DE69938336T2

DE69938336T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur veränderung des flavonoidgehaltes

Info

Publication number: DE69938336T2
Application number: DE69938336T
Authority: DE
Inventors: Arnaud Guillaume Bovy; Hendrikus Theodorus Wilhelmus Maria V/D Hijden; Stephen Glyn Saffron Walden Hughes; Shelagh Rachael Sharnbrook MUIR; Adrianus Johannes Van Tunen; Martine Elisa Sharnbrook Verhoeyen; C. H. De Vos
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-01-26
Filing date: 1999-01-25
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2019-01-26
Also published as: EP1049791B1; AU2424199A; DE69938336D1; ES2301234T3; WO1999037794A1; ATE389024T1; EP1049791A1; WO1999037794A8; US7034203B1; GB9801598D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Beeinflussung der Erzeugung von Flavonoiden in Pflanzen durch Beeinflussung der Gen-Aktivität im biosynthetischen Stoffwechselweg für Flavonoide sowie Zusammensetzungen für die Verwendung in solchen Verfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Konzentrationen von Flavonoiden, die von Anthocyanen verschieden sind, indem Gene exprimiert werden, welche für die Transkriptions-Faktoren kodieren, die an der Kontrolle der Expression von Genen beteiligt sind, welche für die Enzyme des biosynthetischen Stoffwechselweges für Flavonoide kodieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Flavonoide bilden eine große Zahl von polyphenolischen Verbindungen, die auf einem gemeinsamen Diphenylpropan-Skelett beruhen, welches natürlicherweise in Pflanzen vorkommt. Diese Verbindungsklasse umfasst Flavonole, Flavone, Flavonone, Catechine, Anthocyane, Isoflavonoide, Dihydroflavonole und Stilbene. Die Flavonoide liegen meist als Glycoside vor.
In Tomatenfrüchten ist das wichtigste Flavonoid, welches man vorfindet, Narichalcon (Naringenin-Chalcon) (Hunt et al., Phytochemistry 19, 1980, 1415–1419). Es ist bekannt, dass es sich nahezu ausschließlich in der Schale anreichert, und dass es gleichzeitig mit der Farbgebung der Frucht gebildet wird. Über das Naringenin-Chalcon hinaus werden Glycoside von Quercetin, und in einem geringeren Ausmaß von Kaempferol, ebenso in der Tomatenschale gefunden.
Die Angaben in der Literatur legen nahe, dass es vermehrte Hinweise darauf gibt, dass Flavonoide, insbesondere Flavonole, möglicherweise gesundheits-schützende Bestandteile in der menschlichen Diät darstellen. Epidemiologische Studien legen einen direkten Zusammenhang zwischen der herz-schützenden Wirkung und einem erhöhten Verbrauch von Flavonoiden aus diätetischen Quellen nahe, insbesondere von Flavonolen vom Quercetin- und Kaempferol-Typ, wie sie zum Beispiel in Knoblauch, Äpfeln und Tee enthalten sind (siehe zum Beispiel Hertog et al., Lancet 342, 1993, 1007–1011).
Es wurde beschrieben, dass Flavonoide einen breiten Bereich biologischer Wirkungen in vitro aufweisen, einschließlich einer entzündungshemmenden, anti-allergischen und gefäßerweiternden Wirkung (Cook et al., Nutritional Biochemistry 7, 1996, 66–76). Eine solche Aktivität wird zum Teil ihrer Fähigkeit zugeschrieben, als Antioxidationsmittel zu wirken, die in der Lage sind, freie Radikale einzufangen und die Erzeugung freier Radikale zu verhindern. Innerhalb dieser Gruppe von Verbindungen stellen die Flavonole jene Verbindungen dar, welche eine antioxidative Wirkung mit der höchsten Potenz aufweisen (Rice-Evans et al., Free Radical Research 22, 1995, 375–383). Darüber hinaus können Flavonoide ebenso die Aktivität von Schlüsselprozessen hemmen, wie zum Beispiel die Lipid-Peroxidation, die Plättchen-Aggregation und die kapillare Permeabilität (siehe Rice-Evans et al., Trends in Plant Science 2, 1997, 152–159).
Auf der Grundlage von Studien dieser Art gibt es derzeit ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung von Nahrungsmittelprodukten aus Pflanzen, die reich an solchen schützenden Flavonoiden sind.
Es würde wünschenswert sein, Pflanzen zu erzeugen, welche an sich erhöhte Gehalte an gesundheits-schützenden Verbindungen aufweisen, wie zum Beispiel Flavonoide, um Nahrungsmittelprodukte mit erhöhten Schutzeigenschaften zu entwickeln. Traditionellerweise beruhte die Vorgehensweise bei der Verbesserung von Pflanzensorten auf herkömmlichen Kreuzungs- und Züchtungs-Verfahren, jedoch sind diese langsam, da sie Zeit für die Fortpflanzung und Züchtung der nachfolgenden Pflanzengenerationen erfordern. Vor kurzem wurde eine rekombinante DNA-Technologie auf das allgemeine Problem der Modifikation von Pflanzen-Genomen angewendet, um Pflanzen mit gewünschten phänotypischen Merkmalen zu erzeugen. Während in der Literatur auf die Verwendung von genetischen Manipulationsverfahren bei der Modifikation des biosynthetischen Stoffwechselweges für Flavonoide Bezug genommen wird, wie er nachfolgend diskutiert wird, muss man anmerken, dass diese Versuche im Allgemeinen auf die Modifikation der pigmentären Anthocyan-Erzeugung gerichtet waren.
Zum Beispiel haben einige Studien versucht, den Stoffwechselweg für Flavonoide durch die Einführung von Genen, welche für die Enzyme im Stoffwechselweg für Flavonoide kodieren, zu beeinflussen. Beispiele für diese Studien sind EP 522880 , WO 90/11682 , Goldsbrough et al., Plant Physiology 105, 1994, 191–194 und Yoder et al., Euphytica 79, 1994, 163–167.
Weitere Studien haben versucht, den biosynthetischen Stoffwechselweg für Anthocyane durch Veränderung der Expression eines einzelnen Transkriptions-Faktors zu beeinflussen. Beispiele für diese Studien sind WO 91/2059 , Goldsbrough et al., Plant Journal 9(6), 1996, 927–933, Mooney et al., Plant Journal 7(2), 1995, 333–339, WO 93/14211 , WO 93/18171 und Moyano et al., Plant Cell 8, 1996, 1519–1532.
Der biosynthetische Stoffwechselweg für Flavonoide ist gut bekannt und wurde in einer Vielzahl von unterschiedlichen Pflanzenarten in großem Umfang studiert (siehe zum Beispiel Koes et al., BioEssays 16, 1994, 123–132). Kurz gesagt, werden drei Moleküle Malonyl-CoA mit einem Molekül Coumaroyl-CoA kondensiert, wobei die Kondensation durch das Enzym Chalcon-Synthase katalysiert wird, um Naringenin-Chalcon zu ergeben, das schnell zu Naringenin isomerisiert, wobei die Katalyse durch Chalcon-Isomerase erfolgt. Die nachfolgende Hydroxylierung von Naringenin, welche durch Flavonon-3-Hydroxylase katalysiert wird, führt zu Dihydrokaempferol. Dihydrokaempferol selbst kann hydroxyliert werden, um entweder Dihydroquercetin oder Dihydromyricetin zu ergeben. Alle drei Dihydroflavonole können der Reihe nach (durch die Wirkung der Dihydroflavonol-Reduktase und der Flavonoid-Glucosyltransferase) zu Anthocyanen, oder in alternativer Weise durch die Wirkung der Flavonol-Synthase zu Flavonolen umgesetzt werden, wie zum Beispiel zu Kaempferol, Quercetin und Myricetin.
Bisher haben Studien in Mais zwei regulatorische Gene identifiziert, C1 und R, die für die Erzeugung von Anthocyanen notwendig sind (siehe Lloyd et al., Science 258, 1992, 1773–1775). Das C1-Gen kodiert für ein Protein, welches eine DNA-Bindedomäne vom myb-Typ aufweist (Paz-Ares et al., EMBO Journal 6, 1987, 3553–3558), während das R-Gen für ein Protein mit einer basischen Helix-Loop-Helix-Domäne kodiert, die für die myc-Familie der transkriptionalen Regulator-Proteine charakteristisch ist (Ludwig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, 7092–7096).
In der Druckschrift Lloyd et al., auf die vorstehend Bezug genommen wurde, ist die Expression dieser Transkriptions-Faktoren, die für den Anthocyan-Stoffwechselweg spezifisch sind, aus dem einkeimblättrigen Mais in dem zweikeimblättrigen Arabidopsis thaliana und Nicotiana tabacum offenbart. Es wird beschrieben, dass die Anthocyan-Erzeugung in beiden Pflanzenarten durch R (Lc-Allele) in solchen Geweben aktiviert wird, welche normalerweise Anthocyane erzeugen, jedoch hat C1 allein keine Wirkung. Es wurde beschrieben, dass hybride transgene Arabidopsis, welche beide Transkriptionsfaktoren exprimierten, die unter der Transkriptionskontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus' standen, Anthocyane in Geweben erzeugen, welche unter normalen Umständen keine Anthocyane exprimieren würden, wie zum Beispiel die Wurzel, das Blütenblatt und das Staubblatt.
Es wurden Kreuzungen durchgeführt, wobei eine R(Lc)-exprimierende Linie zur Bestäubung von drei Pflanzen verwendet wurde, die C1 exprimierten. Da alle vier Eltern heterozygot waren, erwartete man, dass einer der vier Nachkommen sowohl R als auch C1 enthalten würde. Bei einer Kreuzung wurden 36 Nachkommen erzeugt, von denen vier Pflanzen eine Anhäufung von Anthocyanen in den Wurzeln zeigten und eine geringe Menge von Anthocyanen in den Geweben des Blütenblattes und des Staubblattes aufwiesen, wobei die genaue Größenordnung des Faktors des Anstieges in Bezug auf den Wildtyp nicht beschrieben wurde. Von den 38 Nachkommen, die sich aus anderen Kreuzungen ergaben, zeigten drei Pflanzen Anthocyane im Gewebe des Blütenblatts, während bei einer dritten Kreuzung keine Nachkommen mit einer Pigmentierung in der Wurzel oder im Blütenblatt-Gewebe erzeugt wurden. Man nimmt an, dass die Pflanzen, welche Anthocyane in der Wurzel und den Blütenblättern produzieren, sowohl C1 als auch R enthalten, obwohl dies nicht experimentell bestätigt ist, und darüber hinaus gibt es keinerlei Erklärung, weshalb keiner der Nachkommen, die sich aus der dritten Kreuzung ergaben, eine Anhäufung von Anthocyanen in den Wurzeln und den Blütenblättern zeigte. Die Autoren der Studie berichteten nicht darüber, ob das Vorliegen sowohl von R als auch von C1 in Arabidopsis zu einer konstitutiven Erzeugung von Anthocyanen in der gesamten Pflanze führt, oder ob die Anthocyan-Erzeugung auf bestimmte Bereiche der Pflanze beschränkt ist.
Die Berichte in der Literatur legen nahe, dass die Einführung eines Transkriptions-Faktors aus einer anderen Spezies in Arabidopsis diese dazu veranlassen kann, sich atypisch in Bezug auf die gesteigerte Erzeugung von Anthocyanen zu verhalten (siehe zum Beispiel Mooney et al., Plant Journal 7, 1995, 333–339). In diesem Fall gibt die Überexpression des Gens, welches für den Transkriptionsfaktor aus Antirrhinum delila kodiert und unter der Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus' steht, Anlass zu erhöhten Anthocyan-Konzentrationen sowohl in der Tomaten- als auch in der Tabak-Pflanze, jedoch trat in Arabidopsis kein offensichtlicher Phänotyp auf. Bei der Tomate wurde eine erhöhte Pigmentierung im Hypocotyl, im Keimblatt, in den Blättern, im Stiel und in den Wurzeln erzeugt jedoch wurde keine nachweisbare Steigerung einer normalen Pigmentierung in Tomaten und den Samenschalen der Samen gefunden. Eine gesteigerte Pigmentierung wurde in den Blüten des Tabaks beobachtet, jedoch waren keine vegetativen Teile pigmentiert.
Wie von Goldsbrough et al., Plant Journal 9(6), 1996, 927–933 beschrieben, führt die Expression des Lc-Gens in der Tomate unter der Kontrolle des S35-Promotors aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus zu einer Anhäufung von Anthocyanen lediglich in jenen Geweben, von denen man normalerweise erwartete, dass sie Anthocyane erzeugen, wie zum Beispiel Blätter, Stiele, Kelchblätter und das Hauptgefäß (main vein) der Kronenblätter. In den Blättern trat die gesamte Anthocyan-Erzeugung ausschließlich in der Epidermis-Schicht auf. Es wurde darüber hinaus beschrieben, dass die Überexpression von homozygotem Lc für die Pflanze tödlich ist.
Quattrocchio et al., Plant Cell 5, 1993, 1497–1512 beschreibt die Einführung von Genen in Teile von Petunia-Blättern durch Teilchen-Beschuss. In diesen Experimenten führte die Kombination der Lc- und der C1-Transkriptions-Faktoren zu einer Anhäufung von Anthocyanen in den Blättern. Es wird keine Lehre gegeben, wie sich die Wirkungen dieses Verfahrens auf die Erzeugung von Flavonoiden, die von Anthocyanen verschieden sind, wie zum Beispiel Flavonolen, auswirken. Darüber hinaus ist es im Stand der Technik gut bekannt, dass jene Experimente, welche durch das Verfahren des Teilchen-Beschusses ausgeführt werden, nicht als verlässliche Vorhersagen für die Wirkungen verwendet werden können, welche durch den transgenen Einbau von Genen erhalten werden können.
Es gibt keine Berichte in der Literatur, welche bestätigen, dass die Konzentrationen der Anthocyane in unmittelbarem Zusammenhang mit den Konzentrationen der Flavonole oder anderer Flavonoide stehen. Es gibt ebenso keinerlei Offenbarung in der Literatur über die Beeinflussung der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, in Pflanzen mittels der Expression von regulatorischen Transkriptions-Faktoren.
Dementsprechend gibt es nach wie vor eine fortwährende Notwendigkeit für die Entwicklung von Verfahren zur Steigerung der Konzentrationen der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, insbesondere von Flavonolen, in Pflanzen.
Darüber hinaus besteht eine Notwendigkeit, die Konzentrationen der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, in Pflanzen oder spezifischen Teilen derselben zu steigern, wobei ein wesentlicher Anstieg der Anthocyan-Erzeugung vermieden wird, so dass einerseits die Menge der gewünschten Bestandteile zunimmt, jedoch die Farbe der Pflanzen nahezu die gleiche bleibt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Unter einem ersten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereit, welche erhöhte Konzentrationen von Flavonolen zeigt, welches Verfahren (i) den Einbau eines Gens, das für einen Transkriptions-Faktor vom myb-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei das Gen funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, und (ii) den Einbau eines Gens, das für einen Transkriptions-Faktor vom myc-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei das Gen funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, in diese Pflanze umfasst, so dass die Pflanze mit jedem Gen stabil transformiert wird, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze darstellt, und wobei der Transkriptions-Faktor vom myb-Typ den C1-Transkriptions-Faktor aus Mais, und der Transkriptions-Faktor vom myc-Typ den Lc-Transkriptions-Faktor aus Mais darstellt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass eine Kombination der vorstehenden zwei Gene, welche für Transkriptions-Faktoren kodieren, veränderte Konzentrationen für Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, liefert. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Pflanzen stabil mit diesen Genen transformiert.
Die Erfindung stellt ebenso eine Pflanze mit einem Gen, das einen Transkriptions-Faktor vom myb-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, und mit einem Gen bereit, das für einen Transkriptions-Faktor vom myc-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, welche Gene stabil in das Genom transformiert sind, so dass dessen Fähigkeit, Flavonole zu erzeugen, erhöht ist, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze darstellt, und wobei der Transkriptions-Faktor vom myb-Typ den C1-Transkriptions-Faktor aus Mais, und der Transkriptions-Faktor vom myc-Typ den Lc-Transkriptions-Faktor aus Mais darstellt.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine Tomatenpflanze mit einer Kombination der beiden vorstehenden Gene oder weiterer Gene bereit, welche für Transkriptions-Faktoren der Flavonoid-Biosynthese kodieren, wobei die Gene vorzugsweise stabil in das Genom eingebaut sind, so dass dessen Fähigkeit, Flavonoide zu erzeugen, die von Anthocyanen verschieden sind, verändert wird.
Vorzugsweise stellt die Pflanze eine Tomatenpflanze mit erhöhten Flavonol-Konzentrationen im Fruchtfleisch der Frucht dar.
Die Samen, Früchte und Nachkommen solcher Pflanzen und Hybriden, welche die Transkriptions-Faktoren Lc und C1 aus Mais umfassen, werden ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine Pflanze bereit, welche ein DNA-Konstrukt umfasst, das Sequenzen umfasst, die für eine Kombination der beiden vorstehenden Gene kodieren, wobei jedes Gen einen anderen Transkriptions-Faktor für die Flavonoid-Biosynthese kodiert, und jedes Gen mit dem Promotor funktionell verknüpft ist. Wenn diese Konstrukte in eine Pflanzenzelle einer Tomate transformiert werden, sind sie nützlich bei der Überexpression von Genen, die für die Enzyme des biosynthetischen Stoffwechselweges für Flavonoide kodieren, so dass dadurch die Fähigkeit der Tomatenpflanze, Flavonole zu erzeugen, verändert wird. Die Erfindung liefert ebenso Samen, Früchte und Nachkommen derselben, welche diese Gene umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann besser durch die Bezugnahme auf die folgende Beschreibung verstanden werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen verstanden wird:
1 zeigt eine Restriktionskarte der Plasmide pUCAP, pUCM2 und pUCM3.
2 zeigt Restriktionskarten der Plasmide pGPTV-KAN und pBBC3.
3 zeigt den T-DNA-Bereich der chimären Gen-Konstrukte (a) pBBC10; (b) pBBC20; (c) pBBC30; (d) pBBC200; (e) pBBC300. Abkürzungen: Pnos: Nopalin-Synthase-Promotor, Pd35S: 35S-Promotor mit zwei Enhancern des Blumenkohl-Mosaikvirus' (cauliflower mosaic virus; CaMV); Tnos: Nopalin-Synthase-Terminator; Trbc: Gen-Terminator der kleinen Untereinheit von Ribulose-Eisphosphat-Carboxylase aus der Erbse; C1: Mais C1-Gen; Lc^–: Lc-Gen aus Mais ohne eine Leader-Sequenz; Lc⁺: Lc-Gen aus Mais mit einer Leader-Sequenz.
4 zeigt einen Southern-Blot der chromosomalen DNA aus der Tomate. Die chromosomale DNA wurde aus Blättern von transgenen und nicht-transgenen Tomatenpflanzen isoliert. 5 μg DNA wurden mit BglII verdaut, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ein Nylon-Filter übertragen. Die DNA wurde mit einer radioaktiv markierten, nptII-spezifischen Sonde hybridisiert und autoradiographiert, wobei ein Gerät vom Typ „Bio-Imager" verwendet wurde.
5 zeigt einen Southern-Blot von chromosomaler DNA aus der Tomate. Die chromosomale DNA wurde aus den Blättern von transgenen und nicht-transgenen Tomatenpflanzen isoliert. 5 μg DNA wurden mit EcoRI (Bild A) und NcoI (Bild B) verdaut, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ein Nylon-Filter übertragen. Die DNA wurde mit einer radioaktiv markierten, C1-spezifischen Sonde hybridisiert und autoradiographiert. Der Pfeil zeigt zu der hybridisierenden 1,5 kb großen NcoI-Bande aus pBBC10.
6 zeigt einen Southern-Blot von chromosomaler DNA aus der Tomate. Die chromosomale DNA wurde aus den Blättern von transgenen und nicht-transgenen Tomatenpflanzen isoliert. 5 μg DNA wurden mit BglII und ClaI verdaut, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ein Nylon-Filter übertragen. Die DNA wurde mit einer radioaktiv markierten, nptII-spezifischen Sonde hybridisiert und autoradiographiert.
7 zeigt einen Sothern-Blot von chromosomaler DNA aus der Tomate. Die chromosomale DNA wurde aus den Blättern von transgenen und nicht-transgenen Tomatenpflanzen isoliert. 5 μg DNA wurden mit BglII und ClaI verdaut, auf einem Agarose-Gel aufgetrennt und auf ein Nylon-Filter übertragen. Die DNA wurde mit einer radioaktiv markierten, Lc-spezifischen Sonde hybridisiert und autoradiographiert.
8 zeigt typische HPLC-Chromatogramme, die bei 370 nm aufgenommen wurden, von hydrolysierten Extrakten (A) von der Schale und (B) von dem Fruchtfleisch-Gewebe aus den roten Früchten von nicht-transformierten Tomatenpflanzen. Die Peaks der Quercetin- und Kaempferol-Aglycone sind angegeben.
9 zeigt typische HPLC-Chromatogramme, die bei 360 nm aufgenommen wurden, von nicht-hydrolysierten Extrakten (A) von der Schale und (B) von dem Fruchtfleisch-Gewebe aus den roten Früchten von nicht-transformierten Tomatenpflanzen. Die Peaks von unterschiedlichen Flavonol-Glycosiden und Naringenin-Chalcon sind durch den Verbindungsnamen angegeben.
10 zeigt HPLC-Chromatogramme, die bei 370 nm aufgenommen wurden, von hydrolysierten Extrakten von Fruchtfleisch-Gewebe aus den roten Früchten von (A) einer nicht-transformierten Pflanze und (B) einer Pflanze, die mit dem Genkonstrukt pBBC300 transformiert wurde.
11 zeigt die Konzentrationen von Quercetin, Kaempferol und Naringenin (in mg/kg Trockengewicht (dry weight; DW)) in den Extrakten aus dem Fruchtfleisch von roten Früchten von manchen Kontrollpflanzen und von Pflanzen, die erfolgreich entweder mit dem Genkonstrukt pBBC200 (Reihe 2000–2499 der transformierten Pflanzen) oder mit dem Genkonstrukt pBBC300 (Reihe 3000 der transformierten Pflanzen) transformiert wurden. Die Daten wurden aus den hydrolysierten Extrakten berechnet, das heißt Naringenin stammt aus der Isomerisierung des Narichalcons, und die Aglycone des Quercetins und des Kaempferols stammen von ihren jeweiligen Glycosiden.
12 zeigt die Konzentrationen der gesamten Flavonole (Quercetin plus Kaempferol) sowie Naringenin in den Extrakten aus den ganzen Früchten von bestimmten Kontrollpflanzen- und transformierten Tomatenpflanzen. Die Daten wurden aus den hydrolysierten Extrakten berechnet, das heißt Naringenin stammt aus der Isomerisierung des Narichalcons, und die Aglycone des Quercetins und des Kaempferols stammen von ihren jeweiligen Glycosiden.
13 zeigt typische HPLC-Chromatogramme, die bei 360 nm aufgenommen wurden, von nicht-hydrolysierten Extrakten aus dem Fruchtfleisch-Gewebe von roten Früchten von (A) einer nicht-transformierten Pflanze und (B) einer Pflanze, die mit pBBC300 transformiert wurde.
14 zeigt die von der Reifung abhängige Anhäufung von Flavonolen des Kaempferol-Typs im Fruchtfleisch von Früchten aus einer Pflanze, die mit pBBC300 transformiert wurde. HPLC-Chromatogramme, die bei 370 nm aufgenommen wurden, von hydrolysierten Extrakten aus den Früchten (A) im grünen Stadium, (B) im Übergangsstadium und (C) im roten Stadium sind gezeigt.
15 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pFLAP10, pFLAP20 und pFLAP30.
16 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pFLAP200 und pFLAP300.
17 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pBBC10, pBBC20 und pBBC30.
18 zeigt die Restriktionskarten der Plasmide pBBC200 und pBBC300.
19 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pT7E8.
20 zeigt eine Restriktionskarte des Plasmids pBBC250.
21 zeigt die Expression der regulatorischen Gene Lc und C1, in Bezug auf das konstitutive Gen cyp, in den roten Früchten einer Kontrollpflanze (Nummer 004), von Pflanzen, die mit einem Gen-Konstrukt mit einem einzelnen Gen pBBC10 (nummeriert von 100 aufwärts), pBBC20 (nummeriert von 200 aufwärts) oder pBBC30 (nummeriert von 300 aufwärts) transformiert werden, sowie von Pflanzen, die mit einem Gen-Konstrukt mit zwei Genen pBBC250 (nummeriert von 2500 aufwärts) oder pBBC300 (Nummer 3031) transformiert wurden. Für jede Pflanze ist die Konzentration des Kaempferols angegeben, die in den Früchten gemessen wurde. ---: < 2 mg/kg Frischgewicht; +: 2–10 mg/kg Frischgewicht; ++: 11–40 mg/kg Frischgewicht; +++: > 40 mg/kg Frischgewicht.
22 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration der gesamten Flavonoide (Quercetin, Kaempferol und Naringenin) und der antioxidativen Wirkung (TEAC-Werte) der roten Früchte von manchen Kontrollpflanzen (c) und den mit pBBC300 transformierten Tomatenpflanzen (t).
23 zeigt die Serum-Pellet-Verhältnisse für Tomatenpasten, die aus transformierten Tomaten hergestellt wurden, im Vergleich mit Pasten, die aus Kontroll-Tomaten hergestellt wurden.
24 zeigt Bostwick-Werte von Tomatenpasten, die aus transformierten Tomaten hergestellt wurden, im Vergleich mit Pasten, die aus Kontroll-Tomaten hergestellt wurden.
25 zeigt einen Spektrum-Index-Blot eines Ausschnitts aus einem HPLC-Chromatogramm, das bei 280 nm aufgenommen wurde, von nicht-hydrolysierten Extrakten aus ganzen roten Früchten einer mit pBBC300 transformierten Pflanze. Die Retentionszeiten und die Absorptionsspektren der einzelnen Flavonoide, deren Konzentrationen in der transformierten Pflanze erhöht waren, sind auf dem oberen Bild angegeben.
26 zeigt typische HPLC-Chromatogramme, die bei 360 nm aufgenommen wurden, von nicht-hydrolysierten Extrakten aus ganzen roten Früchten (A) von einer nicht-transformierten Pflanze und (B) von einer Pflanze, die mit pBBC300 transformiert wurde. Die Retentionszeiten und die Namen der identifizierten Peaks sind angegeben.
27 zeigt typische HPLC-Chromatogramme, die bei 280 nm aufgenommen wurden, von nicht-hydrolysierten Extrakten aus ganzen roten Früchten (A) von einer nicht- transformierten Pflanze und (B) von einer Pflanze, die mit pBBC300 transformiert wurde. Die Retentionszeiten und die Namen der identifizierten Peaks sind angegeben.
28 zeigt die Konzentrationen der gesamten Flavonole (Quercetin plus Kaempferol) in hydrolysierten Extrakten von ganzen roten Früchten von nicht-transformierten Kontroll-Pflanzen (linker Balken, Durchschnittswert ± Standardabweichung, n = 10), Pflanzen, die mit einem Gen-Konstrukt mit einem einzelnen Gen pBBC10 (nummeriert von 100 aufwärts), pBBC20 (nummeriert von 200 aufwärts) und pBBC30 (nummeriert von 300 aufwärts) transformiert wurden, sowie von manchen Pflanzen, die mit einem Gen-Konstrukt mit zwei Genen pBBC200 (nummeriert von 2000–2499) und pBBC300 (nummeriert von 3000–3499) transformiert wurden.
29 zeigt die Konzentrationen der gesamten Flavonole (Quercetin plus Kaempferol), Kaempferol, Quercetin und Naringenin, die durch HPLC in den ganzen Früchten der Kontrollpflanzen und der transformierten Tomatenpflanzen gemessen wurden. Die Flavonoid-Konzentrationen sind in mg/kg Frischgewicht angegeben und wurden aus den hydrolysierten Extrakten berechnet, das heißt Naringenin leitet sich aus der Hydrolyse der Naringenin-Glycoside (nur in Transformanten) und aus der Isomerisierung des Narichalcons (sowohl in Kontrollpflanzen als auch in Transformanten) ab. Der erste Balken in jedem Plot stellt die Konzentrationen der Kontrollpflanzen dar (Durchschnittswerte ± Standardabweichung, n = 10).
30 zeigt typische GC-MS-Chromatogramme, den aufgenommenen, gesamten Ionenstrom (total ion counts; TIC) von flüchtigen Verbindungen, die von den roten Tomatenfrüchten (A) einer nicht-transformierten Kontrollpflanze, (B) einer Pflanze, die mit pBBC20 transformiert wurde, (C) einer Pflanze, die mit PBBC10 transformiert wurde, und (D) einer Pflanze, die mit pBBC200 transformiert wurde, erzeugt wurden. Die Pfeile geben die Position von Methylsalicylat an (mit den integrierten Peakflächen). Y-Achse: Prozentsatz des TIC (100% = 8 × 10⁶); X-Achse: Retentionszeit (Minuten).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Ausdruck „Pflanze", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine ganze Pflanze oder einen Teil derselben oder eine Pflanzenzelle oder eine Gruppe von Pflanzenzellen. Vorzugsweise jedoch ist die Erfindung insbesondere auf die Transformation von ganzen Pflanzen gerichtet, und die Verwendung der ganzen Pflanze oder von erheblichen Teilen derselben, wie zum Beispiel auf die Früchte, Blätter oder Samen.
Ein „Flavonoid" oder ein „Flavonol" kann in geeigneter Weise ein Aglycon oder ein Glycosid bezeichnen.
Ein „Gen" ist eine DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, einschließlich der modifizierten oder synthetischen DNA-Sequenzen oder der natürlich vorkommenden Sequenzen, die für ein Protein kodieren, und ausschließlich der 5'-Sequenz, welche den Beginn der Transkription steuert.
Ein „Transkriptions-Faktor" ist ein Protein, das mit einem Promotor in Wechselwirkung treten kann und dadurch das Ausmaß der Expression eines Gens beeinflusst, welches funktionell mit diesem Promotor verknüpft ist. Eine dazu funktionell äquivalente Sequenz ist eine beliebige Sequenz, welche für ein Protein kodiert, das ähnliche funktionelle Eigenschaften aufweist. Es wird zu würdigen sein, dass funktionell äquivalente Sequenzen Gen-Fragmente, welche nach wie vor ähnliche funktionelle Eigenschaften aufweisen, und veränderte Gene (zum Beispiel mutierte Gene) umfassen, die nach wie vor ähnliche funktionelle Eigenschaften aufweisen; die funktionell äquivalenten Sequenzen sind jedoch nicht auf die beschriebenen Gene beschränkt. Vorzugsweise existiert ein hoher Grad an Homologie (eye ball method; Augapfel-Verfahren) zwischen den Genen und ihren funktionellen Äquivalenten, zum Beispiel mindestens 60%, stärker bevorzugt mehr als 80%, am meisten bevorzugt mehr als 95%.
Der Ausdruck „funktionell verknüpft mit einem oder mehreren Promotoren" bezeichnet jenen Zustand, dass das Gen oder die DNA-Sequenz so positioniert ist oder mit dem Promotor so verbunden ist, dass die Funktion des Promotors gewährleistet ist. Der Promotor ist eine beliebige Sequenz, welche ausreicht, um die Transkription der DNA zu ermöglichen. Nachdem die Gen- und Promotor-Sequenzen verbunden wurden, wird das Gen nach der Aktivierung des Promotors exprimiert werden.
Ein „Konstrukt" ist ein Polynukleotid, das Nukleinsäure-Sequenzen umfasst, welche normalerweise in der Natur nicht miteinander vorkommen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem unerwarteten Befund, dass die Konzentrationen der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, in Tomatenpflanzen durch den Einbau von zwei oder mehreren Genen, welche für die aus Mais stammenden Transkriptions-Faktoren C1 und Lc der Flavonoid-Biosynthese kodieren, in die Pflanze beeinflusst werden können.
Vorzugsweise werden die Pflanzen in stabiler Weise mit den zwei Genen transformiert, die für Transkriptions-Faktoren kodieren, zum Beispiel durch Verwendung genetischer Modifikationswege.
In vorteilhafter Weise können mittels der vorliegenden Erfindung die Konzentrationen der Flavonoide in Tomatenpflanzen erhöht werden. Typischerweise ist es bevorzugt, dass der Anstieg der Konzentration der Flavonole in mindestens einem Teil der Pflanzen offensichtlich ist.
Vorzugsweise ist der Anstieg der Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, und/oder der Anstieg in der Konzentration der Flavonole in der Tomatenpflanze insgesamt oder in dem gewünschten Teil derselben, der normalerweise gegessen wird, um mindestens das zweifache, bevorzugt um mindestens das fünffache, am meisten bevorzugt um mindestens das zehnfache erhöht, im Vergleich mit ähnlichen Pflanzen, die nicht gemäß der Erfindung transformiert wurden.
Darüber hinaus wurde es gefunden, dass die Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, insbesondere die Konzentration der Flavonole in spezifischen Teilen der Tomatenpflanze, erhöht werden kann. Für Früchte tragende Tomatenpflanzen, Erdbeeren und dergleichen ist es vorteilhaft, dass die Konzentration in der Frucht erhöht wird.
Es wurde insbesondere gefunden, dass es möglich ist, die Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, insbesondere der Flavonole in der Tomatenfrucht, und sogar völlig überraschend im Fruchtfleisch der Tomatenfrucht zu erhöhen – einem Gewebe, welches normalerweise keine Flavonoide enthält, so dass dadurch Tomaten mit verbesserten Eigenschaften in Bezug auf den Nährwert, die Konservierung und den Geschmack hergestellt wurden.
Die Konzentration der Flavonole im Fruchtfleisch der Tomate beträgt mindestens 2 mg/kg Frischgewicht, stärker bevorzugt mindestens 10 mg/kg Frischgewicht, am meisten bevorzugt mehr als 30 mg/kg Frischgewicht.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Zunahme bezüglich der Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, in allen oder in den gewünschten Teilen der Tomatenpflanze, wodurch die Konzentration der Anthocyane nicht übermäßig erhöht wird, so dass die Farbe der Pflanze des gewünschten Teils derselben die gleiche bleibt.
Vorzugsweise ist daher die Konzentration der Anthocyane in der Tomatenpflanze insgesamt oder in dem gewünschten Teil derselben (insbesondere der Frucht) ähnlich der Konzentration in der nicht-transformierten Pflanze; zum Beispiel beträgt die Konzentration in den transformierten Pflanzen oder in den Teilen derselben weniger als das Zweifache der Konzentration in den nicht-transformierten Pflanzen, stärker bevorzugt weniger als das 1,5-fache, noch stärker bevorzugt etwa das gleiche oder weniger.
In den Tomatenpflanzen sind die Schale und das Fruchtfleisch der Frucht normalerweise im Wesentlichen frei von Anthocyanen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Konzentration der Anthocyane in solchen Teilen, zum Beispiel in der Schale und/oder im Fruchtfleisch der Tomatenfrucht, von transformierten Pflanzen der Erfindung daher gleichermaßen gering, zum Beispiel beträgt die Konzentration weniger als 2 mg/kg Frischgewicht, stärker bevorzugt weniger als 1 mg/kg Frischgewicht, am meisten bevorzugt ist sie im Wesentlichen frei von Anthocyanen.
Es wird darüber hinaus zu würdigen sein, dass die Sequenzen, welche für die Transkriptions-Faktoren Lc und C1 für die Flavonoid-Biosynthese kodieren, eine genomische DNA oder einen cDNA-Klon darstellen können.
Gen-Sequenzen, welche für die Transkriptions-Faktoren der Flavonoid-Biosynthese für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, können in geeigneter Weise aus Maispflanzen erhalten werden (siehe zum Beispiel Lloyd et al., vorstehend), Antirrhinum (siehe zum Beispiel Goodrich et al., Cell 68, 1992, 955–964) und Petunia (siehe Quattrocchio et al., Plant Cell 5, 1993, 1497–1512).
Die betreffenden Gen-Sequenzen werden funktionell (das heißt sie werden so positioniert, dass deren Funktionieren gewährleistet ist) mit einem oder mehreren geeigneten Promotoren verknüpft, welche die Transkription der DNA ermöglichen. Geeignete Promotoren, welche homolog oder heterolog zu dem Gen sein können (das heißt die natürlicherweise nicht funktionell mit einem Gen verknüpft sind, das für einen Transkriptions-Faktor der Flavonoid-Biosynthese kodiert), das für die Expression in Pflanzen nützlich ist, sind im Stand der Technik bekannt, wie zum Beispiel beschrieben in Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22, 1988, 421–477. Die Promotoren für die Verwendung gemäß der Erfindung können induzierbare, konstitutive oder gewebe-spezifische Promotoren sein, oder sie können verschiedene Kombinationen von solchen Eigenschaften aufweisen.
Vorzugsweise ist mindestens eines der Gene mit einem Promotor verknüpft, der entweder nicht-konstitutiv und/oder gewebe-spezifisch ist. Man glaubt, dass die Verwendung von mindestens einem konstitutiven Promotor vorteilhaft in dem Sinne ist, dass er die Bildung von sehr hohen (tödlichen) Dosen von einem oder mehreren Bestandteilen im Flavonoid-Stoffwechselweg verhindert. Die Verwendung von gewebe-spezifischen Promotoren kann in gleicher Weise vorteilhaft in dem Sinne sein, dass sie dazu verwendet werden können, die Bildung von Flavonoiden, die von Anthocyanen verschieden sind, in spezifischen gewünschten Teilen der Pflanze einzuführen oder zu steigern.
Verwendbare Promotoren umfassen konstitutive Promotoren, wie zum Beispiel den Nelken-Ätz-Ringvirus (carnation etched ring virus; CERV), den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus' (cauliflower mosaic virus; CaMV), oder insbesondere den Promotor mit zwei Enhancern des Blumenkohl-Mosaikvirus, welcher zwei 35S-Promotoren des Blumenkohl-Mosaikvirus in Tandem-Anordnung umfasst (bezeichnet als „doppelter 35S-Promotor"); die Promotoren sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Es kann wünschenswert sein, einen gewebe-spezifischen oder einen in Bezug auf die Entwicklung regulierten Promotor anstelle eines konstitutiven Promotors unter bestimmten Umständen zu verwenden. Ein gewebe-spezifischer Promotor induziert oder steigert die Expression des Transkriptions-Faktors für die Flavonoid-Biosynthese in bestimmten gewünschten Geweben, vorzugsweise ohne die Expression in anderen Geweben in übermäßiger Weise zu beeinflussen. Die Promotoren, welche bei der Überexpression des Transkriptions-Faktors Lc aus Mais in Tomatenpflanzen verwendet werden, werden vorzugsweise gewebe-spezifisch, insbesondere frucht-spezifisch sein. Die Überexpression von Lc in vegetativen Geweben von Tomatenpflanzen ist als schädlich für die Gesundheit der Pflanze bekannt (siehe Goldsbrough et al., vorstehend). Geeignete frucht-spezifische Promotoren umfassen den E8-Promotor aus der Tomate (Deikman et al., EMBO J. 7, 1988, 3315–3320), den 2A11-Promotor (Van Haaren et al., Plant Mol. Biol. 21, 625–640), den E4-Promotor (Cordes et al., Plant Cell 1, 1989, 1025–1034) und den PG-Promotor (Bird et al., Plant Mol. Biol. 11, 1988, 651–662; Nicholass et al., Plant Mol. Biol. 28, 1995, 423–435). Beide Transkriptions-Faktoren für die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung können in geeigneter Weise mit demselben oder mit verschiedenen frucht-spezifischen Promotoren funktionell verknüpft werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird jedoch ein Gen, das für einen ersten Transkriptions-Faktor der Flavonoid-Biosynthese kodiert, mit einem konstitutiven Promotor funktionell verknüpft, während ein Gen, das für einen zweiten Transkriptions-Faktor der Flavonoid-Biosynthese kodiert, mit einem nicht-konstitutiven oder gewebe-spezifischen Promotor funktionell verknüpft wird, zum Beispiel mit einem frucht-spezifischen Promotor. Die Kombination eines konstitutiven und eines frucht-spezifischen Promotors hilft dabei, zu gewährleisten, dass die gewünschten Flavonoide hauptsächlich in der Tomatenfrucht hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung einer solchen Kombination liegt darin, dass mögliche hemmende Wirkungen („Gen-Abschaltung"; „gene silencing") auf die Expression der eingeführten Gene vermieden werden, welche Wirkungen aus der Verwendung des gleichen Promoters herrühren.
Das Gen, welches für den Transkriptions-Faktor C1 aus Mais kodiert und funktionell mit dem konstitutiven, doppelten 35S-CaMV-Promotor verknüpft ist, wird mit einem Lc-Transkriptions-Faktor aus Mais kombiniert, der funktionell mit dem frucht-spezifischen E8-Promotor aus der Tomate verknüpft ist.
Es wird zu würdigen sein, dass die Überexpression der Gene, welche für die vorstehenden Transkriptions-Faktoren der Flavonoid-Biosynthese kodieren, gemäß dem Verfahren der Erfindung zu einer Anhäufung sowohl der Anthocyane als auch der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, führen kann, insbesondere, wenn die Transkriptions-Faktoren an einer Position entlang des biosynthetischen Stoffwechselweges der Flavononoide wirksam sind, ehe sich die jeweiligen Stoffwechselwege für Flavonole und Anthocyane verzweigen. Dies kann manchmal unerwünscht sein, da die Bildung der Anthocyane nicht nur zur Erzeugung von ästhetisch unerwünschten, violett gefärbten Früchten führt, sondern auch die Erzeugung der Flavonole begrenzen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher jene Gene für die Kodierung der Transkriptions-Faktoren ausgewählt, welche einerseits zu einem Anstieg der Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, in der ganzen Pflanze oder den gewünschten Geweben führen, welche jedoch andererseits die Konzentration der Anthocyane in dieser Pflanze oder in den gewünschten Geweben derselben nicht wesentlich steigern. In einer weiteren Ausführungsform kann diese Vorgabe durch Blockierung des Expressionsweges der Anthocyane bewerkstelligt werden, zum Beispiel durch einen zusätzlichen Schritt, der eine Antisens-Unterdrückung der Dihydroflavonol-Reduktase (DFR) umfasst, jenes Enzyms, das den letzten Schritt bei der Erzeugung der Anthocyane katalysiert. In alternativer Weise können die Transkriptions-Faktoren in einer mutierten Zelllinie überexprimiert werden, wie zum Beispiel in einer Tomaten-Linie, der es an einer DFR-Aktivität mangelt, zum Beispiel der Anthocyan-Mangelmutante (anthocyanin without mutant; aw-Mutante), die von Goldsbrough et al., Plant Physiol. 105, 1994, 491–496 beschrieben wurde.
Darüber hinaus kann die Anhäufung der Flavonoide ebenso durch die Geschwindigkeit für die Erzeugung der Aminosäure Phenylalanin gehemmt werden, welche das erste Substrat in der Synthese der Phenylpropanoide und der nachfolgenden Flavonoide darstellt. Um die Phenylalanin-Biosynthese zu erhöhen, können die Gene, welche für die Enzyme des Phenylalanin-Stoffwechselweges kodieren, und die gegenüber der Regulation mittels eines Rückkopplungs-Mechanismus' unempfindlich sind, als ein wahlweiser zusätzlicher Schritt eingeführt werden.
Die Pflanzen, welche eine Kombination von Genen beherbergen, die für die Transkriptions-Faktoren der Flavonoid-Biosynthese gemäß der Erfindung kodieren, können durch Kreuzung einer Pflanze, welche einen Transkriptions-Faktor des Paars exprimiert, mit einer anderen Pflanze, welche den anderen Transkriptions-Faktor exprimiert, unter Verwendung herkömmlicher Kreuzungs- und Züchtungs-Verfahren hergestellt werden. Die jeweiligen Ausgangsmaterialien können durch herkömmliche Verfahren zur Transformation von Pflanzen hergestellt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Vorzugsweise werden jedoch die gewünschten Gen-Sequenzen, die funktionell mit den jeweiligen geeigneten Promotoren verknüpft sind, mit den geeigneten Expressions-Sequenzen verbunden, um eine Expressions-Kassette bereitzustellen, die in einer Pflanzenzelle funktionell ist, und die in eine Pflanzenzelle durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren zur Transformation von Pflanzen eingeführt werden kann.
Dementsprechend stellt die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt eine Expressions-Kassette bereit, die als funktionell verknüpfte Bestandteile in 5'-3'-Richtung der Transkription zwei oder mehrere Einheiten umfasst, welche Einheit jeweils einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, ein Gen, das für einen Transkriptions-Faktor für die Flavonoid-Biosynthese kodiert, und einen regulatorischen Bereich für die Termination der Transkription und der Translation, welcher Bereich in einer Pflanzenzelle funktionell ist, umfasst.
Der Promotor und die regulatorischen Bereiche für die Termination werden in der Wirtspflanzenzelle funktionell sein, und sie können heterolog sein (das heißt sie kommen nicht natürlich vor), oder sie können homolog sein (sie stammen von der Spezies der Wirtspflanze ab), in Bezug auf die Pflanzenzelle und das Gen. Geeignete Promotoren, die verwendet werden können, sind vorstehend beschrieben.
Der regulatorische Bereich für die Termination kann von dem 3'-Bereich des Gens stammen, von dem der Promotor erhalten wurde, oder von einem anderen Gen. Geeignete Terminations-Bereiche, welche verwendet werden können, sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen Agrobacterium tumefaciens Nopalin-Synthase-Terminator (Tnos), Agrobacterium tumefaciens Mannopin-Synthase-Terminator (Tmas) und den CaMV-35S-Terminator (T35S). Besonders bevorzugte Terminations-Bereiche für die Verwendung gemäß der Erfindung umfassen den Terminations-Bereich der klei nen Untereinheit der Ribulose-Eisphosphat-Carboxylase aus Tabak oder den Tnos-Terminations-Bereich.
Solche Gen-Konstrukte können in geeigneter Weise in Bezug auf ihre Aktivität durch Transformation in eine Wirtspflanze mittels Agrobacterium und durch Screening der Flavonoid-Konzentrationen durchsucht werden.
In herkömmlicher Weise kann die Expressions-Kassette gemäß der Erfindung durch Klonierung der individuellen Promotor/Gen/Terminator-Einheiten in einen geeigneten Klonierungsvektor hergestellt werden. Geeignete Klonierungsvektoren sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen Vektoren, wie zum Beispiel pUC (Norrander et al., Gene 26, 1983, 101–106), pEMBL (Dente et al., Nucleic Acids Res. 11, 1983, 1645–1699), pBluescript (erhältlich von Stratagene), pGEM (erhältlich von Promega) und pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, 1977, 95–113). Besonders nützliche Klonierungsvektoren sind jene, die auf der pUC-Reihe beruhen. Der Klonierungsvektor erlaubt die Amplifikation und Manipulation der DNA, zum Beispiel durch das Hinzufügen von Sequenzen. Die Klonierungsstellen liegen vorzugsweise in Form eines Polylinkers vor, das heißt in Form einer Sequenz, die viele beieinander liegende Schnittstellen aufweist, so dass dadurch eine Flexibilität bei der Klonierung ermöglicht wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die individuellen Promotor/Gen/Terminator-Einheiten in benachbarte Paare von Schnittstellen in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert. Die individuellen Promotor/Gen/Terminator-Einheiten können in herkömmlicher Weise unter Verwendung eines Klonierungsvektors konstruiert werden, der dieselben Schnittstellen umfasst, wie sie in dem Klonierungsvektor für das Konstrukt mit vielen verschiedenen Einheiten vorliegen, wobei jedoch die Schnittstellen eher in einer verschachtelten Weise angeordnet sind als in einer sequenziellen Weise.
In geeigneter Weise können die Nukleotid-Sequenzen für die Gene aus der Nukleotid-Datenbank „Genbank" entnommen und auf Restriktionsenzyme untersucht werden, die sie nicht schneiden. Diese Schnittstellen können zu den Genen durch herkömmliche Verfahren hinzugefügt werden, wie zum Beispiel durch den Einbau dieser Schnittstellen in PCR-Primer oder durch Sub-Klonierung.
Vorzugsweise ist das DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung in einem Vektor enthalten, am besten geeignet in einem Expressionsvektor, der für die Expression in einer geeigneten Wirtszelle (Pflanze) angepasst ist. Es wird zu würdigen sein, dass ein beliebiger Vektor, der in der Lage ist, eine Pflanze zu ergeben, welche die eingeführte DNA-Sequenz umfasst, ausreichend sein wird.
Geeignete Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet des Standes der Technik gut bekannt und sie werden in allgemeinen technischen Referenzen beschrieben, wie zum Beispiel Pouwels et al., Cloning Vectors. A laboratory manual, Elsevier, Amsterdam (1986). Besonders geeignete Vektoren umfassen die Ti-Plasmid-Vektoren.
Die Transformations-Verfahren für die Einführung der DNA-Konstrukte gemäß der Erfindung in Wirtszellen sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen solche Verfahren, wie zum Beispiel die Mikro-Injektion unter Verwendung von Polyethylenglykol, die Elektroporation, oder das Eindringen eines ballistischen Geschosses mit hoher Geschwindigkeit. Ein bevorzugtes Verfahren für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung beruht auf der durch Agrobacterium vermittelten Transformation.
Nach der Transformation der Pflanzenzellen oder der Pflanze können solche Pflanzenzellen oder Pflanzen, in die die gewünschte DNA eingebaut wurde, mittels solcher Verfahren, wie zum Beispiel einer Antibiotika-Resistenz, einer Herbizid-Restistenz, einer Toleranz gegenüber Aminosäure-Analoga oder unter Verwendung phänotypischer Marker, selektiert werden.
Zahlreiche Assays können verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Pflanzenzelle eine Zunahme in der Gen-Expression zeigt, zum Beispiel Northern-Blotting oder die quantitative PCR mit reverser Transkriptase (RT-PCR). Ganze transgene Pflanzen können aus der transformierten Zelle durch herkömmliche Verfahren wiederhergestellt werden. Solche transgenen Pflanzen mit verbesserten Flavonoid-Konzentrationen können vermehrt und gekreuzt werden, um homozygote Linien zu erzeugen. Solche Pflanzen produzieren Samen, welche die Gene für das eingeführte Merkmal enthalten, und sie können gezüchtet werden, um Pflanzen herzustellen, welche den ausgewählten Phänotyp hervorbringen werden.
In Übereinstimmung mit einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wurden die Klonierungsvektoren, die Plasmide pUCM2 und pUCM3, durch Modifikation des Klonierungsvektors pUCAP hergestellt (Van Engelen et al., Transgenic Research 4, 1995, 288–290). Die multiplen Klonierungsstellen in diesen Plasmiden wurden durch den Einbau von synthetischen Adaptern konstruiert, welche die benötigten Schnittstellen enthalten. Jedes einzelne Gen-Konstrukt, das für einen Transkriptions-Faktor der Flavonoid-Biosynthese kodiert, wird in pUCM2 hergestellt. Im Allgemeinen wurde jeder Promotor als ein KpnI/BamHI-Fragment, jedes Struktur-Gen als ein BamHI/SalI-Fragment und jeder Terminator-Bereich als ein SalI/ClaI-Fragment kloniert, so dass jede individuelle Gen-Fusion als ein KpnI/ClaI-Fragment ausgebildet wurde. Durch Verwendung von Schnittstellen außerhalb von KpnI und ClaI können die individuellen Gen-Fusionen hintereinander in das Plasmid pUCM3 kloniert werden, welches die Schnittstellen von pUCM2 enthält, jedoch in einer unterschiedlichen Reihenfolge. Unter Verwendung der zwei einzigartigen Schnittstellen PacI und AscI wurden die gewünschten Multigen-Konstrukte in das binäre Vektorplasmid pBBC3 für die Pflanzentransformation transformiert, das heißt in ein Derivat des Plasmids pGPTV-KAN, zu welchem ein synthetischer Adapter hinzugefügt wurde, der jeweils eine einzigartige PacI- und AscI-Schnittstelle enthält.
Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von Tomatenpflanzen gemäß der Erfindung oder der gewünschten Teile derselben bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten oder haut- oder haar-schützenden Produkten.
Zum Beispiel können die gewünschten Teile der Pflanze mit der veränderten Konzentration der Flavonoide, die von Anthocyanen verschieden sind, für die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten geerntet werden und darüber hinaus zu einem essbaren Produkt verarbeitet werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tomaten mit erhöhten Konzentrationen von Flavonoiden, die von Anthocyanen verschieden sind, insbesondere Flavonolen. Diese Tomaten können geerntet und als solche gegessen werden. In alternativer Weise können die Tomaten bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten verwendet werden. Zum Beispiel können Teile von Tomaten zu Salaten gegeben werden. Ebenso kann eine Hitze-Behandlung verwendet werden, zum Beispiel können die Tomaten dazu verwendet werden, um Tomaten-Soßen mit Tomaten als einem der Hauptbestandteile herzustellen (zum Beispiel bei Konzentrationen von 10 Gew.-% oder mehr, zum Beispiel 80 Gew.-% oder mehr), wie zum Beispiel Tomatenpaste, Tomatenketchup, Pizzasoße, Pastasoße, Dressings und dergleichen. Ebenso können diese Tomaten dazu verwendet werden, um Produkte wie Tomatensaft, Tomatensuppen und dergleichen herzustellen.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Tomatenpflanzen der Erfindung nicht nur veränderte Konzentrationen an Flavonoiden, die von Anthocyanen verschieden sind, aufweisen, sondern ebenso weitere Vorteile besitzen.
Ein besonderer Vorteil liegt darin, dass die Tomaten erhöhte Gehalte an Methylsalicylat aufweisen. Dies ist eine gut bekannte Vorstufe im Stoffwechselweg der Geschmacksstoffe, und sie führt daher zu einem besseren Geschmack der Produkte der Erfindung.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liegt darin, dass die Tomaten zu verbesserten rheologischen Eigenschaften der daraus hergestellten Produkte führen können. Wenn Tomatensoßen, wie zum Beispiel Tomatenpaste, Tomatenketchup, Pizzasoße, Pastasoße, Dressings und dergleichen, aus Tomaten der Erfindung hergestellt werden, kann dies zu einer Erhöhung der Dicke dieser Soßen führen.
Die DNA-Manipulationen wurden unter Verwendung von Standard-Verfahren durchgeführt, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben in: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 (nachfolgend „Sambrook" genannt).
Die folgenden Literatur-Referenzen werden in den Beispielen erwähnt:

Becker, D. et al., Plant Mol. Biol. 20, 1992, 1195–1197.
Bonierbale, M. W. et al., Genetics 120, 1988, 1095–1103.
Bovy A. G., et al., Acta Hortic 405, 1995, 179–189.
Damiani, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, 8244–8248.
Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 1983, 557–580.
Hertog, M. G. L. et al., J. Agric. Food Chem. 40, 1992, 1591–1598.
Hoekema, A. et al., Plant Mol. Biol. 5, 1985, 85–89.
Jackson, D. et al., Plant Cell 3, 1991, 115–125.
Jefferson, R. et al., EMBO J. 6, 1987, 3901–3907.
Lloyd, A. et al., Science 258, 1992, 1773–1775.
Miller, N. J. und Rice-Evans, C. A., Free Rad. Res. 26, 1997, 195–199.
Murashige, T. und Skoog, F., Physiol. Plant. 15, 1962, 73–97.
Van Engelen, F. et al., Transgenic R. 4, 1995, 288–290.
Verhoeven, H. A. et al., Chromatographia 46, 1997, 63–66.

BEISPIELE
Beispiel 1: Pflanzenmaterial
Alle Experimente können durchgeführt werden, indem normalerweise verfügbare Tomatenlinien als Ausgangsmaterial verwendet werden. FM6203 ist eine solche Linie, die mit den kommerziell erhältlichen Linien, wie zum Beispiel der Sorte Napoli und der Sorte Roma VF, vergleichbar ist, die von Simpson's Seeds (Tomato Growers Club, Surrey, England, MAFF-Registrierungs-Nr. 2620) erhältlich sind.
Die Tomatenlinie FM6203 wurde in einem Glashaus mit einem Belichtungszeitraum von 16 Stunden und einer Tages- und Nacht-Temperatur von 21 bzw. 17°C gezüchtet.
Beispiel 2: Bakterienstämme
Der verwendete Stamm von Escherichia coli war:
DH5', supE44, D(lacZYA-ArgF)U169, f80lacZDM15, hsdR17 (r_k–, m_k+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR (Hanahan, 1983).
Der verwendete Stamm von Agrobacterium war: LBA4404 (Hoekema, 1985).
Die Transformation von E. coli DH5' wurde unter Verwendung des Verfahrens von Hanahan, 1983, durchgeführt.
Die Transformation des Agrobacteriums LBA4404 wurde gemäß dem Verfahren von Gynheung et al., 1988, durchgeführt, das beschrieben ist in Plant Molecular Biology Manual, Eds. Gelvin und Schilperoort, Kluwer Academic Publishers (Dordrecht), pPMANA311-19.
Beispiel 3: Gen-Konstrukte
3.1 Strategie zur Überexpression von Genen der Flavonoid-Biosynthese in Tomatenfrüchten
Die Erzeugung von Flavonoiden in Tomatenfrüchten wird durch die Überexpression der Gene für die Transkriptions-Faktoren C1 und Lc aus Mais gesteigert, deren Gen-Produkte in der Lage sind, die Expression der endogenen Gene für die Flavonoid-Biosynthese in der Tomate zu induzieren. Um die Konzentration der in der Frucht der Tomate vorherrschenden Flavonoide zu steigern, wird das Lc-Gen unter der Kontrolle des frucht-spezifischen E8-Promotors aus der Tomate exprimiert. Das C1-Gen wird unter der Kontrolle des konstitutiven CaMV-35S-Promotors mit einem doppelten Enhancer exprimiert.
Eine Vorgehensweise, bei der eine Kassette eingesetzt wurde, wurde verwendet, um die unterschiedlichen Bestandteile des Gen-Konstrukts zu klonieren, so dass alle Promotoren mit den gleichen Restriktionsenzymen, alle Struktur-Gene mit den gleichen Restriktionsenzymen und alle Terminatoren mit den gleichen Restriktionsenzymen kloniert wurden. Um solche Restriktionsenzyme auszuwählen, wurden die Nukleotid-Sequenzen für alle vorstehend erwähnten Gene aus der Nukleotid-Datenbank „Genbank" herangezogen und nach Restriktionsenzymen durchsucht, die nicht schneiden. Diese Schnittstellen wurden zu den Genen entweder durch den Einbau dieser Schnittstellen in PCR-Primer oder durch Subklonierung hinzugefügt. Die Gene wurden anschließend Schritt für Schritt in speziell dafür konstruierten Vektoren kloniert, die sich von dem Vektor pUC ableiten und die gewünschten Schnittstellen für Restriktionsenzyme in ihren multiplen Klonierungsstellen enthalten.
Die Inserts der endgültigen Konstrukte wurden in einen Transformations-Vektor für Pflanzen überführt und in eine Tomate transformiert.
3.2 Konstruktion der Klonierungsvektoren pUCM2 und pUCM3
Die Plasmide pUCM2 und pUCM3 stammen von dem Klonierungs-Vektor pUCAP ab (1; Van Engelen et al., 1995). Die multiplen Klonierungsstellen in diesen Plasmiden wurden durch Insertion eines synthetischen Adapters konstruiert, der die benötigten Schnittstellen enthielt. Zuerst wurde jedes Gen-Konstrukt in pUCM2 kloniert. Jeder Promotor wurde als ein KpnI/BamHI-Fragment, jedes Struktur-Gen als ein BamHI/SalI- Fragment und jeder Terminator als ein SalI/ClaI-Fragment kloniert. Somit wurden alle Genfusionen als ein KpnI/ClaI-Fragment hergestellt. Durch Verwendung der Schnittstellen außerhalb von KpnI und ClaI können die Gen-Fusionen jeweils hintereinander im Plasmid pUCM3 positioniert werden, welcher Vektor die Schnittstellen von pUCM2 in einer unterschiedlichen Reihenfolge enthält. Mit diesen zwei Gen-Kassetten können bis zu vier Gen-Fusionen hintereinander in einem Konstrukt kloniert werden. Mit den zwei einzigartigen Schnittstellen PacI und AscI können die Multigen-Konstrukte in den binären Vektor pBBC3 überführt werden (2), ein Derivat des Plasmids pGPTV-KAN (Becker et al., 1992).
3.3 Konstruktionen der Lc- und C1-Gen-Fusionen
Gemäß der vorstehend beschriebenen Strategie wurden fünf binäre Konstrukte hergestellt, die Fusionen entweder des Lc- oder des C1-Gens alleine, oder sowohl des Lc- als auch des C1-Gens miteinander enthielten. Zwei Versionen des Lc-Gens wurden verwendet: eine Lc-cDNA mit ihrer 5'-untranslatierten Leader-Sequenz (Lc⁺), und eine Lc-cDNA, der die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz fehlt (Lc^–). Der 5'-Leader enthält ein kleines offenes Leseraster, welches die Lc-Translation unterdrückt, und daher werden die höchsten Konzentrationen an Lc-Protein mit dem letzteren Lc-Gen erhalten (Damiani, 1993). Eine Übersicht über den T-DNA-Bereich dieser Konstrukte ist in 3 gegeben. Die Konstrukte pBBC10, pBBC20 und pBBC30 sind Konstrukte mit einem einzelnen Gen. Die Konstrukte pBBC200 und pBBC300 sind Konstrukte mit zwei Genen, welche sowohl das C1- als auch das Lc-Gen enthalten und dazu verwendet werden, die Menge der Flavonole in der Tomatenfrucht (insbesondere im Fruchtfleisch) zu erhöhen.
In Konstrukt pBBC10 wurde das C1-Gen aus Mais mit dem 35S-Promotor mit zwei Enhancern und dem nos-Terminator fusioniert. Die Konstrukte pBBC20 und pBBC30 sind Konstrukte mit nur einem Gen, in welchem beide Versionen des Lc-Gens aus Mais (ohne bzw. mit der 5'-mRNA-Leader-Sequenz) mit dem E8-Promotor aus der Tomate und dem rbcS-Terminator aus der Erbse fusioniert werden. Das Konstrukt pBBC200 ist ein Konstrukt aus zwei Genen, das aus dem C1-Gen, welches mit dem doppelten 35S-Promotor und dem nos-Terminator fusioniert ist, sowie dem Lc-Gen (ohne Leader-Sequenz) besteht, das mit dem E8-Promotor und dem rbcS-Terminator fusioniert ist. Das Konstrukt pBBC300 ist identisch mit pBBC200, mit der Ausnahme, dass dieses Konstrukt das Lc-Gen mit der 5'-Leader-Sequenz enthält. Eine genaue Beschreibung der Konstruktion aller verwendeten Plasmide ist nachfolgend gegeben.
Gen-Konstrukte
Die verschiedenen Bestandteile der Gen-Fusionen und die verschiedenen verwendeten Plasmid-Vektoren wurden wie folgt erhalten. Der Plasmid-Vektor pUCAP (Van Engelen et al., 1995) wurde von CPRO-DLO bereitgestellt. Der binäre Vektor pGPTV-KAN (Becker et al., 1992) wurde von Unilever bereitgestellt. Der nos-Terminator (Tnos) wurde aus dem Plasmid pBI121 amplifiziert (Jefferson et al., 1987). Der CaMV-35S-Promotor mit zwei Enhancern (Pd35S) wurde aus dem Plasmid pMOG18 isoliert (Symons et al, Biotechnology 8, 1990, 217–221). Der E8-Promotor aus der Tomate (Pe8) wurde durch PCR aus der genomischen DNA der Tomate (Sorte Moneymaker) unter Verwendung der Taq-Polymerase und der Primer E851 (5'-GAA TTC AAG CTT GAC ATC CCT AAT-3') und E8A2 (5'-CTT TTG CAC TGT GAA TGA TTA GA-3') amplifiziert. Die Primer E851 und E8A2 hybridisieren mit den distalen (5') bzw. den proximalen (3') Enden des E8-Promotors. Das erhaltene PCR-Fragment mit einer Größe von 2,2 kb wurde anschließend in die EcoRV-Schnittstelle des Blue-T-Vektors pT7 (erhältlich von Novagen) kloniert. Dies führte zu einem Vektor, bei dem der E8-Promotor in der Orientierung des Uhrzeigersinns (in der gleichen Orientierung wie das lacZ-Gen) insertiert war, welcher Vektor pT7E8 (16) genannt wurde. Die Konstrukte, welche das C1-Gen (pAL77), das LC-Gen mit 5'-Leader-Sequenz (pAL69) und das Lc-Gen ohne 5'-Leader-Sequenz (pAL144) enthielten, wurden von R. W. Davis (Stanford University, siehe ebenso Lloyd et al., 1992) erhalten. Die Lc-Gene in den Plasmiden pAL69 und pAL144 wurden mit dem rbcS-Terminator (TrbcS) fusioniert und konnten als solche verwendet werden. Alle Bestandteile wurden Schritt für Schritt wie nachstehend beschrieben kloniert.
A. Konstruktion der Plasmide pUCM2 und pUCM3
Um das Plasmid pUCM2 zu konstruieren, wurde die multiple Klonierungsstelle des Plasmids pUCAP durch Insertion von zwei Adaptern modifiziert. Zuerst wurde der Adapter F1F2, welcher die Schnittstellen SalI/ClaI/SphI (Tabelle 1) enthielt, in das Plasmid pUCAP kloniert, das mit den Restriktionsenzymen SalI/SphI verdaut worden war. Dies führte zum Plasmid pUCM1. Als nächstes wurde der Adapter F3F4, der die Schnittstelle PacI/NotI/BglII/EcoRI enthielt, in das Plasmid pUCM1 kloniert, das mit den Restrik tionsenzymen PacI/EcoRI verdaut worden war. Dies führte zum Plasmid pUCM2 (1).
Um das Plasmid pUCM3 zu konstruieren, wurde das Plasmid pUCAP mit den Enzymen PacI/AscI verdaut, und die gesamte multiple Klonierungsstelle wurde durch den Adapter F5F6 (Tabelle 1) ersetzt. Dies führte zum Plasmid pUCM3 (1).
B. Konstruktion des Plasmids pBBC3
Um das Plasmid pBBC3 zu konstruieren, wurde der Adapter F38F39 in das Plasmid pGPTV-KAN ligiert, das mit EcoRI/HindIII verdaut worden war. Auf diese Weise wurde das gusA-Tnos-Gen in pGPTV-KAN durch eine kleine multiple Klonierungsstelle ersetzt, welche aus den Schnittstellen PacI/EcoRI/HindIII/AscI bestand (2).
C. Konstruktion des Plasmids pBBC10
Die C1-Genfusion wurde in das pUC-Derivat pUCM2 in drei größeren Schritten kloniert. Im ersten Schritt wurde Tnos durch PCR aus dem Vektor pBI121 mit den Primern F12 und AB13 amplifiziert (siehe Tabelle 1). Das erhaltene Produkt mit einer Größe von 250 bp wurde in den Vektor pUCM2 als ein SalI/ClaI-Fragment kloniert. Dies führte zum Plasmid pFLAP1. Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten PCR-Primer und Adapter

*Die Adapter wurden hergestellt, indem zwei Primer kombiniert und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt wurden, und beide Primer durch langsames Abkühlen auf Raumtemperatur aneinander banden.

Im zweiten Schritt wurde das C1-Gen als ein BamHI/SalI-Fragment stromaufwärts von Tnos in das Plasmid pFLAP2 wie folgt kloniert. Das C1-Gen wurde als ein EcoRI-Fragment mit einer Größe von 2 kb aus dem Plasmid pAL77 in das Plasmid pBluescript SK^–, welches einen Vektor mit hoher Kopienzahl darstellt, überführt, so dass sich das Plasmid pBLC1 ergab. Das C1-Gen wurde als ein EcoRI/PacI-Fragment mit einer Größe von 1,6 kb aus dem Vektor pBLC1 isoliert, und die Adapter F7F8 und F9F10 (Tabelle 1) wurden an das jeweilige Ende des Fragmentes ligiert, um die einzigartigen Schnittstellen BamHI und SalI an beiden Enden des Gens hinzuzufügen und die Schnittstellen für EcoRI und PacI zu zerstören. Das erhaltene BamHI/SalI-C1-Fragment wurde stromaufwärts vom nos-Terminator kloniert, so dass sich das Plasmid pFLAP2 ergab.
Im dritten Schritt wurde der Pd35S-Promotor als ein KpnI/BamHI-Fragment stromaufwärts von C1 in den Vektor pFLAP2 wie folgt kloniert. Um eine einzigartige BamHI-Schnittstelle am 3'-Ende des doppelten 35S-Promotors zu erzeugen, wurde das Plasmid pMOG18 mit den Enzymen EcoRV und BamHI verdaut, so dass der 3'-Teil des d35S-Promotors und das gusA-Gen entfernt wurden. Der 3'-Teil des 35S-Promotors, der im Plasmid pAB80 (Bovy et al., 1995) vorhanden ist, wurde als EcoRV/BamHI-Fragment mit einer Größe von 0,2 kb in den Vektor pMOG18 ligiert, so dass sich das Plasmid pMOG18B ergab. Um eine einzigartige KpnI-Schnittstelle am 5'-Ende des 35S-Promotors mit doppelten Enhancern zu erzeugen, wurde das Plasmid pMOG18B mit dem Enzym EcoRI verdaut, die Enden wurden mit Klenow-Polymerase geglättet und anschließend mit BamHI verdaut. Das erhaltene d35S-Promotor-Fragment mit einer Größe von 0,85 kb, welches ein glattes Ende aufwies bzw. mit BamHI geschnitten wurde, wurde in das Plasmid pBLC1 kloniert, das mit XhoI geschnitten, mit Klenow-Polymerase geglättet, und mit BamHI geschnitten worden war. Dies führte zum Plasmid pBld35S. Schließlich wurde der d35S-Promotor als KpnI/BamHI-Fragment aus pBld35s in das Plasmid pFLAP2 überführt. Dies führte zum Plasmid pFLAP10 (15).
Das Insert des Plasmids pFLAP10 wurde als ein PacI/AscI-Fragment mit einer Größe von 2,8 kb in den binären Vektor pBBC3 transformiert, so dass sich das Plasmid pBBC10 ergab (3 und 17).
D. Konstruktion des Plasmids pBBC20
Die Konstruktion des Plasmids pBBC20 besteht aus drei größeren Schritten: (i) Klonieren des Lc^–-Gens (ohne Leader-Sequenz) mit dem rbcS-Terminator in den pUCM2-Vektor, (ii) Klonieren des frucht-spezifischen E8-Promotors aus der Tomate stromaufwärts von dem Lc^–-Gen, und (iii) Überführen der Lc-Fusion in den binären Vektor pBBC3. Diese Schritte werden in den folgenden Abschnitten erläutert.
Im ersten Schritt wurden das Lc^–-Gen und der rbcS-Terminator als ein BamHI/ClaI-Fragment mit einer Größe von 2,8 kb aus dem Plasmid pAL144 isoliert und in das Plasmid pUCM2 kloniert, das mit den gleichen Enzymen verdaut worden war. Dies führte zum Plasmid pFLAP4.
Im zweiten Schritt wurde der E8-Promotor aus der Tomate stromaufwärts von dem Lc^–-Gen wie folgt kloniert. Der E8-Promotor lag als ein Fragment mit einer Größe von 2,2 kb auf dem Plasmid pT7E8 vor. Dieses Fragment des E8-Promotors enthielt eine unerwünschte PacI-Schnittstelle an der Position 430 in Bezug auf das 5'-Ende. Um diese PacI-Schnittstelle zu entfernen, wurde das Plasmid pT7E8 mit PacI verdaut, die Enden wurden mit T4 DNA-Polymerase geglättet und das Plasmid wurde selbst-ligiert, so dass das Plasmid pT7E8-Pac gebildet wurde. Der E8-Promotor wurde nachfolgend aus diesem Plasmid durch PCR-Reaktion mit den Primern F23 und F26 amplifiziert, welche die einzigartigen Schnittstellen KpnI bzw. BamHI enthielten (Tabelle 1). Das PCR-Produkt wurde mit diesen Enzymen verdaut und stromaufwärts von dem Lc^–-Gen in das Plasmid pFLAP4 kloniert. Dies führte zum Plasmid pFLAP20 (15).
Im dritten Schritt wurde das Insert des Plasmids pFLAP20 als ein PacI/AscI-Fragment mit einer Größe von 5,1 kb in den binären Vektor pBBC3 überführt, so dass das Plasmid pBBC20 erhalten wurde (3 und 17).
E. Konstruktion des Plasmids pBBC30
Das Plasmid pBBC30 ist identisch mit pBBC20, mit der Ausnahme, dass das Lc⁺-Gen anstelle des Lc^–-Gens vorliegt. Dieses Plasmid wurde wie folgt konstruiert.
Im ersten Schritt wurde die Gen-Fusion aus Lc⁺/TrbcS als EcoRI/ClaI-Fragment in das pEMBL-Derivat pAB10 kloniert. Dies führte zum Plasmid pABLC⁺.
Im zweiten Schritt wurde die Gen-Fusion Lc⁺/TrbcS als ein BamHI/ClaI-Fragment aus dem Plasmid pABLC⁺ in das Plasmid pFLAP20 überführt, so dass dadurch Lc^–/TrbcS durch Lc⁺/TrbcS ersetzt wurde. Dies führte zum Plasmid pFLAP30 (15).
Im dritten Schritt wurde das Insert des Plasmids pFLAP30 als ein PacI/AscI-Fragment mit einer Größe von 5,3 kb in den binären Vektor pBBC3 überführt, so dass das Plasmid pBBC30 erhalten wurde (3 und 17).
F. Konstruktion des Plasmids pBBC200
Die Konstrukte mit dem einzelnen Gen, welche vorstehend beschrieben wurden, wurden verwendet, um die Plasmide pBBC200 und pBBC300 wie folgt zu konstruieren.
Im ersten Schritt wird das Insert Pd35S-C1-Tnos des Plasmids pFLAP10 als ein KpnI/ClaI-Fragment mit einer Größe von 2,8 kb in das Plasmid pUCM3 überführt, so dass sich das Plasmid pFLAP100 ergibt.
Im zweiten Schritt wird das Insert Pe8-Lc^--TrbcS des Plasmids pFLAP20 als ein NotI/AscI-Fragment mit einer Größe von 5,1 kb in das Plasmid pFLAP100 überführt, so dass sich das Plasmid pFLAP200 ergab (16).
Im dritten Schritt wird das Insert des Plasmids pFLAP200 als ein PacI/AscI-Fragment mit einer Größe von 7,9 kb in den binären Vektor pBBC3 überführt, so dass sich das Plasmid pBBC200 ergab (3 und 18).
G. Konstruktion des Plasmids pBBC300
Um das Plasmid pBBC300 zu konstruieren, wurde das Insert Pe8-Lc⁺-TrbcS des Plasmids pFLAP30 als ein NotI/AscI-Fragment mit einer Größe von 5,3 kb in das Plasmid pFLAP100 überführt, so dass sich das Plasmid pFLAP300 bildete (16).
Das Insert des Plasmids pFLAP300 wird als ein PacI/AscI-Fragment mit einer Größe von 8,1 kb in den binären Vektor pBBC3 überführt, so dass sich das Plasmid pBBC300 ergab (3 und 18).
Beispiel 4: Stabile Transformation der regulatorischen Genkonstrukte in die Tomatenlinie FM6203
4.1 Transformationen mit Agrobacterium tumefaciens
Die binären Plasmide pBBC10, pBBC20, pBBC30, pBBC200 und pBBC300 wurden in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 eingeführt, indem 1 μg der Plasmid-DNA auf 100 μl von kompetenten Agrobacterium-Zellen gegeben wurde, die durch Beimpfen einer Kultur von 50 ml in YEP-Medium (Sambrook, 1989) hergestellt wurde, und welche Kultur bei 28°C gezüchtet wurde, bis die Kultur eine OD₆₀₀ von 0,5–1,0 erreichte. Die Zellen wurden anschließend pelletiert, erneut in 1 ml CaCl₂-Lösung suspendiert und in Aliquots von 100 μl aufgeteilt. Die Mischung aus DNA und Agrobacterium wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut. Nach der Zugabe von 1 ml YEP-Medium wurden die Bakterien bei 28°C für 4 Stunden unter leichtem Schütteln inkubiert. Schließlich wurden die transformierten Bakterien auf YEP-Agar-Platten, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, selektiert. Das Vorliegen der Plasmide wurde durch Analyse mit Restriktionsenzymen überprüft.
4.2 Transformationen der Tomaten
Die Samen aus der Tomatenlinie FM6203 wurden durch eine 2-stündige Inkubation in 1,5% Hypochlorit sterilisiert, gefolgt von drei Spülungen mit sterilem Wasser. Die Samen ließ man keimen, und die Keimlinge wurden für 8 Tage auf einer Mischung von Vermacolit und MS-Medium im Verhältnis 1:1, welche Mischung mit 0,3% (w/v) Saccharose ergänzt worden war (Murashige und Skoog, 1962; Duchefa), mit einem Belichtungszeitraum von 16 Stunden (3000 Lux) bei 25°C gezüchtet.
Acht Tage alte Keimblätter wurden in Quadrate mit einer Größe von 25 mm² geschnitten und für 24 Stunden auf Platten mit einer Nährschicht aus einer Tabak-Suspension bei einer geringen Lichtintensität (1000 Lux) vorinkubiert. Die Kultur mit der Suspension aus Tabakblättern wurde auf Platten gezüchtet, die MS-Medium enthielten einschließlich Vitamine, und die mit Saccharose (3% w/v), Agarose (6 g/l), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D; 0,5 mg/l) und Benzylaminopurin (BAP; 0,5 mg/l) ergänzt worden waren.
Eine einzelne Kolonie aus den Kulturen des Agrobacteriums LBA4404, die einen der binären Vektoren enthielt, welche Vektoren in den Beispielen 3 und 4.1 erwähnt wurden, wurde für 48 Stunden in flüssigem Minimalmedium A (Sambrook, 1989) bis zu einer OD₆₀₀ von 0,5–1,0 gezüchtet, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt worden war. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert und erneut bei einer OD₆₀₀ von 0,5 in MS-Medium suspendiert, das Vitamine (Duchefa) und 3% (w/v) Saccharose umfasste. Die aus den Keimblättern entnommenen Gewebe wurden in der Agrobacterium-Suspension für 30 Minuten inkubiert, auf einem Filterpapier trocken getupft und für 48 Stunden auf Platten mit einer Nährschicht aus Tabak bei 25°C und einer geringen Lichtintensität cokultiviert.
Nach der Cokultivierung wurden die entnommenen Gewebe auf Regenerationsmedium übertragen, das aus MS-Medium bestand, welches mit Nitsch-Vitaminen, Saccharose (2%, w/v), Agargel (5 g/l), Zeatin-Ribosid (2 mg/l), Kanamycin (100 mg/l) und Cefotaxim (500 mg/l) ergänzt worden war. Die sich regenerierenden Gewebe wurden alle zwei Wochen auf frisches Medium übertragen. Die sich regenerierenden, Kanamycin-resistenten Austriebe wurden auf ein Medium übertragen, welches die Wurzelbildung fördert und aus MS-Medium plus B5-Vitaminen besteht, welches Medium mit Saccharose (0,5% w/v), Gelrite (2 g/l), Kanamycin (50 mg/l) und Cefotaxim (250 mg/l) ergänzt wurde.
Während der Regeneration und der Wurzelbildung wurden die Explantate in einer Wachstumskammer bei 25°C mit einem Belichtungszeitraum von 16 Stunden bei 3000 Lux inkubiert. Nach der Wurzelbildung wurden die Pflänzchen in Erde überführt und in einem Glashaus gezüchtet.
Die transgenen Pflanzen, welche die Konstrukte pBBC200 bzw. pBBC300 tragen, wurden mit den Nummern 2001–2499 bzw. 3001–3499 versehen.
Beispiel 5: Southern-Analyse der transgenen Pflanzen
5.0 Southern-Analyse der Pflanzen, welche mit den Plasmiden pBBC200 und pBBC300 transformiert wurden
Das Vorliegen und die Kopienzahl der Transgene wurden in den transgenen Pflanzen durch Southern-Hybridisierung bestimmt. Die genomische DNA wurde aus frischen Blättern isoliert, wie beschrieben von Bonierbale et al., 1988. Aliquots von 5 μg der genomischen DNA wurden für 16 Stunden mit BglII verdaut und auf einem 0,7% TAE-Agarose-Gel aufgetrennt. Die DNA wurde anschließend in 0,4 M NaOH für 30 Minuten denaturiert und auf eine Hybond N⁺ Membran in 0,4 M NaOH übertragen.
Die Blots wurden mit einem ³²P radioaktiv markierten, nptII-spezifischen PCR-Fragment mit einer Größe von 700 bp als Sonde unter stringenten Bedingungen (65°C) hybridisiert, welches Fragment aus dem Plasmid pBBC3 mit den Primern F80 und F81 (Tabelle 1) amplifiziert wurde. Die Vorhybridisierung wurde für 2 Stunden bei 65°C in einer Mischung von 6,6 × SSC, 10 × Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und 0,1 mg/ml denaturierter DNA aus Herings-Sperma durchgeführt. Die Hybridisierung wurde durch Zugabe einer denaturierten DNA-Sonde zu dem Vorhybridisierungs-Medium durchgeführt, sowie durch Fortsetzung der Inkubation bei 65°C für 16 Stunden. Die hybridisierten Blots wurden dreimal für 30 Minuten bei 65°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS gewaschen und unter Verwendung eines Gerätes vom Typ „Bio-Imager" (Fuji) autoradiographiert.
Das Enzym BglII schneidet in der T-DNA unmittelbar aufwärts von dem nptII-Gen, 1,7 kb vom linken Rand (left border, LB). Die Hybridisierung der nptII-spezifischen Fragmente wird an einem Ende durch diese interne BglII-Schnittstelle und am anderen Ende durch eine genomische BglII-Schnittstelle in jenem Bereich flankiert, welcher dem linken Rand der T-DNA benachbart ist. Dieser Umstand gibt Anlass zu Hybridisierungs banden von unterschiedlicher Länge in Abhängigkeit vom Ort der Integration, und er kann dazu genutzt werden, die Anzahl der T-DNA-Insertionen in jeder transgenen Pflanze zu bestimmen.
Das Ergebnis der Southern-Analyse ist in 4 gezeigt. Die Pflanze Nr. 3028 (Spur 3) ist eine nicht-transgene Pflanze aus der Gewebekultur. Alle anderen Pflanzen sind transgen und hybridisieren mit der nptII-Sonde. Die Anzahl der Kopien in den transgenen Pflanzen schwankt von 1 bis 4.
5.1 Southern-Analyse der Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC10 transformiert wurden
Die Anzahl der Kopien und die Art der T-DNA-Insertion in transgene Pflanzen, die nach der Transformation mit dem Plasmid pBBC10 (nummeriert von 100 aufwärts) erhalten wurden, wurden durch Southern-Hybridisierung bestimmt. Aliquots von 5 μg genomischer DNA wurden bei 16 Stunden sowohl mit dem Enzym EcoRI als auch mit dem Enzym NcoI verdaut, auf einem 0,7% TAE-Agarose-Gel aufgetrennt und auf eine Hybond N⁺ Membran wie in 5.0 beschrieben übertragen.
Der Blot wurde mit einem ³²P radioaktiv markierten, C1-spezifischen Restriktionsfragment mit einer Größe von 900 bp als Sonde hybridisiert, welches Fragment nach dem Verdau des Plasmids pFLAP10 mit den Enzymen NcoI und PstI erhalten wurde. Die Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen waren wie in Abschnitt 5.0 beschrieben.
EcoRI schneidet in der T-DNA unmittelbar stromaufwärts von der P35S-c1-Tnos-Genfusion, 2,8 kb vom rechten Rand (right border; RB). Die Hybridisierung der C1-spezifischen Fragmente wird am einen Ende durch diese innere EcoRI-Schnittstelle und am anderen Ende durch eine genomische EcoRI-Schnittstelle in jenem Bereich flankiert, welcher dem rechten Rand der T-DNA benachbart ist. Dieser Umstand gibt Anlass zu Hybridisierungsbanden von unterschiedlicher Länge in Abhängigkeit vom Ort der Integration, und er kann dazu genutzt werden, um die Anzahl der T-DNA-Insertionen in jeder transgenen Pflanze zu bestimmen.
NcoI schneidet zweimal im T-DNA-Bereich des Plasmids pBBC10 an Position +92 in Bezug auf die C1-Translations-Startstelle, sowie im Linker zwischen dem C1-Gen und dem nos-Terminator. Der Verdau der chromosomalen DNA mit NcoI gibt daher Anlass zu einer Hybridisierungsbande von 1,5 kb.
Das Ergebnis der Southern-Analyse ist in 5 gezeigt. Die Pflanze Nr. 5002 ist eine transgene Pflanze, die ein Pe8-gusA-Tnos-Insert enthält und als eine Negativ-Kontrolle verwendet wird. Alle anderen Pflanzen sind transgen und hybridisieren mit der c1-Sonde. Die Anzahl der Kopien in diesen transgenen Pflanzen schwankt von 1 bis 4 (Bild A). Nach dem Verdau mit NcoI ergeben alle transgenen Pflanzen mit Ausnahme der Pflanze Nr. 5002 eine Bande von 1,5 kb Länge, die sich an der gleichen Position wie das mit NcoI verdaute Plasmid pBBC10 (Bild B) befindet. Dies weist darauf hin, dass sämtliche überprüften pBBC10-Transformanten mindestens eine intakte Kopie des C1-Gens enthalten.
5.2 Southern-Analyse von Pflanzen, die mit den Plasmiden pBBC20 und PBBC30 transformiert wurden
Die Anzahl der Kopien und die Art der DNA-Insertion in transgenen Pflanzen, welche nach der Transformation mit dem Plasmid pBBC20 (nummeriert von 200 aufwärts) und pBBC30 (nummeriert von 300 aufwärts) erhalten wurden, wurden durch Southern-Hybridisierung bestimmt. Aliquots von 5 μg genomischer DNA wurden für 16 Stunden mit BglII und ClaI verdaut, welche Fragmente anschließend auf einem 0,7% TAE-Agarosegel aufgetrennt und auf eine Hybond N⁺-Membran wie im Abschnitt 5.0 beschrieben übertragen wurden.
Um die Anzahl der Kopien zu bestimmen, wurde der Blot mit einem ³²P radioaktiv markierten, nptII-spezifischen Fragment mit einer Größe von 700 bp als Sonde hybridisiert (siehe Abschnitt 5.0). Um die Art der T-DNA-Insertion zu bestimmen, wurde die nptII-Sonde vom Blot gemäß der Anleitung des Herstellers (Amersham) abgezogen und erneut mit einem 0,7 kb großen, Lc-spezifischen Restriktionsfragment hybridisiert, das nach einem Verdau des Plasmids pFLAP30 mit den Enzymen PstI und NcoI erhalten wurde. Die Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen waren wie im Abschnitt 5.0 beschrieben.
Die Enzyme BglII und ClaI schneiden insgesamt viermal im T-DNA-Bereich der pBBC20- und pBBC30-Transformanten. In Bezug auf den linken Rand ist das Enzym BglII die erste Schnittstelle innerhalb der T-DNA. Es schneidet unmittelbar stromaufwärts von dem nptII-Gen, 1,7 kb vom linken Rand (left border; LB). Die Hybridisierung der nptII-spezifischen Fragmente wird am einen Ende durch diese interne BglII-Schnittstelle und am anderen Ende durch eine genomische BglII-Schnittstelle in jenem Bereich flankiert, welcher dem linken Rand der T-DNA benachbart ist. Dieser Umstand gibt Anlass zu Hybridisierungsbanden von unterschiedlicher Länge in Abhängigkeit vom Ort der Integration, und er kann dazu genutzt werden, die Anzahl der T-DNA-Insertionen in jeder transgenen Pflanze zu bestimmen.
BglII schneidet einmal in der Pe8-Lc-Trbc-Genfusion der Plasmide pBBC20 und pBBC30 an der Position +202 in Bezug auf die Lc-Translations-Startstelle. ClaI schneidet unmittelbar stromabwärts vom rbcS-Terminator. Der Verdau der chromosomalen DNA mit BglII und ClaI gibt daher Anlass zu einer Hybridisierungs-Bande von 2,6 kb mit der Lc-spezifischen Sonde.
Die Ergebnisse der Southern-Analysen sind in 6 (nptII-Sonde) und 7 (Lc-Sonde) gezeigt. Die Pflanze Nr. 004 ist eine nicht-transgene Kontrollpflanze, welche mit keiner der verwendeten Sonden hybridisiert. Die Pflanzen 5002, 104, 109 und 117 hybridisieren lediglich mit der nptII-Sonde und nicht mit der Lc-Sonde. Alle anderen Pflanzen (die Nummern 200 und 300) sind transgen und hybridisieren sowohl mit den nptII-Sonden als auch mit den Lc-Sonden. Die Anzahl der Kopien in diesen Pflanzen schwankt von 1 bis 7 (6). Nach der Hybridisierung mit der Lc-Sonde ergeben alle mit 200 und 300 nummerierten Pflanzen eine Bande von 1,5 kb, welche sich an der gleichen Position wie die mit den Enzymen BglII und ClaI verdauten Plasmide pBBC20 und pBBC30 befinden (7). Dieser Umstand weist darauf hin, dass sämtliche überprüften pBBC20- und pBBC30-Transformanten mindestens eine intakte Kopie des Lc-Gens enthalten.
Beispiel 6: Messung der Flavonoide in Tomatenfrüchten
6.1 Züchtung und Ernte der Tomatenfrüchte
Tomatenpflanzen wurden in 10 l Eimern in einem Glashaus unter Standard-Wachstumsbedingungen gezüchtet. Die Früchte wurden in einem vollständig roten, reifen Stadium geerntet; und im Falle der Entwicklungsstudien (14) auch in früheren Entwicklungsstadien. Zur Unterscheidung zwischen Flavonoiden in der Schale und im Frucht feisch wurde die äußere Schicht von etwa 2 mm Dicke (das heißt die Cuticula, die Epidermis-Schicht plus ein Teil des sub-epidermalen Gewebes) von der Frucht unter Verwendung eines Skalpells getrennt; der Rest der Frucht wurde als Fruchtfleisch-Gewebe klassifiziert. Nach der Abtrennung wurden die Gewebe schnell zu Teilchen geschnitten, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Für die Analyse der Flavonoid-Konzentrationen in den ganzen Früchten wurden rote Früchte in Viertel geschnitten, pro Frucht wurde ein Viertel verwendet, in Stücke geschnitten und schnell eingeforen.
6.2 Extraktion der Flavonoide aus Tomaten-Geweben
Die Flavonoide wurden als Aglycone oder als ihre Glycoside bestimmt, indem hydrolysierte bzw. nicht-hydrolysierte Extrakte hergestellt wurden.
Die Herstellung hydrolysierter Extrakte wurde gemäß Hertog et al., 1992 wie folgt durchgeführt: Gefrorene Gewebe wurden zu einem feinen Pulver unter Verwendung entweder einer Reibschale mit Pistill oder einer Kaffee-Mühle gerieben. Die Gewebe der Schale und des Fruchtfleisches wurden für 24 Stunden vor der Flavonoid-Extraktion lyophilisiert. 40 mg dieses gefriergetrockneten Materials wurden gewogen und in ein 10 ml Pyrex-Glasröhrchen überführt. Zu jedem Röhrchen wurden 1,6 ml 62,5% Methanol (HPLC-Reinheitsgrad) in destilliertem Wasser und 0,4 ml 6 M HCl gegeben. Die Röhrchen wurden mit Schraubverschlüssen verschlossen, welche eine Teflon-Einlage enthielten, und für 60 Minuten bei 90°C in einem Wasserbad inkubiert. Nach der Hydrolyse wurden die Röhrchen auf Eis gekühlt, die Extrakte wurden mit 2 ml 100% Methanol verdünnt und für 5 Minuten mit Ultraschall behandelt. Zu Bestimmung der Konzentrationen des Aglycons in den ganzen Tomaten wurden 1,2 g des geriebenen, gefrorenen Gewebes (nicht lyophilisiert) eingewogen und mit 2 ml 100% Methanol und 0,8 ml 6 M HCl wie vorstehend beschrieben hydrolyisert. Nach der Hydrolyse wurden diese Extrakte aus der ganzen Tomate mit 4 ml 100% Methanol verdünnt und für 5 Minuten mit Ultraschall behandelt.
Unter Verwendung von Flavonoid-Standards (erhalten von Apin Chemicals Ltd., Abingdon, UK) wurde es festgestellt, dass die Aglycone während des Hydrolyseschritts aus ihren jeweiligen Glycosiden zu 100% freigesetzt werden, während Narichalcon (= Naringenin-Chalcon) zu mehr als 95% chemisch zu Naringenin umgesetzt wurde. Die Rückgewinnung der Quercetin-, Kaempferol- und Naringenin-Standards, welche zu den Schalen- oder Fruchtfleisch-Extrakten unmittelbar vor der Hydrolyse zugegeben wurden, betrug mehr als 90%.
Zur Bestimmung der Flavonoid-Glycoside und von Naringenin-Chalcon wurden 40 mg gefriergetrocknetes Tomatengewebe zu 4 ml 75% wässrigem Methanol gegeben, der mit HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert wurde. Die Extraktion fand bei Raumtemperatur (20–25°C) durch kontinuierliches Mischen auf einem Walzenband für 2 Stunden statt.
6.3 HPLC-Bedingungen für die Flavonoid-Analyse
Nach der Behandlung mit Ultraschall wurden etwa 1 ml eines jeden Extrakts unter Verwendung einer Wegwerfspritze als Probe genommen und durch ein 0,2 μm PTFE-Wegwerffilter (Inacom Instruments BV, Niederlande) filtriert, ehe die Lösung in das HPLC-System injiziert wurde.
Das HPLC-System bestand aus einem Multi-Lösungsmittel-Zufuhrsystem vom Typ „600 E" der Fa. Waters (Waters Chromatography), einem Autoinjektor vom Typ „Promis" (Separations Analytical Instruments BV) mit einer befestigten Schleife für 10 μl und einer analytischen Säule vom Typ „Nova-Pak C18" (3,9 × 150 mm, Partikelgröße 4 μm) (Waters Chromatography), welche durch einen C18-Einsatz vom Typ „Guard-Pak Nova-Pak" geschützt wurde. Beide Säulen wurden in einen HPLC-Säulenofen vom Typ „LKB 2155" (Pharmacia Biotech) gegeben, der auf 30°C eingestellt war. Ein Photodioden-Array-Detektor (Waters 996) wurde verwendet, um die Spektren der Verbindungen aufzuzeichnen, welche online aus der Säule eluiert wurden. Der Detektor wurde auf ein Absorptions-Spektrum für die Aufzeichnung von 240 bis 600 nm mit einer Auflösung von 4,8 nm bei einem Zeitintervall von 1 Sekunde eingestellt. Das Gerät „Millennium 2010 Chromatography Manager" (Waters Chromatography BV) wurde verwendet, um das Lösungsmittel-Zufuhrsystem und den Photodioden-Array-Detektor zu kontrollieren.

Die Auftrennung der Flavonoide, welche in den hydrolysierten Extrakten vorhanden waren (Flavonol-Aglycone und Naringenin), in der HPLC wurde unter isokratischen Bedingungen von 2% Acetonitril (für HPLC im fernen UV-Bereich) in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,9 ml/Min. durchgeführt. Die Auftrennung der Flavonoide in der HPLC in nicht-hydrolysierten Extrakten (Flavonoid-Glycoside und Naringenin-Chalcon) wurde unter Verwendung eines Gradienten aus Acetonitril in 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. durchgeführt: 5–25% linear in 30 Minuten, anschließend 25–30% in 5 Minuten und 30–50% in 2 5 Minuten, und anschließend wurde 3 Minuten mit 50% Acetonitril in 0,1% TFA gewaschen. Nach dem Waschschritt wurde die Eluenten-Zusammensetzung innerhalb von 2 Minuten auf den anfänglichen Zustand zurückgeführt, und die Säule wurde 6 Minuten vor der nächsten Injektion äquilibriert. Tabelle 2 fasst die Retentionszeiten von manchen Flavonoid-Standards zusammen, welche mit zwei verschiedenen HPLC-Trennungsverfahren erhalten wurden. Tabelle 2: Typische Retentionszeiten von manchen Flavonoid-Standards

		Retentionszeit (Minuten)
Flavonoid-Standard	Detektions-Wellenlänge (nm)	isokratischer Lauf	Gradienten-Lauf
Rutin	360	-	19,2
Quercetin-3-Glucosid	360	-	19,7
Kaempferol-3-Rutinosid	360	-	21,9
Myricitin	370	3,0	23,0
Quercetin	370	5,1	29,5
Naringenin	280	8,3	33,5
Narichalcon	360	-	34,8
Kaempferol	370	9,8	35,5

Anmerkung: Die Anthocyan-Peaks würden normalerweise in Spektren bei 520 oder 280 nm sichtbar sein. In den Experimenten sind diese Peaks jedoch nicht sichtbar (siehe zum Beispiel 25), was darauf hinweist, dass keine nachweisbaren Konzentrationen an Anthocyanen in den überprüften Geweben gefunden wurden.
Die HPLC-Daten wurden unter Verwendung der Software des „Millennium 2010 Chromatography Managers" analysiert. Die Absorptionsspektren (korrigiert in Bezug auf die Basislinie) und die Retentionszeiten der Elutionspeaks (mit einer Peak-Reinheit, die besser als der Reinheits-Schwellenwert ist) wurden mit jenen von im Handel erhältlichen Flavonoid-Standards verglichen. Die Dosis-Antwortkurven von Quercetin, Naringenin und Kaempferol (0 bis 20 μg/ml) wurden erstellt, um diese Verbindungen in den hydrolysierten Tomaten-Extrakten zu quantifizieren. Die Aglycone von Quercetin und Kaempferol wurden nachgewiesen und aus ihrer Absorption bei 370 nm berechnet, die Konzentration von Naringenin wurde bei einer Absorption von 280 nm berechnet. Die Flavonol-Glycoside sowie Naringenin-Chalcon wurden bei 360 nm nachgewiesn (siehe auch Tabelle 2). Die Flavonoid-Konzentrationen in Tomaten wurden entweder auf der Grundlage des Trockengewichts (für die Schale und das Fruchtfleisch-Gewebe) oder auf der Grundlage des Frischgewichts (für ganze Tomaten) berechnet. Mit dem verwendeten HPLC-System und der Software war die unterste Nachweisgrenze für Flavonoide in Tomaten-Extrakten etwa 0,1 μg/ml, was etwa 10 mg/kg Trockengewicht und 1 mg/kg Frischgewicht entspricht. Die Schwankung zwischen wiederholten Injektionen betrug weniger als 5%.
Beispiel 7: Charakterisierung des Flavonoid-Gehalts in einer transgenen Tomatenfrucht
7.1 Flavonoide in der Schale und im Fruchtfleisch von Kontrolltomaten
Die HPLC-Daten von hydrolysierten Extrakten von roten Früchten der Sorte FM6203 sind in 8 gezeigt. Die 8a zeigt, dass sowohl Quercetin als auch Kaempferol im Schalengewebe vorlagen. Im Gegensatz dazu erläutert 8b, dass hydrolysierte Extrakte aus dem Fruchtfleisch-Gewebe dieser Früchte lediglich Spuren von Quercetin mit nicht nachweisbaren Konzentrationen von Kaempferol enthielten. Die bei 280 nm erhaltenen Chromatogramme (nicht gezeigt) derselben Extrakte ergaben einen großen Peak für Naringenin in der Schale, nicht jedoch im Fruchtfleisch.
9 zeigt das HPLC-Spektrum für nicht-hydrolysierte Extrakte aus dieser Frucht. Es kann ersehen werden, dass lediglich ein geringer Peak, welcher dem Rutin entspricht, im Fruchtfleisch vorlag (9b). Im Gegensatz dazu wurden mindestens 5 veschiedene Flavonol-Glycoside sowie Narichalcon in der Schale nachgewiesen (9a). Die NMR-Studien bewiesen, dass es sich bei dem Peak mit einer Retentionszeit von 19,2 Minuten um Rutin handelte, während es sich bei dem Peak mit einer Retentionszeit von 17,6 Minuten um ein Quercetin-3-Trisaccharid handelte: Rutin mit Apiose, die an die Glucose des Rutinosids gebunden war. Die Retentionszeit und das Absorptionsspektrum des kleineren Peaks bei 19,7 Minuten entsprachen jenem des Quercetin-3-Glycosids, während jene des Peaks bei 21, 9 Minuten dem Kaempferol-3-Rutinosid entsprachen. Der kleine Peak bei 25,6 Minuten hatte ein Absorptionsspektrum, das mit jenem des Kaempferol-3-Rutinosids vergleichbar war, jedoch weist der höhere Wert für die Retentionszeit auf ein noch unbekanntes Kaempferol-Glycosid hin. Der große Peak bei 34,8 Minuten war Narichalcon. Die Aglycone des Quercetins und Kaempferols, sowie Naringenin (die alle in den hydrolysierten Schalenextrakten vorlagen) waren in keinem der nicht-hydrolysierten Extrakte nachweisbar.
Durch Vergleich der Flavonoid-Spezies in den hydrolysierten Extrakten mit jenen in den nicht-hydrolysierten Extrakten desselben Gewebes kann der Schluss gezogen werden, dass das Vorliegen von Quercetin- und Kaempferol-Aglyconen in den hydrolysierten Extrakten auf die Hydrolyse ihrer jeweiligen Glycoside zurückzuführen war; das Vorliegen von Naringenin in den hydrolysierten Schalenextrakten ergab sich aus der Isomerisierung von Narichalcon während des Hydrolyseschritts (vergleiche Beispiel 6.2).
Diese HPLC-Daten der Flavonoide weisen darauf hin, dass der biosynthetische Stoffwechselweg für Flavonoide in der Schale aktiv ist, nicht jedoch oder nur in einem sehr begrenzten Ausmaß im Fruchtfleisch der Tomatenfrucht. Diese Schlussfolgerung wurde durch mRNA-Analyse der Schalen- und Fruchtfleisch-Gewebe bestätigt, indem Sonden für chs, chi und fls verwendet wurden.
7.2 Flavonoide in Früchten von transformierten Tomatenpflanzen
Um zu bestimmen, ob die pBBC200- und pBBC300-Konstrukte in der Lage sind, den biosynthetischen Stoffwechselweg für Flavonoide in Tomatenpflanzen zu induzieren, wurden die Transformanten sowie die Kontrollpflanzen auf das Vorliegen von Flavonoiden im Fruchtfleisch ihrer Früchte analysiert – ein Gewebe, das normalerweise lediglich Spuren von Flavonoiden enthält (siehe 7.1). Dieses Screening wurde mittels HPLC unter Verwendung von hydrolysierten Extrakten durchgeführt. 17 Pflanzen, die erfolgreich entweder mit dem pBBC200- oder mit dem pBBC300-Konstrukt transformiert wurden (das heißt nptII-positive Pflanzen), wurden zusammen mit 10 nicht-transformierten Kontrollpflanzen (Pflanzen, die die Konstrukte verloren haben (escapes), das heißt Pflanzen, die nach dem Transformations- und Kanamycin-Selektions-Schritten als nptII-negativ erscheinen) analysiert. Sämtliche untersuchten nicht-transformierten Kontrollpflanzen enthielten lediglich eine geringe Menge an Quercetin in den hydrolysierten Extrakten des Tomatenfruchtfleisches, und keine der Pflanzen wies nachweisbare Konzentrationen an Kaempferol oder Naringenin auf, wie es bei den ursprünglichen Pflanzen der Sorte FM6203 der Fall war. Von den 17 untersuchten Transformanten scheinen 11 Pflanzen (65%) Flavonoide bei nachweisbaren Konzentrationen in ihrem Tomaten fruchtfleisch anzuhäufen, insbesondere Kaempferol und solche vom Naringenin-Typ. 10 zeigt ein Beispiel für Chromatogramme (aufgenommen bei 370 nm), die mit nicht-transformierten Kontrollpflanzen und mit einer Pflanze mit der Nr. 3031, welche das pBBC300-Genkonstrukt enthielt, erhalten wurden. Während die hydrolysierten Extrakte aus dem Fruchtfleisch von nicht-transformierten Tomaten lediglich einen kleinen Peak von Quercetin enthielten (vergleiche Beispiel 7.1, 8), enthielt der hydrolysierte Extrakt aus dem Fruchtfleisch von transformierten Tomaten einen deutlichen Peak von Kaempferol (10), sowie von Naringenin (nachgewiesen bei 280 nm, nicht gezeigt). 11 fasst die Konzentrationen (auf der Basis des Trockengewichts) von Kaempferol, Quercetin und Naringenin zusammen, auf der Basis der hydrolysierten Extrakte im Fruchtfleisch der roten Früchte von manchen Kontrollpflanzen und von manchen Pflanzen, die entweder mit dem pBBC200-Genkonstrukt oder mit dem pBBC300-Genkonstrukt transformiert wurden. Das vorherrschende Flavonoid, das in den hydrolysierten Extrakten des Fruchtfleisches von transformierten Pflanzen vorliegt, war Kaempferol, gefolgt von Naringenin; eine Ausnahme stellte die Pflanze Nr. 3035 dar, deren hydrolysierter Extrakt aus dem Fruchtfleisch mehr Naringenin als Kaempferol enthielt. Quercetin war nicht oder nur leicht erhöht in diesen Transformanten. Ebenso wurde in den hydrolysierten Extrakten des Schalengewebes der mit pBBC200 oder pBBC300 transformierten Tomatenpflanzen ein Anstieg im Kaempferol-Gehalt beobachtet.
Die 12 und 29 zeigen die Konzentrationen (auf der Grundlage des Frischgewichts) von Flavonoiden in ganzen roten Früchten von Kontrollpflanzen und von transformierten Tomatenpflanzen. Die Konzentration der gesamten Flavonole (Quercetin plus Kaempferol) in den Früchten der Kontrollpflanzen (erster Balken) betrug 5,2 ± 4,3 mg/kg Frischgewicht (Durchschnittswert ± Standardabweichung, n = 10), mit den Werten, wobei die Werte zwischen 1,3 und 12,0 in Abhängigkeit von der Jahreszeit des Wachstums schwanken. Quercetin war stets das vorherrschende Flavonol in den Früchten der Kontrollpflanzen. Im Vergleich mit der durchschnittlichen Konzentration in den Kontrollpflanzen zeigten 11 von 13 der mit pBBC200 transformierten Pflanzen (das heißt 85%) und 11 von 17 der mit pBBC300 transformierten Pflanzen (das heißt 65%) erheblich erhöhte Konzentrationen von bis zu 75 mg/kg, das heißt einen 15-fachen Anstieg der gesamten Flavonole in ihren Früchten. Die höchsten Konzentrationen an Kaempferol in den Transformanten betrugen etwa 75 mg/kg: ein 75-facher Anstieg im Vergleich mit den Konzentrationen der Kontrollpflanzen. Im Gegensatz zu Kaempferol war Quercetin lediglich in wenigen Pflanzen erhöht und überdies in einem viel geringeren Ausmaß: bis zum 3-fachen der Konzentration in den Kontrollpflanzen. Die Konzentration von Naringenin in den Kontrollfrüchten, das lediglich aus dem in der Schale vorhandenen Narichalcon stammt, betrug 24 ± 14 mg/kg Frischgewicht (Durchschnittswert ± Standardabweichung, n = 10). Die Konzentration des Naringenins in den ganzen Früchten der Transformanten, das sowohl aus dem Narichalcon als auch von den Naringenin-Glycosiden stammt (vergleiche 27 und 25) war erheblich erhöht in wenigen Pflanzen: bis zum 2,5-fachen der Konzentration der Kontrollfrüchte.
Unter Verwendung nicht-hydrolysierter Extrakte wurde die Form studiert, in der sich die Flavonoide in den Tomatenfrüchten von transformierten Pflanzen anreicherten. Durch Vergleich von HPLC-Chromatogrammen von nicht-hydrolysierten Extrakten aus ganzen roten Früchten von Kontrollpflanzen und von transformierten Tomaten, deren Spektren bei 360 nm (26) aufgenommen wurden, erscheint es, dass die Konzentration von Naringenin-Chalcon (Peak bei einer Retentionszeit von 35,9 Minuten) in den transformierten Tomaten abnahm. Jedoch waren mindestens 6 weitere Flavonoide, die bei 360 nm nachweisbar waren, in den transformierten Tomatenfrüchten erhöht: Peaks bei den Retentionszeiten von 13,9, 14,3, 16,1, 22,8, 23,4 und 26,0 Minuten. Abgesehen von diesen 6 Verbindungen wiesen die HPLC-Chromatogramme, die bei 280 nm (27) aufgenommen wurden, auf einen Anstieg von mindestens weiteren 5 Flavonoid-Verbindungen in den transformierten Tomaten hin: Peaks bei den Retentionszeiten von 11,2, 15,2, 21,2, 23,1 und 28,5 Minuten. Weitere Peaks, die in den Chromatogrammen der transformierten Früchte (zum Beispiel in 14: Peaks bei den Retentionszeiten von 5,1 und 11,9 Minuten) erhöht waren, scheinen Peaks aufgrund von Verunreinigungen zu sein, welche sich aus der Co-Flution von noch unbekannten Verbindungen ergeben. Auf der Grundlage des chromatographischen Verhaltens und der Absorptionsspektren der reinen Peaks, die in den transgenen Früchten erhöht waren (25), kann man den Schluss ziehen, dass die Verbindung, welche bei der Retentionszeit von 22,8 Minuten eluiert wird, Kaempferol-3-O-Rutinosid darstellt, und dass jene Verbindung, die bei 23,1 Minuten eluiert wird, Naringenin-7-O-Rhamnoglucosid (= Naringin) darstellt. Die Absorptionsspektren der Verbindungen, welche bei 13,9, 14,3, 16,1, 23,4 und 26,0 Minuten eluiert werden, passen alle sehr gut zu Kaempferol-3-Rutinosid, jedoch weisen ihre unterschiedlichen Werte für die Retentionszeiten darauf hin, dass es sich um unter schiedliche Kaempferol-Glycoside handelt. In entsprechender Weise besitzen die Verbindungen bei den Retentionszeiten von 11,2, 15,2, 21,2 und 28,5 Minuten Absorptionsspektren, die ähnlich zu Naringin sind, jedoch weisen ihre unterschiedlichen Werte für die Retentionszeiten darauf hin, dass es sich um unterschiedliche Naringenin-Glycoside handelt.
Die Muster der Chromatogramme (aufgenommen bei 360 nm), welche mit nicht hydrolysierten Tomatenextrakten erhalten wurden, waren sehr ähnlich sowohl innerhalb der pBBC200- und pBBC300-Transformanten als auch zwischen diesen Gruppen von Transformanten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass sämtliche Transformanten die gleichen Flavononoid-Spezies bei ungefähr ähnlichen Verhältnissen anreicherten; die Transformanten unterschieden sich lediglich in ihrer Konzentration bezüglich der Anreicherung.
13 zeigt ein Beispiel für Chromatogramme, die bei 360 nm aufgenommen wurden, von nicht-hydrolysierten Extrakten, welche ausschließlich aus dem Fruchtfleisch-Gewebe der Tomatenfrüchte hergestellt wurden (die Schale wurde entfernt). Während nur Rutin im Fruchtfleisch der Kontrollfrüchte nachweisbar war, waren sowohl Rutin als auch Kaempferol-Glycoside, die vorstehend beschrieben wurden (26), im Fruchtfleisch der transgenen Früchte nachweisbar. Die HPLC-Analysen derselben Fruchtfleisch-Extrakte bei 280 nm (nicht gezeigt) ergaben, dass, abgesehen von diesen Kaempferol-Glycosiden, die vorstehend beschriebenen Naringenin-Glycoside (27) ausschließlich in den transgenen Früchten hergestellt wurden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der biosynthetische Stoffwechselweg für Flavonoide in transgenen Pflanzen nicht auf die Schale beschränkt ist, wie es in nicht-transformierten Pflanzen der Fall ist, sondern auch im Fruchtfleisch der Früchte aktiv ist.
Von den 11 Arten von Flavonoiden, die in den ganzen Früchten der transgenen Pflanzen (26) erhöht waren, wurde lediglich Kaempferol-3-Rutenosid ebenso in den Früchten von FM6203-Kontrollpflanzen gefunden, obgleich nur in der Schale. Somit produzierten die Tomatenpflanzen, welche ausschließlich mit pBBC200 oder pBBC300 transformiert waren, (mindestens) 6 unterschiedliche Kaempferol-Glycoside und 5 Naringenin-Glycoside im Fruchtfleisch ihrer Früchte. Außer in Bezug auf Kaempferol-3- rutenosid sind die Flavonoid-Spezies, welche durch pBBC200 oder pBBC300 induziert werden, überdies neue Produkte in den Früchten der Sorte FM6203.
Die Anhäufung von Flavonoiden in den Früchten von transformierten Pflanzen war abhängig vom Reifungsstadium. Die 14 zeigt, dass der Kaempferol-Peak in hydrolysierten Extrakten aus dem Fruchtfleisch von ausgewachsenen Tomatenfrüchten im grünen Stadium nicht nachweisbar war, dass der Peak im Übergangsstadium klein und im roten Stadium am höchsten war. Eine ähnliche reifungsabhängige Zunahme wurde für Naringenin beobachtet (Chromatogramme, die bei 280 nm aufgenommen wurden; nicht gezeigt). Diese Zeitabhängigkeit der Flavonoid-Biosynthese stimmt mit dem Muster der Aktivierung des e8-Promotors überein, der sowohl im pBBC200- als auch im pBBC300-Genkonstrukt vorhanden ist.
In manchen Pflanzen, die mit pBBC200 oder pBBC300 transformiert wurden, wurde eine leichte violette Pigmentierung aufgrund der Anhäufung von Anthocyanen in den Früchten beobachtet, jedoch nur im grünen Stadium und im Übergangsstadium. Eine Analyse der Querschnitte von diesen violett gefärbten Früchten mit dem Mikroskop ergab, dass die Anhäufung von Anthocyanen auf das Schalengewebe der Früchte beschränkt war. Jedoch konnten Anthocyane in roten Früchten nicht nachgewiesen werden, weder mit dem Auge, noch durch HPLC-Analysen von hydrolysierten und nicht-hydrolysierten Extrakten bei 520 nm. Im Gegensatz zu diesem Muster der Anthocyan-Erzeugung war die Erzeugung von Kaempferol- und Naringenin-Glycosiden in denselben transgenen Früchten nicht auf die Fruchtschale beschränkt und nahm während der Fruchtreifung zu (siehe oben). Daher steht die induzierte Biosynthese von Flavonoiden in Tomatenfrüchten, wie in der vorliegenden Erfindung beansprucht, nicht mit der Erzeugung der Anthocyane in Beziehung.
7.3 Die Transformation sowohl mit Lc als auch mit C1 ist wesentlich für erhöhte Flavonoid-Konzentrationen in Tomatenfrüchten
Um zu überprüfen, ob C1 oder Lc allein gleichermaßen die Flavonoid-Biosynthese in Tomatenfrüchten induzieren können, wurde die Sorte FM6203 ebenso mit den Plasmiden pBBC10, pBBC20 und pBBC30 transformiert, welche die einzelnen regulatorischen Genkonstrukte d35S-c1, e8-1c ohne Leader-Sequenz bzw. e8-1c mit Leader-Sequenz enthalten. Die hydrolysierten Extrakte wurden aus ganzen roten Früchten hergestellt und durch HPLC wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert. 28 zeigt, dass die Früchte von Pflanzen, welche nur mit C1 (Pflanzen, die beginnend mit Nummer 101 aufwärts nummeriert wurden) oder nur mit Lc (die Pflanzen ohne Leader-Sequenz wurden beginnend mit Nummer 201 aufwärts nummeriert bzw. die Pflanzen mit Leader-Sequenz wurden beginnend mit Nummer 301 aufwärts nummeriert) transformiert wurden, solche Konzentrationen der gesamten Flavonole (Quercetin plus Kaempferol) aufwiesen, die im Bereich von 1,2 bis 8 mg/kg Frischgewicht lagen, das heißt innerhalb des Bereichs der Kontrollfrüchte (1,8 bis 8,8 mg/kg Frischgewicht). Diese Daten weisen darauf hin, dass die Transformation der Tomatenpflanzen entweder mit C1 oder mit Lc (mit oder ohne Leader-Sequenz) nicht zu erhöhten Flavonol-Konzentrationen in ihren Früchten führt. Im Gegensatz dazu wiesen die Früchte von Pflanzen, welche beide regulatorischen Gene nach der Transformation mit pBBC200 oder pBBC300 (nummeriert beginnend mit Nummer 2000 bzw. 3000 aufwärts) enthielten, erheblich erhöhte Konzentrationen an Flavonolen in ihren Früchten auf, im Vergleich sowohl mit den Kontrollpflanzen als auch mit den Pflanzen, welche mit den Gen-Konstrukten mit einem einzelnen Gen transformiert wurden. Dieser Anstieg der Flavonole war hauptsächlich auf die Anhäufung von Kaempferol (29) zurückzuführen. Offensichtlich ist das Vorliegen von zwei Genen für Transkriptionsfaktoren, wie zum Beispiel sowohl von C1 als auch von Lc, für die erhöhte Erzeugung von Flavonoiden in Tomatenfrüchten wesentlich.
In ähnlicher Weise kann die Konzentration der Flavonole in den Blättern der transformierten Tomaten gemessen werden. Es wurde gefunden, dass die Konzentrationen der Flavonole in den Blättern um bis zu 6-fach erhöht war, im Vergleich mit den Kontrollpflanzen, und meistens waren die Konzentrationen der Flavonole geringer als die Flavonol-Konzentration im Fruchtfleisch der Frucht. In keinem der Fälle wurde eine letale Dosis an Flavonolen angetroffen, dies kann durch die Tatsache erklärt werden, dass ein frucht-spezifischer Promotor verwendet wurde, welcher die Konzentrationen auf eine nicht-letale Dosis beschränkt, obwohl er offensichtlich die Bildung von Flavonolen in Blättern nicht vollständig verhindert.
Beispiel 8: Analyse der transgenen Expression in transgenen Pflanzen
Die Expression der eingeführten C1- und Lc-Gene in die erhaltenen transgenen Tomatenpflanzen wurde durch quantitative RT-PCR in Echtzeit analysiert, wobei der fluoro gene 5'-Nuklease-Assay mit dem PCR-Reagenzkit von „Taqman" auf einem Sequenz-Nachweissystem vom Typ „ABI PRISM 7700" (Perkin-Elmer/ABI) durchgeführt wurde. Die Prinzipien dieses Verfahrens sind folgende: cDNA wird aus der gesamten RNA durch reverse Transkription hergestellt, welche aus der betreffenden Quelle extrahiert wurde. Die Expression des betreffenden Gens wird in einer PCR-Reaktion beobachtet, zu der eine fluorogene Sonde gegeben wird, die aus einem Oligonukleotid besteht, mit welchem Oligonukleotid sowohl ein Reporter- als ein Quencher-Farbstoff verknüpft sind, so dass die Sonde spezifisch zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-Primern bindet. Wenn die Sonde durch die 5'-Nuklease-Aktivität der DNA-Polymerase gespalten wird, wird der Reporter-Farbstoff von dem Quencher-Farbstoff getrennt, und ein sequenz-spezifisches Signal wird erzeugt. Mit jedem Zyklus werden weitere Reporter-Farbstoff-Moleküle von ihren jeweiligen Sonden gespalten, und die Fluoreszenz-Intensität wird während der PCR-Reaktion beobachtet. Der PCR-Zyklus, bei dem die Fluoreszenz einen bestimmten Schwellenwert erreicht, ist ein Maß für die Kopienzahl der betreffenden RNA beim Start. Diese Größe kann durch Durchführung einer Standard-PCR in einem bestimmten Bereich mit bekannten Mengen des betreffenden Gens quantifiziert werden.
Die folgenden Pflanzen wurden für die Tagman-Analyse ausgewählt: Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC10 transformiert wurden (P35s-c1-Tnos), Nummern 104, 109 und 117; Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC20 transformiert wurden (Pe8-Lc^–-Trbc), Nummern 201, 204 und 209; Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC30 transformiert wurden (Pe8-Lc⁺-Trbc), Nummern 302 und 305; Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC300 transformiert wurden (P35S-c1-Tnos/Pe8-Lc⁺-Trbc), Nummer 3031; und Pflanzen, die mit dem Plasmid pBBC250 transformiert wurden (Pe8-c1-Tnos/Pe8-Lc^–-Trbc), Nummern 2509, 2511 und 2519. Im Plasmid pBBC250 werden sowohl das C1- als auch das Lc-Gen unter der Kontrolle des frucht-spezifischen e8-Promotors aus der Tomate exprimiert. Das Plasmid pBBC250 wird in 20 dargestellt und kann analog zu den Plasmiden pBBC200 und pBBC300 hergestellt werden, die Transformanten mit dem Plasmid pBBC250 sind mit den Nummern 2500–2999 nummeriert.
Die Gesamt-RNA wurde aus den roten Früchten von transgenen Tomatenpflanzen isoliert. Der erste Strang der cDNA wurde aus 350 ng der gesamten RNA durch reverse Transkription synthetisiert. Aliquots von 100 ng cDNA wurden in drei Tagman-PCR- Reaktionen mit einer C1-, Lc- bzw. einer cyp-Sonde verwendet. Das Cyclophyllin-Gen (cyp) aus der Tomate wird konstitutiv in Tomatenfrüchten exprimiert, wie durch Northern-Analyse beobachtet, und daher kann es als interne Kontrolle verwendet werden. Bekannte Mengen der Plasmide pFLAP300 und ein 0,4 kb großes PCR-Fragment von Cyclophyllin, das nach RT-PCR mit RNA aus der Tomatenfrucht mit den Primern CYP1S und CYP2A (Tabelle 1) erhalten wurde, wurden als Standards verwendet. Die Sequenz der verwendeten Tagman-Primer und -Sonden ist in Tabelle 4 aufgelistet.
Für alle drei Kombinationen aus Primern und Sonden wurde die Zahl der spezifischen mRNA-Moleküle, die in jeder Probe vorliegen, bestimmt und relativ zur Menge der cyp-mRNA ausgedrückt. Die absolute Menge der cyp-mRNA schwankte um weniger als das 2,5-fache zwischen den unterschiedlichen transgenen Pflanzen – ein Umstand, der darauf hinweist, dass dieses Gen tatsächlich als eine interne Kontrolle fungieren kann. Wie in 21 gezeigt, gab die Kontrollpflanze 004 weder ein Signal mit der c1-Sonde noch mit der Lc-Sonde. Im Gegensatz dazu zeigten alle überprüften transgenen Pflanzen eine klare Expression der eingeführten Transgene: die Pflanzen mit dem einzelnen Gen C1 (Nummern 104, 109 und 117) zeigten lediglich eine Expression des C1-Gens, die Pflanzen mit dem einzelnen Gen Lc (Nummern 201, 204, 209, 302 und 305) zeigten lediglich eine Expression des Lc-Gens, und alle getesteten Pflanzen mit beiden Genen C1 und Lc (Nummern 2509, 2511, 2519 und 3031) zeigten die Expression sowohl von C1 als auch von Lc. Obwohl der Expressionsgrad der C1- und Lc-Gene in manchen transgenen Pflanzen, die nur ein einzelnes Gen aufweisen, höher ist als die Konzentrationen, die in manchen Pflanzen mit beiden Genen gefunden werden, gibt es dennoch keinen nachweisbaren Anstieg in der Konzentration des Kaempferols (21). Der Umstand weist darauf hin, dass die Expression sowohl von C1 als auch von Lc gemeinsam notwendig ist, um den Stoffwechselweg für Flavonoide in Tomatenfrüchten nach oben zu regulieren, so dass es zu einer erhöhten Erzeugung des Flavonols Kaempferol kommt. Tabelle 4: Übersicht über die verwendeten Tagman-Primer und -Sonden

(*) fluoreszierend markierte Taqman-Sonden

Beispiel 9: Tomatenfrüchte mit erhöhten Flavonoid-Konzentrationen aufgrund einer Transformation mit Lc und C1 zeigen eine erhöhte antioxidative Wirkung
Da die postulierten günstigen Wirkungen der Flavonoide in der menschlichen Diät zumindest teilweise ihren antioxidativen Eigenschaften zugeschrieben werden, wurde es überprüft, ob die Tomatenpflanzen mit erhöhten Konzentrationen an Flavonoiden in ihren Früchten ebenso erhöhte antioxidative Wirkungen aufweisen.
Aus 3 Kontrollpflanzen und 3 unabhängigen Transformanten (Nummern 3031, 3059 und 3060 wie vorstehend beschrieben) wurden 0,6 g Frischgewicht aus ganzen Früchten (geriebenes Material aus 3 roten Früchten, die pro Pflanze vereinigt wurden) eingewogen, in 2 ml 70% Methanol durch Ultraschallbehandlung für 30 Minuten extrahiert und filtriert (0,2 μm). Die antioxidative Wirkung wurde anhand der Fähigkeit der Extrakte überprüft, mit dem gefärbten Radikalkation von ABTS (2,2'-Azinobis-[3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure]) zu reagieren, im Wesentlichen wie beschrieben von Miller und Rice-Evans, 1997. Die ABTS-Radikal-Stammlösung, welche mit Kaliumpersulfat erzeugt wurde, wurde in 5 mM Kaliumphosphat-Lösung (pH 7,4), die 150 mM NaCl enthielt, unmittelbar vor Gebrauch verdünnt, so dass eine Arbeitslösung mit einem Absorptionswert von 1,240 erhalten wurde, der bei 734 nm gemessen wurde. Die antioxidative Wirkung der Tomatenextrakte wurde durch Zugabe von 10 μl des Extrakts zu 990 μl der ABTS-Radikal-Arbeitslösung, durch Mischen für 30 Sekunden und durch Ablesen der Absorbtion bei 734 nm genau 1 Minute nach der Zugabe des Extrakts bestimmt. Eine Eichkurve von Trolox (0–20 nmol) wurde hergestellt, um die Werte für die antioxidative Kapazität in Trolox-Äquivalenten (trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC-Werte) der Tomatenextrakte zu berechnen. Die Schwankung zwischen den Wiederholungen lag stets bei weniger als 7%.
Der TEAC-Wert der Extrakte aus den Kontrolltomaten betrug 2513 ± 409 μmol/kg Frischgewicht (Durchschnittswerte ± Standardabweichung von 3 Pflanzen). Im Vergleich mit diesem Kontrollwert waren die TEAC-Werte der transgenen Pflanzen in der Pflanze Nr. 3031 um 20%, in der Pflanze Nr. 3059 um 40%, und in der Pflanze Nr. 3060 um 64% erhöht. Die 22 zeigt, dass die TEAC-Werte der Früchte in enger Beziehung zu den Werten der gesamten Flavonoide in diesen Früchten stehen, sowohl in den Kontrollpflanzen als auch in den transgenen Pflanzen. Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass die erhöhte antioxidative Wirkung, welche in den Früchten der Lc/C1-transformierten Pflanzen beobachtet wurde, auf die erhöhte Flavonoid-Biosynthese zurückzuführen war.
Beispiel 10: Eigenschaften der Tomaten-Pasten, welche aus transformierten Tomaten der Erfindung hergestellt wurden
Dieses Beispiel zeigt, dass die Überexpression der Transkriptionsfaktoren in der Tomate die für den Handel wichtigen Eigenschaften verbessern kann, wie zum Beispiel die Pastenkonstistenz, insbesondere die Tatsache, dass die Tomaten zu dickeren Pasten beim Einsatz der gleichen Fruchtkonzentration führen können.
Die Daten aus fünf unabhängigen Pasten-Zubereitungen sind in diesem Beispiel angegeben. Die Pasten 1 und 2 stammen aus den Pflanzen der T1-Generation (das heißt aus einer Population, die aus dem Samen der geselbsteten primären transgenen Pflanze 2059 stammt). Die Pasten 3, 4 und 5 stammen aus homozygoten Pflanzen der T2-Generation.
10.1 Pflanzenmaterial
10.1 Züchtung
Samen aus den geselbsteten primären transgenen Tomatenpflanzen mit einem einzelnen Insert und der Nummer 2059 werden in flache Erdschichten in einem Glashaus unter Lichtbedingungen wie im Beispiel 1 gesät. Die Sämlinge, welche das Transgen pBBC300 beibehalten haben, wurden durch PCR selektiert, wobei das für das Transgen spezifische Primerpaar F69/F72 (Tabelle 1) verwendet wurde. Die PCR-positiven transgenen Pflanzen wurden als 2059+ bezeichnet. Die PCR-negativen Kontrollpflanzen, welche das pBBC300-Transgen durch Segregation verloren haben, wurden als 2059-bezeichnet. Die Sorte FM6203 (das heißt die Eltern-Linie) wurde ebenso als Kontrolle angepflanzt.
Nach der Selektion durch PCR wurden die 16–20 Tage alten Sämlinge in ein automatisches Nährstoff- und Wasser-Zufuhrsystem mit einer Hydrokultur überführt.
Die Samen aus den homozygoten geselbsteten T1-Pflanzen wurden in flache Erdschichten in einem Glashaus gepflanzt. Die 16–20 Tage alten Sämlinge wurden in ein automatisches Nährstoff- und Wasser-Zufuhrsystem mit einer Hydrokultur überführt.
Die Früchte wurden nach 18–21 Tagen nach dem Farbwechsel geerntet (der Farbwechsel bezeichnet das Stadium, bei dem das erste Auftreten einer orangen Färbung während der Entwicklung der Frucht auftritt). Die Früchte wurden für die Pastenherstellung innerhalb von 2–4 Stunden nach der Ernte verwendet.
10.2 Herstellung der Tomaten-Paste
450–850 g Früchte wurden gewürfelt (15 mm) und in einem Pyrex-Kolben für 4, 2 und 1 Minuten (bei voller Leistung) mit Mikrowellen behandelt, wobei zwischen jeder Heizperiode gerührt wurde. Der Brei wurde auf Raumtemperatur auf schmelzendem Eis gekühlt, und es wurde Wasser zugegeben, um den gekochten Tomatenbrei auf das ursprüngliche Feuchtigkeitsgewicht zu bringen. Der abgekühlte Saft wurde durch ein Maschensieb von 1400 und 710 μm gesiebt, wobei typischerweise Verluste (Samen und Haut) von etwa 10–40% auftraten.
Eine eingewogene Menge von heiß erzeugtem Saft wurde bei 5.000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen, und die Gewichte des Serums und des Überstands wurden bestimmt (Serum-Pellet-Verhältnis). Das Serum-Pellet-Verhältnis ist ein Maß für die Teilchenbelegung – je dicker die Paste ist, desto geringer ist das Serum-Pellet-Verhältnis. Die Pasten, die unter Verwendung von Tomaten aus der 2059+-Linie hergestellt wurden, besaßen in Übereinstimmung mit diesem Befund geringere Serum-Pellet-Verhältnisse als jene Pasten, die entweder aus den Linien 2059– oder der Eltern-Linie FM6203 hergestellt wurden (23).
Die Pasten wurden wiederhergestellt, indem ein Teil des Serums (typischerweise bis 75% des Saftgewichts) zu dem Pellet zurückgemischt wurde, und indem man die Teilchen mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur erneut quellen lies.
Bostwick stellt das standardmäßige Industrieverfahren zur Messung der Pastenviskosität dar. Annähernd 100 g dieser 75% Paste (hergestellt wie oben) wurden in die Kammer des nivellierten Bostwick-Gefäßes gegeben, die Klappe wurde geöffnet, und der Abstand (in cm), über welchen die Paste in 30 Sekunden fließt, wurde aufgezeichnet. Die Pasten mit einem niedrigen Bostwick-Wert besitzen eine hohe Viskosität und vice versa.
Die Pasten, welche mit den Tomaten hergestellt wurden, die von der Linie 2059+ abstammen, besaßen einheitlich geringere Bostwick-Werte als jene, die aus der Linie 2059– oder der Eltern-Linie FM6203 hergestellt wurden (24).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Tomatenlinien der Erfindung vorteilhafte Eigenschaften für die Tomatenprodukte bereitstellen, zum Beispiel können sie die Dicke der Produkte, wie zum Beispiel von Tomaten-Pasten, erhöhen.
Beispiel 11: Die Transformation von Tomatenpflanzen mit Lc und C1 erhöht die Erzeugung von Methylsalicylat in den Früchten
Die Wirkungen der regulatorischen Gene Lc und C1 auf die Erzeugung von flüchtigen Stoffen, welche von den Tomatenfrüchten erzeugt werden, wurden getestet, wobei die Mikroextraktion in der Festphase (solid Phase microextraction; SPME) und die mit der Massenspektrometrie gekoppelte Gaschromatographie verwendet wurden (GC-MS).
In einem Glasgefäß von 4 ml Fassungsvermögen wurden 0,5 g gefrorenes Material (auf der Grundlage des Frischgewichts) der geriebenen ganzen roten Früchte eingewogen. Nach dem Auftauen wurde das Fruchtmaterial bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren für 5 Minuten inkubiert, um enzymatische Reaktionen zu ermöglichen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,37 g festem CaCl₂ beendet, und das Gefäß wurde schnell mit einer Kappe verschlossen, in die am oberen Ende eine Tefloneinlage gearbeitet war. Das Gefäß wurde in ein Wasserbad bei 50°C oberhalb einer Rühreinrichtung platziert. Nach 10 Minuten der Vorinkubation während des Rührens wurden von den flüchtigen Bestandteilen im Kopfraum während 15 Minuten Proben genommen, wobei eine Festphasen-Mikroextraktion mit einer Silikatfaser verwendet wurde, die mit 100 μm Polydimethylsiloxan (Supelco Inc., Bellefonte, PA, USA) beschichtet war. Die eingefangenen flüchtigen Bestandteile wurden durch Gaschromatographie und Massenspektrometrie gemäß dem Verfahren von Verhoeven et al., 1997 identifiziert.
30 zeigt typische GC-MS-Chromatogramme von flüchtigen Bestandteilen, welche von roten Tomaten sowohl von nicht-transformierten als auch von transgenen FM6203 Pflanzen erzeugt wurden. Die Erzeugung von Methylsalicylat in den Fruchtextrakten von Pflanzen, welche sowohl Lc als auch C1 exprimieren, erschien erheblich höher: deren Peakfläche, ausgedrückt als gesamte Ionenströme × 10⁶, betrug in den Kontrollpflanzen 9,2 ± 1,6 (Durchschnittswert ± Standardabweichung; n = 2), während er in den Pflanzen, die unabhängig sowohl mit Lc als auch mit C1 transformiert wurden, eher im Bereich von 17,2 bis 32,2 lag (Durchschnittswert ± Standardabweichung: 29,6 ± 11,4; n = 3). Im Gegensatz dazu war die Erzeugung von Methylsalicylat in den Früchten von Pflanzen, welche nur Lc exprimieren (30b), nicht verändert: in diesen transgenen Pflanzen betrug der Durchschnittswert ± Standardabweichung der Peakfläche 10,8 ± 2,1 (n = 2). Von den zwei getesteten Pflanzen, welche lediglich C1 in ihren Früchten exprimieren, wies eine Pflanze eine Konzentration auf, die mit jener in den nicht-transformierten Kontrollpflanzen vergleichbar war, während die andere (30c) Methylsalicylat erzeugte, dessen Konzentration ähnlich zu den Pflanzen war, welche sowohl C1 als auch Lc exprimieren. Die Anmelder mutmaßen daher, dass die Steigerung der Erzeugung von Methylsalicylaten in den Früchten von Pflanzen, die mit den regulatorischen Genen Lc und C1 transformiert wurden, hauptsächlich auf die Wirkung von C1 zurückzuführen ist.
Eine erhebliche Steigerung der Methylsalicylat-Konzentration in den Tomaten der Erfindung im Vergleich mit den Kontrollfrüchten wurde gefunden. Methylsalicylat ist ein flüchtiges Signalmolekül in Pflanzen, das als Reaktion auf die Verletzung der Pflanze erzeugt wird und ein Schlüsselpathogen darstellt. Seine Biosynthese über den Phenylpropan-Stoffwechselweg beinhaltet wahrscheinlich Benzoesäure als Vorstufe.
Überraschenderweise stellt die kombinierte Insertion von Lc + C1 nicht nur erhöhte Konzentrationen von Flavonoiden, sondern auch erhöhte Konzentrationen von Methylsalicylat bereit und bietet damit Möglichkeiten zur selektiven Herstellung von Pflanzen, um veränderte Konzentrationen der beabsichtigten Aromaverbindungen sowie Nahrungsmittel mit neuem Geschmack zu erzeugen.
SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, welche erhöhte Konzentrationen an Flavonolen zeigt, welches Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) den Einbau eines Gens, welches für einen Transkriptions-Faktor vom myb-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei das Gen funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, und (ii) den Einbau eines Gens, welches für einen Transkriptions-Faktor vom myc-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei das Gen funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, in diese Pflanze, so dass die Pflanze stabil mit jedem Gen transformiert ist, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze darstellt, und wobei der Transkriptions-Faktor vom myb-Typ den Transkriptions-Faktor C1 aus Mais darstellt, und der Transkriptions-Faktor vom myc-Typ den Transkriptions-Faktor Lc aus Mais darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eines der Gene, welches für einen Transkriptions-Faktor kodiert, funktionell mit einem nicht-konstitutiven Promotor und/oder einem gewebe-spezifischen Promotor verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gen, welches für den Transkriptions-Faktor C1 aus Mais kodiert, funktionell mit dem konstitutiven doppelten 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus verknüpft ist, und das Gen, welches für den Transkriptions-Faktor Lc aus Mais kodiert, funktionell mit dem frucht-spezifischen E8-Promotor aus der Tomate verknüpft ist.
Pflanze mit einem Gen, das für einen Transkriptions-Faktor vom myb-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, und mit einem Gen, das für einen Transkriptions-Faktor vom myc-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei die Gene stabil in das Genom transformiert sind, so dass die Fähigkeit der Pflanze, Flavonole herzustellen, gesteigert wird, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze darstellt, und wobei der Transkriptions-Faktor vom myb-Typ den Transkriptions-Faktor C1 aus Mais darstellt, und der Transkriptions-Faktor vom myc-Typ den Transkriptions-Faktor Lc aus Mais darstellt.
Pflanze, die ein DNA-Konstrukt umfasst, das die Sequenzen umfasst, welche Sequenzen für ein Gen kodieren, das für einen Transkriptions-Faktor vom myb-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, und welche Sequenzen für ein Gen kodieren, das für einen Transkriptions-Faktor vom myc-Typ kodiert, der an der Kontrolle der Flavonoid-Biosynthese beteiligt ist, wobei jedes Gen funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, wobei die Pflanze eine Tomatenpflanze darstellt, und wobei der Transkriptions-Faktor vom myb-Typ den Transkriptions-Faktor C1 aus Mais darstellt, und der Transkriptions-Faktor vom myc-Typ den Transkriptions-Faktor Lc aus Mais darstellt.
Pflanze nach Anspruch 5, wobei die Gene als funktionell verknüpfte Bestandteile in einer Expressionskassette vorliegen, von der jede Einheit einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, ein Gen, welches für einen der Transkriptions-Faktoren kodiert, und einen Terminationsbereich für die Transkription und Translation, der in der Pflanzenzelle funktionell ist, umfasst.
Pflanze nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Tomatenpflanze erhöhte Flavonol-Konzentrationen im Fruchtfleisch der Frucht aufweist.
Samen, Früchte, Nachkommen und Hybriden einer Pflanze nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie das DNA-Konstrukt nach Anspruch 5 umfassen.
Verwendung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 5 bis 7 bei der Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts oder eines haut- oder haar-schützenden Produktes.
Verwendung einer Tomatenpflanze nach Anspruch 7 in einem Verfahren zur Erhöhung der Dicke von Tomaten-Pasten, wobei die Tomaten dieser Pflanze als ein Bestandteil derselben verwendet werden.