoplast. De vacuole is bijvoorbeeld een voorkeurscompartiment voor hoge fructaanaccumulatie. Voor andere doeleinden (bijvoorbeeld droogte- en koude-resistentie) kan fructaanac-cumulatie in het cytosol of de apoplast de voorkeur hebben.

De accumulatie van sucrose in de vacuole van verschillende planten maakt deze cellulaire lokatie in het bijzonder geschikt voor de inductie van fructaanbiosynthese door microbiële of plante-enzymen.

De voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding verschaft derhalve een werkwijze voor de vacuolaire expressie van microbiële, plante- of andere fructosyltransferasen in transgene planten. Deze werkwijze omvat de fusie van DNA-sequenties welke coderen voor plantspecifieke expressiesig-nalen, een vacuolair lokalisatiesignaal en microbiële, plante- of andere fructosyltransferasen.

Twee andere compartimenten waarin sucrose beschikbaar is, het cytosol en de apoplast, kunnen eveneens belangrijke plaatsen zijn voor fructaanaccumulatie. Dit kan bereikt worden door het richten van microbiële, plante- of andere fructosyltransferasen naar de cytosol of de apoplast. Voor cytosol-expressie is geen cellulaire route-informatie vereist; expressie van het rijpe enzym is voldoende. Voor expressie van fructosyltransferasen in de apoplast moet een targeting-gebied toegevoegd worden aan het enzym, welk gebied het enzym naar de apoplast leidt.

Voor expressie van het gemodificeerde fructosyl-transferase gen in planten moeten promotersignalen toegevoegd worden aan het DNA-construct. Dergelijke expressie-promoters kunnen specifiek zijn voor een speciaal celtype of kunnen aktief zijn in een ruime verscheidenheid van celtypen. Daarnaast kan het tijdstip van expressie bepaald worden door gebruik van bijvoorbeeld ontwikkelingsspecifieke promoters. Een algemeen gebruikte promoter voor gen-expressie in planten is de 35S Bloemkool (Cauliflower) Mozaïek Virus Promoter (CMV promoter), die aktief is in vele celtypen in de plant onafhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de plant.

De voorkeurspromoter kan een weefselspecifieke of constitutieve promoter zijn, sterk of zwak, afhankelijk van doelplant en doel. Voor fructaanproduktie in opslagorganen zou de voorkeurspromoter een "sink"-specifieke, sterke promoter zijn.

Voor het verder verhogen van transcriptieniveaus is de promoter vaak gemodificeerd teneinde een enhancerduplica-tie te bevatten.

De translatie van de mKNA's kan verbeterd worden door het toevoegen van een translationele enhancer, zoals het Alfalfa Mozaïek Virus RNA4 translatie enhancersignaal, dat aanwezig moet zijn in het getranscribeerde 5' niet-ge-transleerde gebied.

Voor juiste terminatie van transcriptie dient een plant-specifieke terminator-sequentie toegevoegd te worden aan de constructen. Een voorbeeld van een dergelijk sequentie is de nopaline synthasegen terminatie-sequentie.

De geïnduceerde accumulatie van fructaan in transgene planten met gebruikmaking van het boven beschreven principe zal extractie van fructanen uit deze planten voor doeleinden van fructaanproduktie toestaan. Fructanen kunnen in deze planten bijvoorbeeld geaccumuleerd zijn in oogstbare organen zoals wortels, bieten, knollen, vruchten en zaden.

Genetisch gemodificeerde grasplanten welke de bovengenoemde voor fructosyltransferase coderende constructen in zich dragen zullen de efficiënte produktie van een koolhydraat polymeer van hoge kwaliteit, welke bruikbaar is voor de mens, toestaan.

De uitvinding verschaft een werkwijze, welke planten verschaft met nieuwe biosynthetische vermogens, die hen in staat stellen fructaan te produceren en te accumuleren. Dergelijke planten hebben verbeterde prestaties door de veranderde "sink"/"source"-relaties en opbrengst, of verhoogde tolerantie voor droogte, koude of andere stressvor-men, een hoger droge-stof-gehalte, betere smaak of opslag-vermogen, verbeterde nutritionele waarde, of kunnen geschikt gebruikt worden als materiaal voor fructaanproduktie.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen een enkel fructosyltransferase gen of een combinatie van fructosyltransferase genen van ofwel prokaryotische of eukaryotische oorsprong gebruikt worden. Deze genen kunnen coderen voor enzymen voor de biosynthese van een ruime verscheidenheid aan fructanen.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op zaden, stekken, knollen, bollen of andere delen van de transgene planten, welke bruikbaar zijn voor de continue produktie van verdere generaties van de planten.

De begeleidende figuren illustreren de onderhavige uitvinding waarin: figuur 1 een overzicht van de constructen is; figuur 2 de constructie van plasmiden pPA2 en pPBl toont; figuur 3 de constructie van 35S-cpy-sacB-N0S in de binaire vector (pKP) toont; figuur 4 de constructie van 35S-cpy-ftf-N0S in de binaire vector (pTP) toont; figuur 5 de constructie van 35S-pr-s-sacB-N0S in de binaire vector (pKT) toont; figuur 6 de constructie van 35S-pr-s-ftf-NOS in de binaire vector (pTT) toont; figuur 7 de constructie van 35S-sacB-NOS in de binaire vector (pKZ) toont; figuur 8 de constructie van 35S-ftf-NOS in de binaire vector (pTZ) toont; en figuur 9 een voorbeeld is van een gedeeltelijke zuurhydrolyse van fructaan, dat geïsoleerd is uit een transgene KP tabaksplant. Dit gedeeltelijk hydrolysepatroon is identiek aan dat van fructaan, dat geproduceerd is door Bacillus subtilis. F=fructose, S=sucrose (disaccharide), I=l-kestose (trisaccharide) DP4, 5 en 6 zijn respectievelijk tetra-, penta- en hexasacchariden, H=Helianthus tuberosus knolextract, dat gebruikt is als standaard.

De onderhavige uitvinding zal geïllustreerd worden in de volgende voorbeelden welke op geen enkele wijze de bedoeling hebben de omvang van de onderhavige uitvinding te beperken.

VOORBEELD 1.

Expressie van sacB gen in de vacuole.

1. Selectie van te gebruiken genen.

Voor het creëren van fructaan-producerende transgene planten werden genen, die coderen voor eiwitten die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Van deze genen werd levansucrase, dat gecodeerd wordt door het sacB-gen van Bacillus subtilis (Steinmetz M. et al., Mol. Gen. Genet. 200:220-228(1985)), gebruikt. Dit enzym produceert in hoofdzaak fructanen van het (2-6)-koppelingstype in de aanwezigheid van sucrose.

Aangezien sucrose in plantecellen kan accumuleren in vacuolen is dit een voorkeursplaats voor fructaanproduktie. Teneinde het levansucrase naar de vacuole te leiden werd het targeting-gebied van carboxypeptidase Y (Vails L.A. et al., Cell 48, 887-897 (1987)) geselecteerd.

2. Constructie van 35S-cpv-sacB-NOS in binaire vector (pKP).

Plasmide pLS302 werd beschreven door Steinmetz M. et al., supra. Het levansucrase (sacB)-gen werd gekloneerd uit dit plasmide als een BamHI- en Pstl-fragment in de corresponderende BamHI- en Pstl-plaatsen van de meervoudige klone-ringsplaats van pEMBL9 (Dente L. et al., Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655 (1983)), resulterend in plasmide pKA16. Algemene DNA kloneringsmethodologie is beschreven in Sambrook J. et al., Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory (1989).

Voor het creëren van een Ncol-plaats nabij de rijpe verwerkingsplaats ("processing site") van het levansucrase gen werd op nucleotidepositie 550 (Steinmetz M. et al., supra) plaatsgerichte mutagenese uitgevoerd, zoals beschreven door Kramer W. et al. (Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)), met het volgende oligonucleotide: 5'-GCAACTCAAGCCATGGCGAAAGAAACG3-» .

resulterend in plasmide pKD2.

Op aminozuurpositie -2 ten opzichte van de rijpe verwerkingsplaats (nucleotidepositie 544) werd een fenylala-nine veranderd in een methionine. Het NcoI-PstI- fracnnent.

waarin de sequentie die codeert voor het rijpe levansucrase eiwit aanwezig is werd gebruikt voor verdere klonering.

Plasmide pTS3 dat het carboxypeptidase Y (cpv)-gen bevatte werd beschreven voor Vails L.A. et al., supra. Het eerste deel van het cpy-gen werd gekloneerd uit dit plasmide als een Clal (-695) en BamHI (462) fragment in de corresponderende Accl- en BamHI-plaatsen van de meervoudige klone-ringsplaats van pEMBL8 (Dente L. et al., supra), resulterend in plasmide pCAl.

Voor het creëren van een Ncol-plaats nabij de rijpe verwerkingsplaats stroomafwaarts van de vacuolaire targe-ting-sequenties van het cpy-gen op nucleotide positie 330 (Vails, L.A. et al., supra), werd plaatsgerichte mutagenese zoals beschreven door Kramer W. et al. (supra) uitgevoerd met het volgende oligonucleotide: 5'-CGTGTCAACAAGACCATGGACCCTAA-3'.

Het resulterende plasmide pCB50 bevat het eerste deel van het cpy-gen met een Ncol-plaats op de rijpe verwerkingsplaats. Op de aminozuurpositie +2 ten opzichte van de rijpe verwerkingsplaats op nucleotidepositie 334 werd een isoleu-cine vervangen door een threonine. Op aminozuurpositie +3 ten opzichte van de rijpe verwerkingsplaats op nucleotide positie 337 werd een lysine vervangen door een methionine. Het HindiII-Ncol-fragment, waarin de sequentie, die codeert voor het vacuolaire targeting-deel van het carboxypeptidase Y eiwit, aanwezig is, werd gebruikt voor verdere klonering.

De vacuolaire targeting-sequentie van het cpy-gen werd gefuseerd aan de rijpe sequentie van het levansucrase-gen met gebruikmaking van een driepuntsligering (Sambrook J. et al., supra).

De volgende fragmenten werden in equimolaire concentraties gebruikt:

Het HindlII-NcoI-fragment van het cpy-gen (dat codeert voor de vacuolaire targeting-sequentie), het Ncol-PstI-fragment van het sacB-gen en het fragment dat de vector van pEMBL8 bevat, welke gedigesteerd was met Hindlll en PstI. Het resulterende plasmide pKK3 codeert voor het construct, dat in leesraam ligt, van de carboxypeptidase Y-levansucrase fusie. Het correcte leesraam van het fusiegen werd bevestigd door sequentie-analyse.

Het plasmide pM0G18 dat een plantspecifieke 35S promoter met enhancer-duplicatie bevat en sequenties, welke translatie van het mRNA verhogen, is beschreven door Symons et al., Bio/Technology 8, 217-221 (1990). Het bevat het 35S-promoter/uidA-gen/NOS-terminator construct. Een pBluescript II SK (Stratagene, San Diego CA) waaruit door knippen met BamHI en het opvullen van de overhangende uiteinden met Klenow en opnieuw ligeren de interne BamHI-plaats verwijderd was, werd gebruikt voor verdere klonering. Het 35S-uidA-NOS fragment werd verkregen door digestie met EcoRI en HindiII van pM0G18 en werd gekloneerd in deze BamHI-pBluescript in de overeenkomende EcoRI- en HindiII-plaats, resulterend in plasmide pPA2. Dit plasmide werd gedigesteerd met Ncol en BamHI voor het verwijderen van het uidA gen. De resulterende vector werd behandeld met Sl-nuclease voor het verwijderen van overhangende uiteinden en vervolgens gedefosforyleerd. Uit plasmide pKK3 werd het fragment dat de cpv-sacB-fusie bevatte geïsoleerd door digestie met AccI en Pstl. Deze plaatsen werden stompeindig ("blunt") gemaakt met Klenow. Deze twee fragmenten werden geligeerd hetgeen resulteerde in plasmide pKM5. pKM5 bevat het 35S-promoter/cpy-sacB-gen-fusie/NOS-terminator construct.

Dit plasmide, pKM5, werd eerst gedigesteerd met Xhol en vervolgens gedeeltelijk gedigesteerd met Xbal. Het fragment dat het volledige construct (35S-cpy-sacB-NOS) bevatte werd gekloneerd in de Xbal- en Xhol-plaats van pMOG23 (Symons et al., supra), een afgeleide van de binaire plantevec-tor pBIN19 (Bevan M., Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721), resulterend in plasmide pKP.

3. Transformatie van pKP naar tabaksplanten.

Het pKP plasmide werd geconjugeerd in Aorobacterium tumefaciens LB4404 (Hoekema et al., Nature 303, 179-180 (1983)) in een triparentale paring met gebruikmaking van het helperplasmide pRK2013 (Lam S.T. et al., Plasmid 13, 200-204 (1985)). Het construct werd geïntroduceerd in Nicotiana tabacum var. Petit Havana (SRI) met gebruikmaking van de bladschijftransformatie methode (Horsch R.B. et al., Science 227, 1229-1232 (1985)). Geregenereerde planten, die KP planten genoemd worden, werden geselecteerd op kanamycine resistentie en gekweekt op MS medium (Murashige en Skoog Physiol. Plant. 15, 473-497) (1962)) dat in plaats van sucrose glucose bevatte. Daarna werden planten gekweekt op grond in de kas en geanalyseerd.

4. Analyse van KP planten.

Planten werden gekweekt in de kas en bladmateriaal werd afgesneden en vermalen in een eppendorf buisje. Na centrifugatie (2' 16000 rpm) werd 1 μΐ supernatant gespot op TLC (Cairns A.J. and Pollock C.J., New Phytol. 109, 399-405 (1988)). De TLC werd driemaal ontwikkeld in 85:15 aceton: water en vervolgens behandeld met ureumnevel, zoals beschreven (Wise C.S. et al., Analytical Chemistry 27, 33-36 (1955)). Deze methode kleurt bij voorkeur fructose en fruc-tose-bevattende polymeren.

Er werden nooit fructose-polymeren gedetecteerd in wildtype planten noch in planten, die getransformeerd waren met niet-verwante constructen. Het onderzoeken van de transformanten met gebruikmaking van deze methode toonde een uitgebreide accumulatie van fructanen in deze planten. Fructaan expressieniveaus varieerden tussen individuele planten, welke getransformeerd waren met hetzelfde construct dat normaal gevonden wordt in planttransformatie experimenten. Deze variatie in expressieniveaus hangt in hoofdzaak af van de genomische integratieplaats (plaatseffect).

De fructanen, die accumuleren in deze planten, werden verder bestudeerd door isolatie van grotere hoeveelheden (Livingstone III D.A., Plant Physiol. 92, 767-769 (1990)). Dit fructaan werd geanalyseerd door grote bepalingen op een FPLC Superose 6HR 10/30 kolom (Farmacia) en fructanen werden gedetecteerd in het dode volume, hetgeen een mate van polymerisatie van >25.000 fructose-eenheden aangeeft. Fructaan, dat geproduceerd is door Bacillus subti- lis levansucrase elueert op overeenkomstige wijze in het dode volume van de Superose kolom.

Gedeeltelijke fructaan degradatie door zuurdegrada-tie (zie figuur 9) toont een karakteristiek patroon van hydrolyseprodukten. De gezuiverde plante- en bacteriële fructanen toonden identieke degradatiepatronen op TLC. Volledige zuurhydrolyse gevolgd door HPLC analyse op een Aminex HPX87C kolom (Biorad) bij 85°C met gebruikmaking van water als eluens toont aan dat dit fructaan opgebouwd is uit fructose.

De gezuiverde fructanen werden eveneens geanalyseerd door proton-NMR. Fructaan, dat geïsoleerd was uit transgene planten, vertoonde geen verschillen in piekpatroon in vergelijking met fructaan gesynthetiseerd door levansucrase uit Bacillus subtilis.

We hebben geen enkel fructaan hydrolyserende aktivi-teit in verschillende plantespecies (tabak, suikerbiet, tomaat, aardappel) gevonden. Wanneer plante-eiwitextracten geïncubeerd werden met fructaan gedurende langere perioden in fosfaat-citraatbuffer bij pH 5,0 werd geen fructose afgegeven.

Na veroudering bleven plantfructanen aanwezig in de transgene planten, waardoor de stabiliteit die waargenomen is met eiwitextracten, bevestigd wordt. Fructanen accumuleren door de plant heen, hetgeen in overeenstemming is met de niet-specifieke 35S-promoter aktiviteit in transgene planten.

Transgene planten vormden op normale wijze zaad. Zaadontkieming is identiek aan die bij niet-getransformeerde i planten en het construct wordt stabiel overgeërfd door volgende generaties, welke op overeenkomstige wijze fructanen produceren.

VOORBEELD 2.

> Expressie van ftf oen in de vacuole.

1. Selectie van de genen.

Voor het creëren van fructaan-producerende planten, werden genen die coderen voor eiwitten, die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Een ander gen, fruc-tosyltransferase, dat gecodeerd wordt door het ftf-gen van Streptococcus mutans (Steinmetz M. et al., Mol. Gen. Genet. 200:220-228(1985)), werd gebruikt. Dit enzym produceert in hoofdzaak fructanen van het (2-6)-koppelingstype in de aanwezigheid van sucrose. Aangezien sucrose in plantecellen kan accumuleren in vacuoles is dit een voorkeursplaats voor fructaanaccumulatie. Een gen dat codeert voor een eiwit dat in staat is zichzelf naar de vacuole te richten werd geselecteerd: carboxypeptidase Y (Vails L.A. et al., supra). Van dit gen werden de signaalsequentie en vacuolaire targeting sequentie gebruikt zoals beschreven in Voorbeeld 1.

2. Constructie van 35S-cpy-ftf-NOS in binaire vector (pTP).

Plasmide pTSl02 werd beschreven door Shiroza T. and Kuramitsu H.K. (supra). Het fructosyltransferase (ftf) gen werd gekloneerd uit dit plasmide als een EcoRV- en BqlII-fragment in de corresponderende Smal- en BamHI-plaatsen van de meervoudige kloneringsplaats van pEMBL9 (Dente L. et al., supra,) resulterend in plasmide pTA12.

Voor het creëren van een Ncol-plaats nabij de rijpe verwerkingsplaats van het ftf-gen (nucleotidepositie 783 (Shiroza T. and Kuramitsu H.K., supra) werd plaatsgerichte mutagenese zoals beschreven door Kramer W. et al. (supra) uitgevoerd met het volgende oligonucleotide: 5'-GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3' resulterend in plasmide pTD2.

Op aminozuurpositie +1 (nucleotide positie 738) ten opzichte van de rijpe verwerkingsplaats werd hierdoor een glutamine veranderd in een methionine. Het Ncol-Pstl-frag-ment, waarin de sequentie die codeert voor het rijpe levan-sucrase eiwit aanwezig is, werd gebruikt voor verdere klonering.

Uit plasmide pCB50 (zoals beschreven in voorbeeld 1) werd het HindlII-NcoI fragment, waarin de sequentie, die codeert voor het vacuolaire targeting-deel van het carboxypeptidase Y eiwit, aanwezig is, gebruikt voor verdere clonering.

De vacuolaire targeting-seguentie van het cpv-gen werd gekoppeld aan de rijpe sequentie van het fructosyl-transferase gen met gebruikmaking van een driepuntsligering (Sambrook J. et al., supra). De volgende fragmenten werden gebruikt in equimolaire concentraties:

Het HindlII-NcoI-fracrment van het cpy-qen (dat codeert voor de vacuolaire targeting-sequentie), het NcoI-PstI fragment van het ftf-qen en het fragment, dat de vector van pEMBL8, die gedigesteerd was met HindlII en Pstl. bevatte. Het resulterende plasmide pTKl codeert voor. het construct van de carboxypeptidase Y fructosyltransferase fusie. De fusie ligt in het juiste leesraam, hetgeen bevestigd werd door sequen-tie-analyses.

Plasmide pPA2, beschreven in voorbeeld 1, werd gedigesteerd met Ncol en BamHI teneinde het uidA-gen te verwijderen. De resulterende vector werd behandeld met Sl-nuclease teneinde de overhangende uiteinden te verwijderen, en vervolgens gedefosforyleerd. Uit plasmide pTKl werd het fragment, dat de cpy-ftf-fusie bevatte, geïsoleerd door digestie met AccI en Pstl. Deze plaatsen werden stompeindig gemaakt met Klenow. Deze twee fragmenten werden geligeerd, resulterend in plasmide pTM4. pTM4 bevat het 35S-pro-moter/cpy-ftf-genfusie/NOS-terminator construct.

Dit pTM4 werd gedigesteerd met Xhol en vervolgens gedeeltelijk gedigesteerd met Xbal. Het fragment dat het volledige construct (35S-cpy-ftf-NOS) bevatte werd gekloneerd in de Xbal en HindiII-plaats van pMOG23 (Symons et al. supra), een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan M., supra,) resulterend in plasmide pTP.

Transgene planten, die TP-planten genoemd worden, welke het beschreven construct bevatten, werden gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld 1.

3. Analyse van TP-planten.

Het screenen van de transformanten met gebruikmaking van de TLC-methode zoals in voorbeeld 1 toonde accumulatie van fructaan met de gebruikelijke variatie door het positie-effect. De fructanen die zich ophopen in deze planten werden verder bestudeerd door isolatie van grotere hoeveelheden (Livingstone III D.A., supra). Dit fructaan werd geanalyseerd door groottebepaling op een FPLC Superose 6HR 10/30 kolom (Pharmacia) en fructanen werden gedetecteerd in het dode volume, hetgeen een polymerisatiegraad van >25.000 fructose-eenheden weergeeft. Fructaan geproduceerd door Streptococcus mutans fructosyltransferase elueert op overeenkomstige wijze in het dode volume van de Superosekolom.

Op overeenkomstige wijze toont gedeeltelijke fructaandegra-datie door zuurdegradatie een kenmerkend patroon van hydro-lyseprodukten. De gezuiverde plante- en bacteriële fructanen tonen identieke degradatiepatronen op TLC. Volledige zuurhy-drolyse gevolgd door HPLC-analyse op een Aminex HPX87C kolom bij 85°C met gebruikmaking van water als eluens toont aan dat dit fructaan is opgebouwd uit fructose.

Zoals in voorbeeld 1, bevatten ouder wordende planten nog steeds fructanen. De zaden zijn eveneens fertiel en de fructaan producerende eigenschap wordt door de volgende generatie overgeërfd.

VOORBEELD 3.

Expressie van sacB in de apoplast 1. Selectie van de genen.

Voor het creëren van planten die fructanen produceren werden genen die coderen voor eiwitten, die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Eén van deze genen, levansucrase, dat gecodeerd wordt door het sacB-gen (Steinmetz M. et al., supra) en beschreven in voorbeeld 1, werd gebruikt.

Aangezien sucrose in tabaksplanten getransporteerd wordt door de apoplast naar het floëem, is de intercellulaire ruimte (apoplast) eveneens een voorkeursplaats voor fructaanaccumulatie. Een gen dat codeert voor een eiwit dat in staat is zichzelf naar de apoplast te richten werd geselecteerd: het pathogenese-gerelateerde eiwit S, gecodeerd door het pr-s-gen (Cornelissen B.J.C. et al., Nature 321, 531-532 (1986). Uit dit gen werd de exportsignaalse-quentie gebruikt.

2. Constructie van 35S/pr-s-SacB/NOS in binaire vector (pKT).

Plasmide pMOG29 is beschreven door Pen J., et al.(Bio/Technology 10, 292-296 (1992)). Het pathogenese gerelateerde eiwit S (pr-s) gen (Cornelissen B.J.C. et al., supra; Van Kan J.A.L. et al. Plant. Mol. Biol. 12, 153-155 (1989)) heeft een signaalsequentie die eiwitten kan richten naar de intercellulaire ruimte, de apoplast (Pen J. et al., supra). Het plasmide pMOG29 bevatte het 35S-promoter/pr-s-sequentie/NOS-terminator construct. Een pBluescript II SK (Stratagene), waaruit de interne BamHI-knipplaats verwijderd was door knippen met BamHI. invullen van de overhangende uiteinden met Klenow en opnieuw ligeren, werd gebruikt voor verdere klonering.

Het 35S-promoter/pr-s-seauentie/NOS-terminator~ construct werd verkregen door digestie met EcoRI en HindlII van pMOG29 en werd gekloneerd in dit pBluescript in de overeenkomende EcoRI en HindlII knipplaatsen, resulterend in plasmide pPBl. Plasmide pPBl werd gedigesteerd met BamHI en de overhangende uiteinden werden opgevuld met Klenow. Uit plasmide pKK3 (voorbeeld 1) werd het sacB-gen geïsoleerd door digestie met Ncol en Pstl. Deze knipplaatsen werden stompeindig gemaakt met Klenow. Een stompeindige ligering werd uitgevoerd, resulterend in plasmide pKR. Het plasmide pKR codeert voor het construct van de pr-s levansucrase fusie, dat in leesraam ligt. De fusie bevindt zich in het juiste leesraam, hetgeen bevestigd werd door sequentie analyses. Het construct codeert voor de volgende aminozuur-sequentie: MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHARAS gevolgd door de levansucrase eiwitsequentie die begint met methionine, alanine en de rest van het rijpe levansucrase-eiwit (Stein-metz M. et al., supra). Dit construct werd gedigesteerd met Xbal en vervolgens gedeeltelijk gedigesteerd met Xhol. Het fragment dat het volledige construct (35S/pr-s-sacB/NOS) i bevatte werd gekloneerd in de Xbal en Xhol plaatsen van pMOG23 (Symons et al., supra). een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan M., supra), resulterend in plasmide pKT.

Transgene planten, KT-planten genoemd, welke het construct bevatten, werden gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld 1.

3. Analyse van KT-planten.

Screening van de transformanten, met gebruikmaking van de TLC-methode, zoals in voorbeeld 1, toonde accumulatie van fructaan met de normale variatie door het positie-ef-fect.

De fructanen die accumuleren in deze planten werden verder bestudeerd door isolatie van grotere hoeveelheden (Livingstone III D.A., supra). Superose chromatografiegege-vens en volledige zuurhydrolyse gevolgd door HPLC, zoals in voorbeeld 1, toonden aan dat dit fructaan een hoog molecuul-gewicht heeft en opgebouwd is uit fructose.

Zoals in voorbeeld 1, bevatten ouder wordende planten nog steeds fructanen. Op dezelfde wijze zijn zaden fertiel en wordt de fructaanproducerende eigenschap overgeërfd door de volgende generatie.

VOORBEELD 4.

Expressie van ftf-cren in aooplast 1. Selectie van de genen.

Teneinde planten te creëren, welke fructanen produceren, werden genen, die coderen voor eiwitten, die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Er werd een ander gen, fructosyltransferase, dat gecodeerd wordt door ftf-gen (Shiroza T. en Kuramitsu H.K. et al., supra) en geïntroduceerd in voorbeeld 2, gebruikt. Aangezien sucrose in tabaksplanten getransporteerd wordt door de apoplast naar het floëem, is de intercellulaire ruimte (apoplast) eveneens een voorkeursplaats voor fructaanaccumulatie. Een gen dat codeert voor een eiwit dat in staat is zichzelf naar de apoplast te richten werd geselecteerd: het pathogenese-gerelateerde eiwit S, gecodeerd door het pr-s-gen (Cornelis-sen B.J.C. et al., supra). Uit dit gen werd de signaalse-quentie gebruikt.

2. Constructie van 35S/pr-s-ftf/N0S in binaire vector (pTT)

Plasmide pPBl (voorbeeld 3) werd gedigesteerd met BamHI en de overhangende uiteinden werden ingevuld met Klenow. Uit plasmide pTKl (voorbeeld 2) werd het ftf-qen geïsoleerd door digestie met Ncol en Pstl. Deze knipplaatsen werden stompeindig gemaakt met Klenow. Een stompeinde-lige-ring werd uitgevoerd, resulterend in plasmide pTR. Het plasmide pTR codeert voor het construct van de pr-s fructosyl-transferase fusie, dat in leesraam. De fusie ligt in het juiste leesraam hetgeen bevestigd werd door sequentie-analy-ses. Het construct codeert voor de volgende aminozuursequen-tie: MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHARAS en de fructosyltransferase eiwitsequentie die begint met het methionine van het rijpe fructosyltransferase (Shiroza T., supra).

Dit construct werd gedigesteerd met Xbal en HindlII. Het fragment, dat het volledige construct (35S/pr-s-ftf-gen/NOS) bevatte, werd gekloneerd in de Xbal en HindlII knipplaats van pMOG23 (Symons et al., supra), een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan M., supra), resulterend in plasmide pTT.

Transgene planten, die TT-planten genoemd worden, welke het beschreven construct bevatten, werden gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld 1.

3. Analyse van TT-planten.

Screening van de transformanten, met gebruikmaking van de TLC-methode, zoals in voorbeeld 1, toonde accumulatie van fructaan met de normale variatie door het positie-ef-f eet.

De fructanen die accumuleren in deze planten werden verder bestudeerd door isolatie van grote hoeveelheden (Livingstone III D.A., supra). Superose-chromatografie gegevens en volldige zuurhydrolyse gevolgd door HPLC-analyse zoals in voorbeeld l tonen aan dat dit fructaan een hoog molecuulgewicht heeft en opgebouwd is uit fructose.

Net als in voorbeeld 1, bevatten ouder wordende planten nog steeds fructanen. Overeenkomstig zijn zaden fertiel en wordt de fructaanproducerende eigenschap overgeërfd door de volgende generatie.

VOORBEELD 5.

Expressie van levansucrase in het cytoplasma 1. Selectie van de genen.

Voor het creëren van planten, die fructanen produceren werden genen, die coderen voor eiwitten, die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Eén van deze genen, levansucrase, welke gecodeert wordt door het sacB-gen (Steinmetz M. et al., supra) en beschreven in voorbeeld 1, werd gebruikt.

Aangezien sucrose in plantecellen gesynthetiseerd wordt in het cytoplasma is het cytoplasma een voorkeursplaats voor fructaan-accumulatie. Aangezien in de kern gecodeerde eiwitten gemaakt worden in het cytoplasma is geen targeting-sequentie nodig.

2. Constructie van een 35S-sacB-NOS in binaire vector (pKZ).

Plasmide pPA2 (voorbeeld 1) werd gedigesteerd met Ncol en BamHi en het vectorbevattende fragment werd geïsoleerd. Uit plasmide pKK3 (voorbeeld 1) werd het sacB-gen geïsoleerd als een Ncol en BamHI fragment. Beide fragmenten werden geligeerd, resulterend in plasmide pKX. Het resulterende plasmide pKX codeert voor het construct van rijp levansucrase. Het construct is juist, hetgeen bevestigd werd door sequentie-analyses.

Dit construct werd gedigesteerd met Xbal en Xhol.

Het fragment dat het volledige construct (35S-sacB-NOS) bevat werd gekloneerd in de Xbal en Xhol knipplaats van pMOG23 (Symons et al., supra), een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan M., supra), resulterend in plasmide pKZ.

Transgene planten, die KT-planten genoemd worden, welke het beschreven construct bevatten, werden gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld 1.

3. Analyse van KT-planten.

Screening van de transformanten, met gebruikmaking van de TLC-methode, zoals in voorbeeld 1, toonde accumulatie van fructaan met normale variatie door het positie-effect.

De fructanen, die accumuleren in deze planten, werden verder bestudeerd door isolatie van grotere hoeveelheden (Livingstone III D.A., supra). Superose-chromatografie gegevens en volledige zuurhydrolyse gevolgd door HPLC-analy-se, zoals in voorbeeld 1, tonen aan dat dit fructaan een hoog molecuulgewicht heeft en opgebouwd, is uit fructose.

Net als in voorbeeld 1, bevatten ouder wordende planten nog steeds fructanen. Overeenkomstig zijn zaden fertiel en wordt de fructaan producerende eigenschap overgeërfd door de volgende generatie.

VOORBEELD 6.

Expressie van ftf-gen in cvtoplasma 1. Selectie van de genen.

Voor het creëren van planten welke fructanen produceren werden genen, die coderen voor eiwitten, die in staat zijn fructanen te produceren, geselecteerd. Een ander gen, fructosyltransferase, dat gecodeerd wordt door het ftf-gen (Shiroza T. en Kuramitsu H.K., supra) en geïntroduceerd in voorbeeld 2, werd gebruikt. Aangezien sucrose in plantecel-len gesynthetiseerd wordt in het cytoplasma, is het cyto-plasma een voorkeursplaats voor fructaan-accumulatie. Aangezien in de kern gecodeerde eiwitten gemaakt worden in het cytoplasma is geen targeting-sequentie nodig.

2. Constructie van 35S-ftf-NOS in binaire vector (pTZ)

Plasmide pPA2 (voorbeeld 1) werd gedigesteerd met Ncol en BamHI en het vectorbevattende fragment werd geïsoleerd. Uit plasmide pTKl (voorbeeld 2) werd het ftf-gen geïsoleerd als een Ncol en BamHI fragment. Vervolgens werden beide fragmenten geligeerd resulterend in plasmide pTX. Het resulterende plasmide pTX codeert voor het construct van rijp fructosyltransferase. Het construct is juist hetgeen bevestigd werd door sequentie-analyses.

Dit construct werd gedigesteerd met Xbal en HindlII. Het fragment dat het volledige construct (35S-ftf-N0S) bevatte werd gekloneerd in de Xbal en HindlII-plaats van pM0G23 (Symons et al.r supra), een afgeleide van de binaire plantevector pBIN19 (Bevan M., supra), resulterend in plas-mide pTZ.

Transgene planten, TZ-planten genoemd, welke het beschreven construct bevatten, werden gegenereerd, zoals beschreven in voorbeeld 1.

3. Analyse van TZ-planten.

Screening van de transformanten, met gebruikmaking van de TLC-methode, zoals in voorbeeld 1, toonde accumulatie van fructaan met de normale variatie door het positie-effect aan.

De fructanen, die accumuleren in deze planten, werden verder bestudeerd door het isoleren van grotere hoeveelheden (Livingstone III D.A., supra). Superose-chroma-tografie gegevens en volledige zuurhydrolyse gevolgd door HPLC-analyse, zoals in voorbeeld 1, tonen aan dat dit fructaan een hoog molecuulgewicht heeft en opgebouwd is uit fructose.

Net als in voorbeeld 1, bevatten de ouder wordende planten nog steeds fructanen. Overeenkomstig zijn zaden fertiel en wordt de fructaanproducerende eigenschap overgeërfd door de volgende generatie.

Claims (18)

1. Werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten, welke in vergelijking met de wildtype planten een gemodificeerd fructaanpatroon vertonen, door het kweken van planten, met in hun cellen een DNA-construct dragen, omvattende één of meer fructosyltransferasegenen, het 5' niet-getransleerde gebied waarvan zodanig gemodificeerd is dat expressie van het fructosyltransferase niet negatief beïnvloed wordt, waarbij het gen werkbaar gekoppeld is aan een plantspecifiek promotergebied en een plantspecifiek termi-natorgebied.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA-construct eveneens een targeting-gebied stroomopwaarts van het fructosyltransferase gen bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het fructosyltransferase gen afkomstig is van een micro-organisme.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het fructosyltransferase gen het sacB-gen van Bacillus subtilis is.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het fructosyltransferase gen het ftf-gen van Streptococcus mutans is.

6. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het fructosyltransferase gen afkomstig is van een plant.

7. Werkwijze volgens één der conclusies 2-6, met het kenmerk, dat het targeting-gebied de signaalsequentie en de vacuolaire targeting-sequentie van het carboxypeptidase Y (cpy) gen is.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 2-6, met het kenmerk, dat het targeting-gebied de signaalsequentie en apoplasmatische targeting-sequentie van het pathogenese gerelateerde eiwit S gen is.

9. Werkwijze volgens één der conclusies 1-8, met het kenmerk, dat de terminatorgebied een nopaline synthase terminatorgebied is.

10. Werkwijze volgens één der conclusies 1-9, met het kenmerk, dat het promotergebied een reguleerbaar promo-tergebied is.

11. Werkwijze volgens één der conclusies 1-9, met het kenmerk, dat het promotergebied het 35S Bloemkool (Cauliflower) Mozaïek Virus promotergebied is.

12. Werkwijze volgens één der conclusies 1-11, met het kenmerk, dat het DNA-construct stroomopwaarts van het fructosyltransferase gen en stroomafwaarts van het promotergebied eveneens een translationeel enhancergebied bevat.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het translationele enhancergebied een Alfalfa Mozaïek Virus translationele enhancer is.

14. DNA-construct voor de produktie van transgene planten, omvattende één of meer fructosyltransferase genen, het 5' niet-getransleerde gebied waarvan zodanig gemodificeerd is dat de expressie van het fructosyltransferase niet negatief beïnvloed wordt, waarbij het gen werkbaar gekoppeld is aan een plantspecifiek promotergebied en een plantspeci-fiek terminatorgebied.

15. DNA-construct volgens conclusie 14, eveneens omvattende een targeting-gebied stroomopwaarts van het fructosyltransferase gen.

16. Transgene plantecel omvattende een DNA-construct volgens conclusie 14 of 15.

17. Transgene plant geproduceerd volgens de methode van één van de conclusies 1-13.

18. Transgeen planteweefsel, zoals vrucht, stam, wortel, knol, zaad of een plant volgens conclusie 17.